JP2001299341A - 改良されたリボ核酸の単離方法 - Google Patents
改良されたリボ核酸の単離方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】リボ核酸を含有する試料、特に細胞等の生体試
料から、ポリＡ+ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡなどの標的リ
ボ核酸を簡便に効率良く単離できる方法並びにそのため
の試薬を提供する。 【解決手段】以下の工程〜を含んでなることを特徴
とするリボ核酸の単離方法およびそのための試薬。 リボ核酸を含有する試料、タンパク質変性剤、及び２
−メルカプトエタノールを０．２〜１．０Ｍの濃度にな
るように混合し、 必要に応じて緩衝液を添加して、リボ核酸を標的リボ
核酸プローブ固定化担体に特異的に吸着させ、 担体−標的リボ核酸複合体を液相より分離し、洗浄液
により該複合体を洗浄し、 標的リボ核酸を該複合体から溶出する
料から、ポリＡ+ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡなどの標的リ
ボ核酸を簡便に効率良く単離できる方法並びにそのため
の試薬を提供する。 【解決手段】以下の工程〜を含んでなることを特徴
とするリボ核酸の単離方法およびそのための試薬。 リボ核酸を含有する試料、タンパク質変性剤、及び２
−メルカプトエタノールを０．２〜１．０Ｍの濃度にな
るように混合し、 必要に応じて緩衝液を添加して、リボ核酸を標的リボ
核酸プローブ固定化担体に特異的に吸着させ、 担体−標的リボ核酸複合体を液相より分離し、洗浄液
により該複合体を洗浄し、 標的リボ核酸を該複合体から溶出する
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はリボ核酸の単離方法
及びそのための試薬に関する。さらに詳しくは、ポリＡ
+ＲＮＡやウイルスＲＮＡを含有する試料より標的リボ
核酸プローブ固定化担体を用いて、簡便に標的リボ核酸
を単離する方法ならびにそのための試薬に関する。
及びそのための試薬に関する。さらに詳しくは、ポリＡ
+ＲＮＡやウイルスＲＮＡを含有する試料より標的リボ
核酸プローブ固定化担体を用いて、簡便に標的リボ核酸
を単離する方法ならびにそのための試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年種々の生物において、全ゲノムデオ
キシリボ核酸（ＤＮＡ）塩基配列が解明されつつある。
しかしながら、これら全てが生命現象を担うわけではな
く、生命現象の主たる担い手タンパク質のアミノ酸配列
情報を含む領域、このタンパク質の合成を触媒するリボ
核酸（ＲＮＡ）、すなわちトランスファーＲＮＡ（ｔＲ
ＮＡ）及びリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の塩基配列
情報を含む領域の他、生命現象には必要とされない領域
が存在する。また、タンパク質アミノ酸配列情報を含む
領域も一つのタンパク質に対し必ずしも一つの連続した
領域からなるものではない。つまり、タンパク質の合成
の前にまずＲＮＡに転写されるが、この際その間に挟ま
れたアミノ酸配列情報を含まない領域（イントロン)も
合わせて転写され、スプライシングと呼ばれる過程でこ
の領域が切除され、アミノ酸配列情報を含む領域が残っ
たメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が生成するのであ
る。
キシリボ核酸（ＤＮＡ）塩基配列が解明されつつある。
しかしながら、これら全てが生命現象を担うわけではな
く、生命現象の主たる担い手タンパク質のアミノ酸配列
情報を含む領域、このタンパク質の合成を触媒するリボ
核酸（ＲＮＡ）、すなわちトランスファーＲＮＡ（ｔＲ
ＮＡ）及びリボゾーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）の塩基配列
情報を含む領域の他、生命現象には必要とされない領域
が存在する。また、タンパク質アミノ酸配列情報を含む
領域も一つのタンパク質に対し必ずしも一つの連続した
領域からなるものではない。つまり、タンパク質の合成
の前にまずＲＮＡに転写されるが、この際その間に挟ま
れたアミノ酸配列情報を含まない領域（イントロン)も
合わせて転写され、スプライシングと呼ばれる過程でこ
の領域が切除され、アミノ酸配列情報を含む領域が残っ
たメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が生成するのであ
る。
【０００３】真核生物ではこのｍＲＮＡの３’末端がポ
リアデニル化されているのが特徴でありポリＡ+ＲＮＡ
と呼ばれる。このポリＡ+ＲＮＡの解析は、生命現象を
解明する上で非常に重要な情報を提供する。ポリＡ+Ｒ
ＮＡの解析において、しばしばｔＲＮＡ，ｒＲＮＡ，ｍ
ＲＮＡ（ポリＡ+ＲＮＡ）の混合物であるTotal ＲＮＡ
を用いて行われるが、このTotal ＲＮＡに占めるポリＡ
+ＲＮＡの割合は５％以下であり、特にコピー数の少な
いポリＡ+ＲＮＡの解析は困難である。そのため、生体
材料からポリＡ+ＲＮＡを効率良く単離することは、こ
れらの解析において非常に有意義なものである。これら
の分野で頻繁に使用されているｃＤＮＡライブラリーの
調製、ｃＤＮＡクローニング、ノザンブロット解析、逆
転写ポリメラーゼチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ）などの解析法において良好な結果を得るためには、
できる限り高純度のポリＡ+ＲＮＡを使用することがよ
り良い結果をもたらす。また、ウイルスなどにおいてリ
ボ核酸を生命情報の担い手として利用しているものも存
在する。これらリボ核酸の解析は、生化学、遺伝子工学
及び臨床診断等の分野において非常に重要な情報を提供
し、生体材料からのリボ核酸の単離は重要なステップで
ある。
リアデニル化されているのが特徴でありポリＡ+ＲＮＡ
と呼ばれる。このポリＡ+ＲＮＡの解析は、生命現象を
解明する上で非常に重要な情報を提供する。ポリＡ+Ｒ
ＮＡの解析において、しばしばｔＲＮＡ，ｒＲＮＡ，ｍ
ＲＮＡ（ポリＡ+ＲＮＡ）の混合物であるTotal ＲＮＡ
を用いて行われるが、このTotal ＲＮＡに占めるポリＡ
+ＲＮＡの割合は５％以下であり、特にコピー数の少な
いポリＡ+ＲＮＡの解析は困難である。そのため、生体
材料からポリＡ+ＲＮＡを効率良く単離することは、こ
れらの解析において非常に有意義なものである。これら
の分野で頻繁に使用されているｃＤＮＡライブラリーの
調製、ｃＤＮＡクローニング、ノザンブロット解析、逆
転写ポリメラーゼチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣ
Ｒ）などの解析法において良好な結果を得るためには、
できる限り高純度のポリＡ+ＲＮＡを使用することがよ
り良い結果をもたらす。また、ウイルスなどにおいてリ
ボ核酸を生命情報の担い手として利用しているものも存
在する。これらリボ核酸の解析は、生化学、遺伝子工学
及び臨床診断等の分野において非常に重要な情報を提供
し、生体材料からのリボ核酸の単離は重要なステップで
ある。
【０００４】ポリＡ+ＲＮＡを単離するには一般に生体
試料より、ＡＧＰＣ法[Analytical Biochemistry 162,1
56-159(1987)]、リチウム沈殿法（Molecular Cloning,
1.4,(1998)）、あるいはＢｏｏｍらにより考案されたシ
リカ粒子を用いた方法[J. Clin. Microbiol. 28(3), 49
5-503]によりTotal ＲＮＡを抽出し、このTotal ＲＮＡ
のうちポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴセファロース等のオ
リゴｄＴ固定化担体に特異的に吸着させ、ポリＡ+ＲＮ
Ａを精製する方法が用いられてきた。しかしながら、こ
れらの方法では操作工程が長く煩雑となるため、一度に
多サンプルを処理する場合には向かない。その上操作工
程が長いため、ＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡの分解の危
険性も増大する。
試料より、ＡＧＰＣ法[Analytical Biochemistry 162,1
56-159(1987)]、リチウム沈殿法（Molecular Cloning,
1.4,(1998)）、あるいはＢｏｏｍらにより考案されたシ
リカ粒子を用いた方法[J. Clin. Microbiol. 28(3), 49
5-503]によりTotal ＲＮＡを抽出し、このTotal ＲＮＡ
のうちポリＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴセファロース等のオ
リゴｄＴ固定化担体に特異的に吸着させ、ポリＡ+ＲＮ
Ａを精製する方法が用いられてきた。しかしながら、こ
れらの方法では操作工程が長く煩雑となるため、一度に
多サンプルを処理する場合には向かない。その上操作工
程が長いため、ＲＮＡ分解酵素によるＲＮＡの分解の危
険性も増大する。
【０００５】一方、簡便なポリＡ+ＲＮＡの単離方法と
して、カオトロピック剤存在下で生体試料を溶解し、ポ
リＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴセルロース等のオリゴｄＴ固
定化担体に吸着させ、精製する方法が考案されている。
しかしながら、この方法においては、オープンカラムの
操作ではＲＮＡ分解酵素の混入の危険性が高く、またバ
ッチ法における閉鎖系では液相と担体−ポリＡ+ＲＮＡ
複合体を分離するのに遠心操作が必要とされ、一度に多
サンプルを処理する場合には煩雑となる。
して、カオトロピック剤存在下で生体試料を溶解し、ポ
リＡ+ＲＮＡをオリゴｄＴセルロース等のオリゴｄＴ固
定化担体に吸着させ、精製する方法が考案されている。
しかしながら、この方法においては、オープンカラムの
操作ではＲＮＡ分解酵素の混入の危険性が高く、またバ
ッチ法における閉鎖系では液相と担体−ポリＡ+ＲＮＡ
複合体を分離するのに遠心操作が必要とされ、一度に多
サンプルを処理する場合には煩雑となる。
【０００６】オリゴｄＴ固定化担体を使用するポリＡ+
ＲＮＡの単離方法としては、ビオチン化オリゴｄＴをス
トレプトアビジン固定化磁性ビーズに吸着させ、このオ
リゴｄＴ−ストレプトアビジン磁性ビーズにポリＡ+Ｒ
ＮＡを特異的に吸着する方法が考案されている。この方
法では、磁石を用いて担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を分
離でき、遠心操作を必要としない。しかしながら、この
方法は担体への吸着が多段階であるために効率が悪い。
そこで、これらの問題点を克服した方法が必要とされて
いる。
ＲＮＡの単離方法としては、ビオチン化オリゴｄＴをス
トレプトアビジン固定化磁性ビーズに吸着させ、このオ
リゴｄＴ−ストレプトアビジン磁性ビーズにポリＡ+Ｒ
ＮＡを特異的に吸着する方法が考案されている。この方
法では、磁石を用いて担体−ポリＡ+ＲＮＡ複合体を分
離でき、遠心操作を必要としない。しかしながら、この
方法は担体への吸着が多段階であるために効率が悪い。
そこで、これらの問題点を克服した方法が必要とされて
いる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、リボ
核酸を含有する試料、特に細胞等の生体試料から、ポリ
Ａ+ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡなどの標的リボ核酸を簡便
に効率良く単離できる方法並びにそのための試薬を提供
することにある。
核酸を含有する試料、特に細胞等の生体試料から、ポリ
Ａ+ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡなどの標的リボ核酸を簡便
に効率良く単離できる方法並びにそのための試薬を提供
することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、オリゴｄ
Ｔを共有結合で固定化した磁性粒子などの標的リボ核酸
プローブ固定化担体を用いたリボ核酸の単離方法に着目
し、種々検討を重ねた結果、カオトロピック剤、界面活
性剤、２−メルカプトエタノールを含む溶液を用いて細
胞等の生体材料を溶解して緩衝液で希釈し、標的核酸プ
ローブ固定化担体と接触させることで簡便にリボ核酸を
単離できること、特に２−メルカプトエタノールの添加
量に依存して収量が増大することを見出し、本発明を完
成させるに至った。
Ｔを共有結合で固定化した磁性粒子などの標的リボ核酸
プローブ固定化担体を用いたリボ核酸の単離方法に着目
し、種々検討を重ねた結果、カオトロピック剤、界面活
性剤、２−メルカプトエタノールを含む溶液を用いて細
胞等の生体材料を溶解して緩衝液で希釈し、標的核酸プ
ローブ固定化担体と接触させることで簡便にリボ核酸を
単離できること、特に２−メルカプトエタノールの添加
量に依存して収量が増大することを見出し、本発明を完
成させるに至った。
【０００９】すなわち、本発明は以下のような構成から
なる。 （１）以下の工程〜を含んでなることを特徴とする
リボ核酸の単離方法。 リボ核酸を含有する試料、タンパク質変性剤、及び２
−メルカプトエタノールを０．２〜１．０Ｍの濃度にな
るように混合し、 リボ核酸を標的リボ核酸プローブ固定化担体に特異的
に吸着させ、 担体−標的リボ核酸複合体を液相より分離し、洗浄液
により該複合体を洗浄し、 標的リボ核酸を該複合体から溶出する （２）工程において、緩衝液を添加した後でリボ核酸
を標的リボ核酸プローブ固定化担体に特異的に吸着せし
めることを行う（１）のリボ核酸の単離方法。 （３）リボ核酸がポリＡ+ＲＮＡもしくはウイルスＲＮ
Ａである（１）又は（２）の方法。 （４）担体に固定化された標的リボ核酸プローブがオリ
ゴｄＴもしくはウイルスＲＮＡ塩基配列に実質的に相補
的なオリゴヌクレオチドである（１）又は（２）の方
法。 （５）タンパク質変性剤がカオトロピック剤及び／又は
界面活性剤である（１）又は（２）の方法。 （６）カオトロピック剤がグアニジニウム塩、尿素、ヨ
ウ化物及び（イソ）チオシアン酸塩からなる群より選択
される少なくとも１種である（５）の方法。 （７）界面活性剤がＮ−ラウロイルサルコシン、ノニデ
ットＰ−４０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソ
オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート、ドデシル硫酸ナトリウム及びアル
キル硫酸アルカリ金属塩からなる群より選択される少な
くとも１種である（５）の方法。 （８）緩衝液が２００ｍＭ以下の濃度のリチウム塩また
はナトリウム塩を含む溶液である（１）又は（２）の方
法。 （９）洗浄液が２５〜１００ｍＭのリチウム塩またはナ
トリウム塩を含む溶液である（１）又は（２）の方法。 （１０）タンパク質変性剤を含有する溶液、２−メルカ
プトエタノール、標的リボ核酸プローブ固定化担体、洗
浄液及び溶出液を含むことを特徴とするリボ核酸単離用
試薬。 （１１）（ａ）グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物及び
（イソ）チオシアン酸塩からなる群より選択される１種
又は２種以上の化合物、並びにＮ−ラウロイルサルコシ
ン、ノニデットＰ−４０、ポリエチレングリコールモノ
−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレートからなる群より選択され
る１種または２種以上の化合物を含有する溶解液、
（ｂ）２−メルカプトエタノール、（ｃ）緩衝液、
（ｄ）標的核酸プローブが固定化された担体、（ｅ）２
５〜１００ｍＭのリチウム塩またはナトリウム塩を含む
洗浄液、（ｆ）担体から標的リボ核酸を溶出する溶液を
含むことを特徴とするリボ核酸単離用試薬。 （１２）（ｃ）の緩衝液が２００ｍＭ以下の濃度のリチ
ウム塩もしくはナトリウム塩を含む緩衝液である（１
１）のリボ核酸単離用試薬。 （１３）（ａ）グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物及び
（イソ）チオシアン酸塩からなる群より選択される１種
又は２種以上のの化合物、並びにＮ−ラウロイルサルコ
シン、ノニデットＰ−４０、ポリエチレングリコールモ
ノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレートからなる群より選択さ
れる１種または２種以上のの化合物を含有する溶解液、
（ｂ）２−メルカプトエタノール、（ｃ）緩衝液、
（ｄ）オリゴｄＴが固定化された担体、（ｅ）２５〜１
００ｍＭのリチウム塩もしくはナトリウム塩を含む洗浄
液、（ｆ）担体からポリＡ+ＲＮＡを溶出する溶液を含
むことを特徴とするポリＡ+ＲＮＡ単離用試薬。 （１４）（ｃ）の緩衝液が２００ｍＭ以下の濃度のリチ
ウム塩もしくはナトリウム塩を含む緩衝液である（１
３）のポリＡ+ＲＮＡ単離用試薬。
なる。 （１）以下の工程〜を含んでなることを特徴とする
リボ核酸の単離方法。 リボ核酸を含有する試料、タンパク質変性剤、及び２
−メルカプトエタノールを０．２〜１．０Ｍの濃度にな
るように混合し、 リボ核酸を標的リボ核酸プローブ固定化担体に特異的
に吸着させ、 担体−標的リボ核酸複合体を液相より分離し、洗浄液
により該複合体を洗浄し、 標的リボ核酸を該複合体から溶出する （２）工程において、緩衝液を添加した後でリボ核酸
を標的リボ核酸プローブ固定化担体に特異的に吸着せし
めることを行う（１）のリボ核酸の単離方法。 （３）リボ核酸がポリＡ+ＲＮＡもしくはウイルスＲＮ
Ａである（１）又は（２）の方法。 （４）担体に固定化された標的リボ核酸プローブがオリ
ゴｄＴもしくはウイルスＲＮＡ塩基配列に実質的に相補
的なオリゴヌクレオチドである（１）又は（２）の方
法。 （５）タンパク質変性剤がカオトロピック剤及び／又は
界面活性剤である（１）又は（２）の方法。 （６）カオトロピック剤がグアニジニウム塩、尿素、ヨ
ウ化物及び（イソ）チオシアン酸塩からなる群より選択
される少なくとも１種である（５）の方法。 （７）界面活性剤がＮ−ラウロイルサルコシン、ノニデ
ットＰ−４０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソ
オクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソルビ
タンモノラウレート、ドデシル硫酸ナトリウム及びアル
キル硫酸アルカリ金属塩からなる群より選択される少な
くとも１種である（５）の方法。 （８）緩衝液が２００ｍＭ以下の濃度のリチウム塩また
はナトリウム塩を含む溶液である（１）又は（２）の方
法。 （９）洗浄液が２５〜１００ｍＭのリチウム塩またはナ
トリウム塩を含む溶液である（１）又は（２）の方法。 （１０）タンパク質変性剤を含有する溶液、２−メルカ
プトエタノール、標的リボ核酸プローブ固定化担体、洗
浄液及び溶出液を含むことを特徴とするリボ核酸単離用
試薬。 （１１）（ａ）グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物及び
（イソ）チオシアン酸塩からなる群より選択される１種
又は２種以上の化合物、並びにＮ−ラウロイルサルコシ
ン、ノニデットＰ−４０、ポリエチレングリコールモノ
−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレートからなる群より選択され
る１種または２種以上の化合物を含有する溶解液、
（ｂ）２−メルカプトエタノール、（ｃ）緩衝液、
（ｄ）標的核酸プローブが固定化された担体、（ｅ）２
５〜１００ｍＭのリチウム塩またはナトリウム塩を含む
洗浄液、（ｆ）担体から標的リボ核酸を溶出する溶液を
含むことを特徴とするリボ核酸単離用試薬。 （１２）（ｃ）の緩衝液が２００ｍＭ以下の濃度のリチ
ウム塩もしくはナトリウム塩を含む緩衝液である（１
１）のリボ核酸単離用試薬。 （１３）（ａ）グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物及び
（イソ）チオシアン酸塩からなる群より選択される１種
又は２種以上のの化合物、並びにＮ−ラウロイルサルコ
シン、ノニデットＰ−４０、ポリエチレングリコールモ
ノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノラウレートからなる群より選択さ
れる１種または２種以上のの化合物を含有する溶解液、
（ｂ）２−メルカプトエタノール、（ｃ）緩衝液、
（ｄ）オリゴｄＴが固定化された担体、（ｅ）２５〜１
００ｍＭのリチウム塩もしくはナトリウム塩を含む洗浄
液、（ｆ）担体からポリＡ+ＲＮＡを溶出する溶液を含
むことを特徴とするポリＡ+ＲＮＡ単離用試薬。 （１４）（ｃ）の緩衝液が２００ｍＭ以下の濃度のリチ
ウム塩もしくはナトリウム塩を含む緩衝液である（１
３）のポリＡ+ＲＮＡ単離用試薬。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に説明する。
本発明においてリボ核酸を含有する試料とは、例えば、
血清、血液、髄液、組織、尿、糞便、唾液、精液等の生
体材料から分離した細胞及び培養細胞などが挙げられ
る。また、ここでいうリボ核酸とは、これらの試料中に
由来するポリＡ+ＲＮＡなどの内在性リボ核酸以外に、
ウイルス、細菌及び真菌などの外来性のリボ核酸または
生体外で酵素的に合成されたようなリボ核酸も含有しう
る。
本発明においてリボ核酸を含有する試料とは、例えば、
血清、血液、髄液、組織、尿、糞便、唾液、精液等の生
体材料から分離した細胞及び培養細胞などが挙げられ
る。また、ここでいうリボ核酸とは、これらの試料中に
由来するポリＡ+ＲＮＡなどの内在性リボ核酸以外に、
ウイルス、細菌及び真菌などの外来性のリボ核酸または
生体外で酵素的に合成されたようなリボ核酸も含有しう
る。
【００１１】本発明は、まず、リボ核酸を含有する試
料、タンパク質変性剤を含む溶液、濃度が０．２〜０．
５Ｍとなるように加えられた２−メルカプトエタノー
ル、及び標的リボ核酸プローブ固定化担体を混合し、必
要に応じて緩衝液を加え、標的リボ核酸を該担体に特異
的に吸着させる。タンパク質変性剤を含む溶液とは溶解
液である。本発明において使用するタンパク質変性剤と
はカオトロピック剤及び／又は界面活性剤である。 ま
た、緩衝液はｐＨが５〜１０のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、
Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝
液、クエン酸ナトリウム緩衝液などが挙げられる。
料、タンパク質変性剤を含む溶液、濃度が０．２〜０．
５Ｍとなるように加えられた２−メルカプトエタノー
ル、及び標的リボ核酸プローブ固定化担体を混合し、必
要に応じて緩衝液を加え、標的リボ核酸を該担体に特異
的に吸着させる。タンパク質変性剤を含む溶液とは溶解
液である。本発明において使用するタンパク質変性剤と
はカオトロピック剤及び／又は界面活性剤である。 ま
た、緩衝液はｐＨが５〜１０のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、
Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝
液、クエン酸ナトリウム緩衝液などが挙げられる。
【００１２】カオトロピック剤とは、タンパク質および
核酸の一次構造に影響を及ぼすことなく、二次、三次ま
たは四次構造を変えることが可能である物質を意味す
る。本発明において使用するカオトロピック剤としては
特に限定されるものではないが、グアニジニウム塩、尿
素、ヨウ化物、（イソ）チアン酸塩等が挙げられる。該
カオトロピック剤の濃度はそれぞれの化合物によっても
異なるが、通常は１〜１０Ｍ、より好ましくは３〜８Ｍ
である。
核酸の一次構造に影響を及ぼすことなく、二次、三次ま
たは四次構造を変えることが可能である物質を意味す
る。本発明において使用するカオトロピック剤としては
特に限定されるものではないが、グアニジニウム塩、尿
素、ヨウ化物、（イソ）チアン酸塩等が挙げられる。該
カオトロピック剤の濃度はそれぞれの化合物によっても
異なるが、通常は１〜１０Ｍ、より好ましくは３〜８Ｍ
である。
【００１３】グアニジニウム塩としては、グアニジン無
機塩またはグアニジン有機塩がある。グアニジン塩とし
ては、例えば、塩酸グアニジニウム、酢酸グアニジニウ
ム、リン酸グアニジニウム、（イソ）チオシアン酸グア
ニジニウム、硫酸グアニジニウムまたは炭酸グアニジニ
ウムなどの一般にタンパク質の変性に使用されるグアニ
ジンの塩であれば特に限定されない。また、それらを組
み合わせて用いても良い。グアニジン塩の濃度は２Ｍ以
上の高濃度にて使用するのが望ましい。また、ヨウ化物
としては、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウムなど
があり、（イソ）チオシアン酸塩としては、（イソ）チ
オシアン酸ナトリウム、（イソ）チオシアン酸カリウム
または（イソ）チオシアン酸アンモニウムなどがある。
機塩またはグアニジン有機塩がある。グアニジン塩とし
ては、例えば、塩酸グアニジニウム、酢酸グアニジニウ
ム、リン酸グアニジニウム、（イソ）チオシアン酸グア
ニジニウム、硫酸グアニジニウムまたは炭酸グアニジニ
ウムなどの一般にタンパク質の変性に使用されるグアニ
ジンの塩であれば特に限定されない。また、それらを組
み合わせて用いても良い。グアニジン塩の濃度は２Ｍ以
上の高濃度にて使用するのが望ましい。また、ヨウ化物
としては、ヨウ化ナトリウムまたはヨウ化カリウムなど
があり、（イソ）チオシアン酸塩としては、（イソ）チ
オシアン酸ナトリウム、（イソ）チオシアン酸カリウム
または（イソ）チオシアン酸アンモニウムなどがある。
【００１４】さらに、タンパク質変性剤として、細胞膜
の破壊あるいは細胞に含まれるタンパク質を可溶化させ
る界面活性剤を単独で使用してもよいが、あるいはカオ
トロピック剤と併用させてもよい。カオトロピック剤と
併用しない場合は一般に細胞等から核酸の抽出に使用さ
れるものであれば特に限定されないが、特表平１１−５
０１５０４号公報に開示されているようなドデシル硫酸
ナトリウムやアルキル硫酸アルカリ金属塩、あるいはサ
ルコシルが望ましい。しかしながら、カオトロピック剤
と併用する場合、前者２つの界面活性剤は不溶化するた
めに用いることができない。この場合には、トリトン系
界面活性剤及びツイーン系界面活性剤などの非イオン性
界面活性剤、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムな
どの陰イオン性界面活性剤を用いれば問題がない。本発
明においては、特にＲＮＡ分解酵素活性が高い試料にお
いて、カオトロピック剤と併用して０．０１〜１．０％
の陰イオン性界面活性剤を使用することが好ましい。
の破壊あるいは細胞に含まれるタンパク質を可溶化させ
る界面活性剤を単独で使用してもよいが、あるいはカオ
トロピック剤と併用させてもよい。カオトロピック剤と
併用しない場合は一般に細胞等から核酸の抽出に使用さ
れるものであれば特に限定されないが、特表平１１−５
０１５０４号公報に開示されているようなドデシル硫酸
ナトリウムやアルキル硫酸アルカリ金属塩、あるいはサ
ルコシルが望ましい。しかしながら、カオトロピック剤
と併用する場合、前者２つの界面活性剤は不溶化するた
めに用いることができない。この場合には、トリトン系
界面活性剤及びツイーン系界面活性剤などの非イオン性
界面活性剤、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウムな
どの陰イオン性界面活性剤を用いれば問題がない。本発
明においては、特にＲＮＡ分解酵素活性が高い試料にお
いて、カオトロピック剤と併用して０．０１〜１．０％
の陰イオン性界面活性剤を使用することが好ましい。
【００１５】本発明において使用する２−メルカプトエ
タノールの濃度は、リボ核酸を含有する試料、タンパク
質変性剤と混合した際に０．２〜１．０Ｍ、好ましくは
０．２〜０．５Ｍとなるように加える。さらに、２−メ
ルカプトエタノールは溶解液に予め添加しておいてもよ
いが、用時に添加するのがより望ましい。
タノールの濃度は、リボ核酸を含有する試料、タンパク
質変性剤と混合した際に０．２〜１．０Ｍ、好ましくは
０．２〜０．５Ｍとなるように加える。さらに、２−メ
ルカプトエタノールは溶解液に予め添加しておいてもよ
いが、用時に添加するのがより望ましい。
【００１６】従来から生体試料を溶解する際の還元剤と
しては０．１Ｍの２−メルカプトエタノールが広く用い
られている（ＡＧＰＣ法；Analytical Biochemistry 16
2,156-159(1987)など）。また、特開平１１−１９６８
６９号公報には、核酸結合性担体を用いたリボ核酸の単
離方法においてイソプロパノール、プロパノール、およ
びエタノールなどの水溶性有機溶媒、特に５〜２０％の
エタノールにより単離されるリボ核酸の量が増大するこ
とが開示されている。しかしながら、本発明者らはイソ
プロパノールやエタノールの添加により単離されるリボ
核酸の量が減少し、２−メルカプトエタノールを添加す
ることのみに依存して単離されるリボ核酸の収量が添加
量に応じて増加することを見出した。
しては０．１Ｍの２−メルカプトエタノールが広く用い
られている（ＡＧＰＣ法；Analytical Biochemistry 16
2,156-159(1987)など）。また、特開平１１−１９６８
６９号公報には、核酸結合性担体を用いたリボ核酸の単
離方法においてイソプロパノール、プロパノール、およ
びエタノールなどの水溶性有機溶媒、特に５〜２０％の
エタノールにより単離されるリボ核酸の量が増大するこ
とが開示されている。しかしながら、本発明者らはイソ
プロパノールやエタノールの添加により単離されるリボ
核酸の量が減少し、２−メルカプトエタノールを添加す
ることのみに依存して単離されるリボ核酸の収量が添加
量に応じて増加することを見出した。
【００１７】本発明において、特にカオトロピック剤を
含有する溶解液で試料を溶解した場合、溶液の粘性が非
常に高まり担体への特異的な結合を妨げてしまう。その
ため、ｐＨ５〜１０程度のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅ
ｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液、
クエン酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液、特に好ましくは
２００ｍＭ以下の濃度のリチウム塩もしくはナトリウム
塩が含まれるこれらの緩衝液を２倍量程度加えて希釈す
ることにより粘性を下げることが好ましい。さらに、溶
解された試料を２０〜２５Ｇの注射針を装着したシリン
ジに繰り返し通すことで、ゲノムＤＮＡを切断し、粘性
を下げてもよい。
含有する溶解液で試料を溶解した場合、溶液の粘性が非
常に高まり担体への特異的な結合を妨げてしまう。その
ため、ｐＨ５〜１０程度のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅ
ｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液、
クエン酸ナトリウム緩衝液等の緩衝液、特に好ましくは
２００ｍＭ以下の濃度のリチウム塩もしくはナトリウム
塩が含まれるこれらの緩衝液を２倍量程度加えて希釈す
ることにより粘性を下げることが好ましい。さらに、溶
解された試料を２０〜２５Ｇの注射針を装着したシリン
ジに繰り返し通すことで、ゲノムＤＮＡを切断し、粘性
を下げてもよい。
【００１８】本発明においては、上記溶解液中でリボ核
酸と特異的に結合することができる標的リボ核酸プロー
ブ固定化担体を使用する。標的リボ核酸プローブ固定化
担体とは、オリゴヌクレオチド、好ましくは約２０〜５
０塩基からなる標的リボ核酸配列に相補的な配列を有す
るオリゴヌクレオチドを共有結合的に、あるいは非共有
結合的に固定化したものである。例えば、ポリＡ+ＲＮ
Ａを単離する場合には実質的に３’末端ポリアデニル化
領域（ポリＡテール）に相補的な配列であるオリゴｄＴ
を固定化した担体、またウイルスＲＮＡの場合にはこの
ＲＮＡに実質的に相補的なオリゴヌクレオチドを固定化
された担体を使用する。ここで、オリゴｄＴとは、数個
から数十個の主にｄＴＴＰ及びその類似体がホスホジエ
ステル結合により重合した化合物をいう。また、実質的
に相補的なオリゴヌクレオチドとは、標的リボ核酸に対
して特異的に結合可能な塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチドをいう。標的リボ核酸プローブ固定化担体の形態
としては、粒子、フィルター及び反応器具等が具体的に
挙げられるが特に限定はされない。これらのうち、吸着
と溶出の効率を考慮すると粒子の形態のものが好まし
い。さらには、磁性シリカ粒子を用いることがより好ま
しい。
酸と特異的に結合することができる標的リボ核酸プロー
ブ固定化担体を使用する。標的リボ核酸プローブ固定化
担体とは、オリゴヌクレオチド、好ましくは約２０〜５
０塩基からなる標的リボ核酸配列に相補的な配列を有す
るオリゴヌクレオチドを共有結合的に、あるいは非共有
結合的に固定化したものである。例えば、ポリＡ+ＲＮ
Ａを単離する場合には実質的に３’末端ポリアデニル化
領域（ポリＡテール）に相補的な配列であるオリゴｄＴ
を固定化した担体、またウイルスＲＮＡの場合にはこの
ＲＮＡに実質的に相補的なオリゴヌクレオチドを固定化
された担体を使用する。ここで、オリゴｄＴとは、数個
から数十個の主にｄＴＴＰ及びその類似体がホスホジエ
ステル結合により重合した化合物をいう。また、実質的
に相補的なオリゴヌクレオチドとは、標的リボ核酸に対
して特異的に結合可能な塩基配列からなるオリゴヌクレ
オチドをいう。標的リボ核酸プローブ固定化担体の形態
としては、粒子、フィルター及び反応器具等が具体的に
挙げられるが特に限定はされない。これらのうち、吸着
と溶出の効率を考慮すると粒子の形態のものが好まし
い。さらには、磁性シリカ粒子を用いることがより好ま
しい。
【００１９】上記工程にて得られた担体−標的リボ核酸
複合体を液相より分離する工程では、例えば遠心分離、
上清の除去または担体として磁性粒子を使用する場合は
磁界を利用して液相から担体−標的リボ核酸複合体を分
離するのが好ましい。また、フィルターおよび反応容器
等の場合は、液を排出もしくは除去するのみでよい。
複合体を液相より分離する工程では、例えば遠心分離、
上清の除去または担体として磁性粒子を使用する場合は
磁界を利用して液相から担体−標的リボ核酸複合体を分
離するのが好ましい。また、フィルターおよび反応容器
等の場合は、液を排出もしくは除去するのみでよい。
【００２０】上記工程において得られた担体−標的リボ
核酸複合体を洗浄する工程では、該複合体を適当な洗浄
液にて、例えばボルテックスミキサーなどを用いて懸濁
し、再び液相より分離し、上清を除去する工程である。
該複合体の分離は、遠心分離、濾過及びカラム操作が好
ましく、さらに磁性粒子を使用すれば磁石等を用いた簡
便な磁気分離法が可能となりより好適である。
核酸複合体を洗浄する工程では、該複合体を適当な洗浄
液にて、例えばボルテックスミキサーなどを用いて懸濁
し、再び液相より分離し、上清を除去する工程である。
該複合体の分離は、遠心分離、濾過及びカラム操作が好
ましく、さらに磁性粒子を使用すれば磁石等を用いた簡
便な磁気分離法が可能となりより好適である。
【００２１】本発明における洗浄液としては、例えば標
的リボ核酸とプローブの特異的な結合を解離させない程
度の低塩濃度の緩衝液であり、５０〜１００ｍＭのリチ
ウム塩もしくはナトリウム塩を含む。該緩衝液としては
ｐＨが５〜１０のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−
ＫＯＨ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液、クエン酸
ナトリウム緩衝液などが挙げられる。また、該洗浄液に
おいてはカオトロピック剤、界面活性剤を含んでいても
よいが、後に酵素反応を行う場合には、さらに界面活性
剤、カオトロピックイオンを含まない低塩濃度の緩衝液
にて洗浄する必要がある。
的リボ核酸とプローブの特異的な結合を解離させない程
度の低塩濃度の緩衝液であり、５０〜１００ｍＭのリチ
ウム塩もしくはナトリウム塩を含む。該緩衝液としては
ｐＨが５〜１０のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−
ＫＯＨ緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液、クエン酸
ナトリウム緩衝液などが挙げられる。また、該洗浄液に
おいてはカオトロピック剤、界面活性剤を含んでいても
よいが、後に酵素反応を行う場合には、さらに界面活性
剤、カオトロピックイオンを含まない低塩濃度の緩衝液
にて洗浄する必要がある。
【００２２】その次の工程は、リボ核酸が特異的に結合
した担体に固定化された標的リボ核酸プローブより解離
させる溶出工程である。この用途に用いられる溶出液と
しては、プローブからの核酸の溶離を促進するものであ
れば特に限定されない。具体的には、例えばＲＮＡ分解
酵素の混入のない水、トリス緩衝液 [１０ｍＭトリス緩
衝液；ｐＨ７．０〜８．０] が好ましい。また、加熱に
より溶出を促進させてもよい。加熱温度はリボ核酸に悪
影響を及ぼさない程度の温度であれば特に限定されない
が、６０〜６５℃が好ましい。このようにして溶出した
リボ核酸は透析やエタノール沈殿法等の脱塩、濃縮操作
を経ることなく、逆転写酵素を使用した酵素反応に直接
使用することが可能である。
した担体に固定化された標的リボ核酸プローブより解離
させる溶出工程である。この用途に用いられる溶出液と
しては、プローブからの核酸の溶離を促進するものであ
れば特に限定されない。具体的には、例えばＲＮＡ分解
酵素の混入のない水、トリス緩衝液 [１０ｍＭトリス緩
衝液；ｐＨ７．０〜８．０] が好ましい。また、加熱に
より溶出を促進させてもよい。加熱温度はリボ核酸に悪
影響を及ぼさない程度の温度であれば特に限定されない
が、６０〜６５℃が好ましい。このようにして溶出した
リボ核酸は透析やエタノール沈殿法等の脱塩、濃縮操作
を経ることなく、逆転写酵素を使用した酵素反応に直接
使用することが可能である。
【００２３】本発明によるリボ核酸の単離方法は、危険
な溶媒等を使用することなく、簡便な操作で効率よく標
的リボ核酸を生体成分より分離可能であるため、標的リ
ボ核酸精製キットや、固相の分離操作や試薬の分注操作
を自動化した核酸抽出装置へ応用することも可能であ
る。また、本発明で得られたポリＡ+ＲＮＡやウイルス
ＲＮＡなどのリボ核酸はノザンブロッティング解析、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ解析、ｃＤＮＡライブラリーの調製、ｃＤＮ
Ａクローニングの鋳型として使用することが可能であ
る。
な溶媒等を使用することなく、簡便な操作で効率よく標
的リボ核酸を生体成分より分離可能であるため、標的リ
ボ核酸精製キットや、固相の分離操作や試薬の分注操作
を自動化した核酸抽出装置へ応用することも可能であ
る。また、本発明で得られたポリＡ+ＲＮＡやウイルス
ＲＮＡなどのリボ核酸はノザンブロッティング解析、Ｒ
Ｔ−ＰＣＲ解析、ｃＤＮＡライブラリーの調製、ｃＤＮ
Ａクローニングの鋳型として使用することが可能であ
る。
【００２４】本発明におけるリボ核酸の単離方法の一実
施態様としては、リボ核酸を含有する試料、タンパク
質変性剤、０．２〜０．５Ｍの２−メルカプトエタノー
ルを混合し、必要に応じて緩衝液を添加し、リボ核酸
を標的リボ核酸プローブ固定化担体に特異的に吸着さ
せ、担体−標的リボ核酸を液相より分離し、必要に応
じて該複合体を洗浄し、標的リボ核酸を該複合体から
溶出することを特徴とするものである。
施態様としては、リボ核酸を含有する試料、タンパク
質変性剤、０．２〜０．５Ｍの２−メルカプトエタノー
ルを混合し、必要に応じて緩衝液を添加し、リボ核酸
を標的リボ核酸プローブ固定化担体に特異的に吸着さ
せ、担体−標的リボ核酸を液相より分離し、必要に応
じて該複合体を洗浄し、標的リボ核酸を該複合体から
溶出することを特徴とするものである。
【００２５】また、本発明におけるリボ核酸の単離用試
薬の一実施態様として、上述したようなタンパク質変性
剤を含有する溶液、２−メルカプトエタノール、標的リ
ボ核酸プローブ固定化担体、洗浄液及び溶出液を含むリ
ボ核酸単離用試薬である。さらに、具体的な実施様態と
しては、（ａ）グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物及び
（イソ）チオシアン酸塩からなる群より選択される１種
又は２種の化合物、並びにＮ−ラウロイルサルコシン、
ノニデットＰ−４０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ
−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウレートからなる群より選択される１
種または２種の化合物を含有する溶解液、（ｂ）２−メ
ルカプトエタノール、（ｃ）緩衝液、（ｄ）標的リボ核
酸プローブが固定化された担体、（ｅ）０〜１００ｍＭ
のリチウム塩またはナトリウム塩を含む洗浄液、（ｆ）
担体から標的リボ核酸を溶出する溶液を含むリボ核酸単
離用試薬である。（ｃ）の緩衝液は、２００ｍＭ以下の
濃度のリチウム塩もしくはナトリウム塩を含むｐＨが５
〜１０のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩
衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液、クエン酸ナトリウ
ム緩衝液などが好ましい。
薬の一実施態様として、上述したようなタンパク質変性
剤を含有する溶液、２−メルカプトエタノール、標的リ
ボ核酸プローブ固定化担体、洗浄液及び溶出液を含むリ
ボ核酸単離用試薬である。さらに、具体的な実施様態と
しては、（ａ）グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物及び
（イソ）チオシアン酸塩からなる群より選択される１種
又は２種の化合物、並びにＮ−ラウロイルサルコシン、
ノニデットＰ−４０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ
−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン
ソルビタンモノラウレートからなる群より選択される１
種または２種の化合物を含有する溶解液、（ｂ）２−メ
ルカプトエタノール、（ｃ）緩衝液、（ｄ）標的リボ核
酸プローブが固定化された担体、（ｅ）０〜１００ｍＭ
のリチウム塩またはナトリウム塩を含む洗浄液、（ｆ）
担体から標的リボ核酸を溶出する溶液を含むリボ核酸単
離用試薬である。（ｃ）の緩衝液は、２００ｍＭ以下の
濃度のリチウム塩もしくはナトリウム塩を含むｐＨが５
〜１０のＴｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩
衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液、クエン酸ナトリウ
ム緩衝液などが好ましい。
【００２６】また、本発明のさらに別な実施様態として
は、（ａ）グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物及び（イ
ソ）チオシアン酸塩からなる群より選択される１種又は
２種の化合物、並びにＮ−ラウロイルサルコシン、ノニ
デットＰ−４０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イ
ソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレートからなる群より選択される１種ま
たは２種の化合物を含有する溶解液、（ｂ）２−メルカ
プトエタノール、（ｃ）緩衝液、（ｄ）オリゴｄＴが固
定化された担体、（ｅ）０〜１００ｍＭのリチウム塩ま
たはナトリウム塩を含む洗浄液、（ｆ）担体からポリＡ
+ＲＮＡを溶出する溶液を含むポリＡ+ＲＮＡ単離用試薬
である。（ｃ）の緩衝液は、２００ｍＭ以下の濃度のリ
チウム塩もしくはナトリウム塩を含むｐＨが５〜１０の
Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液、Ｈ
ｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液
などが好ましい。
は、（ａ）グアニジニウム塩、尿素、ヨウ化物及び（イ
ソ）チオシアン酸塩からなる群より選択される１種又は
２種の化合物、並びにＮ−ラウロイルサルコシン、ノニ
デットＰ−４０、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イ
ソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレートからなる群より選択される１種ま
たは２種の化合物を含有する溶解液、（ｂ）２−メルカ
プトエタノール、（ｃ）緩衝液、（ｄ）オリゴｄＴが固
定化された担体、（ｅ）０〜１００ｍＭのリチウム塩ま
たはナトリウム塩を含む洗浄液、（ｆ）担体からポリＡ
+ＲＮＡを溶出する溶液を含むポリＡ+ＲＮＡ単離用試薬
である。（ｃ）の緩衝液は、２００ｍＭ以下の濃度のリ
チウム塩もしくはナトリウム塩を含むｐＨが５〜１０の
Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ緩衝液、Ｈ
ｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液
などが好ましい。
【００２７】
【実施例】以下に、本発明の実施例を例示することによ
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。
って、本発明の効果をより一層明確なものとする。
【００２８】実施例１ マウス肺組織からのポリＡ+Ｒ
ＮＡの抽出 マウス肺組織を摘出し、使用するまで液体窒素中で凍結
保存した。使用時に凍結された組織を粉末状になるまで
破砕し、３０ｍｇずつ分取した。４００μｌの溶解液
[４Ｍグアニジンチオシアン酸塩、０．１Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．５％Ｎ−ラウロイルサル
コシン酸ナトリウム] に、０．０５、０．１、０．５、
１．０Ｍ ２−メルカプトエタノールを混合し、破砕試
料に加え、よくホモジナイズした。２５Ｇ注射針を装着
したシリンジを１０回と押し、粘性を低下させた後、８
００μｌの緩衝液 [０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）、２００ｍＭ塩化リチウム、２０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ] を加えた。混合後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、
３分）し、上清をポリＡ+ＲＮＡの単離に用いた。
ＮＡの抽出 マウス肺組織を摘出し、使用するまで液体窒素中で凍結
保存した。使用時に凍結された組織を粉末状になるまで
破砕し、３０ｍｇずつ分取した。４００μｌの溶解液
[４Ｍグアニジンチオシアン酸塩、０．１Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．５％Ｎ−ラウロイルサル
コシン酸ナトリウム] に、０．０５、０．１、０．５、
１．０Ｍ ２−メルカプトエタノールを混合し、破砕試
料に加え、よくホモジナイズした。２５Ｇ注射針を装着
したシリンジを１０回と押し、粘性を低下させた後、８
００μｌの緩衝液 [０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）、２００ｍＭ塩化リチウム、２０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ] を加えた。混合後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、
３分）し、上清をポリＡ+ＲＮＡの単離に用いた。
【００２９】新しいマイクロチューブに５ｍｇ／ｍｌに
調製したオリゴｄＴ固定化磁性粒子（Genovision製）を
２５０μｌ分取し、磁性スタンド（Magical Trapper；
東洋紡績製）に静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペ
ットで除去した。この磁性粒子に上記の上清を加え、ボ
ルテックスミキサーでよく懸濁した後、室温で１０分間
放置した。次に、このマイクロチューブを磁性スタンド
に静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペットで除去し
た。次に、１ｍｌ洗浄液 [１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ塩化リチウム、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ] を加え、ボルテックスミキサーでよく懸濁し、磁
性スタンドに静置して、磁性粒子を回収し、上清をピペ
ットで除去した。この洗浄操作を３回繰り返し、上清を
完全に除去した。３０μｌのＲＮＡ分解酵素を含まない
水を加えて粒子を懸濁し、６５℃、２分間加熱後、再度
磁性スタンドに静置し、磁性粒子を集め、上清を回収し
た。混入ｒＲＮＡ、ゲノムＤＮＡを極力除くため、この
回収液に再度吸着液、２−メルカプトエタノールを加
え、上記一連の工程を繰り返し、３０μｌの水に溶出し
た。
調製したオリゴｄＴ固定化磁性粒子（Genovision製）を
２５０μｌ分取し、磁性スタンド（Magical Trapper；
東洋紡績製）に静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペ
ットで除去した。この磁性粒子に上記の上清を加え、ボ
ルテックスミキサーでよく懸濁した後、室温で１０分間
放置した。次に、このマイクロチューブを磁性スタンド
に静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペットで除去し
た。次に、１ｍｌ洗浄液 [１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ塩化リチウム、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ] を加え、ボルテックスミキサーでよく懸濁し、磁
性スタンドに静置して、磁性粒子を回収し、上清をピペ
ットで除去した。この洗浄操作を３回繰り返し、上清を
完全に除去した。３０μｌのＲＮＡ分解酵素を含まない
水を加えて粒子を懸濁し、６５℃、２分間加熱後、再度
磁性スタンドに静置し、磁性粒子を集め、上清を回収し
た。混入ｒＲＮＡ、ゲノムＤＮＡを極力除くため、この
回収液に再度吸着液、２−メルカプトエタノールを加
え、上記一連の工程を繰り返し、３０μｌの水に溶出し
た。
【００３０】（２）アガロース電気泳動によるポリＡ+
ＲＮＡの解析 本発明の方法によりマウス肺組織より得られたポリＡ+
ＲＮＡ溶液１０μｌに色素液（０．２５％ブロモフェノ
ールブルー、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ホルムアミド）１０μ
ｌを混合し、６５℃、１０分間加熱した後、１％アガロ
ースゲルに全量をスロットした。電気泳動装置はGelMat
e（東洋紡績製）を用い、１×ＭＯＰＳ緩衝液（２０ｍ
Ｍ ＭＯＰＳ、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）中で１００Ｖ、４０分間泳動を行った。電気泳動終
了後、ゲルをエチジウムブロマイド溶液で３０分間浸せ
きし、水道水にて軽く洗浄後、ＵＶ照射下で核酸の蛍光
を撮影した（図１）。
ＲＮＡの解析 本発明の方法によりマウス肺組織より得られたポリＡ+
ＲＮＡ溶液１０μｌに色素液（０．２５％ブロモフェノ
ールブルー、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ホルムアミド）１０μ
ｌを混合し、６５℃、１０分間加熱した後、１％アガロ
ースゲルに全量をスロットした。電気泳動装置はGelMat
e（東洋紡績製）を用い、１×ＭＯＰＳ緩衝液（２０ｍ
Ｍ ＭＯＰＳ、５ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）中で１００Ｖ、４０分間泳動を行った。電気泳動終
了後、ゲルをエチジウムブロマイド溶液で３０分間浸せ
きし、水道水にて軽く洗浄後、ＵＶ照射下で核酸の蛍光
を撮影した（図１）。
【００３１】この方法において、ｒＲＮＡ，ゲノムＤＮ
Ａの混入がほとんど見られないポリＡ+ＲＮＡをスメア
状に検出することができた。その結果を図１に示す。図
１中、レーン１は２−メルカプトエタノール０．０５
Ｍ、レーン２は２−メルカプトエタノール０．１Ｍ、レ
ーン３は２−メルカプトエタノール０．５Ｍ、レーン４
は２−メルカプトエタノール１．０Ｍを加えて単離した
泳動パターンを示す。図１から、２−メルカプトエタノ
ール０．５ＭでＲＮＡの回収量が高い。また吸光光度計
でポリＡ+ＲＮＡ回収量を正確に測定した結果を表１に
示す。
Ａの混入がほとんど見られないポリＡ+ＲＮＡをスメア
状に検出することができた。その結果を図１に示す。図
１中、レーン１は２−メルカプトエタノール０．０５
Ｍ、レーン２は２−メルカプトエタノール０．１Ｍ、レ
ーン３は２−メルカプトエタノール０．５Ｍ、レーン４
は２−メルカプトエタノール１．０Ｍを加えて単離した
泳動パターンを示す。図１から、２−メルカプトエタノ
ール０．５ＭでＲＮＡの回収量が高い。また吸光光度計
でポリＡ+ＲＮＡ回収量を正確に測定した結果を表１に
示す。
【００３２】
【表１】
【００３３】実施例２ マウス心臓からのポリＡ+ＲＮ
Ａの調製 マウスより心臓を摘出し、使用するまで液体窒素中で凍
結保存した。使用時に凍結された組織を粉末状になるま
で破砕し、３５ｍｇずつ分取した。４００μｌの吸着液
[４Ｍグアニジンチオシアン酸塩、０．１Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．５％Ｎ−ラウロイルサル
コシン酸ナトリウム] に、０．０５、０．１、０．５、
１．０Ｍ ２−メルカプトエタノールを混合し、破砕試
料に加え、よくホモジナイズした。２５Ｇ注射針を装着
したシリンジを１０回と押し、粘性を低下させた後、８
００μｌ緩衝液 [０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）、２００ｍＭ塩化リチウム、２０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ] を加えた。混合後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、
３分）し、上清をポリＡ+ＲＮＡの単離に用いた。
Ａの調製 マウスより心臓を摘出し、使用するまで液体窒素中で凍
結保存した。使用時に凍結された組織を粉末状になるま
で破砕し、３５ｍｇずつ分取した。４００μｌの吸着液
[４Ｍグアニジンチオシアン酸塩、０．１Ｍトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）、０．５％Ｎ−ラウロイルサル
コシン酸ナトリウム] に、０．０５、０．１、０．５、
１．０Ｍ ２−メルカプトエタノールを混合し、破砕試
料に加え、よくホモジナイズした。２５Ｇ注射針を装着
したシリンジを１０回と押し、粘性を低下させた後、８
００μｌ緩衝液 [０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）、２００ｍＭ塩化リチウム、２０ｍＭ ＥＤＴ
Ａ] を加えた。混合後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、
３分）し、上清をポリＡ+ＲＮＡの単離に用いた。
【００３４】新しいマイクロチューブに５ｍｇ／ｍｌに
調製したオリゴｄＴ固定化磁性粒子（Genovision製）を
２５０μｌ分取し、磁性スタンド（Magical Trapper；
東洋紡績製）に静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペ
ットで除去した。この磁性粒子に上記の上清を加え、ボ
ルテックスミキサーでよく懸濁した後、室温で１０分間
放置した。次に、このマイクロチューブを磁性スタンド
に静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペットで除去し
た。次に、１ｍｌ洗浄液 [１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０），５０ｍＭ塩化リチウム、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ] を加え、ボルテックスミキサーでよく懸濁し、磁
性スタンドに静置して、磁性粒子を回収し、上清をピペ
ットで除去した。この洗浄操作を３回繰り返し、上清を
完全に除去した。３０μｌのＲＮＡ分解酵素を含まない
水を加えて粒子を懸濁し、６５℃、２分間加熱し、再度
磁性スタンドに静置し、磁性粒子を集め、上清を回収し
た。混入ｒＲＮＡ、ゲノムＤＮＡを極力除くため、この
回収液に再度吸着液、２−メルカプトエタノールを加
え、上記一連の工程を繰り返し、３０μｌの水に溶出し
た。
調製したオリゴｄＴ固定化磁性粒子（Genovision製）を
２５０μｌ分取し、磁性スタンド（Magical Trapper；
東洋紡績製）に静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペ
ットで除去した。この磁性粒子に上記の上清を加え、ボ
ルテックスミキサーでよく懸濁した後、室温で１０分間
放置した。次に、このマイクロチューブを磁性スタンド
に静置し、磁性粒子を回収し、上清をピペットで除去し
た。次に、１ｍｌ洗浄液 [１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．０），５０ｍＭ塩化リチウム、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ] を加え、ボルテックスミキサーでよく懸濁し、磁
性スタンドに静置して、磁性粒子を回収し、上清をピペ
ットで除去した。この洗浄操作を３回繰り返し、上清を
完全に除去した。３０μｌのＲＮＡ分解酵素を含まない
水を加えて粒子を懸濁し、６５℃、２分間加熱し、再度
磁性スタンドに静置し、磁性粒子を集め、上清を回収し
た。混入ｒＲＮＡ、ゲノムＤＮＡを極力除くため、この
回収液に再度吸着液、２−メルカプトエタノールを加
え、上記一連の工程を繰り返し、３０μｌの水に溶出し
た。
【００３５】この方法において単離されたポリＡ+ＲＮ
Ａの回収量を吸光光度計で正確に測定した結果を表２に
示す。実施例１に比べて添加効果は大きくないが、２−
メルカプトエタノール濃度を０．５Ｍ、さらには１．０
Ｍに増加させることで回収量は向上した。また、実施例
１、２において至適濃度が異なるのは試料の性質の違い
によるものと思われる。
Ａの回収量を吸光光度計で正確に測定した結果を表２に
示す。実施例１に比べて添加効果は大きくないが、２−
メルカプトエタノール濃度を０．５Ｍ、さらには１．０
Ｍに増加させることで回収量は向上した。また、実施例
１、２において至適濃度が異なるのは試料の性質の違い
によるものと思われる。
【００３６】
【表２】
【００３７】
【発明の効果】上述したように、本発明により、様々な
生体材料から簡便にしかも効率的にポリＡ+ＲＮＡ等の
標的リボ核酸を単離することが可能となった。この方法
により得られたポリＡ+ＲＮＡ等のリボ核酸は、ノザン
ブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ解析、ｃＤＮＡライブラリ
ーの調製、ｃＤＮＡクローニングなどに利用することが
可能である。
生体材料から簡便にしかも効率的にポリＡ+ＲＮＡ等の
標的リボ核酸を単離することが可能となった。この方法
により得られたポリＡ+ＲＮＡ等のリボ核酸は、ノザン
ブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ解析、ｃＤＮＡライブラリ
ーの調製、ｃＤＮＡクローニングなどに利用することが
可能である。
【図１】本発明の方法により、マウス肺より単離された
ポリＡ+ＲＮＡの電気泳動解析の結果を示す。
ポリＡ+ＲＮＡの電気泳動解析の結果を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川上 文清 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 (72)発明者 川村 良久 福井県敦賀市東洋町10番24号 東洋紡績株 式会社敦賀バイオ研究所内 Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ10 QQ52 QR35 QR38 QR55 QR82 QS14 QS32
Claims (14)
- 【請求項１】 以下の工程〜を含んでなることを特
徴とするリボ核酸の単離方法。 リボ核酸を含有する試料、タンパク質変性剤、及び２
−メルカプトエタノールを０．２〜１．０Ｍの濃度にな
るように混合し、 リボ核酸を標的リボ核酸プローブ固定化担体に特異的
に吸着させ、 担体−標的リボ核酸複合体を液相より分離し、洗浄液
により該複合体を洗浄し、 標的リボ核酸を該複合体から溶出する - 【請求項２】 工程において、緩衝液を添加した後で
リボ核酸を標的リボ核酸プローブ固定化担体に特異的に
吸着せしめることを行う請求項１記載のリボ核酸の単離
方法。 - 【請求項３】 リボ核酸がポリＡ+ＲＮＡもしくはウイ
ルスＲＮＡである請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 担体に固定化された標的リボ核酸プロー
ブがオリゴｄＴもしくはウイルスＲＮＡ塩基配列に実質
的に相補的なオリゴヌクレオチドである請求項１又は２
に記載の方法。 - 【請求項５】 タンパク質変性剤がカオトロピック剤及
び／又は界面活性剤である請求項１又は２に記載の方
法。 - 【請求項６】 カオトロピック剤がグアニジニウム塩、
尿素、ヨウ化物及び（イソ）チオシアン酸塩からなる群
より選択される少なくとも１種である請求項５記載の方
法。 - 【請求項７】 界面活性剤がＮ−ラウロイルサルコシ
ン、ノニデットＰ−４０、ポリエチレングリコールモノ
−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノラウレート、ドデシル硫酸ナトリウ
ム及びアルキル硫酸アルカリ金属塩からなる群より選択
される少なくとも１種である請求項５記載の方法。 - 【請求項８】 緩衝液が２００ｍＭ以下の濃度のリチウ
ム塩またはナトリウム塩を含む溶液である請求項１又は
２に記載の方法。 - 【請求項９】 洗浄液が２５〜１００ｍＭのリチウム塩
またはナトリウム塩を含む溶液である請求項１又は２に
記載の方法。 - 【請求項１０】 タンパク質変性剤を含有する溶液、２
−メルカプトエタノール、標的リボ核酸プローブ固定化
担体、洗浄液及び溶出液を含むことを特徴とするリボ核
酸単離用試薬。 - 【請求項１１】 （ａ）グアニジニウム塩、尿素、ヨウ
化物及び（イソ）チオシアン酸塩からなる群より選択さ
れる１種又は２種以上の化合物、並びにＮ−ラウロイル
サルコシン、ノニデットＰ−４０、ポリエチレングリコ
ールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ポリオ
キシエチレンソルビタンモノラウレートからなる群より
選択される１種または２種以上の化合物を含有する溶解
液、（ｂ）２−メルカプトエタノール、（ｃ）緩衝液、
（ｄ）標的核酸プローブが固定化された担体、（ｅ）２
５〜１００ｍＭのリチウム塩またはナトリウム塩を含む
洗浄液、（ｆ）担体から標的リボ核酸を溶出する溶液を
含むことを特徴とするリボ核酸単離用試薬。 - 【請求項１２】 （ｃ）の緩衝液が２００ｍＭ以下の濃
度のリチウム塩もしくはナトリウム塩を含む緩衝液であ
る請求項１１記載のリボ核酸単離用試薬。 - 【請求項１３】 （ａ）グアニジニウム塩、尿素、ヨウ
化物及び（イソ）チオシアン酸塩からなる群より選択さ
れる１種又は２種以上のの化合物、並びにＮ−ラウロイ
ルサルコシン、ノニデットＰ−４０、ポリエチレングリ
コールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル、ポリ
オキシエチレンソルビタンモノラウレートからなる群よ
り選択される１種または２種以上のの化合物を含有する
溶解液、（ｂ）２−メルカプトエタノール、（ｃ）緩衝
液、（ｄ）オリゴｄＴが固定化された担体、（ｅ）２５
〜１００ｍＭのリチウム塩もしくはナトリウム塩を含む
洗浄液、（ｆ）担体からポリＡ+ＲＮＡを溶出する溶液
を含むことを特徴とするポリＡ+ＲＮＡ単離用試薬。 - 【請求項１４】 （ｃ）の緩衝液が２００ｍＭ以下の濃
度のリチウム塩もしくはナトリウム塩を含む緩衝液であ
る請求項１３記載のポリＡ+ＲＮＡ単離用試薬。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000116846A JP3922420B2 (ja) | 2000-04-18 | 2000-04-18 | 改良されたリボ核酸の単離方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP2000116846A JP3922420B2 (ja) | 2000-04-18 | 2000-04-18 | 改良されたリボ核酸の単離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001299341A true JP2001299341A (ja) | 2001-10-30 |
| JP3922420B2 JP3922420B2 (ja) | 2007-05-30 |
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|---|---|---|---|
| JP2000116846A Expired - Fee Related JP3922420B2 (ja) | 2000-04-18 | 2000-04-18 | 改良されたリボ核酸の単離方法 |
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|---|---|
| JP (1) | JP3922420B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006523463A (ja) * | 2003-04-16 | 2006-10-19 | ジェントラ システムズ インコーポレイテッド | 固体支持体を使用してｒｎａを精製するための、組成物および方法 |
| JP2010193814A (ja) * | 2009-02-26 | 2010-09-09 | Marcom:Kk | 核酸抽出用試薬、核酸抽出用試薬キットおよび核酸抽出方法 |
| JP2010268790A (ja) * | 2009-04-23 | 2010-12-02 | Jsr Corp | ウイルスの検出方法およびウイルス核酸を遊離させるための組成物 |
-
2000
- 2000-04-18 JP JP2000116846A patent/JP3922420B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP2010263919A (ja) * | 2003-04-16 | 2010-11-25 | Qiagen North American Holdings Inc | 固体支持体を使用してｒｎａを精製するための、組成物および方法 |
| JP2010193814A (ja) * | 2009-02-26 | 2010-09-09 | Marcom:Kk | 核酸抽出用試薬、核酸抽出用試薬キットおよび核酸抽出方法 |
| JP2010268790A (ja) * | 2009-04-23 | 2010-12-02 | Jsr Corp | ウイルスの検出方法およびウイルス核酸を遊離させるための組成物 |
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| JP3922420B2 (ja) | 2007-05-30 |
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