JP2018038438A - 非侵襲的出生前診断に有用な母体試料由来の胎児核酸のメチル化に基づく富化のためのプロセスおよび組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】母体試料から胎児核酸を分離、単離または富化するために、母親とその胎児との間で示差的にメチル化されているゲノム領域を利用する組成物およびプロセスが提供される。本明細書に記載の組成物およびプロセスは、染色体の異数性を検出することを含めた、非侵襲的な出生前診断のために特に有用である。本発明は、とりわけ、これらに限定されないが、胎児核酸の存在または非存在、胎児核酸の絶対量または相対量、胎児の性別、および異数性などの胎児の染色体異常を含めた胎児の遺伝形質を非侵襲的に検出するために有用なヒトの後成的なバイオマーカーを提供する。
【選択図】なし
Description
本願は、2009年9月16日に出願された米国特許出願12/561,241の継続出願であり、この出願は、本願と同じ発明の名称を有し、そして代理人整理番号は、SEQ−6022−UTである。この出願はまた、2008年9月16日に出願された米国仮特許出願61/192,264(代理人整理番号はSEQ−6022−PVである)の利益を主張する。上述の特許出願の全体の内容は、あらゆる文章、図面および表を含めて、本明細書中に参考として援用される。
本技術は、一部において、出生前診断および富化方法に関する。
非侵襲的な出生前検査は、関心が急速に増している分野になっている。妊娠中の合併症および胎児の遺伝的欠陥を含めた妊娠に関連する状態を早期検出することは、それにより、母親および胎児の両方の安全性のために必要である早期の医療介入が可能になるので、決定的に重要である。出生前診断は、絨毛採取(CVS)または羊水穿刺などの手順によって胎児から単離された細胞を使用して行われている。しかし、これらの従来の方法は侵襲性であり、母親および胎児の両方に対してかなりの危険性を生じさせる。The National Health Serviceは現在、侵襲性の羊水穿刺検査および絨毛採取(CVS)検査後の1〜2パーセントの流産率に言及している。
本発明は、とりわけ、これらに限定されないが、胎児核酸の存在または非存在、胎児核酸の絶対量または相対量、胎児の性別、および異数性などの胎児の染色体異常を含めた胎児の遺伝形質を非侵襲的に検出するために有用なヒトの後成的なバイオマーカーを提供する。本発明のヒトの後成的なバイオマーカーは、胎児と母親との間で示差的なCpGメチル化パターンを示すゲノムDNAを意味する。本発明の組成物およびプロセスにより、前記試料中の核酸のメチル化状態に基づいて母体試料中の胎児核酸を検出し、定量化することが可能になる。より詳細には、母体試料に由来する胎児核酸の量を、存在する核酸の総量と比較して決定し、それによって試料中の胎児核酸の百分率をもたらすことができる。さらに、胎児核酸の量を、配列特異的に(または遺伝子座に特異的に)、かつ正確な染色体量(chromosomal dosage)分析(例えば、胎児の異数性の存在または非存在を検出するために)を可能にするために十分な感度で決定することができる。
Analysis Routine))技術(米国特許第7,081,339号を参照されたい)、またはその変形を使用するリアルタイムPCR、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(ASO)分析、メチル化特異的PCR(MSPCR)、ピロシーケンス分析、アシクロプライム(acycloprime)分析、逆ドットブロット、GeneChipマイクロアレイ、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション(DASH)、ペプチド核酸(PNA)プローブおよびロックド核酸(LNA)プローブ、TaqMan、分子ビーコン、インターカレート色素、FRETプライマー、蛍光タグを付けたdNTP/ddNTP、AlphaScreen、SNPstream、遺伝子ビット分析(GBA)、多重ミニ配列決定、SNaPshot、GOODアッセイ、マイクロアレイミニ配列決定、アレイ化プライマー伸長(APEX)、マイクロアレイプライマー伸長、タグアレイ、コード化ミクロスフェア、鋳型定方向組み込み(TDI)、蛍光偏光、比色定量オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)、配列コード化OLA、マイクロアレイライゲーション、リガーゼ連鎖反応、Padlockプローブ、Invader(商標)アッセイ、少なくとも1つのプローブを使用するハイブリダイゼーション、少なくとも1つの蛍光標識したプローブを使用するハイブリダイゼーション、電気泳動、例えば454プラットフォーム(Roche)(Margulies, M.ら、2005年、Nature、437巻、376〜380頁)、Illumina Genome Analyzer(もしくはSolexaプラットフォーム)もしくはSOLiD System(Applied Biosystems)において実施されるクローニングおよび配列決定、またはHelicos True単一分子DNA配列決定技術(Harris T
Dら、2008年、Science、320巻、106〜109頁)、単一分子、Pacific Biosciencesのリアルタイム(SMRT(商標))技術、または、例えば、DNAの個々の塩基に関連する電荷を、各塩基が試料ウェルの底部のごく小さな孔を通過するにしたがって測定するIon Torrentイオンセンサーを使用するナノポアに基づく配列決定(Soni GVおよびMeller A.2007年Clin Chem、53巻:1996〜2001頁)、または、DNAの個々の単位に関連する電荷を測定するためにナノポアを使用するOxford Nanoporeデバイス、およびそれらの組み合わせ。ナノポアに基づく方法は、ナノポアを使用して核酸を配列決定する工程、または、例えば、配列情報を決定しない場合には、サイズに基づいてナノポアを使用して核酸分子を計数する工程を含んでよい。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
胎児核酸を調製するための方法であって、
a)妊婦に由来する試料を提供する工程と;
b)該妊婦の該試料に由来する胎児核酸を母体核酸から、該胎児核酸と該母体核酸の等価物との間のメチル化状態の違いによって分離する工程であって、該胎児核酸が、配列番号90〜261のポリヌクレオチド配列の1つ以上に由来する1つ以上のCpG部位を含む工程と;
c)パート(b)において分離された胎児核酸を鋳型として利用するプロセスによって胎児核酸を含む核酸を調製する工程と
を含む方法。
(項目2)
メチル化されたヌクレオチドに特異的に結合する作用剤によって前記胎児核酸を前記母体核酸から分離する、項目1に記載の方法。
(項目3)
メチル化されたヌクレオチドに結合する前記作用剤がメチル−CpG結合性タンパク質(MBD)またはその断片である、項目2に記載の方法。
(項目4)
メチル化されたヌクレオチドに結合する前記作用剤が、メチル化された胎児核酸に結合する、項目2に記載の方法。
(項目5)
メチル化されたヌクレオチドに結合する前記作用剤が、メチル化された母体核酸に結合する、項目2に記載の方法。
(項目6)
メチル化されていないヌクレオチドに特異的に結合する作用剤によって前記胎児核酸を前記母体核酸から分離する、項目2に記載の方法。
(項目7)
メチル化されていない母体核酸を特異的に消化する作用剤によって前記胎児核酸を前記母体核酸から分離する、項目1に記載の方法。
(項目8)
メチル化されていない母体核酸を特異的に消化する前記作用剤が、メチル化感受性制限酵素である、項目7に記載の方法。
(項目9)
2種以上のメチル化感受性制限酵素を同じ反応において使用する、項目8に記載の方法。
(項目10)
工程c)の前記プロセスが増幅反応である、項目1に記載の方法。
(項目11)
工程c)の前記プロセスが、胎児核酸の絶対量を決定するための方法である、項目1に記載の方法。
(項目12)
配列番号90〜261のポリヌクレオチド配列の3つ以上を調製する、項目1に記載の方法。
(項目13)
示差的にメチル化された母体核酸および胎児核酸を含む母体試料中の胎児核酸の絶対量を決定するための方法であって、
a)1種以上のメチル化感受性制限酵素を使用して母体試料中の該母体核酸を消化し、それによって、配列番号90〜261のポリヌクレオチド配列の1つ以上に由来する1つ以上のCpG部位を含む該胎児核酸を富化する工程と;
b)多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を使用して、工程a)からの胎児核酸の絶対量を決定する工程と
を含む方法。
(項目14)
胎児核酸の所与の絶対量または濃度が特定の臨床的感度要件または臨床的特異性要件を満たす必要がある、胎児の形質を決定するための診断方法と併せて、胎児核酸の絶対量または濃度を使用する、項目13に記載の方法。
(項目15)
示差的にメチル化された母体核酸および胎児核酸を含む母体試料中の胎児核酸の濃度を決定するための方法であって、
a)該母体試料中に存在する核酸の総量を決定する工程と;
b)メチル化感受性制限酵素を使用して母体試料中の該母体核酸を消化し、それによって該胎児核酸を富化する工程と;
c)配列番号90〜261のポリヌクレオチド配列の1つ以上に由来する1つ以上のCpG部位を含む、工程b)からの胎児核酸の量を、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を使用して決定する工程と;
d)工程a)からの核酸の総量を、工程c)からの胎児核酸の量と比較し、それによって該母体試料中の胎児核酸の濃度を決定する工程と
を含む方法。
(項目16)
胎児核酸の所与の絶対量または濃度が特定の臨床的感度要件または臨床的特異性要件を満たす必要がある、胎児の形質を決定するための診断方法と併せて、胎児核酸の絶対量または濃度を使用する、項目15に記載の方法。
(項目17)
示差的にメチル化された母体核酸および胎児核酸を含む母体試料に由来する胎児核酸を使用して胎児の異数性の存在または非存在を決定するための方法であって、
a)メチル化感受性制限酵素を使用して母体試料中の該母体核酸を消化し、それによって該胎児核酸を富化する工程と;
b)配列番号164〜261のポリヌクレオチド配列の1つ以上に由来する1つ以上のCpG部位を含む、標的染色体に由来する胎児核酸の量を、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を使用して決定する工程と;
c)配列番号90〜163のポリヌクレオチド配列の1つ以上に由来する1つ以上のCpG部位を含む、参照染色体に由来する胎児核酸の量を、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない定量的方法を使用して決定する工程と;
d)工程b)からの胎児核酸の量を、工程c)からの胎児核酸の量に対して比較する工程であって、標的胎児核酸の量と参照胎児核酸の量との間の統計的有意差により、胎児の異数性の存在が示される工程と
を含む方法。
(項目18)
前記標的染色体および参照染色体のそれぞれの3〜15個の遺伝子座における胎児核酸の量を決定する、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記メチル化感受性制限酵素の消化効率を決定する、項目13、15または17に記載の方法。
(項目20)
前記定量化を実施するための、多型に基づかない定量的方法であって、かつ亜硫酸水素塩に基づかない方法が、胎児核酸の量を決定するための競合剤ベースの方法を使用する、項目13、15または17に記載の方法。
(項目21)
母体試料中に存在するY染色体核酸の存在または非存在を決定する工程をさらに含む、項目13、15または17に記載の方法。
(項目22)
男の胎児について、母体試料中に存在するY染色体核酸の量を決定する、項目21に記載の方法。
(項目23)
胎児核酸の量を、Y染色体核酸の量と比較する、項目22に記載の方法。
(項目24)
2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、15個、20個、30個、40個、50個、または50個超の遺伝子座における胎児核酸の量を決定する、項目13または15に記載の方法。
(項目25)
母体試料中に存在する核酸の総量を決定する、項目13または17に記載の方法。
(項目26)
核酸の総量と、男の胎児についてY染色体核酸の量とを決定する、項目13、15または17に記載の方法。
(項目27)
核酸の総量と、男の胎児についてY染色体核酸の量と、前記メチル化感受性制限酵素の消化効率とを全て決定する、項目13、15または17に記載の方法。
(項目28)
核酸の総量を決定するために2種以上のアッセイを使用し、男の胎児についてY染色体核酸の量を決定するために1種以上のアッセイを使用し、前記メチル化感受性制限酵素の消化効率を決定するために1種以上のアッセイを使用する、項目27に記載の方法。
(項目29)
3つ以上の遺伝子座における胎児核酸の量を決定する、項目28に記載の方法。
(項目30)
消化された母体核酸の平均長よりも大きなアンプリコンを生成する増幅反応によって前記胎児核酸の量を決定し、それによって該胎児核酸をさらに富化する、項目13、15または17に記載の方法。
本出願において使用される「妊娠に伴う障害」という用語は、妊娠中の女性、胎児、または女性および胎児の両方に影響を及ぼす可能性がある任意の状態または疾患を指す。そのような状態または疾患は、その症状が、限られた期間中に、例えば、妊娠中または分娩の間に顕在化する可能性がある、または胎児が誕生した後、その一生涯続く可能性がある。いくつかの妊娠に伴う障害の例としては、異所性の妊娠、子癇前症、早期分娩、RhD不適合、21トリソミーなどの胎児の染色体異常、および嚢胞性線維症などの遺伝性の胎児障害、ベータサラセミアまたは他の単一遺伝子障害が挙げられる。本明細書に記載の組成物およびプロセスは、これらに限定されないが、子癇前症(Loら、Clin. Chem.、45巻:184〜188頁、1999年およびZhongら、Am. J. Obstet. Gynecol.、184巻:414〜419頁、2001年)、胎児のトリソミー(Loら、Clin. Chem.、45巻:1747〜1751頁、1999年およびZhongら、Prenat. Diagn.、20巻:795〜798頁、2000年)および妊娠悪阻(Sekizawaら、Clin. Chem.、47巻:2164〜2165頁、2001年)を含めた母体の血漿/血清中の胎児のDNAの定量的な異常に関連する妊娠に伴う障害を診断、予後判定およびモニターするために特に有用である。例えば、母体の血液中の胎児核酸のレベルの上昇(正常な妊娠(複数可)と比較して)により、子癇前症妊娠が示され得る。さらに、母体試料から胎児核酸を富化することができることが、以前は母体の血漿に基づく非トリソミー出生前診断に対する難題として認識されていた出来事である、母親と父親が同一の病因性突然変異を共有する症例などの常染色体劣性疾患を非侵襲的に出生前診断するために特に有用であることが証明され得る。
vivo事象、またはin vitroでヌクレオチドを化学的にメチル化するために開始される事象のいずれかによってメチル化を受けやすい核酸内のヌクレオチドである。
諸言
母体の血漿中の胎児核酸の存在は、1997年に最初に報告され、それにより単に母体の血液試料を分析することによる、非侵襲的な出生前診断の可能性が提供されている(Loら、Lancet、350巻:485〜487頁、1997年)。現在まで、多数の潜在的な臨床的適用が開発されてきた。具体的には、胎児核酸、例えばDNAの定量的な異常、母体の血漿中の濃度が、子癇前症、早期分娩、分娩前出血、侵襲的な胎盤形成、胎児のダウン症候群、および他の胎児の染色体異数性を含めたいくつもの妊娠に伴う障害に関連することが見いだされた。したがって、母体の血漿中の胎児核酸を分析することにより、胎児母体の良好な状態をモニターするための有力な機構が表される。
本発明の実施には、分子生物学の分野における常套的な技法を利用する。本発明において使用する一般的な方法が開示されている基本的なテキストとしては、SambrookおよびRussell、Molecular Cloning、A Laboratory Manual(第3版、2001年);Kriegler、Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990年);およびCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編、1994年))が挙げられる。
本発明は、妊娠に付随する状態または障害の存在を検出するための、および/またはその進行をモニターするための非侵襲的な手段として、母体の血液中に見られる胎児のDNAを分離、富化および分析することに関する。したがって、本発明の実施の最初の工程は、妊娠中の女性から血液試料を得、試料からDNAを抽出することである。
血液試料を、本発明の方法を使用して試験するために適した妊娠期間にある妊娠中の女性から得る。適切な妊娠期間は、以下に考察するように、試験される障害に応じて変動し得る。女性からの採血を、病院または診療所が一般に従う標準のプロトコールに従って実施する。適量、例えば、一般には5〜50mlの末梢血を採取し、さらに調製する前に標準手順に従って貯蔵することができる。血液試料は、試料中に存在する核酸の質の劣化を最小限にするための当業者に公知の様式で採取、貯蔵または輸送する。
本発明による母体の血液中に見られる胎児のDNAの分析は、例えば、全血、血清、または血漿を使用して実施することができる。母体の血液から血清または血漿を調製するための方法は当業者に周知である。例えば、妊娠中の女性の血液は、血液凝固を予防するためにEDTAを含有するチューブまたはVacutainer SST(Becton Dickinson、Franklin Lakes、N.J.)などの専門の市販品の中に置き、次いで、遠心分離によって全血から血漿を得ることができる。他方では、血清は、血液凝固後に遠心分離して、または遠心分離せずに得ることができる。遠心分離を使用する場合、次いで、これに限らないが、適切なスピード、例えば、1,500〜3,000倍gで行うことが一般的である。血漿または血清を、DNAを抽出するために新しいチューブに移す前に追加的な遠心分離工程に供することができる。
血液を含めた生体試料からDNAを抽出するための多数の公知の方法がある。DNAの調製の一般的な方法(例えば、SambrookおよびRussell、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第3版、2001年に記載されている)に従うことができる;さまざまな市販の試薬またはキット、例えばQiagenのQIAamp Circulating Nucleic Acid Kit、QiaAmp DNA Mini KitまたはQiaAmp DNA Blood
Mini Kit(Qiagen、Hilden、Germany)、GenomicPrep(商標)Blood DNA Isolation Kit(Promega、Madison、Wis.)、およびGFX(商標)Genomic Blood DNA Purification Kit(Amersham、Piscataway、N.J.)も、妊娠中の女性に由来する血液試料からDNAを得るために使用することができる。これらの方法の2つ以上の組み合わせも使用することができる。
本明細書において提供される方法により、示差的にメチル化されたDNAのメチル化特異的な分離に基づいて胎児のDNAを富化するための代替の手法が提供される。発生制御に関与する多くの遺伝子が、胚性幹細胞におけるエピジェネティクスによって調節されていることが最近見いだされた。したがって、多数の遺伝子は、胎児起源の核酸と母体起源の核酸との間の示差的なDNAのメチル化を示すと予測することができる。これらの領域が同定されたら、メチル化されたDNAを捕捉するための技法を使用して、胎児のDNAを特異的に富化することができる。示差的にメチル化された領域を同定するために、新規の手法を使用してメチル化されたDNAを捕捉した。この手法では、MBD2のメチル結合ドメインが抗体のFc断片と融合しているタンパク質(MBD−FC)を使用する(Gebhard C、Schwarzfischer L、Pham TH、Schilling E、Klug M、Andreesen R、Rehli M(2006年)Genomewide profiling of CpG methylation identifies novel targets of aberrant hypermethylation in myeloid leukemia. Cancer
Res、66巻:6118〜6128頁)。この融合タンパク質は、従来のメチル化特異的抗体と比較して、いくつかの有利な点を有する。MBD−FCは、メチル化されたDNAに対して高い親和性を有し、二本鎖DNAに結合する。最も重要なことに、2つのタンパク質は、DNAへの結合の仕方が異なる。メチル化特異的抗体は、確率論的にDNAに結合し、これは、二者択一の答えのみを得ることができることを意味する。MBD−FCのメチル結合ドメインは、他方ではDNA分子のメチル化状態にかかわらず、全てのDNA分子に結合する。このタンパク質−DNA相互作用の強度は、DNAのメチル化のレベルによって定義される。ゲノムDNAに結合させた後、塩濃度を増加させた溶出液を使用して、メチル化されていないDNAおよびメチル化されたDNAを分画し、より調節された分離を可能にすることができる(Gebhard C、Schwarzfischer L、Pham TH、Andreesen R、Mackensen A、Rehli M(2006年)Rapid and sensitive detection of CpG−methylation using methyl−binding(MB)−PCR. Nucleic Acids Res、34巻:e82頁)。したがって、メチル−CpG免疫沈降(MCIP)と称されるこの方法では、ゲノムDNAが富化するだけでなく、メチル化のレベルに従って分画することもでき、これはメチル化されていないDNA画分も同様に調査するべきである場合に特に役立つ。
本発明は、母体試料に由来する胎児核酸の量を決定するための組成物およびプロセスも提供する。本発明により、母体核酸を選択的に、かつ完全に、または実質的に消化して試料を少なくとも1つの胎児核酸領域について富化する酵素を用いて前記母体試料に由来する核酸を選択的に消化することによって、母体試料中の胎児核酸領域を富化することが可能になる。消化効率は、約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%を超えることが好ましい。富化した後、胎児核酸の量を、多型配列または亜硫酸水素塩処理を必要としない定量的方法によって決定することができ、それによって、女の胎児に対して、かつ異なる民族性にわたって同等に良好に働き、低コピー数の胎児試料中に存在する核酸を保存する解決法が提供される。
さまざまなメチル化解析の手順が当技術分野で公知であり、本発明と併せて使用することができる。これらのアッセイにより、DNA配列内の1つ以上のCpG島のメチル化状態を決定することが可能になる。さらに、これらの方法は、メチル化された核酸を数量化するために使用することができる。そのようなアッセイは、他の技法の中でも、亜硫酸水素塩で処理したDNAをDNA配列決定すること、PCR(配列特異的に増幅するための)、サザンブロット分析、およびメチル化感受性制限酵素の使用を伴う。
IVDT.、2004年11月;41巻。
メチル化示差的に核酸を分離した後、核酸を、配列に基づく分析に供することができる。さらに、胎児起源の1つの特定のゲノム配列が母体の等価物と比較して高メチル化されている、または低メチル化されていることが決定されたら、この胎児のゲノム配列の量を決定することができる。その後に、この量を、標準の対照値と比較することができ、またこの量は、特定の妊娠に伴う障害の潜在性の指標としての機能を果たす。
多くの場合、本発明の核酸配列は、当技術分野で周知の(上に列挙され、以下により詳細に記載されている)いくつかの核酸増幅手順のいずれかを使用して増幅することが望ましい。詳細には、核酸の増幅は、増幅されている核酸配列と相補的な配列を含有する核酸アンプリコン(コピー)の酵素的合成である。核酸を増幅することは、試料中に存在する標的配列の量が非常に低い場合に特に有益である。対象の生物体またはウイルスに属する試料中の核酸の検出をより確実にするためにアッセイの開始時に必要な標的配列が少ないので、標的配列を増幅し、合成されたアンプリコンを検出することによってアッセイの感度をはるかに改善することができる。
Sci U S A.、96巻;9236〜41頁、(1999年))。胎児の診断に使用するためにデジタルPCRを適用することは、Cantorらに最初に記載され(PCT特許出願公開WO05023091A2)、その後にQuakeらに記載されており(米国特許出願公開US20070202525)、その両方がこれによって参照により組み込まれる。デジタルPCRでは、単一分子レベルでの核酸(DNA、cDNAまたはRNA)の増幅を活用し、低コピー数の核酸を数量化するための、高感度の方法を提供する。Fluidigm(登録商標)Corporationは核酸をデジタル解析するためのシステムを提供している。
ポリヌクレオチド配列を決定するための技法もよく確立されており、関連性のある研究分野において広く実施されている。例えば、ポリヌクレオチドを配列決定するための基本的な原理および一般的な技法は、Wallaceら、上記;SambrookおよびRussell、上記、およびAusubelら、上記などの分子生物学および組換え遺伝学におけるさまざまな研究報告および専門書に記載されている。研究所において、手動または自動のいずれかで常套的に実施されるDNAの配列決定方法を、本発明を実施するために使用することができる。本発明の方法を実施するための、ポリヌクレオチド配列における変化を検出するために適した追加的な手段としては、これらに限定されないが、質量分析、プライマー伸長、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、リアルタイムPCR、および電気泳動が挙げられる。
DNA analysis.」、Mol. Biotechnol.26巻、147〜164頁(2004年);およびOeth、P.ら、「iPLEX(商標)Assay:Increased Plexing Efficiency and Flexibility for MassARRAY(登録商標)System through single base primer extension with mass−modified Terminators.」、SEQUENOM Application Note(2005年)を参照されたい。増幅プロセス中に切断され、質量分析によって検出される切断可能な検出プローブを使用して標的核酸を検出し、数量化することの概説については、2007年12月4日に出願され、これによって参照により組み込まれる米国特許出願第11/950、395号、を参照されたい。
胎児の異数性を検出するために、いくつかの方法は、母系遺伝性対立遺伝子と父系遺伝性対立遺伝子の比を測定することに頼る。しかし、染色体の変化を数量化する能力は、無細胞核酸の母性の寄与によって損なわれ、測定する前に母体のDNAに由来する試料を枯渇させることが必要になる。有望な手法では、胎児のDNAおよび母体のDNAの異なるサイズ分布を活用する、または胎児に独占的に発現されているRNAを測定する(例えば、US20060252071として公開され、これによって参照により組み込まれる米国特許出願第11/384128号を参照されたい)。胎児のDNAが母体の血漿中の全無細胞DNAの約5%のみを占めると仮定すると、トリソミー試料と健康な対照との間の比率の差が1.6%から約1.2%まで減少する。したがって、対立遺伝子の比率の変化の信頼できる検出には、無細胞DNAの胎児の画分を、例えば、本発明の組成物および方法を使用して富化することが必要である。
本明細書で使用される染色体異常を「検出する」という用語は、上記で生成した増幅された核酸種、ヌクレオチド配列種、または検出可能な産物のセット(集合的に「検出可能な産物」)を検出することから生じるデータを処理することによって染色体の不均衡を同定することを指す。本発明において取り組まれているように、任意の適切な検出デバイスおよび検出方法を使用して、検出可能な産物の1つ以上のセットを区別することができる。染色体異常の存在または非存在に関する転帰は、これらに限定することなく、確率(例えば、オッズ比、p値)、尤度、百分率、閾値を超える値、または対象または試料についての染色体異常の存在に関連する危険因子を含めた任意の適切な形態で表すことができる。特定の実施形態では、転帰は、感度、特異性、標準偏差、変動係数(CV)および/または信頼水準の1つ以上、または前述のものの組み合わせで提供することができる。
以下の実施例では、10対の母体と胎盤のDNA試料を使用して、示差的にメチル化された領域を同定した。これらの結果を、質量分析に基づく定量的メチル化アッセイを使用して実証した。まず、母体の軟膜に由来するゲノムDNAおよび対応する胎盤組織を最初に抽出した。次に、MBD−FCを使用して、各DNA試料のメチル化された画分を捕捉した。図1〜3を参照されたい。2つの組織画分を、異なる蛍光色素で標識し、Agilent(登録商標)CpG島マイクロアレイとハイブリダイズさせた。図4を参照されたい。これは、出生前診断のために利用することができる示差的にメチル化された領域を同定するために行った。したがって、2つの判断基準を使用して、潜在的な富化マーカーとしてのゲノム領域を選択した:観察されたメチル化の差は、試験した試料対全てに存在しなければならず、領域は200bp超の長さでなければならなかった。
母体の軟膜に由来するゲノムDNA(gDNA)および胎盤組織に由来するゲノムDNA(gDNA)を、それぞれQiagen(登録商標)(Hilden、Germany)からのQIAamp DNA Mini Kit(商標)およびQIAamp DNA
Blood Mini Kit(商標)を使用して調製した。MCIpについては、NanoDrop ND 1000(商標)分光光度計(Thermo Fisher(登録商標)、Waltham、MA、USA)を使用してgDNAを数量化した。TE緩衝液500μl中2.5μgのDNAの300〜500bpの平均断片サイズへの超音波処理(Ultrasonication)を、Branson Digital Sonifier 450(商標)(Danbury、CT、USA)を用いて、以下の設定を使用して行った:振幅20%、超音波処理時間110秒間、パルスオン/パルスオフ時間1.4/0.6秒間。ゲル電気泳動を使用して断片の範囲をモニターした。
試料当たり56μgの精製MBD−Fcタンパク質および150μlのProtein
A Sepharose 4 Fast Flowビーズ(Amersham Biosciences(登録商標)、Piscataway、NJ、USA)を、15mlのTBS中、4℃で一晩回転させた。次いで、MBD−Fcビーズ(150μl/アッセイ)を2mlのUltrafree−CL遠心濾過デバイス(Millipore(登録商標)、Billerica、MA、USA)中に移し、分散させ、緩衝液A(20mMのトリス−HCl、pH8.0、2mMのMgCl2、0.5mMのEDTA、300mMのNaCl、0.1%のNP−40)で3回、急速回転させて洗浄した。超音波処理したDNA(2μg)を、2mlの緩衝液A中洗浄したMBD−Fcビーズに加え、4℃で3時間、回転させた。ビーズを遠心分離して結合していないDNA断片(300mMの画分)を回収し、その後に濃度を次第に増加させたNaCl(400mM、500mM、550mM、600mM、および1000mM)を含有する緩衝液600μlで2回洗浄した。各洗浄工程を通した流液を別々のチューブ内に採取し、MinElute PCR Purification Kit(商標)(Qiagen(登録商標))を使用して脱塩した。平行して、200ngの超音波処理した投入DNAを、対照としてMinElute PCR Purification Kit(商標)(Qiagen(登録商標))を使用して処理した。
マイクロアレイハイブリダイゼーション用の蛍光標識したDNAを生成するために、各試料について、600mMおよび1MのNaCl画分(富化されたメチル化されたDNA)を混ぜ合わせ、BioPrime Total Genomic Labeling System(商標)(Invitrogen(登録商標)、Carlsbad、CA、USA)を使用してAlexa Fluor 555−aha−dCTP(母体)またはAlexa Fluor 647−aha−dCTP(胎盤)のいずれかで標識した。標識化反応は製造者のマニュアルに従って行った。釣り合わせた母体/胎盤対の違うように標識したゲノムDNA断片を混ぜ合わせて最終的な体積を80μlとし、50μgのCot−1 DNA(Invitrogen(登録商標))、52μlのAgilent10×ブロッキング試薬(Agilent Technologies(登録商標)、Santa Clara、CA、USA)、78μlの脱イオン化したホルムアミド、および260μlのAgilent2×ハイブリダイゼーション緩衝液を補充した。試料を3分間、95℃まで加熱し、混合し、その後、37℃で30分間インキュベートした。次いでAgilent CpG Island Microarray Kit(商標)において、67℃で40時間、Agilent SureHyb(商標)チャンバーおよびAgilentハイブリダイゼーションオーブンを使用してハイブリダイゼーションを行った。スライドを、洗浄液I(6×SSPE、0.005%のN−ラウロイルザルコシン)中、室温で5分間洗浄し、洗浄液II(0.06×SSPE)中、37℃でさらに5分間洗浄した。次に、スライドをアセトニトリルおよびAgilent Ozone Protection Solution(商標)に、それぞれ30秒間浸した。画像を直ちにスキャンし、Agilent DNA Microarray Scanner(商標)を使用して解析した。マイクロアレイ画像を、Feature Extraction Software v9.5および標準のCGHプロトコールを使用して処理した。
ゲノムDNAの亜硫酸水素ナトリウムによる変換を、EZ−96 DNA Methylation Kit(商標)(ZymoResearch、Orange County、CA)を使用して実施した。1μgのゲノムDNAおよび代替の変換プロトコール(二温DNA変性)を使用し、製造者のプロトコールに従った。
SequenomのMassARRAY(登録商標)システムを使用して、定量的なメチル化解析を実施した。このシステムでは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI−TOF)質量分析をRNA塩基特異的な切断(Sequenom(登録商標)MassCLEAVE(商標))と組み合わせて利用する。次いで、メチル化の状態について検出可能なパターンを解析した。PCRプライマーを、Sequenom(登録商標)EpiDESIGNER(商標)(www.epidesigner.com)を使用して設計した。85個の標的領域を網羅する合計261個のアンプリコンを検証のために使用した(増幅長の中央値=367bp、min=108、max=500;アンプリコン当たりのCpGの数の中央値=23、min=4、max=65)。各リバースプライマーについて、in−vivo転写に対する追加的なT7プロモータータグ、ならびにフォワードプライマー上に10merのタグを加えて融解温度の差を調整した。MassCLEAVE(商標)生化学を、以前に記載された通り実施した(Ehrich
Mら(2005年)Quantitative high−throughput analysis of DNA methylation patterns by base specific cleavage and mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A、102巻:15785〜15790頁)。質量スペクトルを、MassARRAY(商標)Compact MALDI−TOF(Sequenom(登録商標)、San Diego)を使用して取得し、メチル化の比率を、EpiTYPER(商標)ソフトウェアv1.0(Sequenom(登録商標)、San Diego)によって生成した。
全ての統計計算を、R統計ソフトウェアパッケージ(www.r−project.org)を使用して実施した。まず、アレイプローブをそれらの遺伝子位置に基づいてグループ分けした。その後、1000bp未満離れたプローブを1つのグループにした。示差的にメチル化された領域を同定するために、対照試料を参照として使用した。対照試料では、血液に由来する対照DNAのメチル化された画分を、それ自体に対してハイブリダイズさせた。理想的には、この試料は約0の2色チャネルの対数比を示すはずである。しかし、ハイブリダイゼーション挙動は変動するので、プローブは平均対数比0.02および標準偏差0.18を示す。次に、我々の試料において観察された対数比を対照試料と比較した。二元配置の、対応のあるt検定を使用して、グループが同一であるという帰無仮説を検定した。4つ未満のプローブを含有したグループをこの分析から排除した。4つまたは5つのプローブを含むグループについて、全てのプローブを対応のあるt検定において使用した。6つ以上のプローブを有するグループについて、一度に5つのプローブからなるスライドウィンドウを使用し、それによって1つのプローブが増大するごとにウィンドウを移動させた。各試験試料を対照試料と比較し、p値を記録した。10個の試料のうち8個がp値<0.01を示した場合、または10個の試料のうち6個の試料がp値<0.001を示した場合、ゲノム領域を、示差的にメチル化されているとして選択した。グループが、p値<0.01である試料を8個未満、およびp値<0.001である試料6個未満示した場合、ゲノム領域を、示差的にメチル化されていないとして分類した。いずれのカテゴリーにも入らない試料をこの分析から排除した。示差的にメチル化されていると同定されたゲノム領域のサブセットについて、定量的なメチル化解析を使用して結果を確認した。
示差的にメチル化された領域を同定するために、単球のメチル化されたDNA画分をそれ自体に対してハイブリダイズさせた標準試料を使用した。この標準物質により、ゲノム領域における蛍光の測定値の変動性に対する参照がもたらされた。次いで、示差的にメチル化された領域を、10個の胎盤/母体試料のそれぞれの対数比をこの標準物質と比較することによって同定した。この試験の目的は、母体のDNAおよび胎児のDNAの信頼できる分離を可能にするマーカーを同定することであったので、標的の選択は、連続したゲノムDNAのひと続きにわたって安定な、一貫したメチル化の差を示す遺伝子に限られた。これは、多数のプローブにより示差的なメチル化が示されたゲノム領域に対する解析に焦点を合わせた。選択は、同様に、個体間の差が強力なものを除いて、全ての試料が示差的なメチル化を示した標的領域に限られた。2つの試料が、マイクロアレイ解析において一般に低い対数比を示した。標的を選択するために対応のある検定を使用したので、これは結果に負の影響を与えなかった。これらの選択の判断基準に基づいて、母体のDNAと胎児のDNAとの間で示差的にメチル化された3043個のゲノム領域を同定した。21778個の領域ではメチル化の差は示されなかった。示差的にメチル化された領域の分布における染色体間の偏りは観察されなかった。示差的にメチル化された領域は、2159個の既知遺伝子の隣、またはその範囲内に位置した。示差的にメチル化された領域の大部分は、プロモーター領域(18%)およびコード領域の内側(68%)に位置するが、ほんの数領域は、遺伝子の下流(7%)、またはプロモーターからコード領域(7%)への変わり目に位置する。示差的なメチル化を示さなかった領域は、プロモーター(13%)および下流の(5%)場所について同様の分布を示したが、プロモーターからコード領域への変わり目に位置する領域の割合が高く(39%)、コード領域の内側の割合が低かった(43%)。
マイクロアレイの所見を検証するために、第13染色体、第18染色体および第21染色体からの63個の領域ならびに他の常染色体からの追加的な26個の領域を、異なる技術によって確認するために選択した。Sequenom EpiTYPER(商標)技術を使用して、母体試料および胎盤試料におけるDNAメチル化を定量的に測定した。EpiTYPER(商標)法の説明については、Ehrich M、Nelson MR、Stanssens P、Zabeau M、Liloglou T、Xinarianos G、Cantor CR、Field JK、van den Boom D(2005年)Quantitative high−throughput analysis of DNA methylation patterns by base specific cleavage and mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A、102巻:15785〜15790頁)を参照されたい。標的領域内の個々のCpG部位について、母体のDNA試料全てにわたる平均のメチル化の値および胎盤試料全てにわたる平均のメチル化の値を算出した。次いで、平均の母体のメチル化と平均の胎盤のメチル化との間の差を、マイクロアレイの結果と比較した。2つの技術からの結果は良好に一致した(図7参照)。85個の標的領域について、定量的な結果により、マイクロアレイの結果が確認される(95%の確認率)。全て第18染色体に位置する4つの標的領域については、結果は確認することができなかった。この矛盾の理由は今のところ不明である。
実施例2は、母体試料中に存在する胎児核酸の量を検出するための非侵襲的な手法(本発明において「胎児数量化器法(Fetal Quantifier Method)」と称される)を説明し、それは胎児の形質(例えば、胎児の性別またはRhD適合性)を検出または確認するため、または21トリソミーなどの染色体異常を診断するために使用することができる(どちらも本発明において「メチル化に基づく胎児の診断方法」と称される)。図10は、胎児数量化器方法(Fetal Quantifier Method)の一実施形態を示し、図11は、メチル化に基づく胎児の診断方法の一実施形態を示す。どちらのプロセスでも、母体試料から得た胎児のDNAを使用する。試料は、示差的にメチル化されている母体核酸と胎児核酸を含む。例えば、試料は、母体の血漿または血清であってよい。胎児のDNAは、母体の血漿中の総DNAのおよそ2〜30%を構成する。試料中に存在する全核酸に対する胎児の寄与の実際の量は妊婦間で変動し、これらに限定されないが、妊娠期間、母親の健康および胎児の健康を含めたいくつもの因子に基づいて変化し得る。
母体試料から非侵襲的に単離された胎児のDNAを正確に検出および定量化することが必要とされている。本発明では、母体の血漿または血清中を循環している、無細胞胎児核酸(ccfDNA)の存在を活用する。商業的かつ臨床的に実用的であるために、本発明の方法は、有限で入手可能である胎児のDNAのごく一部のみを消費するべきである。例えば、試料の50%未満、40%未満、30%未満、25%未満、20%未満、15%未満、10%未満、5%未満、またはそれよりも少ない。さらに、この手法は、好ましくは、1つ以上の(全てが好ましい)以下のアッセイが含まれる多重アッセイ形式で開発するべきである:
・試料中に存在するゲノム等価物の総量を検出するためのアッセイ、すなわち、母体のDNA種および胎児のDNA種の両方を認識するアッセイ;
・男児の妊娠から単離した胎児のDNA、すなわち、Y染色体に特異的な配列を検出するためのアッセイ;
・胎児と母親との間で示差的にメチル化されていると同定された領域に特異的なアッセイ;または
・調査される全ての組織において低メチル化されていることが公知である、制限効率についての対照としての機能を果たすことができる領域に特異的なアッセイ。
・各アッセイについて、標的配列と比較した1つ以上のヌクレオチドの差などの競合剤の区別可能な特徴は別として、標的配列と同一である、または実質的に同一である、標的に特異的な競合オリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレオチドをPCR反応に加えると標的と同時増幅され、これらの2つのPCRアンプリコン間で得られた比率は、母体試料中に存在する標的特異的なDNA配列(例えば、特定の遺伝子座に由来する胎児のDNA)の数を示すことになる。
・アンプリコンの長さは、好ましくは、増幅がより短い断片に向かって偏らないように、同様の長さであるべきである。しかし、増幅効率がほとんど等しい限りは、異なる長さを使用することができる。
・示差的にメチル化された標的は、表1A〜1Cから、または母親と胎児との間で示差的にメチル化されていることが公知の任意の他の標的から選択することができる。これらの標的は、妊娠していない女性から単離したDNAにおいて低メチル化されてよく、胎児の試料から得た試料において高メチル化されていてよい。これらのアッセイは、制限効率についての対照としての機能を果たす。
・異なるアッセイから得られた結果を使用して、以下の1つ以上を数量化することができる:
○試料中に存在する増幅可能なゲノムの総数(ゲノム等価物の総量);
○増幅可能なゲノムの胎児の割合(胎児の濃度または百分率);または
○胎児に由来するDNA配列間のコピー数の差(例えば、胎児の第21染色体と第3染色体などの参照染色体との間の)。
以下は、例えば、図10に提供されるような本発明の方法を実施するために使用する反応工程の概略である。この概略は、本発明の範囲を限定するものではなく、むしろSequenom(登録商標)MassARRAY(登録商標)技術を使用した本発明の一実施形態を提供する。
ApoEリバースプライマー:
ApoE伸長プライマー:
ApoE合成の競合オリゴヌクレオチド:
2)試料中のY染色体配列の総数を数量化するためのアッセイ。
chrYにおけるSRY:2655628−2655717(逆相補物)
SRYリバースプライマー:
chr12におけるTBX3:115124905−115125001
TBX3リバースプライマー:
TBX3伸長プライマー:
TBX3合成の競合オリゴヌクレオチド:
CACNA1G chr17:48637892−48637977(逆相補物)
HhaIリバースプライマー:
HhaI伸長プライマー:
本発明の感度および正確度を、モデル系および臨床的な試料の両方を使用して測定した。異なる試料において、全コピー数を数量化するための2つのアッセイ、メチル化を数量化するための3つのアッセイ、Y染色体に特異的な1つのアッセイおよび1つの消化対照アッセイを含有する多重アッセイを実行した。表Xを参照されたい。追加的なアッセイを伴う別の多重スキームが表Yに提供されている。
表X: PCRプライマーおよび伸長プライマー
M=メチル化を数量化するためのアッセイ
Y=Y染色体特異的なアッセイ
D=消化対照。
試料中の増幅可能なゲノムのコピーの総数を決定する際に、方法の感度および正確度を決定するために、妊娠していない女性の血液から単離した異なるDNA試料のサブセットを試験した。各試料を、およそ反応当たり2500コピー、1250コピー、625コピーまたは313コピーを含有するように希釈した。増幅可能なゲノムのコピーの総数を、3つの全コピー数アッセイから得たDNA/競合剤の比率の平均を取ることによって得た。4つの異なる試料からの結果が図12に示されている。
臨床的な試料における方法の感度および正確度を調査するために、男の胎児を有する妊娠中の女性から得た33個の血漿試料を、表Xからの多重スキームを使用して調査した。全試料のうちの一部のみを使用するという重要な要件に応じるために、各反応について、抽出物4mlから得たDNAの4分の1を使用した。
全コピー数の数量化からの結果は図14Aおよび図14Bに見ることができる。図14Aには、各試料についてのコピー数が示されている。2つの試料(25番および26番)は他の全ての試料よりも有意に高い全コピー数を有する。一般に、血漿1ml当たり平均でおよそ1300個(766〜2055の範囲)の増幅可能なコピーを得た。図14Bは、結果を要約している、所与の値の箱ひげ図示す。
図15Aおよび図15Bでは、各試料について胎児のコピーの数がプロットされている。全ての試料は男児の妊娠由来であった。得られたコピー数を、メチル化マーカーまたはY染色体特異的なマーカーのいずれかを使用して算出することができる。図15Bにおいて見ることができるように、所与の値の箱ひげ図により、2つの異なる測定値間の最小の差が示された。
質量スペクトル分析を、Typer4(Sequenomのソフトウェア製品)を使用して行った。個々のDNA被検体および競合剤アッセイについてのピークの高さ(シグナル対ノイズ)を決定し、さらに解析するためにエクスポートした。
第21染色体に由来する20種のマーカーおよび1つ以上の他の常染色体に由来する20種のマーカーを使用する測定システムを仮定する第1の単純な検出力計算を実施した。100コピーの胎児のDNA、25個のコピーの測定値の標準偏差および0.001未満であるべき第1種の過誤の確率から開始して、本発明の方法により、全事例の99.5%で、二倍体の染色体セットと三倍体の染色体セットを弁別することができることが見いだされた。そのような手法の実用的な実行は、例えば、絶対的なコピー数を測定するための競合的なPCR手法を使用するシステムである質量分析を使用して実現することができる。この方法では、単一反応において20回のアッセイを実行することができ、繰り返した測定の標準偏差約3%〜5%を有することが示されている。この方法を、例えば、核酸を分離するためにメチル結合剤を使用して、または母体核酸を消化するためにメチル化感受性酵素を使用して、メチル化されている核酸とメチル化されていない核酸を区別するための公知の方法と組み合わせて使用した。図8は、過剰なメチル化されていないDNAの存在下でメチル化されたDNAを捕捉し、それによって分離するためのMBD−FCタンパク質(メチル結合剤)の有効性を示す(図8参照)。
コピー数
母体のコピー数=2000
第21染色体、X染色体およびY染色体以外の染色体についての胎児のコピー数=200
正倍数性の胎児の場合の第21染色体についての胎児のコピー数=200
異数性のT21胎児の場合の第21染色体についての胎児のコピー数=300
胎児のDNAの百分率(メチル化に基づく富化前)=10%(上記参照)
メチル化の頻度
母体のDNAについての標的領域におけるメチル化の百分率の平均=10%
胎児のDNAについての標的領域におけるメチル化の百分率の平均=80%
メチル化されていない母体のDNAおよび消化されなかった母体のDNAの百分率の平均(すなわち、制限効率の機能(数ある中で)=5%
第21染色体をターゲティングするアッセイの数=10
第21染色体、X染色体およびY染色体以外の染色体をターゲティングするアッセイの数=10
図20に結果が示されている。x軸の変動係数(CV)と単純なt検定(y軸)を使用した、アッセイ集団を識別する検出力との間の関連性が示されている。データにより、全事例の99%において、CVが5%以下という条件で、有意水準0.001で2つの集団(正倍数性対異数性)を識別することができることが示されている。このシミュレーションに基づいて、方法は、出生前に胎児の異数性を検出するための、性別に依存せず、全ての民族性において研究される(すなわち、対立遺伝子の偏りがない)有力な非侵襲的な診断方法を表す。
追加的な示差的にメチル化された標的
第21染色体上に位置しない示差的にメチル化された標的
以前のマイクロアレイ解析に基づいて、追加的な示差的にメチル化された標的を、さらなる解析のために選択した。マイクロアレイ解析の説明については実施例1を参照されたい。マイクロアレイスクリーニングの間、胎盤組織とPBMCとの間で示差的にメチル化された領域(DMR)を規定した。領域を、EpiTYPER確認のために、胎盤においてPBMCと比較して高メチル化されていることに基づいて選択した。変化の方向性を選択した後、領域を、有意性に関して最も有意から始めて低下させて設計した領域を用いて、統計的有意性に基づいて選択した。これらの試験を、8対のPBMCと胎盤の試料において実施した。追加的な非第21染色体標的が、表4Bの各標的からの代表的なゲノム配列と一緒に表1Bに提供されている。
マイクロアレイスクリーニングにより、1つのDMRのサブセットのみが第21染色体上に位置することが明らかになった。しかし、マイクロアレイによる第21染色体の適用範囲は不十分であった。したがって、第21染色体上の356個のCpG島の全てを、UCSCゲノムブラウザの標準設定を使用して検査するためにさらなる解析を完了した。下の表1Cに示されているように、これらの標的のいくつかは、表1Aにおいてすでに検査した標識と重複した。より詳細には、各CpGの約1000bp上流および約1000bp下流を含めた第21染色体上に位置するCpG部位を、SequenomのEpiTYPER(登録商標)技術を使用して調査した。SequenomのEpiTYPER(登録商標)技術の説明については実施例1「Sequenom(登録商標)EpiTYPER(商標)を使用した検証」を参照されたい。これらの試験を、8対のPBMCと胎盤の試料において実施した。さらに、DMRは、規定されたCpG島の外側に位置してもよいので、以下の特性を持つ潜在的な候補領域を同定するために、公的に入手可能なマイクロアレイデータに対してデータマイニングを実施した:母体の血液と比較して胎盤において高メチル化されており、規定されたCpG島に位置せず、4つより多いCpGジヌクレオチドを含有し、かつメチル化感受性制限酵素の認識配列を含有する。次いで、これらの判断基準に適合した領域を、8対のPBMCと胎盤の試料に対してSequenomのEpiTYPER(登録商標)技術を使用して検査した。追加的な第21染色体標的が、表4Cの各標的からの代表的なゲノム配列と一緒に表1Cに提供されている。
・領域名:各領域は、規定された、または近くの領域内にある遺伝子(複数可)によって名付けられている。遺伝子名がない領域が列挙されているが、近傍にrefseq遺伝子を有さない遺伝子座のみを含有する。
・遺伝子領域:遺伝子に極めて近接して、またはその範囲内に含有される領域について、遺伝子領域は、この領域の、近くの遺伝子との関連性をさらに説明している。
・Chrom:UCSCゲノムブラウザのhg18ビルドを使用してDMRが位置づけられる染色体。
・開始:UCSCゲノムブラウザのhg18ビルドで示されるDMRの開始位置。
・終了:UCSCゲノムブラウザのhg18ビルドで示されるDMRの終了位置。
・マイクロアレイ解析:この領域が、マイクロアレイ解析によって、示差的にメチル化されていることが同様に/最初に決定されたかどうかについて記載している。10対の胎盤とPBMCの試料のメチル化された画分を、MBD−Fcタンパク質を使用して単離した。次いで、2つの組織画分を、BioPrime Total Genomic Labeling System(商標)を使用してAlexa Fluor 555−aha−dCTP(PBMC)またはAlexa Fluor 647−aha−dCTP(胎盤の)でのいずれかで標識し、Agilent(登録商標)CpG島マイクロアレイとハイブリダイズさせた。これらの試験で検査した多くの領域は、最初のマイクロアレイを含有しなかった。
・EpiTYPER8試料:この領域が、EpiTYPER技術を使用して、8対の胎盤と末梢血単核細胞(PBMC)の試料において示差的にメチル化されていると解析され、決定されたかどうかについて記載している。検査のために選択した領域は、多数の判断基準に基づいた。まず、マイクロアレイ解析からのデータに基づいて領域を選択した。次に、第21染色体上に位置する全てのCpG島の包括的な検査に着手した。最後に、CpG島に位置する領域よりも低いCpG頻度を有する第21染色体上の選択された領域を検査した。
・EpiTYPER73試料:この領域が、その後、73対の胎盤とPBMCの試料からなる同じ試料コホートにおいてEpiTYPER技術を使用して分析されたかどうかについて記載している。この第2の試料コホートにおいて分析するための選択された全ての領域を、EpiTYPER8の列に記載の実験からの結果に基づいて選択した。より詳細には、この追加的なコホート内の領域は、EpiTYPER8試料分析において決定されたものと同様のメチル化のプロファイルを示した。例えば、表1B〜1Cに列挙されている領域の全てが、規定の領域内の検査したCpGジヌクレオチドのかなりの部分において異なるレベルDNAのメチル化を示している。CpG部位の示差的なDNAのメチル化を、対応のあるT検定を使用して決定し、p値(胎盤組織とPBMCを比較した場合)がp<0.05である場合に、その部位を示差的にメチル化されているとみなした。
・以前検証されたEpiTYPER:この領域またはこの領域の一部が、以前の実験の間にEpiTYPERを使用して検証されたかどうかについて記載している。(実施例1および2を参照されたい)。
・母体に対する胎盤の相対的なメチル化:示差的なメチル化の方向について記載している。「高メチル化」と標識された領域は、PBMCと比較して胎盤試料中の示した領域内で多くメチル化されおり、「低メチル化」は、PBMC試料中の示した領域内で多くメチル化されている。
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- 図面に記載された発明。
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A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20210720 |