JP2022546519A - 生物試料に由来する微生物ｒｎａの迅速な分離と収集 - Google Patents

生物試料に由来する微生物ｒｎａの迅速な分離と収集 Download PDF

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Abstract

微生物種の検出・同定で、生物試料から微生物ＲＮＡを迅速に分離・収集するバルクろ過プロセスとして液体クロマトグラフィーを利用する。様々な実施形態において、生物試料に由来する微生物ＲＮＡ分子の遺伝子シーケンシングは、生物試料を得た後、液体クロマトグラフィー用の試験試料として調製することによって改良される。液体クロマトグラフィーは、試験試料中のＲＮＡ分子の混合物から微生物ＲＮＡ分子をバルクろ過して、微生物ＲＮＡ分子を２以上の画分出力に分離・収集するために用いられる。ここで、２つ以上の画分出力のうちの少なくとも１つは、液体クロマトグラフィーの空隙容積内の画分であり、空隙容積内の画分出力を含む、遺伝子シーケンシングのための１つ以上の画分出力を調製し、調製した１つ以上の出力に対して遺伝子シーケンシングを行い、生物試料に由来する微生物ＲＮＡを検出する。

Description

本開示は、生物試料からの核酸の分離に関する。より具体的には、本開示は、生物試料に由来する微生物ＲＮＡを分離・収集するための、バルク濾過プロセスとしての液体クロマトグラフィーを使用することによる、より効率的で効果的な微生物種の検出・同定に関する。
微生物種の検出・同定は、臨床、環境、または生産のコンテキストにおいて、病気を診断・治療し、汚染源を同定するにあたって重要となる。微生物種には、細菌、ウイルス、原生動物、真菌、藻類、アメーバ、および粘菌が含まれ得る。
特定の微生物種の検出・同定は、患者や製品の評価・治療だけでなく、病院や診療所などの医療関連施設、製造工場や厨房などの食品製造環境などの施設・環境においても有用となり得る。特定の微生物種の検出は、例えば、医療機関において、患者に感染症を引き起こす病原体の存在や正体を把握することにより、適切な治療や救済を可能にするために利用される。またこれと同様の方法が、ヘルスケア、食品産業、長期間の介護産業、ホスピタリティー産業、国土安全保障、航空宇宙産業、さらには民間部門においても用いられている。
残念ながら、そのような臨床、環境、生産のコンテキストから得られた生物試料から微生物種を検出することは、理論や研究のコンテキストで使用される管理された生物試料における微生物種の検出とは異なる。そのような臨床、環境、または生産のコンテキストに由来する生の生物試料は管理や精製がなされておらず、理論または研究のコンテキストにおける生物試料から生じた有用な結果を得るために費やせる時間や費用は、臨床、環境、または生産のコンテキストにおける生物試料から結果を得るために費やせるものを大幅に上回ることになる。
生物試料は独特に複雑であり、尿や糞から全血や血清、無傷組織に至るまで様々な生物学的物質を含み得る。生物試料は、脂質、タンパク質、核およびミトコンドリアＤＮＡ、ＲＮＡ（すなわちｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を含むことができ、また、哺乳類源の試料と、試料中に存在し、かつ、宿主生物に感染する任意の単細胞生物（すなわち微生物種）との両方に関する上記のすべての巨大分子を含むことになるであろう。一般に、病原体のバイオマーカー（ＤＮＡやＲＮＡなど）は、生物試料の供給源のバイオマーカーよりもかなり低いレベルで存在するため、分離や検出が困難である。理論および研究のコンテキストにおける、微生物を検出するための現在の技術は、遺伝子分析に適した関連する使用可能な生物試料を形成するために生物試料に適用される培養・精製技術に依存している。
培養技術は、試料を分析するまでに３０時間かかることがあり、それによって特定の微生物種の検出結果に基づいて行動し、好ましくタイムリーな結果を得る能力が遅らせてしまっている。遺伝子配列を増幅するために使用されるそのような培養技術の例は、例えば、米国特許第８，３１３，９３１号（２０時間インキュベーション）および第９，４３５，７３９号（１８～２４時間インキュベーション）、ならびに３Ｍ（登録商標）分子検出システム（https://multimedia.3m.com/mws/media/1353351O/3m-molecular-detection-assay-2-l-monocytogenes-update.pdfで利用できるリンクおよび米国出願公開第２０１７／０２１９５７７Ａ１に記載されているように最大３０時間インキュベーション）に記載されている。
例えば米国特許第９，０６２，３０３号および第８，３８３，３４０号に記載されているような濾過、溶出、または結合技術によって微生物種のバイオマーカーを分離・検出する精製技術。ＤＮａｓｅなどのカオトロピック剤が使用されて臨床試料中のＲＮＡ以外のタンパク質を分解している（Ｔａｎら，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００９，Ｔｕｒｂｏ Ｄｎａｓｅ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから入手できる，米国特許第１０，０７７，４３９号）。しかしながら、これらの方法は、非微生物ＲＮＡからの微生物ＲＮＡの分離を可能にするものではない。同様に、異なる溶解バッファーを用いた共精製により、ヒト血液から大腸菌を抽出する方法が開示されているが（Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅら，Ｊ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏ，２０１７，６６：３０１）、これらの方法は、最初に生物試料から標的ＲＮＡを抽出した後、残留するＤＮＡを分解して除去することに依存するものである。研究のコンテキストにおいて、特別に調製された滅菌プレートを使用した特定の細菌株の分離は、関連性があり、かつ、遺伝子解析に適した各細菌株の生物試料を得る目的で利用されてきた。次のリンクで入手可能なマテリアルを参照（https://www.wrightlabs.org/metatranscriptomics_2,https://aac.asm.org/content/60/8/4722,https://www.nature.com/articles/s41598-018-21841-9）。残念ながら、この種の精製技術は生物試料のさらなる処理・操作を必要とし、その結果、目的の遺伝子バイオマーカーが劣化する可能性がある。
特に、理論または研究のコンテキストにおいて、微生物ＤＮＡを検出するための様々な方法およびシステムが当技術分野で知られている。しかしながら、これらの技術は、微生物ＤＮＡの検出に依存しており、生きている微生物種と死んでいる微生物種との存在を区別することはできない。さらに、一般的には、生物試料中の他の種類のＤＮＡが、その生物試料中の微生物ＤＮＡの相対量を圧倒するため、従来のＤＮＡ同定を用いた微生物ＤＮＡの検出には、それらの微生物を確実に検出・同定するために、十分な数の目的の微生物種が増殖した生物試料の培養又は調製が必要となる。
患者の治療や製品の評価だけでなく、施設や環境の評価のための、そのような生物試料中の微生物種をより効果的、効率的かつ迅速に同定するため、重大で意図的な培養または精製をすることなく、生物試料から微生物種のバイオマーカーを迅速に分離・検出できる技術が必要とされている。
本開示の一側面は、病原性生物のバイオマーカーである微生物ＲＮＡを分解せずに、バルク濾過によって生物試料を微生物ＲＮＡ濾過試料に迅速に変換するための方法である。この方法は、後の遺伝子シーケンシング技術によってそのような病原性生物の存在が検出され得る効率を高めるために、液体クロマトグラフィー工程において空隙容積（ｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅ）を利用することによってなされる。
本開示の別の側面は、生物試料から得られた試験試料を迅速に濾過して、生きているまたは生存している微生物種のバイオマーカーである微生物ＲＮＡを分離・収集する方法に関し、これは、意図的に遺伝物質を増殖させるように設計されたステップを実質的に有さないものである。様々な実施形態において、本開示は、生物試料を得るステップと、液体クロマトグラフィーを可能にするために生物試料を消化または調製して試験試料を生成するステップと、液体クロマトグラフィーによるバルク濾過を用いて試験試料から微生物ＲＮＡ分子を分離・収集するステップとを含む。
本発明の側面によっては、生物試料から得られた試験試料を迅速に濾過して微生物ＲＮＡを分離・収集する方法では、宿主ＲＮＡ分子に対して試験試料から微生物ＲＮＡ分子を効果的に増幅するために、液体クロマトグラフィーの空隙容積出力のみを用いて宿主ＲＮＡ分子を含むＲＮＡ分子の混合物から微生物ＲＮＡ分子をバルク濾過することによって、遺伝物質をインキュベートしたり精製したりするステップを省くことが可能である。
一実施形態として、生物試料に由来する微生物ＲＮＡ分子の遺伝子シーケンシングを改良する方法であって、（ａ）生物試料を得るステップと、（ｂ）生物試料を試薬と相互作用させることによって生物試料を消化して試験試料を生成するステップと、（ｃ）液体クロマトグラフィーを使用して試験試料中のＲＮＡ分子の混合物から微生物ＲＮＡ分子をバルク濾過し、微生物ＲＮＡ分子を試験試料から分離・収集するステップとを備える。
一実施形態として、液体クロマトグラフィー法の空隙容積から微生物ＲＮＡ分子を回収することにより、哺乳類の一本鎖核酸配列と微生物の一本鎖核酸配列とのうちの少なくとも一方の混合物から微生物の一本鎖核酸配列を濾過する方法であって、微生物の一本鎖核酸配列がタンパク質合成のための触媒である。
一実施形態として、生物試料から微生物ＲＮＡ分子を濾過して微生物ＲＮＡを分離する方法であって、生物試料を得るステップと、試料を試薬と相互作用させることによって生物試料を調製するステップと、液体クロマトグラフィー装置を使用して試験試料中のＲＮＡ分子の混合物から微生物ＲＮＡ分子をバルク濾過し、液体クロマトグラフィー装置の空隙容積における微生物ＲＮＡ分子を試験試料から分離・収集するステップとを備える。
態様によっては、移動相の流速は約０．５ｍＬ／分～約３．５ｍＬ／分であり、態様によっては約５５０μＬ／分～約２ｍＬ／分、態様によっては約６００μＬ／分～約１ｍＬ／分、他の態様によっては約６５０μＬ／分～約８５０μＬ／分である。
態様によっては、空隙容積は、０秒以上約６分未満、態様によっては約５分未満、態様によっては約４分未満、態様によっては約３分未満、他の態様によっては約２分未満の保持時間を有する。
態様によっては、濾過された試料物質を含む移動相の複数の画分は液体クロマトグラフィーを用いて溶出され、約５秒から約１分の間、態様によっては約１０秒から約４５秒の間、態様によっては約１５秒から約３０秒の間の時間に収集される。ここで、各アリコートは、約１００μＬ～約１ｍＬの間、態様によっては約１２５μＬ～約７５０μＬの間、態様によっては約１５０μＬ～約５００μＬの間、態様によっては約１７５μＬ～約２５０μＬを含む。
一実施形態として、微生物ＲＮＡは、液体クロマトグラフィーを使用して溶出された１つ以上の画分から検出され、微生物ＲＮＡは、画分の１つ以上について遺伝子シーケンシングを使用して検出される。態様によっては、１つ以上の画分は、液体クロマトグラフィーを用いて溶出された空隙体積の１つ以上の画分を含み、微生物ＲＮＡは、空隙体積を含む１つ以上の画分についての遺伝子シーケンシングを用いて検出される。
態様によっては、各画分は、遺伝子シーケンシングの前に脱水に供される。ここで各アリコートは脱水されて、約１５μＬ～約５００μＬの間、態様によっては約２０μＬ～約１００μＬの間、態様によっては約２５μＬ～約７５μＬの間、好ましい態様によっては約３５μＬ～約６５μＬの間の体積とされる。
上記の概要は、示された各実施形態または本明細書の主題のすべての実施態様を説明することを意図するものではない。図とそれに続く詳細な説明は、様々な実施形態をより具体的に例証するものである。
添付の図面に関連して以下の様々な実施形態の詳細な説明を考慮することで、本開示の主題についてより完全に理解することができる。
図１は、本発明に係るバルク濾過法の一実施形態の代表的なワークフロー図を示す。 図２は、微生物ＲＮＡの分離の代表的なクロマトグラムを示す。 図３は、微生物ＲＮＡの分離の代表的なクロマトグラムを示す。 図４は、生物試料中の微生物ＲＮＡを同定するための全体プロセスの一部としてバルク濾過法を組み込んだ全体ワークフローの一実施形態の代表的なブロック図を示す。 図５Ａは、１５秒ごとに収集された画分及び１５秒画分に重ね合わされた保持時間を備えた、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）ＲＮＡに組み合わされた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮＡを有する試料の分離の代表的なクロマトグラムを示し、これは本発明の特定の実施形態に従って、空隙容積を含む各画分内のピークを示す。 図５Ｂは、１５秒画分のそれぞれに重ね合わされた保持時間無しの図５Ａのクロマトグラムである。 図６Ａは、大腸菌ＲＮＡがホモ・サピエンスＲＮＡに組み合わされた再現可能なものを有する試料の分離の、別の代表的なクロマトグラムを示し、その結果、本発明の特定の実施形態に従って、１５秒ごとに収集された画分が、空隙容積を含む各画分内に非常に類似したピークを有している。 図６Ｂは、１５秒画分のそれぞれに保持時間を重ね合わせていない図６Ａのクロマトグラムである。 図７は、本発明の特定の実施形態による、元の試料と、液体クロマトグラフィーを用いて画分１～２３に濾過し、その後遺伝子シーケンシングをした試料とに関する生のホモ・サピエンスのリードカウントの棒グラフ図である。 図８は、本発明の特定の実施形態による、元の試料と、液体クロマトグラフィーを用いて画分１～２３に濾過し、その後遺伝子シーケンシングをした試料との、生の内部標準ＥＲＣＣカウントの棒グラフ図である。 図９は、本発明の特定の実施形態による、元の試料と、液体クロマトグラフィーを用いて画分１～２３に濾過し、その後遺伝子シーケンシングをした試料との、対数変換されたＥＲＣＣ正規化された腸内細菌／ホモ・サピエンス比の棒グラフ図である。 図１０は、本発明の特定の実施形態による、元の試料と、液体クロマトグラフィーを用いて画分１～２３に濾過し、その後遺伝子配列を決定した試料との、微生物リードとホモ・サピエンスリードとの相対的存在量の棒グラフ図である。
様々な実施形態が様々な修正例や代替形態に修正可能であると同時に、それらの仕様は図面に例として示されており、詳細に説明される。なお当然理解できることであるが、その意図は、特許請求の範囲に記載した発明を、説明する特定の実施形態に限定することではない。それどころか、特許請求の範囲によって規定される主題の趣旨及び範囲内に含まれるすべての修正例、均等物及び代替例をカバーすることを意図している。
本開示に規定される様々な実施形態の説明において、様々な実施形態の開示を理解する上で、以下の定義及び慣例が用いられる。本開示を理解する上で、本開示では、微生物学者によって使用される特定の技術や装置と分析化学者によって使用されるそれらとを統合したり組み合わせたりした様々な実施形態について説明していることは認識されたい。以下の定義及び慣例は、本開示を理解する上で有用で役立つ用語の共通のセットを提供するものである。なぜならば、微生物学者及び分析化学者のそれら２つの領域では、用語の一貫した理解又は用法を有しない場合があるからである。
「哺乳類」、「非微生物種」、または「非微生物群」という用語は、実験室または自然環境における細菌、ウイルス、真菌、または酵母の集団またはそれらの組み合わせ、またはそれらの任意の混合物でなく、かつ、多細胞生物からなる全ての種を包含すると理解される。
「微生物」、「微生物群」、または「微生物種」という用語は、実験室または自然環境における細菌、ウイルス、真菌、または酵母の集団またはそれらの組み合わせ、またはそれらの任意の混合物を包含し、単細胞生物からなるものと理解される。
「生物試料」という用語は、未処理でかつ哺乳類種を起源とする生の生物試料を指し、これには全血、血漿、粘液、血清、尿、糞便、無傷組織、脳脊髄液、滑液、環境スワブ、食物源、および、表面から得られた未知の粉末などが含まれる。したがって、生物試料への言及には、一つ以上の前述の源への言及を含む場合がある。
「試験試料」という用語は、液体クロマトグラフィー装置に導入するための調製後または前処理後の生物試料について言及し、これには、タンパク質、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、脂質、及びその他の巨大分子を除去するステップを実施することを含む場合がある。
「二本鎖核酸配列」という用語はＤＮＡを指します。
「一本鎖核酸配列」という用語は、「リボ核酸」すなわち「ＲＮＡ」を指し、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ラージＲＮＡ、スモールＲＮＡ、変性・非変性ＲＮＡ、断片化ＲＮＡおよび無傷の（ｉｎｔａｃｔ）ＲＮＡを包含すると理解される。
「液体クロマトグラフィー」、「ＨＰＬＣ」、「ＨＰＬＣ装置」等の用語は、様々な実施形態に従って、非微生物ＲＮＡから微生物ＲＮＡを分離・収集するのに用いられる機械、装置や技法を指す同義語である。
パーセント（％）、重量パーセント（％ｗ／ｗ）、重量体積パーセント（％ｗ／ｖ）、重量％、体積％などの用語は、ある物質の重量を標準室温・圧力における全重量または全体積で除して１００を乗じたときのその物質の濃度を指す同義語である。
本開示の組成物中の成分の量、または本開示の方法で採用される回数を修飾する「約」という用語は、例えば、実世界で濃縮物または溶液を作るための典型的な測定手順や取り扱い手順における、手順での故意でないミスによって、これらの組成物および方法を作るために採用される成分の製造、供給元または純度の違いによって、機器（機械）の設定の違いによって、生じ得る数量の変動を指す。
また「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物の平衡条件の違いに起因した異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されているか否かにかかわらず、特許請求の範囲には、その量に対する均等物が含まれる。操作例におけるもの以外、あるいはそうでなければ示されているもの以外の、本明細書で使用される成分量または反応条件を表すすべての数値は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものと理解される。
分子生物学のセントラルドグマは、情報が核酸から核酸へ、または核酸からタンパク質へと渡される可能性があることを説明しているが、タンパク質からタンパク質へ、またはタンパク質から核酸への情報伝達は不可能である。哺乳類と微生物の両方のシステム内で、ＲＮＡは、タンパク質の合成、合成のためのアミノ酸の輸送、またはタンパク質の合成の触媒作用のいずれかに関与する核酸配列である。本開示は、ＲＮＡがＤＮＡとタンパク質との間の移行分子（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であるという事実を利用し、生物試料内の目的の種およびタンパク質の機能を同定する手段として微生物ＲＮＡのバルク濾過を利用する。
ＲＮＡには、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、およびｒＲＮＡと呼ばれる３つの「タイプ」がある。ｍＲＮＡはタンパク質合成を担当し、ｔＲＮＡは合成のためのアミノ酸輸送を担当し、ｒＲＮＡはタンパク質合成の触媒、あるいはタンパク質合成の開始を担当している。ｍＲＮＡはｒＲＮＡの断片よりも比較的大きく、タンパク質のコードに直接関与しているため、よく研究されている。情報の観点からは、ｍＲＮＡは科学的研究に対して歴史的に最も有意義であると考えられてきた。
ＲＮＡに対して関心があるにもかかわらず、この類の分子は分析が困難である。理想的な条件下で何百万年も存続できるＤＮＡとは異なり、ＲＮＡは、通常、生物の死後数分で分解される。しかしながら、その半減期が短いため、ＲＮＡが検出されれば、通常、分析時に生存していた生物の存在を示唆することになる。
従来の分子生物学や生化学の技術は、これらに限定されないが、複雑な生物系からＲＮＡ分子を分離するための、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、酸性グアニジニウムチオシアネート‐フェノール‐クロロホルム抽出（ＡＧＰＣ）、および液液抽出を含む戦略に依存している（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第４版，Ｌｏｄｉｓｈら，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，１９９９）。しかしながら、これらの技術の鍵となる限界は、試料中に存在するＲＮＡａｓｅが目的のＲＮＡ分子を分解してしまう可能性があることである。さらに、ＥＬＩＳＡとＰＣＲの両方の技術を活用するためには、標的ＲＮＡの構造に関する事前の知識が必要である（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，Ｍａｎｚら，Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｒｅｓｓ，２０１５）。ＡＧＰＣおよび液液抽出ではＲＮＡ分子を分離することはできるが、これらの技術は、目的のタイプや種にかかわらず、すべてのＲＮＡを分離する。
従来の分子生物学や生化学の技術とは対照的に、従来の分析化学の技術は小分子の分析に適用するよう開発され、従来は核酸などの生体高分子の分析には適さなかった（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｍａｎｚら，Ｉｍｐｅｒｉａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｐｒｅｓｓ、２０１５）。
ＲＮＡを含む、巨大で複雑な生体分子の分析というユニークな課題に取り組む、ハイブリッドな技術分野、すなわちバイオ分析化学が発展してきた。２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（２Ｄ－ＰＡＧＥ）ゲル、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化－飛行時間（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）、キャピラリー電気泳動、バイオセンサーの使用により、従来の分子生物学や生化学の手法よりも高い特異性と速さで、目的の生体分子の定量、構造解明、定性分析、分離が全面的に可能となった。
これらの生物学的分析法とともに、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が適応され、巨大な生体分子の分析が可能になった（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，第５版，Ｓｋｏｏｇ ａｎｄ Ｈｏｌｌｅｒ，Ｈａｒｃｏｕｒｔ Ｂｒａｃｅ，１９９８）。ＨＰＬＣは、カラム（固定相と呼ばれる）と液体（移動相と呼ばれる）との間の相互作用に基づく混合物の化学的分離に依存している。一般的なＨＰＬＣカラムは、鋼鉄製の外殻にポリスチレンまたはシラノールのマイクロビーズが充填されており、目的の試料を含む移動相をカラムに通して押し出すと、試料の成分（混合物）が固定相に分配され固定相から出ていく。固定相に「なじむ」成分ほど保持され、成分がカラムから出るまたは溶出するまでの時間が長くなる。成分が検出されると、「クロマトグラム」と呼ばれるプロット上に各成分の「保持時間」が割り当てられる。各カラムには「ｔ０」があり、これは「空隙容積」と呼ばれる、カラムによって保持されないすべての分子を指す。この空隙容積は、クロマトグラフィー分析の専門家の間では情報的には重要でないと広く見なされている。なぜならば、クロマトグラムのこの領域には化学的に分離されなかった分子の混合物が含まれるため、クロマトグラムのこの領域は従来利用されず、この領域で見つかった分子は従来研究されず、関心も持たれていない。
本発明の側面によっては、空隙容積は、液体クロマトグラフィーを用いて試料がカラムに導入された時から約６分までの期間を示し、態様によっては、約５分までの期間、態様によっては約４分までの期間、態様によっては約３分までの期間、他の態様によっては約２分までの期間を示し、移動相の流速は約０．５ｍＬ／分～約３．５ｍＬ／分であり、態様によっては約５５０μＬ／分～約２ｍＬ／分、態様によっては約６００μＬ／分～約１ｍＬ／分、他の態様によっては約６５０μＬ／分～約８５０μＬ／分である。
生物分析において、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）とイオン交換液体クロマトグラフィー（ＩＥ－ＬＣ）の２つの様式のＨＰＬＣが一般的である。ＲＰＬＣは、疎水性の固定相を充填したカラムを有し、分子はサイズと極性の両方に応じてカラムから溶出する。疎水性分子は長時間保持され、親水性分子はほとんど保持されない。ほとんどの疎水性分子は、カラムの空隙容積内に溶出する。ＲＰＬＣ内の空隙容積は、カラム固定相と相互作用し損ねた様々なサイズの１つ以上の親水性分子の混合物でできている。
ＲＰＬＣとは異なり、ＩＥ－ＬＣは正味の、全体の電荷によって分子を化学的に分離する。カラム固定相は正味の正電荷を持つミクロスフェア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ）でできており、分子はカラム固定相に吸着され、移動相の塩濃度やｐＨが上昇すると脱着される。分子はカラムから溶出し、検出される。ＩＥ－ＬＣを使用することで、サイズが大きかったり、負電荷が大きかったりするほど分子が最も長く保持され、カラムから溶出するのに時間がかかる。一方、電気的に中性な分子や正電荷を持つ分子は空隙容積に溶出する。この方法は、これまでにもトータルＲＮＡの混合物からｍＲＮＡを化学的に分離するために用いられてきたが、ＲＮＡ収集の手段として空隙容積を調査・利用したことはこれまでにない。
従来、ｍＲＮＡの研究が最も多く行われてきた。なぜならば、ｍＲＮＡはｒＲＮＡの断片よりも比較的大きく、これにより科学者がより正確かつ迅速に情報を得ることができるためである。このようなｍＲＮＡの従来の分析方法では、ｒＲＮＡやｔＲＮＡなどのタイプのＲＮＡをその後の分析用に残すというよりは、除去・廃棄してきた。このような従来のアプローチとは異なり、本開示の様々な実施形態では、微生物ＲＮＡを化学的に分離するのではなく、特にさらなるバイオインフォマティクス研究のためにｒＲＮＡに重点を置いて、分子生物学のセントラルドグマを利用して、液体クロマトグラフィープロセスの空隙容積で発見された全ＲＮＡ断片を収集することにより、迅速に微生物ＲＮＡを濾過・分離する。
本開示は、生物試料から得られた試験試料を迅速に濾過し、生きている又は生存している微生物種のバイオマーカーである微生物ＲＮＡを分離・収集する方法に関する。この方法では、遺伝物質を意図的に増殖させるように設計されたステップを実質的に含まない。様々な実施形態において、本開示は、生物試料を得るステップと、その生物試料を消化または調製して、クロマトグラフィーを可能にする試験試料を生成するステップと、液体クロマトグラフィーによるバルク濾過を利用して試験試料から微生物ＲＮＡ分子を分離・収集するステップとを含む。
本発明の態様によっては、本発明の方法は、試験試料から微生物ＲＮＡ分子を増幅するために、遺伝物質をインキュベートしたり、液体クロマトグラフィーを用いて、生物試料が得られた宿主に由来するＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子の混合物から微生物ＲＮＡ分子をバルク濾過することによって遺伝物質を精製したりする必要をなくすことができる。このように、態様によっては、本発明の方法は微生物ＲＮＡ分子を効果的に増幅するために、液体クロマトグラフィーの空隙容積のアウトプットのみを用いることによって、試験試料をインキュベートして遺伝物質を増殖させるステップを欠くものである。態様によっては、本発明の方法は、微生物ＲＮＡ分子を効果的に増幅するために、液体クロマトグラフィーの空隙容積のアウトプットのみを用いることによって、試験試料を精製するステップを欠くものである。
図１で説明するように、臨床試料１００が得られる。一実施形態として、臨床試料は、硬質表面に由来する環境スワブであり、そのスワブは、試験バイアル内の緩衝溶液中に抽出される。緩衝溶液は、０．１Ｘ～２．５Ｘリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、０．０５Ｍ～１．５Ｍペプトン水、または３０％～５０％のグアニジン塩酸塩と０．１％～１％のマレイン酸からなってもよい。
別の実施形態では、生物試料は、ヒト及び家畜種を含むがこれに限定されない哺乳類種から得られる組織又は排泄物である。生物試料には、これらに限定されないが、全血、血漿、粘液、血清、尿、糞便、脳脊髄液、滑液、及び無傷の組織を含む。臨床試料は、特定の形態の生物試料を収集するように確立された任意の他のプロトコルに加えて、採血、パンチ生検、便培養法、鼻腔ぬぐい液、唾液サンプル、尿検査、皮膚学的掻爬によって採取されてもよい。生物試料には、ラージＲＮＡ分子、スモールＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、変性および非変性ＲＮＡ分子、微生物ＲＮＡ分子、非微生物ＲＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、タンパク質分子、およびその他の巨大分子が含まれる。
生物試料は、その後の消化のステップ用に試料を調製して試験試料を生成するため、当技術分野で知られている方法を用いて、適宜、機械的にホモジナイズしてもよく、窒素でキャビテーションしてもよく、超音波処理してもよい。次に、生物試料は、消化のステップ２００を経る。臨床試料の消化には、酵素、カオトロープ、界面活性剤、洗剤、及び当技術分野で既知の他の添加剤を含んでもよい。生物試料を消化する工程では、ゲノムＤＮＡ分子、タンパク質分子及び非ＲＮＡ巨大分子を除去し、生物試料の分解を防ぐために低温で行われてもよく、必要に応じて表１に記載のような、標的分子を保護することが知られている添加物を含んでもよい。
表１：臨床試料を消化する間、標的分子を保護するための添加物
Figure 2022546519000002
一実施形態として、生物試料の消化は、生物試料をグアニジニウムチオシアネート、Ｎ－ラウロイルサルコシン、及びエタノールと相互作用させることによって臨床試料を溶解させることで開始する。一実施形態として、５５％～８５％のグアニジニウムチオシアネートと１％～２０％のＮ－ラウロイルサルコシンの緩衝液が、７０％～１００％エタノール溶液と等量で混合される。一実施形態として、６５％～７５％のグアニジニウムチオシアネートと１％～１０％のＮ－ラウロイルサルコシンの緩衝液が、７０％～１００％エタノール溶液と等量で混合される。さらに別の実施形態として、６５％～７５％グアニジニウムチオシアネートと１％～１０％Ｎ－ラウロイルサルコシンの緩衝液は、９０％～１００％エタノール溶液と等量で混合される。
一実施形態として、試料を溶解することによる生物試料の消化は、１容量の臨床試料に対して１～３容量の緩衝液とエタノールの混合物を加えることによって継続する。一実施形態として、２容量の緩衝液とエタノールの混合液が１容量の臨床試料に加えられる。別の実施形態として、２００μＬ～４００μＬの緩衝液とエタノールの混合液が、１容量の臨床試料に加えられる。一実施形態として、２５０μＬ～３５０μＬの緩衝液とエタノールの混合液が１容量の臨床試料に加えられる。
前述の生物試料の混合物は、手動による反転、ボルテックス、または当該技術分野で知られる他の手段のいずれかによって混合された後、５００ｇ～２０００ｇで１５秒～９０秒間遠心分離することによって、シリカまたはポリプロピレンフィルターを介して移された。一実施形態として、１５秒～４５秒の遠心分離が使用される。フィルターを通過した物質は廃棄され、フィルターに残ったＤＮＡとＲＮＡは、さらなる調製ステップに供される。
生物試料が消化されたら、次のステップの生物試料の調製・洗浄には、塩化グアニジニウム、エタノール、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－プロパン－１，３－二塩酸塩、およびエデト酸二ナトリウムの少なくともいずれか一つと臨床試料とを相互作用させるステップを含むことができる。一実施形態として、２５％～５５％の塩化グアニジニウムを含む７０％～１００％エタノールの混合物を、３００μＬ～５００μＬの容量で同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、５００ｇ～２０００ｇで１５秒～９０秒間遠心分離する。フィルターを通過した物質は廃棄される。別の実施形態では、１２ｍｇ／ｍ３～７９０ｍｇ／ｍ３の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩と、２０ｍｇ／ｍ３～２０００ｍｇ／ｍ３のエデト酸二ナトリウムとの混合物を調製し、４００μＬ～９００μＬの容量で同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、５００ｇ～２０００ｇで１５秒～６０秒間遠心分離する。フィルターを通過した物質は廃棄される。さらに別の実施形態として、１２ｍｇ／ｍ３～７９０ｍｇ／ｍ３の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩と、２０ｍｇ／ｍ３～２０００ｍｇ／ｍ３のエデト酸二ナトリウムとの第２の混合物を調製し、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに、４００μＬから９００μＬの容量で加え、５００ｇから２０００ｇで３０秒～１８０秒間遠心分離する。別の実施形態として、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに水を加え、５０ｇから２０００ｇで１５秒から６０秒間遠心分離する。フィルターを通過した物質が生物試料であり、保持される。
一実施形態として、３０～４７％の塩化グアニジニウムを含む８０％～１００％エタノールの混合物を同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、５００ｇ～２０００ｇで１５秒～６０秒間遠心分離する。さらに別の実施形態として、３５～４５％の塩化グアニジニウムを含む９０％～１００％エタノールの混合物を、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、５００ｇ～２０００ｇで１５秒～４５秒間遠心分離する。フィルターを通過した物質が生物試料であり、保持される。
別の実施形態として、２５ｍｇ／ｍ３～６００ｍｇ／ｍ３の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩と、５０ｍｇ／ｍ３～１０００ｍｇ／ｍ３のエデト酸二ナトリウムとの混合物を調製し、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに２００μＬ～５００μＬの容量で加え、５００ｇ～２０００ｇで１５秒～６０秒間遠心分離する。さらに別の実施形態として、２５ｍｇ／ｍ３～６００ｍｇ／ｍ３の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩と、５０ｍｇ／ｍ３～１０００ｍｇ／ｍ３のエデト酸二ナトリウムとの混合物を調製し、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに２００μＬ～５００μＬの容量で加え、５００ｇ～２０００ｇで１５秒～６０秒間遠心分離する。さらに別の実施形態として、２５ｍｇ／ｍ３～６００ｍｇ／ｍ３の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩と、５０ｍｇ／ｍ３～１０００ｍｇ／ｍ３のエデト酸二ナトリウムとの混合物を調製し、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに２００μＬ～５００μＬの容量で加え、５００ｇ～２０００ｇで１５秒～４５秒間遠心分離する。
別の実施形態として、２５ｍｇ／ｍ３～６００ｍｇ／ｍ３の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩と、５０ｍｇ／ｍ３～１０００ｍｇ／ｍ３のエデト酸二ナトリウムとの第２の混合物を調製し、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに４００μＬ～９００μＬの容量で加え、５００ｇ～２０００ｇで３０秒～１８０秒間遠心分離する。さらに別の実施形態として、２５ｍｇ／ｍ３～６００ｍｇ／ｍ３の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩と、５０ｍｇ／ｍ３～１０００ｍｇ／ｍ３のエデト酸二ナトリウムとの第２の混合物を調製し、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに６００μＬ～８００μＬの容量で加え、５００ｇ～２０００ｇで３０秒～１８０秒間遠心分離する。さらに別の実施形態として、２５ｍｇ／ｍ３～６００ｍｇ／ｍ３の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩と、５０ｍｇ／ｍ３～１０００ｍｇ／ｍ３のエデト酸二ナトリウムとの第２の混合物を調製し、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに６００μＬ～８００μＬの容量で加え、５００ｇ～２０００ｇで９０秒～１５０秒間遠心分離する。
別の実施形態として、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに水を加え、５０ｇ～２０００ｇで１５秒～４５秒間遠心分離する。さらに別の実施形態として、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに水を加え、１５００ｇ～２０００ｇで１５秒～４５秒間遠心分離する。さらに別の実施形態として、水はＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅフリーの水である。
生物試料の消化は、生物試料を、プロテイナーゼＫ、グアニジニウムチオシアネート、Ｎ－ラウロイルサルコシン、エタノール、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩、及びエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも１つと相互作用させることによって生物試料を洗浄するステップに進む。一実施形態として、洗浄した生物試料に４Ｕ～１２ＵのプロテイナーゼＫを加え、４５℃～６５℃で１５分～６０分保持する。一実施形態として、洗浄した生物試料に４Ｕ～８ＵのプロテイナーゼＫを添加し、４５℃～６５℃で１５分～６０分間保持する。さらに別の実施形態として、洗浄した生物試料に４Ｕ～８ＵのプロテイナーゼＫを添加し、５０℃～６０℃で１５分～６０分保持する。さらに別の実施形態として、洗浄した生物試料に４Ｕ～８ＵのプロテイナーゼＫを添加し、５０℃～６０℃で２０分～４０分間保持する。別の実施形態として、固体組織または複合マトリックスの場合、インキュベーションは１時間から３時間継続する。別の実施形態として、５５％～８５％のグアニジニウムチオシアネートと１％～２０％のＮ－ラウロイルサルコシンとの混合物の１～３容量を、保持した生物試料に添加する。好ましい実施形態として、５５％～８５％のグアニジニウムチオシアネートと１％～２０％のＮ－ラウロイルサルコシンとの１～２容量を、保持した生物試料に添加する。さらに別の好ましい実施形態として、６５％～７５％のグアニジニウムチオシアネートと１％～１０％のＮ－ラウロイルサルコシンとの１～２容量を、保持した生物試料に添加する。
一実施形態として、５５％～８５％のグアニジニウムチオシアネートと１％～２０％のＮ－ラウロイルサルコシンとの緩衝液を、７０％～１００％エタノール溶液と等量で混合する。一実施形態として、６５％～７５％のグアニジニウムチオシアネートと１％～１０％のＮ－ラウロイルサルコシンとの緩衝液を、７０％～１００％エタノール溶液と等量で混合する。さらに別の実施形態として、６５％～７５％グアニジニウムチオシアネートと１％～１０％Ｎ－ラウロイルサルコシンとの緩衝液を、９０％～１００％エタノール溶液と等量で混合する。実施形態において、これで生物試料は洗浄され、生物試料から試験試料を消化・分離する準備が整ったことになる。
生物試料の消化は、生物試料を５５％～８５％のグアニジニウムチオシアネート、１％～２０％のＮ－ラウロイルサルコシン、７０％～１００％エタノール、ＤＮａｓｅＩ、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－プロパン－１，３－二塩酸塩およびエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも１つと相互作用させることによって生物試料から試験試料を分離するステップに進む。一実施形態では、生物試料は、まず１０，０００ｇ以上で１分間遠心分離する。別の実施形態では、遠心分離された生物試料の上清を新しいシリカまたはポリプロピレンフィルターに移し、１０，０００ｇ以上で１分間遠心分離を行う。フィルターを通過した物質が生物試料であり、保持される。
別の実施形態では、２５％～８５％のグアニジニウムチオシアネートと１％～２０％のＮ－ラウロイルサルコシンの混合物中の生物試料に、１～３容量の７０～１００％エタノールを加え、得られた溶液を、手動で反転させるかまたはボルテックス、あるいは当技術分野で知られている他の方法によってよく混合させる。好ましい実施形態では、６５％～７６％のグアニジニウムチオシアネートと１％～１０％のＮ－ラウロイルサルコシンの混合物中の臨床試料に、９０％～１００％エタノールを１～２容量添加し、得られた溶液をよく混合する。
別の実施形態では、得られた溶液をシリカまたはポリプロピレンフィルターに移し、１０，０００ｇ～１６，０００ｇで１５秒～６０秒間遠心分離を行う。好ましい実施形態では、得られた溶液を１５秒～４５秒間遠心分離する。フィルターを通過した物質は廃棄される。
別の実施形態では、２５％～８５％のグアニジニウムチオシアネートと１％～２０％のＮ－ラウロイルサルコシンの混合物２００μＬ～６００μＬをシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、そのフィルターを１０，０００ｇ～１６，０００ｇで１５～６０秒間、遠心分離する。好ましい実施形態では、６５％～７５％のグアニジニウムチオシアネートと１％～１０％のＮ－ラウロイルサルコシンをシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、フィルターを１０，０００ｇ～１６，０００ｇで１５～４５秒間遠心分離する。フィルターを通過した物質は廃棄する。
別の実施形態では、１Ｕ～１５ＵのＤＮａｓｅＩをシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、１０分～２５分間室温で保持する。好ましい実施形態では、３Ｕ～８ＵのＤＮａｓｅＩをシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、１０分～２５分間室温で保持する。さらに別の好ましい実施形態では、３Ｕ～８ＵのＤＮａｓｅＩをシリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、１２分～２０分間室温に保持する。別の実施形態では、２５％～５５％の塩化グアニジニウムと７０％～９９％エタノールとの混合物２００μＬ～７００μＬをシリカまたはポリプロピレンフィルターに添加し、１０，０００ｇ～１６，０００ｇで１５～６０秒間遠心分離する。好ましい実施形態では、３５％～４５％の塩化グアニジニウムと９５％～９９％エタノールの混合物３００μＬ～５００μＬをシリカまたはポリプロピレンフィルターに添加し、１０，０００ｇ～１６，０００ｇで１５～４５秒間遠心分離する。別の実施形態では、１２ｍｇ／ｍ３～７９０ｍｇ／ｍ３の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩と２０ｍｇ／ｍ３～２，０００ｍｇ／ｍ３のエデト酸二ナトリウムとの混合物４００μＬ～９００μＬを、シリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、１０，０００ｇ～１６，０００ｇで、１５秒～６０秒間遠心分離する。一実施形態では、２５ｍｇ／ｍ３～６００ｍｇ／ｍ３の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩と５０ｍｇ／ｍ３～１，０００ｍｇ／ｍ３のエデト酸二ナトリウムの混合物６００μＬ～８００μＬを、シリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、１０，０００ｇ～１６，０００ｇで、１５秒～４５秒間遠心分離する。別の実施形態では、第２の混合物である、１２ｍｇ／ｍ３～７９０ｍｇ／ｍ３の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩と２０ｍｇ／ｍ３～２，０００ｍｇ／ｍ３のエデト酸二ナトリウムとの混合物２００μＬ～７００μＬを、シリカ又はポリプロピレンフィルターに加え、１０，０００ｇ～１６，０００ｇで６０～１８０秒間遠心分離する。一実施形態では、第２の混合物である、２５ｍｇ／ｍ３～６００ｍｇ／ｍ３の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩と５０ｍｇ／ｍ３～１，０００ｍｇ／ｍ３のエデト酸二ナトリウムの混合物３００μＬ～５００μＬを、シリカまたはポリプロピレンフィルターに加え、１０，０００ｇ～１６，０００ｇで９０～１５０秒間、遠心分離する。別の実施形態では、同じシリカまたはポリプロピレンフィルターに水を加え、１０，０００ｇ～１６，０００ｇで１５秒～４５０秒間遠心分離する。フィルターを通過した物質が試験試料であり、保持される。
生物試料に由来する試験試料は、必要に応じてさらに、煮沸、変性剤による処理、または－７０℃で保存することにより完成されてもよい。一実施形態では、試験試料は、１００℃～１２０℃で１０分～３０分間煮沸することによって完成されてもよい。別の実施形態では、試験試料は、１００℃～１０５℃で１０分～２０分間煮沸することによって完成されてもよい。別の実施形態において、試験試料は、試験試料をポリソルベート２０、ポリソルベート８０、（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニル－ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル、４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニル－ポリエチレングリコール、ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、及びポリエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテルのうち少なくとも一つを２５％～５０％備える変性剤で処理することによって完成されてもよい。
別の実施形態では、試験試料は－７０℃で保存することによって完成されてもよい。試験試料は、ラージＲＮＡ分子、スモールＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、変性ＲＮＡ分子及び非変性ＲＮＡ分子、微生物ＲＮＡ分子、非微生物ＲＮＡ分子を含み、これで液体クロマトグラフィー３００を用いて試験試料から微生物ＲＮＡ分子を分離・収集するステップを経る準備が整ったことになる。
液体クロマトグラフィーを使用して試験試料から微生物ＲＮＡ分子のバルクフィルターを行うステップは、試験試料を液体クロマトグラフィー装置３１０の試料ポートに注入することによって開始する。一実施形態では、注入量は０．１ｍＬ～２ｍＬである。一実施形態では、注入量は、０．５～１．５ｍＬである。液体クロマトグラフィー装置３１０内では、試験試料は、移動相と呼ばれる液体混合物を用いて、多孔性固定相カラム全体に所定の流速でポンプにより送られる。このプロセスはコンピュータ３２０によって制御される。試験試料は、従来、液体クロマトグラフィー装置３１０によって処理され、類似の特性を有する成分と、目的の成分とに分離する。典型的には、試験試料の全ての成分は、液体クロマトグラフィー装置３１０を通って廃液ラインに移動する。しかしながら、本開示の様々な実施形態では、自動または手動のいずれかで、目的の成分３３０を有する領域が、さらなる同定のために回収容器に回される。様々な実施形態において、微生物ＲＮＡの形態の目的成分３３０は、ダイオードアレイ、ＵＶ－Ｖｉｓ、又は示差屈折率検出器のいずれかを用いて検出される。目的成分３４０なしの領域は、平坦な線（「ベースライン」）として検出される。
液体クロマトグラフィー機器は、移動相中の有機緩衝液の量を、当該移動相中の水性緩衝剤に対して減少させ、その後増加させることにより、微生物ＲＮＡ分子を非微生物ＲＮＡ分子から濾過し、これらの分子を分離・収集する。一実施形態として、移動相中の有機緩衝液の量は、表２に示すように、２０％～１００％の間で変化する。
表２：微生物ＲＮＡの分離・収集のための移動相の組成
Figure 2022546519000003
一実施形態では、移動相中の有機緩衝液の量は、表３に示すように、３０％～１００％の間で変化する。
表３：微生物ＲＮＡの分離・収集のための移動相の組成
Figure 2022546519000004
態様によっては水性緩衝液の割合が約４０％より大きいとき、態様によっては約４５％より大きいとき、態様によっては約５０％より大きいとき、態様によっては約５５％より大きいとき、態様によっては約６０％より大きいとき、空隙容積は液体クロマトグラフィーの移動相に溶出する。態様によっては、空隙容積は、有機緩衝液の割合が約６０％未満のとき、態様によっては約５５％未満のとき、態様によっては約５０％未満のとき、態様によっては約４５％未満のとき、態様によっては約４０％未満のときに液体クロマトグラフィーの移動相に溶出する。
一実施形態において、ポンプによって送出される液体クロマトグラフィー移動相の流量は、０．５ｍＬ～３．５ｍＬ／分である。一実施形態では、ポンプによって送出される液体クロマトグラフィー移動相の流量は１ｍＬ／分～２．５ｍＬ／分である。さらに別の実施形態では、ポンプによって送出される液体クロマトグラフィー移動相の流量は１ｍＬ／分～１．５ｍＬ／分である。
態様によっては、液体中の移動相の流量は、約０．５ｍＬ／分～約３．５ｍＬ／分、態様によっては約５５０μＬ／分～約２ｍＬ／分、態様によっては約６００μＬ／分～約１ｍＬ／分、態様によっては約６５０μＬ／分～約８５０μＬ／分である。
移動相は、有機緩衝液と水性緩衝液の２つの緩衝液の混合物として送られる。一実施形態では、水性緩衝液は、０．０５～０．９Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム、リン酸、クエン酸、重炭酸アンモニウム、ギ酸、乳酸、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸、マレイン酸、ジエタノールアミン、ピペリジン、エタノールアミンおよびトリエタノールアミンのうちの少なくとも１つを含む。特に、酢酸トリエチルアンモニウム、ギ酸、乳酸、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸、マレイン酸、トリエタノールアミン、ピペリジンのうちの少なくとも１つを含む０．０５Ｍ～０．５Ｍ緩衝液が用いられ、より好ましくは酢酸トリエチルアンモニウム、ギ酸、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸、マレイン酸、およびトリエタノールアミンのうちの少なくとも１つの水性緩衝液の０．０５Ｍ～０．２Ｍ溶液が用いられる。
別の実施形態では、有機緩衝液は、５％～６０％のアセトニトリル、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトン、テトラヒドロフランのうちの少なくとも１つに、０．０５Ｍ～０．９Ｍの水性緩衝液を混合したものを含む。特に、有機緩衝液は、７％～５０％のアセトニトリル、メタノール、エタノール、１－プロパノール、及びアセトンのうちの少なくとも一つに、０．０５Ｍ～０．５Ｍの水性緩衝液を混合したものを含む。一実施形態では、有機緩衝液は、１０％～４０％のアセトニトリル、メタノール、およびアセトンのうちの少なくとも１つに０．０５Ｍ～０．５Ｍの水性緩衝液を混合したものを含む。
様々な実施形態による方法では、非極性化合物が、ポリマービーズ、ポリマーミクロスフェア、または重合ブロックのいずれかの形態で、多孔性固定相カラムとして機能する。その正確な形態に関係なく、ポリマー固定相カラムは本質的に多孔性であり、これはポリマー固定相カラムが細孔によって特徴付けられることを意味する。固定相カラムの材料は市販されており、コーティングされていないか、あるいはビーズまたはマイクロスフィア表面の細孔を覆うように設計された特殊なポリマー化合物でコーティングされており、微生物ＲＮＡが固定相カラムの材料と不可逆的に相互作用しないようにすることができる。固定相カラムの外側構造内にはポリマーミクロスフェアがあり、これは好ましくはアルキル化非多孔性ポリスチレン－ジビニルベンゼン共重合体からなる。固定相カラムには、８．０μｍ～５０μｍ、好ましくは８．０μｍ～２５μｍの粒径のミクロスフェアが備えられている。その結果、固定相カラムの細孔径は１０００A～５０００A、特に１０００A～４０００A、より好ましくは２０００A～４０００A、または２５００～４０００Aの細孔径である。固定相カラムは、幅４ｍｍ～３０ｍｍ×長さ４０ｍｍ～１５０ｍｍ、好ましくは幅５ｍｍ～１０ｍｍ×長さ４０ｍｍ～１００ｍｍ、さらに好ましくは幅７ｍｍ～９ｍｍ×長さ４０～６０ｍｍの寸法を有していてもよい。一実施形態によれば、固定相カラムは、周囲温度で操作されてもよく、より好ましくは２０℃から２７℃で制御されてもよい。
微生物ＲＮＡは、移動相と固定相カラムのミクロスフェアおよび細孔との選択的な相互作用により、固定相カラム内で非微生物ＲＮＡから濾過・分離される。濾過と分離が行われると、微生物ＲＮＡと非微生物ＲＮＡとは異なるタイミングで固定相カラムから出て、すなわち溶出して、カラムの空隙容積に溶出した微生物ＲＮＡとともに検出器によって検出される。一実施形態では、分離された微生物ＲＮＡの検出は、固定相カラムの出口で液体クロマトグラフィー装置に結合されたＵＶ－Ｖｉｓまたはダイオードアレイ検出器で行われる。その検出波長は２００ｎｍ～２２０ｎｍ、特に２０３ｎｍ～２１７ｎｍ、さらに好ましくは２０５ｎｍ～２１５ｎｍである。別の実施形態では、分離された微生物ＲＮＡの検出は、固定相カラムの出口で液体クロマトグラフィー装置に結合されたＵＶ－Ｖｉｓまたはダイオードアレイ検出器で行われる。その検出波長は、２５０ｎｍ～２７０ｎｍ、特に２５７ｎｍ～２６７ｎｍ、さらに好ましくは２５５ｎｍ～２６５ｎｍである。別の実施形態では、分離された微生物ＲＮＡの検出は、固定相カラムの出口で液体クロマトグラフィー装置に連結され、屈折率のデフォルト範囲が０．７５ＲＩ～２．００ＲＩ、特に０．９ＲＩ～１．９０ＲＩ、さらに好ましくは１．００ＲＩ～１．７５ＲＩに設定された示差屈折率検出器を用いて行われる。
分離された微生物ＲＮＡは、クロマトグラムと呼ばれるデータのトレースで検出される。分離された微生物ＲＮＡの例示的なクロマトグラムを図２および３に示す。０分から３分の間のウィンドウに観察されるピークは、分離された微生物ＲＮＡに対応する。非微生物ＲＮＡは、Ｋｅｔｔｅｒｅｒら（ＵＳ８，３８３，３４０参照）が開示するように、７分～１５分のウィンドウに検出されるであろう。微生物ＲＮＡが検出された場合、目的の化合物（例えば微生物ＲＮＡ）を含む移動相は、将来的な同定または実験のために廃液ラインから試料収集バイアルに回される。
態様によっては、液体クロマトグラフィーから出る移動相の試料収集は、空隙容積と、非微生物ＲＮＡに関連するピークに対応する移動相の少なくとも一部とを含む。態様によっては、目的の化合物（例えば微生物ＲＮＡ）を含む移動相は、溶出試料の１つ以上の画分に収集されてもよい。態様によっては、溶出試料の複数の画分が、任意の目的の化合物を含む移動相がカラムから溶出する際に、時間、体積、またはその両方に基づき収集される。
態様によっては、各画分は、約５秒から約１分の間、態様によっては約１０秒から約４５秒の間、態様によっては約１５秒から約３０秒の間の時間でカラムから収集される。態様によっては、収集された各画分は、約１００μＬ～約１ｍＬの間、態様によっては約１２５μＬ～約７５０μＬの間、態様によっては約１５０μＬ～約５００μＬの間、態様によっては約１７５μＬ～約２５０μＬの間の体積を有している。
態様によっては、空隙容積の少なくとも一部が、少なくとも１画分～最大約７２画分、態様によっては少なくとも１画分～最大約３６画分、他の態様によっては少なくとも１画分～最大約２４画分の所望の画分数で収集されてもよい。
その試料体積が液体クロマトグラフィーから１つ以上の画分に収集された後、１つ以上の画分の各々は、遺伝子シーケンシングに供することができる。
一実施形態では、微生物ＲＮＡは、液体クロマトグラフィーを用いて空隙容積から溶出された１つ以上の画分から検出される。ここで、空隙容積から溶出された１つ以上の画分のうちの少なくとも１つから遺伝子シーケンシングを使って微生物ＲＮＡが検出される。
態様によっては、各画分は、遺伝子シーケンシングの前に脱水に供される。ここで各画分は脱水されて、約１５μＬ～約５００μＬの間、態様によっては約２０μＬ～約１００μＬの間、態様によっては約２５μＬ～約７５μＬの間、好ましい態様によっては約３５μＬ～約６５μＬの間の体積とされる。
態様によっては、コントロールを生物試料に導入し、非微生物ＲＮＡに対して微生物ＲＮＡを正規化したりモニタリングしたりしてもよい。態様によっては、コントロールは、生物試料を消化するステップの前、または生物試料が消化された後、液体クロマトグラフィーに導入される試験試料とともに生物試料に導入されてもよいし、あるいは所望の試料が遺伝子シーケンシングに供されるときに生物試料に導入されてもよい。コントロールは、空隙容積と通常の試料分離容積の両方にカラムから溶出するように選択されることが好ましい。コントロールは、微生物ＲＮＡまたは試料ＲＮＡと干渉しない任意の所望の供給源から選択することができる。好ましい態様によっては、コントロールは、サーモフィッシャーサイエンティフィックから市販されているＥＲＣＣ ＲＮＡコントロールやＥＲＣＣ ＲＮＡコントロールＡｍｂｉｏｎ（登録商標）などの合成により誘導されたＲＮＡである。
本開示に従った様々な実施形態を用いることにより、目的の全ての微生物ＲＮＡを同時に分離・収集することが可能となり、それによって将来的に生物試料内の全ての生存（生きている）微生物種の同定、またはその後の微生物ＲＮＡの構造解明、定量、もしくは定性分析が可能となる。本開示の様々な実施形態によって、グラム陽性菌、グラム陰性菌、細菌芽胞、エンベロープウイルス、ノンエンベロープウイルス、ＲＮＡウイルス、真菌、酵母、及び原生動物から微生物ＲＮＡを同時に分離・収集することが可能になる。本開示の方法を用いて微生物ＲＮＡとして濾過、分離、収集される試験試料内の例示的な微生物種が表４に見出される。
表４．臨床試料からＲＮＡを分離・収集することによって検出された微生物種
Figure 2022546519000005
図４は、生物試料中の微生物ＲＮＡを同定するための全体プロセスの一部として、バルク濾過法を組み込んだ全体ワークフローの一実施形態の代表的なブロック図である。４１０において、生物試料４０２は、臨床、生産、又は環境のいずれかの場面からサンプリングされ、収集される。生物試料は、それがサンプリングされた場面のすぐ近くの設備である様々な実施形態に従って処理されてもよいが、他の実施形態として、生物試料４０２は、４２０で異なる施設に輸送されて様々な実施形態に従って濾過法を行うこともできる。様々な実施形態を通して生物試料を試験試料へと転換し、液体クロマトグラフィーを用いて微生物ＲＮＡを分離・収集することを可能にする。４３０において、分離・収集された微生物ＲＮＡを含む試験試料４０４が、様々な実施形態に従って、ＨＰＬＣの空隙容積内に生成される。次いで、微生物ＲＮＡのみを有する試験試料４０４は、４４０でシーケンシングされ、試験試料内の全ての生存している（生きている）微生物種を同定する。他の実施形態として、４４０には、微生物ＲＮＡの構造解明、定量、又は定性分析を含むことができる。生物試料から得た生存微生物種の同定結果は、データベース４５０に収集され、安全なネットワークインターフェースを介してアクセス可能なユーザーインターフェース４６０を介して提示又は報告され得る。
実施例
試験は、液体クロマトグラフィーを用いて微生物ＲＮＡとヒトＲＮＡの混合物を濾過するとともに、遺伝子シーケンシングのための後のライブラリーを調製して実施した。使用した材料は、ヒトＲＮＡとしてユニバーサルヒトリファレンス（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＱＳ０６３９；Ｌｏｔ２４４２７３）、微生物ＲＮＡとして大腸菌の全ＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ ＡＭ７９４０；Ｌｏｔ２２１９５３８），ＲｏｂｏＳｅｐカラム，Ｗａｖｅ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ（登録商標）Ａ，Ｗａｖｅ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｂ，Ｗａｖｅ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ Ｃ，ヌクレアーゼフリーの超純水（ＮＦＷ）である。
ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ）は、０．７５ｍＬ／分の一定流速に設定し、カラム温度はラン全体の間、約７５℃に保持し、ＤＡＤは２６０ｎｍ（バンド幅１ｎｍ）で検出するよう設定し、フラクションコレクターは０：３０～１２分までの１５秒画分を収集するように設定し、試料は５０μＬ注入した。ＨＰＬＣは、表５に示す移動相グラジエントを有するように設定した。
表５．移動相溶出グラジエント（流速０．７５ｍＬ／分）
Figure 2022546519000006
ヒトＲＮＡは、全１０μＬのストックを１９０μＬの冷却ＮＦＷで希釈することによって、１，０００ｎｇ／μＬから５０ｎｇ／μＬまでヌクレアーゼフリーの超純水で希釈した。大腸菌ＲＮＡをＮＦＷで１０ｎｇ／μＬに２段階で希釈した。（ｉ）１，０００ｎｇ／μＬの大腸菌ＲＮＡストック１０μＬを９０μＬの冷却ＮＦＷに希釈し、１００ｎｇ／μＬのアリコートを得た。そして（ｉｉ）１００ｎｇ／μＬの希釈濃度の１０μＬを９０μＬの冷却ＮＦＷに希釈して１０ｎｇ／μＬのアリコートを得た。５０ｎｇ／μＬのヒトＲＮＡ（９５０ｎｇ）１９μＬを、１０ｎｇ／μＬの大腸菌ＲＮＡ（５０ｎｇ）５μＬと混合し、ヒトＲＮＡに対して５％の大腸菌ＲＮＡを含む試料を生成した。この混合液に７６μＬの冷却ＮＦＷを加えて１００μＬにした。
その後、混合ＲＮＡ試料を新しい滅菌ＰＣＲプレートの位置Ａ１にプレーティングすることによって画分収集を行いながらＨＰＬＣ上で濾過し、４℃で保持するＨＰＬＣにロードした。この方法を開始し、５０μＬ（～５００ｎｇ）の試料をカラムに注入した。０：３０から１２分までの画分を１５秒間隔で新しい滅菌済みＰＣＲプレートに収集した（すなわち、３０秒の収集につき２画分）。収集した各画分は、１５秒ごとに約０．１８８ｍＬとなった。この時間は、このプロトコルでのリボラブラーハイレンジラダー（ＲｉｂｏＲｕｂｌｅｒ Ｈｉｇｈ Ｒａｎｇｅ Ｌａｄｄｅｒ）ランに基づく０～６０００ｎｔのサイズと一致する。図５Ａ～５Ｂのクロマトグラフをその試料について得た。図５Ａ～５Ｂにおける１５秒ごとの画分のクロマトグラフに示されるように、マイナーピークが約１．３分、２．１分、２．７分の保持時間でカラムから空隙容積内に溶出する一方で、メジャーピークは８分後～約１２分までカラムから溶出した。
０：３０秒から６分までのピークは、ＲＮの吸光度が低かった。理論に束縛されるものではないが、その空隙容積内のこれらの画分は、スモールＲＮＡ分子、ＲＮＡ断片、二次および三次特徴を有するＲＮＡ分子やｍＲＮＡから構成されていると思われる。空隙容積（例えば８分から１２分の保持時間）の後には、２つの大きなピークがあり、理論に束縛されるものではないが、それらはより大きなｍＲＮＡ転写物またはｒＲＮＡ転写物で構成されていると思われる。
さらに５０μＬの試料（～５００ｎｇ）をカラムに注入し、この方法を繰り返した。図６のクロマトグラフは、その繰り返した試料について得られたものである。図５と図６のクロマトグラフはほぼ同じであり、本方法の再現性を裏付けている。
次いで、収集した画分は、ジモクリーン（Ｚｙｍｏ Ｃｌｅａｎ）とコンセントレイト（Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）－５キットとを用いてＲＮＡを定量する前に濃縮した。０：３０から１２分の間の時間の１５秒収集画分のうち２つ（例えば０：３０～０：４５と０：４５～１分、１～１：１５と１：１５～１：３０など）を、滅菌したヌクレアーゼフリーの５ｍＬチューブにまとめて入れ、約３７５μＬの組み合わせ画分を提供するようにした。７５０μＬ（２Ｘ画分容量）のＲＮＡ結合バッファーを各画分に添加した後、振とうしてよく混合した。１．１２５μＬの２００プルーフのエタノール（１Ｘ画分＋バッファー容量）をその混合物に加え、振とうしてよく混合した。その後、８００μＬまで混合物をシリカフィルタにかけ、１０，０００×ｇで３０秒間回転させて結合させた。これは３ステップを経た。４００μＬのＲＮＡプレップバッファー（Ｐｒｅｐ Ｂｕｆｆｅｒ）を、全ＲＮＡを結合した後のフィルターに加えた後、１０，０００×ｇで３０秒間洗浄した。その後、７００μＬのＲＮＡ洗浄バッファーを、前のフロースルーを除去した後のフィルターに加え、１０，０００×ｇで３０秒間洗浄した。フロースルーを捨てた後、４００μＬのＲＮＡ洗浄バッファーをそのフィルターに加え、１０，０００×ｇで１分間洗浄した。その後、カラムを新しい滅菌済みヌクレアーゼフリーの微量遠心管に注意深く移した。新しいものに入ったらすぐに、同様にラベル付けされたチューブのヌクレアーゼフリー水１５μＬをそのフィルターに加え、全ＲＮＡを１０，０００×ｇで１分間溶出させた。
遺伝子シーケンシング用に得た画分に対応する画分濃度を表６に示す。
表６．ＨＰＬＣ画分とアッセイ画分間の画分表
Figure 2022546519000007
その後、溶出したＲＮＡ画分をＱｕａｎｔｉ－Ｔ ＲＮＡ ＨＳアッセイで定量した。これの設定は、１５ｍＬコニカルチューブに６７６６μＬのＱｕａｎｔ－ｉＴ ＲＮＡバッファーを加えた後、３４μＬのＱｕａｎｔ－ｉＴ ＲＮＡ試薬を加え、１０秒間ボルテックスにより混和して行った。表６に示す各アッセイ画分の３μＬのアリコートを、カラム１２の標準物質（ｓｔａｎｄａｒｄｓ）とともにプレートにまいた（３μＬのＲＮＡインプット）。その後、３０秒の軌道振とうと、２分のインキュベーションの後、Ｔｅｃａｎ ｉｎｆｉｎｉｔｅ ｐｒｏ ２００プレートリーダーでそのプレートを読み取った。その定量結果を表７に示す。
表７．ＲＮＡ定量結果
Figure 2022546519000008
表７に示すように、画分の濃度は０．１～６９．１ｎｇ／μＬであった。これらの濃度は、シーケンシング用のＲＮＡを調製するためのライブラリー調製に対する入力として使用された。合成ＥＲＣＣ内部コントロールスパイク１μＬ（１５ｐｇ）とともに精製ＲＮＡ７μＬを、イルミナ用のＮＥＢＮｅｘｔマルチプレックスオリゴ（９６の固有のデュアルインデックスプライマーペア）とともに、ＮＥＢＢＥＸＴシングルセル／低インプットＲＮＡライブラリー調製プロトコルに投入した。このプロトコルには要約して以下のものが含まれる。（ｉ）７μＬのオリジナルの５％大腸菌ＲＮＡが後の比較用の位置に調製され、（ｉｉ）ノーテンプレートコントロール（ＮＴＣ）が、３．５μＬのプレランＨＰＬＣフロースルー及びＺｙｍｏ濃縮器キットに入ったＮＦＷ３．５μＬとともに、一定位置に加えられ、（ｉｉｉ）画分１８と１９はそれぞれ１μＬのＲＮＡインプットを有し、それらの濃度は他の画分よりはるかに高いため、ＮＦＷで７μＬにし、（ｉｖ）これら二つの画分１８と１９はクロマトグラムにおいて大きなピークで一致した。ＲＴプライマーは、各ＲＮＡ試料に１μＬのプライマーを加えた後、ＲＮＡにアニーリングさせた。次に、プライマーを付けた（Ｐｒｉｍｅｄ）ＲＮＡを、１５サイクルのｃＤＮＡ増幅と６サイクルのライブラリーＰＣＲを用いてｃＤＮＡに逆転写した。その後、増幅されたｃＤＮＡは、純度を上げるためにＡｍｐｕｒｅ ＸＰビーズで２回精製した。その後、精製されたｃＤＮＡは、次にＱｕａｎｔ－ｉＴ ｄｓＤＮＡ １Ｘアッセイを用いて定量され、表８に示す濃度を有していた。
表８．増幅されたｃＤＮＡの濃度
Figure 2022546519000009
定量後、各試料についてｃＤＮＡを４０ｎｇ入力に正規化した（この量を入力できない濃度であった画分１、画分１５、及び画分２３を除き、全量を製造元のプロトコルに従って加えた）。その後、正規化したｃＤＮＡを断片化し、末端修復した。末端修復されたｃＤＮＡは、イルミナのアダプターとライゲーションされた。ライゲーションされたｃＤＮＡは、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰビーズでクリーンアップされ、ライゲーションされていないアダプターが除去された。一旦精製されたら、そのｃＤＮＡは、２０～１００ｎｇのｃＤＮＡインプットのためにライブラリーＰＣＲを６サイクル行い、ＰＣＲエンリッチメントを行った。ＰＣＲ後、増幅されたライブラリーをＡｍｐｕｒｅＸＰビーズで精製し、その後、表８に示す正規化濃度でＱｕａｎｔ－ｉＴ ｄｓＤＮＡ １Ｘアッセイを用いて定量した。
各試料は各試料につき２５ｎｇずつプールした（ただし、画分２３はインプットが十分でなかったため、その全量を加えた）。プールされた試料は、０．９ｘ容量のＡｍｐｕｒｅＸＰビーズを用いた追加精製を行い、残存する不純物を除去し、試料を濃縮した。プールされた純粋な試料の濃度は９．８８ｎｇ／ｕＬ（予想サイズは３００ｂｐで～５０ｎＭ）であった。この精製シーケンスライブラリーは、イルミナのプロトコルに従ってローディング濃度に希釈・変性されて、表９に示すインデックスを使用して、１５０サイクルのＶ２高出力ケミストリーのＮｅｘｔＳｅｑ５５０でシーケンシングした。
表９．シーケンスのインデックス
Figure 2022546519000010
各ＨＰＬＣ画分およびＨＰＬＣ分画前の元の試料について、シングルエンドのＦＡＳＴＱファイルを作成した。その後、すべてのＦＡＳＴＱファイルに対して、ＦＡＳＴＱファイルの品質フィルタリングと配列アノテーションとを並行して実施することによってＦＡＳＴＱファイルを処理した。フィルタリングされたリードは、手動でキュレーションされたデータベースを用いてアノテーションされた。すべてのデータベース配列は、参照ゲノム核酸配列に共通のコンタミリードついて問い合わせ、かつ、そのような領域をマスクして系統的なミスアノテーションを防ぐプラットフォームを使用して、あらゆるコンタミリードをフィルタリングしている。完成後、微生物、ホモ・サピエンス、及びＥＲＣＣ内部コントロールのアノテーション数からなるデータフレームを、表１０に示すように突き合せた。
表１０．シーケンス数リードカウント
Figure 2022546519000011
元の試料と画分１～２３との生のホモ・サピエンスのリードカウントは、図７に提供される棒グラフに示されており、これは、画分１１より下のホモ・サピエンスのリードカウントが比較的少ないことを示している。画分１１より下のホモ・サピエンスのリードカウントが相対的に欠如していることにより、空隙容積に対応するこれらの画分における微生物ＲＮＡの存在が高められている。
元の試料と画分１～２３との生の内部標準ＥＲＣＣカウントは、図８に提供される棒グラフに示されており、これは、液体クロマトグラフィー溶離液の分画が特定のＲＮＡを選択していることを示している。画分１４までは、ホモ・サピエンス画分が相対的に枯渇している。
観測された微生物およびホモ・サピエンスのアノテーション数は、各試料内の観測されたＥＲＣＣ配列数によって正規化し、その後１，０００，０００の係数を掛けた。計算された腸内細菌とホモ・サピエンスとのＥＲＣＣ正規化カウントを抽出し、図９に提供されるように、元の試料および画分１～２３の各々内で正規化されたカウントである腸内細菌対ホモ・サピエンスの比率を計算した。図９の棒グラフは、液体クロマトグラフが微生物含有量に基づいて除外しないように、各画分全体のホモ・サピエンスに対するＥＲＣＣの比率が、微生物含有量についてフィルタリングしていることを示している。
元の試料および画分１～２３の微生物リード（各棒の上部分）とホモ・サピエンスリード（各棒の下部分）の相対的存在量が、図１０に提供される棒グラフに示されている。注釈付きリードの分布は、空隙容積画分における微生物リードの相対的な増幅を示す。具体的には、画分２のリードの約５％と、画分３のリードのほぼ８％とが、微生物リード（大腸菌ＲＮＡ）に起因している。ここで、元の試料中の微生物リードは約０．０３％である。液体クロマトグラフィーの空隙容積の出力によって、宿主ＲＮＡ分子に対する試験試料に由来にする微生物ＲＮＡ分子を、元の試料における１／１，０００，０００と比較して、空隙容積においては約１／２０～約１／１０に効果的に増幅している。本方法の特定の実施形態の効果的な増幅により、ピクトグラムからナノグラムの範囲の遺伝物質におけるＲＮＡ検出が可能になる。
実施形態
以下の実施形態は、例示としてのみ与えられるものであり、添付の特許請求の範囲に規定される請求項の発明の範囲を限定しようとするものではない。
Ｉ．生物試料から微生物ＲＮＡ分子を濾過して微生物ＲＮＡを分離する方法であって、
（ａ）生物試料を得るステップと、
（ｂ）試薬を試料と相互作用させることにより生物試料を消化して試験試料を生成するステップと、
（ｃ）液体クロマトグラフィーを用いて試験試料中のＲＮＡ分子の混合物から微生物ＲＮＡ分子をバルク濾過し、試験試料から微生物ＲＮＡ分子を分離・回収するステップとを備える。
ＩＩ．実施形態Ｉの方法であって、生物試料が哺乳類試料である。
ＩＩＩ．実施形態Ｉの方法であって、生物試料が、次のうちの少なくとも１つを含んでいる。ラージＲＮＡ分子、スモールＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、変性および非変性ＲＮＡ分子、微生物ＲＮＡ分子、非微生物ＲＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、タンパク質分子、および他の巨大分子。
ＩＶ．実施形態ＩＩＩの方法であって、生物試料を消化するステップによって、ゲノムＤＮＡ分子、タンパク質分子、及び他の巨大分子を除去する。
Ｖ．実施形態Ｉの方法であって、微生物ＲＮＡ分子が、真菌、ウイルス、原生動物、アメーバ、または細菌ＲＮＡを含む。
ＶＩ．実施形態Ｉの方法であって、生物試料を得るステップが、滅菌技術または殺菌技術のうちの少なくとも１つを使用して臨床環境において行われる。
ＶＩＩ．実施形態Ｉの方法であって、生物試料を消化するステップで、試薬として溶解試薬を使用する。
ＶＩＩＩ．実施形態Ｉの方法であって、液体クロマトグラフィーを使用するステップに、液体クロマトグラフィー装置の試料ポートに試験試料を注入する手順を含む。
ＩＸ．実施形態ＶＩＩＩの方法であって、液体クロマトグラフィー装置によって、移動相中の水性緩衝液に対して移動相中の有機緩衝液の量を減少させ、その後に増加させることによって、微生物ＲＮＡ分子を分離する。
Ｘ．実施形態ＩＸの方法であって、移動相中の有機緩衝液の量が３０％～１００％である。
ＸＩ．実施形態ＶＩＩＩの方法であって、微生物ＲＮＡ分子が、液体クロマトグラフィー装置において、２０５ｎｍ～２１５ｎｍの波長で検出される。
ＸＩＩ．実施形態ＶＩＩＩの方法であって、微生物ＲＮＡ分子が、液体クロマトグラフィー装置において、２５５ｎｍ～２６５ｎｍの波長で検出される。
ＸＩＩＩ．実施形態ＶＩＩＩの方法であって、液体クロマトグラフィー装置が分離する微生物ＲＮＡ分子が、廃液ラインから移動相を流用することによって収集される。
ＸＩＶ．実施形態ＶＩＩＩの方法であって、液体クロマトグラフィー装置の流速が１ｍＬ／分～２．５ｍＬ／分である。
ＸＶ．実施形態ＩＸの方法であって、水性緩衝液が、酢酸トリエチルアンモニウムの０．０５Ｍ～０．２Ｍ溶液、リン酸、クエン酸、重炭酸アンモニウム、ギ酸、乳酸、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸、マレイン酸、ジエタノールアミン、ピペリジン、エタノールアミン及びトリエタノールアミンのうちの少なくとも１つからなる。
ＸＶＩ．実施形態ＩＸの方法であって、有機緩衝液が、少なくとも１０％～４０％のアセトニトリル、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトン、及びテトラヒドロフランのうちの１つにおける０．０５Ｍ～０．２Ｍ水性緩衝液の混合物を含む。
ＸＶＩＩ．実施形態ＶＩＩの方法であって、生物試料を消化するステップが、以下のステップを含む。
（ａ）生物試料を、グアニジニウムチオシアネート、Ｎ－ラウロイルサルコシン、及びエタノールのうちの少なくとも１つと相互作用させることによって生物試料を溶解するステップと、
（ｂ）生物試料を、塩化グアニジニウム、エタノール、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩、およびエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも１つと相互作用させることにより生物試料を洗浄するステップと、
（ｃ）生物試料を、プロテイナーゼＫ、グアニジニウムチオシアネート、Ｎ－ラウロイルサルコシン、エタノール、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩、およびエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも１つと相互作用させることによってクリーニングするステップと、
（ｄ）生物試料を、５５％～８５％のグアニジニウムチオシアネート、１％～２０％のＮ－ラウロイルサルコシン、７０％～１００％エタノール、ＤＮａｓｅＩ、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩、およびエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも１つと相互作用させることにより、生物試料から試験試料を分離するステップ。
ＸＶＩＩＩ．実施形態ＸＶＩＩの方法であって、生物試料を溶解するステップが、生物試料を５５％～８５％のグアニジニウムチオシアネート、１％～２０％のＮ－ラウロイルサルコシン、及び７０％～１００％のエタノールのうちの少なくとも１つと相互作用させることによって完了する。
ＸＩＸ．実施形態ＸＶＩＩの方法であって、生物試料を洗浄するステップが、生物試料を、２５％～５５％の塩化グアニジニウム、７０％～９９％のエタノール、１２ｍｇ／ｍ３～７９０ｍｇ／ｍ３の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩、及び２０ｍｇ／ｍ３～２，０００ｍｇ／ｍ３のエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも１つと相互作用させて完了する。
ＸＸ．実施形態ＸＶＩＩの方法であって、生物試料をクリーニングするステップが、臨床試料を、４Ｕ～１２ＵのプロテイナーゼＫ、５５％～８５％のグアニジニウムチオシアネート、１％～２０％のＮ－ラウロイルサルコシン、及び７０％～１００％のエタノールのうちの少なくとも１つと相互作用させることによって完了する。
ＸＸＩ．実施形態ＸＶＩＩの方法であって、生物試料から試験試料を分離するステップが、生物試料を、１Ｕ～１５ＵのＤＮａｓｅＩ、２５％～８５％グアニジニウムチオシアネート、１％～２０％のＮ－ラウロイルサルコシン、７０％～１００％のエタノール、ＤＮａｓｅＩ、１２ｍｇ／ｍ３～７９０ｍｇ／ｍ３の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－プロパン－１，３－二塩酸塩および２０ｍｇ／ｍ３～２，０００ｍｇ／ｍ３のエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも１つと相互作用させることによって完了する。
ＸＸＩＩ．実施形態ＸＸＩの方法であって、生物試料から試験試料を分離するステップが、試験試料を煮沸するステップ、試験試料を変性剤で処理するステップ、または試験試料を保存するステップのうちの少なくとも１つのステップで完了する。
ＸＸＩＩＩ．実施形態ＸＸＩの方法であって、臨床試料から試験試料を分離するステップが、試験試料を１００℃～１２０℃で１０分～３０分間煮沸することによって完了する。
ＸＸＩＶ．実施形態ＸＸＩＩの方法であって、試験試料を変性剤で処理するステップが、試験サンプルをポリソルベート２０、ポリソルベート８０、（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニル－ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテル、及び４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェニル－ポリエチレングリコール、ｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリエチレングリコールｔｅｒｔ－オクチルフェニルエーテルのうちの少なくとも１つの２５％～５０％と相互作用させることによって完了する。
ＸＸＶ．実施形態ＶＩＩＩの方法であって、液体クロマトグラフィー装置が分離する微生物ＲＮＡ分子が、０分～３分の溶出時間で検出される。
ＸＸＶＩ．液体クロマトグラフィー装置の空隙容積から微生物ＲＮＡ分子を回収することにより、哺乳類の一本鎖核酸配列と微生物の一本鎖核酸配列とのうちの少なくとも一方の混合物から微生物の一本鎖核酸配列をフィルタリングする方法であって、微生物の一本鎖核酸配列がタンパク質合成のための触媒である。
ＸＸＶＩＩ．実施形態ＸＸＶＩの方法であって、空隙容積が、クロマトグラムの初期時間（ｉｎｉｔｉａｌ ｔｉｍｅ ｐｅｒｉｏｄ）によって表される。
ＸＸＶＩＩＩ．実施形態ＸＸＶＩＩの方法であって、初期時間が０分～６分である。
ＸＸＩＸ．実施形態ＸＸＶＩＩＩの方法であって、空隙容積内の微生物ＲＮＡ分子が正に帯電している。
ＸＸＸ．実施形態ＸＸＶＩＩＩの方法であって、空隙容積内の微生物ＲＮＡ分子が正味ゼロ電荷を運ぶ。
ＸＸＸＩ．実施形態ＸＸＶＩＩＩの方法であって、空隙容積内の微生物ＲＮＡ分子が、１ヌクレオチド～２８０ヌクレオチドのサイズを有する。
ＸＸＸＩＩ．生物試料から微生物ＲＮＡ分子を濾過して微生物ＲＮＡを分離する方法であって、生物試料を得るステップと、試薬を試料と相互作用させることにより試験試料を生成するための生物試料を調製するステップと、液体クロマトグラフィー装置を用いて、試験試料中のＲＮＡ分子の混合物から微生物ＲＮＡ分子をバルク濾過し、液体クロマトグラフィー装置の空隙容積の試験試料から微生物ＲＮＡ分子を分離・回収するステップとを備える。
ＸＸＸＩＩＩ．実施形態ＸＸＸＩＩの方法であって、生物試料が哺乳類試料である。
ＸＸＸＩＶ．実施形態ＸＸＸＩＩの方法であって、生物試料が、次のうちの少なくとも一つを備える。ラージＲＮＡ分子、スモールＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、変性及び非変性ＲＮＡ分子、微生物ＲＮＡ分子、非微生物ＲＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、タンパク質分子、及び他の巨大分子。
ＸＸＸＶ．実施形態ＸＸＸＩＩＩＩの方法であって、生物試料を調製するステップにより試料を精製し、遺伝物質の相対的特性を変化させる。
ＸＸＸＶＩ．実施形態ＸＸＸＶの方法であって、生物試料を調製するステップが、遺伝物質の意図的な増殖を実質的に伴わない。
ＸＸＸＶＩＩ．実施形態ＸＸＸＩＶの方法であって、生物試料を調製するステップによって試料を精製し、液体クロマトグラフィーによる濾過を可能にする。
ＸＸＸＶＩＩＩ．実施形態ＸＸＸＩＶの方法であって、生物試料を調製するステップによって試料を精製し、ゲノムＤＮＡ分子、タンパク質分子、及び他の巨大分子を除去する。
ＸＸＸＩＸ．実施形態ＸＸＸＩＩの方法であって、生物試料を調製するステップが、遺伝物質を意図的に増殖させるものでない。
ＸＬ．実施形態ＸＸＸＩＩの方法であって、微生物ＲＮＡ分子が、真菌、ウイルス、原生動物、アメーバ、または細菌ＲＮＡを含む。
ＸＬＩ．実施形態ＸＸＸＩＩの方法であって、生物試料を得るステップが、無菌技術または殺菌技術のうちの少なくとも１つを使用して臨床環境において行われる。
ＸＬＩＩ．実施形態ＸＸＸＩＩの方法であって、生物試料を消化するステップで、試薬として溶解試薬を使用する。
ＸＬＩＩＩ．実施形態ＸＸＸＩＩの方法であって、液体クロマトグラフィーを使用するステップに、液体クロマトグラフィー装置の試料ポートに試験試料を注入する手順を含む。
ＸＬＩＶ．実施形態ＸＬＩＩＩの方法であって、液体クロマトグラフィー装置が、移動相中の水性緩衝液に対する移動相中の有機緩衝液の量を減少させた後に増加させることによって微生物ＲＮＡ分子を分離する。
ＸＬＶ．実施形態ＸＬＩＶの方法であって、移動相中の有機緩衝液の量が３０％～１００％である。
ＸＬＶＩ．実施形態ＸＬＩＩＩの方法であって、微生物ＲＮＡ分子が、液体クロマトグラフィー装置において、２０５ｎｍ～２１５ｎｍの波長で検出される。
ＸＬＶＩＩ．実施形態ＸＬＩＩＩの方法であって、微生物ＲＮＡ分子が、液体クロマトグラフィー装置において、２５５ｎｍ～２６５ｎｍの波長で検出される。
ＸＬＶＩＩＩ．実施形態ＸＸＸＩＩの方法であって、液体クロマトグラフィー装置が分離する微生物ＲＮＡ分子が、廃液ラインから移動相を流用することによって空隙容積内に収集される。
本開示の特定の側面の背景および理解として、以下の添付資料が参照され、これらは参照により本明細書に援用される。
1. Stewart, D.B.; Write, J.R.; Fowler, M.; McLimans, C.J.;Tokarev, V.; Amaniera, I.; Baker, O.; Wong, H.; Brabec, J.; Drucker, R.;Lamendella, R. “Integrated Meta Omics Reveals a Fungus-AssociatedBacteriome and Distinct Functional Pathways in Clostridioides difficileInfection”, Clinical Science and Epidemiology, 4(4), 1-16.
2. Goswami, K.; Purtill, J.J.; Shope, A.J.; Wright, J.;Lamendella, R. “Shotgun Metatranscriptomics for PJI diagnosis: ANovel Prospective Investigation, 2019 Abstract submission, AAHKS AnnualMeeting.
3. Goswami, K.; Purtill, J.J.; Shope, A.J.; Wright, J.;Lamendella, R. “Shotgun Metatranscriptomics for PJI diagnosis: ANovel Prospective Investigation, 2019 Slide deck presentation, AAHKS AnnualMeeting.
4. Slide deck for CSI Compendium, Confidential InvestorPresentation, unpublished work (2019).
本明細書では、システム、装置、および方法の様々な実施形態について説明してきた。これらの実施形態は、例示としてのみ与えられており、特許請求の範囲に記載された発明の範囲を制限することを意図するものではない。さらに、これまで説明してきた実施形態の様々な特徴を様々な方法で組み合わせて、多数の追加の実施形態を生み出すことができることを理解されたい。さらに、開示した実施形態で使用する様々な材料、寸法、形状、構成、配置などについて説明してきたが、開示したもの以外のものも、特許請求の範囲に記載の発明の範囲を超えない範囲で利用することができる。
関連する技術分野の当業者であれば、本発明の主題が、上述の個々の実施形態で説明したものよりも少ない特徴を含んでもよいことを認識できるであろう。本明細書に記載した実施形態は、本明細書の主題の様々な特徴を組み合わせることができる方法を網羅的に提示することを意図していない。したがって、実施形態は、相互に排他的な特徴の組み合わせではなく、むしろ、当業者が理解するように、様々な実施形態は、異なる個々の実施形態から選択された異なる個々の特徴の組み合わせを含むことができる。さらに、一実施形態に関して記載された要素は、特に断りのない限り、そのような実施形態に記載されていない場合でも、他の実施形態で実装することができる。
従属請求項は、特許請求の範囲において、１つ以上の他の請求項との特定の組み合わせについて言及することもあるが、他の実施形態も、従属請求項と他の各従属請求項の主題との組み合わせ、または１つ以上の特徴と他の従属請求項または独立請求項との組み合わせを含むこともできる。本明細書では、具体的な組み合わせを意図していないということが記載されていない限り、そのような組み合わせが提示されている。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうでない場合を除き、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「ある微生物種」を含む臨床試料は、２以上の微生物種の混合物を含むことができる。また、「または」という用語は、概して、内容に別段の定めがない限り、「および／または」を含む意味で採用されていることに留意すべきである。
上記の文書の参照による援用は、本明細書の明示的な開示に反する主題が援用されないように制限される。上記の文書の参照による援用は、文書に含まれる請求項が参照により本明細書に援用されないよう、さらに限定される。上記の文書の参照による援用は、文書内に提供されている定義が、本明細書に明示的に含まれていない限り、参照によって本明細書に援用されないように、さらに限定される。
特許請求の範囲を解釈する上で、「～のための手段」または「～のステップ」という特定の用語が特許請求の範囲に記載されていない限り、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２（ｆ）の規定は適用されないことが明示的に意図されている。

Claims (15)

  1. 生物試料に由来する微生物ＲＮＡ分子の遺伝子シーケンシングを改良する方法であって、
    （ａ）生物試料を得るステップを備え、
    （ｂ）液体クロマトグラフィー用の試験試料として生物試料を調製するステップを備え、
    （ｃ）液体クロマトグラフィーを使用して試験試料中のＲＮＡ分子の混合物から微生物ＲＮＡ分子をバルク濾過し、液体クロマトグラフィーの２つ以上の画分出力に微生物ＲＮＡ分子を分離・収集するステップを備え、２つ以上の画分出力のうちの少なくとも１つが液体クロマトグラフィーの空隙容積内の画分出力であり、
    （ｄ）遺伝子シーケンシング用に１つ以上の画分出力を調製するステップを備え、その１つ以上の画分出力が空隙容積内の画分出力であり、
    （ｅ）調製した１つ以上の画分出力について遺伝子シーケンシングを行い、生物試料から微生物ＲＮＡを検出するステップを備える方法。
  2. 請求項１に記載の方法であって、生物試料が哺乳類試料である方法。
  3. 請求項１に記載の方法であって、生物試料が、ラージＲＮＡ分子、スモールＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、変性及び非変性ＲＮＡ分子、微生物ＲＮＡ分子、非微生物ＲＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ分子、タンパク質分子、及びその他の巨大分子のうちの少なくとも１つを含む方法。
  4. 請求項１に記載の方法であって、生物試料を調製するステップに、試薬を生物試料と相互作用させることによって生物試料を消化して試験試料を生成するステップを含む方法。
  5. 請求項４に記載の方法であって、生物試料を消化するステップに、
    （ｉ）生物試料を、グアニジニウムチオシアネート、Ｎ－ラウロイルサルコシン、及びエタノールのうちの少なくとも１つと相互作用させることによって生物試料を溶解する手順と、
    （ｉｉ）生物試料を、塩化グアニジニウム、エタノール、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－プロパン－１，３－二塩酸塩、及びエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも１つと相互作用させることによって生物試料を洗浄する手順と、
    （ｉｉｉ）生物試料を、プロテイナーゼＫ、グアニジニウムチオシアネート、Ｎ－ラウロイルサルコシン、エタノール、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩、及びエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも１つと相互作用させることによって生物試料をクリーニングする手順と、
    （ｉｖ）生物試料を、５５％～８５％のグアニジニウムチオシアネート、１％～２０％のＮ－ラウロイルサルコシン、７０％～１００％のエタノール、ＤＮａｓｅＩ、２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－プロパン－１，３－二塩酸塩、及びエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも１つと相互作用させることによって生物試料から試験試料を分離する手順とを含む方法。
  6. 請求項４に記載の方法であって、生物試料を消化することによって、ゲノムＤＮＡ分子、タンパク質分子、及びその他の巨大分子を除去する方法。
  7. 請求項５に記載の方法であって、
    生物試料を溶解する手順が、生物試料を、５５％～８５％のグアニジニウムチオシアネート、１％～２０％のＮ－ラウロイルサルコシン、及び７０％～１００％のエタノールのうちの少なくとも１つと相互作用させることによって完了され、
    生物試料を洗浄する手順が、生物試料を、２５％～５５％の塩化グアニジニウム、７０％～９９％のエタノール、１２ｍｇ／ｍ3～７９０ｍｇ／ｍ3の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－１，３－二塩酸塩、及び２０ｍｇ／ｍ3～２，０００ｍｇ／ｍ3のエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも１つと相互作用させることによって完了し、
    生物試料をクリーニングする手順が、生物試料を、４Ｕ～１２ＵのプロテイナーゼＫ、５５％～８５％のグアニジニウムチオシアネート、１％～２０％のＮ－ラウロイルサルコシン、及び７０％～１００％のエタノールのうちの少なくとも１つと相互作用させることによって完了し、
    生物試料から試験試料を分離する手順が、生物試料を、１Ｕ～１５ＵのＤＮａｓｅＩ、２５％～８５％グアニジニウムチオシアネート、１％～２０％のＮ－ラウロイルサルコシン、７０％～１００％のエタノール、ＤＮａｓｅＩ、１２ｍｇ／ｍ3～７９０ｍｇ／ｍ3の２－アミノ－２－（ヒドロキシメチル）－プロパン－１，３－二塩酸塩、及び２０ｍｇ／ｍ3～２，０００ｍｇ／ｍ3のエデト酸二ナトリウムのうちの少なくとも１つと相互作用させることによって完了する方法。
  8. 請求項１に記載の方法であって、微生物ＲＮＡ分子が、真菌、ウイルス、原生動物、アメーバ、または細菌のＲＮＡを含む方法。
  9. 請求項１に記載の方法であって、液体クロマトグラフィーで、約０．５５０ｍＬ／分～約２ｍＬ／分の流速で、移動相中の有機緩衝液に関する水性緩衝液の濃度勾配を利用することによって、微生物ＲＮＡ分子を分離する方法。
  10. 請求項９に記載の方法であって、水性緩衝液が、酢酸トリエチルアンモニウムの０．０５Ｍ～０．２Ｍ溶液、リン酸、クエン酸、重炭酸アンモニウム、ギ酸、乳酸、２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタンスルホン酸、マレイン酸、ジエタノールアミン、ピペリジン、エタノールアミン、及びトリエタノールアミンのうちの少なくとも１つからなる方法。
  11. 請求項９に記載の方法であって、有機緩衝液が、少なくとも１０％～４０％のアセトニトリル、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、アセトン、及びテトラヒドロフランのうちの少なくとも１つにおける０．０５Ｍ～０．２Ｍ水性緩衝液の混合物からなる方法。
  12. 請求項１に記載の方法であって、液体クロマトグラフィーから出る２つ以上の画分出力のそれぞれが、約１０秒～約４５秒の間に収集され、約１２５μＬ～約７５０μＬの体積を有する方法。
  13. 請求項１に記載の方法であって、生物試料をインキュベートせずに、液体クロマトグラフィーを用いて試験試料中のＲＮＡ分子の混合物から微生物ＲＮＡ分子を濾過する方法。
  14. 請求項１に記載の方法であって、液体クロマトグラフィー装置で分離する微生物ＲＮＡ分子が、約６分未満、好ましくは約４分未満の溶出時間を有する空隙容積において検出される方法。
  15. 請求項１に記載の方法であって、遺伝子シーケンシング用に１つ以上の画分出力を調製するステップが、
    （ｉ）１つ以上の画分出力のそれぞれを濃縮して、１つ以上の濃縮画分出力を準備する手順と、
    （ｉｉ）１つ以上の濃縮画分出力の各々においてＲＮＡ物質をプライミングし、１つ以上のプライミングされたＲＮＡ画分出力を準備する手順と、
    （ｉｉｉ）１つ以上のプライミングされたＲＮＡ画分出力のそれぞれを、１つ以上のｃＤＮＡ画分出力に逆転写する手順とを備える方法。

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