CN110273028A - 病毒整合型dna的富集方法、测序数据分析方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种病毒整合型DNA的富集方法、测序数据分析方法和装置。本申请的富集方法包括引物杂交和延伸步骤、磁珠分离和洗涤步骤；本申请的测序数据分析方法包括数据过滤步骤、拼接组装步骤、比对和断点判断步骤和基因注释步骤。本申请富集方法，采用特异性引物对病毒基因组靶标基因进行延伸，替换长探针，成本低，效率高、特异性强，缩短了富集时间。本申请的测序数据分析方法，与全基因组对比，节省数据量，能获得更高测序深度；获得更多病毒DNA断点信息，及在宿主基因组上的整合位置信息；不仅能获得由多reads支持的克隆性整合事件，而且能同时检测到单reads支持的非克隆性整合，构建病毒在宿主基因组上整合的全面图景。

Description

病毒整合型DNA的富集方法、测序数据分析方法和装置
技术领域
本申请涉及病毒整合型DNA检测技术领域，特别是涉及一种病毒整合型DNA的富集方法、测序数据分析方法和装置。
背景技术
致瘤性DNA病毒，或称DNA致瘤病毒，可以引起人类和动物肿瘤。已经明确是人类恶性肿瘤发生发展的关键因子的DNA致瘤病毒包括乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)、人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)、非洲淋巴细胞瘤病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)和卡波济肉瘤相关疱疹病毒((Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus，KSHV)等。致瘤性DNA病毒普遍具有一种导致细胞癌变的手段，那就是病毒DNA在宿主细胞基因组上的整合，形成新的病毒整合型DNA。
病毒DNA整合到宿主细胞基因组上能够引起宿主细胞基因组不稳定性，导致宿主细胞基因组结构出现染色体缺失、易位和重排等异常，从而使正常细胞向肿瘤细胞转化。因此，对病毒整合型DNA进行研究在揭示癌症发生机制以及研发肿瘤早期筛查和诊断技术等领域有积极作用。
对病毒整合型DNA的研究方法，主要有PCR、QPCR、酶切、高通量测序。除了高通量测序之外，其他三种方法均存在操作繁琐、通量低、无法准确定位病毒整合的位点、无法定量整合拷贝数等不足。高通量测序是目前研究病毒整合型DNA最合适的方法，然而，全基因组测序成本高昂、数据量大、分析繁琐。因此，最佳策略是对高通量测序的预文库进行病毒整合型DNA的靶向富集，然后进行测序分析。在高通量测序领域，应用最广泛的文库靶向富集技术是探针杂交捕获技术，但探针成本较高、杂交时间长、特异性不足等缺陷，极大的制约其在病毒整合型DNA高通量测序研究中的应用。同时，病毒基因组DNA和人类基因组DNA的杂合片段，在测序数据处理分析上也比较繁琐。
因此，对于基于高通量测序的病毒整合型DNA研究亟需一种低成本、高效率、高特异性的病毒整合型DNA富集方法以及准确高效的数据分析方案。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的病毒整合型DNA的富集方法、测序数据分析方法，以及基于以上方法的专用装置。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种病毒整合型DNA的富集方法，包括以下步骤，引物杂交和延伸步骤，包括采用引物混合物对DNA样品进行退火、延伸；引物混合物由针对病毒基因组靶标基因设计的特异性引物组成，在病毒基因组靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，使得引物混合物能够覆盖整个靶标基因，并且特异性引物的5’端具有生物素修饰；磁珠分离和洗涤步骤，包括采用链霉亲和素修饰的磁珠，对引物杂交和延伸步骤的延伸产物进行捕获，并通过磁珠将生物素修饰的特异性引物以及相应的靶标基因分离，洗涤去除非靶标基因，即获得靶向富集的病毒基因组靶标基因。
需要说明的是，本申请的病毒整合型DNA富集方法，其原理还是利用预先设计的特异性引物，对病毒基因组靶标基因进行杂交捕获；但是，不同于现有的探针杂交捕获，本申请设计的是特异性引物。一方面，本申请的特异性引物是在靶标基因区域内间隔一定距离设计的，即间隔50-200bp，对于相同大小的病毒基因组靶标基因，本申请的方法所采用的特异性引物的数量大大小于探针杂交捕获方法的探针数量；另一方面，本申请利用特异性引物的延伸，可以采用较短的特异性引物捕获较长的靶标区域，而不需要设计长探针，大大降低了成本；此外，本申请的方法通过特异性引物的退火、延伸实现病毒基因组靶标基因的特异性杂交捕获，单就杂交捕获来说，在本申请的一种实现方式中，仅仅需要8分钟即可完成，提高了杂交捕获的效率。
可以理解，本申请的引物混合物是由多条特异性引物组成的，这些特异性引物是间隔设计于靶标基因上的同一扩增方向的引物，例如，都是上游引物或者都是下游引物。本申请的方法中，引物杂交和延伸步骤的目的并非是对病毒基因组靶标基因进行指数倍的PCR扩增，其目的仅仅是能够更好更完整的杂交捕获靶标基因，因此，所有特异性引物的扩增方向相同，能够最大限度的保障各条特异性引物延伸后对靶标基因的覆盖度。本申请方法中的对DNA样品进行退火、延伸，
实际上就是在退火温度下，保温一定时间，使特异性引物杂交到靶标基因上，然后在延伸温度下保温一定时间，使特异性引物沿靶标基因延伸即可；其中，所采用的试剂，例如酶、缓冲液，以及反应条件都可以参考常规PCR进行，例如延伸温度通常为72℃；所不同的是，本申请的引物杂交和延伸步骤中没有循环扩增的设计。
优选的，本申请的方法还包括测序文库扩增步骤，其中，测序文库扩增步骤包括采用文库构建引物对靶向富集的病毒基因组靶标基因进行PCR扩增，获得用于高通量测序的测序文库。
需要说明的是，测序文库扩增步骤是针对高通量测序而言的，实际上，本申请的方法中，经过引物杂交和延伸步骤和磁珠分离和洗涤步骤，即可完成对病毒基因组靶标基因的靶向富集；但是，如果需要继续进行后续的高通量测序，则通常需要测序文库扩增步骤。本申请的方法中，测序文库扩增步骤的最终目的是采用文库构建引物，对富集的靶标基因进行PCR扩增，获得可以直接用于高通量测序的文库。一般来说，如果引物杂交和延伸步骤处理的DNA样品是预文库样品，则测序文库扩增步骤，直接采用通用引物扩增富集产物即可；其中，预文库样品是指经过常规的片段处理、末端修复和加接头等处理的DNA样品。如果，引物杂交和延伸步骤处理的DNA样品不是预文库样品，则测序文库扩增步骤还需要包括对富集的靶标基因的DNA片段进行加接头等操作，然后再进行PCR扩增获得测序文库。至于DNA片段处理、末端修复、加接头等的具体方法可以参考现有的文库构建方法，在此不作具体限定。
优选的，特异性引物的长度不小于10碱基。
优选的，特异性引物的长度为15-25碱基。
需要说明的是，特异性引物的长度一方面需要考虑其特异性，另一方面需要考虑合成成本。可以理解，特异性引物的长度越长其特异性越好，但是，相应的合成成本高，难以体现与长探针的区别。因此，在保障特异性的情况下，本申请提出特异性引物的长度不小于10碱基，即特异性引物的长度可以做到最小10碱基，这样既能够保障特异性，又能够降低成本。
优选的，对DNA样品进行退火、延伸，具体条件为，98℃变性5分钟、65℃预杂交1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，反应结束后4℃待机。
需要说明的是，本申请的引物杂交和延伸步骤中，对DNA样品进行退火、延伸的反应体系可以参考常规的PCR扩增，只是反应条件有所不同。例如，变性后只进行一个步骤的退火和延伸，没有循环步骤；并且，在退火之前引入预杂交步骤，即65℃预杂交1分钟，使得所有的特异性引物都能够更好的结合到设计的靶标基因上。可以理解，以上反应条件只是最佳的参考，各步骤的温度和时间可以根据试验情况进行适应性的调整，例如变性温度通常在90℃以上，变性时间通常为30秒-10分钟；又例如预杂交的温度通常为60-70℃，时间为30秒-10分钟；退火的温度通常为50-60℃，时间为30秒-2分钟；延伸通常都是65-75℃延伸1-10分钟。反应结束后的待机温度只是为了更好的保存反应产物，通常是4℃，或者可以不用该待机温度，直接在反应结束后，立即取出存放于4℃左右的冰箱内备用。
本申请的另一面公开了一种病毒整合型DNA的富集装置，包括引物杂交和延伸模块和磁珠分离和洗涤模块；引物杂交和延伸模块，包括用于采用引物混合物对DNA样品进行退火、延伸；引物混合物由针对病毒基因组靶标基因设计的特异性引物组成，在病毒基因组靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，使得引物混合物能够覆盖整个靶标基因，并且特异性引物的5’端具有生物素修饰；磁珠分离和洗涤模块，包括用于采用链霉亲和素修饰的磁珠，对引物杂交和延伸模块获得的延伸产物进行捕获，并通过磁珠将生物素修饰的特异性引物以及相应的靶标基因分离，洗涤去除非靶标基因，即获得靶向富集的病毒基因组靶标基因。
优选的，本申请的富集装置还包括测序文库扩增模块，测序文库扩增模块包括用于采用文库构建引物对靶向富集的病毒基因组靶标基因进行PCR扩增，获得用于高通量测序的测序文库。
需要说明的是，本申请的富集装置，实际上就是通过各个模块实现本申请的病毒整合型DNA的富集方法中的各个步骤，以实现病毒基因组靶标基因的自动化富集。其中，引物杂交和延伸模块和测序文库扩增模块，其核心就在于通过温度控制实现引物杂交和延伸步骤的退火、延伸，以及测序文库扩增步骤的PCR扩增，其结构类似于恒温仪或PCR仪；磁珠分离和洗涤模块，其核心在于通过磁力架将磁珠吸附沉淀，使其分离，配套的还可以设置，例如振荡、搅拌混匀或超声波混匀等组件，用于自动实现磁珠的重悬等操作。至于样品或试剂的添加等操作可以参考现有的自动加样系统，试管的移动可以采用常规的机械臂，在此不作具体限定。
本申请的再一面还公开了一种病毒整合型DNA的测序数据分析方法，包括以下步骤，数据过滤步骤，包括对双端测序的原始数据进行数据过滤，去除接头序列和质量不合格碱基，获得干净数据；拼接组装步骤，包括将有R1和R2重合的reads组装成长片段reads；比对和断点判断步骤，包括将组装的长片段reads比对到病毒和人的混合参考基因组上，从比对结果中提取能同时部分比对到人和病毒基因组的soft clip reads，确定soft clipreads的断点位置；基因注释步骤，包括将断点位置同时进行人和病毒基因组的基因注释。
其中，病毒和人的混合参考基因组是指由人标准参考基因组和病毒基因组混合而成的，作为参考基因的混合基因组数据；基因注释时，是分别将断点位置注释到人基因组上和病毒基因组上。
需要说明的是，本申请的病毒整合型DNA测序数据分析方法，将双端测序结果过滤、拼接后与全基因组序列比对，不仅大大节省了数据量，而且能够获得更高的测序深度，采用本申请的测序数据分析方法能够获得更多的病毒DNA断点信息，以及在宿主基因组上的整合位置信息，能够对病毒基因组进行超高深度测序，不仅可以获得由多reads支持的克隆性整合事件，而且能够同时检测到单reads支持的非克隆性整合，从而构建出病毒在宿主基因组上整合的全面图景，可进一步作为生物标志物应用到临床。
本申请的再一面还公开了一种病毒整合型DNA的测序数据分析装置，包括数据过滤模块、拼接组装模块、比对和断点判断模块和基因注释模块；数据过滤模块，包括用于对双端测序的原始数据进行数据过滤，去除接头序列和质量不合格碱基，获得干净数据；拼接组装模块，包括用于将有R1和R2重合的reads组装成长片段reads；比对和断点判断模块，包括用于将组装的长片段reads比对到病毒和人的混合参考基因组上，从比对结果中提取能同时部分比对到人和病毒基因组的soft clip reads，确定soft clip reads的断点位置；基因注释模块，包括用于将断点位置同时进行人和病毒基因组的基因注释。
需要说明的是，本申请的病毒整合型DNA测序数据分析装置，实际上就是通过各模块实现本申请的病毒整合型DNA测序数据分析方法，从而实现测序数据的自动化分析。
本申请的再一面还公开了一种致瘤性DNA病毒的检测装置，包括预文库构建模块、病毒整合型DNA富集模块、测序模块和测序数据分析模块；预文库构建模块，包括用于对提取的核酸依序进行片段化处理、末端修复和加“A”处理、加接头处理和连接产物纯化处理，获得片段化并且具有接头序列的预文库；病毒整合型DNA富集模块，包括用于根据本申请的病毒整合型DNA的富集方法，或者本申请的病毒整合型DNA的富集装置，对预文库的DNA样品进行病毒基因组靶标基因富集；测序模块，包括用于对富集的病毒基因组靶标基因进行双端测序；测序数据分析模块，包括用于根据本申请的病毒整合型DNA的测序数据分析方法，或者采用本申请的病毒整合型DNA的测序数据分析装置，对双端测序的原始数据进行分析。
需要说明的是，本申请的致瘤性DNA病毒检测装置，实际上就是将本申请的病毒整合型DNA富集方法或装置，与本申请的病毒整合型DNA的测序数据分析方法或装置，组合在一起，实现完整的致瘤性DNA病毒检测。
优选的，本申请的致瘤性DNA病毒检测装置还包括核酸提取模块，包括用于对待测对象进行核酸提取。
可以理解，核酸提取模块的作用是使得本申请的致瘤性DNA病毒检测装置能够更好的自动化的实现致瘤性DNA病毒检测，核酸提取模块可以参考现有的自动化核酸提取装置。
本申请的再一面还公开了本申请的富集方法或本申请的富集装置或本申请的测序数据分析方法或本申请的测序数据分析装置或本申请的检测装置在制备乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒或卡波济肉瘤相关疱疹病毒检测试剂盒或装置中的应用。
可以理解，本申请的最终目的是实现病毒整合型DNA的检测和研究，因此，本申请的所有方法或装置都可以用于乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒或卡波济肉瘤相关疱疹病毒的检测和研究，用于制备专门用于各病毒检测的试剂盒或装置。其中，试剂盒可以是包含本申请的富集方法或核酸提取或测序中所使用的全部试剂，以方便使用。
可以理解，本申请病毒整合型DNA的富集方法或病毒整合型DNA的测序数据分析方法，其全部或部分功能可以通过硬件的方式实现，也可以通过计算机程序的方式实现。当通过计算机程序的方式实现时，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘、光盘、硬盘等，通过计算机执行该程序以实现本申请的方法。例如，将程序存储在设备的存储器中，当通过处理器执行存储器中程序，即可实现本申请的方法。当本申请的方法中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序也可以存储在服务器、另一计算机、磁盘、光盘、闪存盘或移动硬盘等存储介质中，通过下载或复制保存到本地设备的存储器中，或对本地设备的系统进行版本更新，然后在处理器执行存储器中的程序时，即可实现本申请方法的全部或部分功能。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的病毒整合型DNA的富集方法，采用特异性引物对病毒基因组靶标基因进行延伸，替换长探针，不仅成本低，而且效率高、特异性强，大大缩短了富集反应时间。基于本申请富集方法的测序数据分析方法，与全基因组测序对比，不仅节省了大量数据量，能获得更高测序深度；而且能获得更多病毒DNA的断点信息，以及在宿主基因组上的整合位置信息。更高的测序深度不仅能获得由多reads支持的克隆性整合事件，而且能同时检测到单reads支持的非克隆性整合，从而构建出病毒在宿主基因组上整合的全面图景，为病毒整合型DNA研究提供了一种准确高效的数据分析方案。
附图说明
图1是本申请实施例中病毒整合型DNA的富集方法的流程框图；
图2是本申请实施例中病毒整合型DNA的富集装置的结构框图；
图3是本申请实施例中病毒整合型DNA的测序数据分析方法的流程框图；
图4是本申请实施例中病毒整合型DNA的测序数据分析装置的结构框图；
图5是本申请实施例中致瘤性DNA病毒的检测方法的流程框图；
图6是本申请实施例中致瘤性DNA病毒的检测装置的结构框图。
具体实施方式
目前比较常规的测序文库富集方法是探针杂交法，但是，探针杂交法为了保障对靶标基因的覆盖度，需要采用数量繁多的探针，并且，探针长度较长，每条探针通常需要60-120碱基的长度，甚至更长。
本申请创造性的提出，在病毒基因组靶标基因上间隔一定距离，例如间隔50-200bp，设计特异性引物，利用引物延伸替代长探针，其中，特异性引物的长度可以做到最小10碱基，本申请的一种实现方式中具体为15-25碱基，不仅比长探针更短，而且采用间隔设置，对于相同大小的靶标基因，在保障靶标基因的覆盖度的情况下，特异性引物的数量也比探针的数量更少，大大节约了合成成本。而且，本申请利用特异性引物延伸替换长探针，整个富集反应仅需要约8分钟即可完成，即本申请方法中的引物杂交和延伸步骤，提高了靶标基因的富集效率。
基因以上研究和认识，本申请提出了一种病毒整合型DNA的富集方法，如图1所示，包括引物杂交和延伸步骤11、磁珠分离和洗涤步骤12，以及特别针对测序文库构建的测序文库扩增步骤13。
其中，引物杂交和延伸步骤11，包括采用引物混合物对DNA样品进行退火、延伸；所述引物混合物由针对病毒基因组靶标基因设计的特异性引物组成，在病毒基因组靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，使得引物混合物能够覆盖整个靶标基因，并且特异性引物的5’端具有生物素修饰。
本申请的一种实现方式中，退火、延伸具体采用购自赛默飞世尔科技有限公司的AmpliTaqDNAPolymerase和PCR Buffer II，反应体系中加入dNTP Mix和MgCl2，并补充水至50μL，各组分具体用量参考现有的常规PCR。反应条件为，98℃变性5分钟、65℃预杂交1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，反应结束后4℃待机。本申请在靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，每条特异性引物至少包含10个碱基，一般为15-25碱基，相对于现有的数量繁多的长探针杂交捕获，本申请的方法可以采用短且数量少的特异性引物完整的覆盖靶标基因，保障靶标基因的富集质量和完整性。
磁珠分离和洗涤步骤12，包括采用链霉亲和素修饰的磁珠，对所述引物杂交和延伸步骤的延伸产物进行捕获，并通过磁珠将生物素修饰的特异性引物以及相应的靶标基因分离，洗涤去除非靶标基因，即获得靶向富集的病毒基因组靶标基因。
本申请的一种实现方式中，具体采用Invitrogen的DynabeadsTM M-270Streptavidin磁珠进行靶标基因的分离，磁珠预先采用生物素和链霉亲和素反应的结合缓冲液洗涤，然后将磁珠重悬于该结合缓冲液中，与引物杂交和延伸步骤的产物室温孵育约30分钟，在按照磁珠试剂盒的提供的洗涤试剂和方法对磁珠进行漂洗，最终用ddH2O重悬磁珠，即获得靶标基因。
测序文库扩增步骤13，包括采用文库构建引物对靶向富集的病毒基因组靶标基因进行PCR扩增，获得用于高通量测序的测序文库。
本申请的一种实现方式中，具体采用的是购自KAPABiosystems公司的引物、酶和反应液，用于测序文库构建。具体的，缓冲液为2×KAPAHiFi HotStart ReadyMix，文库构建引物为10×LibraryAmplification PrimerMix。反应条件为，98℃预变性45秒，然后进入15个循环：98℃变性15秒、60℃退火30秒、72℃延伸30秒，循环结束后72℃延伸1分钟，最后4℃待机。反应结束即获得测序文库，可直接上机测序。
基于本申请的病毒整合型DNA富集方法，本申请进一步提出了一种病毒整合型DNA的富集装置，如图2所示，该装置包括引物杂交和延伸模块21、磁珠分离和洗涤模块22和测序文库扩增模块23。引物杂交和延伸模块21，包括用于采用引物混合物对DNA样品进行退火、延伸；所述引物混合物由针对病毒基因组靶标基因设计的特异性引物组成，在病毒基因组靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，使得引物混合物能够覆盖整个靶标基因，并且特异性引物的5’端具有生物素修饰；磁珠分离和洗涤模块22，包括用于采用链霉亲和素修饰的磁珠，对引物杂交和延伸模块获得的延伸产物进行捕获，并通过磁珠将生物素修饰的特异性引物以及相应的靶标基因分离，洗涤去除非靶标基因，即获得靶向富集的病毒基因组靶标基因；测序文库扩增模块23包括用于采用文库构建引物对靶向富集的靶标基因进行PCR扩增，获得用于高通量测序的测序文库。
本申请的病毒整合型DNA的富集方法和装置，其目的是为了获得富集的病毒基因组靶标基因，以用于高通量测序分析。基于本申请的病毒整合型DNA的富集方法和装置，本申请进一步提出了一种病毒整合型DNA的测序数据分析方法，如图3所示，包括数据过滤步骤31、拼接组装步骤32、比对和断点判断步骤33和基因注释步骤34。
数据过滤步骤31，包括对双端测序的原始数据进行数据过滤，去除接头序列和质量不合格碱基，获得干净数据。
本例的一种实现方式中，具体采用fastp软件的质量过滤功能进行数据过滤，获得干净数据。
拼接组装步骤32，包括将有R1和R2重合的reads组装成长片段reads。
本例的一种实现方式中，具体利用fastp软件的双端测序reads merge功能进行R1和R2reads的拼接与组装。
比对和断点判断步骤33，包括将组装的长片段reads比对到病毒和人的混合参考基因组上，从比对结果中提取能同时部分比对到人和病毒基因组的soft clip reads，确定soft clip reads的断点位置。
本例的一种实现方式中，具体通过将病毒基因组和人类基因组的fasta文件进行合并，通过bwa index功能构建病毒和人的混合参考基因组；然后再利用BWAmem功能进行序列比对，从比对结果中提取能同时部分比对到人类和病毒基因组的soft clip reads，确定它们的断点位置；例如，可以根据比对结果sam文件中第三列、第四列、第六列和SA标签进行综合判定和信息提取。
基因注释步骤34，包括将断点位置同时进行人和病毒基因组的基因注释。
本例的一种实现方式中，具体利用annovar软件的基因注释功能将断点位置进行人和病毒基因组的基因注释。
基于本申请的病毒整合型DNA的测序数据分析方法，本申请进一步提出了一种病毒整合型DNA的测序数据分析装置，如图4所示，包括数据过滤模块41、拼接组装模块42、比对和断点判断模块43和基因注释模块44。数据过滤模块41，包括用于对双端测序的原始数据进行数据过滤，去除接头序列和质量不合格碱基，获得干净数据；拼接组装模块42，包括用于将有R1和R2重合的reads组装成长片段reads；比对和断点判断模块43，包括用于将组装的长片段reads比对到病毒和人的混合参考基因组上，从比对结果中提取能同时部分比对到人和病毒基因组的soft clip reads，确定soft clip reads的断点位置；基因注释模块44，包括用于将断点位置同时进行人和病毒基因组的基因注释。
基于本申请的病毒整合型DNA的富集方法和装置，以及本申请的病毒整合型DNA的测序数据分析方法和装置，本申请进一步提出了一种致瘤性DNA病毒的检测方法，如图5所示，包括核酸提取步骤51、预文库构建步骤52、病毒整合型DNA富集步骤53、测序模块54和测序数据分析步骤55。核酸提取步骤51，包括对待测对象进行核酸提取。预文库构建步骤52，包括对提取的核酸依序进行片段化处理、末端修复和加“A”处理、加接头处理和连接产物纯化处理，获得片段化并且具有接头序列的预文库。病毒整合型DNA富集步骤53，包括根据本申请的病毒整合型DNA的富集方法，或者采用本申请的病毒整合型DNA的富集装置，对预文库的DNA样品进行病毒基因组靶标基因富集。测序步骤54，包括用于对富集的病毒基因组靶标基因进行双端测序。测序数据分析步骤55，包括用于根据本申请的病毒整合型DNA的测序数据分析方法，或者采用本申请的病毒整合型DNA的测序数据分析装置，对双端测序的原始数据进行分析。
本申请进一步提出了一种致瘤性DNA病毒的检测装置，如图6所示，包括核酸提取模块61、预文库构建模块62、病毒整合型DNA富集模块63、测序模块64和测序数据分析模块65。
核酸提取模块61，包括用于对待测对象进行核酸提取。该模块可以参考现有的核酸自动化提取装置，将其整合到本申请的致瘤性DNA病毒检测装置中。
预文库构建模块62，包括用于对提取的核酸依序进行片段化处理、末端修复和加“A”处理、加接头处理和连接产物纯化处理，获得片段化并且具有接头序列的预文库。该模块可以参考现有的自动加样装置以及PCR仪实现各处理的具体反应。
病毒整合型DNA富集模块63，包括用于根据本申请的病毒整合型DNA的富集方法，或者采用本申请的病毒整合型DNA的富集装置，对预文库的DNA样品进行病毒基因组靶标基因富集。该模块实际上就是将本申请的病毒整合型DNA的富集装置整合到本申请的致瘤性DNA病毒检测装置中。
测序模块64，包括用于对富集的病毒基因组靶标基因进行双端测序。该模块可以参考现有的自动测序设备。
测序数据分析模块65，包括用于根据本申请的病毒整合型DNA的测序数据分析方法，或者采用本申请的病毒整合型DNA的测序数据分析装置，对双端测序的原始数据进行分析。该模块实际上就是将本申请的病毒整合型DNA的测序数据分析装置整合到本申请的致瘤性DNA病毒检测装置中。
下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例根据病毒基因组序列信息设计并人工合成特异性引物，即捕获引物；捕获引物与待富集的二代测序预文库进行富集反应，反应结束后用亲和链霉素磁珠吸附杂交产物，并通过漂洗液清洗除去非特异吸附的核酸。吸附有杂交产物的磁珠进行POST-PCR，然后上机测序。数据下机后，将双端测序的原始数据进行数据过滤，去除接头序列和质量不合格碱基，获得干净数据；然后进行R1和R2reads的拼接与组装，将有R1和R2重合的reads组装成长片段reads；再构建病毒和人的混合参考基因组，进一步进行BWA比对；从比对结果中提取能同时部分比对到人和病毒基因组的soft clip reads，确定它们的断点位置；最后将断点位置同时进行人和病毒基因组的基因注释。详细如下：
一、特异性引物设计与合成
本例的特异性引物根据靶标基因的序列设计，与靶标基因互补配对，具体的，在靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，每条特异性引物至少包含10个碱基，并且引物的5’端带有生物素修饰。
将本例的所有特异性引物混合在一起作为引物混合物使用，原则上所有特异性引物的退火温度要保持一致，例如在58℃左右1-2℃的范围内，以确保在退火步骤，所有特异性引物都能够结合到靶标基因上。
本例进行试验的预文库是将待测的基因组DNA打断至主峰200bp左右的片段后，经过末端修复、加接头、片段筛选和文库预扩增后获得的预文库。
二、富集反应
采用引物混合物对DNA样品进行退火、延伸，本例具体采用的AmpliTaqDNAPolymerase、PCR Buffer II均购自赛默飞世尔科技有限公司。50μL的反应体系包括：AmpliTaqDNAPolymerase 0.25μL、预文库DNA样品1ng-3μg、10pmol的引物混合物5μL、10×PCR Buffer II 5μL、10mM的dNTP Mix 1μL、25mM的MgCl23μL，补充ddH2O至50μL。
配制好的反应体系在热循环仪中进行反应，具体反应条件为：98℃变性5分钟、65℃预杂交1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，反应结束后4℃待机。
三、磁珠分离纯化
1.磁珠预处理
本例采用购自Invitrogen的DynabeadsTM M-270Streptavidin磁珠。磁珠预处理包括以下步骤：
a.在涡旋混匀仪上重悬M-270磁珠，每个反应样品加入50μL磁珠至新的离心管中。
b.各加入200μL结合缓冲液，用移液器吹打或涡旋仪混匀磁珠，将离心管放置在磁力架上，等待1分钟后，吸取并弃去上清液。
c.重复步骤b一次。
d.加入50μL结合缓冲液重悬磁珠。
2.磁珠分离纯化
利用链霉亲和素磁珠杂交吸附生物素修饰的特异性引物，以及与引物互补匹配的靶标基因。具体的，将“二、富集反应”的产物加入预处理后的磁珠中，混匀后室温孵育30分钟。然后进行磁珠漂洗，获得富集的靶标基因，具体如下：
a.将含有磁珠和DNA的样品管上磁力架，等待1分钟后除去上清液；
b.加入200μL漂洗缓冲液，65℃金属浴孵育2分钟，上磁力架，等待1分钟后除去上清液；
c.重复步骤b两次；
d.加入20μL的ddH2O重悬磁珠，即获得靶向富集的病毒基因组靶标基因。
四、测序文库构建
采用POST-PCR扩增靶向富集的靶标基因，获得可直接上机测序的测序文库，本例PCR使用的引物和酶反应液均购自KAPABiosystems公司。50μL的反应体系包括：2×KAPAHiFi HotStart ReadyMix 25μL、10×Library Amplification PrimerMix 5μL、吸附有靶标基因的磁珠20μL。
反应条件为：98℃预变性45秒，然后进入15个循环：98℃变性15秒、60℃退火30秒、72℃延伸30秒，循环结束后72℃延伸1分钟，最后4℃待机。
PCR反应结束后，回收PCR扩增产物，即获得测序文库。本例具体采用的是核酸纯化磁珠回收纯化PCR反应产物，磁珠使用量为1×，纯化后的测序文库溶于30μL的ddH2O中。最后，纯化后的测序文库直接上机测序即可。
五、上机测序
本例采用双端测序方案对构建的测序文库进行测序。
六、测序数据分析方法
本例应用fastp软件的质量过滤功能将双端测序的原始数据进行数据过滤，去除质量不合格碱基和接头序列，获得干净数据；然后利用fastp软件的双端测序reads merge功能进行R1和R2reads的拼接与组装，将有R1和R2重合的reads组装成长片段reads；再通过将病毒基因组和人类基因组的fasta文件进行合并，通过bwa index功能构建病毒和人的混合参考基因组，进一步利用BWAmem功能进行序列比对；从比对结果中提取能同时部分比对到人类和病毒基因组的soft clip reads，确定它们的断点位置，这可以根据比对结果sam文件中第三列、第四列、第六列和SA标签进行综合判定和信息提取；最后利用annovar软件的基因注释功能将断点位置进行人和病毒基因组的基因注释。
试验例
本例按照以上方法和步骤，对发生HBV整合的肝癌患者的基因组DNA进行靶向捕获试验，具体设计了26条引物用于HBV基因富集，每条引物长15-25个碱基。作为对比，采用常规的探针杂交法，使用605plus探针用于相同靶标基因的富集。本例采用Novaseq测序平台，对本例二代测序文库靶向快速富集方法制备的测序文库，和探针杂交法制备的测序文库进行测序和分析。
测序结果显示，本例的采用特异性引物的靶向捕获方法的HBV基因组测序深度为3261×，检测到两个多克隆整合事件和19个单克隆整合事件，其中两个多克隆整合事件分别有1089和54条reads支持。作为对比的常规探针捕获法HBV基因组测序深度仅有382×，仅能检测到两个多克隆整合事件，分别有47和3条reads支持，这两种方法检测到的整合断点位置是一致的。可见，本例基于特异性引物的靶向捕获方法具有超高灵敏性，能够检测到低频整合事件，且准确性高。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (9)

1.一种病毒整合型DNA的富集方法，其特征在于：包括以下步骤，
引物杂交和延伸步骤，包括采用引物混合物对DNA样品进行退火、延伸；所述引物混合物由针对病毒基因组靶标基因设计的特异性引物组成，在病毒基因组靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，使得引物混合物能够覆盖整个靶标基因，并且特异性引物的5’端具有生物素修饰；
磁珠分离和洗涤步骤，包括采用链霉亲和素修饰的磁珠，对所述引物杂交和延伸步骤的延伸产物进行捕获，并通过磁珠将生物素修饰的特异性引物以及相应的靶标基因分离，洗涤去除非靶标基因，即获得靶向富集的病毒基因组靶标基因。
2.根据权利要求1所述的富集方法，其特征在于：还包括测序文库扩增步骤，所述测序文库扩增步骤包括采用文库构建引物对靶向富集的病毒基因组靶标基因进行PCR扩增，获得用于高通量测序的测序文库；
优选的，所述特异性引物的长度不小于10碱基；优选的，所述特异性引物的长度为15-25碱基；
优选的，所述对DNA样品进行退火、延伸，具体条件为，98℃变性5分钟、65℃预杂交1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，反应结束后4℃待机。
3.一种病毒整合型DNA的富集装置，其特征在于：包括引物杂交和延伸模块和磁珠分离和洗涤模块；
所述引物杂交和延伸模块，包括用于采用引物混合物对DNA样品进行退火、延伸；所述引物混合物由针对病毒基因组靶标基因设计的特异性引物组成，在病毒基因组靶标基因上每间隔50-200bp设计一条特异性引物，使得引物混合物能够覆盖整个靶标基因，并且特异性引物的5’端具有生物素修饰；
所述磁珠分离和洗涤模块，包括用于采用链霉亲和素修饰的磁珠，对所述引物杂交和延伸模块获得的延伸产物进行捕获，并通过磁珠将生物素修饰的特异性引物以及相应的靶标基因分离，洗涤去除非靶标基因，即获得靶向富集的病毒基因组靶标基因。
4.根据权利要求3所述的富集装置，其特征在于：还包括测序文库扩增模块，所述测序文库扩增模块包括用于采用文库构建引物对靶向富集的病毒基因组靶标基因进行PCR扩增，获得用于高通量测序的测序文库；
优选的，所述特异性引物的长度不小于10碱基；优选的，所述特异性引物的长度为15-25碱基；
优选的，所述对DNA样品进行退火、延伸，具体条件为，98℃变性5分钟、65℃预杂交1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，反应结束后4℃待机。
5.一种病毒整合型DNA的测序数据分析方法，其特征在于：包括以下步骤，
数据过滤步骤，包括对双端测序的原始数据进行数据过滤，去除接头序列和质量不合格碱基，获得干净数据；
拼接组装步骤，包括将有R1和R2重合的reads组装成长片段reads；
比对和断点判断步骤，包括将组装的长片段reads比对到病毒和人的混合参考基因组上，从比对结果中提取能同时部分比对到人和病毒基因组的soft clip reads，确定softclip reads的断点位置；
基因注释步骤，包括将断点位置同时进行人和病毒基因组的基因注释。
6.一种病毒整合型DNA的测序数据分析装置，其特征在于：包括数据过滤模块、拼接组装模块、比对和断点判断模块和基因注释模块；
所述数据过滤模块，包括用于对双端测序的原始数据进行数据过滤，去除接头序列和质量不合格碱基，获得干净数据；
所述拼接组装模块，包括用于将有R1和R2重合的reads组装成长片段reads；
所述比对和断点判断模块，包括用于将组装的长片段reads比对到病毒和人的混合参考基因组上，从比对结果中提取能同时部分比对到人和病毒基因组的soft clip reads，确定soft clip reads的断点位置；
所述基因注释模块，包括用于将断点位置同时进行人和病毒基因组的基因注释。
7.一种致瘤性DNA病毒的检测装置，其特征在于：包括预文库构建模块、病毒整合型DNA富集模块、测序模块和测序数据分析模块；
所述预文库构建模块，包括用于对提取的核酸依序进行片段化处理、末端修复和加“A”处理、加接头处理和连接产物纯化处理，获得片段化并且具有接头序列的预文库；
所述病毒整合型DNA富集模块，包括用于根据权利要求1或2所述的病毒整合型DNA的富集方法，或者采用权利要求3或4所述的病毒整合型DNA的富集装置，对预文库的DNA样品进行病毒基因组靶标基因富集；
所述测序模块，包括用于对富集的病毒基因组靶标基因进行双端测序；
所述测序数据分析模块，包括用于根据权利要求5所述的病毒整合型DNA的测序数据分析方法，或者采用权利要求6所述的病毒整合型DNA的测序数据分析装置，对双端测序的原始数据进行分析。
8.根据权利要求7所述的检测装置，其特征在于：还包括核酸提取模块，包括用于对待测对象进行核酸提取。
9.根据权利要求1或2所述的富集方法或权利要求3或4所述的富集装置或权利要求5所述的测序数据分析方法或权利要求6所述的测序数据分析装置或权利要求7或8所述的检测装置在制备乙型肝炎病毒、人乳头瘤病毒、非洲淋巴细胞瘤病毒或卡波济肉瘤相关疱疹病毒检测试剂盒或装置中的应用。
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