CN117089598B - 一种尿液免提取直接亚硫酸盐转化的甲基化检测样本前处理试剂盒及应用 - Google Patents
一种尿液免提取直接亚硫酸盐转化的甲基化检测样本前处理试剂盒及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明开发了一种尿液免提取直接亚硫酸盐转化的甲基化检测样本前处理试剂盒及应用。通过采用特别的尿液保存液，该保存液能够在常温下有效保存尿液中的核酸，经该保存液保存的尿液无需进行离心操作富集脱落细胞，可直接通过加入磁珠富集尿液中的核酸物质，所得核酸直接进行亚硫酸盐转化。该方案既有效解决了常温运输和保存尿液样本的问题，同时省去了尿液样本离心处理过程和核酸提取纯化过程，直接进行亚硫酸盐转化后即可应用于下游qPCR或测序反应。从收到样本到亚硫酸盐转化完成，整个过程耗时小于2小时，真正实现了快速甲基化检测样本的制备。同时免提取方案也极大地降低了甲基化检测成本。
Description
技术领域
本发明属于生物样本保存及甲基化检测前处理领域，尤其涉及一种针对尿液样本保存及免提取直接亚硫酸盐转化的试剂盒及其应用。
背景技术
近年来，相较于组织活检，液体活检在肿瘤基因检测中的优势已经得到广泛认可。由于泌尿系统中的细胞(包括泌尿系统肿瘤细胞)会脱落至尿液中，因此尿液样本在治疗和监测泌尿系统肿瘤中有重要的意义。早在2016年ASCO会议就已报道了一项研究结果：以组织作为参照，血浆检测T790M突变与组织T790M的阳性一致率为81.5％，尿液检测的T790M突变与组织检测的阳性一致率为83.8％。预示“液体活检”样本或可迈入更加无创方便的“尿液”。尿液作为一种比外周血更易得的样本，其无创取样的优势受到越来越多研究者和临床人士的关注。
但由于尿液样本不易保存及成分多样的复杂性，样本中各种体内代谢物的相互作用，对样本的保存提出了更高的要求：尿液中核酸酶含量非常高，DNA很容易被降解；
尿液样本中含有大量病原微生物，容易滋生细菌，产生污染，进而影响检测结果准确性；因此如何定量采集、防止细菌在体外滋生和有效保存尿液样本，以保证后续精准检测是关键点之一。
DNA甲基化是表观遗传调控基因表达的关键形式之一，抑癌基因高度甲基化是多种肿瘤发生的早期事件，这些异常的DNA甲基化在肿瘤发生早期即可被检测到。大量研究显示，尿液中的DNA甲基化是诊断膀胱癌的有效标志物。DNA甲基化标志物被广泛应用于恶性肿瘤的诊断和预后评估。
然而常规DNA甲基化水平检测分为三步，第一步是对样本进行DNA提取，包括样本裂解、结合、洗涤和洗脱等步骤；第二步是使用亚硫酸氢盐对DNA进行处理，包括亚硫酸氢盐转化反应、结合、脱磺、洗涤和洗脱等步骤；第三步是DNA甲基化位点的检测。存在步骤多、过程繁琐、DNA损耗大和时间长等缺点。
CN112143778A公开了一种血浆游离DNA提取与转化合并的方法及其应用，仍需要额外的裂解时间和较长时间高温易引起DNA片段化，所述实施例1中亚硫酸氢钠在转化混合液中的摩尔浓度为7M，该浓度亚硫酸氢钠在常温下不能完全溶解有晶体析出，市面上很多同类型产品就是如此，每次使用前需要高温溶解，溶解不彻底会影响转化性能。而常规低浓度亚硫酸氢钠的转化效率又不能满足转化效率需求。而且，该专利将提取和转化合并时反应液总体积875μL-3500μL(500μL/1mL/2mL血浆加入150μL/300μL/600μL裂解缓冲液和50μL/100μL/200μL蛋白酶K，60℃加热15min后加入175μL/350μL/700μL转化混合液，上PCR仪进行反应)，普通PCR仪孔槽无法满足要求，金属浴常规1.5ml/2.0ml孔槽也无法满足2ml血浆样本量反应需求，使得反应仪器的要求受限。另外除血浆外其他类型样本适用情况未知。
CN116004767A公开了一种免核酸提取的DNA甲基化检测样本制备方法及其应用，对尿液细胞、宫颈细胞、针吸细胞、胸腹水细胞样本进行了测试，但该方案需要通过高速离心步骤进行样本前处理，对仪器设备的需求较高，同时离心操作也增加了检测时长。
另外，该专利采用吸附柱进行核酸的富集回收，不利于自动化方案转化；实验数据仅展示了PCR扩增的结果，没有测序数据展示具体的转化效率和比对率，无法准确评估该方案的转化性能。
CN111269963A公开了一步法核酸提取转化试剂盒及其使用方法，将核酸提取和转化过程合二为一，省去了原核酸提取过程中的纯化过程，并结合简便的磁珠法对转化DNA进行纯化，以节省时间和材料，但该方法主要适用于小体积细胞样本，对于大体积尿液或血浆样本是否适用情况未知。实验数据仅展示了PCR扩增的结果，没有测序数据展示具体的转化效率和比对率，无法准确评估该方案的转化性能。
CN107868813A公开了一种血浆DNA边提取边转化的方法及应用，该方法在血浆被裂解处理后加入亚硫酸氢钠粉末进行转化，亚硫酸氢钠粉末溶解需要一定时间并非遇水即溶解，这种加入粉末的方式不利于实验室大规模流程化检测的便利性。实验数据仅展示了PCR扩增的结果，没有测序数据展示具体的转化效率和比对率，无法准确评估该方案的转化性能。
综上所列举专利，目前针对亚硫酸盐转化法用于甲基化检测样本制备的产品还存在如下缺陷：1.常规采用先提取再亚硫酸盐转化的方式，流程繁琐负责，总时长在3-5小时左右。2.有专利提供了免提取进行转化的方案，但样本类型仅限于小体积细胞样本，对于大体积尿液或者血浆样本的情况未知。3.有专利提供了较大体积2ml血浆样本类型边提取边转化的方案，但反应总体积大，不适用于常规PCR仪或金属浴反应。4.大部分的方法在检测性能时均只采用的PCR扩增的方式，没有进行测序评估具体的转化率和比对率，无法准确评估该方案的转化性能。因此，需要找到适用于尿液等大体积样本快速高效地进行亚硫酸盐转化的方案，以推进液体活检在肿瘤基因检测中的应用，尤其是尿液样本在肿瘤基因检测中的应用。
发明内容
基因甲基化作为调控遗传信息表达与否的重要机制，在肿瘤的发生、发展过程中有着与基因变异同等甚至更大的作用。检测基因甲基化水平的方法很多，最常见的是基于亚硫酸盐转化法的检测技术。现有亚硫酸盐转化产品主要是通过一种高盐高温的方式对提取后的核酸进行转化，该流程操作复杂耗时长；有些产品可以实现免提取转化，但仅限小体积的细胞样本，对于尿液大体积样本的直接转化产品暂未见于市面上。
基于上述现有技术存在的问题，本发明开发了一种针对尿液样本免提取直接转化的方案，通过采用特别的尿液保存液，该保存液能够在常温下有效保存尿液中的核酸，经该保存液保存的尿液无需进行离心操作富集脱落细胞，可直接通过加入磁珠富集尿液中的核酸物质，所得核酸直接进行亚硫酸盐转化。该方案既有效解决了常温运输和保存尿液样本的问题，同时省去了尿液样本离心处理过程和核酸提取纯化过程，直接进行亚硫酸盐转化后即可应用于下游qPCR或测序反应。处理后的核酸损伤程度小，极大降低了常规重盐转化过程对核酸的影响。从收到样本到亚硫酸盐转化完成，整个过程耗时小于2小时，真正实现了快速甲基化检测样本的制备。同时免提取方案也极大地降低了甲基化检测成本。
本发明的首要目的在于提供一种尿液免提取直接亚硫酸盐转化的甲基化检测样本前处理试剂盒，
包括如下试剂：尿液保存液、核酸富集磁珠、亚硫酸盐转化试剂；
所述的尿液保存液包括以下组分：离液盐、化学表面活性剂、生物表面活性剂、核酸酶抑制剂、还原剂、核酸助沉剂、低级醇、pH缓冲液，溶剂为无核酸酶的水；
其中离液盐包括如下组分中的一种或多种：硫脲、盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素、高氯酸钠、高氯酸锂，浓度为2-6M；
化学表面活性剂包括如下组分中的一种或多种：Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、Brij35、3-[(3-氯代丙基)二甲基-铵]-1-丙烷磺酸盐、N,N-二甲基十二烷胺-N-氧化物、十二烷基硫酸锂、十二烷基二甲基(3-磺丙基)氢氧化铵内盐、N-月桂酰肌氨酸钠盐、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、3-((4-庚基)苯基-3-羟丙基)二甲基铵丙烷磺酸盐，含量1％-10％；
生物表面活性剂包括如下组分中的一种或多种：枯草菌脂肽钠、鼠李糖脂、槐糖脂，含量0.1mM-10mM/L；
核酸酶抑制剂包括如下组分中的任一种：7.5mM-75mM EDTA、7.5mM-75mM EGTA、0.75-15mM ATA、75mM-300mM甘油醛、1.5mg/ml-7.5mg/ml NaF；
还原剂包括如下组分中的任一种：30mM-300mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐、3％-15％β-巯基乙醇、75-600mM DTT；
核酸助沉剂包括如下组分中的一种或多种：5％-25％PEG6000、1-5M LiCl、10-20μg/mL线性化丙烯酰胺；
低级醇包括乙醇或异丙醇，含量15％-40％；
pH缓冲液包括如下组分中的任一种：0.1M-0.3M pH 5.4-6.8的NaAc-HAc缓冲液、0.15M-0.3M pH 5.4-6.8的Tris-HCl缓冲液；
核酸富集磁珠包括羟基磁珠、羧基磁珠；
所述的亚硫酸盐转化试剂，包括以下组分：转化液、保护液、结合液、转化后纯化磁珠、洗涤液、脱磺化液、洗脱液；
其中转化液包括4-5M亚硫酸盐，氢氧化钠调剂pH值至4.0-5.5,包括以下一种或几种：亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠，优选亚硫酸氢钠；
保护液包括如下组分中的任一种：2.5mM-10mM对苯二酚、5mM-50mM丙酮肟、5mM-50mM对苯二胺、50％-90％乙二醇二甲醚、250mM-1M奎诺二甲基丙烯酸酯；
结合液包括如下组分：浓度为1-4M的盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素、高氯酸钠中的至少一种；浓度为1％-10％的Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、Brij35中的至少一种；含量20％-40％的异丙醇和无水乙醇中的至少一种；2.5％-5％PEG6000和1-5M LiCl中的至少一种；0.1M-0.2M pH6.6的NaAc-HAc缓冲液和pH 6.6的0.1M-0.2M Tris-HCl缓冲液中的至少一种；5mM-50mM EDTA；
转化后纯化磁珠是多分散硅羟基磁珠，粒径为300-500nm；合成方法：首先通过共沉淀法合成出磁性四氧化三铁，然后以四氧化三铁作为磁核，表面进行硅基化修饰处理后得到；
洗涤液包括如下组分：含量70％-80％乙醇、10mM-100mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液、50-200mM氯化钠；
脱磺化液包括如下组分：含量50-80％乙醇、0.28-0.32M NaOH、0.5％-5％PEG6000、0.05-0.5M NaCl、浓度为0.5％-2％的Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、Brij35中的一种或多种，0.5％-2％的N-月桂酰肌氨酸钠盐；
洗脱液为10mM的pH 8.0的Tris-HCl和0.1mM pH 8.0的EDTA。
尿液保存液中离液盐优选多种离液盐的组合，优选浓度4-6M，进一步优选5-6M；化学表面活性剂优选Triton X-100，浓度优选5％-8％，进一步优选5％-7％；生物表面活性剂优选枯草菌脂肽钠，含量优选1mM-5mM/L，进一步优选2-4mM/L；核酸酶抑制剂优选EDTA，浓度优选10mM-50mM EDTA，进一步优选10mM-20mM；还原剂优选三(2-羧乙基)膦盐酸盐，浓度优选100mM-300mM，进一步优选200mM-300mM；核酸助沉剂优选PEG6000，浓度优选5％-20％，进一步优选10％-15％；低级醇优选异丙醇，浓度优选15％-30％，进一步优选20％-30％；pH缓冲液优选NaAc-HAc缓冲液，浓度优选0.10M-0.20M，进一步优选0.10M-0.15M。
尿液保存液进一步优选：4-4.2M异硫氰酸胍、1.8-2.0M硫脲、4.8-5.2％Triton X-100、1.8-2.2mM/L枯草菌脂肽钠、28-32％的异丙醇、10-15％PEG6000、0.1-0.12M NaAc-HAc缓冲液(pH6.6)、8-12mM EDTA、240-260mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
最优选：4M异硫氰酸胍、2M硫脲、5％Triton X-100、2mM/L枯草菌脂肽钠、30％的异丙醇、12％PEG6000、0.1M NaAc-HAc缓冲液(pH6.6)、10mM EDTA、250mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
核酸富集磁珠优选羟基磁珠。
亚硫酸盐转化试剂中的转化液优选亚硫酸氢钠，浓度优选4.5-5M,进一步优选5M；保护液优选对苯二酚，浓度优选5mM-10mM，进一步优选5-7.5mM；结合液中盐离子优选盐酸胍，浓度优选2-4M，进一步优选2.5-3M；结合液中的表面活性剂优选Tween 20，浓度优选1％-5％，进一步优选1％-2％；结合液中的醇优选无水乙醇，含量优选20％-30％，进一步优选20％-25％；结合液中的助沉剂优选PEG6000，含量优选2.5％-4％PEG6000，进一步优选2.5％-3％；结合液中的缓冲液优选pH5.4-6.6的NaAc-HAc缓冲液，浓度优选0.15M-0.2M；结合液中的EDTA优选浓度10mM-40mM，进一步优选10-20mM；
亚硫酸盐转化试剂中洗涤液的组分乙醇含量优选75％-80％；pH 7.5Tris-HCl缓冲液优选10mM-50mM，进一步优选10mM-20mM；氯化钠优选100-200mM,进一步优选100-150mM。
亚硫酸盐转化试剂中脱磺化液的组分乙醇含量优选60-75％，进一步优选60-70％；NaOH优选0.3M；PEG6000优选0.5％-2％，进一步优选1％-2％；NaCl优选0.1M-0.4M，进一步优选0.1-0.2M、非离子表面活性剂优选Tween 20，浓度优选0.5％-1％；阴离子表面活性剂N-月桂酰肌氨酸钠盐优选浓度0.5％-1％。
进一步优选：转化液包含4.8-5M亚硫酸氢钠，NaOH调节PH至4.8-5.2；保护液包含4.8-5.2mM对苯二酚；结合液包含浓度为2.8-3.2M盐酸胍、1.8-2.2％Tween 20、23-27％无水乙醇、2.8-3.2％PEG6000、0.18-1.22M pH6.6的NaAc-HAc缓冲液、8-12mM EDTA；转化后纯化磁珠为45-55mg/ml的多分散硅羟基磁珠，粒径300-500nm；洗涤液包含78-80％乙醇、18-22mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液、145-155mM氯化钠；脱磺化液包含55-65％乙醇、0.28-0.32M NaOH、0.8-1.2％PEG6000、0.18-0.22M NaCl、0.5-0.8％Tween 20、0.8-1.2％N-月桂酰肌氨酸钠盐。洗脱液为10mM的pH 8.0的Tris-HCl、0.1mM pH 8.0的EDTA。
最优选：转化液包含5M亚硫酸氢钠，NaOH调节PH至5.0；保护液包含5mM对苯二酚；结合液包含浓度为3M盐酸胍、2％Tween 20、25％无水乙醇、3％PEG6000、0.2M pH6.6的NaAc-HAc缓冲液、10mM EDTA；转化后纯化磁珠为50mg/ml的多分散硅羟基磁珠，粒径300-500nm；洗涤液包含80％乙醇、20mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液、150mM氯化钠；脱磺化液包含60％乙醇、0.3M NaOH、1％PEG6000、0.2M NaCl、0.5％Tween 20、1％N-月桂酰肌氨酸钠盐。洗脱液为10mM的pH 8.0的Tris-HCl、0.1mM pH 8.0的EDTA。
本发明的目的之二是提供所述的试剂盒在非诊断目的的检测尿液样本DNA甲基化的应用。
所述的应用，包括如下步骤：
1)将尿液加入保存液中，再加入用于核酸富集的磁珠，充分振荡混匀，静置后磁力吸附，弃上清，晾干后加入无核酸酶水溶解，磁力吸附后吸取含有核酸的上清液用于亚硫酸盐转化；
2)取步骤1)得到的核酸溶液，加入转化液和保护液，置于PCR仪中进行反应，
3)步骤2)得到的产物加入结合液和多分散硅羟基磁珠，振荡混匀，瞬时离心，磁力吸附，吸弃上清；
4)加入洗涤液，振荡混匀后，瞬时离心，磁力吸附，吸弃上清；
5)加入脱磺化液，常温、震荡混匀，短暂离心，磁力吸附后，去除废液；
6)加入洗涤液漂洗，短暂离心，磁力吸附后吸弃废液；重复漂洗，充分晾干；
7)加入洗脱液，充分混匀磁珠，56℃震荡混匀，短暂离心，磁力吸附后，将洗脱液转移在-15℃以下保存备用，或者直接进行甲基化检测。
进一步地，包括如下步骤：
1)按12ml尿液：8ml保存液比例混合，在常温保存3天后的尿液样本中加入20μL用于核酸富集的磁珠，充分振荡混匀，静置5min后上磁力吸附5min，小心弃上清，晾干5min后加入45μL无核酸酶水溶解2min，磁力吸附2min后小心吸取含有核酸的上清液40μL用于后续亚硫酸盐转化；
2)取40μL上述核酸溶液，加入90μL转化液和10μL保护液，置于PCR仪中进行反应，反应程序如下：95℃ 5min,58℃,50min，反应结束后瞬离5s，将全部液体转移至一新1.5ml离心管；
3)加入300μL结合液和20μL磁珠，振荡混匀5min，瞬时离心5s，磁力吸附3min，小心吸弃上清；
4)加入1000μL洗涤液，振荡混匀数秒后，瞬时离心5s，磁力吸附2min，小心吸弃上清；
5)加入200μL脱磺化液，在恒温混匀仪上常温、1700rpm震荡混匀15-20min，短暂离心，磁力吸附30s后，去除废液；
6)加入1000μL洗涤液漂洗1次，短暂离心，磁力吸附30s后吸弃废液；重复漂洗一次，充分晾干5-10min；
7)加入30-50μL洗脱液，充分混匀磁珠，在恒温混匀仪上56℃1700rpm震荡10min，短暂离心，磁力吸附30s后，将洗脱液转移到新的离心管中，-15℃以下保存备用，或者直接进行甲基化检测。
本发明的目的之三是提供一种尿液保存液。
所述的尿液保存液包括以下组分：离液盐、化学表面活性剂、生物表面活性剂、核酸酶抑制剂、还原剂、核酸助沉剂、低级醇、pH缓冲液，溶剂为无核酸酶的水；
其中离液盐包括如下组分中的一种或多种：硫脲、盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素、高氯酸钠、高氯酸锂，浓度为2-6M；
化学表面活性剂包括如下组分中的一种或多种：Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、Brij35、3-[(3-氯代丙基)二甲基-铵]-1-丙烷磺酸盐、N,N-二甲基十二烷胺-N-氧化物、十二烷基硫酸锂、十二烷基二甲基(3-磺丙基)氢氧化铵内盐、N-月桂酰肌氨酸钠盐、N-癸酰基-N-甲基葡糖胺、3-((4-庚基)苯基-3-羟丙基)二甲基铵丙烷磺酸盐，含量1％-10％；
生物表面活性剂包括如下组分中的一种或多种：枯草菌脂肽钠、鼠李糖脂、槐糖脂，含量0.1mM-10mM/L；
核酸酶抑制剂包括如下组分中的任一种：7.5mM-75mM EDTA、7.5mM-75mM EGTA、0.75-15mM ATA、75mM-300mM甘油醛、1.5mg/ml-7.5mg/ml NaF；
还原剂包括如下组分中的任一种：30mM-300mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐、3％-15％β-巯基乙醇、75-600mM DTT；
核酸助沉剂包括如下组分中的一种或多种：5％-25％PEG6000、1-5M LiCl、10-20μg/mL线性化丙烯酰胺；
低级醇包括乙醇或异丙醇，含量15％-40％；
pH缓冲液包括如下组分中的任一种：0.1M-0.3M pH 5.4-6.8的NaAc-HAc缓冲液、0.15M-0.3M pH 5.4-6.8的Tris-HCl缓冲液。
尿液保存液中离液盐优选多种离液盐的组合，优选浓度4-6M，进一步优选5-6M；化学表面活性剂优选Triton X-100，浓度优选5％-8％，进一步优选5％-7％；生物表面活性剂优选枯草菌脂肽钠，含量优选1mM-5mM/L，进一步优选2-4mM/L；核酸酶抑制剂优选EDTA，浓度优选10mM-50mM EDTA，进一步优选10mM-20mM；还原剂优选三(2-羧乙基)膦盐酸盐，浓度优选100mM-300mM，进一步优选200mM-300mM；核酸助沉剂优选PEG6000，浓度优选5％-20％，进一步优选10％-15％；低级醇优选异丙醇，浓度优选15％-30％，进一步优选20％-30％；pH缓冲液优选NaAc-HAc缓冲液，浓度优选0.10M-0.20M，进一步优选0.10M-0.15M。
尿液保存液进一步优选：4-4.2M异硫氰酸胍、1.8-2.0M硫脲、4.8-5.2％Triton X-100、1.8-2.2mM/L枯草菌脂肽钠、28-32％的异丙醇、10％-15％PEG6000、0.1-0.12M NaAc-HAc缓冲液(pH6.6)、8-12mM EDTA、240-260mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
最优选：4M异硫氰酸胍、2M硫脲、5％Triton X-100、2mM/L枯草菌脂肽钠、30％的异丙醇、12％PEG6000、0.1M NaAc-HAc缓冲液(pH6.6)、10mM EDTA、250mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
本发明的目的之四是提供一种亚硫酸盐转化试剂。
所述的亚硫酸盐转化试剂，包括以下组分：转化液、保护液、结合液、转化后纯化磁珠、洗涤液、脱磺化液、洗脱液；
其中转化液包括4-5M亚硫酸盐，氢氧化钠调剂pH值至4.0-5.5,包括以下一种或几种：亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠，优选亚硫酸氢钠；
保护液包括如下组分中的任一种：2.5mM-10mM对苯二酚、5mM-50mM丙酮肟、5mM-50mM对苯二胺、50％-90％乙二醇二甲醚、250mM-1M奎诺二甲基丙烯酸酯；
结合液包括如下组分：浓度为1-4M的盐酸胍、异硫氰酸胍、尿素、高氯酸钠中的至少一种；浓度为1％-10％的Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、Brij35中的至少一种；含量20％-40％的异丙醇和无水乙醇中的至少一种；2.5％-5％PEG6000和1-5M LiCl中的至少一种；0.1M-0.2M pH6.6的NaAc-HAc缓冲液和pH 6.6的0.1M-0.2M Tris-HCl缓冲液中的至少一种；5mM-50mM EDTA；
转化后纯化磁珠是多分散硅羟基磁珠，粒径为300-500nm；合成方法：首先通过共沉淀法合成出磁性四氧化三铁，然后以四氧化三铁作为磁核，表面进行硅基化修饰处理后得到；
洗涤液包括如下组分：含量70％-80％乙醇、10mM-100mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液、50-200mM氯化钠；
脱磺化液包括如下组分：含量50-80％乙醇、0.28-0.32M NaOH、0.5％-5％PEG6000、0.05-0.5M NaCl、浓度为0.5％-2％的Tween 20、Triton X-100、Nonidet P40、Brij35中的一种或多种，0.5％-2％的N-月桂酰肌氨酸钠盐。
洗脱液为10mM的pH 8.0的Tris-HCl和0.1mM pH 8.0的EDTA。
亚硫酸盐转化试剂中的转化液优选亚硫酸氢钠，浓度优选4.5-5M,进一步优选5M；保护液优选对苯二酚，浓度优选5mM-10mM，进一步优选5-7.5mM；结合液中盐离子优选盐酸胍，浓度优选2-4M，进一步优选2.5-3M；结合液中的表面活性剂优选Tween 20，浓度优选1％-5％，进一步优选1％-2％；结合液中的醇优选无水乙醇，含量优选20％-30％，进一步优选20％-25％；结合液中的助沉剂优选PEG6000，含量优选2.5％-4％PEG6000，进一步优选2.5％-3％；结合液中的缓冲液优选pH5.4-6.6的NaAc-HAc缓冲液，浓度优选0.15M-0.2M；结合液中的EDTA优选浓度10mM-40mM，进一步优选10-20mM；
亚硫酸盐转化试剂中洗涤液的组分乙醇含量优选75％-80％；pH 7.5Tris-HCl缓冲液优选10mM-50mM，进一步优选10mM-20mM；氯化钠优选100-200mM,进一步优选100-150mM。
亚硫酸盐转化试剂中脱磺化液的组分乙醇含量优选60-75％，进一步优选60-70％；NaOH优选0.3M；PEG6000优选0.5％-2％，进一步优选1％-2％；NaCl优选0.1M-0.4M，进一步优选0.1-0.2M、非离子表面活性剂优选Tween 20，浓度优选0.5％-1％；阴离子表面活性剂N-月桂酰肌氨酸钠盐优选浓度0.5％-1％。
进一步优选：转化液包含4.8-5M亚硫酸氢钠，NaOH调节PH至4.8-5.2；保护液包含4.8-5.2mM对苯二酚；结合液包含浓度为2.8-3.2M盐酸胍、1.8-2.2％Tween 20、23-27％无水乙醇、2.8-3.2％PEG6000、0.18-1.22M pH6.6的NaAc-HAc缓冲液、8-12mM EDTA；转化后纯化磁珠为45-55mg/ml的多分散硅羟基磁珠，粒径300-500nm；洗涤液包含78-80％乙醇、18-22mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液、145-155mM氯化钠；脱磺化液包含55-65％乙醇、0.28-0.32M NaOH、0.8-1.2％PEG6000、0.18-0.22M NaCl、0.5-0.8％Tween 20、0.8-1.2％N-月桂酰肌氨酸钠盐。洗脱液为10mM的pH 8.0的Tris-HCl、0.1mM pH 8.0的EDTA。
最优选：转化液包含5M亚硫酸氢钠，NaOH调节PH至5.0；保护液包含5mM对苯二酚；结合液包含浓度为3M盐酸胍、2％Tween 20、25％无水乙醇、3％PEG6000、0.2M pH6.6的NaAc-HAc缓冲液、10mM EDTA；转化后纯化磁珠为50mg/ml的多分散硅羟基磁珠，粒径300-500nm；洗涤液包含80％乙醇、20mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液、150mM氯化钠；脱磺化液包含60％乙醇、0.3M NaOH、1％PEG6000、0.2M NaCl、0.5％Tween 20、1％N-月桂酰肌氨酸钠盐。洗脱液为10mM的pH 8.0的Tris-HCl、0.1mM pH 8.0的EDTA。
本发明有益效果：
1、采用特别的尿液保存液能够实现对样本常温保存和运输，便于临床应用推广。
2、经本发明开发的特别的保存液保存的尿液样本(包括血尿样本等复杂尿液样本)无需进行核酸提取与纯化，只需要几分钟的磁珠富集就可直接进行后续亚硫酸盐转化，减少了常规尿液样本离心前处理步骤和核酸提取纯化步骤。本发明的保存液的裂解能力经过与市面上较多提取试剂的裂解液组分进行对比，表现出更优越的裂解能力。常规的提取试剂中样本与裂解液的比例为1:2-1:4，较大的稀释了尿液样本浓度，本发明采用样本与裂解液为3:2的比例，有效保存和裂解尿液或血尿样本，同时降低了尿液被稀释的比例，减少了采尿管的使用数量。
3、亚硫酸盐转化试剂可常温储存，使用前无需加热溶解，转化及纯化全流程1.5小时内完成，操作简单耗时短。
4、采用磁珠法回收转化后核酸，流程短，操作简单，未来能够适用于仪器自动化操作，极大提高了临床应用范围。
5、经本发明处理的核酸片段完整性好，极大降低了重亚硫酸盐转化对DNA的影响。
6、本发明在开发过程中发现，常规的脱磺化试剂组分主要包含NaOH和乙醇。硅羟基磁珠表面修饰大量的硅烷醇基团(羟基)，硅羟基在一定条件下具有电负性，当磁珠的保存环境遭受到破坏后(NaOH的钠离子中和了胶体粒子所带的的电荷)，磁珠就会聚集成较大颗粒，从而形成沉淀从分散剂里析出，导致核酸脱磺化效率降低。本发明通过加入适当浓度的两性离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、聚乙二醇等物质，能够改善磁珠聚集的现象，提高该步骤的核酸脱磺化效率。
7、本发明采用大量临床尿液样本进行测试验证，包括复杂度高的血尿样本。通过甲基化特异性qPCR检测和NGS测序验证等多角度评估了该方法的转化性能。
附图说明
图1：不同裂解液保存尿液样本经磁珠富集上磁力架时的吸附现象；
图2：不同裂解液保存尿液样本经磁珠富集后无核酸酶水洗脱吸取上清液时磁珠吸附性强弱对比；
图3：不同裂解液保存尿液样本经磁珠富集后无核酸酶水洗脱所的核酸溶液；
图4：转化后纯化磁珠在不同脱磺化试剂中的分散性；
图5：三种不同亚硫酸盐转化试剂盒处理后的核酸电泳图。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1：尿液保存液保存效果测试
本实施例设置6组，分组如下表1：
表1
实施例1：4组保存液配方：4M异硫氰酸胍、2M硫脲、5％Triton X-100、2mM/L枯草菌脂肽钠、30％的异丙醇、12％PEG6000、0.1M NaAc-HAc缓冲液(pH6.6)、10mM EDTA、250mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐。
所用提取试剂为商品化试剂盒，济凡生物，M117-02,FineMag大体积磁珠法尿液游离DNA提取试剂盒。
所得核酸用酶标仪进行浓度及纯度测定，采用针对人ACTB基因上设计的引物探针进行qPCR检测。检测结果如下表2：
表2
表3
经保存液常温或-20℃保存15天的尿液样本，提取的核酸浓度与0天立即提取的核酸浓度无明显差异，而未加保存液的纯尿常温放置15天后提取的核酸浓度虽然高，但主要是微生物核酸(用微生物16s rRNA引物扩增验证)；人源ACTB的ct值结果显示加保存液组的样本在不同保存温度条件下的保存效果均良好，与0天纯尿组无显著差异，而15天纯尿组的人源核酸量显著减少。
实施例2：不同裂解液裂解尿液样本效果对比测试
本实施例设置6组，分组如下表4：
表4
/>
1)采尿后，按每1ml尿液加入20ul全血制备成模拟血尿样本，各组按上表加入保存液，颠倒混匀5-8次，然后常温放置1小时；
2)分别加入20μL羟基磁珠富集核酸，振荡混匀5min后上磁力架吸附5min，小心吸弃上清液，保留下层约1-1.5ml溶液连同磁珠一起转移至1.5ml离心管，然后将1.5ml离心管放置于磁力架上，此时可观察到不同裂解液处理后的磁珠富集现象差异，裂解能力差的磁珠表面有很多血块，同时上清液中会有磁珠残留；本发明的保存液裂解效果较好，磁珠迅速吸附到靠磁棒一侧的管壁上，磁珠干净无血块，上清液中未见磁珠分散悬浮。如图1示：
3)小心弃上清，晾干5min后加入45μL无核酸酶水溶解2min，上磁力架吸附2min，小心吸取上清液40μL即为所富集核酸。此步骤可观察到不同裂解液处理后的现象差异，裂解能力差的在该步骤磁珠表面有血块，导致磁珠无法集中吸附到管壁上，容易在吸取上清时随上清一起吸走磁珠，如图2示，而且吸取到的上清液出现棕褐色，如图3示：
本发明的保存液(第1组)所得核酸上清液清澈透明，效果最好。
核酸浓度检测结果如下表5：
表5
| 组号 | 组别 | 模拟血尿 | 保存液 | Qubit检测浓度(ng/μL) |
| 1 | 保存液组 | 12ml | 8ml | 46.6 |
| 2 | 裂解液1 | 12ml | 8ml | 22.0 |
| 3 | 裂解液2 | 12ml | 8ml | 2.5 |
| 4 | 裂解液3 | 12ml | 8ml | 2.2 |
| 5 | 裂解液4 | 12ml | 8ml | 35.6 |
| 6 | 裂解液5 | 12ml | 8ml | 32.2 |
| 7 | 裂解液6 | 12ml | 8ml | 32.8 |
| 8 | 裂解液7 | 12ml | 8ml | 18.0 |
本发明的保存液(第1组)所得核酸浓度最高。
实施例3：尿液免提取直接亚硫酸盐转化测试
本实施例样本为按12ml尿液：8ml保存液比例常温保存3天后的尿液样本。设置3组，第1组为尿液提取核酸后接商品试剂盒亚硫酸盐转化方案，第2组为尿液提取核酸后接本发明所述自研亚硫酸盐转化方案，第3组为尿液免提取直接进行本发明所述自研亚硫酸盐转化方案。自研亚硫酸盐转化方法中的试剂包括转化液、保护液、结合液、转化后纯化磁珠、洗涤液、脱磺化液、洗脱液，具体配方如下述：转化液包含5M亚硫酸氢钠，NaOH调节pH至5.0；保护液包含5mM对苯二酚；结合液包含浓度为3M盐酸胍、2％Tween 20、25％无水乙醇、3％PEG6000、0.2M pH6.6的NaAc-HAc缓冲液、10mM EDTA；转化后纯化磁珠为50mg/ml的多分散硅羟基磁珠，粒径300-500nm；洗涤液包含80％乙醇、20mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液、150mM氯化钠；脱磺化液包含60％乙醇、0.3M NaOH、1％PEG6000、0.2M NaCl、0.5％Tween20、1％N-月桂酰肌氨酸钠盐。洗脱液为10mM的pH 8.0的Tris-HCl、0.1mM pH 8.0的EDTA。
第1组尿液提取核酸采用的商品化试剂盒，济凡生物，M117-02,FineMag大体积磁珠法尿液游离DNA提取试剂盒；转化试剂采用的Zymo Research，D5031。
第2组提取核酸采用的商品化试剂盒，济凡生物，M117-02,FineMag大体积磁珠法尿液游离DNA提取试剂盒，提取核酸后采用本发明所述自研亚硫酸盐转化方法进行转化处理，如下详述：
取40μL提取后的核酸，加入90μL转化液和10μL保护液，置于PCR仪中进行反应，反应程序如下：95℃ 5min,58℃,50min，反应结束后瞬离5s，将全部液体转移至一新1.5ml离心管。
加入300μL结合液和20μL转化后纯化磁珠，振荡混匀5min，瞬时离心5s，上磁力架吸附3min，小心吸弃上清。
加入1000μL洗涤液，振荡混匀数秒后，瞬时离心5s，上磁力架吸附2min，小心吸弃上清。
加入200μL脱磺化液，在恒温混匀仪上常温、1700rpm震荡混匀15-20min，短暂离心，磁力架上30s后，去除废液。
加入1000μL洗涤液漂洗1次，短暂离心，磁力架上30s后吸弃废液。重复漂洗一次。充分晾干5-10min。
加入30-50μL洗脱液，充分混匀磁珠，在恒温混匀仪上56℃1700rpm震荡10min，短暂离心，放在磁力架上30s后，将洗脱液转移到新的离心管中，-15℃以下保存备用。
第3组尿液免提取直接进行自研亚硫酸盐转化方案具体操作如下详述：
按12ml尿液：8ml保存液比例常温保存3天后的尿液样本中加入20μL用于核酸富集的磁珠，本实施例使用的是羟基磁珠，充分振荡混匀，静置5min后上磁力架吸附5min，小心弃上清，晾干5min后加入45μL无核酸酶水溶解2min，上磁力架吸附2min后小心吸取上清液40μL用于后续亚硫酸盐转化。
取40μL上述核酸溶液，加入90μL转化液和10μL保护液，置于PCR仪中进行反应，反应程序如下：95℃ 5min,58℃,50min，反应结束后瞬离5s，将全部液体转移至一新1.5ml离心管。
加入300μL结合液和20μL磁珠，振荡混匀5min，瞬时离心5s，上磁力架吸附3min，小心吸弃上清。
加入1000μL洗涤液，振荡混匀数秒后，瞬时离心5s，上磁力架吸附2min，小心吸弃上清。
加入200μL脱磺化液，在恒温混匀仪上常温、1700rpm震荡混匀15-20min，短暂离心，磁力架上30s后，去除废液。
加入1000μL洗涤液漂洗1次，短暂离心，磁力架上30s后吸弃废液。重复漂洗一次。充分晾干5-10min。
加入30-50μL洗脱液，充分混匀磁珠，在恒温混匀仪上56℃1700rpm震荡10min，短暂离心，放在磁力架上30s后，将洗脱液转移到新的离心管中，-15℃以下保存备用。
所得转化后核酸针对人ACTB基因进行甲基化特异性qPCR检测。检测结果如下表6：
表6
免提取搭配本发明自研转化试剂的效果与核酸提取后用Zymo转化效果无明显差异。
第一组核酸提取时长约1.5小时，20ml尿液提取成本约100元，Zymo转化时长约1.5小时，成本约20元，总计时长约3小时，成本约120元；
第二组核酸提取时长约1.5小时，20ml尿液提取成本约100元，自研试剂转化时长约1.5小时，成本约10元，总计时长约3小时，成本约110元；
第三组免提取，20ml尿液磁珠富集时长约15分钟，成本约2元，自研试剂转化时长约1.5小时，成本约10元，总计时长约1小时45分钟，成本约12元。
总结，第三组免提取+自研试剂转化的时长最短且成本最低。
实施例4：脱磺化过程优化测试
在开发过程发现，脱磺化试剂采用50-80％乙醇、0.3M NaOH，反应过程中磁珠会发生结块聚集现象，导致磁珠沉淀，影响脱磺化效果。本发明进行了多次优化测试，总结了优化结果如下表7：
表7
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现象如图4：
从本实施例来看，第1组降低乙醇含量能适当减少磁珠聚集现象，但会降低核酸得率；第2组磁珠聚集现象严重，核酸得率略低但无显著差异；第3、4组分别加入阴离子表面活性剂和两性离子表面活性剂，不能有效解决磁珠聚集现象；第5、6组增加PEG6000或降低乙醇增加PEG6000，能够改善磁珠聚集现象，但是磁珠吸附速度变慢；第7、8组降低乙醇增加阴离子表面活性剂和两性离子表面活性剂，能够改善磁珠聚集现象，但会降低核酸得率；第9组降低乙醇增加PEG6000、阴离子表面活性剂和两性离子表面活性剂，能够改善磁珠聚集现象，且核酸得率无影响，效果最佳。
实施例5：亚硫酸盐转化效率测试
本实施例核酸样本为一段人工合成的167bp的λDNA序列，片段上包含13个未甲基化的C碱基，用于评判亚硫酸盐C转U的转化效率；1个完全甲基化的C碱基，用于监控甲基化的C碱基不会被转化成U。具体序列如下(斜体加粗标注的为未甲基化的CG位点，下划线标注的为甲基化的CG位点)：
设置2组，第1组为商品试剂盒(Zymo Research，D5031)亚硫酸盐转化方案，具体，第2组为本发明所述自研亚硫酸盐转化方法(采用实施例3中本发明的亚硫酸盐转化步骤)。两组分别各取200ng上述167bp的λDNA序列进行亚硫酸盐转化，第1组参照试剂盒说明书进行，第2组本发明所述自研亚硫酸盐转化方法如下详述：
取200ngλDNA核酸(体积40μL)，加入90μL转化液和10μL保护液，置于PCR仪中进行反应，反应程序如下：95℃5min,58℃,50min，反应结束后瞬离5s，将全部液体转移至一新1.5ml离心管。
加入300μL结合液和20μL磁珠，振荡混匀5min，瞬时离心5s，上磁力架吸附3min，小心吸弃上清。
加入1000μL洗涤液，振荡混匀数秒后，瞬时离心5s，上磁力架吸附2min，小心吸弃上清。
加入200μL脱磺化液，在恒温混匀仪上常温、1700rpm震荡混匀15-20min，短暂离心，磁力架上30s后，去除废液。
加入1000μL洗涤液漂洗1次，短暂离心，磁力架上30s后吸弃废液。重复漂洗一次。充分晾干5-10min。
加入30μL洗脱液，充分混匀磁珠，在恒温混匀仪上56℃1700rpm震荡10min，短暂离心，放在磁力架上30s后，将洗脱液转移到新的离心管中，-15℃以下保存备用。
两组所得转化后核酸往下完成常规NGS建库测序，具体操作方法如下：
反应一：片段化加“A”：
反应体系如下表8：
表8
| 试剂 | 用量(uL) |
| 转化后的DNA | 17.5 |
| 10×FEA Reaction Buffer | 2.5 |
| 5×FEA enzyme Mix | 5 |
| 总体积 | 25 |
反应程序见表9：热盖85℃
表9
| 温度 | 时长 |
| 4℃ | 1min |
| 32℃ | 12min |
| 65℃ | 30min |
| 4℃ | ∞ |
反应二：加接头：
反应体系见表10：
表10
| 试剂 | 用量(uL) |
| 上一步反应产物 | 25 |
| Adaptor(5μM) | 2 |
| 连接buffer1 | 7 |
| 连接buffer2 | 23 |
| 连接酶mix | 2 |
| ddH2O | 21 |
| 总体积 | 80 |
反应程序见表11：热盖85℃
表11
| 温度 | 时长 |
| 20℃ | 15min |
| 4℃Hold | ∞ |
反应结束后，立刻用1.2×磁珠纯化，25uL无核酸酶水洗脱；
反应三：Post-PCR
反应体系见表12：
表12
反应程序见表13：热盖105℃
表13
产物0.9×磁珠纯化，25ul无核酸酶水洗脱。所得文库进行illumina上机测序。
测序数据结果如下表14：
表14
测序结果显示，13个未甲基化的C碱基转化为U碱基的效率均超过99％以上，与商品试剂盒的效率无差异；1个甲基化的C碱基转化为U碱基的比率不超过2％，证明该转化过程不会对甲基化的C碱基造成影响。
实施例6：亚硫酸盐转化对核酸的影响程度测试
本实施例选取完整基因组DNA和经cavoris打断至150-600bp大小的模拟小片段DNA为样本进行测试。具体操作流程如下：
取500ng完整基因组DNA和500ng cavoris打断至150-600bp大小的模拟小片段DNA，分别采用商品试剂盒(Zymo Research，D5031)(图中简称Zymo)、本发明所述自研亚硫酸盐转化方法(采用实施例3中本发明的亚硫酸盐转化及转化后纯化步骤)(图中简称Yearth)、商品试剂盒(康为世纪，CWY105)(图中简称KW)进行转化及转化后纯化处理，所得核酸跑琼脂糖凝胶电泳评估片段完整性。结果如图5所示。
该实施例结果显示，经Zymo和本发明所述方案处理的完整基因组DNA完整性较好，而康为世纪试剂盒处理的完整基因组DNA发生严重损伤(片段小于1kb)；经Zymo和本发明所述方案处理的模拟小片段DNA主带集中在150-400bp，而康为世纪试剂盒处理的完整基因组DNA发生损伤，主带集中在100bp以下。
实施例7：临床尿液样本免提取亚硫酸盐转化应用于尿路上皮癌基因甲基化检测
本实施例选取10例临床确诊为尿路上皮癌患者术前收集的晨尿样本，10例正常男性晨尿样本，将尿液采集至无菌尿杯后，每例尿液设置两组，一组为对照组，取12ml尿液至干净的50ml离心管，30min内提取核酸(济凡生物，M117-02,FineMag大体积磁珠法尿液游离DNA提取试剂盒)，然后用试剂盒(Zymo Research，D5031)进行亚硫酸盐转化，转化后的核酸保存于-80℃备用；另外一组为实验组，取12ml尿液至装有8ml尿液保存液(配方如实施例1所述)的50ml离心管内，常温放置15天后，采用实施例3中所述的本发明的尿液免提取直接转化的方法进行亚硫酸盐转化，转化后的核酸保存于-80℃备用。
将两组转化后的核酸分别进行尿路上皮癌基因甲基化特异性的qPCR检测，检测结果与临床膀胱镜检测结果对比，统计如下表15：
表15
从本实施例的结果看出，采用本发明尿液保存液保存样本后进行免提取亚硫酸盐转化，所得核酸进行qPCR检测的结果与常规采样后立即提取核酸进行亚硫酸盐转化的结果一致。与临床诊断结果的阴阳性符合率100％。本实施例结果显示，临床尿液样本免提取亚硫酸盐转化方法可应用于尿路上皮癌基因甲基化检测。
Claims (3)
1.一种尿液免提取直接亚硫酸盐转化的甲基化检测样本前处理试剂盒在非诊断目的的检测尿液样本DNA甲基化的应用，其特征在于，
包括如下步骤：
1）将尿液加入保存液中，再加入用于核酸富集的磁珠，充分振荡混匀，静置后磁力吸附，弃上清，晾干后加入无核酸酶水溶解，磁力吸附后吸取含有核酸的上清液用于亚硫酸盐转化；
2）取步骤1）得到的核酸溶液，加入转化液和保护液，置于PCR仪中进行反应，
3）步骤2）得到的产物加入结合液和多分散硅羟基磁珠，振荡混匀，瞬时离心，磁力吸附，吸弃上清；
4）加入洗涤液，振荡混匀后，瞬时离心，磁力吸附，吸弃上清；
5）加入脱磺化液，常温、震荡混匀，短暂离心，磁力吸附后，去除废液；
6）加入洗涤液漂洗，短暂离心，磁力吸附后吸弃废液；重复漂洗，充分晾干；
7）加入洗脱液，充分混匀磁珠， 56 ℃震荡混匀，短暂离心，磁力吸附后，将洗脱液转移在-15 ℃以下保存备用，或者直接进行甲基化检测；
所述的试剂盒包括如下试剂：尿液保存液、核酸富集磁珠、亚硫酸盐转化试剂；
所述的尿液保存液包括以下组分：离液盐、化学表面活性剂、生物表面活性剂、核酸酶抑制剂、还原剂、核酸助沉剂、低级醇、pH缓冲液，溶剂为无核酸酶的水；
其中离液盐包括：硫脲和异硫氰酸胍，浓度为2-6M；
化学表面活性剂包括Triton X-100，含量1%-10%；
生物表面活性剂包括：枯草菌脂肽钠，含量0.1mM-10mM/L；
核酸酶抑制剂包括：7.5mM-75mM EDTA；
还原剂包括：30mM-300mM三(2-羧乙基)膦盐酸盐；
核酸助沉剂包括：5%-25% PEG6000；
低级醇包括乙醇或异丙醇，含量15%-40%；
pH缓冲液包括：0.1M-0.3M pH 5.4-6.8的NaAc-HAc缓冲液或0.15M-0.3M pH 5.4-6.8的Tris-HCl缓冲液；
核酸富集磁珠包括羟基磁珠或羧基磁珠；
所述的亚硫酸盐转化试剂，包括以下组分：转化液、保护液、结合液、转化后纯化磁珠、洗涤液、脱磺化液、洗脱液；
其中转化液包括4-5M亚硫酸盐，氢氧化钠调剂pH值至4.0-5.5,包括：亚硫酸氢钠、亚硫酸氢铵、亚硫酸钠或焦亚硫酸钠；
保护液包括：2.5mM-10mM对苯二酚；
结合液包括如下组分：浓度为1-4M的盐酸胍；浓度为1%-10%的Tween 20；含量20%-40%的无水乙醇；2.5%-5% PEG6000；0.1M-0.2M pH6.6的NaAc-HAc缓冲液或pH 6.6的0.1M-0.2MTris-HCl缓冲液；5mM-50mM EDTA；
转化后纯化磁珠是多分散硅羟基磁珠，粒径为300-500nm；合成方法：首先通过共沉淀法合成出磁性四氧化三铁，然后以四氧化三铁作为磁核，表面进行硅基化修饰处理后得到；
洗涤液包括如下组分：含量70%-80%乙醇、10mM-100mM pH 7.5的Tris-HCl缓冲液、50-200mM 氯化钠；
脱磺化液包括如下组分：含量50-80%乙醇、0.28-0.32 M NaOH、0.5%-5%PEG6000、0.05-0.5M NaCl、浓度为0.5%-2%的Tween 20、0.5%-2%的N-月桂酰肌氨酸钠盐；
洗脱液为10mM的pH 8.0的Tris-HCl和0.1mM pH 8.0的EDTA。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，
尿液保存液中化学表面活性剂：Triton X-100，浓度5%-8%；生物表面活性剂：枯草菌脂肽钠，含量1mM-5mM/L；核酸酶抑制剂：EDTA，浓度10mM-50mM；还原剂：三(2-羧乙基)膦盐酸盐，浓度100mM-300mM；核酸助沉剂：PEG6000，浓度5%-20%；低级醇：异丙醇，浓度15%-30%；pH缓冲液：NaAc-HAc缓冲液，浓度0.10M-0.20M；
核酸富集磁珠：羟基磁珠；
亚硫酸盐转化试剂中的转化液：亚硫酸氢钠，浓度4.5-5M；保护液：对苯二酚，浓度5mM-10mM；结合液中盐离子：盐酸胍，浓度2-4M；结合液中的表面活性剂：Tween 20，浓度1%-5%；结合液中的醇：无水乙醇，含量20%-30%；结合液中的助沉剂：PEG6000，含量：2.5%-4%；结合液中的缓冲液：pH6.6的NaAc-HAc缓冲液，浓度0.15M-0.2M；结合液中的EDTA：浓度10mM-40mM；
亚硫酸盐转化试剂中洗涤液的组分乙醇含量：75%-80%；pH 7.5 Tris-HCl缓冲液：10mM-50mM；氯化钠：100-200mM；
亚硫酸盐转化试剂中脱磺化液的组分乙醇含量：60-75%；NaOH：0.3M；PEG6000：0.5%-2%；NaCl：0.1M-0.4M；非离子表面活性剂：Tween 20，浓度：0.5%-1%；阴离子表面活性剂N-月桂酰肌氨酸钠盐浓度0.5%-1%。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
1）按12ml尿液：8ml保存液比例混合，在常温保存3天后的尿液样本中加入20µL用于核酸富集的磁珠，充分振荡混匀，静置5min后上磁力吸附5min，小心弃上清，晾干5min后加入45µL无核酸酶水溶解2min，磁力吸附2min后小心吸取含有核酸的上清液40µL用于后续亚硫酸盐转化；
2）取40µL上述核酸溶液，加入90µL转化液和10µL保护液，置于PCR仪中进行反应，反应程序如下：95℃ 5 min, 58℃ 50 min，反应结束后瞬离5s，将全部液体转移至一新1.5ml离心管；
3）加入300µL 结合液和20 µL磁珠，振荡混匀5min，瞬时离心5s，磁力吸附3min，小心吸弃上清；
4）加入1000µL 洗涤液，振荡混匀数秒后，瞬时离心5s，磁力吸附2min，小心吸弃上清；
5）加入200µL脱磺化液，在恒温混匀仪上常温、1700 rpm震荡混匀15-20 min，短暂离心，磁力吸附30 s后，去除废液；
6）加入1000 μL洗涤液漂洗1次，短暂离心，磁力吸附30 s后吸弃废液；重复漂洗一次，充分晾干5-10min；
7）加入30-50 μL洗脱液，充分混匀磁珠，在恒温混匀仪上56℃ 1700 rpm震荡10 min，短暂离心，磁力吸附30 s后，将洗脱液转移到新的离心管中，-15℃以下保存备用，或者直接进行甲基化检测。
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