CN116445583A - 一种用于细胞甲基化检测样本前处理试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明公开了一种用于细胞甲基化检测样本前处理试剂盒及使用方法，试剂盒包括免提取试剂和甲基化重亚硫酸盐转化试剂，免提取试剂由chelex‑100、盐酸胍、NP40、EDTA、Tris‑Hcl、Tween类表面活性剂组成；甲基化重亚硫酸盐转化试剂由亚硫酸铵、硫代乙酸钠、磷酸钠缓冲液、异硫氰酸胍、盐酸胍、EDTA、Tris‑Hcl、乙醇、氢氧化钠和硅羟基磁珠组成。该试剂盒将DNA提取和重亚硫酸盐转化相结合形成甲基化检测样本前处理过程，可充分释放DNA且不干扰重亚硫酸盐转化反应，大大减少了甲基化检测样本前处理时间，且bis‑DNA的转化效率达到99.53%，后续相关的甲基化基因检测性能得到有效提升。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种用于细胞甲基化检测样本前处理试剂盒及使用方法。
背景技术
核酸是长链聚合物分子。单体或重复单元称为核苷酸，因此有时将核酸称为多核苷酸。核酸可以定义为存在于活细胞中的有机分子。核酸是遗传信息从一代传给下一代的关键因素。目前，在医学和分子生物学各个研究领域都离不开核酸的检测，因此核酸的提取纯化是分子生物学研究和临床检测的基础。
现有常用的核酸提取方法有苯酚氯仿抽提法、离心柱纯化、磁珠核酸分离技术等。其中苯酚氯仿抽提法利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，而DNA易溶于水，却不溶于有机溶剂。利用萃取原理，根据蛋白核酸溶于不同的试剂层，经在不同液层抽取所需的组分，即可得到纯化核酸。但在提取过程中使用了有毒有害的有机溶剂，操作步骤繁琐，提取时间长。离心柱纯化法是利用核酸表面会覆盖一层由水分子构成的薄膜，在高盐环境下，这层亲水膜会遭到破坏从而核酸可吸附在离心柱上，而其他杂质如蛋白质、代谢产物等则会被离心沉淀与核酸分离，最后通过洗脱将核酸从吸附膜上脱离，即可得到纯化后的核酸。此方法能够得到纯度较高的核酸，但是需要用到高速离心机，操作复杂，提取时间相对较长。磁珠核酸分离技术是将样品与结合缓冲液和磁珠混合，核酸与磁珠结合后，经过数次洗涤与磁场捕获，洗脱下来的核酸即可通过PCR或其他特定方法来检测特定的DNA。磁珠分离广泛应用于诊断行业，且能实现高通量、自动化的核酸提取方法。
现有的核酸提取方法均能稳定将核酸提取，但仍存在提取操作过程比较复杂，耗时较长，不利于实现快速检测等缺陷。
DNA的重亚硫酸盐转化会将DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化了胞嘧啶则保持不变。尽管这种重亚硫酸转化在理论上很简单，但真正做到高转化率并非那么容易。一般来说，进行甲基化分析时要对重亚硫酸盐的转化效率进行评估，转化的高效率是之后分析的基础。现阶段常用的重亚硫酸盐的转化过程较为繁琐，转化操作时间过长，不利于甲基化检测样本的快速检测。
基于以上对样本DNA提取和重亚硫酸转化的分析，不论是DNA提取还是DNA甲基化转化仍然存在一定的缺陷，主要是操作繁琐、操作时间长、转化效率较低等。因此，需要一种快速DNA提取方法，且同时具备高转化率的转化方法，得到的Bis-DNA可用于后续相关的甲基化基因PCR检测。
发明内容
本发明的目的是真对现有技术中的上述不足，提供一种用于细胞甲基化检测样本前处理试剂盒及使用方法，可简单快速获得bis-DNA。
本发明技术方案详述如下：
第一方面，本发明提供了一种用于细胞甲基化检测样本前处理试剂盒，包括免提取试剂和甲基化重亚硫酸盐转化试剂；
所述免提取试剂由chelex-100、盐酸胍、NP40、EDTA、Tris-Hcl、Tween类非离子型表面活性剂组成；
所述甲基化重亚硫酸盐转化试剂由亚硫酸盐转化液、结合液、漂洗液、脱硫液、洗脱缓冲液、磁珠悬浮液组成，
亚硫酸盐转化液由亚硫酸铵、硫代乙酸钠和磷酸钠缓冲液组成；
结合液由异硫氰酸胍、盐酸胍、EDTA和Tris-Hcl组成；
漂洗液由EDTA、Tris-Hcl和乙醇组成；
脱硫液由EDTA、Tris-Hcl、氢氧化钠和乙醇组成；
洗脱缓冲液由EDTA、Tris-Hcl组成；
磁珠悬浮液由硅羟基磁珠和水组成。
其中，免提取试剂中chelex-100对高价金属离子有很高的亲和力和螯合作用，在低离子强度及煮沸的条件下，可结合NP40、EDTA、Tris-Hcl、Tween类非离子型表面活性剂使细胞膜破裂并结合盐酸胍使蛋白质变性，进而使DNA充分释放。该组合用于细胞DNA免抽提过程只需要90℃3分钟即可获得样本基因组DNA。
所述甲基化重亚硫酸盐转化试剂，亚硫酸盐转化液使转化率提高，且甲基化转化反应时间大大缩短，只需90℃5分钟或50℃10分钟。纯化主要由相应缓冲液（结合液、洗涤液、脱硫液等）和磁珠决定。高浓度的亚硫酸铵配合硫代乙酸钠在甲基化重亚硫酸盐转化过程中既能提高转化效率，同时能够大幅缩短转化时间。
第二方面，本发明提供了上述试剂盒的使用方法，是先用免提取试剂对细胞离心沉淀物进行裂解处理获得DNA，再向DNA中加入亚硫酸盐转化液对DNA进行转化，转化完成后，依次用结合液、漂洗液、脱硫液、洗脱缓冲液、磁珠悬浮液进行纯化，得到Bis-DNA。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明将甲基化相关基因PCR扩增前样本前处理的DNA提取和重亚硫酸盐转化相联合。这种联合能够很大程度上缩短检测时间和操作步骤，且能够获得大量DNA和高转化率bis-DNA。常规单独的DNA提取方法至少需要一个小时以上，单独的甲基化重亚硫酸盐转化方法至少需要2个小时以上。本发明的细胞免抽提试剂，只需90℃ 3分钟即可获得样本基因组DNA。本发明的甲基化重亚硫酸盐转化试剂，转化率高，且甲基化转化反应时间也大大缩短，只需90℃ 5分钟，50℃ 10分钟。因此，本发明中将DNA提取和甲基化重亚硫酸盐转化联合处理时间可缩短至半小时之内，且可获得高质量bis-DNA，用于后续甲基化相关基因PCR扩增或者其他用途。
附图说明
图1为DNA提取chelex-100浓度筛选结果；
图2为DNA提取盐酸胍浓度筛选结果。
图3为DNA提取NP40浓度筛选结果。
图4为DNA提取Tween60浓度筛选结果。
图5为DNA提取Tween类非离子型表面活性剂筛选结果。
图6为DNA提取不同反应条件筛选结果。
图7为甲基化重亚硫酸盐转化硫代乙酸钠浓度筛选结果。
图8为甲基化重亚硫酸盐转化亚硫酸铵浓度筛选结果。
图9为甲基化重亚硫酸盐转化异硫氰酸胍浓度筛选结果。
图10为甲基化重亚硫酸盐转化盐酸胍浓度筛选结果。
图11为甲基化重亚硫酸盐转化氢氧化钠浓度筛选结果。
图12为甲基化重亚硫酸盐转化硅羟基磁珠浓度筛选结果。
图13为甲基化重亚硫酸盐转化不同反应条件筛选结果。
实施方式
下面结合附图和较佳的具体实施例，对本发明的技术方案进行详细解释和说明，以便本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施。实施例中除特殊说明外，所用仪器和试剂均为本领域常规仪器和试剂。
实施例1 细胞免提取试剂的筛选
本发明设计的细胞基因组DNA提取目的在于找到一种快速、简单、方便，且DNA含量高的方法。
本发明采用对细胞基因组DNA免抽提的方法进行提取，此目的主要是充分将细胞基因组DNA释放出来，接着联合后续甲基化重亚硫酸盐转化过程实现对上述免提取DNA转化和纯化，既保证DNA含量充分释放，又不会对后续甲基化重亚硫酸盐转化过程产生抑制或者影响。
因此，对于免提取试剂组分的选择有两个要求：一是充分释放基因组DNA；一是参与免提取试剂的组分不能影响后续的甲基化重亚硫酸盐转化过程。
免提取试剂主要由chelex-100、盐酸胍、NP40、EDTA、Tris-Hcl、Tween类非离子型表面活性剂组成。
所选用DNA提取对照试剂为血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)（天根生化科技（北京）有限公司）和甲基化重亚硫酸盐转化试剂为DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(离心柱型)（DP215-02）（天根生化科技（北京）有限公司）。同时选用HEK293细胞作为后续细胞免提取试剂和甲基化重亚硫酸盐转化试剂的筛选样本。
本发明中免提取试剂组分的浓度分别为：chelex-100含量为3% wt -5% wt；盐酸胍含量为1M-2M；NP40含量为1% wt -1.5% wt；EDTA含量为100 mM-250 mM；Tris-Hcl含量为50 mM-100mM；Tween类非离子型表面活性剂为Tween60，含量为1% wt -1.5% wt。
以下是对免提取试剂各组分试剂和浓度含量的筛选确定：
1、细胞样本准备：选取1mL HEK293细胞进行12000rpm离心1分钟，去上清，利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)（天根生化科技（北京）有限公司）进行细胞基因组DNA的提取，获得DNA作为对照与免提取试剂进行比对。因优先确定免提取试剂各组分组合，所以甲基化重亚硫酸盐转化试剂采用DNA重亚硫酸盐转化试剂盒(离心柱型)（DP215-02）（天根生化科技（北京）有限公司），以确保产品结果的稳定性。
2、免提取试剂各组分浓度的筛选，如下表所示：
备注：EDTA 、Tris-Hcl规用量即可。
3、将上述组分按唯一变量进行筛选确认，免提取反应条件为90℃ 30分钟，筛选结果见附图1-5，最终确定各组分最为合适的浓度为chelex-100含量为3%wt-5%wt；盐酸胍含量为1M-2M；NP40含量为1%wt-1.5%wt；EDTA含量为100 mM-250 mM；Tris-Hcl含量为50 mM-100mM；Tween类非离子型表面活性剂为Tween60，含量为1%wt-1.5%wt。
4、免提取反应条件的筛选：
用步骤3确定的各成分浓度和用量，进行免提取反应条件筛选，如下表所示：
5、经过筛选得出90℃、95℃ 3-30分钟的反应条件均可获得较好的裂解效果，结果如图6所示，为了更好的缩短反应时间，能够更快的完成反应，最终确定反应90℃ 3分钟。
实施例2 甲基化重亚硫酸盐转化试剂的筛选
本发明设计的甲基化重亚硫酸盐转化试剂目的是联合细胞免提取试剂得到bis-DNA，用于后续甲基化相关基因的PCR扩增检测。因此对于甲基化重亚硫酸盐转化试剂而言，一是细胞免提取试剂不能对其产生抑制或者影响；二是其要有更好的转化率，保证bis-DNA的量。
1、甲基化重亚硫酸盐转化试剂包含亚硫酸铵、硫代乙酸钠、磷酸钠缓冲液、异硫氰酸胍、盐酸胍、EDTA、Tris-Hcl、氢氧化钠和硅羟基磁珠，各物质浓度为：硫代乙酸钠、亚硫酸铵含量分别为500mM-1M和3M-5M，用0.5M磷酸钠缓冲液（pH6.0）进行稀释；异硫氰酸胍含量为300mM-500mM；盐酸胍含量为2M-3M；EDTA含量为100 mM-250 mM；Tris-Hcl含量为50 mM-100mM；氢氧化钠含量为100mM-250mM；硅羟基磁珠为直径为0.2微米的磁珠，含量为40mg/mL。
2、甲基化重亚硫酸盐转化试剂由亚硫酸盐转化液、结合液、漂洗液、脱硫液、洗脱缓冲液、磁珠悬浮液多个组分组成。
亚硫酸盐转化液包含亚硫酸铵、硫代乙酸钠、磷酸钠缓冲液；
结合液包含异硫氰酸胍、盐酸胍、EDTA、Tris-Hcl；
漂洗液包含EDTA、Tris-Hcl、乙醇80% v/v；
脱硫液包含EDTA、Tris-Hcl、氢氧化钠、乙醇70%v/v；
洗脱缓冲液包含EDTA、Tris-Hcl；
磁珠悬浮液包含硅羟基磁珠和水。
3、甲基化重亚硫酸盐转化试剂的筛选过程，利用上述细胞免提取DNA作为转化模板，具体如下表所示：
4、将上述组分按唯一变量进行筛选确认，重亚硫酸盐转化反应条件为90℃ 10分钟，50℃30分钟。筛选结果见附图7-12，最终确定各组分最为合适的浓度为硫代乙酸钠含量为500mM-1M；亚硫酸铵含量为3M-5M；异硫氰酸胍含量为300mM-500mM；盐酸胍含量为2M-3M；EDTA含量为100 mM-250 mM；Tris-Hcl含量为50 mM-100mM；氢氧化钠含量为100mM-250mM；硅羟基磁珠为直径为0.2微米的磁珠，含量为40mg/mL。
5、重亚硫酸盐转化反应条件的筛选：
用步骤4确定的各成分浓度和用量，进行转化反应条件筛选，如下表所示：
6、经过筛选得出上述的反应条件均可获得较好的转化率，在上述条件下亚硫酸盐转化液均能表现出较好的转化效率，满足要求。结果如图13所示，为了更好的缩短反应时间，能够更快的完成反应，最终确定反应90℃ 3分钟，50℃ 10分钟。
7、与对照试剂的转化率对比分析，转化率通过7种不同基因片段，共含有426个胞嘧啶，通过对本发明中获得的bis-DNA和对照试剂获得的bis-DNA进行PCR扩增，然后进行测序分析。测序结果分析可知：本发明中获得的bis-DNA的转化率为424（转化成功的胞嘧啶的个数）/426（所有的胞嘧啶）=99.53%；对照试剂获得的bis-DNA的转化率为419（转化成功的胞嘧啶的个数）/426（所有的胞嘧啶）=98.35%；
经过筛选确认细胞DNA免提取和甲基化重亚硫酸盐转化联合作为甲基化检测样本前处理试剂相比于对照能够较好获得bis-DNA，并用于后续甲基化相关基因PCR扩增检测。
实施例3 宫颈脱落细胞样本的验证
选择从中国医学科学院北京协和医院获得120例宫颈脱落细胞样本，其中病理为宫颈癌样本15例，其余均为CIN1或者宫颈炎症样本。将上述宫颈脱落细胞样本用本发明的一种用于细胞甲基化检测样本前处理试剂盒和对照试剂共同提取转化获得bis-DNA。后续通过利用本公司生产的人PAX1和JAM3基因甲基化检测试剂盒(PCR-荧光探针法)（国械注准20233400253）作为后续甲基化PCR扩增检测。具体结果如下表所示。
通过用真实临床样本验证可知，发明试剂所获的Bis-DNA与对照试剂获得的Bis-DNA结果基本一致，检测结果略优于对照试剂，可用于细胞甲基化检测样本前处理。本发明提供的用于细胞甲基化检测样本前处理试剂盒不仅可以在半小时内完成bis-DNA的获得，且DNA的量以及转化率均能够满足于后续甲基化相关基因的PCR扩增检测。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种用于细胞甲基化检测样本前处理试剂盒，其特征在于，包括免提取试剂和甲基化重亚硫酸盐转化试剂；
所述免提取试剂由chelex-100、盐酸胍、NP40、EDTA、Tris-Hcl、Tween类非离子型表面活性剂组成；
所述甲基化重亚硫酸盐转化试剂由亚硫酸盐转化液、结合液、漂洗液、脱硫液、洗脱缓冲液、磁珠悬浮液组成，
亚硫酸盐转化液由亚硫酸铵、硫代乙酸钠和磷酸钠缓冲液组成；
结合液由异硫氰酸胍、盐酸胍、EDTA和Tris-Hcl组成；
漂洗液由EDTA、Tris-Hcl和乙醇组成；
脱硫液由EDTA、Tris-Hcl、氢氧化钠和乙醇组成；
洗脱缓冲液由EDTA、Tris-Hcl组成；
磁珠悬浮液由硅羟基磁珠和水组成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，免提取试剂中，各物质终浓度为：chelex-100 3%wt-5%wt；盐酸胍1M-2M；NP40 1%wt-1.5%wt；EDTA 100 mM-250mM；Tris-Hcl50mM-100mM；Tween类非离子型表面活性剂1%wt-1.5%wt。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，甲基化重亚硫酸盐转化试剂中，各物质终浓度为：
亚硫酸盐转化液：亚硫酸铵3M-5M、硫代乙酸钠500mM-1M，用0.5M磷酸钠缓冲液进行稀释；
结合液：异硫氰酸胍300mM-500mM、盐酸胍2M-3M、EDTA 100mM-250mM，Tris-Hcl50 mM-100mM；
漂洗液：EDTA 100mM-250mM、Tris-Hcl 50mM-100mM、乙醇80%v/v；
脱硫液：EDTA 100mM-250mM、Tris-Hcl 50mM-100mM、氢氧化钠100mM-250mM、乙醇70%v/v；
洗脱缓冲液：EDTA100mM-250mM、Tris-Hcl 50mM-100mM；
磁珠悬浮液：硅羟基磁珠40mg/mL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述Tween类非离子型表面活性剂为Tween60。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，所述硅羟基磁珠直径为0.2微米。
6.权利要求1-5任一所述试剂盒的使用方法，其特征在于，先用免提取试剂对细胞离心沉淀物进行裂解处理获得DNA，再向DNA中加入亚硫酸盐转化液对DNA进行转化，转化完成后，依次用结合液、漂洗液、脱硫液、洗脱缓冲液、磁珠悬浮液进行纯化，得到Bis-DNA。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述用免提取试剂对细胞离心沉淀物进行裂解处理的条件为90℃、3分钟。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述对DNA进行转化的条件是90℃、5分钟；或者，50℃、10分钟。
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