JP2001299341A - 改良されたリボ核酸の単離方法 - Google Patents
改良されたリボ核酸の単離方法Info
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Abstract
料から、ポリA+RNA、ウイルスRNAなどの標的リ
ボ核酸を簡便に効率良く単離できる方法並びにそのため
の試薬を提供する。 【解決手段】以下の工程〜を含んでなることを特徴
とするリボ核酸の単離方法およびそのための試薬。 リボ核酸を含有する試料、タンパク質変性剤、及び2
−メルカプトエタノールを0.2〜1.0Mの濃度にな
るように混合し、 必要に応じて緩衝液を添加して、リボ核酸を標的リボ
核酸プローブ固定化担体に特異的に吸着させ、 担体−標的リボ核酸複合体を液相より分離し、洗浄液
により該複合体を洗浄し、 標的リボ核酸を該複合体から溶出する
Description
及びそのための試薬に関する。さらに詳しくは、ポリA
+RNAやウイルスRNAを含有する試料より標的リボ
核酸プローブ固定化担体を用いて、簡便に標的リボ核酸
を単離する方法ならびにそのための試薬に関する。
キシリボ核酸(DNA)塩基配列が解明されつつある。
しかしながら、これら全てが生命現象を担うわけではな
く、生命現象の主たる担い手タンパク質のアミノ酸配列
情報を含む領域、このタンパク質の合成を触媒するリボ
核酸(RNA)、すなわちトランスファーRNA(tR
NA)及びリボゾーマルRNA(rRNA)の塩基配列
情報を含む領域の他、生命現象には必要とされない領域
が存在する。また、タンパク質アミノ酸配列情報を含む
領域も一つのタンパク質に対し必ずしも一つの連続した
領域からなるものではない。つまり、タンパク質の合成
の前にまずRNAに転写されるが、この際その間に挟ま
れたアミノ酸配列情報を含まない領域(イントロン)も
合わせて転写され、スプライシングと呼ばれる過程でこ
の領域が切除され、アミノ酸配列情報を含む領域が残っ
たメッセンジャーRNA(mRNA)が生成するのであ
る。
リアデニル化されているのが特徴でありポリA+RNA
と呼ばれる。このポリA+RNAの解析は、生命現象を
解明する上で非常に重要な情報を提供する。ポリA+R
NAの解析において、しばしばtRNA,rRNA,m
RNA(ポリA+RNA)の混合物であるTotal RNA
を用いて行われるが、このTotal RNAに占めるポリA
+RNAの割合は5%以下であり、特にコピー数の少な
いポリA+RNAの解析は困難である。そのため、生体
材料からポリA+RNAを効率良く単離することは、こ
れらの解析において非常に有意義なものである。これら
の分野で頻繁に使用されているcDNAライブラリーの
調製、cDNAクローニング、ノザンブロット解析、逆
転写ポリメラーゼチェインリアクション(RT−PC
R)などの解析法において良好な結果を得るためには、
できる限り高純度のポリA+RNAを使用することがよ
り良い結果をもたらす。また、ウイルスなどにおいてリ
ボ核酸を生命情報の担い手として利用しているものも存
在する。これらリボ核酸の解析は、生化学、遺伝子工学
及び臨床診断等の分野において非常に重要な情報を提供
し、生体材料からのリボ核酸の単離は重要なステップで
ある。
試料より、AGPC法[Analytical Biochemistry 162,1
56-159(1987)]、リチウム沈殿法(Molecular Cloning,
1.4,(1998))、あるいはBoomらにより考案されたシ
リカ粒子を用いた方法[J. Clin. Microbiol. 28(3), 49
5-503]によりTotal RNAを抽出し、このTotal RNA
のうちポリA+RNAをオリゴdTセファロース等のオ
リゴdT固定化担体に特異的に吸着させ、ポリA+RN
Aを精製する方法が用いられてきた。しかしながら、こ
れらの方法では操作工程が長く煩雑となるため、一度に
多サンプルを処理する場合には向かない。その上操作工
程が長いため、RNA分解酵素によるRNAの分解の危
険性も増大する。
して、カオトロピック剤存在下で生体試料を溶解し、ポ
リA+RNAをオリゴdTセルロース等のオリゴdT固
定化担体に吸着させ、精製する方法が考案されている。
しかしながら、この方法においては、オープンカラムの
操作ではRNA分解酵素の混入の危険性が高く、またバ
ッチ法における閉鎖系では液相と担体−ポリA+RNA
複合体を分離するのに遠心操作が必要とされ、一度に多
サンプルを処理する場合には煩雑となる。
RNAの単離方法としては、ビオチン化オリゴdTをス
トレプトアビジン固定化磁性ビーズに吸着させ、このオ
リゴdT−ストレプトアビジン磁性ビーズにポリA+R
NAを特異的に吸着する方法が考案されている。この方
法では、磁石を用いて担体−ポリA+RNA複合体を分
離でき、遠心操作を必要としない。しかしながら、この
方法は担体への吸着が多段階であるために効率が悪い。
そこで、これらの問題点を克服した方法が必要とされて
いる。
核酸を含有する試料、特に細胞等の生体試料から、ポリ
A+RNA、ウイルスRNAなどの標的リボ核酸を簡便
に効率良く単離できる方法並びにそのための試薬を提供
することにある。
Tを共有結合で固定化した磁性粒子などの標的リボ核酸
プローブ固定化担体を用いたリボ核酸の単離方法に着目
し、種々検討を重ねた結果、カオトロピック剤、界面活
性剤、2−メルカプトエタノールを含む溶液を用いて細
胞等の生体材料を溶解して緩衝液で希釈し、標的核酸プ
ローブ固定化担体と接触させることで簡便にリボ核酸を
単離できること、特に2−メルカプトエタノールの添加
量に依存して収量が増大することを見出し、本発明を完
成させるに至った。
なる。 (1)以下の工程〜を含んでなることを特徴とする
リボ核酸の単離方法。 リボ核酸を含有する試料、タンパク質変性剤、及び2
−メルカプトエタノールを0.2〜1.0Mの濃度にな
るように混合し、 リボ核酸を標的リボ核酸プローブ固定化担体に特異的
に吸着させ、 担体−標的リボ核酸複合体を液相より分離し、洗浄液
により該複合体を洗浄し、 標的リボ核酸を該複合体から溶出する (2)工程において、緩衝液を添加した後でリボ核酸
を標的リボ核酸プローブ固定化担体に特異的に吸着せし
めることを行う(1)のリボ核酸の単離方法。 (3)リボ核酸がポリA+RNAもしくはウイルスRN
Aである(1)又は(2)の方法。 (4)担体に固定化された標的リボ核酸プローブがオリ
ゴdTもしくはウイルスRNA塩基配列に実質的に相補
的なオリゴヌクレオチドである(1)又は(2)の方
法。 (5)タンパク質変性剤がカオトロピック剤及び/又は
界面活性剤である(1)又は(2)の方法。 (6)カオトロピック剤がグアニジニウム塩、尿素、ヨ
ウ化物及び(イソ)チオシアン酸塩からなる群より選択
される少なくとも1種である(5)の方法。 (7)界面活性剤がN−ラウロイルサルコシン、ノニデ
ットP−40、ポリエチレングリコールモノ−p−イソ
オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート、ドデシル硫酸ナトリウム及びアル
キル硫酸アルカリ金属塩からなる群より選択される少な
くとも1種である(5)の方法。 (8)緩衝液が200mM以下の濃度のリチウム塩また
はナトリウム塩を含む溶液である(1)又は(2)の方
法。 (9)洗浄液が25〜100mMのリチウム塩またはナ
トリウム塩を含む溶液である(1)又は(2)の方法。 (10)タンパク質変性剤を含有する溶液、2−メルカ
プトエタノール、標的リボ核酸プローブ固定化担体、洗
浄液及び溶出液を含むことを特徴とするリボ核酸単離用
試薬。 (11)(a)グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物及び
(イソ)チオシアン酸塩からなる群より選択される1種
又は2種以上の化合物、並びにN−ラウロイルサルコシ
ン、ノニデットP−40、ポリエチレングリコールモノ
−p−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレートからなる群より選択され
る1種または2種以上の化合物を含有する溶解液、
(b)2−メルカプトエタノール、(c)緩衝液、
(d)標的核酸プローブが固定化された担体、(e)2
5〜100mMのリチウム塩またはナトリウム塩を含む
洗浄液、(f)担体から標的リボ核酸を溶出する溶液を
含むことを特徴とするリボ核酸単離用試薬。 (12)(c)の緩衝液が200mM以下の濃度のリチ
ウム塩もしくはナトリウム塩を含む緩衝液である(1
1)のリボ核酸単離用試薬。 (13)(a)グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物及び
(イソ)チオシアン酸塩からなる群より選択される1種
又は2種以上のの化合物、並びにN−ラウロイルサルコ
シン、ノニデットP−40、ポリエチレングリコールモ
ノ−p−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレートからなる群より選択さ
れる1種または2種以上のの化合物を含有する溶解液、
(b)2−メルカプトエタノール、(c)緩衝液、
(d)オリゴdTが固定化された担体、(e)25〜1
00mMのリチウム塩もしくはナトリウム塩を含む洗浄
液、(f)担体からポリA+RNAを溶出する溶液を含
むことを特徴とするポリA+RNA単離用試薬。 (14)(c)の緩衝液が200mM以下の濃度のリチ
ウム塩もしくはナトリウム塩を含む緩衝液である(1
3)のポリA+RNA単離用試薬。
本発明においてリボ核酸を含有する試料とは、例えば、
血清、血液、髄液、組織、尿、糞便、唾液、精液等の生
体材料から分離した細胞及び培養細胞などが挙げられ
る。また、ここでいうリボ核酸とは、これらの試料中に
由来するポリA+RNAなどの内在性リボ核酸以外に、
ウイルス、細菌及び真菌などの外来性のリボ核酸または
生体外で酵素的に合成されたようなリボ核酸も含有しう
る。
料、タンパク質変性剤を含む溶液、濃度が0.2〜0.
5Mとなるように加えられた2−メルカプトエタノー
ル、及び標的リボ核酸プローブ固定化担体を混合し、必
要に応じて緩衝液を加え、標的リボ核酸を該担体に特異
的に吸着させる。タンパク質変性剤を含む溶液とは溶解
液である。本発明において使用するタンパク質変性剤と
はカオトロピック剤及び/又は界面活性剤である。 ま
た、緩衝液はpHが5〜10のTris−塩酸緩衝液、
Hepes−KOH緩衝液、Hepes−NaOH緩衝
液、クエン酸ナトリウム緩衝液などが挙げられる。
核酸の一次構造に影響を及ぼすことなく、二次、三次ま
たは四次構造を変えることが可能である物質を意味す
る。本発明において使用するカオトロピック剤としては
特に限定されるものではないが、グアニジニウム塩、尿
素、ヨウ化物、(イソ)チアン酸塩等が挙げられる。該
カオトロピック剤の濃度はそれぞれの化合物によっても
異なるが、通常は1〜10M、より好ましくは3〜8M
である。
機塩またはグアニジン有機塩がある。グアニジン塩とし
ては、例えば、塩酸グアニジニウム、酢酸グアニジニウ
ム、リン酸グアニジニウム、(イソ)チオシアン酸グア
ニジニウム、硫酸グアニジニウムまたは炭酸グアニジニ
ウムなどの一般にタンパク質の変性に使用されるグアニ
ジンの塩であれば特に限定されない。また、それらを組
み合わせて用いても良い。グアニジン塩の濃度は2M以
上の高濃度にて使用するのが望ましい。また、ヨウ化物
としては、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウムなど
があり、(イソ)チオシアン酸塩としては、(イソ)チ
オシアン酸ナトリウム、(イソ)チオシアン酸カリウム
または(イソ)チオシアン酸アンモニウムなどがある。
の破壊あるいは細胞に含まれるタンパク質を可溶化させ
る界面活性剤を単独で使用してもよいが、あるいはカオ
トロピック剤と併用させてもよい。カオトロピック剤と
併用しない場合は一般に細胞等から核酸の抽出に使用さ
れるものであれば特に限定されないが、特表平11−5
01504号公報に開示されているようなドデシル硫酸
ナトリウムやアルキル硫酸アルカリ金属塩、あるいはサ
ルコシルが望ましい。しかしながら、カオトロピック剤
と併用する場合、前者2つの界面活性剤は不溶化するた
めに用いることができない。この場合には、トリトン系
界面活性剤及びツイーン系界面活性剤などの非イオン性
界面活性剤、N−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムな
どの陰イオン性界面活性剤を用いれば問題がない。本発
明においては、特にRNA分解酵素活性が高い試料にお
いて、カオトロピック剤と併用して0.01〜1.0%
の陰イオン性界面活性剤を使用することが好ましい。
タノールの濃度は、リボ核酸を含有する試料、タンパク
質変性剤と混合した際に0.2〜1.0M、好ましくは
0.2〜0.5Mとなるように加える。さらに、2−メ
ルカプトエタノールは溶解液に予め添加しておいてもよ
いが、用時に添加するのがより望ましい。
しては0.1Mの2−メルカプトエタノールが広く用い
られている(AGPC法;Analytical Biochemistry 16
2,156-159(1987)など)。また、特開平11−1968
69号公報には、核酸結合性担体を用いたリボ核酸の単
離方法においてイソプロパノール、プロパノール、およ
びエタノールなどの水溶性有機溶媒、特に5〜20%の
エタノールにより単離されるリボ核酸の量が増大するこ
とが開示されている。しかしながら、本発明者らはイソ
プロパノールやエタノールの添加により単離されるリボ
核酸の量が減少し、2−メルカプトエタノールを添加す
ることのみに依存して単離されるリボ核酸の収量が添加
量に応じて増加することを見出した。
含有する溶解液で試料を溶解した場合、溶液の粘性が非
常に高まり担体への特異的な結合を妨げてしまう。その
ため、pH5〜10程度のTris−塩酸緩衝液、He
pes−KOH緩衝液、Hepes−NaOH緩衝液、
クエン酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液、特に好ましくは
200mM以下の濃度のリチウム塩もしくはナトリウム
塩が含まれるこれらの緩衝液を2倍量程度加えて希釈す
ることにより粘性を下げることが好ましい。さらに、溶
解された試料を20〜25Gの注射針を装着したシリン
ジに繰り返し通すことで、ゲノムDNAを切断し、粘性
を下げてもよい。
酸と特異的に結合することができる標的リボ核酸プロー
ブ固定化担体を使用する。標的リボ核酸プローブ固定化
担体とは、オリゴヌクレオチド、好ましくは約20〜5
0塩基からなる標的リボ核酸配列に相補的な配列を有す
るオリゴヌクレオチドを共有結合的に、あるいは非共有
結合的に固定化したものである。例えば、ポリA+RN
Aを単離する場合には実質的に3’末端ポリアデニル化
領域(ポリAテール)に相補的な配列であるオリゴdT
を固定化した担体、またウイルスRNAの場合にはこの
RNAに実質的に相補的なオリゴヌクレオチドを固定化
された担体を使用する。ここで、オリゴdTとは、数個
から数十個の主にdTTP及びその類似体がホスホジエ
ステル結合により重合した化合物をいう。また、実質的
に相補的なオリゴヌクレオチドとは、標的リボ核酸に対
して特異的に結合可能な塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチドをいう。標的リボ核酸プローブ固定化担体の形態
としては、粒子、フィルター及び反応器具等が具体的に
挙げられるが特に限定はされない。これらのうち、吸着
と溶出の効率を考慮すると粒子の形態のものが好まし
い。さらには、磁性シリカ粒子を用いることがより好ま
しい。
複合体を液相より分離する工程では、例えば遠心分離、
上清の除去または担体として磁性粒子を使用する場合は
磁界を利用して液相から担体−標的リボ核酸複合体を分
離するのが好ましい。また、フィルターおよび反応容器
等の場合は、液を排出もしくは除去するのみでよい。
核酸複合体を洗浄する工程では、該複合体を適当な洗浄
液にて、例えばボルテックスミキサーなどを用いて懸濁
し、再び液相より分離し、上清を除去する工程である。
該複合体の分離は、遠心分離、濾過及びカラム操作が好
ましく、さらに磁性粒子を使用すれば磁石等を用いた簡
便な磁気分離法が可能となりより好適である。
的リボ核酸とプローブの特異的な結合を解離させない程
度の低塩濃度の緩衝液であり、50〜100mMのリチ
ウム塩もしくはナトリウム塩を含む。該緩衝液としては
pHが5〜10のTris−塩酸緩衝液、Hepes−
KOH緩衝液、Hepes−NaOH緩衝液、クエン酸
ナトリウム緩衝液などが挙げられる。また、該洗浄液に
おいてはカオトロピック剤、界面活性剤を含んでいても
よいが、後に酵素反応を行う場合には、さらに界面活性
剤、カオトロピックイオンを含まない低塩濃度の緩衝液
にて洗浄する必要がある。
した担体に固定化された標的リボ核酸プローブより解離
させる溶出工程である。この用途に用いられる溶出液と
しては、プローブからの核酸の溶離を促進するものであ
れば特に限定されない。具体的には、例えばRNA分解
酵素の混入のない水、トリス緩衝液 [10mMトリス緩
衝液;pH7.0〜8.0] が好ましい。また、加熱に
より溶出を促進させてもよい。加熱温度はリボ核酸に悪
影響を及ぼさない程度の温度であれば特に限定されない
が、60〜65℃が好ましい。このようにして溶出した
リボ核酸は透析やエタノール沈殿法等の脱塩、濃縮操作
を経ることなく、逆転写酵素を使用した酵素反応に直接
使用することが可能である。
な溶媒等を使用することなく、簡便な操作で効率よく標
的リボ核酸を生体成分より分離可能であるため、標的リ
ボ核酸精製キットや、固相の分離操作や試薬の分注操作
を自動化した核酸抽出装置へ応用することも可能であ
る。また、本発明で得られたポリA+RNAやウイルス
RNAなどのリボ核酸はノザンブロッティング解析、R
T−PCR解析、cDNAライブラリーの調製、cDN
Aクローニングの鋳型として使用することが可能であ
る。
施態様としては、リボ核酸を含有する試料、タンパク
質変性剤、0.2〜0.5Mの2−メルカプトエタノー
ルを混合し、必要に応じて緩衝液を添加し、リボ核酸
を標的リボ核酸プローブ固定化担体に特異的に吸着さ
せ、担体−標的リボ核酸を液相より分離し、必要に応
じて該複合体を洗浄し、標的リボ核酸を該複合体から
溶出することを特徴とするものである。
薬の一実施態様として、上述したようなタンパク質変性
剤を含有する溶液、2−メルカプトエタノール、標的リ
ボ核酸プローブ固定化担体、洗浄液及び溶出液を含むリ
ボ核酸単離用試薬である。さらに、具体的な実施様態と
しては、(a)グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物及び
(イソ)チオシアン酸塩からなる群より選択される1種
又は2種の化合物、並びにN−ラウロイルサルコシン、
ノニデットP−40、ポリエチレングリコールモノ−p
−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウレートからなる群より選択される1
種または2種の化合物を含有する溶解液、(b)2−メ
ルカプトエタノール、(c)緩衝液、(d)標的リボ核
酸プローブが固定化された担体、(e)0〜100mM
のリチウム塩またはナトリウム塩を含む洗浄液、(f)
担体から標的リボ核酸を溶出する溶液を含むリボ核酸単
離用試薬である。(c)の緩衝液は、200mM以下の
濃度のリチウム塩もしくはナトリウム塩を含むpHが5
〜10のTris−塩酸緩衝液、Hepes−KOH緩
衝液、Hepes−NaOH緩衝液、クエン酸ナトリウ
ム緩衝液などが好ましい。
は、(a)グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物及び(イ
ソ)チオシアン酸塩からなる群より選択される1種又は
2種の化合物、並びにN−ラウロイルサルコシン、ノニ
デットP−40、ポリエチレングリコールモノ−p−イ
ソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレートからなる群より選択される1種ま
たは2種の化合物を含有する溶解液、(b)2−メルカ
プトエタノール、(c)緩衝液、(d)オリゴdTが固
定化された担体、(e)0〜100mMのリチウム塩ま
たはナトリウム塩を含む洗浄液、(f)担体からポリA
+RNAを溶出する溶液を含むポリA+RNA単離用試薬
である。(c)の緩衝液は、200mM以下の濃度のリ
チウム塩もしくはナトリウム塩を含むpHが5〜10の
Tris−塩酸緩衝液、Hepes−KOH緩衝液、H
epes−NaOH緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液
などが好ましい。
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。
NAの抽出 マウス肺組織を摘出し、使用するまで液体窒素中で凍結
保存した。使用時に凍結された組織を粉末状になるまで
破砕し、30mgずつ分取した。400μlの溶解液
[4Mグアニジンチオシアン酸塩、0.1Mトリス−塩
酸緩衝液(pH8.0)、0.5%N−ラウロイルサル
コシン酸ナトリウム] に、0.05、0.1、0.5、
1.0M 2−メルカプトエタノールを混合し、破砕試
料に加え、よくホモジナイズした。25G注射針を装着
したシリンジを10回と押し、粘性を低下させた後、8
00μlの緩衝液 [0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH
8.0)、200mM塩化リチウム、20mM EDT
A] を加えた。混合後、遠心分離(10000rpm、
3分)し、上清をポリA+RNAの単離に用いた。
調製したオリゴdT固定化磁性粒子(Genovision製)を
250μl分取し、磁性スタンド(Magical Trapper;
東洋紡績製)に静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペ
ットで除去した。この磁性粒子に上記の上清を加え、ボ
ルテックスミキサーでよく懸濁した後、室温で10分間
放置した。次に、このマイクロチューブを磁性スタンド
に静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペットで除去し
た。次に、1ml洗浄液 [10mMトリス−塩酸緩衝液
(pH8.0)、50mM塩化リチウム、1mM ED
TA] を加え、ボルテックスミキサーでよく懸濁し、磁
性スタンドに静置して、磁性粒子を回収し、上清をピペ
ットで除去した。この洗浄操作を3回繰り返し、上清を
完全に除去した。30μlのRNA分解酵素を含まない
水を加えて粒子を懸濁し、65℃、2分間加熱後、再度
磁性スタンドに静置し、磁性粒子を集め、上清を回収し
た。混入rRNA、ゲノムDNAを極力除くため、この
回収液に再度吸着液、2−メルカプトエタノールを加
え、上記一連の工程を繰り返し、30μlの水に溶出し
た。
RNAの解析 本発明の方法によりマウス肺組織より得られたポリA+
RNA溶液10μlに色素液(0.25%ブロモフェノ
ールブルー、1mM EDTA、ホルムアミド)10μ
lを混合し、65℃、10分間加熱した後、1%アガロ
ースゲルに全量をスロットした。電気泳動装置はGelMat
e(東洋紡績製)を用い、1×MOPS緩衝液(20m
M MOPS、5mM酢酸ナトリウム、1mM EDT
A)中で100V、40分間泳動を行った。電気泳動終
了後、ゲルをエチジウムブロマイド溶液で30分間浸せ
きし、水道水にて軽く洗浄後、UV照射下で核酸の蛍光
を撮影した(図1)。
Aの混入がほとんど見られないポリA+RNAをスメア
状に検出することができた。その結果を図1に示す。図
1中、レーン1は2−メルカプトエタノール0.05
M、レーン2は2−メルカプトエタノール0.1M、レ
ーン3は2−メルカプトエタノール0.5M、レーン4
は2−メルカプトエタノール1.0Mを加えて単離した
泳動パターンを示す。図1から、2−メルカプトエタノ
ール0.5MでRNAの回収量が高い。また吸光光度計
でポリA+RNA回収量を正確に測定した結果を表1に
示す。
Aの調製 マウスより心臓を摘出し、使用するまで液体窒素中で凍
結保存した。使用時に凍結された組織を粉末状になるま
で破砕し、35mgずつ分取した。400μlの吸着液
[4Mグアニジンチオシアン酸塩、0.1Mトリス−塩
酸緩衝液(pH8.0)、0.5%N−ラウロイルサル
コシン酸ナトリウム] に、0.05、0.1、0.5、
1.0M 2−メルカプトエタノールを混合し、破砕試
料に加え、よくホモジナイズした。25G注射針を装着
したシリンジを10回と押し、粘性を低下させた後、8
00μl緩衝液 [0.1Mトリス−塩酸緩衝液(pH
8.0)、200mM塩化リチウム、20mM EDT
A] を加えた。混合後、遠心分離(10000rpm、
3分)し、上清をポリA+RNAの単離に用いた。
調製したオリゴdT固定化磁性粒子(Genovision製)を
250μl分取し、磁性スタンド(Magical Trapper;
東洋紡績製)に静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペ
ットで除去した。この磁性粒子に上記の上清を加え、ボ
ルテックスミキサーでよく懸濁した後、室温で10分間
放置した。次に、このマイクロチューブを磁性スタンド
に静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペットで除去し
た。次に、1ml洗浄液 [10mMトリス−塩酸緩衝液
(pH8.0),50mM塩化リチウム、1mM ED
TA] を加え、ボルテックスミキサーでよく懸濁し、磁
性スタンドに静置して、磁性粒子を回収し、上清をピペ
ットで除去した。この洗浄操作を3回繰り返し、上清を
完全に除去した。30μlのRNA分解酵素を含まない
水を加えて粒子を懸濁し、65℃、2分間加熱し、再度
磁性スタンドに静置し、磁性粒子を集め、上清を回収し
た。混入rRNA、ゲノムDNAを極力除くため、この
回収液に再度吸着液、2−メルカプトエタノールを加
え、上記一連の工程を繰り返し、30μlの水に溶出し
た。
Aの回収量を吸光光度計で正確に測定した結果を表2に
示す。実施例1に比べて添加効果は大きくないが、2−
メルカプトエタノール濃度を0.5M、さらには1.0
Mに増加させることで回収量は向上した。また、実施例
1、2において至適濃度が異なるのは試料の性質の違い
によるものと思われる。
生体材料から簡便にしかも効率的にポリA+RNA等の
標的リボ核酸を単離することが可能となった。この方法
により得られたポリA+RNA等のリボ核酸は、ノザン
ブロット解析、RT−PCR解析、cDNAライブラリ
ーの調製、cDNAクローニングなどに利用することが
可能である。
ポリA+RNAの電気泳動解析の結果を示す。
Claims (14)
- 【請求項1】 以下の工程〜を含んでなることを特
徴とするリボ核酸の単離方法。 リボ核酸を含有する試料、タンパク質変性剤、及び2
−メルカプトエタノールを0.2〜1.0Mの濃度にな
るように混合し、 リボ核酸を標的リボ核酸プローブ固定化担体に特異的
に吸着させ、 担体−標的リボ核酸複合体を液相より分離し、洗浄液
により該複合体を洗浄し、 標的リボ核酸を該複合体から溶出する - 【請求項2】 工程において、緩衝液を添加した後で
リボ核酸を標的リボ核酸プローブ固定化担体に特異的に
吸着せしめることを行う請求項1記載のリボ核酸の単離
方法。 - 【請求項3】 リボ核酸がポリA+RNAもしくはウイ
ルスRNAである請求項1又は2に記載の方法。 - 【請求項4】 担体に固定化された標的リボ核酸プロー
ブがオリゴdTもしくはウイルスRNA塩基配列に実質
的に相補的なオリゴヌクレオチドである請求項1又は2
に記載の方法。 - 【請求項5】 タンパク質変性剤がカオトロピック剤及
び/又は界面活性剤である請求項1又は2に記載の方
法。 - 【請求項6】 カオトロピック剤がグアニジニウム塩、
尿素、ヨウ化物及び(イソ)チオシアン酸塩からなる群
より選択される少なくとも1種である請求項5記載の方
法。 - 【請求項7】 界面活性剤がN−ラウロイルサルコシ
ン、ノニデットP−40、ポリエチレングリコールモノ
−p−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレート、ドデシル硫酸ナトリウ
ム及びアルキル硫酸アルカリ金属塩からなる群より選択
される少なくとも1種である請求項5記載の方法。 - 【請求項8】 緩衝液が200mM以下の濃度のリチウ
ム塩またはナトリウム塩を含む溶液である請求項1又は
2に記載の方法。 - 【請求項9】 洗浄液が25〜100mMのリチウム塩
またはナトリウム塩を含む溶液である請求項1又は2に
記載の方法。 - 【請求項10】 タンパク質変性剤を含有する溶液、2
−メルカプトエタノール、標的リボ核酸プローブ固定化
担体、洗浄液及び溶出液を含むことを特徴とするリボ核
酸単離用試薬。 - 【請求項11】 (a)グアニジニウム塩、尿素、ヨウ
化物及び(イソ)チオシアン酸塩からなる群より選択さ
れる1種又は2種以上の化合物、並びにN−ラウロイル
サルコシン、ノニデットP−40、ポリエチレングリコ
ールモノ−p−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレートからなる群より
選択される1種または2種以上の化合物を含有する溶解
液、(b)2−メルカプトエタノール、(c)緩衝液、
(d)標的核酸プローブが固定化された担体、(e)2
5〜100mMのリチウム塩またはナトリウム塩を含む
洗浄液、(f)担体から標的リボ核酸を溶出する溶液を
含むことを特徴とするリボ核酸単離用試薬。 - 【請求項12】 (c)の緩衝液が200mM以下の濃
度のリチウム塩もしくはナトリウム塩を含む緩衝液であ
る請求項11記載のリボ核酸単離用試薬。 - 【請求項13】 (a)グアニジニウム塩、尿素、ヨウ
化物及び(イソ)チオシアン酸塩からなる群より選択さ
れる1種又は2種以上のの化合物、並びにN−ラウロイ
ルサルコシン、ノニデットP−40、ポリエチレングリ
コールモノ−p−イソオクチルフェニルエーテル、ポリ
オキシエチレンソルビタンモノラウレートからなる群よ
り選択される1種または2種以上のの化合物を含有する
溶解液、(b)2−メルカプトエタノール、(c)緩衝
液、(d)オリゴdTが固定化された担体、(e)25
〜100mMのリチウム塩もしくはナトリウム塩を含む
洗浄液、(f)担体からポリA+RNAを溶出する溶液
を含むことを特徴とするポリA+RNA単離用試薬。 - 【請求項14】 (c)の緩衝液が200mM以下の濃
度のリチウム塩もしくはナトリウム塩を含む緩衝液であ
る請求項13記載のポリA+RNA単離用試薬。
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JP2010193814A (ja) * | 2009-02-26 | 2010-09-09 | Marcom:Kk | 核酸抽出用試薬、核酸抽出用試薬キットおよび核酸抽出方法 |
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