CN104062334A

CN104062334A - 一种针对dna甲基化监测的定量分析方法

Info

Publication number: CN104062334A
Application number: CN201410328685.2A
Authority: CN
Inventors: 林振宇; 魏晓峰; 马小明; 郭隆华; 邱彬; 陈国南
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2014-07-11
Filing date: 2014-07-11
Publication date: 2014-09-24

Abstract

本发明公开一种针对DNA甲基化监测的定量分析方法，包括如下步骤：（1）根据DNA甲基化回文序列设计发夹型DNA次级结构，并在该结构上修饰亚甲基蓝电活性物质；（2）将发夹型DNA与甲基转移酶、甲基化腺苷共同反应，合成甲基化的发夹型DNA；（3）用DpnI酶特异性地酶解DNA甲基化位点，释放出连接有亚甲基蓝的DNA碎片；（4）用带负电的ITO微电极芯片进行样品监测，多通路电信号读取装置收集电化学信号；（5）记录监测结果。该方法具有操作简易、便携低廉、不需要对电极进行复杂修饰等优点；（6）在DNA甲基化过程加入抑制甲基化药物，进行DNA甲基化抑制剂的药物筛选。

Description

一种针对DNA甲基化监测的定量分析方法

技术领域

本发明涉及一种针对DNA甲基化水平监测的电化学定量分析方法，属于电化学定量分析方法技术领域。

背景技术

DNA甲基化是指在甲基转移酶的催化作用下，甲基基团从腺苷蛋氨酸中转移至具有特殊序列DNA的腺嘌呤或者胞嘧啶核苷酸上，常见于基因5’-CpG-3’， 5’-G-A-T-C-3’序列等，甲基化后分别形成5’-mCpG-3’和5’-G-mA-T-C-3’。在表观遗传学研究当中，DNA甲基化是最早被发现的基因修饰途径之一。DNA的甲基化对原核/真核生物起到了基因保护作用，并且影响着哺乳动物的基因转录和复制，以及胚胎的形成和发育。而对于人类而言，DNA甲基化畸变会抑制DNA的转录，使得DNA表达失控，进而引起一系列机体病变。因此，DNA甲基化的监测对其相关的癌症早期诊断和辅助治疗具有极大的临床意义。（1、Goren, A.; Cedar, H. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.2003, 4,25-32；2、Bernstein, B. E.; Meissner, A.; Lander, E. S.Cell2007, 128, 669-681；3、Jones, P. A.; Baylin, S. B.Cell2007, 128, 683-692）。

到目前为止，各种检测手段都被应用与DNA甲基化水平的检测和监测。市场上比较成熟的方法主要有甲基化特异性酶联免疫法（methylation-specific polymerase chain reaction/MSP）；亚硫酸盐测序法（bisulfite sequencing polymerase chain reaction/BSP）和甲基化特异性及限制性酶联用酶联免疫法（methylation-specific restriction enzyme polymerase chain reaction/MS-RE-PCR）等。但这些方法都是基于亚硫酸盐处理或者酶联免疫试验的基础上进行的DNA甲基化检测，该类方法检测耗时长，检测工序繁琐，一定程度上限制了DNA甲基化检测的临床价值。因此，有必要开发出适应DNA甲基化监测需求的新方法，以实现该指标对疾病诊断的预测和临床治疗的辅助。（4、Herman, J. G.; Graff, J. R.; Myohanen, S.; Nelkin, B. D.; Baylin, S. B. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.1996, 93, 9821-9826；5、Frommer, M.; McDonald, L. E.; Millar, D. S.; Collis, C. M.; Watt, F.; Grigg, G. W.; Molloy, P. L.; Paul, C. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.1992, 89, 1827-1831；6、Hughes, S.; Jones, J. L.BMC Mol. Biol.2007, 8,91-97）。

发明内容

本发明针对现有DNA甲基化检测手段繁复，单体样品耗用量大等问题，提出一种基于免修饰ITO微芯片的灵敏，便携，操作简易且耗样量少的电化学定量监测方法。

本发明的技术方案为：

一种针对DNA甲基化监测的定量分析方法，包括如下步骤：

（1）根据DNA甲基化回文序列设计发夹型DNA次级结构，并在该结构上修饰亚甲基蓝电活性物质；

（2）将发夹型DNA与甲基转移酶、甲基化腺苷共同孵育，即进行DNA甲基化反应，合成甲基化的发夹型DNA；

（3）用Dpn I酶特异性地酶解DNA甲基化位点，释放出连接有亚甲基蓝的DNA碎片；

（4）用带负电的ITO微电极进行样品监测，多通路电信号读取装置收集电化学信号；

（5）根据电化学工作站的电化学信号，记录监测结果；

（6）根据DNA甲基化的作用机理，在DNA甲基化过程加入抑制甲基化药物进行DNA甲基化抑制剂的药物筛选。

其中，步骤（1）中设计有修饰了亚甲基蓝并包含DNA甲基化回文序列的发夹型DNA次级结构。

其中，步骤（2）中的发夹型DNA，甲基转移酶（Dam MTase），甲基化腺苷（SAM）的终浓度分别为1-100 μM，0-70 U/μl，50-500μM。

其中，步骤（2）DNA甲基化反应中，在缓冲液中进行，使用的缓冲液体系为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

其中，步骤（3）中Dpn I酶的终浓度为5-50 U/μL。

其中，步骤（4）中带负电的ITO微电极的制作，具体步骤如下：（1）通过光刻技术和金属喷镀技术加工成三电极体系集成的ITO微电极芯片；（2）将芯片浸泡在Alconox溶液中15分钟，再用异丙醇浸泡15分钟；（3）最后用二次水浸泡清洗3次，每次15分钟，自然晾干，储存备用。

其中，步骤（4）中的DNA甲基化监测，具体步骤如下：（1）将含有甲基化回文序列的发夹型DNA次级结构，（S-adenosyl-L-methiolnine/SAM）甲基化腺苷、（DTT）二硫苏糖醇和（Dam MTase）腺嘌呤甲基化转移酶和Dpn I酶混合，在Tris-HCl缓冲体系中37℃下反应；（2）每隔10分钟取样 2 μL （6份），分别滴加到ITO微电极芯片的检测区，用多路输出电化学工作站进行DPV示差脉冲电信号的收集。通过DPV电信号的变化趋势来监测DNA甲基化水平。

本发明的优点在于：首先，对于传统电化学检测方法，虽然具有较高的灵敏度，但电极修饰复杂且耗时，而本方法兼具了电化学检测的高灵敏度，又具备免电极修饰的特性，简化了硬件前期准备过程；

其次，利用光刻微加工技术制备的微型ITO电极芯片，成本低，便携可抛；

另外，相比于传统的三电极体系，样品试剂耗用量少，对于检测昂贵样品源或稀少样品源有极大的优势；

再者，多通路模型的设计实现了多个样品同时检测的高通量检测效果，减少了实验耗时，提高了测样效率。

附图说明

图1为带有亚甲基蓝的发夹型DNA构型图。

图2为ITO微电极芯片示意图。

图3为DNA甲基化监测原理图。

图4为药物抑制效果柱状图。

具体实施方式

实施例1 ITO微电极芯片的制作

使用CorelDraw12 软件画出芯片的二维结构，并制作掩膜板。利用软光刻技术将图形转移到ITO玻璃板上，显影去除曝光层后，将芯片置于酸蚀液（HCl:H2O:NHO3=50:50:3）中进行湿法刻蚀45 分钟，即可获得芯片的ITO工作电极结构，并去除剩余的光刻胶。再次光刻上参比电极和对电极图形于ITO玻璃板上，显影去除曝光层光刻胶后，金属溅射喷镀上金属铂层，即可获得芯片的铂参比电极和对电极结构，并去除剩余的光刻胶。用二次水冲洗微芯片并用氮气吹干。把制作好的ITO微芯片浸泡在Alconox清洁液（10 g/L）15分钟，再用异丙醇溶液浸泡15分钟，最后用二次水浸泡30分钟，即可获得带负电的ITO工作电极微芯片。图2为最终ITO微芯片的模拟示意图。

实施例2 DNA甲基化过程的监测

用10 mM的Tris-HCl缓冲液（包含10 mM的MgCl₂，50 mM的NaCl，且pH为7.5）作为溶剂混合1 μM的发夹型DNA，160 μM的SAM（甲基化腺苷），1 mM DTT（二硫苏糖醇），50 U/mL的Dam MTase（甲基转移酶）和20 U/mL的 Dpn I酶。在恒温37℃下反应，每隔10分钟取出2μL样品滴加到ITO微电极芯片的工作单元上，使用电化学工作站进行其DPV示差脉冲电信号的收集，DPV电信号的高低即表示DNA甲基化水平的高低，进而实现对DNA甲基化水平的实时监测。图3为混合反应的原理示意图，即发夹型DNA会先与SAM和Dam MTase共反应转化为甲基化的发夹型DNA，而生成的DNA甲基化位点会被Dpn I酶酶解断开，从而使得带有亚甲基蓝的片段核苷酸链接近ITO工作电极表面，得到增强的DPV电信号。因此，建立起了DNA甲基化水平和DPV电信号之间的正相关性。

实施例3 筛选DNA甲基化抑制药物

用10 mM的Tris-HCl缓冲液（包含10 mM的MgCl₂，50 mM的NaCl，且pH为7.5）作为溶剂混合1 μM的发夹型DNA，160 μM的SAM（甲基化腺苷），1 mM DTT（二硫苏糖醇），50 U/mL的Dam MTase（甲基转移酶）和待筛选药物。在水浴37℃下反应2小时使得DNA甲基化完全。再加入（20 U/mL）Dpn I酶进入样品，再反应2小时（37℃）。最后取出2 μL样品滴加到ITO微电极芯片的工作单元上，使用电化学工作站进行其DPV示差脉冲电信号的收集。倘若DPV电信号较强，说明该药品对DNA甲基化的抑制作用不明显；反之，则可筛选得较好的DNA甲基化抑制药物。根据所设计方案，使用DNA探针（序列：5’-AG GATC CCGC TTCT TTTG AAGC GGGA TCCTC-3’）对阿莫西林，青霉素，硫酸庆大霉素，氧氟沙星，氟尿嘧啶和丝裂霉素等6种药物进行筛选，结果显示青霉素，硫酸庆大霉素和氟尿嘧啶对DNA甲基化水平有接近35% ~ 50%的抑制效果，而另外三种药物没有抑制效果。图4为药物抑制效果柱状图，其中阿莫西林，氧氟沙星和丝裂霉素与无药物作用的DPV电信号相近，说明这三种药物没有起到抑制效果，而青霉素，硫酸庆大霉素和氟尿嘧啶有明显的抑制效果，其中硫酸庆大霉素的抑制效果最好，达到50% 的抑制率。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种针对DNA甲基化监测的定量分析方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> DNA探针

<400> 1

aggatcccgc ttcttttgaa gcgggatcct c 31

Claims

1.一种针对DNA甲基化监测的定量分析方法，其特征在于：包括如下步骤：

（2）将发夹型DNA与甲基转移酶、甲基化腺苷共同反应，即进行DNA甲基化反应，合成甲基化的发夹型DNA；

（4）用带负电的ITO微电极芯片进行样品监测，多通路电信号读取装置收集电化学信号；

（5）根据电化学工作站的电化学信号，记录监测结果；

（6）根据DNA甲基化的作用机理，在DNA甲基化过程加入抑制甲基化药物，进行DNA甲基化抑制剂的药物筛选。

2.根据权利要求1所述的一种针对DNA甲基化监测的定量分析方法，其特征在于：步骤（1）中的修饰有亚甲基蓝并包含DNA甲基化回文序列的发夹型DNA次级结构设计。

3.根据权利要求1所述的一种针对DNA甲基化监测的定量分析方法，其特征在于：步骤（2）中的发夹型DNA，甲基转移酶（Dam MTase），甲基化腺苷（SAM）的终浓度分别为1-100 μM，0-70 U/μl，50-500μM。

4.根据权利要求1所述的一种针对DNA甲基化监测的定量分析方法，其特征在于：步骤（2）DNA甲基化反应中，在缓冲液中进行，使用的缓冲液体系为磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。

5.根据权利要求1所述的一种针对DNA甲基化监测的定量分析方法，其特征在于：步骤（3）中Dpn I酶的终浓度为5-50 U/μL。

6.根据权利要求1所述的一种针对DNA甲基化监测的定量分析方法，其特征在于：步骤（4）中带负电的ITO微电极的制作，包括如下步骤：（1）通过光刻技术和金属喷镀技术加工成三电极体系集成的ITO微电极芯片；（2）将芯片浸泡在Alconox溶液中15 分钟，再用异丙醇浸泡15 分钟；（3）最后用二次水浸泡清洗3次，每次15 分钟，自然晾干，储存备用。

7.根据权利要求1所述的一种针对DNA甲基化监测的定量分析方法，其特征在于：步骤（4）中的DNA甲基化监测，包括如下步骤：（1）将含有甲基化回文序列的发夹型DNA次级结构，甲基化腺苷、二硫苏糖醇和腺嘌呤甲基化转移酶和Dpn I酶混合，在Tris-HCl缓冲体系中37℃下反应；（2）每隔10分钟取样 2 μL ，取6份，分别滴加到ITO微电极芯片的检测区，用多路输出电化学工作站进行DPV示差脉冲电信号的收集，通过DPV电信号的变化趋势来监测DNA甲基化水平。

8.一种如权利要求1所述的一种针对DNA甲基化监测的定量分析方法在DNA甲基化抑制剂的药物筛选上的应用。