CN105603536A - Rna甲基化测序文库的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种RNA甲基化测序文库的构建方法。该构建方法包括：步骤S1，对RNA样品进行片段化，得到片段化RNA；步骤S2，利用RNA甲基化特异性抗体对片段化RNA进行免疫共沉淀，得到沉淀物；步骤S3，利用蛋白酶对沉淀物进行消化，得到消化物；步骤S4，从消化物中提取RNA并对提取的RNA进行逆转录，得到cDNA；以及步骤S5，利用cDNA进行测序文库构建，得到RNA甲基化测序文库。蛋白酶的消化作用较类似物的竞争洗脱作用更强，因而可提高RNA的得率，且避免了甲基化位点类似物所引入的噪音，解决了现有技术中所构建的文库噪音高的问题，提高了文库的构建质量，进而提高文库产出有效数据的利用率。

Description

RNA甲基化测序文库的构建方法

技术领域

本发明涉及RNA测序领域，具体而言，涉及一种RNA甲基化测序文库的构建方法。

背景技术

表观遗传学是指在基因组DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达和调控发生了可遗传的变化，其现象主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印记和RNA修饰等。其中RNA甲基化修饰广泛存在于哺乳动物、植物等真核生物中，主要的存在形式有m⁷G、N_m、m⁵C、m⁶A和m⁶A_m。不同形式的RNA甲基化在调控生物生长发育等过程中起着至关重要的作用，例如m⁷G参与mRNA的翻译修饰、转移、剪切等，N_m甲基化经常用作宿主细胞识别自身mRNA和外源mRNA的分子标记，而通过基因敲除等实验显示m⁵C、m⁶A在调控顶端发育和细胞命运等方面发挥重要作用。甲基化修饰不改变沃森克里克配对，基于常规的反转录构建文库测序的方法无法鉴定m⁶A等RNA甲基化修饰位点，因此基于RNA免疫共沉淀(RNAImmunoprecipitation，RIP)的甲基化的RNA免疫沉淀测序(MeRIP-seq)方法对研究RNA甲基化位点非常必要。

1970s中期，在哺乳动物(1975年)、病毒(1976年)、果蝇(1978年)和植物(1979年)中陆续发现了m⁶A的存在，2011年首次发现了RNA甲基化修饰可逆化，近些年的研究发现RNA的这种可逆修饰广泛存在于多种真核生物细胞中。RNA复杂的结构和功能关系使对RNA甲基化修饰的研究受到抑制。2012年DanDominissini等建立了m⁶A-seq技术，成功实现了人和小鼠转录水平上m⁶A高分辨率定位，并于2013年将这种基于免疫沉淀技术的MeRIP-seq方法发表于NatureProtocols，成为首个从整个转录水平研究RNA修饰的方法。

MeRIP-seq方法的产生主要基于染色体免疫共沉淀测序(ChIP-seq)和甲基化的DNA免疫沉淀测序(MeDIP)方法的发展，通过RNA甲基化识别抗体特异结合发生甲基化的RNA，对富集得到的RNA片段进行测序，通过测序序列(reads)的密度分布鉴定甲基化位点，推测甲基化位点保守区域(motif)，并对发生RNA甲基化修饰的相关基因进行注释分析。基于RIP-seq对RNA甲基化进行定位分析的方法，对研究RNA甲基化修饰在真核生物中的生物学功能有重要意义。

下面以m⁶A甲基化的建库流程来详细说明现有技术中所存在的缺陷：

基于免疫沉淀法RNA的m⁶A甲基化的高通量测序文库构建的原理是通过甲基化特异性的抗体与片段化后的mRNA中的m⁶A甲基化结合，再通过蛋白A(蛋白A)磁珠将抗体富集下来，最终在RNA提取后进行文库构建。具体的建库流程为：

(1)将总RNA通过Dyna磁珠oligo(dT)磁珠进行mRNA富集；

(2)将富集后的mRNA浓缩到1ug/ul，加入片段化缓冲液，进行盐离子打断，用0.5MEDTA进行终止打断过程；

(3)利用乙醇过夜沉淀片段化的RNA，然后收集溶解RNA，并留取一小部分做上样对照(input)，另一部分用来进行免疫沉淀(IP)实验；

(4)将待IP的样品等分为两管，均分别加入IP缓冲液和RNA酶抑制剂，其中一管加入抗体，一管不加抗体(作为对照)放于4℃，旋转混匀仪上孵育2h；

(5)在抗体孵育的同时，向200μL蛋白A磁珠离心弃上清，重悬于添加有BSA的IP缓冲液中，然后置于4℃的旋转混匀仪上孵育2h进行预封闭；

(6)将预封闭后的蛋白A磁珠等分两份，离心弃上清，将孵育好的样品(加抗体和不加抗体)转移到含磁珠的离心管内，然后置于4℃的旋转混匀仪上孵育2h；

(7)离心弃掉磁珠中的上清，加入洗脱液进行洗脱；

(8)将洗脱液离心，收集上清，进行RNA提取；

(9)对得到的RNA进行反转录以及cDNA二链合成反应；

(10)将合成的双链DNA用XP磁珠纯化后进行末端修复加A反应；

(11)将末端修复加A的产物连接接头，并通过XP磁珠进行片段选择去掉未连接的接头；

(12)对纯化后的片段进行PCR扩增，扩增产物等体积XP磁珠纯化出库。

(13)将构建完成的文库进行库捡，使用Hiseq2500SE50进行测序，得到的数据进行信息分析。

然而，在实际使用中发现，利用上述方法所构建的RNA甲基化文库产出的数据中噪音高，文库质量相对较低。因而，仍需要对上述方法进行改进以提高文库质量。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种RNA甲基化测序文库的构建方法，以解决现有技术中所构建的文库噪音高的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种RNA甲基化测序文库的构建方法，该构建方法包括：步骤S1，对RNA样品进行片段化，得到片段化RNA；步骤S2，利用RNA甲基化特异性抗体对片段化RNA进行免疫共沉淀，得到沉淀物；步骤S3，利用蛋白酶对沉淀物进行消化，得到消化物；步骤S4，从消化物中提取RNA并对提取的RNA进行逆转录，得到cDNA；以及步骤S5，利用cDNA进行测序文库构建，得到RNA甲基化测序文库。

进一步地，蛋白酶选择蛋白酶K、木瓜蛋白酶或者胃蛋白酶。

进一步地，步骤S1中，采用化学法对RNA进行片段化，得到片段化RNA。

进一步地，片段化RNA的长度为50～200nt。

进一步地，采用含Zn²⁺的盐溶液对RNA进行片段化。

进一步地，含Zn²⁺的盐溶液中Zn²⁺的摩尔浓度为5～10mol/L。

进一步地，RNA甲基化特异性抗体为特异识别RNA中m⁷G、N_m、m⁵C、m⁶A以及m⁶A_m中任一种甲基化的抗体。

进一步地，在步骤S4中，从消化物中提取RNA的步骤包括采用trizol和氯仿对消化物进行抽提，得到上清RNA的步骤。

进一步地，trizol和氯仿的体积比为4～6：1。

进一步地，从消化物中提取RNA的步骤在得到上清RNA的步骤后，还包括：用醋酸钠和异丙醇对上清RNA进行沉淀过夜，得到提取的RNA。

应用本发明的技术方案，本发明的上述RNA甲基化文库构建方法，通过采用蛋白酶直接将甲基化特异性抗体进行消化降解，使目的RNA片段从磁珠上解离下来。蛋白酶的消化作用较类似物的竞争洗脱作用更强，因而可提高RNA的得率，且避免了甲基化位点类似物所引入的噪音，提高了文库的构建质量，进而提高文库产出有效数据的利用率。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1示出了根据现有技术及本发明的一种优选实施例中片段化后的RNA的长度比较图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

如背景技术部分所提到的，现有技术中基于免疫沉淀的RNA甲基化文库构建方法存在噪音高导致文库质量相对较低的缺陷，为了改善这一缺陷，在本发明一种典型的实施方式中，提供了一种RNA甲基化测序文库的构建方法，该构建方法包括：步骤S1，对RNA样品进行片段化，得到片段化RNA；步骤S2，利用RNA甲基化特异性抗体对片段化RNA进行免疫共沉淀，得到沉淀物；步骤S3，利用蛋白酶对沉淀物进行消化，得到消化物；步骤S4，从消化物中提取RNA并对提取的RNA进行逆转录，得到cDNA；以及步骤S5，利用cDNA进行测序文库构建，得到RNA甲基化测序文库。

现有技术中采用甲基化位点的类似物将目的RNA片段以竞争的方式进行洗脱存在着以下三方面的缺陷：(1)制备甲基化类似物需要一定的成本和时间；(2)从原理上可知，竞争关系为RNA上甲基化的碱基位点和该甲基化位点的类似物与同一种抗体的动态结合的平衡，这就决定了无法使的抗体所结合的RNA全部置换下来；(3)类似物的引入会增加实验的噪音，使得后续有效数据利用率大大降低。

与现有技术相比，本发明的上述RNA甲基化文库构建方法，通过采用蛋白酶直接将甲基化特异性抗体进行消化降解，使目的RNA片段从磁珠上解离下来。的消化作用较类似物的竞争洗脱作用更强，且避免了甲基化位点类似物所引入的噪音，提高了文库的构建质量，进而提高文库产出有效数据的利用率。

上述构建方法中，对蛋白酶的具体种类并无特殊要求，只要能够将甲基化抗体蛋白进行消化降解即可，因而任何能够实现上述功能的蛋白酶都适用于本发明。在本发明一种优选的实施例中，上述蛋白酶选自蛋白酶K、木瓜蛋白酶或者胃蛋白酶。

在上述步骤S3中，由于沉淀物中与RNA直接结合的为抗体，而抗体的本质为蛋白，所以通过配制含有蛋白酶K的消化液，然后比如可以在50℃的温度下快速消化1h，使得蛋白酶K将抗体充分消化，从而将通过抗体结合到磁珠上的RNA洗脱下来，使得最大效率的将所富集到的RNA片段洗脱下来，从而更大程度的保障了目的RNA的回收，使得后期文库产出的数据信息更为真实和完整。

在本发明的上述构建方法中，上述对RNA进行片段化的步骤可以根据需要合理选择物理或化学方式进行打断。在本发明中优选采用化学打断的方式对RNA进行片段化，具体的化学打断试剂包括但不仅限于Mg²⁺盐溶液、Zn²⁺盐溶液或者NaOH溶液等现有的片段化试剂。

上述现有的化学打断试剂可以根据所欲得到的目的片段的具体长度、试剂的作用时间或者片段化的效率进行合理选择。在本发明一种优选的实施例中，采用化学打断后，得打的片段化RNA的长度为50～200nt。将片段化RNA的长度控制在该长度范围内，更加适应目前市场上对测序长度要求越来越长的需求。并且，随着高通量测序仪器的更新，双端36nt的测序长度已经不能满足市场需求，而将片段化RNA的长度提高为50～200nt，使之更适用现在流行的SE50或PE125的测序需求，而且还能够降低接头率，大大提高了有效数据率。

如上述，不同的化学打断试剂对RNA进行打断的效率虽各有不同，但都能通过调整作用时间或者调整盐溶液中相应金属离子的浓度来进行合理调整。为了提高片段化的速率，在本发明一种优选的实施例中，采用含Zn²⁺的盐溶液对RNA进行片段化，该盐溶液对RNA进行片段化的速度相对较快，且片段长度也较含Mg²⁺盐溶液打断的片段长度(～250nt)相对较小。

在上述采用含Zn²⁺的盐溶液对RNA进行片段化能够快速得到目的长度的RNA的基础上，为了进一步得到含量相对较多且长度相对较大的目的片段，在本发明另一种更优选的实施例中，上述含Zn²⁺的盐溶液中Zn²⁺的摩尔浓度为5～10mol/L。通过适当降低含Zn²⁺的盐溶液中Zn²⁺的摩尔浓度，将片段长度提高到100～200nt，不仅能同时满足于目前SE50和PE125上机策略的要求，而且增加了高通量测序时测序策略选择的灵活性。

由于本发明的上述RNA甲基化文库构建方法是基于RNA各种甲基化的特异性抗体进行免疫沉底，从而富集相应位置的RNA来构建文库的，因而任何能够特异识别RNA的各种碱基位点上的甲基化修饰的抗体都能够适用于本发明。在本发明中，上述RNA甲基化特异性抗体包括但不仅限于能够特异识别RNA中m⁷G、N_m、m⁵C、m⁶A以及m⁶A_m中任一种甲基化的抗体。即，针对上述各个已知的或将来发现的RNA中的不同碱基上的不同位置的甲基化修饰，只要有相应的特异性抗体可用，均可适用于本发明。

由于RNA本身存在不稳定、易降解等问题，使得上述抗体免疫共沉淀的实验难度相比DNA的免疫共沉淀大大增加。为了尽量提高富集的RNA片段得率，在节省了实验成本的同时使得实验成功率更高，所获的有效数据更多，在本发明一种优选的实施例中，上述步骤S4中，从消化物中提取RNA的步骤包括采用trizol和氯仿对消化物进行抽提，得到上清RNA的步骤。

在提取步骤的处理上将现有的酚氯仿抽提的方法，改为采用trizol和氯仿抽提的方法。酚氯仿抽提难以有效将DNA与RNA进行分离，对RNA抽提的特异性较差，而Trizol里含异硫氰酸胍以及饱和酚，能更加好地保护RNA不被损伤，而且加入氯仿后能有效地将DNA和蛋白质分离到有机相，进而有利于对上清中的RNA进行提取，较酚氯仿方法，RNA能有较高的得率。

上述trizol和氯仿的体积比可以根据实际需要进行合理调整。在本发明另一种更优选的实施例中，上述trizol和氯仿的体积比为4～6:1，更优选5：1。将磁珠离心，收集洗脱液，加入trizol和氯仿的体积比在上述范围内，对RNA进行抽提时，更够将更多的RNA集中在上清层，而DNA与蛋白质则集中在第二层的有机相中，使得RNA的得到更高。

在得到上述上清RNA的步骤后，后续的RNA纯化的步骤为本领域的常规步骤，采用现有的纯化步骤即可。在本发明一种优选的实施例中，在得到上述上清RNA的步骤后，上述从消化物中提取RNA的步骤还包括：用醋酸钠和异丙醇对上清RNA进行沉淀过夜，得到提取的RNA。该纯化沉淀方式能够得到更多的RNA。在沉淀过程中，所使用的用醋酸钠的浓度和体积以及异丙醇的体积可根据实际需要进行合理调整。更优选地，上述醋酸钠的浓度优选为3mol/L，pH为5.2，醋酸钠与上清RNA的体积比为1:8～15，更优选1：10，异丙醇与上清RNA的体积比为1～2：1。该体积用量下沉淀得到的RNA量相对更多。

下面将结合具体的实施例来进一步说明本发明的有益效果。

下列实施例以猪的肝脏RNA作为实验材料进行实验，前期需要对离体的肝脏组织进行总RNA提取，待总RNA满足实验需求之后进行后续操作。在进行具体实验之前先配制相关缓冲液的母液，具体如下表1至表3所示。

表1：RNA片段化的缓冲液，10X(现用现配)：

表2：IP缓冲液，5X(现用现配)：

表3：洗脱液(300μL)：

具体实验步骤如下：

一、甲基化RNA(m⁶A)捕获和富集

1.mRNA纯化(1mg，约200ul的磁珠可结合2ugmRNA)

该步骤所使用的磁珠和相关试剂均为life公司的产品。mRNA纯化所需磁珠为Oligo(dT)25公司：lifetechnologies，货号：61012。以下洗脱液(WashingBuffer)，磁珠结合缓冲液(BingdingBuffer)均为该试剂盒所带。

1.1.充分混匀Dyna磁珠oligo(dT)磁珠，然后取60μL到装有mRNA的1.5mL离心管中，然后将离心管置于磁力架上，静置3min后，用枪头小心吸取丢弃上清液。

1.2.加入200μL结合缓冲液(BindingBuffer)充分吹打混匀，瞬时离心后再次将离心管置于磁力架上，静置3min后，用枪头小心吸取丢弃上清液。

1.3.重复步骤1.2一次。

1.4.再加入100μL结合缓冲液，充分吹打混匀。

1.5.取6μg总RNA样品，并向RNA样品中补加物RNA酶水至100μL.

1.6.将样品加入到上述Dyna磁珠oligo(dT)磁珠中，充分吹打混匀，65℃孵育5min，孵育结束后立刻置于冰上2min。

1.7.混匀仪上室温孵育10min，瞬时离心，在磁力架上静置3min，用枪头小心吸取丢弃上清液。

1.8.向离心管中加入200μLWashingBuffer，充分吹打混匀，然后置于磁力架上，静置3min后，用枪头小心吸取丢弃上清液。

1.9.重复步骤1.8一次。

1.10.向离心管中加入100μL10mMTris-HCl，充分吹打混匀，然后先置于80℃孵育2min，然后再置于25℃孵育2min。

1.11.在上步加入100μLBeadingBindingBuffer，枪头吹打混匀后置于混匀仪上孵育5min，然后瞬时离心，将离心管放在磁力架上，静置3min后，用枪头小心吸取丢弃上清液。

1.12.向离心管中加入200μLWashingBuffer，充分吹打混匀，瞬时离心，然后置于磁力架上，静置3min后用枪头小心吸取丢弃上清液。

1.13.重复步骤1.12一次。

1.14.向离心管中加入31μL10mMTris-HCL，充分吹打混匀后于80℃孵育2min。

1.15.然后将离心管立即置于磁力架上，静置3min。然后用枪头小心吸取30μL上清液到PCR管中。

2.片段化反应

2.1调整RNA浓度为1μg/μl，然后按表4所示配比配制片段化反应体系。

表4：

将上述配制好的片段化反应体系置于94℃的PCR仪中反应1min(预热PCR仪，不使用热盖)，取出PCR管后立即加入2μL0.5M的EDTA。涡旋混匀及瞬时离心后，将PCR管放置于冰上。

2.2反应结束后将所有管中的反应产物收集到一起，加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)、糖原(Thermoscientific，货号：R0551)(终浓度100μg/mL)和2.5倍体积的无水乙醇。混匀后置于-80℃，沉淀过夜或更长时间以得到尽可能多的RNA。然后在4℃条件下以15，000g的转速离心25min。然后弃上清，用1ml体积浓度为75％的乙醇洗涤沉淀(沉淀肉眼可见)。然后再在4℃条件下以15，000g的转速离心15min，再次弃掉上清，将反应管晾干后，向反应管中加入300μL无RNA酶的水对RNA进行溶解。

2.3片段化反应验证(2h)：

用质量浓度为1.5％的琼脂糖凝胶，对上述片段化后得到的RNA0.5μg进行电泳检测，在120V的电压下电泳30min后进行检测，检测结果见图1，其中1表示现有方法所得到片段的检测大小，2表示本发明改进后的片段化流程所得片段的检测大小。从图1可以看出，相比现有方法所得片段，改进后的片段化的RNA长度相对较长，且符合预期大小，主要集中在150nt。

3.免疫沉淀(IP)(约需要5h)

在进行IP之前，留取部分片段化后的RNA作为上样量的定量(input，记为上样文库)，用来做RNA-seq的对照，上样文库用来与甲基化富集后的文库做比对。

3.1抗体孵育

按照表5所示的抗体捕获体系配制如下反应(其中一管不加m⁶A特异性抗体，作为只有磁珠的对照)，然后在旋转混匀仪上孵育2h，4℃。

表5：

上表5中，RNasin代表RNA酶抑制剂；RVC代表氧钒核苷复合物。

3.2蛋白A磁珠的预封闭

为去除背景的影响，样品孵育的同时对蛋白A磁珠用BSA进行预封闭(preblock)，预封闭方法为：取200μL蛋白A磁珠(含BSA0.5mg/ml)，用1mlIP缓冲液(1X，含BSA0.5mg/ml)重悬，颠倒混匀2h。将磁珠等量分到1.7ml离心管中，然后对离心管进行瞬时离心，弃离心后所得上清，用IP缓冲液(1X)洗涤磁珠两次，每次0.5ml。弃上清。

注：(1)IP缓冲液中应加入RNasin和RVC。(2)磁珠的使用量已经过量，若再增加使用量，背景也会增加。

3.3免疫沉淀

将上述孵育好的样品(加m⁶A特异性抗体和不加加m⁶A特异性抗体只加磁珠的对照)转移到含磁珠的1.7ml离心管中，于4℃颠倒混匀2h。

3.4收集

将反应液瞬时离心，吸去上清，用1mlIP缓冲液(1X)洗涤磁珠三次，吸去上清。

4.洗脱(2.5h):

4.1向离心后的磁珠中加入300μL含蛋白酶K的洗脱液50℃孵育1h。

4.2瞬时离心，吸取上清并将上清(含有洗脱的RNA片段)置于新的离心管中。

4.3对新的离心管所洗脱的上清进行Trizol和氯仿抽提，向RNA上清中加入2倍体积的Trizol以及0.4倍体积的氯仿进行抽提。

4.4向Trizol和氯仿抽提后的上清中加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)和2.5倍体积的无水乙醇。混匀后置于-80℃，沉淀过夜或更长时间。

4.5将沉淀后的RNA于4℃条件下以15，000g的转速离心25min，然后弃上清，用1ml体积浓度为75％的乙醇洗涤沉淀(此时沉淀是不可见的)，然后再于4℃下，以15，000g的转速离心15min。

4.6小心吸走上清，使离心管沉淀自然干燥，然后再用15μL无RNA酶水重悬沉淀。

二、RNA文库构建

1.cDNA合成

参考UltraTMRNA文库构建试剂盒(E7530L，NEB)的说明书，对上样量(input)、只有磁珠的对照(control)和免疫沉淀组(IP)共三组样品进行cDNA的合成。

理论上只有磁珠的对照(bead-onlycontrol)样品不会产生文库，可以使用AgilentTechnologies2100生物分析仪进行验证。该步骤中只有磁珠的对照可以只做2100检测，不建库。

1.1按照下表6的逆转录体系，在冰上配置逆转录反应体系。

表6：

RNA片段	15μL
		随机引物	1μL
NEBNext一链合成缓冲液(5X)	4μL
		终体积	20μL

1.2将PCR管放在PCR仪中，于72℃孵育2min(不用热盖)后，取出PCR管并立即放于冰上，冰浴时间大于1min。

1.3冰上继续向PCR管中加入下表7所列试剂。

表7：

Murine RNase抑制剂	0.5μL
		M-MLV RNase H-反转录酶	1μL
终体积	21.5μL

简单涡旋混匀溶液后离心收集溶液至管底。

1.4接着，按照表8所示PCR程序如下(不用热盖)进行反应。

表8：

25℃	10min
		42℃	50min
70℃	15min
		4℃	维持

1.5冰上继续向PCR管中加入表9所示第二链反应试剂。

表9：

无核酸酶的水	21μL
		二链合成缓冲液(10X)	5μL
二链合成酶混物	2.5μL
		终体积	50μL

简单涡旋混匀溶液后离心收集溶液至管底，并置于16℃孵育1h。

2.cDNA纯化

2.1涡旋混匀AMPureXP磁珠，室温孵育30min备用。

2.2按样品数准备好干净的1.5ml离心管，加入90μL(1.8X)重悬好的AMPureXP磁珠，并将对应的编号写好。将上一步的cDNA加入准备好的XP磁珠内，并用枪头混匀。室温孵育5min。

2.3如管壁上有液体可瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液。

2.4加入200μL体积浓度为80％的乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液。注：80％乙醇使用无核酸酶的水配制。

2.5重复步骤2.4一次。最后使用10μL枪头吸净离心管底部残留的液体。

2.6室温干燥一段时间，使乙醇尽量挥发干净。

2.7加入58μL无核酸酶的水，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。准备PCR管，并将编号写好。用枪头小心吸取56μL上清液到准备好的PCR管内。

3.末端修复加A

3.1在PCR管中配制如下表10所示的修复反应体系，混匀。

表10：

cDNA	56μL
		NEBNext末端修复缓冲液(10X)	6.5μL
NEBNext末端修复酶混物	3μL
		终体积	65μL

按照表11所示的PCR程序进行末端修复反应(不用热盖)。

表11：

20℃	30min
		65℃	30min
4℃	维持

3.2修复反应结束后，按下表12所示的接头连接体系向PCR管中继续加入下列试剂。

表12：

平末端/TA连接酶混合物	15μL
		NEBNext接头(15μM)	1μL9 -->
无核酸酶的水	2.5μL
		终体积	83.5μL

轻柔混匀，瞬时离心后置于PCR仪中在20℃下进行反应30min(不用热盖)。反应结束后立即放入冰上，加入3μLUSER酶，PCR仪37℃，15min。

4.片段大小选择

4.1涡旋混匀AMPureXP磁珠。

4.2准备干净的1.5ml离心管，写好对应编号，加入13.5μL无核酸酶的水，再加入57μL(0.57X)重悬的AMPureXP磁珠。

4.3将接头连接的DNA产物加入上步准备好的1.5ml离心管中，枪头混匀，室温孵育5min。

4.4瞬时离心。将1.5ml离心管置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取上清液到另一个干净的1.5ml离心管中，12，000rpm离心3min后置于磁力架上。准备干净的离心管并将对应的编号写好。将上清液转入对应的离心管中(此步磁珠上吸的为大片段DNA，离心帮助去除磁珠)。

4.5加入63μL(0.63X)重悬好的AMPureXP磁珠，并用枪头混匀。室温孵育5min(该步骤为去接头等小片段)。

4.6置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液。

4.7加入200μL80％乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液。

4.8重复步骤4.7一次。最后使用10μL枪头吸取离心管底部残留的液体。

4.9室温干燥一段时间，使乙醇尽量挥发干净。

4.10加入52μL无核酸酶的水，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。

4.11准备干净的离心管，写好对应编号，加入50μL涡旋混匀好的AMPureXP磁珠。吸取上步50μL上清至对应AMPureXP磁珠管内，枪头混匀，静置5min。置于磁力架上，静置5min。于磁力架上小心吸取丢弃上清液。

4.12加入200μL80％乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液。

4.13重复步骤4.12一次。最后使用10μL枪头吸取离心管底部残留的液体。

4.14室温干燥一段时间，使乙醇尽量挥发干净。

4.15加入24.5μL无核酸酶的水，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用10μL枪头小心吸取24μL上清至干净的PCR管内。

4.16取1μL进行Qubit定量。将浓度低于0.2ng/μL的标注。用后的Qubit管置于黑暗处备用。

5.PCR文库扩增

5.1向PCR管中加入以下表13所示试剂，简单震荡混匀：

表13：

片段选择后的DNA	23μL
		NEBNext High-Fidelity PCR混合物(2X)	25μL
通用PCR引物	1μL10 -->
		标签引物	1μL
终体积	50μL

注：所有试剂在冰上彻底融化，使用后立即放回-20℃。然后将反应管置于PCR仪中，按照表14所示的PCR程序进行PCR反应；

表14：

*注：当第八步的Qubit浓度低于0.2ng/μL的，扩增循环增至11或12个，

6.PCR产物纯化(等体积纯化两次)

6.1涡旋混匀AMPureXP磁珠。

6.2按样品数准备好干净的1.5ml离心管，加入50μL(等体积)重悬好的AMPureXP磁珠，并将对应的编号写好。将上一步PCR产物加入准备好的AMPureXP磁珠内，并用枪头混匀。室温孵育5min。

6.3置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用枪头小心吸取丢弃上清液。

6.4加入200μL80％乙醇漂洗，置于磁力架上，静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液。

6.5重复步骤6.4一次。最后使用10μL枪头吸取离心管底部残留的液体。

6.6敞开盖子5～10min让乙醇尽量挥发干净，至磁珠干燥。

6.7加入52μLRNase-freeH2O，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。

6.8准备干净的离心管，写好对应编号，加入50μL涡旋混匀好的AMPureXP磁珠。吸取上步50μL上清至对应AMPureXP磁珠管内，枪头混匀，静置5min。置于磁力架上，静置5min。于磁力架上小心吸取丢弃上清液。

6.9加入200μL80％乙醇漂洗，于磁力架上静置30s。用枪头小心吸取丢弃上清液(注意尽量不要吸到磁珠)。

6.10重复步骤9一次。最后使用10μL枪头吸取离心管底部残留的液体。

6.11室温干燥5～10min让乙醇尽量挥发干净。

6.12加入22.5μL无核酸酶的水，枪头吹吸混匀，瞬时离心，置于磁力架上，静置5min。待溶液清亮后，用10μL枪头枪头小心吸取21μL上清至干净的1.5ml离心管内；当第八步的Qubit浓度低于0.2ng/μL的，最后文库溶于12μL无核酸酶的水中，吸出10μL上清至干净的离心管内。

6.13取1μL进行Qubit定量(第八步的Qubit重复利用)。记下文库浓度，写上诺禾文库编号。准备干净的0.5ml离心管，写好对应文库编号，取1μL文库按照Qubit浓度稀释至1.5-2ng/μL，交至上机组做库检。

根据图中电泳可以得知，经过本专利改进过的方法所获打断片段将50nt提高到100～200nt范围内，更适合后续上机测序。

八、下机数据进行分析

对所构建文库使用Hiseq2500SE50进行测序，测序数据为10M。对下机数据进行处理。将测序得到的原始测序序列(SequencedReads或者rawreads)，里面含有带接头的、低质量的序列。为了保证信息分析质量，必须对原始测序序列过滤，得到有效测序序列(cleanreads)，后续分析都基于有效测序序列。数据处理的步骤如下：

(1)去除带接头(adapter)的序列(reads)；

(2)去除N(N表示无法确定碱基信息)的比例大于10％的序列(reads)；

(3)去除低质量序列(reads)(质量值sQ<＝5的碱基数占整个序列的50％以上的序列)。

将得到的有效测序序列比对后进行检出峰(peakcalling)统计，统计结果见下表15。

表15：

从上表15可以看出，经过本发明改进过的方法所构建的文库中所捕获到的峰(peak)数远高于原流程，几乎是现有技术的两倍；且从对具体峰的比对可以看出，利用现有技术捕获到的3742个峰中，利用本申请的方法所构建的文库所能捕获到的峰的数目占了3040个，除此之外，本申请还捕获了额外的将近3000个峰，本发明流程所捕获富集的峰(peak)真是可信。通过本发明对RNA甲基化的富集和洗脱使得所捕获的RNA更多，信息更全，且通过与现有技术的对比，本发明的信息可信，也进而证明本发明的洗脱液未对RNA洗脱造成不利影响。

此外，发明人还利用上述方法对RNA中m5C的甲基化文库进行构建，并将现有技术与本发明所构建的文库的产出数据经上述相同的处理步骤后，得到的有效测序序列，以下表16是对有效测序序列比对后的检出峰(peakcalling)的统计结果。

表16：

从表16可以看出，由于该实验采用总RNA进行实验材料进行实验，收到核糖体RNA的干扰，捕获效率偏低，且m5C甲基化在RNA甲基化中含量较低，所以也造成所检出峰较少。尽管检出峰较少，但从所检出的峰来看，仍然能看到本发明所捕获的峰是现有技术的两倍的趋势，也通过现有技术与本发明的信息交叉对比显示，本发明所捕获的峰可信。从而说明本发明确实比现有技术提高了RNA的得率，且信息数据可信。

从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：通过优化打断条件，使得片段大小更加适用于现在的高通量测序，通过用蛋白酶K将抗体进行消化，使得捕获的RNA片段从蛋白A磁珠上解离下来，再进行收集提取。该方法与原流程相比主要节省了m⁶A等甲基化位点类似物的购买成本，且提高了洗脱效率，使得有效数据大大提高。同时，避免了m⁶A等甲基化位点类似物的干扰，降低了实验过程中的噪音，使得后期信息分析更为简单、有效。此外，将酚氯仿的提取方式改进为TRizol和氯仿抽提的方式，也在最大效率地获得富集后的RNA片段方面有较大贡献。基于以上几个方面，上述实施例能够在节约成本，降低实验噪音，提高文库质量各方面均有较大改善。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种RNA甲基化测序文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：

步骤S1，对RNA样品进行片段化，得到片段化RNA；

步骤S2，利用RNA甲基化特异性抗体对所述片段化RNA进行免疫共沉淀，得到沉淀物；

步骤S3，利用蛋白酶对所述沉淀物进行消化，得到消化物；

步骤S4，从所述消化物中提取RNA并对提取的RNA进行逆转录，得到cDNA；以及

步骤S5，利用所述cDNA进行测序文库构建，得到所述RNA甲基化测序文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述蛋白酶选择蛋白酶K、木瓜蛋白酶或者胃蛋白酶。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，采用化学法对所述RNA进行片段化，得到所述片段化RNA。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述片段化RNA的长度为50～200nt。

5.根据权利要求3或4中任一项所述的构建方法，其特征在于，采用含Zn²⁺的盐溶液对所述RNA进行片段化。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述含Zn²⁺的盐溶液中Zn²⁺的摩尔浓度为5～10mol/L。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述RNA甲基化特异性抗体为特异识别RNA中m⁷G、N_m、m⁵C、m⁶A以及m⁶A_m中任一种甲基化的抗体。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述步骤S4中，从所述消化物中提取RNA的步骤包括采用trizol和氯仿对所述消化物进行抽提，得到上清RNA的步骤。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述trizol和氯仿的体积比为4～6：1。

10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，从所述消化物中提取RNA的步骤在得到所述上清RNA的步骤后，还包括：用醋酸钠和异丙醇对所述上清RNA进行沉淀过夜，得到所述提取的RNA。