CN113999898A - m6A RNA甲基化位点检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种m6A RNA甲基化位点检测方法，属于分子生物学领域。本发明是专门针对低起始量总RNA检测m6A位点的方法，整个实验过程简捷，RNA完整性高，文库质量好，尤其适用于临床样本起始量少的情况，可实现高效m6A甲基化RNA获取，通过去rRNA链特异性建库最终得到浓度足够高的文库，完成上机测序和后续的测序相关的应用，有效实现临床微量样本和珍贵临床样本mRNA和IncRNA中m6A甲基化位点的识别，可应用于机制探讨、诊断治疗等领域m6A甲基化的研究。

Description

m6A RNA甲基化位点检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种m6A RNA甲基化位点检测方法。

背景技术

RNA修饰是表观遗传学的重要内容之一，是一种转录后水平的调控方式。目前已鉴定到超过170多种RNA修饰，它们广泛存在于各类RNA，如mRNA、tRNA、rRNA、sncRNA和IncRNA。最常见的RNA转录后修饰方式有N6-甲基腺苷(N6-methyladenosine，简称m6A，即RNA碱基第6个氮原子上的甲基化)和5-甲基胞苷(C5-methylcytidine，简称m5C，即胞苷碱基的第5位上有一个RNA甲基化等)。

RNA甲基化修饰占所有RNA修饰的60%以上，而m6A（6-甲基腺嘌呤）是高等生物mRNA上最丰富的一类RNA甲基化修饰形式（m6A修饰大约占细胞总RNA全部腺苷含量的0.1%-0.4%）。尽管m6A在二十世纪七十年代就被发现，但当时并没有引起广泛的关注，直到转录组测序技术的发展，m6A在无数的转录本中被发现，并且通常在编码序列的终止密码子，3’UTR和5’UTR附近聚集。哺乳动物中平均每一条mRNA含有3-5个6-甲基修饰的腺苷。m6A甲基化位点主要发生在高度保守的DRACH (D=A/G/U; R=A/G; H=A/C/U)序列中，在表观遗传中可能发挥重要的作用。最新研究发现，m6A在调控基因表达、可变剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状RNA翻译等方面扮演重要角色。

MeRIP-seq （m6A-seq）转录组高通量测序技术目前已广泛用于从转录后修饰水平进行m6A甲基化差异基因筛选，更能精准定位差异基因。现有文献和报道的常规m6A-seq检测都需要几百微克级别的RNA，严重限制了对于很多临床微量样本的研究，阻碍对人类疾病的认识，尤其是肿瘤、癌症等疾病。因此，提供一种用于检测微量样本mRNA和IncRNA中m6A甲基化位点的实验方法非常有必要，实现在微量样本中也能满足m6A甲基化高通量测序，从转录后修饰水平进行相关功能差异基因的筛选，可以更精准定位差异基因，助力解决多领域生物学问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种RNA甲基化位点检测方法，特别是mRNA和IncRNA的m6A甲基化位点检测方法。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种m6A RNA甲基化位点检测方法，包括以下步骤：

1）提取微量样本中的总RNA；

2）将步骤1）所得总RNA与m6A特异性抗体、Protein-A磁珠及IP缓冲液混合，室温孵育；

3）孵育结束后，向步骤2）的混合液中加入核酸裂解酶和RNA酶抑制剂，室温孵育，然后进行磁力分离，去除上清；

4）步骤3）所得磁珠沉淀依次用低盐缓冲液、高盐缓冲液洗涤3-4次，然后加入蛋白酶进行消化，所得消化物进行磁力分离，取上清弃磁珠，得到m6A甲基化修饰的RNA；

5）将步骤4）所得m6A甲基化修饰的RNA进行反转录，得到cDNA，并进行RNA甲基化测序文库的构建，实现对RNA甲基化位点的检测。

前述的方法，步骤1）还包括对所提取的总RNA进行质控的步骤。

前述的方法，步骤5）在进行反转录之前，对m6A甲基化修饰的RNA进行质控。

步骤2）所述的m6A特异性抗体为m6A Antibody，购自Synaptic Systems，货号为202 003。

所述IP缓冲液的组成为：130-160mM NaCl，9-12mM Tris-HCl和0.08%-0.12%IGEPAL CA-630。

步骤3）所述的裂解酶为：Protein A-Protein G-微球菌核酸酶，购自Epigentek 。

步骤4）所述的蛋白酶为蛋白酶K。所述低盐缓冲液的组成为：40-60mM NaCl，9-12mM Tris-HCl和0.08%-0.12% IGEPAL CA-630。

所述高盐缓冲液的组成为：450-550mM NaCl，9-12mM Tris-HCl和0.08%-0.12%IGEPAL CA-630。

前述的方法，步骤1）所得总RNA的RIN值为7以上。

前述的方法，步骤2）中孵育的条件为：25-30℃孵育时间为1.5h。

前述的方法，步骤3）中孵育的条件为：25-30℃孵育2min。

前述的方法，步骤4）中消化的条件为：55℃反应15min。

前述的方法，步骤2）将500ng-20µg RNA、2µL 1mg/ml m6A特异性抗体、2µLProtein-A磁珠及IP缓冲液配置成200µL的溶液体系。

前述的方法，步骤3）向混合液中加入2µL核酸裂解酶和10µL RNA酶抑制剂（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号为R301-01，2000U）。

优选地，步骤5）中采用SMART去rRNA链特异性方法建库。

本发明中，样本可以是临床组织样本、动物组织、细胞、体液、外泌体等样本，但不限于上述样本类型。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

（一）本发明基于去基因组的方法提取样本中总RNA，从根本上减少了DNA甲基化的误差。

（二）本发明采用CUT&RUN技术，使用Protein A-Protein G-微球菌核酸剪切酶富集m6A甲基化RNA片段，相比其他传统MeRIP技术，所需的总RNA起始量可低至500ng。

（三）本发明是专门针对低起始量总RNA检测m6A位点的方法，整套实验过程简捷，RNA完整性高，文库质量好，尤其适用于临床样本起始量少的情况，可实现高效m6A甲基化RNA获取。

（四）本发明提供的微量m6A甲基化RNA的获取方法可用于检测mRNA和IncRNA中m6A甲基化位点。

（五）本发明获取的m6A甲基化RNA通过去rRNA链特异性建库获得浓度足够高的文库，完成上机测序和后续的测序相关的应用，有效实现微量样本和珍贵临床样本mRNA和IncRNA中m6A甲基化位点的识别，可应用于机制探讨、诊断、治疗等领域m6A甲基化的研究。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中样本总RNA甲基化m6A检测方法原理图。

图2为本发明较佳实施例中样本总RNA质检结果。

图3A为本发明较佳实施例中样本Sample-1总RNA中富集的m6A甲基化修饰片段RNA质检结果。

图3B为本发明较佳实施例中样本Sample-2总RNA中富集的m6A甲基化修饰片段RNA质检结果。

图4A为本发明较佳实施例中样本Sample-1文库质检图。

图4B为本发明较佳实施例中样本Sample-2文库质检图。

图5A为本发明较佳实施例中样本Sample-1 Peak特征图。

图5B为本发明较佳实施例中样本Sample-2 Peak特征图。

图5C为本发明较佳实施例中样本Sample-1 mRNA和IncRNA的Peak特征分布图。

图5D为本发明较佳实施例中样本Sample-2 mRNA和IncRNA的Peak特征分布图。

图6为本发明较佳实施例中微量mRNA和IncRNA甲基化m6A修饰的motif图。

具体实施方式

本发明提供一种微量样本m6A甲基化位点的检测方法，一种用于检测mRNA和IncRNA中m6A甲基化位点的方法，一种检测mRNA和IncRNA m6A甲基化水平差异表达的方法以及一种在基因水平鉴定m6A甲基化水平的方法，旨在使用微量样本就可以完成mRNA和IncRNA中m6A甲基化位点的识别分析。

本发明可通过如下技术方案实现：

本发明提供一种用于检测微量样本mRNA和IncRNA中m6A甲基化位点的方法，包括以下步骤：

1、样品前处理和总RNA提取：提前准备样本（细胞样品收集离心去上清留下细胞沉淀；组织样本充分研磨），获取样品中总RNA并进行质控（提取过程注意提前消除总RNA中的基因组）；

2、取步骤1质控合格的微量总RNA，加入适量m6A特异性抗体、高亲和Protein-A磁珠及IP缓冲液，充分混匀后置于旋转仪室温孵育；

3、孵育结束后，向步骤2混合液中加入核酸裂解酶，室温充分裂解；

4、优选地，在步骤3中加入核酸裂解酶的同时加入足量RNA酶抑制剂，充分裂解后的RNA，磁力分离去除上清，加入沉淀缓冲液和高低盐缓冲液洗涤3-4次；

5、用低盐缓冲液、高盐缓冲液纯化后的所得产物中加入蛋白酶K，去除磁珠和抗体，进一步富集洗脱具有m6A特殊修饰的RNA片段，获得纯化后RNA产物；

6、优选地，采用相似的方法获得input对照RNA片段；

7、将富集到的RNA产物进行去rRNA链特异性文库构建；

8、根据文库测序结果进行MeRIP-seq生信分析。

本发明提供一种用于检测mRNA和IncRNA中m6A甲基化位点的实验方法，将所述的m6A修饰检测文库结果用于NGS高通量测序，获得微量mRNA和IncRNA m6A甲基化测序结果。

作为本发明所述的一种用于检测微量样本中mRNA和IncRNA m6A甲基化位点方法的优选方案，步骤1中总RNA质控具体使用Agilent 2100进行；总RNA和m6A特异性抗体、高亲和Protein-A磁珠及IP缓冲液的沉淀缓冲液混合物室温孵育时间为90min。

作为本发明的一种用于检测微量样本中mRNA和IncRNA m6A甲基化位点方法的优选方案，步骤3中裂解酶室温充分裂解时间范围一般为2-4min。

作为本发明的一种用于检测微量样本中mRNA和IncRNA m6A甲基化位点方法的优选方案，步骤5中蛋白酶K和蛋白酶缓冲液的体积比为1:9，蛋白酶消化体系为20µL，55℃消化15min后去除抗体蛋白，释放纯化RNA产物。

作为本发明的一种用于检测微量样本中mRNA和IncRNA m6A甲基化位点方法的优选方案，步骤6中input对照RNA片段的获取，主要方法为在20µL IP缓冲液体系中加入200ng总RNA，2µL核酸裂解酶裂解1-2min，纯化input RNA片段。

作为本发明的一种用于检测微量样本中mRNA和IncRNA m6A甲基化位点方法的优选方案，步骤5和步骤6中纯化后的RNA产物使用Agilent 2100进行质控。

作为本发明的一种用于检测微量样本中mRNA和IncRNA m6A甲基化位点方法的优选方案，步骤7中将富集到的RNA产物进行超微量SMART去rRNA链特异性文库构建。

作为本发明的一种用于检测mRNA和IncRNA中m6A甲基化位点的实验方法，一种检测mRNA和IncRNA m6A甲基化水平差异表达的方法、一种在基因水平鉴定m6A甲基化水平的方法，旨在使用微量样本就可以完成整个MeRIP-seq和mRNA和IncRNA中m6A甲基化位点的识别分析。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J & Russell DW,Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的试剂如下：

m6A特异性抗体：m6A Antibody，购自Synaptic Systems GmbH，货号为202 003。

IGEPAL CA-630购自Sigma-Aldrich, 货号为cat. no. I8896。

IP缓冲液的组成为：160mM NaCl，12mM Tris-HCl和0.12% IGEPAL CA-630。

核酸裂解酶：Protein A-Protein G-微球菌核酸酶（一种CUT&RUN裂解酶），购自Epigentek。

低盐缓冲液的组成为：60mM NaCl，12mM Tris-HCl和0.12% IGEPAL CA-630。

高盐缓冲液的组成为：550mM NaCl，12mM Tris-HCl和0.12% IGEPAL CA-630。

实施例1 微量细胞总RNA的提取

本发明提供一种微量细胞总RNA甲基化m6A检测方法（原理见图1），提供一种用于检测mRNA和IncRNA中m6A甲基化位点的方法及其应用。

本发明采用了提供的超微量去rRNA链特异性m6A甲基化检测文库构建试剂盒，所述方法包括但不限于如下步骤的一个或多个步骤：

1、样品前处理：本实施例所用样本为293-T细胞。首先将培养好的10⁶个293-T细胞收集，500×g室温离心5-8min，弃上清留下细胞沉淀。

2、去基因组总RNA提取：用柱提法(QIAGEN，货号为217204)提取293-T细胞样本总RNA，提取过程注意提前使用消除总RNA中的基因组，避免造成基因组的影响。

2.1 向293-T细胞沉淀中加入足量Qiazol，枪头充分吹打混匀至无白色絮状细胞成团，此时裂解液呈粉色清透状，裂解5-10min；

2.2 充分裂解后加入适量氯仿，大力摇晃15s，4℃，12000×g离心15min；

2.3 将最上层无色透亮溶液转移至一个新的EP管中，加入1.5倍体积无水乙醇混匀；

2.4 将2.3中的溶液完全转移至CPU柱膜中，离心使RNA充分结合在柱膜上；

2.5 向柱膜中加入足量DNaseⅠ（DNase I采购自Roche，货号为4536282001-20KU），室温消化15min；

2.6 DNaseⅠ消化后用RWT和RPE缓冲液清洗柱膜2-3次，再使用Free-RNase H₂O洗脱收集总RNA；

2.7 优选地，得到样本总RNA之后进行Agilent 2100（试剂名称RNA 6000 Pico总RNA分析试剂盒，货号5067-1513）质控，要求OD260/280 ≥1.8，OD260/230≥1.7，RIN值≥7.0（图2）。

获取样品中m6A修饰片段RNA：总RNA打断纯化回收m6A片段化RNA (Sample-1和Sample-2为两个平行重复样本数据)。

实施例2 m6A RNA片段捕获

1、制备抗体磁珠RNA混合物：以10µg 总RNA起始量为例，按以下体系配制，上下颠倒充分混匀后置于旋转仪室温孵育1.5h；

RNA sample浓度为1µg/µL，m6A特异性抗体2µg/管；

2、总RNA裂解：孵育结束后，向上一步混合液中加入10µL RNA酶抑制剂和2µL核酸裂解酶，室温裂解2-4min；

3、m6A甲基化RNA富集：裂解结束后，置于小型磁力架上静置2-3min后磁力分离去除上清；

4、非m6A RNA片段洗脱：加入150µL低盐缓冲液、高盐缓冲液洗涤3-4次；

5、纯化m6A RNA片段：

1) 低盐缓冲液、高盐缓冲液纯化后的复合物按蛋白酶K：蛋白酶K缓冲液=1:9的体积比配制20µL蛋白酶K溶液/管；

2) 按照如下程序反应：55℃，15min；

3) 蛋白酶K消化结束后置于小磁力架2-3min，取上清弃磁珠，加入RNA亲和磁珠，进一步富集洗脱具有m6A特殊修饰的RNA片段，获得纯化后RNA产物；

4) 使用Nanodrop分光光度计/Qµbit测量RNA浓度，使用Agilent 2100（试剂名称RNA 6000 Pico总RNA分析试剂盒，货号5067-1513）检测RNA准确浓度和片段大小（图3A和图3B）。

实施例3 m6A RNA文库构建

将实施例2中富集到的RNA产物进行去rRNA链特异性文库构建。

1、配置一链cDNA合成：按照以下体系冰上配置；

1）将上述混合液运行以下反应程序后立即置于冰上：72℃，3min，冰上2 min；

2）按以下体系配好混合液后取Mix加入上一步反应液：

3）吹打混匀后并按照运行以下程序：42℃ 90min；70℃ 10min；4℃ ∞。

2、准备PCR1反应

1）按以下试剂配置反应mix，吹打混匀后加入步骤1的反应液中：

2）吹打混匀短暂离心后运行以下程序：94℃ 1min；98℃ 15sec，55℃ 15sec，68℃30sec，5个循环；68℃ 2min，4℃ ∞。

3）第一轮PCR1产物用AMPure Beads磁珠纯化。

3、去除核糖体RNA

1) 提前将R-Probes v2按如下程序进行变性处理：72℃，2min；4℃ 2min；4℃ ∞。

2）按以下体系配制ZapR Master Mix：

向4.2 4)中磁珠加入ZapR Master Mix，吹打混匀简短离心，磁力分离取20µL上清运行以下程序：37℃ 60min；72℃ 10min；4℃ ∞。

4、准备PCR2反应

1)按以下体系配制PCR2 Master Mix：

2)加80µL的PCR2 Master Mix到样品中，共100µL。吹打混匀，简短离心。

3)运行以下程序：94℃ 1min；98℃ 15s，55℃ 15s，68℃ 30s，16个循环；4℃ ∞。

5、文库纯化

第二轮PCR2产物用1×的XP磁珠纯化，用20µL Nuclease-Free Water洗脱（如果产量低，建议用12µL的体积洗脱），最后得到的文库进行Agilent 2100进行质控（Highsensitivity DNA Kit，Agilent货号5067-4626），如图4A和图4B所示。优选地，根据文库测序结果进行MeRIP-seq生信分析。

本发明提供的用于检测mRNA和IncRNA中m6A甲基化位点的方法，将所述m6A修饰检测文库结果用于NGS高通量测序，获得微量mRNA和IncRNA m6A甲基化测序结果。

本实施例中使用的index序列如表1所示。

表1 index序列

实施例4 微量样本种甲基化m6A的检测

1、基因组序列比对结果统计

测序得到的原始测序数据（Raw Data），可能含有带接头的、低质量的Reads，为了保证信息分析质量，会进行Raw Data进行过滤，得到Clean Data，用于后续信息分析。数据过滤后，使用FASTQC软件对Clean Data进行数据质量评估。本发明实施例使用HISAT2软件（参考基因组下载地址见：ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-102/fasta/homo_sapiens/）对指定的基因组作为参考进行序列比对及后续分析，基因组比对率是衡量数据质量的一个标准，通过比对效率，可以评估所选参考基因组组装是否能满足信息分析的需求。本实施例起始量10ug的Sample-1/Sample-2样本Mapped_Reads>90%，Uniq_Mapped_Reads>80%，Multi_Mapped_Reads＜10%，rRNA＜5%，如表2所示。

表2 基因组序列比对结果统计

注：Total Reads：Clean Reads数目，按单端计；

Mapped Reads：比对到参考基因组上的Reads数目及在Clean Reads中占的百分比；

Uniq Mapped Reads：比对到参考基因组唯一位置的Reads数目及在Clean Reads中占的百分比；

Multiple Map Reads：比对到参考基因组多处位置的Reads数目及在Clean Reads中占的百分比。

2、m6A甲基化富集区寻找(Peak Calling)

本发明实施例中获得的Reads比对到基因组上后找出这些短序列在基因组上的富集情况（又称为Peak Calling）。本实施例使用最常用的Peak Calling的软件exome Peak来识别转录本上m6A富集的Peak区，exomePeak包是一个专门用于分析MeRIP-Seq数据的R包，它被证明能够比基于ChIP-Seq的算法获得更好的性能，是分析m6A水平的重要步骤，也是检验数据质量的另一个标准。本实施例识别到的Peak数量大于13000（表3），且m6A修饰主要分布在CDS和3’UTR区域（如图5A和图5B所示），这些结果与目前文献报道一致，甚至更好。

根据识别到的m6A Peak绘制频率分布图（每个样品的m6A Peak落在转录本区域上每个位点的频率），该图反映了Peak在RNA结构上的分布，结果如图5C、图5D所示，表明m6A修饰主要分布在CDS和3’UTR区域附近，该图符合m6A修饰的结构分布特点。

表3 样品识别到的mRNA_Peaks/IncRNA_Peaks数

3、motif分析

在MeRIP-Seq实验中鉴定的Peak区域，为带有m6A位点修饰的区域，此位点对于转录组后水平基因表达的调控起到重要的作用。因此，可以通过鉴定富集在Peak区域的代表性的Motif（over-represented）序列来研究基因转录组水平的调控机制。m6A甲基化位点主要发生在高度保守的特定碱基序列中DRACH(D=A/G/U；R=A/G；H=A/C/U)，通过HOMER(http://homer.ucsd.edu/homer/ngs/peak Motifs.html)软件对Peaks进行motif基序分析。m6A修饰典型motif序列是“GGAC”。本发明实施例Sample-1/Sample-2 motif分析结果如图6所示，motif基序分析结果显示Sample-1/ Sample-2样本有明显的“GGAC”富集，符合m6A修饰的Motif特点，证明本方法捕获m6A修饰的特异性较强。

综上，就微量样本而言，常规MeRIP-seq最少需要300微克的total RNA，但是利用本发明可以将样本起始量降低至500ng，相当于常规起始量的六百分之一。特别对于临床上难以获得的样本或者极其珍贵的微量样本提供了高效的mRNA和IncRNA 的m6A位点分析方法。

本发明提供的技术方案可实现微量样本total RNA的mRNA和IncRNA 中m6A甲基化位点的检测，整个实验过程total RNA完整性高，m6A片段高效富集，且低起始量文库构建文库浓度高、丰度集中；特别注意的是整个流程会对total RNA，m6A-RNA片段，文库分别质控，对后续上机测序和后续测序相关分析提供了保障。有效实现了微量样本中mRNA和IncRNA的MeRIP-seq，适用于组织、细胞、外泌体RNA甲基化修饰的研究，可应用于研发、诊断、治疗等多个领域，是微量样本m6A甲基化检测的最佳选择。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献：

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[3]Meng J, Lu Z, Liu H, et al.A protocol for RNA methylationdifferential analysis with Me RIP-Seq data and exome Peak R/Bioconductorpackage[J].Methods,2014,69(3):274-281.

[4] Daria M, Hong W T, Kei I, et al. Author Correction: Synaptic N6-methyladenosine (m6A) epitranscriptome reveals functional partitioning oflocalized transcripts[J]. Nature Neuroence, 2018, 21.

[5]Kim D, Langmead B, Salzberg S L.HISAT:a fast spliced aligner withlow memory requirements[J].Nature methods,2015,12(4):357.

[6] Li Z, Qian P, Shao W, et al. Suppression of m6A reader Ythdf2promotes hematopoietic stem cell expansion[J]. Cell Research, 2018.

Claims (8)

1.m6A RNA甲基化位点检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取临床微量样本中的总RNA；

2）将步骤1）所得总RNA与m6A特异性抗体、磁珠及IP缓冲液混合，室温孵育；

3）孵育结束后，向步骤2）的混合液中加入核酸裂解酶和RNA酶抑制剂，室温孵育，然后进行磁力分离，去除上清；

4）步骤3）所得RNA磁珠沉淀依次用低盐缓冲液、高盐缓冲液洗涤3-4次，然后加入蛋白酶进行消化，所得消化物进行磁力分离，取上清弃磁珠，得到m6A甲基化修饰的RNA；

5）将步骤4）所得m6A甲基化修饰的RNA进行反转录，得到cDNA，并进行RNA甲基化测序文库的构建，实现对RNA甲基化位点的检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）还包括对所提取的总RNA进行质控的步骤；和/或

步骤5）在进行反转录之前，对m6A甲基化修饰的RNA进行质控。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述的m6A特异性抗体为m6AAntibody，购自Synaptic Systems，货号为202 003；

所述IP缓冲液的组成为：130-160mM NaCl，9-12mM Tris-HCl和0.08%-0.12% IGEPALCA-630；

步骤3）所述的核酸裂解酶为：Protein A-Protein G-微球菌核酸酶，购自Epigentek；

步骤4）所述的蛋白酶为蛋白酶K；

所述低盐缓冲液的组成为：40-60mM NaCl，9-12mM Tris-HCl和0.08%-0.12% IGEPALCA-630；

所述高盐缓冲液的组成为：450-550mM NaCl，9-12mM Tris-HCl和0.08%-0.12% IGEPALCA-630。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）中孵育的条件为：25-30℃孵育时间为1.5h；

步骤3）中孵育的条件为：25-30℃孵育2min；

步骤4）中消化的条件为：55℃反应15min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所得总RNA的RIN值为7以上。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）将500ng-20µg RNA、2µL 1mg/mLm6A特异性抗体、2µL Protein-A磁珠及IP缓冲液配置成200µL的溶液体系。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3）向混合液中加入2µL核酸裂解酶和10µL RNA酶抑制剂；所述RNA酶抑制剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号为R301-01。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤5）中采用SMART去rRNA链特异性方法建库。

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