CN107723383A - 一种ebv病毒的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Epstein‑Barr病毒(EBV)整合鉴定的高通量测序检测方法，本方法利用Epstein‑Barr病毒(EBV)的基因组信息，结合第二代高通量测序技术，更全面的检测患者感染EBV的状况，克服了传统检测方法准确率低、假阳性高、重复性差等缺失。采用基因测序有助于提高准确度，第二代高通量测序技术比目前多采用经典的Sanger测序方法有检通量更大、测序速度更快、精确度更高、成本更低和信息量更丰富等优点。本方法在第二代高通量测序技术帮助下，可以对Epstein‑Barr病毒在人体感染情况进行高精度的鉴定，从而在感染期，进行针对性治疗，减少疾病对人体造成的危害，从而降低肿瘤的发生。
Description
一.技术领域
本发明涉及一种病毒的检测方法，尤其是一种Epstein-Barr病毒(EBV)整合鉴定的高通量测序检测方法。
二.技术背景
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是发生于鼻腔和咽之间鼻咽部的恶性肿瘤，原发于鼻咽粘膜上皮，具有原发部位隐蔽，不易被早期发现，病理分化差，恶性程度高易浸润性生长和早期转移的特点。在我国鼻咽癌是死亡率最高的七个恶性肿瘤之一，从发现症状到死亡平均生存期仅18.7个月。按照世界卫生组织的分类，鼻咽癌被分成角化性鳞状细胞癌(占95％)和非角化性癌。目前已知鼻咽癌的发生与多种因素有关，其中，EB病毒是引起鼻咽癌的直接因素。
Epstein-Barr病毒(EBV)是一种普遍存在的人类疱疹病毒，为γ-1型疱疹病毒。它于1964年被发现，并分布在世界各地，世界上大约90％的人口感染过EBV。EBV呈球形，直径180～200nm，基因组为双链DNA，全长约为171Kb,包含至少86个开放性阅读框。EBV具有专一性嗜淋巴B细胞的生物学特性，主要通过唾液传播，在人体B淋巴细胞内增殖。实验室对该病毒的检查方法是直接寻找病毒基因组和其表达产物(RNA、蛋白)。一般认为，细胞免疫在对病毒活化的“监视”和清除转化的B细胞中起着关键性作用。该功能下降将导致EBV的活化。三个典型症状为发热，咽炎和颈淋巴结肿大。随着疾病的发展，病毒可播散至其他淋巴结，造成肝脾肿大、肝功能异常、外周血单核细胞增多，并出现异型淋巴细胞。
EBV已经被证实是淋巴瘤、鼻咽癌等多种恶性疾病重要的致病因子，但是通常为隐形感染，绝大多数患者血清中没有抗EBV抗体，因此常规检测难以发现。EBV感染细胞有两种形式：潜伏性感染和增值性感染，在潜伏性感染中，病毒基因以环状游离体和/或整合型形式存在。在一定条件下，EBV可以从潜伏状态转变成增殖状态，可以感染进入宿主细胞后编码病毒蛋白,病毒蛋白可通过激活宿主细胞基因组原瘤基因表达、调节细胞周期蛋白,抑制细胞凋亡等不同机制作用于细胞,导致细胞恶性转化及肿瘤形成。另一方面,EBV在整合进入宿主细胞基因组后,引起宿主细胞基因组不稳定性,并引起宿主细胞内与一些癌基因和抑癌基因的异常表达。针对EBV的诊断，目前由于EBV分离培养困难，因此，一般用血清学方法辅助诊断，用核酸杂交和PCR等方法检测细胞内EBV基因组及其表达产物。在分子诊断领域，最直接而明确的技术是基因测序，传统的基因测序方法是通过Sanger终止法进行的，缺点是一次只能读取单个基因的序列，测序通量太低、不全面。第二代高通量测序技术实现了同时对几百万甚至数亿条DNA序列进行测序，具有费用低、通量高、速度快、灵敏度高及准确度高等优点。同时，由于近年全基因组测序技术迅猛发生，成本迅速降低，使得测序技术可以在临床医学中的应用。因此，利用EBV病毒序列捕获探针，可以通过二代高通量测序技术对样本进行检测，鉴定EBV病毒的感染情况，从而使新技术更好的服务于临床。
三.发明内容
本发明提供一种Epstein-Barr病毒(EBV)整合鉴定的高通量测序检测方法
实现本发明目的的一种Epstein-Barr病毒(EBV)整合鉴定的高通量测序检测方法，包括如下步骤:
(1)根据Epstein-Barr病毒基因组，调取EBV的全基因组序列。
(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp；
(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应和转录的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，并制作鼻咽癌易感基因高通量捕获试剂盒；
所述试剂盒检测方法包括如下步骤:
从患者获取样本，提取一定量的DNA(3-5ug)，利用超声打断，扩增，构建全基因组文库，然后利用Epstein-Barr病毒扫描试剂盒将Epstein-Barr病毒序列捕获出来，再用测序仪(Illumina Nextseq 500)进行高通量测序，进而分析，找出Epstein-Barr病毒的DNA序列，以达到对Epstein-Barr病毒筛查的目的。
利用测序仪(Illumina Nextseq 500)进行高通量测序，分析的过程包括Epstein-Barr病毒的DNA序列的比对和融合分析流程；
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列并去除测序数据的接头；
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据；
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到相应的Epstein-Barr病毒基因组数据(Human herpesvirus 4type 2(Epstein-Barr virus type2),GCF_000872045.1)相应的位置上(所用到参数:bwa aln-L-l 40-i 10-k 2-t 7-e 40-M3-f)；
(4)使用PicardTools及自写脚本，统计Epstein-Barr病毒DNA序列覆盖度及短序列数量，确定检测结果。
基因融合分析流程包括如下步:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列；
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据；
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到定制的人类基因和Epstein-Barr病毒基因组数据(Human-EBV)相应的位置上所用到参数:bwa aln-L-l40-i 10-k 2-t 7-e 40-M 3-f)；
(4)用factera检测被测样本中Epstein-Barr病毒多个基因基因的全部或一部分的编码区是否与人类基因相连。包括染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果，得到Epstein-Barr病毒基因融合结果。
本发明提供一种Epstein-Barr病毒(EBV)整合鉴定的高通量测序检测方法的有益效果如下:本发明是一种Epstein-Barr病毒(EBV)整合鉴定的检测方法，是以DNA文库的方式进行捕获测序。然后利用EBV基因探针将目的基因序列捕获出来，再用测序仪(IlluminaNextseq500)进行高通量测序。捕获过程中会添加过量的探针，保证了对目标片段的完全捕获。所以，即使可能出现的某些丰度较低的变异DNA也能被捕获并检测出来，因此，其灵敏度相对于其他方法要高出许多。本方法相比于临床上传统的病理学诊断而言，本方法有以下优势:
1、相比于传统的细胞学检测手段。采用二代高通量等直接测序鉴定EBV整合，其准确率更高，且重复性更好；采取高深度测序，平均要达到500X，保证足够的检测深度，使假阴性更低。
2、准确度高：临床诊断通常只能在患者身体己经出现病理改变(出现肿块，蛋白改变)时做出诊断；而基因测序检测，直接通过测序和比对发现Epstein-Barr病毒(EBV)是否整合，准确度更高。
四.具体实施方式
本发明提供一种Epstein-Barr病毒(EBV)整合鉴定高通量测序检测方法，包括如下步骤:
1.样本文库制备:
(1)、超声片段化：起始量为3μg，加RNA-free-water到100μl稀释到30ng/μl。采用SCIENTZ08-Ⅲ杯式超声波细胞粉碎机进行超声片段化，设定参数为：功率70％，打断3s，停止1s，循环30-60min。
(2)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温，震荡混匀，取180ul磁珠加入超声打断后的PCR产物中，抽打混匀，温室孵育5min。
(3)、将PCR单管放于磁力架上，静置5min，去上清，保持PCR管在磁力架上，加入80％乙醇(新配)200ul漂洗，静置30s后去上清，80％乙醇漂洗两遍，室温干燥10min(还有2min时用小抢头吸残液)，直至无乙醇残留。
(4)将PCR管从磁力架上取出，加入65ul超纯灭菌水，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，将PCR单管置于磁力架上，静置5min后小心吸取上清60ul于新的PCR管中。
(5)将40ul End prepmix加入(4)中60ul上清的PCR管中，吹打混匀，短暂离心，进行末端修复，反应条件为30℃、30min。
(4)、将PCR管从磁力架中取出，加入20ul超纯灭菌水洗脱，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，置于磁力架上，待溶液澄清后吸上清17.5ul于新的PCR管中，再在PCR管中加入12.5ul dA-Tailing(解冻后放4℃，离心后再使用)，吹打混匀。进行末端加尾，反应条件为37℃30min,70℃5min,4℃5min。
(5)、在上步加尾后的产物中加入Ligation mix和adapter各2.5ul，吹打混匀，短暂离心，放入PCR仪中，反应条件为30℃10min，20℃20min。
(6)、在上步连接产物中加入15ul的超纯灭菌水，再加入50ul磁珠，震荡混匀，室温孵育5min，短暂离心，放入磁力架上，静置5min，澄清后去上清，保持PCR管在磁力架上，用200ul的80％乙醇(新配)漂洗两次，室温干燥10min，直至无乙醇残留。
(7)、将PCR管从磁力架上取出，加入25ul超纯灭菌水，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，将PCR单管置于磁力架上，静置5min后小心吸取上清22ul于新的PCR管中。
(8)、将PCR primer mix和Amplification mix 2解冻后颠倒混匀，在上步连接产物中加入3ul的primer mix和25ul的Amplification mix 2，吹打混匀，短暂离心，进行PCR扩增，反应条件为
第二----四步扩增15cycle。
(9)、用上步扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带亮度。
(10)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温，震荡混匀，取50ul加入PCR扩增产物中，震荡混匀，室温孵育5min，短暂离心，置于磁力悬架上，静置5min，待溶液澄清后去上清，用200ul的80％乙醇(新配)漂洗两次，室温干燥10min，直至无乙醇残留。
(11)、将PCR管从磁力架中取出，加入40ul超纯灭菌水洗脱，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，置于磁力架上，待溶液澄清后吸上清38ul于新的EP管中，用Qubit测溶液浓度并记录，-20℃保存。
2.样本富集液相杂交
(1)、用于杂交的建库后DNA总量为500ng，根据检测的溶液浓度计算杂交时加入EP管的溶液体积。
(2)、在上步的EP管中加入2.5ul的cot-1DNA，2.5ul的SS DNA，2ul的P5(500um)，2ul的P7-x(500um)，短暂离心。
(3)、将上步混合好的溶液在60℃真空干燥30min，直至无液体残留。
(4)、在上步干燥后的EP管中加入10ul超纯灭菌水，轻弹混匀，水化10min，短暂离心，取10ul加入PCR八连排中。
(5)、将上步PCR八连排放入PCR仪中进行PCR反应，反应条件为
第一步95℃5min
第二步65℃5min
第三步65℃无限
在95℃结束后，将1ul RNAsin和5ul RNAbait混合(每个样品所取量)，在65℃2.5min时将RNAsin和RNAbait混合液以及杂交液放入65℃PCR仪中，在65℃5min结束后先在八连排每个孔中加入6ul的混合液，加入时吹打混匀，2.5min后加入10ul(每个样品所取量)杂交液，加入后吹打混匀，65℃过夜。
3.捕获
(1)、洗磁珠，取Dnabeads磁珠震荡混匀，根据样品数取磁珠(每个样品取30ul磁珠)，用200ul beads洗液洗3次。
(2)、悬浮磁珠于binding buffer中，每个样品取165ul的binding buffer。
(3)、吸取binding buffer和磁珠的结合液165ul于杂交样品中，震荡45min(每隔5min上下颠倒混匀)，45min后置于磁力架上，待澄清后吸弃上清。
(4)、加165ul的洗液1于上步磁珠中，洗15min，每5min颠倒混匀一次，15min后置于磁力架上，待澄清后吸弃上清。
(5)、将洗液2提前放入70℃PCR仪预热，加165ul的洗液2于上步磁珠中，颠倒混匀，在70℃洗10min，10min后置于磁力架上，待澄清后吸弃上清，洗液2洗3次。
(6)、在上步八连排的每个孔中加入22ul的超纯灭菌水，3ul的primer和25ul的Amplification mix2，颠倒混匀，进行PCR扩增，扩增程序为
(7)、将上步八连排放在磁力架上，待溶液澄清后，吸上清进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带亮度。
(8)、将磁珠提前半个小时拿出以恢复到室温，震荡混匀，吸取上步八连排中的上清于新的PCR单管中，吸取50ul磁珠加入PCR单管中，震荡混匀，室温孵育5min，短暂离心，置于磁力悬架上，静置5min，待溶液澄清后去上清，用200ul的80％乙醇(新配)漂洗两次，室温干燥10min，直至无乙醇残留。
(9)、将PCR管从磁力架中取出，加入40ul超纯灭菌水洗脱，轻弹混匀，静置5min，短暂离心，置于磁力架上，待溶液澄清后吸上清38ul于新的EP管中，用Qubit测溶液浓度并记录，-20℃保存。
以上得到的DNA通过Illumina Nextseq 500测序，得到测序的数据。
4.Epstein-Barr病毒的高通量检测方法数据分析流程
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头；
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据；
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到相应的Epstein-Barr病毒基因组数据(Human herpesvirus 4type 2(Epstein-Barr virus type2),GCF_000872045.1)相应的位置上(所用到参数:bwa aln-L-l 40-i 10-k 2-t 7-e 40-M3-f)；
(4)使用PicardTools及自写脚本，统计Epstein-Barr病毒DNA序列覆盖度及短序列数量，确定检测结果。
5.Epstein-Barr病毒与人类基因融合分析流程包括如下步.:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列；
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据；
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到定制的人类基因和Epstein-Barr病毒基因组数据(Human-EBV)相应的位置上所用到参数:bwa aln-L-l40-i 10-k 2-t 7-e 40-M 3-f)；
(4)用factera检测被测样本中Epstein-Barr病毒多个基因基因的全部或一部分的编码区是否与人类基因相连。包括染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果，得到Epstein-Barr病毒基因融合结果。
上面所述的实施案例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神前提下，本领域普通工程技术人员对本发明技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明的权。
Claims (4)
1.本发明提供一种Epstein-Barr病毒(EBV)整合鉴定的高通量测序检测方法。
2.实现本发明目的的一种Epstein-Barr病毒(EBV)整合鉴定的高通量测序检测方法，包括如下步骤:
(1)根据Epstein-Barr病毒基因组，调取EBV的全基因组序列;
(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp;
(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应和转录的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，并制作鼻咽癌易感基因高通量捕获试剂盒;
所述试剂盒检测方法包括如下步骤:
从患者获取样本，提取一定量的DNA(3-5 ug)，利用超声打断，扩增，构建全基因组文库，然后利用Epstein-Barr病毒扫描试剂盒将Epstein-Barr病毒序列捕获出来，再用测序仪(Illumina Nextseq 500) 进行高通量测序，进而分析，找出Epstein-Barr病毒的DNA序列，以达到对Epstein-Barr病毒筛查的目的。
3.根据权利要求1所述的一种用于鉴定Epstein-Barr (EBV)病毒的检测方法，采用测序仪进行高通量测序分析流程包括如下步骤:
利用测序仪(Illumina Nextseq 500)进行高通量测序，分析的过程包括Epstein-Barr病毒的DNA序列的比对和融合分析流程;
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列并去除测序数据的接头;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到相应的Epstein-Barr病毒基因组数据（Human herpesvirus 4 type 2 (Epstein-Barr virus type 2) ,GCF_000872045.1）相应的位置上(所用到参数: bwa aln -L -l 40 -i 10 -k 2 -t 7 -e40 -M 3 -f);
(4) 使用PicardTools及自写脚本，统计Epstein-Barr病毒DNA序列覆盖度及短序列数量，确定检测结果。
4.基因融合分析流程包括如下步.:
(1)测序仪(Illumina Nextseq 500)获取原始短序列;
(2)用Trim Galore进行QC并去除低质量数据;
(3)把短序列用BWA-Burrows-Wheeler Alignment(BWA)软件定位到定制的人类基因和Epstein-Barr病毒基因组数据（Human-EBV）相应的位置上所用到参数: bwa aln -L -l 40-i 10 -k 2 -t 7 -e 40 -M 3 -f);
(4)用factera检测被测样本中Epstein-Barr病毒多个基因基因的全部或一部分的编码区是否与人类基因相连，包括染色体易位、中间缺失或染色体倒置所致的结果，得到Epstein-Barr病毒基因融合结果。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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2016
- 2016-08-12 CN CN201610662608.XA patent/CN107723383A/zh active Pending
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