JP2022546519A - 生物試料に由来する微生物rnaの迅速な分離と収集 - Google Patents

生物試料に由来する微生物rnaの迅速な分離と収集 Download PDF

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Abstract

微生物種の検出・同定で、生物試料から微生物RNAを迅速に分離・収集するバルクろ過プロセスとして液体クロマトグラフィーを利用する。様々な実施形態において、生物試料に由来する微生物RNA分子の遺伝子シーケンシングは、生物試料を得た後、液体クロマトグラフィー用の試験試料として調製することによって改良される。液体クロマトグラフィーは、試験試料中のRNA分子の混合物から微生物RNA分子をバルクろ過して、微生物RNA分子を2以上の画分出力に分離・収集するために用いられる。ここで、2つ以上の画分出力のうちの少なくとも1つは、液体クロマトグラフィーの空隙容積内の画分であり、空隙容積内の画分出力を含む、遺伝子シーケンシングのための1つ以上の画分出力を調製し、調製した1つ以上の出力に対して遺伝子シーケンシングを行い、生物試料に由来する微生物RNAを検出する。

Description

本開示は、生物試料からの核酸の分離に関する。より具体的には、本開示は、生物試料に由来する微生物RNAを分離・収集するための、バルク濾過プロセスとしての液体クロマトグラフィーを使用することによる、より効率的で効果的な微生物種の検出・同定に関する。
微生物種の検出・同定は、臨床、環境、または生産のコンテキストにおいて、病気を診断・治療し、汚染源を同定するにあたって重要となる。微生物種には、細菌、ウイルス、原生動物、真菌、藻類、アメーバ、および粘菌が含まれ得る。
特定の微生物種の検出・同定は、患者や製品の評価・治療だけでなく、病院や診療所などの医療関連施設、製造工場や厨房などの食品製造環境などの施設・環境においても有用となり得る。特定の微生物種の検出は、例えば、医療機関において、患者に感染症を引き起こす病原体の存在や正体を把握することにより、適切な治療や救済を可能にするために利用される。またこれと同様の方法が、ヘルスケア、食品産業、長期間の介護産業、ホスピタリティー産業、国土安全保障、航空宇宙産業、さらには民間部門においても用いられている。
残念ながら、そのような臨床、環境、生産のコンテキストから得られた生物試料から微生物種を検出することは、理論や研究のコンテキストで使用される管理された生物試料における微生物種の検出とは異なる。そのような臨床、環境、または生産のコンテキストに由来する生の生物試料は管理や精製がなされておらず、理論または研究のコンテキストにおける生物試料から生じた有用な結果を得るために費やせる時間や費用は、臨床、環境、または生産のコンテキストにおける生物試料から結果を得るために費やせるものを大幅に上回ることになる。
生物試料は独特に複雑であり、尿や糞から全血や血清、無傷組織に至るまで様々な生物学的物質を含み得る。生物試料は、脂質、タンパク質、核およびミトコンドリアDNA、RNA(すなわちtRNA、rRNA、mRNA)を含むことができ、また、哺乳類源の試料と、試料中に存在し、かつ、宿主生物に感染する任意の単細胞生物(すなわち微生物種)との両方に関する上記のすべての巨大分子を含むことになるであろう。一般に、病原体のバイオマーカー(DNAやRNAなど)は、生物試料の供給源のバイオマーカーよりもかなり低いレベルで存在するため、分離や検出が困難である。理論および研究のコンテキストにおける、微生物を検出するための現在の技術は、遺伝子分析に適した関連する使用可能な生物試料を形成するために生物試料に適用される培養・精製技術に依存している。
培養技術は、試料を分析するまでに30時間かかることがあり、それによって特定の微生物種の検出結果に基づいて行動し、好ましくタイムリーな結果を得る能力が遅らせてしまっている。遺伝子配列を増幅するために使用されるそのような培養技術の例は、例えば、米国特許第8,313,931号(20時間インキュベーション)および第9,435,739号(18~24時間インキュベーション)、ならびに3M(登録商標)分子検出システム(https://multimedia.3m.com/mws/media/1353351O/3m-molecular-detection-assay-2-l-monocytogenes-update.pdfで利用できるリンクおよび米国出願公開第2017/0219577A1に記載されているように最大30時間インキュベーション)に記載されている。
例えば米国特許第9,062,303号および第8,383,340号に記載されているような濾過、溶出、または結合技術によって微生物種のバイオマーカーを分離・検出する精製技術。DNaseなどのカオトロピック剤が使用されて臨床試料中のRNA以外のタンパク質を分解している(Tanら,J Biomed and Biotech,2009,Turbo Dnase,ThermoFisherから入手できる,米国特許第10,077,439号)。しかしながら、これらの方法は、非微生物RNAからの微生物RNAの分離を可能にするものではない。同様に、異なる溶解バッファーを用いた共精製により、ヒト血液から大腸菌を抽出する方法が開示されているが(Brenneckeら,J Med Micro,2017,66:301)、これらの方法は、最初に生物試料から標的RNAを抽出した後、残留するDNAを分解して除去することに依存するものである。研究のコンテキストにおいて、特別に調製された滅菌プレートを使用した特定の細菌株の分離は、関連性があり、かつ、遺伝子解析に適した各細菌株の生物試料を得る目的で利用されてきた。次のリンクで入手可能なマテリアルを参照(https://www.wrightlabs.org/metatranscriptomics_2,https://aac.asm.org/content/60/8/4722,https://www.nature.com/articles/s41598-018-21841-9)。残念ながら、この種の精製技術は生物試料のさらなる処理・操作を必要とし、その結果、目的の遺伝子バイオマーカーが劣化する可能性がある。
特に、理論または研究のコンテキストにおいて、微生物DNAを検出するための様々な方法およびシステムが当技術分野で知られている。しかしながら、これらの技術は、微生物DNAの検出に依存しており、生きている微生物種と死んでいる微生物種との存在を区別することはできない。さらに、一般的には、生物試料中の他の種類のDNAが、その生物試料中の微生物DNAの相対量を圧倒するため、従来のDNA同定を用いた微生物DNAの検出には、それらの微生物を確実に検出・同定するために、十分な数の目的の微生物種が増殖した生物試料の培養又は調製が必要となる。
患者の治療や製品の評価だけでなく、施設や環境の評価のための、そのような生物試料中の微生物種をより効果的、効率的かつ迅速に同定するため、重大で意図的な培養または精製をすることなく、生物試料から微生物種のバイオマーカーを迅速に分離・検出できる技術が必要とされている。
本開示の一側面は、病原性生物のバイオマーカーである微生物RNAを分解せずに、バルク濾過によって生物試料を微生物RNA濾過試料に迅速に変換するための方法である。この方法は、後の遺伝子シーケンシング技術によってそのような病原性生物の存在が検出され得る効率を高めるために、液体クロマトグラフィー工程において空隙容積(void volume)を利用することによってなされる。
本開示の別の側面は、生物試料から得られた試験試料を迅速に濾過して、生きているまたは生存している微生物種のバイオマーカーである微生物RNAを分離・収集する方法に関し、これは、意図的に遺伝物質を増殖させるように設計されたステップを実質的に有さないものである。様々な実施形態において、本開示は、生物試料を得るステップと、液体クロマトグラフィーを可能にするために生物試料を消化または調製して試験試料を生成するステップと、液体クロマトグラフィーによるバルク濾過を用いて試験試料から微生物RNA分子を分離・収集するステップとを含む。
本発明の側面によっては、生物試料から得られた試験試料を迅速に濾過して微生物RNAを分離・収集する方法では、宿主RNA分子に対して試験試料から微生物RNA分子を効果的に増幅するために、液体クロマトグラフィーの空隙容積出力のみを用いて宿主RNA分子を含むRNA分子の混合物から微生物RNA分子をバルク濾過することによって、遺伝物質をインキュベートしたり精製したりするステップを省くことが可能である。
一実施形態として、生物試料に由来する微生物RNA分子の遺伝子シーケンシングを改良する方法であって、(a)生物試料を得るステップと、(b)生物試料を試薬と相互作用させることによって生物試料を消化して試験試料を生成するステップと、(c)液体クロマトグラフィーを使用して試験試料中のRNA分子の混合物から微生物RNA分子をバルク濾過し、微生物RNA分子を試験試料から分離・収集するステップとを備える。
一実施形態として、液体クロマトグラフィー法の空隙容積から微生物RNA分子を回収することにより、哺乳類の一本鎖核酸配列と微生物の一本鎖核酸配列とのうちの少なくとも一方の混合物から微生物の一本鎖核酸配列を濾過する方法であって、微生物の一本鎖核酸配列がタンパク質合成のための触媒である。
一実施形態として、生物試料から微生物RNA分子を濾過して微生物RNAを分離する方法であって、生物試料を得るステップと、試料を試薬と相互作用させることによって生物試料を調製するステップと、液体クロマトグラフィー装置を使用して試験試料中のRNA分子の混合物から微生物RNA分子をバルク濾過し、液体クロマトグラフィー装置の空隙容積における微生物RNA分子を試験試料から分離・収集するステップとを備える。
態様によっては、移動相の流速は約0.5mL/分~約3.5mL/分であり、態様によっては約550μL/分~約2mL/分、態様によっては約600μL/分~約1mL/分、他の態様によっては約650μL/分~約850μL/分である。
態様によっては、空隙容積は、0秒以上約6分未満、態様によっては約5分未満、態様によっては約4分未満、態様によっては約3分未満、他の態様によっては約2分未満の保持時間を有する。
態様によっては、濾過された試料物質を含む移動相の複数の画分は液体クロマトグラフィーを用いて溶出され、約5秒から約1分の間、態様によっては約10秒から約45秒の間、態様によっては約15秒から約30秒の間の時間に収集される。ここで、各アリコートは、約100μL~約1mLの間、態様によっては約125μL~約750μLの間、態様によっては約150μL~約500μLの間、態様によっては約175μL~約250μLを含む。
一実施形態として、微生物RNAは、液体クロマトグラフィーを使用して溶出された1つ以上の画分から検出され、微生物RNAは、画分の1つ以上について遺伝子シーケンシングを使用して検出される。態様によっては、1つ以上の画分は、液体クロマトグラフィーを用いて溶出された空隙体積の1つ以上の画分を含み、微生物RNAは、空隙体積を含む1つ以上の画分についての遺伝子シーケンシングを用いて検出される。
態様によっては、各画分は、遺伝子シーケンシングの前に脱水に供される。ここで各アリコートは脱水されて、約15μL~約500μLの間、態様によっては約20μL~約100μLの間、態様によっては約25μL~約75μLの間、好ましい態様によっては約35μL~約65μLの間の体積とされる。
上記の概要は、示された各実施形態または本明細書の主題のすべての実施態様を説明することを意図するものではない。図とそれに続く詳細な説明は、様々な実施形態をより具体的に例証するものである。
添付の図面に関連して以下の様々な実施形態の詳細な説明を考慮することで、本開示の主題についてより完全に理解することができる。
図1は、本発明に係るバルク濾過法の一実施形態の代表的なワークフロー図を示す。 図2は、微生物RNAの分離の代表的なクロマトグラムを示す。 図3は、微生物RNAの分離の代表的なクロマトグラムを示す。 図4は、生物試料中の微生物RNAを同定するための全体プロセスの一部としてバルク濾過法を組み込んだ全体ワークフローの一実施形態の代表的なブロック図を示す。 図5Aは、15秒ごとに収集された画分及び15秒画分に重ね合わされた保持時間を備えた、ホモ・サピエンス(Homo sapiens)RNAに組み合わされた大腸菌(E.coli)RNAを有する試料の分離の代表的なクロマトグラムを示し、これは本発明の特定の実施形態に従って、空隙容積を含む各画分内のピークを示す。 図5Bは、15秒画分のそれぞれに重ね合わされた保持時間無しの図5Aのクロマトグラムである。 図6Aは、大腸菌RNAがホモ・サピエンスRNAに組み合わされた再現可能なものを有する試料の分離の、別の代表的なクロマトグラムを示し、その結果、本発明の特定の実施形態に従って、15秒ごとに収集された画分が、空隙容積を含む各画分内に非常に類似したピークを有している。 図6Bは、15秒画分のそれぞれに保持時間を重ね合わせていない図6Aのクロマトグラムである。 図7は、本発明の特定の実施形態による、元の試料と、液体クロマトグラフィーを用いて画分1~23に濾過し、その後遺伝子シーケンシングをした試料とに関する生のホモ・サピエンスのリードカウントの棒グラフ図である。 図8は、本発明の特定の実施形態による、元の試料と、液体クロマトグラフィーを用いて画分1~23に濾過し、その後遺伝子シーケンシングをした試料との、生の内部標準ERCCカウントの棒グラフ図である。 図9は、本発明の特定の実施形態による、元の試料と、液体クロマトグラフィーを用いて画分1~23に濾過し、その後遺伝子シーケンシングをした試料との、対数変換されたERCC正規化された腸内細菌/ホモ・サピエンス比の棒グラフ図である。 図10は、本発明の特定の実施形態による、元の試料と、液体クロマトグラフィーを用いて画分1~23に濾過し、その後遺伝子配列を決定した試料との、微生物リードとホモ・サピエンスリードとの相対的存在量の棒グラフ図である。
様々な実施形態が様々な修正例や代替形態に修正可能であると同時に、それらの仕様は図面に例として示されており、詳細に説明される。なお当然理解できることであるが、その意図は、特許請求の範囲に記載した発明を、説明する特定の実施形態に限定することではない。それどころか、特許請求の範囲によって規定される主題の趣旨及び範囲内に含まれるすべての修正例、均等物及び代替例をカバーすることを意図している。
本開示に規定される様々な実施形態の説明において、様々な実施形態の開示を理解する上で、以下の定義及び慣例が用いられる。本開示を理解する上で、本開示では、微生物学者によって使用される特定の技術や装置と分析化学者によって使用されるそれらとを統合したり組み合わせたりした様々な実施形態について説明していることは認識されたい。以下の定義及び慣例は、本開示を理解する上で有用で役立つ用語の共通のセットを提供するものである。なぜならば、微生物学者及び分析化学者のそれら2つの領域では、用語の一貫した理解又は用法を有しない場合があるからである。
「哺乳類」、「非微生物種」、または「非微生物群」という用語は、実験室または自然環境における細菌、ウイルス、真菌、または酵母の集団またはそれらの組み合わせ、またはそれらの任意の混合物でなく、かつ、多細胞生物からなる全ての種を包含すると理解される。
「微生物」、「微生物群」、または「微生物種」という用語は、実験室または自然環境における細菌、ウイルス、真菌、または酵母の集団またはそれらの組み合わせ、またはそれらの任意の混合物を包含し、単細胞生物からなるものと理解される。
「生物試料」という用語は、未処理でかつ哺乳類種を起源とする生の生物試料を指し、これには全血、血漿、粘液、血清、尿、糞便、無傷組織、脳脊髄液、滑液、環境スワブ、食物源、および、表面から得られた未知の粉末などが含まれる。したがって、生物試料への言及には、一つ以上の前述の源への言及を含む場合がある。
「試験試料」という用語は、液体クロマトグラフィー装置に導入するための調製後または前処理後の生物試料について言及し、これには、タンパク質、デオキシリボ核酸(DNA)、脂質、及びその他の巨大分子を除去するステップを実施することを含む場合がある。
「二本鎖核酸配列」という用語はDNAを指します。
「一本鎖核酸配列」という用語は、「リボ核酸」すなわち「RNA」を指し、トランスファーRNA(tRNA)、リボソームRNA(rRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、ラージRNA、スモールRNA、変性・非変性RNA、断片化RNAおよび無傷の(intact)RNAを包含すると理解される。
「液体クロマトグラフィー」、「HPLC」、「HPLC装置」等の用語は、様々な実施形態に従って、非微生物RNAから微生物RNAを分離・収集するのに用いられる機械、装置や技法を指す同義語である。
パーセント(%)、重量パーセント(%w/w)、重量体積パーセント(%w/v)、重量%、体積%などの用語は、ある物質の重量を標準室温・圧力における全重量または全体積で除して100を乗じたときのその物質の濃度を指す同義語である。
本開示の組成物中の成分の量、または本開示の方法で採用される回数を修飾する「約」という用語は、例えば、実世界で濃縮物または溶液を作るための典型的な測定手順や取り扱い手順における、手順での故意でないミスによって、これらの組成物および方法を作るために採用される成分の製造、供給元または純度の違いによって、機器(機械)の設定の違いによって、生じ得る数量の変動を指す。
また「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物の平衡条件の違いに起因した異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されているか否かにかかわらず、特許請求の範囲には、その量に対する均等物が含まれる。操作例におけるもの以外、あるいはそうでなければ示されているもの以外の、本明細書で使用される成分量または反応条件を表すすべての数値は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものと理解される。
分子生物学のセントラルドグマは、情報が核酸から核酸へ、または核酸からタンパク質へと渡される可能性があることを説明しているが、タンパク質からタンパク質へ、またはタンパク質から核酸への情報伝達は不可能である。哺乳類と微生物の両方のシステム内で、RNAは、タンパク質の合成、合成のためのアミノ酸の輸送、またはタンパク質の合成の触媒作用のいずれかに関与する核酸配列である。本開示は、RNAがDNAとタンパク質との間の移行分子(transitional molecule)であるという事実を利用し、生物試料内の目的の種およびタンパク質の機能を同定する手段として微生物RNAのバルク濾過を利用する。
RNAには、mRNA、tRNA、およびrRNAと呼ばれる3つの「タイプ」がある。mRNAはタンパク質合成を担当し、tRNAは合成のためのアミノ酸輸送を担当し、rRNAはタンパク質合成の触媒、あるいはタンパク質合成の開始を担当している。mRNAはrRNAの断片よりも比較的大きく、タンパク質のコードに直接関与しているため、よく研究されている。情報の観点からは、mRNAは科学的研究に対して歴史的に最も有意義であると考えられてきた。
RNAに対して関心があるにもかかわらず、この類の分子は分析が困難である。理想的な条件下で何百万年も存続できるDNAとは異なり、RNAは、通常、生物の死後数分で分解される。しかしながら、その半減期が短いため、RNAが検出されれば、通常、分析時に生存していた生物の存在を示唆することになる。
従来の分子生物学や生化学の技術は、これらに限定されないが、複雑な生物系からRNA分子を分離するための、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、酸性グアニジニウムチオシアネート‐フェノール‐クロロホルム抽出(AGPC)、および液液抽出を含む戦略に依存している(Molecular Cell Biology,第4版,Lodishら,W.H.Freeman,1999)。しかしながら、これらの技術の鍵となる限界は、試料中に存在するRNAaseが目的のRNA分子を分解してしまう可能性があることである。さらに、ELISAとPCRの両方の技術を活用するためには、標的RNAの構造に関する事前の知識が必要である(Bioanalytical Chemistry,第2版,Manzら,Imperial College Press,2015)。AGPCおよび液液抽出ではRNA分子を分離することはできるが、これらの技術は、目的のタイプや種にかかわらず、すべてのRNAを分離する。
従来の分子生物学や生化学の技術とは対照的に、従来の分析化学の技術は小分子の分析に適用するよう開発され、従来は核酸などの生体高分子の分析には適さなかった(Bioanalytical Chemistry、第2版、Manzら,Imperial College Press、2015)。
RNAを含む、巨大で複雑な生体分子の分析というユニークな課題に取り組む、ハイブリッドな技術分野、すなわちバイオ分析化学が発展してきた。2次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(2D-PAGE)ゲル、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化-飛行時間(MALDI-TOF)、キャピラリー電気泳動、バイオセンサーの使用により、従来の分子生物学や生化学の手法よりも高い特異性と速さで、目的の生体分子の定量、構造解明、定性分析、分離が全面的に可能となった。
これらの生物学的分析法とともに、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が適応され、巨大な生体分子の分析が可能になった(Principles of Instrumental Analysis,第5版,Skoog and Holler,Harcourt Brace,1998)。HPLCは、カラム(固定相と呼ばれる)と液体(移動相と呼ばれる)との間の相互作用に基づく混合物の化学的分離に依存している。一般的なHPLCカラムは、鋼鉄製の外殻にポリスチレンまたはシラノールのマイクロビーズが充填されており、目的の試料を含む移動相をカラムに通して押し出すと、試料の成分(混合物)が固定相に分配され固定相から出ていく。固定相に「なじむ」成分ほど保持され、成分がカラムから出るまたは溶出するまでの時間が長くなる。成分が検出されると、「クロマトグラム」と呼ばれるプロット上に各成分の「保持時間」が割り当てられる。各カラムには「t」があり、これは「空隙容積」と呼ばれる、カラムによって保持されないすべての分子を指す。この空隙容積は、クロマトグラフィー分析の専門家の間では情報的には重要でないと広く見なされている。なぜならば、クロマトグラムのこの領域には化学的に分離されなかった分子の混合物が含まれるため、クロマトグラムのこの領域は従来利用されず、この領域で見つかった分子は従来研究されず、関心も持たれていない。
本発明の側面によっては、空隙容積は、液体クロマトグラフィーを用いて試料がカラムに導入された時から約6分までの期間を示し、態様によっては、約5分までの期間、態様によっては約4分までの期間、態様によっては約3分までの期間、他の態様によっては約2分までの期間を示し、移動相の流速は約0.5mL/分~約3.5mL/分であり、態様によっては約550μL/分~約2mL/分、態様によっては約600μL/分~約1mL/分、他の態様によっては約650μL/分~約850μL/分である。
生物分析において、逆相液体クロマトグラフィー(RPLC)とイオン交換液体クロマトグラフィー(IE-LC)の2つの様式のHPLCが一般的である。RPLCは、疎水性の固定相を充填したカラムを有し、分子はサイズと極性の両方に応じてカラムから溶出する。疎水性分子は長時間保持され、親水性分子はほとんど保持されない。ほとんどの疎水性分子は、カラムの空隙容積内に溶出する。RPLC内の空隙容積は、カラム固定相と相互作用し損ねた様々なサイズの1つ以上の親水性分子の混合物でできている。
RPLCとは異なり、IE-LCは正味の、全体の電荷によって分子を化学的に分離する。カラム固定相は正味の正電荷を持つミクロスフェア(microspheres)でできており、分子はカラム固定相に吸着され、移動相の塩濃度やpHが上昇すると脱着される。分子はカラムから溶出し、検出される。IE-LCを使用することで、サイズが大きかったり、負電荷が大きかったりするほど分子が最も長く保持され、カラムから溶出するのに時間がかかる。一方、電気的に中性な分子や正電荷を持つ分子は空隙容積に溶出する。この方法は、これまでにもトータルRNAの混合物からmRNAを化学的に分離するために用いられてきたが、RNA収集の手段として空隙容積を調査・利用したことはこれまでにない。
従来、mRNAの研究が最も多く行われてきた。なぜならば、mRNAはrRNAの断片よりも比較的大きく、これにより科学者がより正確かつ迅速に情報を得ることができるためである。このようなmRNAの従来の分析方法では、rRNAやtRNAなどのタイプのRNAをその後の分析用に残すというよりは、除去・廃棄してきた。このような従来のアプローチとは異なり、本開示の様々な実施形態では、微生物RNAを化学的に分離するのではなく、特にさらなるバイオインフォマティクス研究のためにrRNAに重点を置いて、分子生物学のセントラルドグマを利用して、液体クロマトグラフィープロセスの空隙容積で発見された全RNA断片を収集することにより、迅速に微生物RNAを濾過・分離する。
本開示は、生物試料から得られた試験試料を迅速に濾過し、生きている又は生存している微生物種のバイオマーカーである微生物RNAを分離・収集する方法に関する。この方法では、遺伝物質を意図的に増殖させるように設計されたステップを実質的に含まない。様々な実施形態において、本開示は、生物試料を得るステップと、その生物試料を消化または調製して、クロマトグラフィーを可能にする試験試料を生成するステップと、液体クロマトグラフィーによるバルク濾過を利用して試験試料から微生物RNA分子を分離・収集するステップとを含む。
本発明の態様によっては、本発明の方法は、試験試料から微生物RNA分子を増幅するために、遺伝物質をインキュベートしたり、液体クロマトグラフィーを用いて、生物試料が得られた宿主に由来するRNA分子などのRNA分子の混合物から微生物RNA分子をバルク濾過することによって遺伝物質を精製したりする必要をなくすことができる。このように、態様によっては、本発明の方法は微生物RNA分子を効果的に増幅するために、液体クロマトグラフィーの空隙容積のアウトプットのみを用いることによって、試験試料をインキュベートして遺伝物質を増殖させるステップを欠くものである。態様によっては、本発明の方法は、微生物RNA分子を効果的に増幅するために、液体クロマトグラフィーの空隙容積のアウトプットのみを用いることによって、試験試料を精製するステップを欠くものである。
図1で説明するように、臨床試料100が得られる。一実施形態として、臨床試料は、硬質表面に由来する環境スワブであり、そのスワブは、試験バイアル内の緩衝溶液中に抽出される。緩衝溶液は、0.1X~2.5Xリン酸緩衝液(PBS)、0.05M~1.5Mペプトン水、または30%~50%のグアニジン塩酸塩と0.1%~1%のマレイン酸からなってもよい。
別の実施形態では、生物試料は、ヒト及び家畜種を含むがこれに限定されない哺乳類種から得られる組織又は排泄物である。生物試料には、これらに限定されないが、全血、血漿、粘液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、滑液、及び無傷の組織を含む。臨床試料は、特定の形態の生物試料を収集するように確立された任意の他のプロトコルに加えて、採血、パンチ生検、便培養法、鼻腔ぬぐい液、唾液サンプル、尿検査、皮膚学的掻爬によって採取されてもよい。生物試料には、ラージRNA分子、スモールRNA分子、tRNA分子、rRNA分子、mRNA分子、変性および非変性RNA分子、微生物RNA分子、非微生物RNA分子、ゲノムDNA分子、タンパク質分子、およびその他の巨大分子が含まれる。
生物試料は、その後の消化のステップ用に試料を調製して試験試料を生成するため、当技術分野で知られている方法を用いて、適宜、機械的にホモジナイズしてもよく、窒素でキャビテーションしてもよく、超音波処理してもよい。次に、生物試料は、消化のステップ200を経る。臨床試料の消化には、酵素、カオトロープ、界面活性剤、洗剤、及び当技術分野で既知の他の添加剤を含んでもよい。生物試料を消化する工程では、ゲノムDNA分子、タンパク質分子及び非RNA巨大分子を除去し、生物試料の分解を防ぐために低温で行われてもよく、必要に応じて表1に記載のような、標的分子を保護することが知られている添加物を含んでもよい。
表1:臨床試料を消化する間、標的分子を保護するための添加物
Figure 2022546519000002
一実施形態として、生物試料の消化は、生物試料をグアニジニウムチオシアネート、N-ラウロイルサルコシン、及びエタノールと相互作用させることによって臨床試料を溶解させることで開始する。一実施形態として、55%~85%のグアニジニウムチオシアネートと1%~20%のN-ラウロイルサルコシンの緩衝液が、70%~100%エタノール溶液と等量で混合される。一実施形態として、65%~75%のグアニジニウムチオシアネートと1%~10%のN-ラウロイルサルコシンの緩衝液が、70%~100%エタノール溶液と等量で混合される。さらに別の実施形態として、65%~75%グアニジニウムチオシアネートと1%~10%N-ラウロイルサルコシンの緩衝液は、90%~100%エタノール溶液と等量で混合される。
一実施形態として、試料を溶解することによる生物試料の消化は、1容量の臨床試料に対して1~3容量の緩衝液とエタノールの混合物を加えることによって継続する。一実施形態として、2容量の緩衝液とエタノールの混合液が1容量の臨床試料に加えられる。別の実施形態として、200μL~400μLの緩衝液とエタノールの混合液が、1容量の臨床試料に加えられる。一実施形態として、250μL~350μLの緩衝液とエタノールの混合液が1容量の臨床試料に加えられる。
前述の生物試料の混合物は、手動による反転、ボルテックス、または当該技術分野で知られる他の手段のいずれかによって混合された後、500g~2000gで15秒~90秒間遠心分離することによって、シリカまたはポリプロピレンフィルターを介して移された。一実施形態として、15秒~45秒の遠心分離が使用される。フィルターを通過した物質は廃棄され、フィルターに残ったDNAとRNAは、さらなる調製ステップに供される。
生物試料が消化されたら、次のステップの生物試料の調製・洗浄には、塩化グアニジニウム、エタノール、2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-プロパン-1,3-二塩酸塩、およびエデト酸二ナトリウムの少なくともいずれか一つと臨床試料とを相互作用させるステップを含むことができる。一実施形態として、25%~55%の塩化グアニジニウムを含む70%~100%エタノールの混合物を、300μL~500μLの容量で同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、500g~2000gで15秒~90秒間遠心分離する。フィルターを通過した物質は廃棄される。別の実施形態では、12mg/m~790mg/mの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩と、20mg/m~2000mg/mのエデト酸二ナトリウムとの混合物を調製し、400μL~900μLの容量で同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、500g~2000gで15秒~60秒間遠心分離する。フィルターを通過した物質は廃棄される。さらに別の実施形態として、12mg/m~790mg/mの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩と、20mg/m~2000mg/mのエデト酸二ナトリウムとの第2の混合物を調製し、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに、400μLから900μLの容量で加え、500gから2000gで30秒~180秒間遠心分離する。別の実施形態として、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに水を加え、50gから2000gで15秒から60秒間遠心分離する。フィルターを通過した物質が生物試料であり、保持される。
一実施形態として、30~47%の塩化グアニジニウムを含む80%~100%エタノールの混合物を同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、500g~2000gで15秒~60秒間遠心分離する。さらに別の実施形態として、35~45%の塩化グアニジニウムを含む90%~100%エタノールの混合物を、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、500g~2000gで15秒~45秒間遠心分離する。フィルターを通過した物質が生物試料であり、保持される。
別の実施形態として、25mg/m~600mg/mの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩と、50mg/m~1000mg/mのエデト酸二ナトリウムとの混合物を調製し、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに200μL~500μLの容量で加え、500g~2000gで15秒~60秒間遠心分離する。さらに別の実施形態として、25mg/m~600mg/mの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩と、50mg/m~1000mg/mのエデト酸二ナトリウムとの混合物を調製し、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに200μL~500μLの容量で加え、500g~2000gで15秒~60秒間遠心分離する。さらに別の実施形態として、25mg/m~600mg/mの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩と、50mg/m~1000mg/mのエデト酸二ナトリウムとの混合物を調製し、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに200μL~500μLの容量で加え、500g~2000gで15秒~45秒間遠心分離する。
別の実施形態として、25mg/m~600mg/mの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩と、50mg/m~1000mg/mのエデト酸二ナトリウムとの第2の混合物を調製し、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに400μL~900μLの容量で加え、500g~2000gで30秒~180秒間遠心分離する。さらに別の実施形態として、25mg/m~600mg/mの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩と、50mg/m~1000mg/mのエデト酸二ナトリウムとの第2の混合物を調製し、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに600μL~800μLの容量で加え、500g~2000gで30秒~180秒間遠心分離する。さらに別の実施形態として、25mg/m~600mg/mの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩と、50mg/m~1000mg/mのエデト酸二ナトリウムとの第2の混合物を調製し、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに600μL~800μLの容量で加え、500g~2000gで90秒~150秒間遠心分離する。
別の実施形態として、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに水を加え、50g~2000gで15秒~45秒間遠心分離する。さらに別の実施形態として、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに水を加え、1500g~2000gで15秒~45秒間遠心分離する。さらに別の実施形態として、水はDNase/RNaseフリーの水である。
生物試料の消化は、生物試料を、プロテイナーゼK、グアニジニウムチオシアネート、N-ラウロイルサルコシン、エタノール、2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩、及びエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも1つと相互作用させることによって生物試料を洗浄するステップに進む。一実施形態として、洗浄した生物試料に4U~12UのプロテイナーゼKを加え、45℃~65℃で15分~60分保持する。一実施形態として、洗浄した生物試料に4U~8UのプロテイナーゼKを添加し、45℃~65℃で15分~60分間保持する。さらに別の実施形態として、洗浄した生物試料に4U~8UのプロテイナーゼKを添加し、50℃~60℃で15分~60分保持する。さらに別の実施形態として、洗浄した生物試料に4U~8UのプロテイナーゼKを添加し、50℃~60℃で20分~40分間保持する。別の実施形態として、固体組織または複合マトリックスの場合、インキュベーションは1時間から3時間継続する。別の実施形態として、55%~85%のグアニジニウムチオシアネートと1%~20%のN-ラウロイルサルコシンとの混合物の1~3容量を、保持した生物試料に添加する。好ましい実施形態として、55%~85%のグアニジニウムチオシアネートと1%~20%のN-ラウロイルサルコシンとの1~2容量を、保持した生物試料に添加する。さらに別の好ましい実施形態として、65%~75%のグアニジニウムチオシアネートと1%~10%のN-ラウロイルサルコシンとの1~2容量を、保持した生物試料に添加する。
一実施形態として、55%~85%のグアニジニウムチオシアネートと1%~20%のN-ラウロイルサルコシンとの緩衝液を、70%~100%エタノール溶液と等量で混合する。一実施形態として、65%~75%のグアニジニウムチオシアネートと1%~10%のN-ラウロイルサルコシンとの緩衝液を、70%~100%エタノール溶液と等量で混合する。さらに別の実施形態として、65%~75%グアニジニウムチオシアネートと1%~10%N-ラウロイルサルコシンとの緩衝液を、90%~100%エタノール溶液と等量で混合する。実施形態において、これで生物試料は洗浄され、生物試料から試験試料を消化・分離する準備が整ったことになる。
生物試料の消化は、生物試料を55%~85%のグアニジニウムチオシアネート、1%~20%のN-ラウロイルサルコシン、70%~100%エタノール、DNaseI、2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-プロパン-1,3-二塩酸塩およびエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも1つと相互作用させることによって生物試料から試験試料を分離するステップに進む。一実施形態では、生物試料は、まず10,000g以上で1分間遠心分離する。別の実施形態では、遠心分離された生物試料の上清を新しいシリカまたはポリプロピレンフィルターに移し、10,000g以上で1分間遠心分離を行う。フィルターを通過した物質が生物試料であり、保持される。
別の実施形態では、25%~85%のグアニジニウムチオシアネートと1%~20%のN-ラウロイルサルコシンの混合物中の生物試料に、1~3容量の70~100%エタノールを加え、得られた溶液を、手動で反転させるかまたはボルテックス、あるいは当技術分野で知られている他の方法によってよく混合させる。好ましい実施形態では、65%~76%のグアニジニウムチオシアネートと1%~10%のN-ラウロイルサルコシンの混合物中の臨床試料に、90%~100%エタノールを1~2容量添加し、得られた溶液をよく混合する。
別の実施形態では、得られた溶液をシリカまたはポリプロピレンフィルターに移し、10,000g~16,000gで15秒~60秒間遠心分離を行う。好ましい実施形態では、得られた溶液を15秒~45秒間遠心分離する。フィルターを通過した物質は廃棄される。
別の実施形態では、25%~85%のグアニジニウムチオシアネートと1%~20%のN-ラウロイルサルコシンの混合物200μL~600μLをシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、そのフィルターを10,000g~16,000gで15~60秒間、遠心分離する。好ましい実施形態では、65%~75%のグアニジニウムチオシアネートと1%~10%のN-ラウロイルサルコシンをシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、フィルターを10,000g~16,000gで15~45秒間遠心分離する。フィルターを通過した物質は廃棄する。
別の実施形態では、1U~15UのDNaseIをシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、10分~25分間室温で保持する。好ましい実施形態では、3U~8UのDNaseIをシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、10分~25分間室温で保持する。さらに別の好ましい実施形態では、3U~8UのDNaseIをシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、12分~20分間室温に保持する。別の実施形態では、25%~55%の塩化グアニジニウムと70%~99%エタノールとの混合物200μL~700μLをシリカまたはポリプロピレンフィルターに添加し、10,000g~16,000gで15~60秒間遠心分離する。好ましい実施形態では、35%~45%の塩化グアニジニウムと95%~99%エタノールの混合物300μL~500μLをシリカまたはポリプロピレンフィルターに添加し、10,000g~16,000gで15~45秒間遠心分離する。別の実施形態では、12mg/m~790mg/mの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩と20mg/m~2,000mg/mのエデト酸二ナトリウムとの混合物400μL~900μLを、シリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、10,000g~16,000gで、15秒~60秒間遠心分離する。一実施形態では、25mg/m~600mg/mの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩と50mg/m~1,000mg/mのエデト酸二ナトリウムの混合物600μL~800μLを、シリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、10,000g~16,000gで、15秒~45秒間遠心分離する。別の実施形態では、第2の混合物である、12mg/m~790mg/mの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩と20mg/m~2,000mg/mのエデト酸二ナトリウムとの混合物200μL~700μLを、シリカ又はポリプロピレンフィルターに加え、10,000g~16,000gで60~180秒間遠心分離する。一実施形態では、第2の混合物である、25mg/m~600mg/mの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩と50mg/m~1,000mg/mのエデト酸二ナトリウムの混合物300μL~500μLを、シリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、10,000g~16,000gで90~150秒間、遠心分離する。別の実施形態では、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに水を加え、10,000g~16,000gで15秒~450秒間遠心分離する。フィルターを通過した物質が試験試料であり、保持される。
生物試料に由来する試験試料は、必要に応じてさらに、煮沸、変性剤による処理、または-70℃で保存することにより完成されてもよい。一実施形態では、試験試料は、100℃~120℃で10分~30分間煮沸することによって完成されてもよい。別の実施形態では、試験試料は、100℃~105℃で10分~20分間煮沸することによって完成されてもよい。別の実施形態において、試験試料は、試験試料をポリソルベート20、ポリソルベート80、(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニル-ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル、4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニル-ポリエチレングリコール、t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、及びポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテルのうち少なくとも一つを25%~50%備える変性剤で処理することによって完成されてもよい。
別の実施形態では、試験試料は-70℃で保存することによって完成されてもよい。試験試料は、ラージRNA分子、スモールRNA分子、tRNA分子、rRNA分子、mRNA分子、変性RNA分子及び非変性RNA分子、微生物RNA分子、非微生物RNA分子を含み、これで液体クロマトグラフィー300を用いて試験試料から微生物RNA分子を分離・収集するステップを経る準備が整ったことになる。
液体クロマトグラフィーを使用して試験試料から微生物RNA分子のバルクフィルターを行うステップは、試験試料を液体クロマトグラフィー装置310の試料ポートに注入することによって開始する。一実施形態では、注入量は0.1mL~2mLである。一実施形態では、注入量は、0.5~1.5mLである。液体クロマトグラフィー装置310内では、試験試料は、移動相と呼ばれる液体混合物を用いて、多孔性固定相カラム全体に所定の流速でポンプにより送られる。このプロセスはコンピュータ320によって制御される。試験試料は、従来、液体クロマトグラフィー装置310によって処理され、類似の特性を有する成分と、目的の成分とに分離する。典型的には、試験試料の全ての成分は、液体クロマトグラフィー装置310を通って廃液ラインに移動する。しかしながら、本開示の様々な実施形態では、自動または手動のいずれかで、目的の成分330を有する領域が、さらなる同定のために回収容器に回される。様々な実施形態において、微生物RNAの形態の目的成分330は、ダイオードアレイ、UV-Vis、又は示差屈折率検出器のいずれかを用いて検出される。目的成分340なしの領域は、平坦な線(「ベースライン」)として検出される。
液体クロマトグラフィー機器は、移動相中の有機緩衝液の量を、当該移動相中の水性緩衝剤に対して減少させ、その後増加させることにより、微生物RNA分子を非微生物RNA分子から濾過し、これらの分子を分離・収集する。一実施形態として、移動相中の有機緩衝液の量は、表2に示すように、20%~100%の間で変化する。
表2:微生物RNAの分離・収集のための移動相の組成
Figure 2022546519000003
一実施形態では、移動相中の有機緩衝液の量は、表3に示すように、30%~100%の間で変化する。
表3:微生物RNAの分離・収集のための移動相の組成
Figure 2022546519000004
態様によっては水性緩衝液の割合が約40%より大きいとき、態様によっては約45%より大きいとき、態様によっては約50%より大きいとき、態様によっては約55%より大きいとき、態様によっては約60%より大きいとき、空隙容積は液体クロマトグラフィーの移動相に溶出する。態様によっては、空隙容積は、有機緩衝液の割合が約60%未満のとき、態様によっては約55%未満のとき、態様によっては約50%未満のとき、態様によっては約45%未満のとき、態様によっては約40%未満のときに液体クロマトグラフィーの移動相に溶出する。
一実施形態において、ポンプによって送出される液体クロマトグラフィー移動相の流量は、0.5mL~3.5mL/分である。一実施形態では、ポンプによって送出される液体クロマトグラフィー移動相の流量は1mL/分~2.5mL/分である。さらに別の実施形態では、ポンプによって送出される液体クロマトグラフィー移動相の流量は1mL/分~1.5mL/分である。
態様によっては、液体中の移動相の流量は、約0.5mL/分~約3.5mL/分、態様によっては約550μL/分~約2mL/分、態様によっては約600μL/分~約1mL/分、態様によっては約650μL/分~約850μL/分である。
移動相は、有機緩衝液と水性緩衝液の2つの緩衝液の混合物として送られる。一実施形態では、水性緩衝液は、0.05~0.9Mの酢酸トリエチルアンモニウム、リン酸、クエン酸、重炭酸アンモニウム、ギ酸、乳酸、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸、マレイン酸、ジエタノールアミン、ピペリジン、エタノールアミンおよびトリエタノールアミンのうちの少なくとも1つを含む。特に、酢酸トリエチルアンモニウム、ギ酸、乳酸、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸、マレイン酸、トリエタノールアミン、ピペリジンのうちの少なくとも1つを含む0.05M~0.5M緩衝液が用いられ、より好ましくは酢酸トリエチルアンモニウム、ギ酸、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸、マレイン酸、およびトリエタノールアミンのうちの少なくとも1つの水性緩衝液の0.05M~0.2M溶液が用いられる。
別の実施形態では、有機緩衝液は、5%~60%のアセトニトリル、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、アセトン、テトラヒドロフランのうちの少なくとも1つに、0.05M~0.9Mの水性緩衝液を混合したものを含む。特に、有機緩衝液は、7%~50%のアセトニトリル、メタノール、エタノール、1-プロパノール、及びアセトンのうちの少なくとも一つに、0.05M~0.5Mの水性緩衝液を混合したものを含む。一実施形態では、有機緩衝液は、10%~40%のアセトニトリル、メタノール、およびアセトンのうちの少なくとも1つに0.05M~0.5Mの水性緩衝液を混合したものを含む。
様々な実施形態による方法では、非極性化合物が、ポリマービーズ、ポリマーミクロスフェア、または重合ブロックのいずれかの形態で、多孔性固定相カラムとして機能する。その正確な形態に関係なく、ポリマー固定相カラムは本質的に多孔性であり、これはポリマー固定相カラムが細孔によって特徴付けられることを意味する。固定相カラムの材料は市販されており、コーティングされていないか、あるいはビーズまたはマイクロスフィア表面の細孔を覆うように設計された特殊なポリマー化合物でコーティングされており、微生物RNAが固定相カラムの材料と不可逆的に相互作用しないようにすることができる。固定相カラムの外側構造内にはポリマーミクロスフェアがあり、これは好ましくはアルキル化非多孔性ポリスチレン-ジビニルベンゼン共重合体からなる。固定相カラムには、8.0μm~50μm、好ましくは8.0μm~25μmの粒径のミクロスフェアが備えられている。その結果、固定相カラムの細孔径は1000A~5000A、特に1000A~4000A、より好ましくは2000A~4000A、または2500~4000Aの細孔径である。固定相カラムは、幅4mm~30mm×長さ40mm~150mm、好ましくは幅5mm~10mm×長さ40mm~100mm、さらに好ましくは幅7mm~9mm×長さ40~60mmの寸法を有していてもよい。一実施形態によれば、固定相カラムは、周囲温度で操作されてもよく、より好ましくは20℃から27℃で制御されてもよい。
微生物RNAは、移動相と固定相カラムのミクロスフェアおよび細孔との選択的な相互作用により、固定相カラム内で非微生物RNAから濾過・分離される。濾過と分離が行われると、微生物RNAと非微生物RNAとは異なるタイミングで固定相カラムから出て、すなわち溶出して、カラムの空隙容積に溶出した微生物RNAとともに検出器によって検出される。一実施形態では、分離された微生物RNAの検出は、固定相カラムの出口で液体クロマトグラフィー装置に結合されたUV-Visまたはダイオードアレイ検出器で行われる。その検出波長は200nm~220nm、特に203nm~217nm、さらに好ましくは205nm~215nmである。別の実施形態では、分離された微生物RNAの検出は、固定相カラムの出口で液体クロマトグラフィー装置に結合されたUV-Visまたはダイオードアレイ検出器で行われる。その検出波長は、250nm~270nm、特に257nm~267nm、さらに好ましくは255nm~265nmである。別の実施形態では、分離された微生物RNAの検出は、固定相カラムの出口で液体クロマトグラフィー装置に連結され、屈折率のデフォルト範囲が0.75RI~2.00RI、特に0.9RI~1.90RI、さらに好ましくは1.00RI~1.75RIに設定された示差屈折率検出器を用いて行われる。
分離された微生物RNAは、クロマトグラムと呼ばれるデータのトレースで検出される。分離された微生物RNAの例示的なクロマトグラムを図2および3に示す。0分から3分の間のウィンドウに観察されるピークは、分離された微生物RNAに対応する。非微生物RNAは、Kettererら(US8,383,340参照)が開示するように、7分~15分のウィンドウに検出されるであろう。微生物RNAが検出された場合、目的の化合物(例えば微生物RNA)を含む移動相は、将来的な同定または実験のために廃液ラインから試料収集バイアルに回される。
態様によっては、液体クロマトグラフィーから出る移動相の試料収集は、空隙容積と、非微生物RNAに関連するピークに対応する移動相の少なくとも一部とを含む。態様によっては、目的の化合物(例えば微生物RNA)を含む移動相は、溶出試料の1つ以上の画分に収集されてもよい。態様によっては、溶出試料の複数の画分が、任意の目的の化合物を含む移動相がカラムから溶出する際に、時間、体積、またはその両方に基づき収集される。
態様によっては、各画分は、約5秒から約1分の間、態様によっては約10秒から約45秒の間、態様によっては約15秒から約30秒の間の時間でカラムから収集される。態様によっては、収集された各画分は、約100μL~約1mLの間、態様によっては約125μL~約750μLの間、態様によっては約150μL~約500μLの間、態様によっては約175μL~約250μLの間の体積を有している。
態様によっては、空隙容積の少なくとも一部が、少なくとも1画分~最大約72画分、態様によっては少なくとも1画分~最大約36画分、他の態様によっては少なくとも1画分~最大約24画分の所望の画分数で収集されてもよい。
その試料体積が液体クロマトグラフィーから1つ以上の画分に収集された後、1つ以上の画分の各々は、遺伝子シーケンシングに供することができる。
一実施形態では、微生物RNAは、液体クロマトグラフィーを用いて空隙容積から溶出された1つ以上の画分から検出される。ここで、空隙容積から溶出された1つ以上の画分のうちの少なくとも1つから遺伝子シーケンシングを使って微生物RNAが検出される。
態様によっては、各画分は、遺伝子シーケンシングの前に脱水に供される。ここで各画分は脱水されて、約15μL~約500μLの間、態様によっては約20μL~約100μLの間、態様によっては約25μL~約75μLの間、好ましい態様によっては約35μL~約65μLの間の体積とされる。
態様によっては、コントロールを生物試料に導入し、非微生物RNAに対して微生物RNAを正規化したりモニタリングしたりしてもよい。態様によっては、コントロールは、生物試料を消化するステップの前、または生物試料が消化された後、液体クロマトグラフィーに導入される試験試料とともに生物試料に導入されてもよいし、あるいは所望の試料が遺伝子シーケンシングに供されるときに生物試料に導入されてもよい。コントロールは、空隙容積と通常の試料分離容積の両方にカラムから溶出するように選択されることが好ましい。コントロールは、微生物RNAまたは試料RNAと干渉しない任意の所望の供給源から選択することができる。好ましい態様によっては、コントロールは、サーモフィッシャーサイエンティフィックから市販されているERCC RNAコントロールやERCC RNAコントロールAmbion(登録商標)などの合成により誘導されたRNAである。
本開示に従った様々な実施形態を用いることにより、目的の全ての微生物RNAを同時に分離・収集することが可能となり、それによって将来的に生物試料内の全ての生存(生きている)微生物種の同定、またはその後の微生物RNAの構造解明、定量、もしくは定性分析が可能となる。本開示の様々な実施形態によって、グラム陽性菌、グラム陰性菌、細菌芽胞、エンベロープウイルス、ノンエンベロープウイルス、RNAウイルス、真菌、酵母、及び原生動物から微生物RNAを同時に分離・収集することが可能になる。本開示の方法を用いて微生物RNAとして濾過、分離、収集される試験試料内の例示的な微生物種が表4に見出される。
表4.臨床試料からRNAを分離・収集することによって検出された微生物種
Figure 2022546519000005
図4は、生物試料中の微生物RNAを同定するための全体プロセスの一部として、バルク濾過法を組み込んだ全体ワークフローの一実施形態の代表的なブロック図である。410において、生物試料402は、臨床、生産、又は環境のいずれかの場面からサンプリングされ、収集される。生物試料は、それがサンプリングされた場面のすぐ近くの設備である様々な実施形態に従って処理されてもよいが、他の実施形態として、生物試料402は、420で異なる施設に輸送されて様々な実施形態に従って濾過法を行うこともできる。様々な実施形態を通して生物試料を試験試料へと転換し、液体クロマトグラフィーを用いて微生物RNAを分離・収集することを可能にする。430において、分離・収集された微生物RNAを含む試験試料404が、様々な実施形態に従って、HPLCの空隙容積内に生成される。次いで、微生物RNAのみを有する試験試料404は、440でシーケンシングされ、試験試料内の全ての生存している(生きている)微生物種を同定する。他の実施形態として、440には、微生物RNAの構造解明、定量、又は定性分析を含むことができる。生物試料から得た生存微生物種の同定結果は、データベース450に収集され、安全なネットワークインターフェースを介してアクセス可能なユーザーインターフェース460を介して提示又は報告され得る。
実施例
試験は、液体クロマトグラフィーを用いて微生物RNAとヒトRNAの混合物を濾過するとともに、遺伝子シーケンシングのための後のライブラリーを調製して実施した。使用した材料は、ヒトRNAとしてユニバーサルヒトリファレンス(Thermofisher QS0639;Lot244273)、微生物RNAとして大腸菌の全RNA(Thermofisher AM7940;Lot2219538),RoboSepカラム,Wave Optimized(登録商標)A,Wave Optimized B,Wave Optimized C,ヌクレアーゼフリーの超純水(NFW)である。
HPLC(Agilent 1260 Infinity II)は、0.75mL/分の一定流速に設定し、カラム温度はラン全体の間、約75℃に保持し、DADは260nm(バンド幅1nm)で検出するよう設定し、フラクションコレクターは0:30~12分までの15秒画分を収集するように設定し、試料は50μL注入した。HPLCは、表5に示す移動相グラジエントを有するように設定した。
表5.移動相溶出グラジエント(流速0.75mL/分)
Figure 2022546519000006
ヒトRNAは、全10μLのストックを190μLの冷却NFWで希釈することによって、1,000ng/μLから50ng/μLまでヌクレアーゼフリーの超純水で希釈した。大腸菌RNAをNFWで10ng/μLに2段階で希釈した。(i)1,000ng/μLの大腸菌RNAストック10μLを90μLの冷却NFWに希釈し、100ng/μLのアリコートを得た。そして(ii)100ng/μLの希釈濃度の10μLを90μLの冷却NFWに希釈して10ng/μLのアリコートを得た。50ng/μLのヒトRNA(950ng)19μLを、10ng/μLの大腸菌RNA(50ng)5μLと混合し、ヒトRNAに対して5%の大腸菌RNAを含む試料を生成した。この混合液に76μLの冷却NFWを加えて100μLにした。
その後、混合RNA試料を新しい滅菌PCRプレートの位置A1にプレーティングすることによって画分収集を行いながらHPLC上で濾過し、4℃で保持するHPLCにロードした。この方法を開始し、50μL(~500ng)の試料をカラムに注入した。0:30から12分までの画分を15秒間隔で新しい滅菌済みPCRプレートに収集した(すなわち、30秒の収集につき2画分)。収集した各画分は、15秒ごとに約0.188mLとなった。この時間は、このプロトコルでのリボラブラーハイレンジラダー(RiboRubler High Range Ladder)ランに基づく0~6000ntのサイズと一致する。図5A~5Bのクロマトグラフをその試料について得た。図5A~5Bにおける15秒ごとの画分のクロマトグラフに示されるように、マイナーピークが約1.3分、2.1分、2.7分の保持時間でカラムから空隙容積内に溶出する一方で、メジャーピークは8分後~約12分までカラムから溶出した。
0:30秒から6分までのピークは、RNの吸光度が低かった。理論に束縛されるものではないが、その空隙容積内のこれらの画分は、スモールRNA分子、RNA断片、二次および三次特徴を有するRNA分子やmRNAから構成されていると思われる。空隙容積(例えば8分から12分の保持時間)の後には、2つの大きなピークがあり、理論に束縛されるものではないが、それらはより大きなmRNA転写物またはrRNA転写物で構成されていると思われる。
さらに50μLの試料(~500ng)をカラムに注入し、この方法を繰り返した。図6のクロマトグラフは、その繰り返した試料について得られたものである。図5と図6のクロマトグラフはほぼ同じであり、本方法の再現性を裏付けている。
次いで、収集した画分は、ジモクリーン(Zymo Clean)とコンセントレイト(Concentrate)-5キットとを用いてRNAを定量する前に濃縮した。0:30から12分の間の時間の15秒収集画分のうち2つ(例えば0:30~0:45と0:45~1分、1~1:15と1:15~1:30など)を、滅菌したヌクレアーゼフリーの5mLチューブにまとめて入れ、約375μLの組み合わせ画分を提供するようにした。750μL(2X画分容量)のRNA結合バッファーを各画分に添加した後、振とうしてよく混合した。1.125μLの200プルーフのエタノール(1X画分+バッファー容量)をその混合物に加え、振とうしてよく混合した。その後、800μLまで混合物をシリカフィルタにかけ、10,000×gで30秒間回転させて結合させた。これは3ステップを経た。400μLのRNAプレップバッファー(Prep Buffer)を、全RNAを結合した後のフィルターに加えた後、10,000×gで30秒間洗浄した。その後、700μLのRNA洗浄バッファーを、前のフロースルーを除去した後のフィルターに加え、10,000×gで30秒間洗浄した。フロースルーを捨てた後、400μLのRNA洗浄バッファーをそのフィルターに加え、10,000×gで1分間洗浄した。その後、カラムを新しい滅菌済みヌクレアーゼフリーの微量遠心管に注意深く移した。新しいものに入ったらすぐに、同様にラベル付けされたチューブのヌクレアーゼフリー水15μLをそのフィルターに加え、全RNAを10,000×gで1分間溶出させた。
遺伝子シーケンシング用に得た画分に対応する画分濃度を表6に示す。
表6.HPLC画分とアッセイ画分間の画分表
Figure 2022546519000007
その後、溶出したRNA画分をQuanti-T RNA HSアッセイで定量した。これの設定は、15mLコニカルチューブに6766μLのQuant-iT RNAバッファーを加えた後、34μLのQuant-iT RNA試薬を加え、10秒間ボルテックスにより混和して行った。表6に示す各アッセイ画分の3μLのアリコートを、カラム12の標準物質(standards)とともにプレートにまいた(3μLのRNAインプット)。その後、30秒の軌道振とうと、2分のインキュベーションの後、Tecan infinite pro 200プレートリーダーでそのプレートを読み取った。その定量結果を表7に示す。
表7.RNA定量結果
Figure 2022546519000008
表7に示すように、画分の濃度は0.1~69.1ng/μLであった。これらの濃度は、シーケンシング用のRNAを調製するためのライブラリー調製に対する入力として使用された。合成ERCC内部コントロールスパイク1μL(15pg)とともに精製RNA7μLを、イルミナ用のNEBNextマルチプレックスオリゴ(96の固有のデュアルインデックスプライマーペア)とともに、NEBBEXTシングルセル/低インプットRNAライブラリー調製プロトコルに投入した。このプロトコルには要約して以下のものが含まれる。(i)7μLのオリジナルの5%大腸菌RNAが後の比較用の位置に調製され、(ii)ノーテンプレートコントロール(NTC)が、3.5μLのプレランHPLCフロースルー及びZymo濃縮器キットに入ったNFW3.5μLとともに、一定位置に加えられ、(iii)画分18と19はそれぞれ1μLのRNAインプットを有し、それらの濃度は他の画分よりはるかに高いため、NFWで7μLにし、(iv)これら二つの画分18と19はクロマトグラムにおいて大きなピークで一致した。RTプライマーは、各RNA試料に1μLのプライマーを加えた後、RNAにアニーリングさせた。次に、プライマーを付けた(Primed)RNAを、15サイクルのcDNA増幅と6サイクルのライブラリーPCRを用いてcDNAに逆転写した。その後、増幅されたcDNAは、純度を上げるためにAmpure XPビーズで2回精製した。その後、精製されたcDNAは、次にQuant-iT dsDNA 1Xアッセイを用いて定量され、表8に示す濃度を有していた。
表8.増幅されたcDNAの濃度
Figure 2022546519000009
定量後、各試料についてcDNAを40ng入力に正規化した(この量を入力できない濃度であった画分1、画分15、及び画分23を除き、全量を製造元のプロトコルに従って加えた)。その後、正規化したcDNAを断片化し、末端修復した。末端修復されたcDNAは、イルミナのアダプターとライゲーションされた。ライゲーションされたcDNAは、Ampure XPビーズでクリーンアップされ、ライゲーションされていないアダプターが除去された。一旦精製されたら、そのcDNAは、20~100ngのcDNAインプットのためにライブラリーPCRを6サイクル行い、PCRエンリッチメントを行った。PCR後、増幅されたライブラリーをAmpureXPビーズで精製し、その後、表8に示す正規化濃度でQuant-iT dsDNA 1Xアッセイを用いて定量した。
各試料は各試料につき25ngずつプールした(ただし、画分23はインプットが十分でなかったため、その全量を加えた)。プールされた試料は、0.9x容量のAmpureXPビーズを用いた追加精製を行い、残存する不純物を除去し、試料を濃縮した。プールされた純粋な試料の濃度は9.88ng/uL(予想サイズは300bpで~50nM)であった。この精製シーケンスライブラリーは、イルミナのプロトコルに従ってローディング濃度に希釈・変性されて、表9に示すインデックスを使用して、150サイクルのV2高出力ケミストリーのNextSeq550でシーケンシングした。
表9.シーケンスのインデックス
Figure 2022546519000010
各HPLC画分およびHPLC分画前の元の試料について、シングルエンドのFASTQファイルを作成した。その後、すべてのFASTQファイルに対して、FASTQファイルの品質フィルタリングと配列アノテーションとを並行して実施することによってFASTQファイルを処理した。フィルタリングされたリードは、手動でキュレーションされたデータベースを用いてアノテーションされた。すべてのデータベース配列は、参照ゲノム核酸配列に共通のコンタミリードついて問い合わせ、かつ、そのような領域をマスクして系統的なミスアノテーションを防ぐプラットフォームを使用して、あらゆるコンタミリードをフィルタリングしている。完成後、微生物、ホモ・サピエンス、及びERCC内部コントロールのアノテーション数からなるデータフレームを、表10に示すように突き合せた。
表10.シーケンス数リードカウント
Figure 2022546519000011
元の試料と画分1~23との生のホモ・サピエンスのリードカウントは、図7に提供される棒グラフに示されており、これは、画分11より下のホモ・サピエンスのリードカウントが比較的少ないことを示している。画分11より下のホモ・サピエンスのリードカウントが相対的に欠如していることにより、空隙容積に対応するこれらの画分における微生物RNAの存在が高められている。
元の試料と画分1~23との生の内部標準ERCCカウントは、図8に提供される棒グラフに示されており、これは、液体クロマトグラフィー溶離液の分画が特定のRNAを選択していることを示している。画分14までは、ホモ・サピエンス画分が相対的に枯渇している。
観測された微生物およびホモ・サピエンスのアノテーション数は、各試料内の観測されたERCC配列数によって正規化し、その後1,000,000の係数を掛けた。計算された腸内細菌とホモ・サピエンスとのERCC正規化カウントを抽出し、図9に提供されるように、元の試料および画分1~23の各々内で正規化されたカウントである腸内細菌対ホモ・サピエンスの比率を計算した。図9の棒グラフは、液体クロマトグラフが微生物含有量に基づいて除外しないように、各画分全体のホモ・サピエンスに対するERCCの比率が、微生物含有量についてフィルタリングしていることを示している。
元の試料および画分1~23の微生物リード(各棒の上部分)とホモ・サピエンスリード(各棒の下部分)の相対的存在量が、図10に提供される棒グラフに示されている。注釈付きリードの分布は、空隙容積画分における微生物リードの相対的な増幅を示す。具体的には、画分2のリードの約5%と、画分3のリードのほぼ8%とが、微生物リード(大腸菌RNA)に起因している。ここで、元の試料中の微生物リードは約0.03%である。液体クロマトグラフィーの空隙容積の出力によって、宿主RNA分子に対する試験試料に由来にする微生物RNA分子を、元の試料における1/1,000,000と比較して、空隙容積においては約1/20~約1/10に効果的に増幅している。本方法の特定の実施形態の効果的な増幅により、ピクトグラムからナノグラムの範囲の遺伝物質におけるRNA検出が可能になる。
実施形態
以下の実施形態は、例示としてのみ与えられるものであり、添付の特許請求の範囲に規定される請求項の発明の範囲を限定しようとするものではない。
I.生物試料から微生物RNA分子を濾過して微生物RNAを分離する方法であって、
(a)生物試料を得るステップと、
(b)試薬を試料と相互作用させることにより生物試料を消化して試験試料を生成するステップと、
(c)液体クロマトグラフィーを用いて試験試料中のRNA分子の混合物から微生物RNA分子をバルク濾過し、試験試料から微生物RNA分子を分離・回収するステップとを備える。
II.実施形態Iの方法であって、生物試料が哺乳類試料である。
III.実施形態Iの方法であって、生物試料が、次のうちの少なくとも1つを含んでいる。ラージRNA分子、スモールRNA分子、tRNA分子、rRNA分子、mRNA分子、変性および非変性RNA分子、微生物RNA分子、非微生物RNA分子、ゲノムDNA分子、タンパク質分子、および他の巨大分子。
IV.実施形態IIIの方法であって、生物試料を消化するステップによって、ゲノムDNA分子、タンパク質分子、及び他の巨大分子を除去する。
V.実施形態Iの方法であって、微生物RNA分子が、真菌、ウイルス、原生動物、アメーバ、または細菌RNAを含む。
VI.実施形態Iの方法であって、生物試料を得るステップが、滅菌技術または殺菌技術のうちの少なくとも1つを使用して臨床環境において行われる。
VII.実施形態Iの方法であって、生物試料を消化するステップで、試薬として溶解試薬を使用する。
VIII.実施形態Iの方法であって、液体クロマトグラフィーを使用するステップに、液体クロマトグラフィー装置の試料ポートに試験試料を注入する手順を含む。
IX.実施形態VIIIの方法であって、液体クロマトグラフィー装置によって、移動相中の水性緩衝液に対して移動相中の有機緩衝液の量を減少させ、その後に増加させることによって、微生物RNA分子を分離する。
X.実施形態IXの方法であって、移動相中の有機緩衝液の量が30%~100%である。
XI.実施形態VIIIの方法であって、微生物RNA分子が、液体クロマトグラフィー装置において、205nm~215nmの波長で検出される。
XII.実施形態VIIIの方法であって、微生物RNA分子が、液体クロマトグラフィー装置において、255nm~265nmの波長で検出される。
XIII.実施形態VIIIの方法であって、液体クロマトグラフィー装置が分離する微生物RNA分子が、廃液ラインから移動相を流用することによって収集される。
XIV.実施形態VIIIの方法であって、液体クロマトグラフィー装置の流速が1mL/分~2.5mL/分である。
XV.実施形態IXの方法であって、水性緩衝液が、酢酸トリエチルアンモニウムの0.05M~0.2M溶液、リン酸、クエン酸、重炭酸アンモニウム、ギ酸、乳酸、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸、マレイン酸、ジエタノールアミン、ピペリジン、エタノールアミン及びトリエタノールアミンのうちの少なくとも1つからなる。
XVI.実施形態IXの方法であって、有機緩衝液が、少なくとも10%~40%のアセトニトリル、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、アセトン、及びテトラヒドロフランのうちの1つにおける0.05M~0.2M水性緩衝液の混合物を含む。
XVII.実施形態VIIの方法であって、生物試料を消化するステップが、以下のステップを含む。
(a)生物試料を、グアニジニウムチオシアネート、N-ラウロイルサルコシン、及びエタノールのうちの少なくとも1つと相互作用させることによって生物試料を溶解するステップと、
(b)生物試料を、塩化グアニジニウム、エタノール、2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩、およびエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも1つと相互作用させることにより生物試料を洗浄するステップと、
(c)生物試料を、プロテイナーゼK、グアニジニウムチオシアネート、N-ラウロイルサルコシン、エタノール、2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩、およびエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも1つと相互作用させることによってクリーニングするステップと、
(d)生物試料を、55%~85%のグアニジニウムチオシアネート、1%~20%のN-ラウロイルサルコシン、70%~100%エタノール、DNaseI、2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩、およびエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも1つと相互作用させることにより、生物試料から試験試料を分離するステップ。
XVIII.実施形態XVIIの方法であって、生物試料を溶解するステップが、生物試料を55%~85%のグアニジニウムチオシアネート、1%~20%のN-ラウロイルサルコシン、及び70%~100%のエタノールのうちの少なくとも1つと相互作用させることによって完了する。
XIX.実施形態XVIIの方法であって、生物試料を洗浄するステップが、生物試料を、25%~55%の塩化グアニジニウム、70%~99%のエタノール、12mg/m~790mg/mの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩、及び20mg/m~2,000mg/mのエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも1つと相互作用させて完了する。
XX.実施形態XVIIの方法であって、生物試料をクリーニングするステップが、臨床試料を、4U~12UのプロテイナーゼK、55%~85%のグアニジニウムチオシアネート、1%~20%のN-ラウロイルサルコシン、及び70%~100%のエタノールのうちの少なくとも1つと相互作用させることによって完了する。
XXI.実施形態XVIIの方法であって、生物試料から試験試料を分離するステップが、生物試料を、1U~15UのDNaseI、25%~85%グアニジニウムチオシアネート、1%~20%のN-ラウロイルサルコシン、70%~100%のエタノール、DNaseI、12mg/m~790mg/mの2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-プロパン-1,3-二塩酸塩および20mg/m~2,000mg/mのエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも1つと相互作用させることによって完了する。
XXII.実施形態XXIの方法であって、生物試料から試験試料を分離するステップが、試験試料を煮沸するステップ、試験試料を変性剤で処理するステップ、または試験試料を保存するステップのうちの少なくとも1つのステップで完了する。
XXIII.実施形態XXIの方法であって、臨床試料から試験試料を分離するステップが、試験試料を100℃~120℃で10分~30分間煮沸することによって完了する。
XXIV.実施形態XXIIの方法であって、試験試料を変性剤で処理するステップが、試験サンプルをポリソルベート20、ポリソルベート80、(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニル-ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル、及び4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)フェニル-ポリエチレングリコール、t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテルのうちの少なくとも1つの25%~50%と相互作用させることによって完了する。
XXV.実施形態VIIIの方法であって、液体クロマトグラフィー装置が分離する微生物RNA分子が、0分~3分の溶出時間で検出される。
XXVI.液体クロマトグラフィー装置の空隙容積から微生物RNA分子を回収することにより、哺乳類の一本鎖核酸配列と微生物の一本鎖核酸配列とのうちの少なくとも一方の混合物から微生物の一本鎖核酸配列をフィルタリングする方法であって、微生物の一本鎖核酸配列がタンパク質合成のための触媒である。
XXVII.実施形態XXVIの方法であって、空隙容積が、クロマトグラムの初期時間(initial time period)によって表される。
XXVIII.実施形態XXVIIの方法であって、初期時間が0分~6分である。
XXIX.実施形態XXVIIIの方法であって、空隙容積内の微生物RNA分子が正に帯電している。
XXX.実施形態XXVIIIの方法であって、空隙容積内の微生物RNA分子が正味ゼロ電荷を運ぶ。
XXXI.実施形態XXVIIIの方法であって、空隙容積内の微生物RNA分子が、1ヌクレオチド~280ヌクレオチドのサイズを有する。
XXXII.生物試料から微生物RNA分子を濾過して微生物RNAを分離する方法であって、生物試料を得るステップと、試薬を試料と相互作用させることにより試験試料を生成するための生物試料を調製するステップと、液体クロマトグラフィー装置を用いて、試験試料中のRNA分子の混合物から微生物RNA分子をバルク濾過し、液体クロマトグラフィー装置の空隙容積の試験試料から微生物RNA分子を分離・回収するステップとを備える。
XXXIII.実施形態XXXIIの方法であって、生物試料が哺乳類試料である。
XXXIV.実施形態XXXIIの方法であって、生物試料が、次のうちの少なくとも一つを備える。ラージRNA分子、スモールRNA分子、tRNA分子、rRNA分子、mRNA分子、変性及び非変性RNA分子、微生物RNA分子、非微生物RNA分子、ゲノムDNA分子、タンパク質分子、及び他の巨大分子。
XXXV.実施形態XXXIIIIの方法であって、生物試料を調製するステップにより試料を精製し、遺伝物質の相対的特性を変化させる。
XXXVI.実施形態XXXVの方法であって、生物試料を調製するステップが、遺伝物質の意図的な増殖を実質的に伴わない。
XXXVII.実施形態XXXIVの方法であって、生物試料を調製するステップによって試料を精製し、液体クロマトグラフィーによる濾過を可能にする。
XXXVIII.実施形態XXXIVの方法であって、生物試料を調製するステップによって試料を精製し、ゲノムDNA分子、タンパク質分子、及び他の巨大分子を除去する。
XXXIX.実施形態XXXIIの方法であって、生物試料を調製するステップが、遺伝物質を意図的に増殖させるものでない。
XL.実施形態XXXIIの方法であって、微生物RNA分子が、真菌、ウイルス、原生動物、アメーバ、または細菌RNAを含む。
XLI.実施形態XXXIIの方法であって、生物試料を得るステップが、無菌技術または殺菌技術のうちの少なくとも1つを使用して臨床環境において行われる。
XLII.実施形態XXXIIの方法であって、生物試料を消化するステップで、試薬として溶解試薬を使用する。
XLIII.実施形態XXXIIの方法であって、液体クロマトグラフィーを使用するステップに、液体クロマトグラフィー装置の試料ポートに試験試料を注入する手順を含む。
XLIV.実施形態XLIIIの方法であって、液体クロマトグラフィー装置が、移動相中の水性緩衝液に対する移動相中の有機緩衝液の量を減少させた後に増加させることによって微生物RNA分子を分離する。
XLV.実施形態XLIVの方法であって、移動相中の有機緩衝液の量が30%~100%である。
XLVI.実施形態XLIIIの方法であって、微生物RNA分子が、液体クロマトグラフィー装置において、205nm~215nmの波長で検出される。
XLVII.実施形態XLIIIの方法であって、微生物RNA分子が、液体クロマトグラフィー装置において、255nm~265nmの波長で検出される。
XLVIII.実施形態XXXIIの方法であって、液体クロマトグラフィー装置が分離する微生物RNA分子が、廃液ラインから移動相を流用することによって空隙容積内に収集される。
本開示の特定の側面の背景および理解として、以下の添付資料が参照され、これらは参照により本明細書に援用される。
1. Stewart, D.B.; Write, J.R.; Fowler, M.; McLimans, C.J.;Tokarev, V.; Amaniera, I.; Baker, O.; Wong, H.; Brabec, J.; Drucker, R.;Lamendella, R. “Integrated Meta Omics Reveals a Fungus-AssociatedBacteriome and Distinct Functional Pathways in Clostridioides difficileInfection”, Clinical Science and Epidemiology, 4(4), 1-16.
2. Goswami, K.; Purtill, J.J.; Shope, A.J.; Wright, J.;Lamendella, R. “Shotgun Metatranscriptomics for PJI diagnosis: ANovel Prospective Investigation, 2019 Abstract submission, AAHKS AnnualMeeting.
3. Goswami, K.; Purtill, J.J.; Shope, A.J.; Wright, J.;Lamendella, R. “Shotgun Metatranscriptomics for PJI diagnosis: ANovel Prospective Investigation, 2019 Slide deck presentation, AAHKS AnnualMeeting.
4. Slide deck for CSI Compendium, Confidential InvestorPresentation, unpublished work (2019).
本明細書では、システム、装置、および方法の様々な実施形態について説明してきた。これらの実施形態は、例示としてのみ与えられており、特許請求の範囲に記載された発明の範囲を制限することを意図するものではない。さらに、これまで説明してきた実施形態の様々な特徴を様々な方法で組み合わせて、多数の追加の実施形態を生み出すことができることを理解されたい。さらに、開示した実施形態で使用する様々な材料、寸法、形状、構成、配置などについて説明してきたが、開示したもの以外のものも、特許請求の範囲に記載の発明の範囲を超えない範囲で利用することができる。
関連する技術分野の当業者であれば、本発明の主題が、上述の個々の実施形態で説明したものよりも少ない特徴を含んでもよいことを認識できるであろう。本明細書に記載した実施形態は、本明細書の主題の様々な特徴を組み合わせることができる方法を網羅的に提示することを意図していない。したがって、実施形態は、相互に排他的な特徴の組み合わせではなく、むしろ、当業者が理解するように、様々な実施形態は、異なる個々の実施形態から選択された異なる個々の特徴の組み合わせを含むことができる。さらに、一実施形態に関して記載された要素は、特に断りのない限り、そのような実施形態に記載されていない場合でも、他の実施形態で実装することができる。
従属請求項は、特許請求の範囲において、1つ以上の他の請求項との特定の組み合わせについて言及することもあるが、他の実施形態も、従属請求項と他の各従属請求項の主題との組み合わせ、または1つ以上の特徴と他の従属請求項または独立請求項との組み合わせを含むこともできる。本明細書では、具体的な組み合わせを意図していないということが記載されていない限り、そのような組み合わせが提示されている。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形の「a」、「an」および「the」は、内容が明らかにそうでない場合を除き、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ある微生物種」を含む臨床試料は、2以上の微生物種の混合物を含むことができる。また、「または」という用語は、概して、内容に別段の定めがない限り、「および/または」を含む意味で採用されていることに留意すべきである。
上記の文書の参照による援用は、本明細書の明示的な開示に反する主題が援用されないように制限される。上記の文書の参照による援用は、文書に含まれる請求項が参照により本明細書に援用されないよう、さらに限定される。上記の文書の参照による援用は、文書内に提供されている定義が、本明細書に明示的に含まれていない限り、参照によって本明細書に援用されないように、さらに限定される。
特許請求の範囲を解釈する上で、「~のための手段」または「~のステップ」という特定の用語が特許請求の範囲に記載されていない限り、35U.S.C.§112(f)の規定は適用されないことが明示的に意図されている。

Claims (15)

  1. 生物試料に由来する微生物RNA分子の遺伝子シーケンシングを改良する方法であって、
    (a)生物試料を得るステップを備え、
    (b)液体クロマトグラフィー用の試験試料として生物試料を調製するステップを備え、
    (c)液体クロマトグラフィーを使用して試験試料中のRNA分子の混合物から微生物RNA分子をバルク濾過し、液体クロマトグラフィーの2つ以上の画分出力に微生物RNA分子を分離・収集するステップを備え、2つ以上の画分出力のうちの少なくとも1つが液体クロマトグラフィーの空隙容積内の画分出力であり、
    (d)遺伝子シーケンシング用に1つ以上の画分出力を調製するステップを備え、その1つ以上の画分出力が空隙容積内の画分出力であり、
    (e)調製した1つ以上の画分出力について遺伝子シーケンシングを行い、生物試料から微生物RNAを検出するステップを備える方法。
  2. 請求項1に記載の方法であって、生物試料が哺乳類試料である方法。
  3. 請求項1に記載の方法であって、生物試料が、ラージRNA分子、スモールRNA分子、tRNA分子、rRNA分子、mRNA分子、変性及び非変性RNA分子、微生物RNA分子、非微生物RNA分子、ゲノムDNA分子、タンパク質分子、及びその他の巨大分子のうちの少なくとも1つを含む方法。
  4. 請求項1に記載の方法であって、生物試料を調製するステップに、試薬を生物試料と相互作用させることによって生物試料を消化して試験試料を生成するステップを含む方法。
  5. 請求項4に記載の方法であって、生物試料を消化するステップに、
    (i)生物試料を、グアニジニウムチオシアネート、N-ラウロイルサルコシン、及びエタノールのうちの少なくとも1つと相互作用させることによって生物試料を溶解する手順と、
    (ii)生物試料を、塩化グアニジニウム、エタノール、2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-プロパン-1,3-二塩酸塩、及びエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも1つと相互作用させることによって生物試料を洗浄する手順と、
    (iii)生物試料を、プロテイナーゼK、グアニジニウムチオシアネート、N-ラウロイルサルコシン、エタノール、2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩、及びエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも1つと相互作用させることによって生物試料をクリーニングする手順と、
    (iv)生物試料を、55%~85%のグアニジニウムチオシアネート、1%~20%のN-ラウロイルサルコシン、70%~100%のエタノール、DNaseI、2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-プロパン-1,3-二塩酸塩、及びエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも1つと相互作用させることによって生物試料から試験試料を分離する手順とを含む方法。
  6. 請求項4に記載の方法であって、生物試料を消化することによって、ゲノムDNA分子、タンパク質分子、及びその他の巨大分子を除去する方法。
  7. 請求項5に記載の方法であって、
    生物試料を溶解する手順が、生物試料を、55%~85%のグアニジニウムチオシアネート、1%~20%のN-ラウロイルサルコシン、及び70%~100%のエタノールのうちの少なくとも1つと相互作用させることによって完了され、
    生物試料を洗浄する手順が、生物試料を、25%~55%の塩化グアニジニウム、70%~99%のエタノール、12mg/m3~790mg/m3の2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-二塩酸塩、及び20mg/m3~2,000mg/m3のエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも1つと相互作用させることによって完了し、
    生物試料をクリーニングする手順が、生物試料を、4U~12UのプロテイナーゼK、55%~85%のグアニジニウムチオシアネート、1%~20%のN-ラウロイルサルコシン、及び70%~100%のエタノールのうちの少なくとも1つと相互作用させることによって完了し、
    生物試料から試験試料を分離する手順が、生物試料を、1U~15UのDNaseI、25%~85%グアニジニウムチオシアネート、1%~20%のN-ラウロイルサルコシン、70%~100%のエタノール、DNaseI、12mg/m3~790mg/m3の2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)-プロパン-1,3-二塩酸塩、及び20mg/m3~2,000mg/m3のエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも1つと相互作用させることによって完了する方法。
  8. 請求項1に記載の方法であって、微生物RNA分子が、真菌、ウイルス、原生動物、アメーバ、または細菌のRNAを含む方法。
  9. 請求項1に記載の方法であって、液体クロマトグラフィーで、約0.550mL/分~約2mL/分の流速で、移動相中の有機緩衝液に関する水性緩衝液の濃度勾配を利用することによって、微生物RNA分子を分離する方法。
  10. 請求項9に記載の方法であって、水性緩衝液が、酢酸トリエチルアンモニウムの0.05M~0.2M溶液、リン酸、クエン酸、重炭酸アンモニウム、ギ酸、乳酸、2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸、マレイン酸、ジエタノールアミン、ピペリジン、エタノールアミン、及びトリエタノールアミンのうちの少なくとも1つからなる方法。
  11. 請求項9に記載の方法であって、有機緩衝液が、少なくとも10%~40%のアセトニトリル、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、アセトン、及びテトラヒドロフランのうちの少なくとも1つにおける0.05M~0.2M水性緩衝液の混合物からなる方法。
  12. 請求項1に記載の方法であって、液体クロマトグラフィーから出る2つ以上の画分出力のそれぞれが、約10秒~約45秒の間に収集され、約125μL~約750μLの体積を有する方法。
  13. 請求項1に記載の方法であって、生物試料をインキュベートせずに、液体クロマトグラフィーを用いて試験試料中のRNA分子の混合物から微生物RNA分子を濾過する方法。
  14. 請求項1に記載の方法であって、液体クロマトグラフィー装置で分離する微生物RNA分子が、約6分未満、好ましくは約4分未満の溶出時間を有する空隙容積において検出される方法。
  15. 請求項1に記載の方法であって、遺伝子シーケンシング用に1つ以上の画分出力を調製するステップが、
    (i)1つ以上の画分出力のそれぞれを濃縮して、1つ以上の濃縮画分出力を準備する手順と、
    (ii)1つ以上の濃縮画分出力の各々においてRNA物質をプライミングし、1つ以上のプライミングされたRNA画分出力を準備する手順と、
    (iii)1つ以上のプライミングされたRNA画分出力のそれぞれを、1つ以上のcDNA画分出力に逆転写する手順とを備える方法。

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