ES2650666T3 - Procesos y composiciones para el enriquecimiento basado en metilación de ácido nucleico fetal de una muestra materna útil para diagnósticos prenatales no invasivos - Google Patents

Procesos y composiciones para el enriquecimiento basado en metilación de ácido nucleico fetal de una muestra materna útil para diagnósticos prenatales no invasivos Download PDF

Info

Publication number
ES2650666T3
ES2650666T3 ES10817598.5T ES10817598T ES2650666T3 ES 2650666 T3 ES2650666 T3 ES 2650666T3 ES 10817598 T ES10817598 T ES 10817598T ES 2650666 T3 ES2650666 T3 ES 2650666T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
nucleic acid
fetal
dna
sample
methylation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10817598.5T
Other languages
English (en)
Inventor
Mathias Ehrich
Anders Olof Herman Nygren
Taylor Jacob Jensen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sequenom Inc
Sequenom Center for Molecular Medicine LLC
Original Assignee
Sequenom Inc
Sequenom Center for Molecular Medicine LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sequenom Inc, Sequenom Center for Molecular Medicine LLC filed Critical Sequenom Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2650666T3 publication Critical patent/ES2650666T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6804—Nucleic acid analysis using immunogens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6879—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for sex determination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/38—Pediatrics
    • G01N2800/385—Congenital anomalies

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Un método para determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en una muestra que comprende: a) poner en contacto ácido nucleico presente en una muestra de una mujer embarazada, muestra que comprende ácido nucleico fetal y ácido nucleico materno diferencialmente metilado, la combinación del ácido nucleico fetal y ácido nucleico materno comprende el ácido nucleico total en la muestra, con un reactivo que digiere específicamente ácido nucleico no metilado, enriqueciendo de esta manera el ácido nucleico fetal; y b) determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en la muestra en una reacción multiplex mediante (i) análisis de la cantidad de ácido nucleico fetal en una pluralidad de loci seleccionados de los loci de SEQ ID NO: 90- 163, 176, 179, 180, 184, 188, 189, 190, 191, 193, 195, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 221, 223, 225, 226, 231, 232, 233, 235, 239, 241, 257, 258, 259, y 261, (ii) determinar la cantidad de ácido nucleico total, (iii) determinar la cantidad de ácido nucleico del cromosoma y, si está presente, y (iv) determinar la eficacia de digestión del reactivo.

Description

Procesos y composiciones para el enriquecimiento basado en metilación de ácido nucleico fetal de una muestra materna útil para diagnósticos prenatales no invasivos
Campo
La presente invención se define por las reivindicaciones. La tecnología descrita en el presente documento en parte se refiere a diagnóstico prenatal y métodos de enriquecimiento.
Antecedentes
Las pruebas prenatales no invasivas se vuelven un campo de interés que crece rápidamente. La detección temprana de afecciones relacionadas con el embarazo, incluyendo complicaciones durante el embarazo y defectos genéticos del feto es de importancia crucial, ya que permite intervención médica temprana necesaria para la seguridad tanto de la madre como del feto. El diagnóstico prenatal se ha realizado usando células aisladas del feto mediante procedimientos tal como muestras de vellosidades coriónicas (CVS) o amniocentesis. Sin embargo, estos métodos convencionales son invasivos y presentan un riesgo apreciable tanto para la madre como el feto. El Servicio Nacional de Salud actualmente cita un índice de abortos espontáneos de entre el 1 y el 2 por ciento después de pruebas de amniocentesis y muestras de vellosidades coriónicas (CVS) invasivas.
Se ha desarrollado una alternativa a estos enfoques invasivos para cribado prenatal, por ejemplo, para detectar anomalías fetales, después del descubrimiento que se puede detectar ácido nucleico fetal libre de células circulante en plasma y suero materno (Lo et al., Lancet 350:485-487, 1997; y Parente en EE UU 6.258.540). El ácido nucleico fetal libre de células circulante (ANflc) tiene varias ventajas que lo hacen más aplicable para pruebas prenatales no invasivas. Por ejemplo, el ácido nucleico libre de células está presente a niveles más altos que las células fetales y a concentraciones suficientes para análisis genéticos. Además, el ANflc se depura del torrente sanguíneo materno horas después del parto, previniendo contaminación de embarazos previos.
Los ejemplos de pruebas prenatales realizadas detectando ADN fetal en plasma o suero materno incluyen genotipado de rhesus D fetal (RhD) (Lo et al., N. Engl. J. Med. 339:1734-1738, 1998), determinación del sexo del feto (Costa et al., N. Engl. J. Med. 346:1502, 2002), y diagnóstico de varios trastornos fetales (Amicucci et al., Clin. Chem. 46:301-302, 2000; Saito et al., Lancet 356:1170, 2000; y Chiu et al., Lancet 360:998-1000, 2002). Además, se han descrito anomalías cuantitativas de ADN fetal en plasma/suero materno en preeclampsia (Lo et al., Clin. Chem. 45:184-188, 1999 y Zhong et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 184:414-419, 2001), trisomía 21 fetal (Lo et al., Clin. Chem. 45:1747-1751, 1999 y Zhong et al., Prenat. Diagn. 20:795-798, 2000) e hiperémesis gravídica (Sekizawa et al., Clin. Chem. 47:21642165, 2001).
Resumen
La presente invención se define mediante las reivindicaciones. En más detalle, la presente invención se refiere a un método para determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en una muestra que comprende: a) poner en contacto ácido nucleico presente en una muestra de una mujer embarazada, muestra que comprende ácido nucleico fetal y ácido nucleico materno diferencialmente metilados, la combinación del ácido nucleico fetal y el ácido nucleico materno comprende el ácido nucleico total en la muestra, con un reactivo que digiere específicamente ácido nucleico no metilado, enriqueciendo mediante ello el ácido nucleico fetal; y b) determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en la muestra en una reacción multiplex (i) analizando la cantidad de ácido nucleico fetal en una pluralidad de loci seleccionados de los loci de SEQ ID NO: 90-163, 176, 179, 180, 184, 188, 189, 190, 191, 193, 195, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 221, 223, 225, 226, 231, 232, 233, 235, 239, 241, 257, 258, 259, y 261, (ii) determinando la cantidad de ácido nucleico total, (iii) determinando la cantidad de nucleico del cromosoma y, si está presente, y (iv) determinando la eficacia de digestión del reactivo. Los proporcionados en el presente documento son, entre otros, biomarcadores epigenéticos humanos que son útiles para la detección no invasiva de rasgos genéticos fetales, incluyendo, pero no limitados a, la presencia o ausencia de ácido nucleico fetal, la cantidad absoluta o relativa de ácido nucleico fetal, sexo del feto, y anomalías cromosómicas fetales tal como aneuploidía. Los biomarcadores epigenéticos humanos descritos en el presente documento representan ADN genómico que muestra patrones de metilación CpG diferenciales entre el feto y la madre. Las composiciones y procesos descritos en el presente documento permiten la detección y cuantificación de ácido nucleico fetal en una muestra materna basado en el estado de metilación del ácido nucleico en dicha muestra. Más específicamente, la cantidad de ácido nucleico fetal de una muestra materna se puede determinar relativa a la cantidad total de ácido nucleico presente, proporcionando de esta manera el porcentaje de ácido nucleico fetal en la muestra. Además, la cantidad de ácido nucleico fetal se puede determinar de una manera específica de secuencia (o específica de locus) y con suficiente sensibilidad para permitir el análisis de dosis cromosómica precisa (por ejemplo, para detectar la presencia o ausencia de una aneuploidía fetal).
También se proporciona un método en el presente documento para enriquecer ácidos nucleicos fetales de una muestra biológica materna, basado en metilación diferencial entre ácido nucleico fetal y materno que comprende las
etapas de: (a) unir un ácido nucleico diana, de una muestra, y un ácido nucleico control, de la muestra, a una proteína de unión específica de metilación; y (b) eluir el ácido nucleico unido basado en el estado de metilación, en donde ácidos nucleicos diferencialmente metilados eluyen al menos parcialmente en fracciones separadas. La secuencia de ácido nucleico puede incluir una o más de las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NO: 1-261. Se proporcionan las SEQ ID NO: 1-261 en las tablas 4A-4C. El método incluye las secuencias de SEQ ID NO: 1-261 y variaciones de las mismas. Un ácido nucleico control puede no estar incluido en la etapa (a).
En un aspecto relacionado, también se proporciona un método en el presente documento para enriquecer ácido nucleico fetal de una muestra materna, que comprende las siguientes etapas: (a) obtener una muestra biológica de una mujer; (b) separar ácido nucleico fetal y materno basado en el estado de metilación de una secuencia genómica que contiene CpG en la muestra, en donde la secuencia genómica del feto y la secuencia genómica de la mujer están diferencialmente metiladas, distinguiéndose de esta manera la secuencia genómica de la mujer y la secuencia genómica del feto en la muestra. La secuencia genómica puede tener al menos 15 nucleótidos de longitud, comprender al menos una citosina, en donde además la región consiste en (1) un locus genómico seleccionado de las tablas 1A-1C; y (2) una secuencia de ADN de no más de 10 kb antes y/o después de locus. Para este aspecto y todos los aspectos descritos en el presente documento, obtener una muestra biológica de una mujer no pretende limitar el ámbito de los aspectos. Dicha obtención se puede referir a realmente extraer una muestra de una mujer (por ejemplo, una extracción de sangre) o a recibir una muestra de otro sitio (por ejemplo, de una clínica u hospital) y realizar el resto de las etapas del método.
En un aspecto relacionado, también se proporciona un método en el presente documento para enriquecer ácido nucleico fetal de una muestra materna, que comprende las siguientes etapas: (a) obtener una muestra biológica de una mujer; (b) digerir o eliminar ácido nucleico materno basado en el estado de metilación de una secuencia genómica que contiene CpG en la muestra, en donde la secuencia genómica del feto y la secuencia genómica de la mujer están diferencialmente metiladas, enriqueciendo de esta manera la secuencia genómica del feto en la muestra. El ácido nucleico materno se puede digerir usando una o más enzimas de restricción sensibles a metilación que selectivamente digieren o cortan ácido nucleico materno basado en su estado de metilación. La secuencia genómica puede tener al menos 15 nucleótidos de longitud, comprender al menos una citosina, en donde además la región consiste en (1) un locus genómico seleccionado de las tablas 1A-1C; y (2) una secuencia de ADN de no más de 10 kb antes y/o después de locus.
Además se proporciona un método en el presente documento para preparar ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico fetal, que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una muestra de una mujer embarazada; (b) separar el ácido nucleico fetal del ácido nucleico materno de la muestra de la mujer embarazada según un estado de metilación diferente entre el ácido nucleico fetal y el ácido nucleico materno equivalente, en donde la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico fetal comprende uno o más sitios CpG de una
o más secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261 en una secuencia polinucleotídica de un gen o locus que contiene una de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261; y (c) preparar ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico fetal mediante un proceso de amplificación en el que el ácido nucleico fetal separado en la parte (b) se utiliza como molde. También se proporciona un método en el presente documento para preparar ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico fetal, que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una muestra de una mujer embarazada; (b) digerir o eliminar el ácido nucleico materno de la muestra de la mujer embarazada según un estado de metilación diferente entre el ácido nucleico fetal y el ácido nucleico materno equivalente, en donde la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico fetal comprende uno o más sitios CpG de una o más secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261 en una secuencia polinucleotídica de un gen o locus que contiene una de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261; y (c) preparar ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico fetal. El proceso de preparación de la etapa (c) puede ser un proceso de hibridación, un proceso de captura, o un proceso de amplificación en el que el ácido nucleico fetal separado en la parte (b) se utiliza como molde. Además, en el método anterior en donde se digiere el ácido nucleico materno, el ácido nucleico materno se puede digerir usando una o más enzimas de restricción sensibles a metilación que digieren o cortan selectivamente ácido nucleico materno basado en su estado de metilación. En cualquier método, las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261 pueden estar en una secuencia polinucleotídica de una isla CpG que contiene una de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261. Las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261 se caracterizan adicionalmente en las tablas 1-3 en el presente documento, incluyendo la identificación de islas CpG que solapan con las secuencias polinucleotídicas proporcionadas en SEQ ID NO: 1-261. El ácido nucleico preparado por la parte (c) puede estar en solución. El método puede comprender además cuantificar el ácido nucleico fetal del proceso de amplificación de la etapa (c).
También se proporciona un método en el presente documento para el enriquecimiento de ácido nucleico fetal de una muestra de una mujer embaraza con respecto a ácido nucleico materno, que comprende las siguientes etapas: (a) proporcionar una muestra de una mujer embarazada; y (b) separar o capturar el ácido nucleico fetal del ácido nucleico materno de la muestra de la mujer embarazada según un estado de metilación diferente entre el ácido nucleico fetal y el ácido nucleico materno, en donde la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico fetal comprende uno o más sitios CpG de una o más secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261 en una secuencia polinucleotídica de un gen que contiene una de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261. Las
secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261 pueden estar en una secuencia polinucleotídica de una isla CpG que contiene una de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261. Las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261 se caracterizan en las tablas 1A-1C en el presente documento. El ácido nucleico separado por la parte (b) puede estar en solución. El método puede comprender además amplificar y/o cuantificar el ácido nucleico fetal del proceso de separación de la etapa (b).
También se proporciona una composición en el presente documento que comprende un ácido nucleico aislado de un feto de una mujer embarazada, en donde la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico comprende una o más de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261. La secuencia de nucleótidos consiste esencialmente en una secuencia de nucleótidos de un gen, o parte del mismo. La secuencia de nucleótidos puede consistir esencialmente en una secuencia de nucleótidos de una isla CpG, o parte de la misma. Las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261 se caracterizan adicionalmente en las tablas 1A-1C. El ácido nucleico puede estar en solución. El ácido nucleico del feto puede estar enriquecido relativo al ácido nucleico materno. La composición puede comprender además un agente que se une a nucleótidos metilados. Por ejemplo, el agente puede ser una proteína de unión a metil-CpG (MBD) o fragmento de la misma.
También se proporciona una composición en el presente documento que comprende un ácido nucleico aislado de un feto de una mujer embarazada, en donde la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico comprende uno o más sitios CpG de una o más secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261 en una secuencia polinucleotídica de un gen,
o parte del mismo, que contiene una de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261. La secuencia de nucleótidos del ácido nucleico puede comprender uno o más sitios CpG de una o más secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261 en una secuencia polinucleotídica de una isla CpG, o parte de la misma, que contiene una de las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261. Las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID NO: 1-261 se caracterizan adicionalmente en las tablas 1A-1C. El ácido nucleico puede estar en solución. El ácido nucleico del feto puede estar enriquecido relativo al ácido nucleico materno. Secuencias de ácido nucleico hiper e hipometiladas descritas en el presente documento se identifican en las tablas 1A-1C. La composición puede comprender además un agente que se une a nucleótidos metilados. Por ejemplo, el agente puede ser una proteína de unión a metil-CpG (MBD) o fragmento de la misma.
Una secuencia de nucleótidos descrita en el presente documento puede incluir tres o más de los sitios CpG. La secuencia de nucleótidos puede incluir cinco o más de los sitios CpG. La secuencia de nucleótidos puede ser de una región génica que comprende un dominio PRC2 (véase la tabla 3). La secuencia de nucleótidos puede ser de una región génica implicada con desarrollo. Por ejemplo, SOX14 -que es un marcador epigenético descrito en el presente documento (véase la tabla 1)-es un miembro de la familia SOX (caja HMG relacionada con SRY) de factores de transcripción implicados en la regulación de desarrollo embrionario y en la determinación de destino celular.
La secuencia genómica de la mujer puede estar metilada y la secuencia genómica del feto puede estar sin metilar. Alternativamente, la secuencia genómica de la mujer puede estar sin metilar y la secuencia genómica del feto puede estar metilada. La secuencia genómica del feto puede estar hipermetilada relativa a la secuencia genómica de la madre. Las secuencias genómicas fetales encontradas que están hipermetiladas relativas a la secuencia genómica materna se proporcionan en SEQ ID NO: 1-59, 90-163, 176, 179, 180, 184, 188, 189, 190, 191, 193, 195, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 221, 223, 225, 226, 231, 232, 233, 235, 239, 241, 257, 258, 259, y 261. Alternativamente, la secuencia genómica del feto está hipometilada relativa a la secuencia genómica de la madre. Las secuencias genómicas fetales encontradas que están hipometiladas relativas a la secuencia genómica materna se proporcionan en SEQ ID NO: 60-85, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 178, 181, 182, 183, 185, 186, 187, 192, 194, 196, 197, 204, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 222, 224, 227, 228, 229, 230, 234, 236, 237, 238, 240, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, y 260. Las enzimas de restricción sensibles a metilación descritas en el presente documento pueden ser sensibles a ácido nucleico hipo-o hiper-metilado.
El ácido nucleico fetal puede ser ácido nucleico extracelular. En general el ácido nucleico fetal extracelular tiene aproximadamente 500, 400, 300, 250, 200 o 150 (o cualquier número entre ellos) bases nucleotídicas o menos. El ácido nucleico materno digerido puede tener menos de aproximadamente 90, 100, 110, 120, 130, 140 o 150 pares de bases. En un aspecto relacionado, el ácido nucleico fetal se puede amplificar, capturar o separar selectivamente de o relativo al ácido nucleico materno digerido basado en tamaño. Por ejemplo, se pueden diseñar cebadores de PCR para amplificar ácido nucleico mayor de aproximadamente 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 o 120 (o cualquier número entre ellos) pares de bases, amplificando de este modo ácido nucleico fetal y no ácido nucleico materno digerido. El ácido nucleico se somete a fragmentación antes de los métodos descritos en el presente documento. Los ejemplos de métodos de fragmentar ácido nucleico incluyen, pero no están limitados a, sonicación y digestión con enzimas de restricción. El ácido nucleico fetal puede derivar de la placenta. El ácido nucleico fetal también puede ser apoptótico.
También se proporciona en el presente documento un método en el que la muestra es un miembro seleccionado de lo siguiente: sangre materna completa, plasma o suero materno, líquido amniótico, una muestra de vellosidades coriónicas, material de biopsia de un embrión preimplantación, células nucleadas fetales o restos celulares fetales
aislados de sangre materna, orina materna, saliva materna, lavados del aparato reproductor femenino y una muestra obtenida por celocentesis o lavado pulmonar. La muestra biológica puede ser sangre materna. La muestra biológica puede ser una muestra de vellosidades coriónicas. La muestra materna se puede enriquecer para ácido nucleico fetal antes de los métodos descritos en el presente documento. Los ejemplos de métodos de enriquecimiento fetal se proporcionan en las publicaciones PCT No. WO2007140417A2, WO2009/032781A2 y la publicación en EE UU No. 20050164241.
Todas las poblaciones celulares nucleadas y anucleadas se pueden retirar de la muestra antes de practicar los métodos descritos en el presente documento. La muestra se puede recoger, almacenar o transportar de una manera conocida para los expertos en la materia para minimizar la degradación o la calidad de ácido nucleico fetal presente en la muestra.
La muestra puede ser de cualquier animal incluyendo, pero no limitado a, humano, no humano, mamífero, reptil, ganado, gato, perro, cabra, marrano, cerdo, mono, simio, gorila, toro, vaca, oso, caballo, oveja, aves de corral, ratón, rata, pez, delfín, ballena, y tiburón, o cualquier animal u organismo que pueda tener un trastorno asociado a la gestación o anomalía cromosómica detectable.
La muestra se puede tratar con un reactivo que modifique diferencialmente ADN metilado y sin metilar. Por ejemplo, el reactivo puede comprender bisulfito; o el reactivo puede comprender una o más enzimas que preferentemente cortan ADN metilado; o el reactivo puede comprender una o más enzimas que preferentemente cortan ADN sin metilar. Los ejemplos de enzimas de restricción sensibles a metilación incluyen, pero no están limitados a, HhaI y HpaII.
El ácido nucleico fetal se puede separar del ácido nucleico materno por un agente que se une específicamente a nucleótidos metilados en el ácido nucleico fetal. El ácido nucleico fetal se puede separar o retirar del ácido nucleico materno por un agente que se une específicamente a nucleótidos metilados en el ácido nucleico materno equivalente. El agente que se une a nucleótidos metilados puede ser una proteína de unión a metil-CpG (MBD) o fragmento de la misma.
También se proporciona un método en el presente documento para determinar la cantidad o número de copia de ADN fetal en una muestra materna que comprende ADN materno y fetal diferencialmente metilados. El método se realiza mediante a) distinguir entre el ADN materno y fetal basado en el estado de metilación diferencial; y b) cuantificar el ADN fetal de la etapa a). El método puede comprender a) digerir el ADN materno en una muestra materna usando una o más enzimas de restricción sensibles a metilación enriqueciendo de este modo el ADN fetal; y b) determinar la cantidad de ADN fetal de la etapa a). La cantidad de ADN fetal se puede usar entre otros, para confirmar la presencia o ausencia de ácido nucleico fetal, determinar el sexo del feto, diagnosticar enfermedad fetal
o un trastorno asociado a la gestación, o usarse junto con otros métodos de diagnóstico fetal para mejorar la sensibilidad o especificidad. El método para determinar la cantidad de ADN fetal puede no requerir el uso de una secuencia polimórfica. Por ejemplo, una proporción alélica no se usa para cuantificar el ADN fetal en la etapa b). El método para determinar la cantidad de ADN fetal puede no requerir el tratamiento de ADN con bisulfito para convertir los residuos de citosina a uracilo. Se sabe que el bisulfito degrada ADN, reduciendo más de esta manera el ácido nucleico fetal ya limitado presente en muestras maternas. Determinar la cantidad de ADN fetal en la etapa b) se puede hacer introduciendo uno o más competidores a concentraciones conocidas. Determinar la cantidad de ADN fetal en la etapa b) se puede hacer por RT-PCR, extensión de cebador, secuenciación o conteo. La cantidad de ácido nucleico se puede determinar usando tecnología BEAMing como se describe en la publicación de patente en EE UU No. US20070065823. La cantidad de ácido nucleico se puede determinar usando la tecnología de secuenciación aleatoria descrita en la publicación de patente en EE UU No. US20090029377, o variaciones de la misma. La eficacia de restricción se puede determinar y la proporción de eficacia se usa para determinar adicionalmente la cantidad de ADN fetal. Se proporcionan ácidos nucleicos diferencialmente metilados ejemplares en SEQ ID NO: 1-261.
También se proporciona un método en el presente documento para determinar la concentración del ADN fetal en una muestra materna, en donde la muestra materna comprende ADN materno y fetal diferencialmente metilados, que comprende: a) determinar la cantidad total de ADN presente en la muestra materna; b) digerir selectivamente el ADN materno en una muestra materna usando una o más enzimas de restricción sensibles a metilación, enriqueciendo de este modo el ADN fetal; c) determinar la cantidad de ADN fetal de la etapa b); y d) comparar la cantidad de ADN fetal de la etapa c) con la cantidad total de ADN de la etapa a), determinando de este modo la concentración del ADN fetal en la muestra materna. La concentración de ADN fetal se puede usar entre otros, junto con otros métodos de diagnóstico fetal para mejorar la sensibilidad o especificidad. El método para determinar la cantidad de ADN fetal puede no requerir el uso de una secuencia polimórfica. Por ejemplo, no se usa una proporción alélica para cuantificar el ADN fetal en la etapa b). El método para determinar la cantidad de ADN fetal puede no requerir el tratamiento de ADN con bisulfito para convertir los residuos de citosina a uracilo. Determinar la cantidad de ADN fetal en la etapa b) se puede hacer introduciendo uno o más competidores a concentraciones conocidas. Determinar la cantidad de ADN fetal en la etapa b) se puede hacer por RT-PCR, secuenciación o conteo. La eficacia de restricción se puede determinar y la proporción de eficacia se usa para determinar adicionalmente la cantidad de ADN fetal. Se proporcionan ácidos nucleicos diferencialmente metilados ejemplares en SEQ ID NO: 1-261.
También se proporciona un método en el presente documento para determinar la presencia o ausencia de una aneuploidía fetal usando ADN fetal de una muestra materna, en donde la muestra materna comprende ADN materno y fetal diferencialmente metilados, que comprende: a) digerir selectivamente el ADN materno en una muestra materna usando una o más enzimas de restricción sensibles a metilación enriqueciendo de este modo el ADN fetal; b) determinar la cantidad de ADN fetal de un cromosoma diana; c) determinar la cantidad de ADN fetal de un cromosoma de referencia; y d) comparar la cantidad de ADN fetal de la etapa b) respecto a la etapa c), en donde una diferencia biológica o estadísticamente significativa entre la cantidad de ADN fetal diana y de referencia es indicativa de la presencia de una aneuploidía fetal. El método para determinar la cantidad de ADN fetal puede no requerir el uso de una secuencia polimórfica. Por ejemplo, no se usa una proporción alélica para cuantificar el ADN fetal en la etapa b). El método para determinar la cantidad de ADN fetal puede no requerir el tratamiento de ADN con bisulfito para convertir los residuos de citosina a uracilo. Determinar la cantidad de ADN fetal en las etapas b) y c) se puede hacer introduciendo uno o más competidores a concentraciones conocidas. Determinar la cantidad de ADN fetal en las etapas b) y c) se puede hacer por RT-PCR, secuenciación o conteo. La cantidad de ADN fetal de un cromosoma diana determinada en la etapa b) se puede comprar a un control estándar, por ejemplo, la cantidad de ADN fetal de un cromosoma diana de gestaciones euploides. La eficacia de restricción se puede determinar y la proporción de eficacia se usa para determinar adicionalmente la cantidad de ADN fetal. Se proporcionan ácidos nucleicos diferencialmente metilados ejemplares en SEQ ID NO: 1-261.
También se proporciona un método en el presente documento para detectar la presencia o ausencia de una anomalía cromosómica analizando la cantidad o número de copia de un ácido nucleico diana y ácido nucleico control de una muestra de ácidos nucleicos diferencialmente metilados que comprende las etapas de: (a) enriquecer un ácido nucleico diana, de una muestra, y un ácido nucleico control, de la muestra, basado en su estado de metilación;
(b)
realizar un análisis de número de copia del ácido nucleico diana enriquecido en al menos una de las fracciones;
(c)
realizar un análisis de número de copia del ácido nucleico control enriquecido en al menos una de las fracciones;
(d)
comparar el número de copia de la etapa (b) con el número de copia de la etapa (c); y (e) determinar si existe una anomalía cromosómica basado en la comparación en la etapa (d), en donde el ácido nucleico diana y el ácido nucleico control tienen el mismo o sustancialmente el mismo estado de metilación. En un aspecto relacionado, también se proporciona un método en el presente documento para detectar la presencia o ausencia de una anomalía cromosómica analizando la cantidad o número de copia de un ácido nucleico diana y ácido nucleico control de una muestra de ácidos nucleicos diferencialmente metilados que comprende las etapas de: (a) unir un ácido nucleico diana, de una muestra, y un ácido nucleico control, de la muestra, a un agente de unión; (b) eluir el ácido nucleico unido basado en el estado de metilación, en donde ácidos nucleicos diferencialmente metilados eluyen al menos parcialmente en fracciones separadas; (c) realizar un análisis de número de copia del ácido nucleico diana eluido en al menos una de las fracciones; (d) realizar un análisis de número de copia del ácido nucleico control eluido en al menos una de las fracciones; (e) comparar el número de copia de la etapa (c) con el número de copia de la etapa (d); y (f) determinar si existe una anomalía cromosómica basado en la comparación en la etapa (e), en donde el ácido nucleico diana y el ácido nucleico control tienen el mismo o sustancialmente el mismo estado de metilación. Se proporcionan ácidos nucleicos diferencialmente metilados en SEQ ID NO: 1-261.
También se proporciona un método en el presente documento para detectar la presencia o ausencia de una anomalía cromosómica analizando la proporción alélica de ácido nucleico diana y ácido nucleico control de una muestra de ácidos nucleicos diferencialmente metilados, que comprende las etapas de: (a) unir un ácido nucleico diana, de una muestra, y un ácido nucleico control, de la muestra, a un agente de unión; (b) eluir el ácido nucleico unido basado en el estado de metilación, en donde ácidos nucleicos diferencialmente metilados eluyen al menos parcialmente en fracciones separadas; (c) realizar un análisis de proporción alélica del ácido nucleico diana eluido en al menos una de las fracciones; (d) realizar un análisis de proporción alélica del ácido nucleico control eluido en al menos una de las fracciones; (e) comparar la proporción alélica de la etapa (c) con la proporción alélica de la etapa (d); y (f) determinar si existe una anomalía cromosómica basado en la comparación en la etapa (e), en donde el ácido nucleico diana y el ácido nucleico control tienen el mismo o sustancialmente el mismo estado de metilación. Se proporcionan ácidos nucleicos diferencialmente metilados en SEQ ID NO: 1-261, y se proporcionan SNP en los ácidos nucleicos diferencialmente metilados en la tabla 2. Los métodos también pueden ser útiles para detectar un trastorno asociado al embarazo.
La cantidad de ácido nucleico materno se puede determinar usando los métodos basados en metilación descritos en el presente documento. Por ejemplo, el ácido nucleico fetal se puede separar (por ejemplo, digerir usando una enzima sensible a la metilación) del ácido nucleico materno en una muestra, y el ácido nucleico materno se puede cuantificar usando los métodos descritos en el presente documento. Una vez se determina la cantidad de ácido nucleico materno, esa cantidad se puede restar de la cantidad total de ácido nucleico en una muestra para determinar la cantidad de ácido nucleico fetal. La cantidad de ácido nucleico fetal se puede usar para detectar rasgos fetales, incluyendo aneuploidía fetal, como se describe en el presente documento.
Para todos los aspectos descritos en el presente documento, los métodos también pueden ser útiles para detectar un trastorno asociado al embarazo. La muestra puede comprender ácido nucleico fetal, o ácido nucleico fetal y ácido nucleico materno. En el caso cuando la muestra comprende ácido nucleico fetal y materno, el ácido nucleico fetal y el ácido nucleico materno pueden tener diferente estado de metilación. Se pueden diferenciar especies de ácido
nucleico con un estado de metilación diferente por cualquier método conocido en la técnica. El ácido nucleico fetal se puede enriquecer por la digestión selectiva de ácido nucleico materno mediante un enzima de restricción sensible a metilación. El ácido nucleico fetal se puede enriquecer por la digestión selectiva de ácido nucleico materno usando dos o más enzimas de restricción sensibles a metilación en el mismo ensayo. El ácido nucleico diana y el ácido nucleico control pueden ser ambos del feto. En una forma de realización, el tamaño medio del ácido nucleico fetal es desde aproximadamente 100 bases hasta aproximadamente 500 bases de longitud. La anomalía cromosómica puede ser una aneuploidía, tal como trisomía 21. El ácido nucleico diana puede ser al menos una parte de un cromosoma que puede ser anómalo y el ácido nucleico control es al menos una parte de un cromosoma que es muy raramente anómalo. Por ejemplo, cuando el ácido nucleico diana es del cromosoma 21, el ácido nucleico control es de un cromosoma diferente del cromosoma 21 – preferiblemente de otro autosoma. El agente de unión puede ser una proteína de unión específica de metilación, tal como MBD-Fc. Además, el ácido nucleico enriquecido o eluido se amplifica y/o cuantifica por cualquier método conocido en la técnica. El ADN fetal se puede cuantificar usando un método que no requiere el uso de una secuencia polimórfica. Por ejemplo, no se usa una proporción alélica para cuantificar el ADN fetal. El método para cuantificar la cantidad de ADN fetal puede no requerir el tratamiento del ADN con bisulfito para convertir residuos de citosina a uracilo.
Los métodos descritos en el presente documento pueden incluir la etapa adicional de determinar la cantidad de una
o más secuencias específicas del cromosoma Y. En un aspecto relacionado, la cantidad de ácido nucleico fetal en una muestra determinada usando los métodos basados en metilación descritos en el presente documento se puede comprar a la cantidad de ácido nucleico de cromosoma Y presente.
Los métodos para diferenciar ácidos nucleicos basado en el estado de metilación incluyen, pero no están limitados a, captura sensible a metilación, por ejemplo, usando el fragmento MBD2-Fc; métodos de conversión con bisulfito, por ejemplo, MSP (PCR sensible a metilación), COBRA, extensión de cebador de nucleótido único sensible a metilación (Ms-SNuPE) o tecnología MassCLEAVE™ de Sequenom; y el uso de enzimas de restricción sensibles a metilación. Excepto donde se manifiesta explícitamente, cualquier método para diferenciar ácidos nucleicos basado en el estado de metilación se puede usar con las composiciones y métodos descritos en el presente documento.
Los métodos descritos en el presente documento pueden comprender además una etapa de amplificación. La etapa de amplificación se puede realizar por PCR, tal como PCR específica de metilación. La reacción de amplificación se puede realizar en moléculas únicas, por ejemplo, por PCR digital, que se describe adicionalmente en las patentes en EE UU No. 6.143.496 y 6.440.706. El método puede no requerir amplificación. Por ejemplo, la cantidad de ADN fetal enriquecido se puede determinar contando el ADN fetal (o etiquetas de secuencia unidas al mismo) con un citómetro de flujo o por medios de secuenciación que no requieren amplificación. La cantidad de ADN fetal se puede determinar por una reacción de amplificación que genera amplicones mayores que el ácido nucleico materno digerido, enriqueciendo más de este modo el ácido nucleico fetal.
El ácido nucleico fetal (solo o en combinación con el ácido nucleico materno) puede comprender una o más fracciones de detección. La fracción de detección puede ser uno o más de un compómero, azúcar, péptido, proteína, anticuerpo, compuesto químico (por ejemplo, biotina), etiqueta de masa (por ejemplo, iones metálicos o grupos químicos), etiqueta fluorescente, etiqueta de carga (por ejemplo, tal como poliaminas o colorantes cargados) y etiqueta hidrofóbica. La fracción de detección puede ser un producto distinguible por masa (MDP) o parte de un MDP detectado por espectrometría de masas. La fracción de detección puede ser una etiqueta o marcador fluorescente que se detecta por espectrometría de masas. La fracción de detección puede estar en el extremo 5’ de un oligonucleótido detector, la fracción de detección está unida a una región no complementaria de un oligonucleótido de detección, o la fracción de detección está en el extremo 5’ de una secuencia no complementaria. La fracción de detección se incorpora a o une a un nucleótido interno o a un nucleótido en el extremo 3’ de un oligonucleótido detector. Una o más fracciones de detección de pueden usar solas o en combinación. Véase, por ejemplo, las solicitudes de patente en EE UU US20080305479 y US20090111712. Una fracción de detección se puede cortar por una endonucleasa de restricción, por ejemplo, como se describe en el documento US20100279295. Un cromosoma diana específico se puede marcar con una fracción de detección específica y uno o más cromosomas no diana se marcan con una fracción de detección diferente, por lo cual la cantidad del cromosoma diana se puede comprar con la cantidad del cromosoma no diana.
Para métodos que requieren análisis de secuencia, se puede usar cualquiera de las siguientes tecnologías de secuenciación: un método de extensión de cebador (por ejemplo, iPLEX®; Sequenom, Inc.), secuenciación directa de ADN, polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (análisis RFLP), PCR en tiempo real, por ejemplo, usando tecnología “STAR” (rutina de análisis de transcripción escalable) (véase la patente en EE UU No. 7.081.339),
o variaciones de la misma, análisis de oligonucleótido específico de alelo (ASO), PCR específica de metilación (MSPCR), análisis de pirosecuenciación, análisis por Acycloprime, transferencia en mancha inversa, micromatrices GeneChip, hibridación específica de alelo dinámica (DASH); sondas de ácido peptidonucleico (APN) y ácidos nucleicos bloqueados (ANB), TaqMan, balizas moleculares, colorante intercalante, cebadores FRET, dNTP/ddNTP con etiquetas de fluorescencia, AlphaScreen, SNPstream, análisis de bit genético (GBA), minisecuenciación multiplex, SNaPshot, ensayo GOOD, minisecuenciación en micromatriz, extensión de cebador en haces (APEX), extensión de cebador en micromatriz, matrices de etiquetas, microesferas Coded, incorporación dirigida por molde (TDI), polarización de fluorescencia, ensayo de ligación de oligonucleótidos colorimétrico (OLA), OLA codificado por
secuencia, ligación en micromatriz, reacción en cadena de la ligasa, sondas Padlock, ensayo Invader™. hibridación usando al menos una sonda, hibridación usando al menos una sonda fluorescentemente marcada, electroforesis, clonación y secuenciación, por ejemplo, realizada en la plataforma 454 (Roche) (Margulies, M. et al. 2005 Nature 437, 376-380), Analizador de Genoma Illumina (o plataforma Solexa) o sistema SOLiD (Applied Biosystems) o la tecnología de secuenciación de ADN Helicos True Single Molecule DNA (Harris T D et al. 2008 Science, 320, 106109), la tecnología de molécula única, a tiempo real (SMRT.TM.) de Pacific Biosciences, o secuenciación basada en nanoporos (Soni GV y Meller A. 2007 Clin Chem 53: 1996-2001), por ejemplo, usando un sensor iónico Ion Torrent que mide una carga eléctrica asociada con cada base individual de ADN según pasa cada base a través de un poro diminuto en la parte inferior de un pocillo de muestra, o dispositivo Oxford Nanopore que usa un nanoporo para medir la carga eléctrica asociada con cada unidad individual de ADN, y combinaciones de las mismas. Los métodos basados en nanoporos pueden incluir secuenciación de ácidos nucleicos usando un nanoporo, o contar moléculas de ácido nucleico usando un nanoporo, por ejemplo, basado en el tamaño en donde la información de secuencia no se determina.
El número de copia absoluto de uno o más ácidos nucleicos se puede determinar, por ejemplo, usando espectrometría de masas, un sistema que usa un enfoque de PCR competitiva para medidas del número de copia absoluto. Véase, por ejemplo, Ding C, Cantor CR (2003) A high-throughput gene expression analysis technique using competitive PCR and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS. Proc Natl Acad Sci U A 100:3059-3064, y la publicación de patente en EE UU No. 20040081993.
La cantidad de la secuencia genómica se puede comparar con un control estándar, en donde un aumento o disminución del control estándar indica la presencia o evolución de un trastorno asociado a la gestación. Por ejemplo, la cantidad de ácido nucleico fetal se puede comparar con la cantidad total de ADN presente en la muestra. O cuando se detecta la presencia o ausencia de aneuploidía fetal, la cantidad de ácido nucleico fetal del cromosoma diana se puede comprar con la cantidad de ácido nucleico fetal de un cromosoma de referencia. Preferiblemente el cromosoma de referencia es otro autosoma que tiene una tasa baja de aneuploidía. La proporción de ácido nucleico fetal diana respecto a ácido nucleico fetal de referencia se puede comparar con la misma proporción de una gestación euploide normal. Por ejemplo, se puede determinar una proporción control de una muestra de ADN obtenida de una mujer que porta un feto sano que no tiene una anomalía cromosómica. Preferiblemente, se usa un panel de muestras control. Donde se conocen ciertas anomalías cromosómicas, también se pueden tener estándares que son indicativos de una enfermedad o afección específica. Por tanto, por ejemplo, para cribar para tres aneuploidías cromosómicas diferentes en un plasma materno de una mujer embarazada, preferiblemente se usa un panel de ADN control que se han aislado de madres que se sabe portan un feto con, por ejemplo, trisomía del cromosoma 13, 18 o 21, y una madre que está embarazada con un feto que no tiene una anomalía cromosómica.
También se proporciona en el presente documento un método en que los alelos del ácido nucleico diana y ácido nucleico control se diferencian por variación de secuencia. La variación de secuencia puede ser un polimorfismo de nucleótido único (SNP) o un polimorfismo de inserción/deleción. El ácido nucleico fetal debe comprender al menos un polimorfismo heterocigoto de alta frecuencia (por ejemplo, aproximadamente el 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25% o más tasa de frecuencia), que permite la determinación de la proporción alélica del ácido nucleico para evaluar la presencia o ausencia de la anomalía cromosómica. Se proporciona una lista de SNP ejemplares en la tabla 2, sin embargo, esto no representa una lista completa de alelos polimórficos que se pueden usar como parte de los aspectos descritos en el presente documento. Cualquier SNP que cumpla los siguientes criterios también se puede considerar: (a) el SNP tiene una frecuencia de heterocigosidad mayor de aproximadamente el 2% (preferiblemente a través de una gama de poblaciones diferentes), (b) el SNP está un locus heterocigoto; y (c) (i) el SNP está en una secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento, o (c) (iii) el SNP está de aproximadamente 5 a aproximadamente 2000 pares de bases de un SNP descrito en el presente documento (por ejemplo, a aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1250, 1500, 1750 o 2000 pares de bases de un SNP descrito en el presente documento).
La variación de secuencia puede ser un polimorfismo de repetición en tándem corta (STR). La variación de secuencia puede estar en un sitio de restricción, por lo cual un alelo es susceptible a digestión por una enzima de restricción y uno o más otros alelos no. La variación de secuencia puede ser un sitio de metilación.
Realizar un análisis de proporción alélica puede comprender determinar la proporción de alelos del ácido nucleico diana y ácido nucleico control del feto de una mujer embarazada obteniendo una muestra biológica que contiene ácido nucleico de la mujer embarazada, en donde la muestra biológica contiene ácido nucleico fetal, separar parcial
o totalmente el ácido nucleico fetal del ácido nucleico materno basado en metilación diferencial, distinguir los alelos del ácido nucleico diana y el ácido nucleico control, seguido por la determinación de la proporción de los alelos, y detectar la presencia o ausencia de un trastorno cromosómico en el feto basado en la proporción de alelos, en donde un proporción por encima o por debajo de una proporción normal, euploide es indicativa de un trastorno cromosómico. El ácido nucleico diana puede ser de un cromosoma aneuploide sospechado (por ejemplo, cromosoma 21) y el ácido nucleico control puede ser de un cromosoma euploide del mismo feto.
es los aspectos descritos en el presente documento se pueden combinar con otros marcadores fetales para detectar la presencia o ausencia de múltiples anomalías cromosómicas, en donde las anomalías cromosómicas se seleccionan de las siguientes: trisomía 21, trisomía 18 y trisomía 13, o combinaciones de las mismas. El trastorno cromosómico puede implicar el cromosoma X o el cromosoma Y.
Las composiciones o procesos se pueden multiplexar en una única reacción. Por ejemplo, la cantidad de ácido nucleico fetal se puede determinar en múltiples loci a lo largo del genoma. O cuando se detecta la presencia o ausencia de aneuploidía fetal, la cantidad de ácido nucleico fetal se puede determinar en múltiples loci en uno o más cromosomas diana (por ejemplo, cromosomas 13, 18 o 21) y en uno o más cromosomas de referencia. Si se usa una proporción alélica, uno o más alelos de la tabla 2 se pueden detectar y distinguir simultáneamente. Cuando se determinan proporciones alélicas, composiciones o procesos de multiplexado son particularmente importantes cuando el genotipo en un locus polimórfico no se conoce. En algunos casos, por ejemplo, cuando la madre y el hijo son homocigotos en el locus polimórfico, el ensayo puede no ser informativo. Más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 200, 300 o 500, y cualquier nivel intermedio, secuencias polinucleotídicas descritas en el presente documento se pueden enriquecer, separar y/o examinar según los métodos descritos en el presente documento. Cuando se detecta una anomalía cromosómica analizando el número de copias de un ácido nucleico diana y ácido nucleico control, se puede necesitar analizar menos de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 secuencias polinucleotídicas para detectar de forma precisa la presencia o ausencia de una anomalía cromosómica. Las composiciones o procesos descritos en el presente documento se pueden usar para ensayar muestras que se han dividido en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100 o más replicados, o en equivalentes de moléculas únicas. Los métodos para analizar ácidos nucleicos fetales de una muestra materna en replicados, incluyendo análisis de moléculas individuales, se proporcionan en la publicación de patente en EE UU No. US 2007-0207466 A1.
También se proporciona en el presente documento un método en donde una etapa de comparación muestra un riesgo aumentado de que un feto tenga un trastorno cromosómico si la proporción de los alelos o número de copia absoluto del ácido nucleico diana es mayor o menor en 1 desviación estándar de la secuencia control estándar. La etapa de comparación puede mostrar un riesgo aumentado de que un feto tenga un trastorno cromosómico si la proporción de los alelos o número de copia absoluto del ácido nucleico diana es mayor o menor en 2 desviaciones estándar de la secuencia control estándar. La etapa de comparación puede mostrar un riesgo aumentado de que un feto tenga un trastorno cromosómico si la proporción de los alelos o número de copia absoluto del ácido nucleico diana es mayor o menor en 3 desviaciones estándar de la secuencia control estándar. La etapa de comparación puede mostrar un riesgo aumentado de que un feto tenga un trastorno cromosómico si la proporción de los alelos o número de copia absoluto del ácido nucleico diana es mayor o menor que una desviación estándar estadísticamente significativa del control. El control estándar puede ser una referencia materna, y en un ejemplo el control estándar es un cromosoma de referencia fetal (por ejemplo, autosoma no trisómico).
Los métodos descritos en el presente documento se pueden combinar con otros métodos para diagnosticar una anomalía cromosómica. Por ejemplo, un método de diagnóstico no invasivo puede requerir confirmación de la presencia o ausencia de ácido nucleico fetal, tal como una prueba de sexo para un feto femenino o para confirmar feto femenino negativo para RhD en una madre negativa para RhD. Las composiciones y métodos descritos en el presente documento se pueden usar para determinar el porcentaje de ácido nucleico fetal en una muestra materna para permitir otro método de diagnóstico que requiere que el porcentaje de ácido nucleico fetal se conozca. Por ejemplo, ¿cumple una muestra ciertos requisitos de concentración umbral? Cuando se determina una proporción alélica para diagnosticar una aneuploidía fetal de una muestra materna, la cantidad o concentración de ácido nucleico fetal se puede requerir para hacer un diagnóstico con una sensibilidad y especificidad determinadas. Las composiciones descritas en el presente documento para detectar una anomalía cromosómica también se pueden combinar con otros métodos conocidos mejorando de este modo la sensibilidad y especificidad globales del método de detección. Por ejemplo, modelos matemáticos han sugerido que un programa de cribado del primer trimestre combinado que utiliza edad materna (MA), espesor de translucencia nucal (NT), beta-hCG sin suero, y PAPP-A en suero detectarán más del 80% de fetos con síndrome de Down para un índice de ensayo invasivo del 5% (Wald y Hackshaw, Prenat Diagn 17(9):921-9 (1997)). Sin embargo, la combinación de métodos de detección de aneuploidía comúnmente usados combinados con los métodos basados en ácidos nucleicos fetales libres no invasivos descritos en el presente documento pueden ofrecer precisión mejorada con un índice menor de falsos positivos. Se proporcionan ejemplos de métodos diagnósticos combinados en la publicación PCT número WO2008157264A2. Los métodos descritos en el presente documento se pueden combinar con métodos basados en células, en donde las células fetales se obtienen de forma invasiva o no invasiva.
Un riesgo aumentado para una anomalía cromosómica se basa en el desenlace o resultado(s) producido de las composiciones o métodos proporcionados en el presente documento. Un ejemplo de un desenlace es una desviación del número de copia absoluto euploide o proporción alélica, que indica la presencia de una aneuploidía cromosómica. Este aumento o disminución en el número de copia absoluto o proporción del control estándar indica un riesgo aumentado de tener un feto con una anomalía cromosómica (por ejemplo, trisomía 21). La información referente a un método descrito en el presente documento, tal como un desenlace, resultado, o riesgo de trisomía o aneuploidía, por ejemplo, se puede fijar, traducir, registrar y/o mostrar en cualquier medio adecuado. Por ejemplo, un desenlace se puede fijar en un medio para guardar, almacenar, compartir, comunicar o analizar de otra manera el
desenlace. Un medio puede ser tangible (por ejemplo, papel) o intangible (por ejemplo, medio electrónico), y los ejemplos de medios incluyen, pero no están limitados a, medios informáticos, bases de datos, gráficos, gráficos del paciente, registros, registros del paciente, gráficas y tables, y cualquier otro medio de expresión. La información algunas veces se almacena y/o traduce en forma legible por ordenador y algunas se almacena y organiza en bases de datos. La información se puede transferir de una localización a otra usando un medio físico (por ejemplo, papel) o un medio legible por ordenador (por ejemplo, medio de almacenamiento o transmisión óptico y/o magnético, disquete, disco duro, memoria de acceso aleatorio, unidad procesadora de ordenador, señal de facsímil, señal satélite, transmisión en una red o transmisión en la world wide web).
Al practicar toso los aspectos mencionados anteriormente, se puede usar una isla CpG como la secuencia genómica que contiene CpG en algunos casos, mientras que en otros casos la secuencia genómica que contiene CpG puede no ser una isla CpG.
También se proporciona en el presente documento un kit para realizar los métodos descritos en el presente documento. Un componente del kit es un agente de unión sensible a metilación.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Muestra el diseño de la proteína MBD-Fc recombinante usada para separar ADN diferencialmente metilado.
Figura 2: Muestra que la proteína de tipo anticuerpo de unión de metil-CpG tiene una alta afinidad y alta avidez hacia su “antígeno”, que es preferiblemente ADN que está metilado en dinucleótidos CpG.
Figura 3: Muestra que el dominio de unión a metilo de MBD-FC se une a todas las moléculas de ADN independientemente de su estado de metilación. La fuerza de esta interacción proteína/ADN se define por el nivel de metilación de ADN. Después de unirse a ADN genómico, se pueden usar soluciones eluato de concentraciones de sal crecientes para fraccionar ADN no metilado y metilado permitiendo una separación controlada.
Figura 4: Muestra el experimento usado para identificar ADN diferencialmente metilado de un feto y madre usando la proteína MBD-Fc recombinante y una micromatriz.
Figura 5: Muestra resultados típicos generados por el método EpiTYPER™ de Sequenom®, que se usó para validar los resultados generados del experimento ilustrado en la figura 4.
Figura 6: muestra la correlación entre las proporciones logarítmicas derivadas de análisis de micromatriz (eje x) y las diferencias de metilación obtenidas por análisis de EpiTYPER (eje y). Cada punto de datos representa la media para una región a lo largo de todas las muestras medidas. El análisis de micromatriz es comparativo en naturaleza porque la fracción muy metilada del ADN materno hibrida junto con la fracción muy metilada de ADN de placenta. Los valores positivos indican mayor metilación de las muestras de placenta. En espectrometría de masas cada muestra se mide individualmente. Primero se calculó la diferencia en metilación restando los valores de metilación materna del valor de metilación de la placenta. Para comparar los resultados con los datos de micromatrices se calculó la media de las diferencias para todos los pares de ADN materno/placenta.
Figura 8: Se muestra la correlación entre el número de moléculas de ADNg que se esperaba y el número de moléculas medidas por PCR competitiva en combinación con análisis por espectrometría de masas. En este experimento se usó ADN derivado de sangre completa (signos más negros) y ADN completamente metilado comercialmente disponible (cruces rojas) en una proporción de 90 a 10. Se usó la proteína de fusión MBD-FC para separar la fracción no metilada y metilada de ADN. Cada fracción se sometió a análisis de PCR cuantitativa con lectura de espectroscopia de masas. El método se ha descrito anteriormente para el análisis de variaciones en el número de copia y está comercialmente disponible para análisis de expresión génica. El enfoque permite la cuantificación absoluta de moléculas de ADN con la ayuda de oligonucleótidos sintéticos de concentración conocida. En este experimento, se dirigió al locus MGMT, que no estaba metilado en la muestra de sangre completa usada aquí. Usando un aporte de 300 copias de ADNg total se espera ver 270 copias de ADN no metilado y 30 copias de ADN metilado. Los números de copia medidos están en gran medida de acuerdo con los valores esperados. El punto de datos a 600 copias de ADN aportado indica un sesgo en la reacción y muestra que este experimento de prueba de concepto inicial necesita seguirse con más trabajo de desarrollo, antes de que el ensayo se pueda usar. Sin embargo, estos datos iniciales indican la viabilidad de este enfoque para capturar y cuantificar unas pocas copias de ADN metilado en presencia de un exceso de especies de ADN sin metilar.
Figura 9A-9C: Se muestran gráficos de barras de las diferencias en metilación obtenidas de análisis de micromatriz (barras oscuras) y el análisis de espectrometría de masas (barras grises claras) con respecto a su localización genómica. Para cada una de las 85 regiones que se identificó que estaban diferencialmente metiladas por micromatriz se proporcionar un gráfico individual. El eje x de cada gráfico muestra la posición cromosómica de la región. El eje y representa la proporción logarítmica (en el caso de las micromatrices) y las diferencias en metilación (en el caso de los resultados de espectrometría de masas). Para las micromatrices cada sonda de hibridación en el
área se muestra como una única barra negra (o gris oscuro). Para los resultados de espectrometría de masas cada sitio CpG se muestra como una barra gris clara. Las barras que muestran valores mayores de cero indican mayor metilación de ADN en las muestras de placenta comparado con el ADN materno. Para algunos genes las diferencias son pequeñas (es decir, RB1 o DSCR6), pero aun estadísticamente significativas. Esas regiones serían menos adecuadas para estrategia de enriquecimiento de ADN fetal.
Figura 10: Muestra un ejemplo del método cuantificador fetal. El ácido nucleico materno se digiere selectivamente y el ácido nucleico fetal restante se cuantifica usando un competidor de concentración conocida. En este esquema, el analito se separa y cuantifica por un espectrómetro de masas.
Figura 11: Muestra un ejemplo del método diagnóstico fetal basado en metilación. El ácido nucleico materno se digiere selectivamente y el ácido nucleico fetal restante se cuantifica para tres cromosomas diferentes (13, 18 y 21). Las partes 2 y 3 de la figura ilustran la distribución de tamaño del ácido nucleico en la muestra antes y después de la digestión. Las reacciones de amplificación pueden ser específicas de tamaño (por ejemplo, amplicones mayores de 100 pares de bases) de modo que favorecen el ácido nucleico fetal más largo, no digerido sobre el ácido nucleico materno digerido, enriqueciendo más de este modo el ácido nucleico fetal. Los espectros en la parte inferior de la figura muestran una cantidad aumentada del ácido nucleico fetal del cromosoma 21 indicativo de trisomía 21.
Figura 12: Muestra el número total de copias genómicas amplificables de cuatro muestras de ADN diferentes aisladas de sangre de mujeres no embarazadas. Cada muestra se diluyó para contener aproximadamente 2500, 1250, 625 o 313 copias por reacción. Cada medida se obtuvo tomando la proporción ADN/competidor media obtenida de dos ensayos de número de copia total (ALB y RNAsaP en la tabla X). Como muestra la figura 12, el número de copia total es preciso y estable a través de diferentes muestras, validando así la utilidad del enfoque basado en competidor.
Figuras 13A y B: Se creó un sistema modelo que contenía un número constante de ADN no metilado materno con cantidades variables de ADN metilado de placenta masculino añadido. A las muestras se les añadió cantidades de placenta masculina que variaban aproximadamente del 0 al 25% relativo al ADN no metilado materno. La fracción de ADN de placenta se calculó usando las proporciones obtenidas de los ensayos de metilación (figura 13A) y el marcador de cromosoma Y (figura 13B) comparado con el ensayo de número de copia total. Los marcadores de metilación y de cromosoma Y se proporcionan en la tabla X.
Figuras 14A y B: Muestran los resultados del ensayo de número de copia total en muestras de plasma. En la figura 14A, se muestra el número de copia para cada muestra. Dos muestras (no. 25 y 26) tienen un número de copia total significativamente mayor que todas las otras muestras. Se obtuvo una media de aproximadamente 1300 copias amplificables/ml de plasma (intervalo 766-2055). La figura 14B muestra un diagrama de caja y bigotes de los valores dados, resumiendo los resultados.
Figuras 15A y B: Se representan la cantidad (o números de copia) de ácido nucleico fetal de 33 muestras de plasma diferentes tomadas de mujeres embarazadas con fetos masculinos. Los números de copia obtenidos se calcularon usando los marcadores de metilación y los marcadores específicos de cromosoma Y usando los ensayos proporcionados en la tabla X. Como se puede ver en la figura 15B, el diagrama de caja y bigotes de los valores dados indicaba diferencia mínima entre las dos medidas diferentes, validando de esta manera la precisión y estabilidad del método.
Figura 16: Muestra una correlación emparejada entre los resultados obtenidos usando los marcadores de metilación frente al marcador del cromosoma Y de la figura 15A.
Figura 17: Muestra la eficacia de digestión de las enzimas de restricción usando la proporción de digestión para el control frente al competidor y comprando este valor con los ensayos de número de copia total media. Aparte de la muestra 26 todas las reacciones indican que la eficacia está por encima del 99%.
Figura 18: Proporciona un método específico para calcular la fracción (o concentración) de ADN fetal en una muestra usando los marcadores específicos de cromosoma Y para embarazos masculinos y la media de la fracción metilada para todos los embarazos (independientemente del sexo del feto).
Figura 19: Proporciona un método específico para calcular la fracción (o concentración) de ADN fetal en una muestra sin los marcadores específicos de cromosoma Y. En su lugar, solo se usaron ensayos para cuantificación de metilación para determinar la concentración del ADN fetal.
Figura 20: Muestra una prueba de t de cálculo de poder para diagnóstico de trisomía 21 simulada usando los métodos descritos en el presente documento. La figura muestra la relación entre el coeficiente de variación (CV) en el eje x y el poder para distinguir las poblaciones del ensayo usando una sencilla prueba de la t (eje y). Los datos indican que en el 99% de todos los casos, se pueden distinguir las dos poblaciones (euploide frente a aneuploide) en un nivel de significancia de 0,001 provisto de un CV del 5% o menos.
Definiciones
El término “trastorno asociado al embarazo”, como se usa en esta solicitud, se refiere a cualquier afección o enfermedad que pueda afectar a una mujer embarazada, el feto, o tanto a la mujer como al feto. Tal afección o enfermedad puede manifestar sus síntomas durante un periodo de tiempo limitado, por ejemplo, durante el embarazo o parto, o puede durar la vida entera del feto después de su nacimiento. Algunos ejemplos de un trastorno asociado al embarazo incluyen embarazo ectópico, preeclampsia, parto prematuro, incompatibilidad de RhD, anomalías cromosómicas fetales tal como trisomía 21 y trastornos fetales genéticamente heredados tal como fibrosis quística, beta-talasemia u otros trastornos monogénicos. Las composiciones y procesos descritos en el presente documento son particularmente útiles para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de trastornos asociados al embarazo con anomalías cuantitativas de ADN fetal en plasma/suero materno, incluyendo, pero no limitados a preeclampsia (Lo et al., Clin. Chem. 45:184-188, 1999 y Zhong et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 184:414-419, 2001), trisomía fetal (Lo et al., Clin. Chem. 45:1747-1751, 1999 y Zhong et al., Prenat. Diagn. 20:795-798, 2000) e hiperémesis gravídica (Sekizawa et al., Clin. Chem. 47:2164-2165, 2001). Por ejemplo, un nivel elevado de ácido nucleico fetal en sangre materna (comparado con un embarazo o embarazos normal(es)) puede ser indicativo de un embarazo preeclámptico. Además, la capacidad para enriquecer ácido nucleico fetal de una muestra materna puede demostrarse particularmente útil para el diagnóstico prenatal no invasivo de enfermedades recesivas autosómicas tal como el caso cuando una madre y un padre comparten una enfermedad idéntica que produce mutación, una aparición previamente percibida como un desafío para el diagnóstico prenatal no de trisomía basado en plasma materno.
El término “anomalía cromosómica” o “aneuploidía” como se usa en el presente documento se refiere a una desviación entre la estructura del cromosoma objeto y un cromosoma homólogo normal. El término “normal” se refiere al cariotipo predominante o patrón de bandas encontrado en individuos sanos de una especie particular, por ejemplo, un genoma euploide (en seres humanos, 46XX o 46XY). Una anomalía cromosómica puede ser numérica o estructural, e incluye, pero no está limitada a, aneuploidía, poliploidía, inversión, una trisomía, una monosomía, duplicación, deleción, deleción de una parte de un cromosoma, adición, adición de una parte de un cromosoma, inserción, un fragmento de un cromosoma, una región de un cromosoma, reorganización cromosómica, y translocación. La anomalía cromosómica también se puede denominar un estado de anomalía cromosómica donde una parte de uno o más cromosomas no es un múltiplo exacto del número haploide habitual debido a, por ejemplo, translocación cromosómica. La translocación cromosómica (por ejemplo, translocación entre el cromosoma 21 y 14 donde parte del cromosoma 14 se sustituye por cromosoma 21 extra) puede producir trisomía 21 parcial. Una anomalía cromosómica se puede correlacionar con la presencia de un estado patológico o con una predisposición a desarrollar un estado patológico. Una anomalía cromosómica se puede detectar por análisis cuantitativo de ácido nucleico.
Los términos “ácido nucleico” y “molécula de ácido nucleico” se pueden usar de forma intercambiable a lo largo de la divulgación. Los términos se refieren a ácidos nucleicos de cualquier composición, tal como ADN (por ejemplo, ADN complementario (ADNc), ADN genómico (ADNg) y similares), ARN (por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ARN inhibidor pequeño (ARNip), ARN ribosómico (ARNr), ARNt, microARN, ARN muy expresado por el feto o la placenta, y similares), y/o análogos de ADN o ARN (por ejemplo, que contienen análogos de bases, análogos de azúcar y/o un esqueleto no nativo, y similares), híbridos ARN/ADN y ácido nucleicos poliamida (ANP), todos los cuales pueden estar en forma mono o bicatenaria, y a menos que se limite de otra manera, puede abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de una manera similar que los nucleótidos naturales. Por ejemplo, los ácidos nucleicos proporcionados en SEQ ID NO: 1-261 (véase las tablas 4A-4C) pueden estar en cualquier forma útil para realizar procesos en el presente documento (por ejemplo, lineal, circular, superenrollada, monocatenaria, bicatenaria y similar) o pueden incluir variaciones (por ejemplo, inserciones, deleciones o sustituciones) que no alteran su utilidad como parte de la presente divulgación. Un ácido nucleico puede ser, o puede ser de, un plásmido, fago, secuencia que se replica autónomamente (ARS), centrómero, cromosoma artificial, cromosoma, u otros ácidos nucleicos capaces de replicarse o ser replicados in vitro o en una célula huésped, una célula, un núcleo celular o citoplasma de una célula. Un ácido nucleico molde puede ser de un único cromosoma (por ejemplo, una muestra de ácido nucleico puede ser de un cromosoma de una muestra obtenida de un organismo diploide). A menos que se limite específicamente, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares que el ácido nucleico de referencia y se metabolizan de una manera similar a nucleótidos naturales. A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular también abarca implícitamente variantes conservadoramente modificadas de la misma (por ejemplo, sustituciones de codón degenerados), alelos, ortólogos, polimorfismos de nucleótido único (SNP), y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, las sustituciones de codón degenerado se pueden lograr generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) se sustituye con bases mezcladas y/o residuos de desoxiinosina (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); y Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:9198 (1994)). El término ácido nucleico se usa de forma intercambiable con locus, gen, ADNc, y ARNm codificado por un gen. El término también puede incluir, como equivalentes, derivados, variantes y análogos de ARN o ADN sintetizados de análogos de nucleótidos, polinucleótidos monocatenarios (“sentido” o “antisentido”, hebra “más” o hebra “menos”, marco de lectura “directo” o marco de lectura “inverso”) y bicatenarios. Los desoxirribonucleótidos incluyen desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxiguanosina y desoxitimidina. Para ARN, la base citosina se sustituye
con uracilo. Un ácido nucleico molde se puede preparar usando un ácido nucleico obtenido de un sujeto como molde.
Un “ácido nucleico que comprende uno o más sitios CpG” o una “secuencia genómica que contiene CpG” como se usa en el presente documento se refiere a un segmento de secuencia de ADN en una localización definida en el genoma de un individuo tal como un feto humano o una mujer embarazada. Típicamente, una “secuencia genómica que contiene CpG” tiene al menos 15 nucleótidos de longitud y contiene al menos una citosina. Puede tener al menos 30, 50, 80, 100, 150, 200, 250, o 300 nucleótidos de longitud y contener al menos 2, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 citosinas. Para cualquier “secuencia genómica que contiene CpG” en una localización determinada, por ejemplo, en una región que se centra alrededor de un locus genético determinado (véanse las tablas 1A-1C), pueden existir variaciones en la secuencia de nucleótidos de individuo a individuo y de alelo a alelo incluso para el mismo individuo. Típicamente, tal región que se centra alrededor de un locus genético determinado (por ejemplo, una isla CpG) contiene el locus, así como secuencias anteriores y/o posteriores. Cada una de la secuencia anterior y/o posterior (contando desde el límite 5’ o 3’ del locus genético, respectivamente) puede ser tan larga como 10 kb, en otros casos puede ser tan larga como 5 kb, 2 kb, 1 kb, 500 pb, 200 pb, o 100 pb. Además, una “secuencia genómica que contiene CpG” puede abarcar una secuencia de nucleótidos transcrita o no transcrita para la producción de proteína, y la secuencia de nucleótidos puede ser una secuencia intergénica, secuencia intragénica, secuencia codificante de proteína, una secuencia no codificante de proteína (tal como un promotor de transcripción), o una combinación de las mismas.
Como se usa en el presente documento, un “nucleótido metilado” o una “base nucleotídica metilada” se refiere a la presencia de una fracción metilo en una base nucleotídica, donde la fracción metilo no está presente en una base nucleotídica típica reconocida. Por ejemplo, la citosina no contiene una fracción metilo en su anillo de pirimidina, pero 5-metilcitosina contiene una fracción metilo en la posición 5 de su anillo de pirimidina. Por tanto, citosina no es un nucleótido metilado y 5-metilcitosina es un nucleótido metilado. En otro ejemplo, timina contiene una fracción metilo en la posición 5 de su anillo de pirimidina, sin embargo, para los fines en el presente documento, timina no se considera un nucleótido metilado cuando está presente en ADN ya que timina es una base nucleotídica típica del ADN. Las bases de nucleósidos típicas para ADN son timina, adenina, citosina y guanina. Las bases típicas para ARN son uracilo, adenina, citosina y guanina. Correspondientemente un “sitio de metilación” es la localización en la región de ácido nucleico génico diana donde la metilación se ha, o tiene la posibilidad de producirse. Por ejemplo, una localización que contiene CpG es un sitio de metilación en donde la citosina puede o no estar metilada.
Como se usa en el presente documento, un “sitio CpG” o “sitio de metilación” es un nucleótido en un ácido nucleico que es susceptible a metilación sea por sucesos naturales in vivo o por un suceso instituido para metilar químicamente el nucleótido in vitro.
Como se usa en el presente documento, una “molécula de ácido nucleico metilada” se refiere a una molécula de ácido nucleico que contiene uno o más nucleótidos metilados que está(n) metilado(s).
Una “isla CpG” como se usa en el presente documento describe un segmento de secuencia de ADN que comprende una densidad de CpG funcional o estructuralmente desviada. Por ejemplo, Yamada et al. (Genome Research 14:247-266, 2004) han descrito un conjunto de estándares para determinar una isla CpG: debe tener al menos 400 nucleótidos de longitud, tiene un contenido en GC mayor del 50%, y una proporción OCF/ECF mayor de 0,6. Otros (Takai et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:3740-3745, 2002) han definido una isla CpG de forma menos rigurosa como una secuencia de al menos 200 nucleótidos de longitud, que tiene un contenido en GC mayor del 50% y una proporción OCF/ECF mayor de 0,6.
El término “condición epigenética” o “estado epigenético” como se usa en el presente documento se refiere a cualquier característica estructural a nivel molecular de un ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) diferente de la secuencia de nucleótidos primaria. Por ejemplo, el estado epigenético de un ADN genómico puede incluir su estructura secundaria o terciaria determinada o influida por, por ejemplo, su patrón de metilación o su asociación con proteínas celulares.
El término “perfil de metilación”, “estado de metilación” o “condición de metilación”, como se usa en el presente documento para describir el estado de metilación de una secuencia genómica, se refiere a las características de un segmento de ADN en un locus genómico particular relevante a metilación. Tales características incluyen, pero no están limitadas a, si cualquiera de los residuos de citosina (C) en su secuencia de ADN están metilados, localización del/los residuo(s) de C metilado(s), porcentaje de C metilado en cualquier tramo particular de residuos, y diferencias alélicas en metilación debido a, por ejemplo, diferencia en el origen de los alelos. El término “perfil de metilación”, o “estado de metilación” también se refiere a la concentración relativa o absoluta de C metilada o C sin metilar en cualquier tramo particular de residuos en una muestra biológica. Por ejemplo, si el/los residuo(s) de citosina (C) en una secuencia de ADN están metilados se puede denominar como “hipermetilada”; mientras que si el/los residuo(s) de citosina (C) en una secuencia de ADN no están metilados se puede denominar “hipometilada”. Asimismo, si el/los residuo(s) de citosina (C) en una secuencia de ADN (por ejemplo, ácido nucleico fetal) están metilados comparados con otra secuencia de una región diferente o de un individuo diferente (por ejemplo, relativo al ácido nucleico materno), esa secuencia se considera hipermetilada comparada con la otra secuencia. Alternativamente, si el/los
residuo(s) de citosina (C) en una secuencia de ADN no están metilados comparados con otra secuencia de una región diferente o de un individuo diferente (por ejemplo, la madre), esa secuencia se considera hipometilada comparada con la otra secuencia. Se dice que estas secuencias están “diferencialmente metiladas”, y más específicamente, cuando el estado de metilación se diferencia entre madre y feto, las secuencias se consideran “ácido nucleico materno y fetal diferencialmente metilados”.
El término “agente que se une a nucleótidos metilados” como se usa en el presente documento se refiere a una sustancia que es capaz de unirse a ácido nucleico metilado. El agente puede ser natural o sintético, y puede estar modificado o sin modificar. El agente puede permitir la separación de diferentes especies de ácidos nucleicos según sus estados de metilación respectivos. Un ejemplo de un agente que se une a nucleótidos metilados se describe en la solicitud de patente PCT No. PCT/EP2005/012707, que se publicó como WO06056480A2. El agente descrito es un polipéptido bifuncional que comprende el dominio de unión a ADN de una proteína que pertenece a la familia de proteínas de unión de metil-CpG (MBD) y una porción Fc de un anticuerpo (véase la figura 1). La proteína de tipo anticuerpo que se une a metil-CpG recombinante se puede unir preferiblemente a ADN metilado en CpG de una manera similar a anticuerpos. Esto significa, que la proteína de tipo anticuerpo que se une a metil-CpG tiene alta afinidad y alta avidez hacia su “antígeno”, que es preferiblemente ADN que está metilado en dinucleótidos CpG. El agente también puede ser una MBD multivalente (véase la figura 2).
El término “polimorfismo” como se usa en el presente documento se refiere a una variación de secuencia en diferentes alelos de la misma secuencia genómica. Una secuencia que contiene un polimorfismo se considera “secuencia polimórfica”. La detección de uno o más polimorfismo permite la diferenciación de diferentes alelos de una única secuencia genómica o entre dos o más individuos. Como se usa en el presente documento, el término “marcador polimórfico” o “secuencia polimórfica” se refiere a segmentos de ADN genómico que muestran variación heredable en una secuencia de ADN entre individuos. Tales marcadores incluyen, pero no están limitados a, polimorfismos de nucleótidos únicos (SNP), polimorfismos de longitud de fragmento de restricción (RFLP), repeticiones en tándem cortas, tal como repeticiones de di-tri-o tetranucleótidos (STR), y similares. Los marcadores polimórficos según la presente divulgación se pueden usar para diferenciar específicamente entre un alelo materno y paterno en la muestra de ácido nucleico fetal enriquecido.
Los términos “polimorfismo de nucleótido único” o “SNP” como se usan en el presente documento se refieren a la variación de secuencia polinucleotídica presente en un único residuo de nucleótido en diferentes alelos de la misma secuencia genómica. Esta variación se puede producir en la región codificante o región no codificante (es decir, en el promotor o región intrónica) de una secuencia genómica, si la secuencia genómica se transcribe durante la producción de proteínas. La detección de uno o más SNP permite la diferenciación de diferentes alelos de una única secuencia genómica o entre dos o más individuos.
El término “alelo” como se usa en el presente documento es una de varias formas alternativas de un gen o regiones no codificantes de ADN que ocupan la misma posición en un cromosoma. El término alelo se puede usar para describir ADN de cualquier organismo incluyendo, pero no limitado a, bacterias, virus, hongos, protozoos, mohos, levaduras, plantas, humanos, no humanos, animales, y arqueobacterias.
Los términos “proporción de los alelos” o “proporción alélica” como se usan en el presente documento se refieren a la proporción de la población de un alelo y la población del otro alelo en una muestra. En algunos casos trisómicos, es posible que un feto pueda ser trialélico para un locus particular. En tales casos, el término “proporción de los alelos” se refiere a la proporción de la población de cualquier alelo frente a uno de los otros alelos, o cualquier alelo frente a los otros dos alelos.
El término “método cuantitativo no basado en polimorfismo” como se usa en el presente documento se refiere a un método para determinar la cantidad de un analito (por ejemplo, ácido nucleico total, ácido nucleico del cromosoma Y,
o ácido nucleico fetal) que no requiere el uso de un marcador o secuencia polimórfica. Aunque puede estar presente un polimorfismo en la secuencia, dicho polimorfismo no se requiere para cuantificar la secuencia. Los ejemplos de métodos cuantitativos no basados en polimorfismo incluyen, pero no están limitados a, RT-PCR, PCR digital, métodos basados en matrices, métodos de secuenciación, métodos basados en nanoporos, métodos de conteo basados en ácido nucleico unidos a bolas y métodos basados en competidores en donde uno o más competidores se introducen a una concentración(es) conocida(s) para determinar la cantidad de uno o más analitos. Algunos de los métodos ejemplares anteriores (por ejemplo, secuenciación) pueden necesitar ser modificados o diseñados activamente de modo que no se interrogan uno o más polimorfismos.
Los términos “cantidad absoluta” o “número de copia” como se usan en el presente documento se refieren a la cantidad de un analito (por ejemplo, ácido nucleico total o ácido nucleico fetal). La presente divulgación proporciona composiciones y procesos para determinar la cantidad absoluta del ácido nucleico fetal en una muestra materna mixta. La cantidad absoluta o número de copia representa el número de moléculas disponibles para detección, y se puede expresar como los equivalentes genómicos por unidad. El término “concentración” se refiere a la cantidad o proporción de una sustancia en una mezcla o solución (por ejemplo, la cantidad de ácido nucleico fetal en una muestra materna que comprende una mezcla de ácido nucleico fetal y materno). La concentración se puede expresar como un porcentaje, que se usa para expresar cómo de grande/pequeña es una cantidad, relativa a otra
cantidad como una fracción de 100. Las plataformas para determinar la cantidad de un analito (por ejemplo, ácido nucleico diana) incluyen, pero no están limitadas a, espectrometría de masas, PCR digital, secuenciación por plataformas de síntesis (por ejemplo, pirosecuenciación), espectroscopía de fluorescencia y citometría de flujo.
El término “muestra” como se usa en el presente documento se refiere a un espécimen que contiene ácido nucleico. Los ejemplos de muestras incluyen, pero no están limitados a, tejido, líquido corporal (por ejemplo, sangre, suero, plasma, saliva, orina, lágrimas, líquido peritoneal, líquido ascítico, secreción vaginal, líquido del pecho, leche de las mamas, líquido linfoide, líquido cefalorraquídeo o secreción de mucosa), sangre del cordón umbilical, vellosidades coriónicas, líquido amniótico, líquido de linfa, líquido cefalorraquídeo, secreción de mucosa u otro exudado corporal, materia fecal, una célula individual o extracto de tales fuentes que contienen el ácido nucleico de la misma, y estructuras subcelulares tal como mitocondrias, usando protocolos bien establecidos en la técnica.
Se puede obtener ADN fetal de fuentes que incluyen, pero no limitadas a, sangre materna, suero materno, plasma materno, células fetales, sangre de cordón umbilical, vellosidades coriónicas, líquido amniótico, orina, saliva, lavado pulmonar, células o tejidos.
El término “sangre” como se usa en el presente documento se refiere a una muestra o preparación de sangre de una mujer embarazada o una mujer que se prueba sobre un posible embarazo. El término abarca sangre completa o cualquier fracción de sangre, tal como suero y plasma como se definen convencionalmente.
El término “bisulfito” como se usa en el presente documento abarca todos los tipos de bisulfitos, tal como bisulfito de sodio, que son capaces de convertir químicamente una citosina (C) a un uracilo (U) sin modificar químicamente una citosina metilada y por tanto se puede usar para modificar diferencialmente una secuencia de ADN basado en el estado de metilación del ADN.
Como se usa en el presente documento, un reactivo que “modifica diferencialmente” ADN metilado o sin metilar abarca cualquier reactivo que modifica ADN metilado y/o sin metilar en un proceso a través del cual se producen productos distinguibles de ADN metilado y sin metilar, permitiendo de esta manera la identificación del estado de metilación del ADN. Tales procesos pueden incluir, pero no están limitados a, reacciones químicas (tal como una conversión C a U por bisulfito) y tratamiento enzimático (tal como el corte por una endonucleasa dependiente de metilación). Por tanto, una enzima que preferentemente corta o digiere ADN metilado es una capaz de cortar o digerir una molécula de ADN a mucha mayor eficacia cuando el ADN está metilado, mientras que una enzima que preferentemente corta o digiere ADN sin metilar muestra una eficacia significativamente mayor cuando el ADN no está metilado.
Los términos “método no basado en bisulfito” y “método cuantitativo no basado en bisulfito” como se usan en el presente documento se refieren a cualquier método para cuantificar ácido nucleico metilado o sin metilar que no requiere el uso de bisulfito. Los términos también se refieren a métodos para preparar un ácido nucleico que se va a cuantificar que no requiere tratamiento con bisulfito. Los ejemplos de métodos no basados en bisulfito incluyen, pero no están limitados a, métodos para digerir ácido nucleico usando una o más enzimas sensibles a metilación y métodos para separar ácido nucleico usando agentes que se unen a ácido nucleico basado en el estado de metilación.
Los términos “enzimas sensibles de metilo” y “enzimas de restricción sensibles a metilación” son endonucleasas de restricción de ADN que dependen del estado de metilación de su sitio de reconocimiento de ADN para actividad. Por ejemplo, hay enzimas sensibles a metilo que cortan o digieren en su secuencia de reconocimiento de ADN solo si no está metilada. Por tanto, una muestra de ADN sin metilar se cortará en fragmentos más pequeños que una muestra de ADN metilado. Similarmente, una muestra de DAN hipermetilado no se cortará. En contraste, hay enzimas sensibles a metilo que cortan en su secuencia de reconocimiento de ADN solo si está metilada. Como se usa en el presente documento, los términos “romper”, “cortar”, y “digerir” se usan de forma intercambiable.
El término “ácido nucleico diana” como se usa en el presente documento se refiere a un ácido nucleico examinado usando los métodos divulgados en el presente documento para determinar si el ácido nucleico es parte de un trastorno relacionado con el embarazo o anomalía cromosómica. Por ejemplo, un ácido nucleico diana del cromosoma 21 se podría examinar usando los métodos descritos en el presente documento para detectar síndrome de Down.
El término “ácido nucleico control” como se usa en el presente documento se refiere a un ácido nucleico usado como un ácido nucleico de referencia según los métodos divulgados en el presente documento para determinar si el ácido nucleico es parte de una anomalía cromosómica. Por ejemplo, un ácido nucleico control de un cromosoma diferente del cromosoma 21 (en el presente documento denominado “cromosoma de referencia”) podría ser una secuencia de referencia para detectar síndrome de Down. La secuencia control puede tener una cantidad conocida o predeterminada.
El término “específico de secuencia” o “método específico de locus” como se usa en el presente documento se refiere a un método que interroga (por ejemplo, cuantifica) ácido nucleico en una localización específica (o locus) en
el genoma basado en la composición de la secuencia. Los métodos específicos de secuencia o específicos de locus permiten la cuantificación de regiones específicas o cromosomas.
El término “gen” significa un segmento de ADN implicado en producir una cadena polipeptídica; incluye regiones que preceden y siguen a la región codificante (líder y remolque) implicadas en la transcripción/traducción del producto génico y la regulación de la transcripción/traducción, así como las secuencias intermedias (intrones) entre los segmentos codificantes individuales (exones).
En esta solicitud, los términos “polipéptido”, “péptido” y “proteína” se usan de forma intercambiables en el presente documento para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos es un mimético químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos naturales y polímero de aminoácidos no naturales. Como se usa en el presente documento, los términos abarcan cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completa (es decir, antígenos), en donde los residuos de aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos covalentes.
El término “aminoácido” se refiere a aminoácidos naturales y sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos naturales. Los aminoácidos naturales son los codificados por el código genético, así como esos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, gamma-carboxiglutamato y O-fosfoserina.
Se puede hacer referencia a aminoácidos en el presente documento mediante los símbolos de tres letras comúnmente sabidos o por los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Asimismo, a los nucleótidos se puede hacer referencia por sus códigos de letra única comúnmente aceptados.
“Cebadores” como se usa en el presente documento se refiere a oligonucleótidos que se pueden usar en un método de amplificación, tal como una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para amplificar una secuencia de nucleótidos basada en la secuencia polinucleotídica correspondiente a una secuencia genómica particular, por ejemplo, una localizada en la isla CpG CGI137, PDE9A o CGI009 en el cromosoma 21, en varios estados de metilación. Al menos uno de los cebadores de PCR para amplificación de una secuencia polinucleotídica es específico de secuencia para la secuencia.
El término “molde” se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico que se puede usar para amplificación en la divulgación. ARN o ADN que no es naturalmente bicatenario se puede hacer en ADN bicatenario de modo que se use como ADN molde. Cualquier ADN bicatenario o preparación que contenga múltiples, diferentes moléculas de ADN bicatenario se pueden usar como ADN molde para amplificar un locus o loci de interés contenido en el ADN molde.
El término “reacción de amplificación” como se usa en el presente documento se refiere a un proceso para copiar ácido nucleico una o más veces. El método de amplificación puede incluir, pero no está limitado a, reacción en cadena de la polimerasa, reacción de secuencia autosostenida, reacción en cadena de la ligasa, amplificación rápida de extremos de ADNc, reacción en cadena de la polimerasa y reacción en cadena de la ligasa, amplificación de fago Q-beta, amplificación por desplazamiento de la hebra, o reacción en cadena de la polimerasa por extensión de solapamiento de ayuste. Una única molécula de ácido nucleico se puede amplificar, por ejemplo, por PCR digital.
El término “sensibilidad” como se usa en el presente documento se refiere al número de verdaderos positivos dividido por el número de verdaderos positivos más el número de falsos negativos, donde la sensibilidad (sens) puede estar en el intervalo de 0 ≤ sens ≤ 1. Idealmente, los métodos descritos en el presente documento tienen el número de falsos negativos igual a cero o cerca de igual a cero, de modo que ningún sujeto se identifica erróneamente como que no tiene al menos una anomalía cromosómica u otro trastorno genético cuando de hecho tienen al menos una anomalía cromosómica u otro trastorno genético. Al contrario, con frecuencia se hace una evaluación de la capacidad de un algoritmo de predicción para clasificar negativos correctamente, una medida complementaria a la sensibilidad. El término “especificidad” como se usa en el presente documento se refiere al número de verdaderos negativos dividido por el número de verdaderos negativos más el número de falsos positivos, donde la sensibilidad (espec) puede estar en el intervalo de 0 ≤ espec ≤ 1. Idealmente, los métodos descritos en el presente documento tienen el número de falsos positivos igual a cero o cerca de igual a cero, de modo que ningún sujeto identificado erróneamente como que tiene al menos una anomalía cromosómica u otro trastorno genético cuando no tienen la anomalía cromosómica u otro trastorno genético que se evalúa. Por tanto, un método que tiene sensibilidad y especificidad igual a uno, o el 100%, a veces se selecciona.
Se pueden usar uno o más algoritmos de predicción para determinar la significancia o dar significado a los datos de detección recogidos en condiciones variables que se pueden ponderar independientemente de o dependientemente entre sí. El término “variable” como se usa en el presente documento se refiere a un factor, cantidad, o función de un algoritmo que tiene un valor o conjunto de valores. Por ejemplo, una variable puede ser el diseño de un conjunto de especies de ácido nucleico amplificado, el número de conjuntos de especies de ácido nucleico amplificado,
porcentaje de contribución genética fetal ensayada, porcentaje de contribución genética materna ensayada, tipo de anomalía cromosómica ensayada, tipo de trastorno genético ensayado, tipo de anomalías ligadas al sexo ensayadas, la edad de la madre y similares. El término “independiente” como se usa en el presente documento se refiere a no estar influido o no estar controlado por otro. El término “dependiente” como se usa en el presente documento se refiere a estar influido o controlado por otro. Por ejemplo, un cromosoma particular y un suceso de trisomía que se produce para ese cromosoma particular que produce un ser viable son variables que son dependientes entre sí.
Un experto en la materia puede usar cualquier tipo de método o algoritmo de predicción para dar significancia a los datos de la presente divulgación en una sensibilidad y/o especificidad aceptable. Por ejemplo, se pueden usar algoritmos de predicción tal como la prueba de chi cuadrado, prueba de la z, prueba de la t, ANOVA (análisis de varianza), análisis de regresión, redes neurales, lógica difusa, modelos ocultos de Markov, estimación del estado de modelo múltiple, y similares. Uno o más métodos o algoritmos de predicción se pueden determinar para dar significancia a los datos que tienen diferentes variables independientes y/o dependientes de la presente divulgación. Y se pueden determinar uno o más métodos o algoritmos de predicción para no dar significancia a los datos que tienen diferentes variables independientes y/o dependientes de la presente divulgación. Se pueden diseñar o cambiar parámetros de las diferentes variables de métodos descritos en el presente documento basado en resultados de uno o más algoritmos de predicción (por ejemplo, número de conjuntos analizados, tipos de especies de nucleótido en cada conjunto). Por ejemplo, aplicar la prueba de chi cuadrado a los datos de detección puede sugerir que intervalos específicos de edad materna se correlacionan con una mayor probabilidad de tener descendencia con una anomalía cromosómica específica, por tanto, la variable edad materna se puede ponderar diferentemente frente a ponderarse igual que otras variables.
Se pueden elegir varios algoritmos para probarse. Estos algoritmos se pueden entrenar con datos sin procesar. Para cada nueva muestra de datos sin procesar, los algoritmos entrenados asignarán una clasificación a esa muestra (es decir, trisomía o normal). Basado en la clasificación de las nuevas muestras de datos sin procesar, los rendimientos de los algoritmos entrenados se pueden evaluar basado en sensibilidad y especificidad. Por último, se puede identificar un algoritmo con la mayor sensibilidad y/o especificidad o combinación de las mismas.
Descripción detallada
Introducción
La presencia de ácido nucleico fetal en plasma materno se describió por primera vez en 1997 y ofrece la posibilidad de diagnóstico prenatal no invasivo simplemente mediante el análisis de una muestra de sangre materna (Lo et al., Lancet 350:485-487, 1997). Hasta la fecha, se han desarrollado numerosas aplicaciones clínicas potenciales. En particular, anomalías cuantitativas de concentraciones de ácido nucleico fetal, por ejemplo, ADN en plasma materno se ha encontrado que están asociadas con un número de trastornos asociados al embarazo, incluyendo preeclampsia, parto prematuro, hemorragia preparto, placentación invasiva, síndrome de Down fetal, y otras aneuploidías cromosómicas fetales. Por tanto, el análisis de ácido nucleico fetal en plasma materno representa un mecanismo poderoso para el seguimiento del bienestar fetomaterno.
Sin embargo, el ADN fetal coexiste con ADN materno de fondo en plasma materno. Por tanto, las aplicaciones más descritas han dependido de la detección de secuencias de cromosoma Y ya que estas son más convenientemente distinguibles del ADN materno. Tal enfoque limita la aplicabilidad de los ensayos existentes a solo el 50% de todos los embarazos, es decir, esos con fetos masculinos. Por tanto, hay mucha necesidad para el desarrollo de composiciones y métodos independientes del sexo para enriquecer y analizar ácido nucleico fetal de una muestra materna. Además, los métodos que dependen en marcadores polimórficos para cuantificar el ácido nucleico fetal pueden ser susceptibles a índices variables de heterocigosidad a través de diferentes grupos étnicos limitando por tanto su aplicabilidad (por ejemplo, aumentando el número de marcadores que se necesitan).
Se ha demostrado previamente que el ADN fetal y materno se pueden distinguir por sus diferencias en el estado de metilación (patente en EE UU No. 6.927.028). La metilación es un fenómeno epigenético, que se refiere a procesos que alteran un fenotipo sin implicar cambios en la secuencia de ADN. Explotando la diferencia en el estado de metilación del ADN entre madre y feto, se puede detectar y analizar con éxito ácido nucleico fetal en un fondo de ácido nucleico materno.
Los presentes inventores proporcionan novedosos polinucleótidos genómicos que están diferencialmente metilados entre ADN fetal del feto (por ejemplo, de la placenta) y el ADN materno de la madre, por ejemplo, de células de sangre periférica. Este descubrimiento proporciona, por tanto, un nuevo enfoque para distinguir ADN genómico fetal y materno y nuevos métodos para cuantificar con precisión ácido nucleico fetal que se puede usar para diagnóstico prenatal no invasivo.
Metodología
Practicar la divulgación utiliza técnicas rutinarias en el campo de la biología molecular. Textos básicos que divulgan los métodos generales de uso en la divulgación incluyen Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3ª ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)).
Para ácidos nucleicos, los tamaños se dan en kilobases (kb) o pares de bases (pb). Estos son estimaciones derivadas de electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida, de ácidos nucleicos secuenciados, o de secuencias de ADN publicadas. Para proteínas, los tamaños se dan en kilodalton (kDa) o números de residuos de aminoácidos. Los tamaños de proteínas se estiman de electroforesis en gel, de proteínas secuenciadas, de secuencias de aminoácidos derivadas o de secuencias de proteínas publicadas.
Los oligonucleótidos que no están comercialmente disponibles se pueden sintetizar químicamente, por ejemplo, según el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descrito primero por Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981), usando un sintetizador automatizado, como se describe en Van Devanter et. al., Nucleic Acids Res. 12: 6159-6168 (1984). La purificación de oligonucleótidos se realiza usando cualquier estrategia reconocida en la técnica, por ejemplo, electroforesis en gel de acrilamida nativa o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de intercambio iónico como se describe en Pearson & Reanier, J. Chrom. 255: 137-149 (1983).
Adquisición de muestras de sangre y extracción de ADN
La presente divulgación también se refiere a separar, enriquecer y analizar ADN fetal encontrado en sangre materna como un medio no invasivo para detectar la presencia y/o para seguir la evolución de una afección o trastorno asociado al embarazo. Por tanto, las primeras etapas de practicar la divulgación son obtener una muestra de sangre de una mujer embarazada y extraer ADN de la muestra.
A. Adquisición de muestras de sangre
Se obtiene una muestra de sangre de una mujer embarazada en una edad gestacional adecuada para ensayar usando un método descrito en el presente documento. La edad gestacional adecuada puede variar dependiendo del trastorno ensayado, como se discute posteriormente. La recogida de sangre de une mujer se realiza según el protocolo estándar que hospitales y clínicas generalmente siguen. Se recoge una cantidad apropiada de sangre periférica, por ejemplo, típicamente entre 5-50 ml, y se puede almacenar según procedimiento estándar antes de preparación adicional. Las muestras de sangre se pueden recoger, almacenar o transportar de una manera que conoce el experto en la materia para minimizar la degradación o la calidad del ácido nucleico presente en la muestra.
B. Preparación de muestras de sangre
El análisis del ADN fetal encontrado en sangre materna según la presente divulgación se puede realizar usando, por ejemplo, la sangre completa, suero o plasma. Los métodos para preparar suero o plasma de sangre materna son bien conocidos entre esos expertos en la materia. Por ejemplo, la sangre de una mujer embarazada se puede colocar en un tubo que contiene EDTA o un producto comercial especializado tal como Vacutainer SST (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) para prevenir la coagulación de la sangre, y el plasma se puede obtener después de la sangre completa mediante centrifugación. Por otra parte, se puede obtener suero con o sin centrifugación después de la coagulación de la sangre. Si se usa centrifugación entonces típicamente, aunque no exclusivamente, se realiza a una velocidad apropiada, por ejemplo, 1.500-3.000 veces g. El plasma o suero se pueden someter a etapas adicionales de centrifugación antes de transferirlos a un tubo nuevo para la extracción de ADN.
Además de la porción acelular de la sangre completa, también se puede recuperar ADN de la fracción celular, enriquecida en la porción de la capa leucocítica, que se puede obtener después de la centrifugación de una muestra de sangre completa de la mujer y eliminación del plasma.
C. Extracción de ADN
Hay numerosos métodos conocidos para extraer ADN de una muestra biológica incluyendo sangre. Se pueden seguir los métodos generales de preparación de ADN (por ejemplo, descritos en Sambrook y Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3ª ed. 2001); varios reactivos o kits comercialmente disponibles, tal como Qiagen's QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit, QiaAmp DNA Mini Kit o QiaAmp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemania), GenomicPrep™ Blood DNA Isolation Kit (Promega, Madison, Wis.), y GFXTM Genomic Blood DNA Purification Kit (Amersham, Piscataway, N.J.), también se pueden usar para obtener ADN de una muestra de sangre de una mujer embarazada. También se pueden usar combinaciones de más de uno de estos métodos.
La muestra se puede primero enriquecer o enriquecer relativamente para ácido nucleico fetal por uno o más métodos. Por ejemplo, la distinción de ADN fetal y materno se puede realizar usando las composiciones y procesos descritos en el presente documento solos o en combinación con otros factores de distinción. Los ejemplos de estos factores incluyen, pero no están limitados a, diferencias de nucleótidos únicos entre cromosoma X e Y, secuencias
específicas del cromosoma Y, polimorfismos localizados en otro sitio en el genoma, diferencias de tamaño entre ADN fetal y materno y diferencias en el patrón de metilación entre tejidos maternos y fetales.
Otros métodos para enriquecer una muestra para una especie particular de ácido nucleico se describen en la solicitud de patente PCT número PCT/US07/69991, presentada el 30 de mayo, 2007, solicitud de patente PCT número PCT/US2007/071232, presentada el 15 de junio, 2007, solicitud de patente PCT número PCT/EP05/012707, presentada el 28 de noviembre, 2005. El ácido nucleico materno se puede eliminar selectivamente (sea parcial, sustancial, casi por completo o completamente) de la muestra.
Separación de ácido nucleico específica de metilación
Los métodos proporcionados en el presente documento ofrecen un enfoque alternativo para el enriquecimiento de ADN fetal basado en la separación específica de metilación de ADN diferencialmente metilado. Se ha descubierto recientemente que muchos genes implicados en regulación del desarrollo están controlados mediante epigenética en células madre embrionarias. En consecuencia, se puede esperar que múltiples genes muestren metilación diferencial de ADN entre ácido nucleico de origen fetal y origen materno. Una vez se identifican estas regiones, se puede usar una técnica para capturar ADN metilado para enriquecer específicamente ADN fetal. Para la identificación de regiones diferencialmente metiladas, se usó un enfoque novedoso para capturar ADN metilado. Este enfoque usa una proteína, en la que el dominio de unión a metilo de MBD2 se fusiona al fragmento Fc de un anticuerpo (MBD-FC) (Gebhard C, Schwarzfischer L, Pham TH, Schilling E, Klug M, Andreesen R, Rehli M (2006) Genomewide profiling of CpG methylation identifies novel targets of aberrant hypermethylation in myeloid leukemia. Cancer Res 66:6118-6128). Esta proteína de fusión tiene varias ventajas sobre anticuerpos específicos de metilación convencionales. La MBD-FC tiene mayor afinidad hacia ADN metilado y se une a ADN bicatenario. De forma importante las dos proteínas se diferencian en el modo que se unen a ADN. Los anticuerpos específicos de metilación se unen a ADN estocásticamente, lo que significa que solo se puede obtener una respuesta binaria. El dominio de unión a metilo de MBD-FC, por otra parte, se une a todas las moléculas de ADN independientemente de su estado de metilación. Después de unir ADN genómico, se pueden usar soluciones eluato de concentraciones de sal crecientes para fraccionar ADN sin metilar y metilado permitiendo una separación más controlada (Gebhard C, Schwarzfischer L, Pham TH, Andreesen R, Mackensen A, Rehli M (2006) Rapid and sensitive detection of CpGmethylation using methyl-binding (MB)-PCR. Nucleic Acids Res 34:e82). Consecuentemente este método, llamado inmunoprecipitación metil-CpG (MCIP), no puede solo enriquecer, sino también fraccionar ADN genómico según el nivel de metilación, lo que es particularmente útil cuando la fracción de ADN sin metilar se debe investigar también.
Digestión con enzimas de restricción sensibles a metilación
También se proporcionan en el presente documento composiciones y procesos para determinar la cantidad de ácido nucleico fetal de una muestra materna. La divulgación permite el enriquecimiento de regiones de ácido nucleico fetal en una muestra materna digiriendo selectivamente ácido nucleico de dicha muestra materna con una enzima que digiere selectiva y completa o sustancialmente el ácido nucleico materno para enriquecer la muestra para al menos una región de ácido nucleico fetal. La eficacia de digestión puede ser mayor de aproximadamente el 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%. Después del enriquecimiento, la cantidad de ácido nucleico fetal se puede determinar por métodos cuantitativos que no requieren secuencias polimórficas o tratamiento con bisulfito, ofreciendo de esta manera una solución que funciona igualmente bien para fetos femeninos y a través de diferentes grupos étnicos y conserva el ácido nucleico fetal de bajo número de copia presente en la muestra.
Por ejemplo, hay enzimas sensibles a metilo que preferente o sustancialmente cortan o digieren en su secuencia de reconocimiento de ADN si no está metilada. Por tanto, una muestra de ADN sin metilar se cortará en fragmentos más pequeños que una muestra de ADN metilado. De forma similar, una muestra de ADN hipermetilado no se cortará. En contraste, hay enzimas sensibles a metilo que cortan su secuencia de reconocimiento de ADN solo si está metilada.
Las enzimas sensibles a metilo que digieren ADN sin metilar adecuadas para uso en los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero no están limitadas a, HpaII, HhaI, MaeII, BstUI y AciI. Una enzima que se puede usar es HpaII que corta solo la secuencia CCGG sin metilar. Otra enzima que se puede usar es HhaI que corta solo la secuencia GCGC sin metilar. Ambas enzimas están disponibles de New England Biolabs® Inc. También se pueden usar combinaciones de dos o más enzimas sensibles a metilo que digieren solo ADN sin metilar. Las enzimas adecuadas que digieren solo ADN metilado incluyen, pero no están limitadas a, DpnI, que corta una secuencia de reconocimiento GATC, y McrBC, que pertenece a la familia de proteínas AAA+ y corta ADN que contiene citosinas modificadas y corta en el sitio de reconocimiento 5’… PumC(N40-3000)PumC…3’ (New England Biolabs Inc., Beverly, Mass.).
Los métodos y procedimientos de corte para enzimas de restricción seleccionadas para cortar ADN en sitios específicos los conoce bien el experto en la materia. Por ejemplo, muchos suministrados de enzimas de restricción proporcionan información sobre las condiciones y tipos de secuencias de ADN cortadas por enzimas de restricción específicas, incluyendo New England BioLabs, Pro-Mega Biochems, Boehringer-Mannheim, y similares. Sambrook
et al. (Véase Sambrook et al., Molecular Biology: A laboratory Approach, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989) proporcionan una descripción general de métodos para usar enzimas de restricción y otras enzimas. Las enzimas con frecuencia se usan en condiciones que permitirán el corte del ADN materno con una eficacia de aproximadamente el 95%-100%, preferiblemente con eficacia de aproximadamente el 98%-100%.
Otros métodos para análisis de metilación
Varios procedimientos de análisis de metilación se conocen en la técnica, y se pueden usar junto con la presente divulgación. Estos ensayos permiten la determinación del estado de metilación de una o una pluralidad de islas CpG en una secuencia de ADN. Además, los métodos se pueden usar para cuantificar ácido nucleico metilado. Tales ensayos implican, entre otras técnicas, secuenciación de ADN de ADN tratado con bisulfito, PCR (para amplificación específica de secuencia), análisis por transferencia Southern, y uso de enzimas de restricción sensibles a metilación.
La secuenciación genómica es una técnica que se ha simplificado para análisis de patrones de metilación de ADN y distribución de 5-metilcitosina usando tratamiento con bisulfito (Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:18271831, 1992). Además, se puede usar la digestión con enzimas de restricción de productos de PCR amplificados de ADN convertido con bisulfito, por ejemplo, el método descrito por Sadri & Hornsby (Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996), o COBRA (Análisis Combinado de Bisulfito y Restricción) (Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997).
El análisis COBRA es un ensayo de metilación cuantitativo útil para determinar niveles de metilación de ADN en loci de genes específicos en cantidades pequeñas de ADN genómico (Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997). Brevemente, se usa digestión con enzimas de restricción para revelar diferencias de secuencia dependientes de metilación en productos de PCR de ADN tratado con bisulfito de sodio. Las diferencias de secuencia dependientes de metilación se introdujeron primero en el ADN genómico por tratamiento estándar con bisulfito según el procedimiento descrito por Frommer et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992). La amplificación con PCR del ADN convertido con bisulfito se realiza después usando cebadores específicos para las islas CpG interesadas, seguido por digestión con endonucleasas de restricción, electroforesis en gel, y detección usando sondas de hibridación marcadas, específicas. Los niveles de metilación en la muestra de ADN original están representados por las cantidades relativas de producto de PCR digerido y sin digerir de una manera linealmente cuantitativa a través de un amplio espectro de niveles de metilación de ADN. Además, esta técnica se puede aplicar de forma precisa a ADN obtenido de muestras de tejido embebidas en parafina microdisecadas. Los reactivos típicos (por ejemplo, como se podrían encontrar en un kit basado en COBRA típico) para análisis COBRA pueden incluir, pero no están limitados a: cebadores de PCR para gen específico (o secuencia de ADN alterada por metilación o isla CpG); enzima de restricción y tampón apropiado; oligo de hibridación a gen; oligo de hibridación control; kit de marcaje con quinasa para sonda de oligo; y nucleótidos radiomarcados. Además, los reactivos de conversión con bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kits de recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.
El ensayo MethyLigth™ es un ensayo de metilación cuantitativa de alto rendimiento que utiliza tecnología de PCR en tiempo real basada en fluorescencia (TaqMan.RTM) que no requiere manipulaciones adicionales después de la etapa de PCR (Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999). Brevemente, el proceso MethyLigth™ empieza con una muestra mixta de ADN genómico que se convierte, en una reacción con bisulfito de sodio, a un conjunto mixto de diferencias de secuencia dependiente de metilación según procedimientos estándar (el proceso de bisulfito convierte residuos de citosina sin metilar a uracilo). Se realiza después PCR basada en fluorescencia en una reacción de PCR “sin sesgo” (con cebadores que no solapan con sitios de metilación CpG conocidos), o en una reacción “sesgada” (con cebadores de PCR que solapan con dinucleótidos CpG conocidos). La distinción de secuencia se puede producir o bien al nivel del proceso de amplificación o al nivel del proceso de detección de fluorescencia, o ambos.
El ensayo MethyLigth se puede usar como una prueba cuantitativa para patrones de metilación en la muestra de ADN genómico, en donde la distinción de secuencia se produce al nivel de hibridación de sonda. En esta versión cuantitativa, la reacción de PCR proporciona amplificación sin sesgar en presencia de una sonda fluorescente que solapa con un sitio de metilación putativo particular. Se proporciona un control sin sesgar para la cantidad de ADN aportado mediante una reacción en la que ni los cebadores, ni la sonda solapan ningún dinucleótido CpG. Alternativamente, una prueba cuantitativa para metilación genómica se logra por exploración del conjunto de PCR sesgado con oligonucleótidos control que no “cubren” sitios de metilación conocidos (una versión basada en fluorescencia de la técnica “MSP”), o con oligonucleótidos que cubren potenciales sitios de metilación.
El proceso MethyLigth se puede usar con una sonda “TaqMan” en el proceso de amplificación. Por ejemplo, se trata ADN genómico bicatenario con bisulfito de sodio y se somete a uno o dos conjuntos de reacciones de PCR usando sondas TaqMan.RTM; por ejemplo, con cebadores sesgados y sonda TaqMan.RTM, o cebadores sin sesgar y sonda TaqMan.RTM. La sonda TaqMan.RTM está dualmente marcada con moléculas “indicadora” y “desactivadora” fluorescentes, y se diseña para ser específica para una región de contenido relativamente alto de CG de modo que se funde a una temperatura aproximadamente 10 grados C mayor en el ciclo de PCR que los cebadores directo o
inverso. Esto permite que la sonda TaqMan.RTM permanezca completamente hibridada durante la etapa de hibridación/extensión de PCR. Según la Taq polimerasa sintetiza enzimáticamente una nueva hebra durante la PCR, finalmente alcanzará la sonda TaqMan.RTM hibridada. La actividad endonucleasa 5’ a 3’ de la Taq polimerasa desplazará entonces la sonda TaqMan.RTM digiriéndola para liberar la molécula indicadora fluorescente para la detección cuantitativa de su señal ahora no desactivada usando un sistema de detección fluorescente a tiempo real.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como se podrían encontrar en un kit basado en MethyLigth™ típico) para análisis de MethyLigth.TM pueden incluir, pero no están limitados a: cebadores de PCR para gen específico (o secuencia de ADN alterada por metilación o isla CpG); sondas TaqMan.RTM; tampones y desoxinucleótidos de PCR optimizados; y Taq polimerasa.
La técnica Ms-SNuPE es un método cuantitativo para evaluar diferencias en metilación en sitios CpG específicos basado en tratamiento con bisulfito de ADN, seguido por extensión de cebador de nucleótido único (Gonzalgo & lones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997).
Brevemente, se hace reaccionar ADN genómico con bisulfito de sodio para convertir citosina sin metilar a uracilo mientras se deja 5-metilcitosina sin cambiar. La amplificación de la secuencia diana deseada se realiza después usando cebadores de PCR específicos para ADN convertido con bisulfito, y el producto resultante se aísla y usa como molde para análisis de metilación en el/los sitio(s) CpG de interés.
Se pueden analizar pequeñas cantidades de ADN (por ejemplo, secciones de patología microdisecadas), y evita la utilización de enzimas de restricción para determinar el estado de metilación en sitios CpG.
Los reactivos típicos (por ejemplo, como se podrían encontrar en un kit basado en Ms-SNuPE típico) para análisis por Ms-SnuPE pueden incluir, pero no están limitados a: cebadores de PCR para gen específico (o secuencia de ADN alterada por metilación o isla CpG); tampones y desoxinucleótidos de PCR optimizados; kit de extracción de gel; cebadores control positivo; cebadores Ms-SNuPE para gen específico; tampón de reacción (para la reacción Ms-SNuPE); y nucleótidos radioactivos. Además, los reactivos de conversión de bisulfito pueden incluir: tampón de desnaturalización de ADN; tampón de sulfonación; reactivos o kit de recuperación de ADN (por ejemplo, precipitación, ultrafiltración, columna de afinidad); tampón de desulfonación; y componentes de recuperación de ADN.
MSP (PCR específica de metilación) permite evaluar el estado de metilación de virtualmente cualquier grupo de sitios CpG en una isla CpG, independiente del uso de enzimas de restricción sensibles a metilación (Herman et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996; patente en EE UU No. 5.786.146). Brevemente, el ADN se modifica por bisulfito de sodio que convierte todas las citosinas sin metilar, pero no las metiladas, a uracilo, y posteriormente se amplifica con cebadores específicos para ADN metilado frente a sin metilar. MSP requiere solo pequeñas cantidades de ADN, es sensible al 0,1% de los alelos metilos de un locus de isla CpG determinado, y se puede realizar en ADN extraído de muestras embebidas en parafina. Los reactivos típicos (por ejemplo, como se podrían encontrar en un kit basado en MSP) para análisis por MSP pueden incluir, pero no están limitados a: cebadores de PCR metilados o sin metilar para gen específico (o secuencia de ADN alterada por metilación o isla CpG); tampones y desoxinucleótidos de PCR optimizados, y sondas específicas.
La técnica MCA es un método que se puede usar para cribar patrones de metilación alterados en ADN genómico, y para aislar secuencias específicas asociadas con estos cambios (Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999). Brevemente, se usan enzimas de restricción con diferentes sensibilidades a metilación de citosina en sus sitios de reconocimiento para digerir ADN genómicos de tumores primarios, líneas celulares y tejidos normales, antes de amplificación por PCR arbitrariamente cebada. Los fragmentos que muestran metilación diferencial se clonan y secuencian después de resolver los productos de PCR en geles de poliacrilamida de alta resolución. Los fragmentos clonados se usan después como sondas para análisis de Southern para confirmar metilación diferencial de estas regiones. Los reactivos típicos (por ejemplo, como se podrían encontrar en un kit basado en MCA típico) para análisis por MCA pueden incluir, pero no están limitados a: cebadores de PCR para cebar arbitrariamente ADN genómico; tampones y nucleótidos de PCR, enzimas de restricción y tampones apropiados; oligos o sondas de hibridación de genes; oligos o sondas de hibridación control.
Otro método para analizar los sitios de metilación es un ensayo de extensión de cebador, que incluye una reacción de amplificación por PCR optimizada que produce dianas amplificadas para posterior análisis de genotipado por extensión de cebador usando espectrometría de masas. El ensayo también se puede hacer en multiplex. Este método (particularmente según se refiere a genotipado de polimorfismos de nucleótido único) se describe en detalle en la publicación PCT WO05012578A1 y la publicación en EE UU US20050079521A1. Para análisis de metilación, el ensayo se puede adoptar para detectar cambios de secuencia C a T dependiente de metilación introducido por bisulfito. Estos métodos son particularmente útiles para realizar reacciones de amplificación multiplexadas y reacciones de extensión de cebador multiplexadas (por ejemplo, ensayos de extensión de masa de cebador homogéneo multiplexadas (hME)) en un único pocillo para aumentar más el rendimiento y reducir el coste por reacción para las reacciones de extensión de cebador.
Cuatro métodos adicionales para análisis de metilación de ADN incluyen barrido genómico de puntos de referencia de restricción (RLGS, Costello et al., 2000), análisis de diferencia representacional sensible a metilación (MS-RDA), AP-PCR específico de metilación (MS-AP-PCR) y columna/segregación de dominio de unión a metil-CpG de moléculas parcialmente fundidas (MBD/SPM).
Se describen métodos adicionales de análisis de metilación que se pueden usar junto con la presente divulgación en los siguientes artículos: Laird, P.W. Nature Reviews Cancer 3, 253-266 (2003); Biotechniques; Uhlmann, K. et al. Electrophoresis 23:4072-4079 (2002) -PyroMeth; Colella et al. Biotechniques. Jul 2003;35(1):146-50; Dupont JM, Tost J, Jammes H, y Gut IG. Anal Biochem, Oct 2004; 333(1): 119-27; y Tooke N y Pettersson M. IVDT. Nov 2004;
41.
Amplificación y determinación de secuencias de polinucleótidos
Después de la separación de ácido nucleico de una manera diferencial de metilación, el ácido nucleico se puede someter a análisis basado en secuencia. Además, una vez se determina que una secuencia genómica particular de origen fetal está hipermetilada o hipometilada comparado con el equivalente materno, se puede determinar la cantidad de esta secuencia genómica fetal. Posteriormente, esta cantidad se puede comparar con un valor control estándar y servir como una indicación para el potencial de cierto trastorno asociado al embarazo.
A. Amplificación de secuencias de nucleótidos
En muchos casos, es deseable amplificar una secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento usando cualquiera de varios procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos que se conocen bien en la técnica (enumerados anteriormente y descrito en mayor detalle a continuación). Específicamente, la amplificación de ácido nucleico es la síntesis enzimática de amplicones de ácido nucleico (copias) que contienen una secuencia que es complementaria a una secuencia de ácido nucleico que se amplifica. La amplificación de ácidos nucleicos es especialmente beneficiosa cuando la cantidad de secuencia diana presente en una muestra es muy baja. Amplificando las secuencias diana y detectando el amplicón sintetizado, la sensibilidad de un ensayo se puede mejorar enormemente, ya que se necesitan menos secuencias diana al principio del ensayo para asegurar mejor la detección de ácido nucleico en la muestra que pertenece al organismo o virus de interés.
Una variedad de métodos de amplificación de polinucleótidos están bien establecidos y se usan con frecuencia en investigación. Por ejemplo, los métodos generales de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificación de secuencias de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica y por tanto no se describen en detalle en el presente documento. Para una revisión de métodos, protocolos y principios de PCR en diseñar cebadores, véase, por ejemplo, Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y., 1990. También están disponibles reactivos y protocolos de PCR de vendedores comerciales, tal como Roche Molecular Systems.
Los más habitualmente PCR se lleva a cabo como un proceso automatizado con una enzima termoestable. En este proceso, la temperatura de la mezcla de reacción cicla a través de una región de desnaturalización, una región de hibridación de cebadores y una región de reacción de extensión automáticamente. Máquinas específicamente adaptadas para este fin están comercialmente disponibles.
Aunque la amplificación por PCR de una secuencia polinucleotídica típicamente se usa en practicar la presente divulgación, el experto en la materia reconocerá que la amplificación de una secuencia genómica encontrada en una muestra de sangre materna se puede lograr por cualquier método conocido, tal como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación mediada por transcripción, y replicación de secuencia autosostenida o amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), cada una de las cuales proporciona suficiente amplificación. También se puede usar tecnología de ADN ramificado más recientemente desarrollada para demostrar cualitativamente la presencia de una secuencia genómica particular descrita en el presente documento, que representa un patrón de metilación particular, o para determinar cuantitativamente la cantidad de esta secuencia genómica particular en la sangre materna. Para una revisión de amplificación de señal de ADN ramificado para cuantificación directa de secuencias de ácido nucleico en muestras clínicas, véase, Nolte, Adv. Clin. Chem. 33:201235, 1998.
Las composiciones y procesos descritos en el presente documento también son particularmente útiles cuando se practican con PCR digital. La PCR digital se desarrolló primero por Kalinina y colaboradores (Kalinina et al., "Nanoliter scale PCR with TaqMan detection." Nucleic Acids Research. 25; 1999-2004, (1997)) y desarrollada adicionalmente por Vogelstein y Kinzler (Digital PCR. Proc Natl Acad Sci U S A. 96; 9236-41, (1999)). La aplicación de PCR digital para uso con diagnóstico fetal se describió primero por Cantor et al. (publicación de patente PCT No. W005023091A2) y posteriormente descrita por Quake et al. (publicación de patente en EE UU No. US 20070202525). La PCR digital se aprovecha de amplificación de ácido nucleico (ADN, ADNc o ARN) a nivel de molécula individual, y ofrece un método muy sensible para cuantificar ácido nucleico de bajo número de copia. Fluidigm® Corporation ofrece sistemas para el análisis digital de ácidos nucleicos.
B. Determinación de secuencias de polinucleótidos
Las técnicas para la determinación de la secuencia polinucleotídica también están bien establecidas y se practican ampliamente en el campo de investigación relevante. Por ejemplo, los principios básicos y técnicas generales para la secuenciación de polinucleótidos se describen en varios artículos de investigación y tratados sobre biología molecular y genética recombinante, tal como Wallace et al., anteriormente, Sambrook y Russell, anteriormente, y Ausubel et al., anteriormente. Se pueden usar métodos de secuenciación de ADN rutinariamente practicados en laboratorios de investigación, sean manuales o automatizados, para practicar la presente divulgación. Medios adicionales adecuados para detectar cambios en una secuencia polinucleotídica para practicar los métodos descritos en el presente documento incluyen, pero no están limitados a, espectrometría de masas, extensión de cebador, hibridación de polinucleótidos, PCR en tiempo real, y electroforesis.
El uso de una reacción de extensión de cebador también se puede aplicar en métodos descritos en el presente documento. Una reacción de extensión de cebador opera, por ejemplo, distinguiendo los alelos SNP mediante la incorporación de desoxinucleótidos y/o didesoxinucleótidos a un cebador de extensión de cebador que hibrida con una región adyacente al sitio SNP. El cebador se extiende con una polimerasa. El SNP extendido con cebador se puede detectar físicamente por espectrometría de masas o por una fracción etiqueta tal como biotina. Como el sitio SNP solo se extiende por un desoxinucleótido o didesoxinucleótido complementario que o bien está etiquetado por un marcador específico o genera un producto de extensión de cebador con una masa específica, los alelos SNP se pueden distinguir y cuantificar.
Los ácidos nucleicos con transcripción inversa y amplificados pueden ser ácidos nucleicos modificados. Los ácidos nucleicos modificados pueden incluir análogos de nucleótidos, y pueden incluir un marcador detectable y/o un agente de captura. Los ejemplos de marcadores detectables incluyen sin limitación fluoróforos, radioisótopos, agentes colorimétricos, agentes emisores de luz, agentes quimioluminiscentes, agentes dispersores de luz, enzimas y similares. Los ejemplos de agentes de captura incluyen sin limitación un agente de un par de unión seleccionado de pares anticuerpo/antígeno, anticuerpo/anticuerpo, anticuerpo/fragmento de anticuerpo, anticuerpo/receptor de anticuerpo, anticuerpo/proteína A o proteína G, hapteno/anti-hapteno, biotina/avidina, biotina/estreptavidina, ácido fólico/proteína de unión a folato, vitamina B12/factor intrínseco, grupo reactivo químico/grupo reactivo químico complementario (por ejemplo, sulfhidrilo/maleimida, sulfhidrilo/derivado haloacetilo, amina/isotriocianato, amina/éster succinimidilo, y amina/haluros de sulfonilo), y similares. Los ácidos nucleicos modificados que tienen un agente de captura se pueden inmovilizar a un soporte sólido.
La espectrometría de masas es un método particularmente eficaz para la detección de un polinucleótido descrito en el presente documento, por ejemplo, un amplicón de PCR, un producto de extensión de cebador o una sonda detectora que se corta de un ácido nucleico diana. La presencia de la secuencia polinucleotídica se verifica comparando la masa de la señal detectada con la masa esperada del polinucleótido de interés. La fuerza relativa de la señal, por ejemplo, pico de masa en un espectro, para una secuencia polinucleotídica particular indica la población relativa de un alelo específico, permitiendo de esta manera el cálculo de la proporción de alelo directamente de los datos. Para una revisión de métodos de genotipado usando el ensayo iPLEX™ estándar y tecnología MassARRAY® de Sequenom®, véase Jurinke, C., Oeth, P., van den Boom, D., "MALDI-TOF mass spectrometry: a versatile tool for high-performance DNA analysis." Mol. Biotechnol. 26, 147-164 (2004); y Oeth, P. et al., "iPLEX™ Assay: Increased Plexing Efficiency and Flexibility for MassARRAY® System through single base primer extension with mass-modified Terminators." SEQUENOM Application Note (2005). Para una revisión de detectar y cuantificar ácido nucleico diana usando sondas detectoras cortables que se cortan durante el proceso de amplificación y se detectan por espectrometría de masas, véase la publicaciò9j de patente en EE UU Número 20080305479.
Las tecnologías de secuenciación están mejorando en términos de rendimiento y coste. Las tecnologías de secuenciación, tal como la alcanzable en la plataforma 454 (Roche) (Margulies, M. et al. 2005 Nature 437, 376-380), Illumina Genome Analyzer (o plataforma Solexa) o sistema SOLiD (Applied Biosystems) o la tecnología de secuenciación de ADN Helicos True Single Molecule (Harris T D et al. 2008 Science, 320, 106-109), la tecnología de molécula única, a tiempo real (SMRT.TM.) de Pacific Biosciences, y secuenciación de nanoporo (Soni GV y Meller A. 2007 Clin Chem 53: 1996-2001), permiten la secuenciación de muchas moléculas de ácido nucleico aisladas de una muestra a altos órdenes de multiplexado de una manera paralela (Dear Brief Funct Genomic Proteomic 2003; 1: 397-416).
Cada una de estas plataformas permite la secuenciación de moléculas únicas clonalmente expandidas o no amplificadas de fragmentos de ácido nucleico. Ciertas plataformas implican, por ejemplo, (i) secuenciación por ligación de sondas modificadas con colorante (incluyendo ligación cíclica y corte), (ii) pirosecuenciación, y (iii) secuenciación de molécula única. Especies de secuencia de nucleótidos, especies de ácidos nucleicos de amplificación y productos detectables generados de los mismos se pueden considerar un “ácido nucleico de estudio” para los fines de analizar una secuencia de nucleótidos mediante tales plataformas de análisis de secuencia.
La secuenciación por ligación es un método de secuenciación de ácido nucleico que depende de la sensibilidad de ADN ligasa para mal emparejamiento de pares de base. La ADN ligasa une extremos de ADN que tienen bases
correctamente emparejadas. Combinar la capacidad de la ADN ligasa para unir extremos de ADN con pares de bases correctamente emparejadas, con conjuntos mixtos de oligonucleótidos o cebadores fluorescentemente marcados, permite la determinación de la secuencia por detección de fluorescencia. Se pueden obtener lecturas de secuencias más largas incluyendo cebadores que contienen enlaces cortables que se pueden cortar después de la identificación del marcador. El corte en el enlazador elimina el marcador y regenera el 5’ fosfato en el extremo del cebador ligado, preparando el cebador para otra ronda de ligación. Los cebadores se pueden marcar con más de un marcador fluorescente (por ejemplo, 1 marcador fluorescente, 2, 3 o 4 marcadores fluorescentes).
Un ejemplo de un sistema que se puede usar por un experto en la materia en secuenciación por ligación en general implica las siguientes etapas. Se pueden preparar poblaciones de bolas clonales en microrreactores de emulsión que contienen ácido nucleico de estudio (“molde”), componentes de reacción de amplificación, bolas y cebadores. Después de la amplificación, los moldes se desnaturalizan y se realiza el enriquecimiento de las bolas para separar bolas con moldes extendidos de bolas no deseadas (por ejemplo, bolas sin moldes extendidos). El molde en las bolas seleccionadas experimenta una modificación en 3’ para permitir la unión covalente al portaobjetos, y las bolas modificadas se pueden modificar en un portaobjetos de vidrio. Cámaras de depósito ofrecen la capacidad de segmentar un portaobjetos en una, cuatro u ocho cámaras durante el proceso de carga de bolas. Para análisis de secuencia, los cebadores hibridan con la secuencia adaptadora. Un conjunto de sondas marcadas con colorantes de cuatro colores compite por ligación al cebador de secuenciación. La especificidad de ligación de la sonda se logra interrogando cada 4ª y 5ª base durante la serie de ligación. De cinco a siete rondas de ligación, detección y corte registran el color cada 5ª posición con el número de rondas determinado por el tipo de genoteca usada. Después de cada ronda de ligación, un nuevo cebador complementario compensado por una base en la dirección 5’ se echa para otra serie de ligaciones. Se repiten el reajuste de cebadores y rondas de ligación (5-7 ciclos de ligación por ronda) secuencialmente cinco veces para generar 25-35 pares de bases de secuencia para una única etiqueta. Con la secuenciación de extremos apareados, este proceso se repite para una segunda etiqueta. Tal sistema se puede usar para amplificar exponencialmente productos de amplificación generados por un proceso descrito en el presente documento, por ejemplo, ligando un ácido nucleico heterólogo al primer producto de amplificación generado por un proceso descrito en el presente documento y realizar amplificación en emulsión usando el mismo o diferente soporte sólido originalmente usado para generar el primer producto de amplificación. Tal sistema también se puede usar para analizar productos de amplificación directamente generados por un proceso descrito en el presente documento evitando un proceso de amplificación exponencial y separando directamente los soportes sólidos descritos en el presente documento en el portaobjetos de vidrio.
La pirosecuenciación es un método de secuenciación de ácidos nucleicos basado en secuenciación por síntesis, que depende de la detección de un pirofosfato liberado en la incorporación de nucleótidos. Generalmente, la secuenciación por síntesis implica sintetizar, un nucleótido cada vez, una hebra de ADN complementaria a la hebra cuya secuencia se busca. Los ácidos nucleicos de estudio se pueden inmovilizar a un soporte sólido, hibridar con un cebador de secuenciación, incubar con ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5’ fosfosulfato y luciferina. Las soluciones de nucleótidos se añaden y eliminan secuencialmente. La incorporación correcta de un nucleótido libera un pirofosfato, que interacciona con ATP sulfurilasa y produce ATP en presencia de adenosina 5’ fosfosulfato, estimulando la reacción de luciferina, que produce una señal quimioluminiscente que permite la determinación de la secuencia.
Un ejemplo de un sistema que puede usar un experto en la materia basado en pirosecuenciación en general implica las siguientes etapas: ligar un ácido nucleico adaptador a un ácido nucleico de estudio e hibridar el ácido nucleico de estudio a una bola; amplificar una secuencia de nucleótidos en el ácido nucleico de estudio en una emulsión; separar las bolas usando un soporte sólido multipocillo de picolitros; y secuencias las secuencias de nucleótidos amplificadas por metodología de pirosecuencación (por ejemplo, Nakano et al., "Single-molecule PCR using waterin-oil emulsion"; Journal of Biotechnology 102: 117-124 (2003)). Tal sistema se puede usar para amplificar exponencialmente productos de amplificación generados por un proceso descrito en el presente documento, por ejemplo, ligando un ácido nucleico heterólogo al primer producto de amplificación generado por un proceso descrito en el presente documento.
Ciertos métodos de secuenciación de moléculas única se basan en el principio de secuenciación por síntesis, y utilizan transferencia de energía de resonancia de fluorescencia de par único (FRET de par único) como mecanismo por el que se emiten fotones como resultado de incorporación de nucleótido con éxito. Los fotones emitidos con frecuencia se detectan usando dispositivos de carga acoplada enfriada intensificada o de alta sensibilidad junto con microscopía de reflexión interna total (TIRM). Solo se emiten fotones cuando la solución de reacción introducida contiene el nucleótido correcto para incorporar a la cadena de ácido nucleico creciente que se sintetiza como resultado del proceso de secuenciación. En la secuenciación de molécula única basada en FRET, la energía se transfiere entre dos colorantes fluorescentes, algunas veces colorantes de polimetino cianina Cy3 y Cy5, mediante interacciones de dipolo de largo alcance. El donante se excita a su longitud de onda de excitación específica y la energía de estado excitado se transfiere, no radiativamente al colorante aceptor, que a su vez se excita. El colorante aceptor finalmente vuelve al estado basal por emisión radiativa de un fotón. Los dos colorantes usados en el proceso de transferencia de energía representan el “par único”, en FRET de par único. Cy3 con frecuencia se usa como el fluoróforo donante y con frecuencia se incorpora como el primer nucleótido marcado. Cy5 con frecuencia se usa como el fluoróforo aceptor y se usa como el marcador de nucleótidos para sucesivas adiciones de nucleótidos
después de la incorporación de un primer nucleótido marcado con Cy3. Los fluoróforos en general están a 10 nanómetros entre sí para que la transferencia de energía se produzca con éxito.
Un ejemplo de un sistema que se puede usar basado en secuenciación de molécula única generalmente implica hibridar un cebador a un ácido nucleico de estudio para generar un complejo; asociar el complejo con una fase sólida; extender iterativamente el cebador por un nucleótido etiquetado con una molécula fluorescente; y capturar una imagen de señales de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia después de cada iteración (por ejemplo, patente en EE UU No. 7.169.314; Braslaysky et al., PNAS 100(7): 3960-3964 (2003)). Tal sistema se puede usar para secuenciar directamente productos de amplificación generados por procesos descritos en el presente documento. El producto de amplificación lineal liberado se puede hibridar con un cebador que contiene secuencias complementarias a secuencias de captura inmovilizadas presentes en un soporte sólido, una bola o portaobjetos de vidrio, por ejemplo. La hibridación de los complejos cebador-producto de amplificación lineal liberado con las secuencias de captura inmovilizadas, inmoviliza los productos de amplificación lineales liberados a soportes sólidos para secuenciación basada en FRET de par único por síntesis. El cebador con frecuencia es fluorescente, de modo que se puede generar una imagen de referencia inicial de la superficie del portaobjetos con ácidos nucleicos inmovilizados. La imagen de referencia inicial es útil para determinar localizaciones en las se produce la verdadera incorporación de nucleótidos. Las señales de fluorescencia detectadas en localizaciones de matriz no inicialmente identificadas en la imagen de referencia de “cebador solo” se desechan como fluorescencia no específica. Después de la inmovilización de los complejos cebador-producto de amplificación lineal liberado, los ácidos nucleicos unidos con frecuencia se secuencian en paralelo por las etapas iterativas de, a) extensión con polimerasa en presencia de un nucleótido fluorescentemente marcado, b) detección de fluorescencia usando microscopía adecuada, TIRM, por ejemplo, c) eliminación de nucleótido fluorescente, y d) vuelta a la etapa a con un nucleótido fluorescentemente marcado diferente.
La secuenciación de nucleótidos puede ser por métodos y procesos de secuenciación de nucleótido único en fase sólida. Los métodos de secuenciación de nucleótido único en fase sólida implican poner en contacto ácido nucleico de muestra y soporte sólido en condiciones en los que una única molécula de ácido nucleico de muestra hibrida con una única molécula en un soporte sólido. Tales condiciones pueden incluir proporcionar las moléculas del soporte sólido y una única molécula de ácido nucleico de muestra en un “microrreactor”. Tales condiciones también pueden incluir proporcionar una mezcla en la que la molécula de ácido nucleico de muestra puede hibridar con el ácido nucleico de fase sólida en el soporte sólido. Los métodos de secuenciación de nucleótido único útiles en los aspectos descritos en el presente documento se describen en el documento PCT/US2009/031169.
Los métodos de detección de secuenciación en nanoporo pueden incluir (a) poner en contacto un ácido nucleico para secuenciación (“ácido nucleico base”, por ejemplo, molécula sonda unida) con detectores específicos de secuencia, en condiciones en las que los detectores hibridan específicamente con subsecuencias sustancialmente complementarias del ácido nucleico base; (b) detectar señales de los detectores; y (c) determinar la secuencia del ácido nucleico base según las señales detectadas. Los detectores hibridados al ácido nucleico base se pueden disociar del ácido nucleico base (por ejemplo, disociar secuencialmente) cuando los detectores interfieren con una estructura de nanoporo según el ácido nucleico base pasa a través de un poro, y los detectores disociados del ácido nucleico base se pueden detectar. Un detector disociado por un ácido nucleico base puede emitir una señal detectable, y el detector hibridado al ácido nucleico base puede emitir una señal detectable diferente o señal no detectable. Los nucleótidos en un ácido nucleico (por ejemplo, molécula de sonda unida) se pueden sustituir con secuencias de nucleótidos específicas correspondientes a nucleótidos específicos (“representativos de nucleótidos”), dando lugar de esta manera a un ácido nucleico expandido (por ejemplo, patente en EE UU No. 6.723.513), y los detectores hibridan con los representativos de nucleótidos en el ácido nucleico expandido, que sirve como un ácido nucleico base. Los representativos de nucleótidos se pueden organizar en una organización de orden binario o superior (por ejemplo, Soni y Meller, Clinical Chemistry 53(11): 1996-2001 (2007)). Un ácido nucleico puede no expandirse, puede no dar lugar a un ácido nucleico expandido, y puede servir directamente como un ácido nucleico base (por ejemplo, una molécula de sonda unida puede servir como un ácido nucleico base no expandido), y los detectores se pueden poner directamente en contacto con el ácido nucleico base. Por ejemplo, un primer detector puede hibridar con una primera subsecuencia y un segundo detector puede hibridar con una segunda subsecuencia, donde el primer detector y el segundo detector tienen cada uno marcadores detectables que se pueden distinguir entre sí, y donde las señales del primer detector y el segundo detector se pueden distinguir entre sí cuando los detectores se disocian del ácido nucleico base. Los detectores pueden incluir una región que hibrida con el ácido nucleico base (por ejemplo, dos regiones), que pueden tener de aproximadamente 3 a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud (por ejemplo, aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, o 95 nucleótidos de longitud). Un detector también puede incluir una o más regiones de nucleótidos que no hibridan con el ácido nucleico base. Un detector puede ser una baliza molecular. Un detector con frecuencia comprende uno o más marcadores detectables independientemente seleccionados de los descritos en el presente documento. Cada marcador detectable se puede detectar por cualquier proceso de detección conveniente capaz de detectar una señal generada por cada marcador (por ejemplo, magnética, eléctrica, química, óptica y similares). Por ejemplo, se puede usar una cámara CD para detectar señales de uno o más puntos cuánticos distinguibles unidos a un detector.
En ciertos análisis de secuencia descritos en el presente documento, se pueden usar lecturas para construir una secuencia de nucleótidos más larga, que se puede facilitar identificando secuencias solapantes en diferentes lecturas y usando secuencias de identificación en las lecturas. Tales métodos y software de análisis de secuencias para construir secuencias más largas a partir de lecturas las conoce el experto en la materia (por ejemplo, Venter et al., Science 291: 1304-1351 (2001)). Lecturas específicas, construcciones de secuencias de nucleótidos parciales, y construcciones de secuencias de nucleótidos completas se pueden comparar entre secuencias de nucleótidos en un ácido nucleico de muestra (es decir, comparación interna) o se pueden comparar con una secuencia de referencia (es decir, comparación de referencia) en ciertos análisis de secuencia descritos en el presente documento. Las comparaciones internas algunas veces se realizan en situaciones donde un ácido nucleico de muestra se prepara de múltiples muestras o de una única fuente de muestra que contiene variaciones de secuencia. Las comparaciones de referencia algunas veces se realizan cuando una secuencia de nucleótidos de referencia se conoce y un objetivo es determinar si un ácido nucleico de muestra contiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente similar o la misma, o diferente, que una secuencia de nucleótidos de referencia. El análisis de secuencia está facilitado por aparatos y componentes de análisis de secuencias conocidos para el experto en la materia.
Los métodos proporcionados en el presente documento permiten la detección de alto rendimiento de especies de ácido nucleico en una pluralidad de ácidos nucleicos (por ejemplo, especies de secuencias de nucleótidos, especies de ácidos nucleicos amplificados y productos detectables generados de los anteriores). Multiplexar se refiere a la detección simultánea de más de una especie de ácido nucleico. Los métodos generales para realizar reacciones multiplexadas junto con espectrometría de masas se conocen (véase, por ejemplo, las patentes en EE UU No. 6.043.031, 5.547.835 y la solicitud internacional PCT No. WO 97/37041). Multiplexar proporciona una ventaja que una pluralidad de especies de ácido nucleico (por ejemplo, algunas con diferentes variaciones de secuencia) se pueden identificar en tan poco como un único espectro de masa, comparado con tener que realizar un análisis de espectrometría de masas para cada especie de ácido nucleico diana particular. Los métodos proporcionados en el presente documento se prestan a procesos de alto rendimiento, altamente automatizados para analizar variaciones de secuencia con alta velocidad y precisión. Los métodos en el presente documento se pueden multiplexar a altos niveles en una única reacción.
El número de especies de ácidos nucleicos multiplexados puede incluir, sin limitación, de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 (por ejemplo, aproximadamente 1-3, 3-5, 5-7, 7-9, 9-11, 11-13, 13-15, 15-17, 17-19, 19-21, 21-23, 23-25, 25-27, 27-29, 29-31, 31-33, 33-35, 35-37, 37-39, 39-41, 41-43, 43-45, 45-47, 47-49, 49-51, 51-53, 5355, 55-57, 57-59, 59-61, 61-63, 63-65, 65-67, 67-69, 69-71, 71-73, 73-75, 75-77, 77-79, 79-81, 81-83, 83-85, 85-87, 87-89, 89-91, 91-93, 93-95, 95-97, 97-101, 101-103, 103-105, 105-107, 107-109, 109-111, 111-113, 113-115, 115117, 117-119, 121-123, 123-125, 125-127, 127-129, 129-131, 131-133, 133-135, 135-137, 137-139, 139-141, 141143, 143-145, 145-147, 147-149, 149-151, 151-153, 153-155, 155-157, 157-159, 159-161, 161-163, 163-165, 165167, 167-169, 169-171, 171-173, 173-175, 175-177, 177-179, 179-181, 181-183, 183-185, 185-187, 187-189, 189191, 191-193, 193-195, 195-197, 197-199, 199-201, 201-203, 203-205, 205-207, 207-209, 209-211, 211-213, 213215, 215-217, 217-219, 219-221, 221-223, 223-225, 225-227, 227-229, 229-231, 231-233, 233-235, 235-237, 237239, 239-241, 241-243, 243-245, 245-247, 247-249, 249-251, 251-253, 253-255, 255-257, 257-259, 259-261, 261263, 263-265, 265-267, 267-269, 269-271, 271-273, 273-275, 275-277, 277-279, 279-281, 281-283, 283-285, 285287, 287-289, 289-291, 291-293, 293-295, 295-297, 297-299, 299-301, 301-303, 303-305, 305-307, 307-309, 309311, 311-313, 313-315, 315-317, 317-319, 319-321, 321-323, 323-325, 325-327, 327-329, 329-331, 331-333, 333335, 335-337, 337-339, 339-341, 341-343, 343-345, 345-347, 347-349, 349-351, 351-353, 353-355, 355-357, 357359, 359-361, 361-363, 363-365, 365-367, 367-369, 369-371, 371-373, 373-375, 375-377, 377-379, 379-381, 381383, 383-385, 385-387, 387-389, 389-391, 391-393, 393-395, 395-397, 397-401, 401-403, 403-405, 405-407, 407409, 409-411, 411-413, 413-415, 415-417, 417-419, 419-421, 421-423, 423-425, 425-427, 427-429, 429-431, 431433, 433-435, 435-437, 437-439, 439-441, 441-443, 443-445, 445-447, 447-449, 449-451, 451-453, 453-455, 455457, 457-459, 459-461, 461-463, 463-465, 465-467, 467-469, 469-471, 471-473, 473-475, 475-477, 477-479, 479481, 481-483, 483-485, 485-487, 487-489, 489-491, 491-493, 493-495, 495-497, 497-501).
Los métodos de diseño para alcanzar espectros de masa resueltos con ensayos multiplexados pueden incluir métodos de diseño de cebadores y oligonucleótidos y métodos de diseño de reacciones. Véase, por ejemplo, los esquemas multiplex proporcionados en las tablas X e Y. Para diseño de cebadores y oligonucleótidos en ensayos multiplexados, aplican las mismas directrices generales para el diseño de cebadores para reacciones uniplexadas, tal como evitar cebado falso y dímeros de cebadores, solo que están implicados más cebadores para reacciones multiplex. Para aplicaciones de espectrometría de masas, los picos de analitos en los espectros de masa para un ensayo se resuelven suficientemente de un producto en cualquier ensayo con el que ese ensayo está multiplexado, incluyendo picos de pausa y cualquier otro pico de subproductos. Además, los picos de analitos óptimamente están en una ventana de masa especificada por el usuario, por ejemplo, en un intervalo de 5.000-8.500 Da. El análisis multiplex se puede adaptar a detección espectrométrica de masa de anomalías cromosómicas, por ejemplo. El análisis multiplex se puede adaptar a varios métodos de secuencias de nucleótido único o basado en nanoporo descritos en el presente documento. Se pueden usar cámaras de microrreacción o dispositivos o matrices o chips comercialmente producidos para facilitar el análisis multiplex, y están comercialmente disponibles.
Detección de aneuploidía fetal
Para la detección de aneuploidías fetales, algunos métodos dependen en medir la proporción entre alelos heredados por vía materna y paternal. Sin embargo, la capacidad de cuantificar cambios cromosómicos está alterada por la contribución materna de ácido nucleicos libres de células, lo que hace necesario disminuir la muestra de ADN materno antes de la medida. Los enfoques prometedores se aprovechan de la diferente distribución de tamaño de ADN fetal y materno o ARN medido que se expresa exclusivamente por el feto (véase, por ejemplo, el documento US20060252071). Asumiendo que el ADN fetal contribuye sólo aproximadamente el 5% de todo el ADN libre de células en el plasma materno, hay una disminución en la diferencia de proporción desde el 1,6% a solo aproximadamente el 1,2% entre una muestra de trisomía y un control sano. Consecuentemente, la detección fiable de cambios en la proporción de alelos requiere enriquecer la fracción fetal de ADN libre de células, por ejemplo, usando las composiciones y métodos descritas en el presente documento.
Algunos métodos dependen en medir la proporción de alelos heredados por vía materna respecto a paterna para detectar aneuploidías cromosómicas fetales en plasma materno. Un conjunto diploide da una proporción 1:1 mientras que las trisomías se pueden detectar como una proporción 2:1. La detección de esta diferencia está alterada por muestreo estadístico debido a la baja abundancia de ADN fetal, presencia de exceso de ADN materno en la muestra de plasma y variabilidad de la técnica de medida. Lo último es abordable usando métodos con alta precisión de medida, como PCR digital o espectrometría de masas. Enriquecer la fracción fetal de ADN libre de células en una muestra actualmente se logra o bien disminuyendo el ADN materno mediante exclusión de tamaño o enfocándose en ácidos nucleicos fetales específicos, como ARN fetal expresado. Otra característica diferenciadora de ADN fetal es su patrón de metilación de ADN. Por tanto, en el presente documento se proporcionan composiciones y métodos novedosos para cuantificar de forma precisa ácido nucleico fetal basado en metilación diferencial entre un feto y madre. Los métodos dependen del análisis del número de copia absoluto sensible para cuantificar la porción de ácido nucleico fetal de una muestra materna, permitiendo de esta manera la detección prenatal de rasgos fetales. Los métodos descritos en el presente documento han identificado aproximadamente 3000 regiones ricas en CpG en el genoma que está diferencialmente metiladas entre ADN materno y fetal. Las regiones seleccionadas mostraron metilación diferencial muy conservada a través de todas las muestras medidas. Además, el conjunto de regiones está enriquecido para genes importantes en regulación de desarrollo, lo que indica que la regulación epigenética de estas áreas es un proceso biológicamente relevante y consistente (véase la tabla 3). El enriquecimiento de ADN fetal se puede lograr ahora usando nuestra proteína MBD-FC para capturar todo el ADN libre de células y después eluir la fracción de ADN muy metilado con altas concentraciones de sal. Usando las fracciones de eluato con baja sal, MBD-Fc es igualmente capaz de enriquecer ADN fetal no metilado.
También se proporcionan en el presente documento 63 regiones genómicas confirmadas en los cromosomas 13, 18 y 21 con niveles de metilación bajos maternos y altos fetales. Después de capturar estas regiones, se pueden usar SNP para determinar las proporciones de alelos anteriormente mencionadas. Cuando se usan SNP de alta frecuencia se tienen que medir aproximadamente 10 marcadores para alcanzar una alta confianza de encontrar al menos un SNP donde los padres tienen genotipos homocigotos opuestos y el hijo tiene un genotipo heterocigoto.
Un método para la detección de anomalías cromosómicas también se proporciona en el presente documento que utiliza cuantificación de número de copia absoluto. Un conjunto de cromosomas diploide mostrará el mismo número de copias para regiones diferencialmente metiladas a través de todos los cromosomas, pero, por ejemplo, una muestra de trisomía 21 mostraría 1,5 veces más copias para regiones diferencialmente metiladas en el cromosoma
21. La normalización de las cantidades de ADN genómico para un conjunto de cromosomas diploide se puede lograr usando cromosomas inalterados como referencia (también proporcionado en el presente documento – véase la tabla 1B). Comparable a otros enfoques, un único marcador es menos probable que sea suficiente para la detección de esta diferencia, porque los números de copia globales son bajos. Típicamente hay aproximadamente de 100 a 200 copias de ADN fetal de 1 ml de plasma materno a 10 a 12 semanas de gestación. Sin embargo, los métodos descritos en el presente documento ofrecen una redundancia de marcadores detectables que permite la distinción muy precisa de conjuntos de cromosomas diploides frente a aneuploides.
Procesamiento de datos e identificación de la presencia o ausencia de una anomalía cromosómica
El término “detección” de una anomalía cromosómica como se usa en el presente documento se refiere a la identificación de un desequilibrio de cromosomas procesando datos que surgen de detectar conjuntos de especies de ácido nucleico amplificados, especies de secuencias de nucleótidos o un producto detectable generado de los anteriores (colectivamente “producto detectable”). Se puede usar cualquier dispositivo y método de detección adecuado para distinguir uno o más conjuntos de productos detectables, como se aborda en el presente documento. Un desenlace que se refiere a la presencia o ausencia de una anomalía cromosómica se puede expresar en cualquier forma adecuada, incluyendo, sin limitación, probabilidad (por ejemplo, cociente de posibilidades, valor p), verosimilitud, porcentaje, valor sobre un umbral, o factor de riesgo, asociado con la presencia de una anomalía cromosómica para un sujeto o muestra. Un desenlace se puede proporcionar con uno o más de sensibilidad, especificidad, desviación estándar, coeficiente de variación (CV) y/o nivel de confianza, o combinaciones de los anteriores.
La detección de una anomalía cromosómica basada en uno o más conjuntos de productos detectables se puede identificar basado en una o más variables calculadas incluyendo, pero no limitadas a, sensibilidad, especificidad,
desviación estándar, coeficiente de variación (CV), un umbral, nivel de confianza, puntuación, probabilidad y/o una combinación de las mismas. (i) El número de conjuntos seleccionados para un método diagnóstico, y/o (ii) la especie de secuencia de nucleótidos particular de cada conjunto seleccionado para un método diagnóstico, se pueden determinar en parte o al completo según una o más de tales variables calculadas.
Uno o más de sensibilidad, especificidad y/o nivel de confianza se pueden expresar como un porcentaje. El porcentaje, independientemente para cada variable, puede ser mayor de aproximadamente el 90% (por ejemplo, aproximadamente el 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% o mayor del 99% (por ejemplo, aproximadamente el 99,5% o mayor, aproximadamente el 99,9% o mayor)). El coeficiente de variación (CV) se puede expresar como un porcentaje, y algunas veces el porcentaje es aproximadamente el 10% o menos (por ejemplo, aproximadamente el 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1% o menor del 1% (por ejemplo, aproximadamente el 0,5% o menos, aproximadamente el 0,1% o menos, aproximadamente el 0,05% o menos, aproximadamente el 0,01% o menos)). Una probabilidad (por ejemplo, que un desenlace particular determinado por un algoritmo no se debe al azar) se puede expresar como valor p, y algunas el valor p es aproximadamente 0,05 o menor (por ejemplo, aproximadamente 0,05, 0,04, 0,03, 0,02 o 0,01, o menor de 0,01 (por ejemplo, aproximadamente 0,001 o menor, aproximadamente 0,0001 o menor, aproximadamente 0,00001 o menor, aproximadamente 0,000001 o menor)).
Por ejemplo, puntuar o una puntuación se puede referir a calcular la probabilidad de que una anomalía cromosómica particular esté realmente presente o ausente en un sujeto/muestra. El valor de una puntuación se puede usar para determinar, por ejemplo, la variación, diferencia, o proporción de producto detectable nucleico amplificado que puede corresponder a la anomalía cromosómica real. Por ejemplo, calcular una puntuación positiva de productos detectables puede producir una identificación de una anomalía cromosómica que es particularmente relevante para análisis de muestras únicas.
Los datos simulados (o simulación) pueden ayudar al procesamiento de datos, por ejemplo, entrenando un algoritmo
o ensayando un algoritmo. Los datos simulados pueden, por ejemplo, implicar varias muestras hipotéticas de diferentes concentraciones de ácido nucleico fetal y materno en suero, plasma, y similares. Los datos simulados se pueden basar en lo que se podría esperar de una población real o pueden estar sesgados para probar un algoritmo y/o asignar una clasificación correcta basado en un conjunto de datos simulados. Datos simulados también se denominan en el presente documento datos “virtuales”. Las contribuciones fetal/materna en una muestra se pueden simular como una tabla o matriz de números (por ejemplo, como una lista de picos correspondientes a las señales de masa de productos de corte de una biomolécula de referencia o secuencia de ácido nucleico amplificada), como un espectro de masa, como un patrón de bandas en un gel, o como una representación de cualquier técnica que mide distribución de masa. Se pueden realizar simulaciones en la mayoría de los casos mediante un programa informático. Una posible etapa en usar un conjunto de datos simulados es evaluar la confianza de los resultados identificados, es decir, cómo de bien los positivos/negativos seleccionados coinciden con la muestra y si hay variaciones adicionales. Un enfoque común es calcular el valor de probabilidad (valor p) que estima la probabilidad de que una muestra aleatoria tenga mejor puntuación que la seleccionada. Como los cálculos del valor p pueden ser prohibitivos en ciertas circunstancias, se puede evaluar un modelo empírico, en el que se asume que al menos una muestra coincide con una muestra de referencia (con o sin variaciones resueltas). Alternativamente, otras distribuciones tal como la distribución de Poisson se pueden usar para describir la distribución de probabilidad.
Un algoritmo puede asignar un valor de confianza a los verdaderos positivos, verdaderos negativos, falsos positivos y falsos negativos calculados. La asignación de una verosimilitud de la aparición de una anomalía cromosómica también se puede basar en un cierto modelo de probabilidad.
Los datos simulados con frecuencia se generan en un proceso in silico. Como se usa en el presente documento, el término “in silico” se refiere a investigación y experimentos realizados usando un ordenador. Los métodos in silico incluyen, pero no están limitados a, estudios de modelado molecular, cariotipado, cálculos genéticos, experimentos de acoplamiento biomolecular, y representaciones virtuales de estructuras y/o procesos moleculares, tal como interacciones moleculares.
Como se usa en el presente documento, una “rutina de procesamiento de datos” se refiere a un proceso, que puede estar incorporado en software, que determina la significación biológica de datos adquiridos (es decir, los resultados finales de un ensayo). Por ejemplo, una rutina de procesamiento de datos puede determinar la cantidad de cada especie de secuencia de nucleótidos basado en los datos recogidos. Una rutina de procesamiento de datos también puede controlar un instrumento y/o una rutina de recogida de datos basado en resultados determinados. Una rutina de procesamiento de datos y una rutina de recogida de datos con frecuencia están integradas y proporcionan retroalimentación para operar la adquisición de datos por el instrumento, y, por tanto, proporcionar métodos de juicio basados en ensayo proporcionados en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, software se refiere a instrucciones de programas legibles por ordenador que, cuando se ejecutan por un ordenador, realizan operaciones informáticas. Típicamente, el software se proporciona en un producto de programa que contiene instrucciones de programa registradas en un medio legible por ordenador incluyendo, pero no limitado a, medios magnéticos incluyendo disquetes, discos duros, y cinta
magnética; y medios ópticos incluyendo, discos CD-ROM, discos DVD, discos magnetópticos, y otros tales medios en que las instrucciones del programa se pueden registrar.
Diferentes métodos de predecir anomalía o normalidad pueden producir diferentes tipos de resultados. Para cualquier predicción determinada, hay cuatro posibles tipos de desenlaces: verdadero positivo, verdadero negativo, falso positivo o falso negativo. El término “verdadero positivo” como se usa en el presente documento se refiere a un sujeto correctamente diagnosticado como que tiene una anomalía cromosómica. El término “falso positivo” como se usa en el presente documento se refiere a un sujeto equivocadamente identificado como que tiene una anomalía cromosómica. El término “verdadero negativo” como se usa en el presente documento se refiere a un sujeto correctamente identificado como que no tiene una anomalía cromosómica. El término “falso negativo” como se usa en el presente documento se refiere a un sujeto equivocadamente identificado como que no tiene una anomalía cromosómica. Se pueden calcular dos medidas de rendimiento para cualquier método determinado basado en las proporciones de estas incidencias: (i) un valor de sensibilidad, la fracción de positivos predichos que se identifican correctamente como que son positivos (por ejemplo, la fracción de conjuntos de secuencias de nucleótidos correctamente identificadas por comparación de nivel detección/determinación como indicativo de anomalía cromosómica, relativo a todos los conjuntos de secuencias de nucleótidos identificados como tal, correcta o incorrectamente), reflejando de esta manera la precisión de los resultados en detectar la anomalía cromosómica; y
(ii) un valor de especificidad, la fracción de negativos predichos correctamente identificados como que son negativos (la fracción de conjuntos de secuencias de nucleótidos correctamente identificadas por comparación de nivel detección/determinación como indicativo de normalidad cromosómica, relativo a todos los conjuntos de secuencias de nucleótidos identificadas como tal, correcta o incorrectamente), reflejando de esta manera precisión de los resultados en detectar la anomalía cromosómica.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración solo y no a modo de limitación. Los expertos en la materia reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que se podrían cambiar o modificar para dar esencialmente los mismos resultados o similares.
En el ejemplo 1 a continuación, los solicitantes usaron una nueva proteína de fusión que captura ADN metilado en combinación con matriz de islas CpG para identificar regiones genómicas que están diferencialmente metiladas entre tejido de placenta fetal y sangre materna. Se usó un enfoque estadístico riguroso para solo seleccionar regiones que muestran poca variación entre las muestras y, por tanto, sugerir un mecanismo biológico subyacente. Se validaron ochenta y cinco regiones genómicas diferencialmente metiladas predominantemente localizadas en los cromosomas 13, 18 y 21. Para esta validación, se usó un enfoque basado en espectrometría de masas cuantitativa que interroga 261 amplicones de PCR que cubren estas 85 regiones. Los resultados están en muy buena concordancia (confirmación del 95%), demostrando la viabilidad del enfoque.
A continuación, los solicitantes proporcionan un enfoque innovador para ensayo de aneuploidía, que depende de la medida de números de copia absolutos más que proporciones de alelos.
Ejemplo 1
En el ejemplo siguiente, se usaron diez muestras emparejadas de ADN materno y placentario para identificar regiones diferencialmente metiladas. Estos resultados se validaron usando un ensayo de metilación cuantitativa basado en espectrometría de masas. Primero, el ADN genómico de capa leucocítica materna y tejido placentario correspondiente se extrajo primero. A continuación, se usó la MBD-FC para capturar la fracción metilada de cada muestra de ADN. Véanse las figuras 1-3. Las dos fracciones de tejido se marcaron con diferentes colorantes fluorescentes y se hibridaron con una micromatriz de isla CpG de Agilent®. Véase la figura 4. Esto se hizo para identificar regiones diferencialmente metiladas que se podrían utilizar para diagnósticos prenatales. Por tanto, se emplearon dos criterios para seleccionar regiones genómicas como potenciales marcadores de enriquecimiento: la diferencia de metilación observada tenía que estar presente en todos los pares de muestras ensayadas, y la región tenía que tener más de 200 pb de longitud.
Preparación y fragmentación de ADN
Se preparó ADN genómico (ADNg) de capa leucocítica materna y tejido placentario usando QlAamp DNA Mini Kit™ y QlAamp DNA Blood Mini Kit™, respectivamente, de Qiagen® (Hilden, Alemania). Para MCIp, se cuantificó ADNg usando el espectrofotómetro NanoDrop ND 1000TM (Thermo Fisher®, Waltham, MA, EE UU). La ultrasonicación de 2,5 µg de ADN en 500 µl de tampón TE a un tamaño medio de fragmento de 300-500 pb se llevó a cabo con el Branson Digital Sonifier 450™ (Danbury, CT, EE UU) usando los siguientes ajustes: amplitud del 20%, tiempo de sonicación 110 segundos, tiempo de pulso encendido/pulso apagado 1,4/0,6 segundos. El intervalo de fragmento se siguió usando electroforesis en gel.
Inmunoprecipitación de metil-CpG
Por muestra, 56 µg de proteína MBD-FC purificada y 150 µl de bolas de proteína A Sepharosa Fast Flow (Amersham Biosciences®, Piscataway, NJ, EE UU) se rotaron en 15 ml de TBS durante la noche a 4ºC. A continuación, las bolas de MBD-Fc (150 µl por ensayo) se transfirieron y dispersaron en dispositivos de filtro centrífugo Ultrafree-CL de 2 ml (Millipore®, Billerica, MA, EE UU) y se lavaron por centrifugación tres veces con tampón A (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, MgCl2 2 mM, EDTA 0,5 mM, NaCl 300 mM, NP-40 al 0,1%). Se añadió ADN sonicado (2 µg) a las bolas MBD-Fc lavadas en 2 ml de tampón A y se rotó durante 3 horas a 4ºC. Las bolas se centrifugaron para recuperar los fragmentos de ADN no unidos (fracción 300 mM) y posteriormente se lavaron dos veces con 600 µl de tampón que contenía concentraciones crecientes de NaCl (400, 500, 550, 600 y 1000 mM). El flujo no retenido de cada paso de lavado se recogió en tubos separados y se desaló usando un MiniElute PCR Purification Kit™ (Qiagen®). En paralelo, se procesaron 200 ng de ADN de entrada sonicado como control usando el MiniElute PCR Purification Kit™ (Qiagen®).
Manejo y análisis de micromatrices
Para generar ADN fluorescentemente marcado para hibridación de micromatriz, las fracciones de NaCl 600 mM y 1 M (enriquecidas en ADN metilado) para cada muestra se combinaron y marcaron con Alexa Fluor 555-aha-dCTP (materna) o Alexa Fluor 647-aha-dCTP (placentaria) usando el BioPrime Total Genomic Labelling System™ (Invitrogen®, Carlsbad, CA, EE UU). La reacción de marcaje se llevó a cabo según el manual del fabricante. Los fragmentos de ADN genómico diferencialmente marcados de pares materno/placentario concordantes se combinaron a un volumen final de 80 µl, suplementados con 50 µg de ADN de Cot-1 (Invitrogen®), 52 µl de reactivo de bloqueo 10X de Agilent (Agilent Tecnologies®, Santa Clara, CA, EE UU), 78 µl de formamida desionizada, y 260 µl de tampón de hibridación 2X de Agilent. Las muestras se calentaron a 95ºC durante 3 min, se mezclaron, y posteriormente se incubaron a 37ºC durante 30 min. La hibridación en Agilent CpG Isalnd Microarray Kit™ se llevó después a cabo a 67ºC durante 40 horas usando una cámara Agilent SureHyb™ y un horno de hibridación Agilent. Los portaobjetos se lavaron en Lavado I (SSPE 6X, N-lauroilsarcosina al 0,005%) a temperatura ambiente durante 5 min y en lavado II (SSPE 0,06X) a 37ºC durante 5 min adicionales. A continuación, los portaobjetos se sumergieron en acetonitrilo y Agilent Ozone Protection Solution™, respectivamente, durante 30 segundos. Se escanearon las imágenes inmediatamente y se analizaron usando un Agilent DNA Microarray Scanner™. Las imágenes de micromatriz se procesaron usando software Feature Extraction v9.5 y el protocolo CGH estándar.
Tratamiento con bisulfito
La conversión con bisulfito de sodio de ADN genómico se realizó usando EZ-96 DNA Methylation Kit™ (ZymoResearch, Orange County, CA). Se siguió el protocolo del fabricante usando 1 µg de ADN genómico y el protocolo de conversión alternativo (una desnaturalización de ADN a dos temperaturas).
Análisis de metilación cuantitativa
Se usó el sistema MassARRAY® de Sequenom para realizar análisis de metilación cuantitativa. Este sistema utiliza espectrometría de masas de desorción ionización laser asistida por matriz tiempo de vuelo (MALDI-TOF) en combinación con corte específico de base de ARN (MassCLEAVE™ de Sequenom®). Se analiza después un patrón detectable para el estado de metilación. Los cebadores de PCR se diseñaron usando EpiDESIGNER™ de Sequenom® (www.epidesigner.com). Se usaron un total de 261 amplicones que cubrían 85 regiones diana para la validación (longitud de amplificación mediana = 367 pb, min = 108, max = 500; número mediano de CpG por amplicón = 23, min = 4, max = 65). Para cada cebador inverso, se añadió una etiqueta de promotor T7 adicional para transcripción in vivo, así como una etiqueta 10mera en el cebador directo para ajustar para diferencias en la temperatura de fusión. La bioquímica MassCLEAVE™ se realizó como se ha descrito previamente (Ehrich M, et al. (2005) Quantitative high-throughput analysis of DNA methylation patterns by base specific cleavage and mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A 102:15785-15790). Se adquirieron espectros de masa usando un MassARRAY™ compact MALDI-TOF (Sequenom®, San Diego) y se generaron proporciones de metilación por el software EpiTIPER™ v1.0 (Sequenom®, San Diego).
Análisis estadístico
Todos los cálculos estadísticos se realizaron usando el paquete de software estadístico R (www.r-project.org). Primero, las sondas de matriz se agruparon basado en su localización genómica. Sondas posteriores que estaban separadas menos de 1000 pb se agruparon. Para identificar regiones diferencialmente metiladas, se usó una muestra control como referencia. En la muestra control, la fracción metilada de un ADN control derivado de sangre se hibridó frente a sí misma. Idealmente esta muestra debe mostrar proporciones log de los dos canales de color alrededor de 0. Sin embargo, debido a la variabilidad en el comportamiento de hibridación, las sondas muestran una proporción log media de 0,02 y una desviación estándar de 0,18. Después las proporciones log observadas en nuestras muestras se compararon a la muestra control. Se usó una prueba de la t bilateral, para datos emparejados para probar la hipótesis NULA que los grupos son idénticos. Los grupos que contenían menos de 4 sondas se excluyeron del análisis. Para grupos que incluyen cuatro o cinco sondas, se usaron todas las sondas en una prueba de la t de datos emparejados. Pata grupos con seis o más sondas, se usó una prueba de ventana deslizante que consistía en cinco sondas a la vez, por lo cual la ventana se movía por incrementos de una sonda. Cada muestra de
prueba se comparó con la muestra control y se registraron los valores p. Se seleccionaron regiones genómicas como que estaban diferencialmente metiladas si ocho de diez muestras mostraron un valor p < 0,01, o si seis de diez muestras mostraron un valor p < 0,001. Las regiones genómicas se clasificaron como que no estaban diferencialmente metiladas cuando el grupo mostró menos de ocho muestras con un valor p < 0,01 y menos de seis muestras con un valor p < 0,001. Las muestras que no estaban en ninguna categoría se excluyeron del análisis. Para un subconjunto de regiones genómicas que se han identificado como diferencialmente metiladas, los resultados se confirmaron usando análisis de metilación cuantitativo.
Se realizó el análisis Go usando la herramienta GOstat en línea (http://gostat.wehi.edu.au/cgibin/-goStat.pl). Se calcularon valores p usando la prueba exacta de Fisher.
Resultados de descubrimiento de marcadores basados en micromatriz
Para identificar regiones diferencialmente metiladas se usó una muestra estándar, en la que la fracción de ADN metilado de monocitos se hibridó frente a sí misma. Este estándar proporcionó una referencia para la variabilidad de medidas fluorescentes en una región genómica. Las regiones diferencialmente metiladas se identificaron después comparando las proporciones log de cada una de las diez muestras placentarias/maternas frente a este estándar. Puesto que el fin de este estudio era identificar marcadores que permitan la separación fiable de ADN materno y fetal, la selección diana se limitó a genes que mostraron una diferencia en metilación estable, consistente a lo largo de un tramo contiguo de ADN genómico. Esto enfocó el análisis en regiones genómicas donde múltiples sondas indicaron metilación diferencial. La selección también se limitó a regiones diana donde todas las muestras mostraron metilación diferencial, excluyendo esas con fuertes diferencias inter-individuales. Dos de las muestras mostraron generalmente menores proporciones log en el análisis de micromatriz. Puesto que se usó una prueba emparejada para selección diana, esto no tuvo impacto negativo en los resultados. Basado en estos criterios de selección, se identificaron 3043 regiones genómicas que estaban diferencialmente metiladas entre ADN materno y fetal. 21778 regiones no mostraron diferencia de metilación. No se observó sesgo intercromosómico en la distribución de regiones diferencialmente metiladas. Las regiones diferencialmente metiladas se localizan cerca de o en 2159 genes conocidos. La mayoría de las regiones diferencialmente metiladas se localizan en el área del promotor (18%) y dentro de la región codificante (68%), mientras que solo pocas regiones se localizan después del gen (7%) o en la transición de promotor a región codificante (7%). Las regiones que no mostraron metilación diferencial mostraron una distribución similar para locaciones de promotor (13%) y posteriores (5%), pero la fracción de regiones localizadas en la transición del promotor a la región codificante era mayor (39%) y la fracción dentro de la región codificante era menor (43%).
Se ha mostrado en células madre embrionarias (ES) que genes a los que se dirige el complejo represivo polycomb 2 (PRC2) están enriquecidos en genes que regulan el desarrollo (Lee TI, et al. (2006) Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells. Cell 125:301-313). También se ha mostrado que genes diferencialmente metilados están enriquecidos en genes a los que se dirige PRC2 en muchos tipos de cáncer (Ehrich M, et al. (2008) Cytosine methylation profiling of cancer cell lines. Proc Natl Acad Sci U S A 105:4844-48). El conjunto de genes identificado como diferencialmente metilado en este estudio también está enriquecido en genes a los que se dirige PRC2 (valor p < 0,001, cociente de posibilidades = 3,6, IC al 95% para cociente de posibilidades = 3,1-4,2). Un análisis GO del conjunto de genes diferencialmente metilados revela que este conjunto está significativamente enriquecido para funciones importantes durante el desarrollo. Seis de las diez funciones más enriquecidas incluyen procesos de desarrollo o morfogénicos [morfogénesis de estructura anatómica (GO:0009653, valor p = 0), procesos de desarrollo (GO:0032502, valor p = 0), desarrollo de organismos multicelulares (GO:0007275, valor p =0), desarrollo de un órgano (GO:0048513, valor p = 0), desarrollo de sistemas (GO:0048731, valor p = 0) y desarrollo de una estructura anatómica (GO:0048856, valor p = 0)].
Validación usando EpiTYPER™ de Sequenom®
Para validar los descubrimientos de micromatriz, 63 regiones de los cromosomas 13, 18 y 21, y 26 regiones adicionales de otros autosomas se seleccionaron para confirmación por una tecnología diferente. La tecnología EpiTYPER™ de Sequenom se usó para medir cuantitativamente la metilación de ADN en muestras maternas y placentarias. Para una explicación de los métodos EpiTYPER™, véase Ehrich M, Nelson MR, Stanssens P, Zabeau M, Liloglou T, Xinarianos G, Cantor CR, Field JK, van den Boom D (2005) Quantitative high-throughput analysis of DNA methylation patterns by base specific cleavage and mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A 102:1578515790). Para cada sitio CpG individual en una región diana, se calculó el valor medio de metilación a través de todas las muestras de ADN materno y a través de todas las muestras de placenta. La diferencia entre la metilación media materna y placentaria se comparó después con los resultados de micromatriz. Los resultados de las dos tecnologías estaban en buena concordancia (véase la figura 7). Para 85 regiones diana los resultados cuantitativos confirman los resultados de micromatriz (tasa de confirmación del 95%). Para 4 regiones diana, todas localizadas en el cromosoma 18, los resultados no se pudieron confirmar. La razón para esta discrepancia actualmente no está clara.
En contraste con las micromatrices, que se enfocan en la identificación de diferencias de metilación, la medida cuantitativa de metilación de ADN permitió el análisis de valores de metilación absolutos. En el conjunto de validación de 85 regiones diferencialmente metiladas confirmadas, un subconjunto de 26 regiones está más metilada
en la muestra de ADN materno y 59 regiones están más metiladas en la muestra placentaria (véase la tabla 1A). De forma interesante, los genes que están hipometilados en las muestras placentarias tienden a mostrar mayores diferencias de metilación que los genes que están hipermetilados en la muestra placentaria (diferencia media de metilación para genes hipometilados = 39%, para genes hipermetilados = 20%).
5 Ejemplo 2
El ejemplo 2 describe un enfoque no invasivo para detectar la cantidad de ácido nucleico fetal presente en una muestra materna (en el presente documento denominado el “método cuantificador fetal”), que se puede usar para 10 detectar o confirmar rasgos fetales (por ejemplo, sexo fetal de compatibilidad RhD), o diagnosticar anomalías cromosómicas tal como trisomía 21 (ambos de las cuales se denominan en el presente documento “Método de diagnóstico fetal basado en metilación”). La figura 10 muestra un ejemplo del método cuantificador fetal y la figura 11 muestra un ejemplo del método de diagnóstico fetal basado en metilación. Ambos procesos usan ADN fetal obtenido de una muestra materna. La muestra comprende ácido nucleico materno y fetal que está deferencialmente metilado.
15 Por ejemplo, la muestra puede ser plasma o suero materno. El ADN fetal comprende aproximadamente el 2-30% del ADN total en plasma materno. La cantidad real de contribución fetal al ácido nucleico total presente en una muestra varía de embarazo a embarazo y puede cambiar basado en un número de factores, incluyendo, pero no limitado a, edad gestacional, la salud de la madre y la salud del feto.
20 Como se describe en el presente documento, el desafío técnico planteado por el análisis de ADN fetal en plasma materno está en la necesidad de poder distinguir el ADN fetal del ADN materno de fondo coexistente. Los métodos de la presente divulgación explotan tales diferencias, por ejemplo, la metilación diferencial que se observa entre ADN fetal y materno, como un medio para enriquecer el porcentaje relativamente pequeño de ADN fetal presente en una muestra de la madre. La naturaleza no invasiva del enfoque proporciona una ventaja principal sobre métodos
25 convencionales de diagnóstico prenatal tal como, amniocentesis, muestreo de vellosidades coriónicas y cordocentesis, que se asocian con un riesgo pequeño pero finito de pérdida fetal. Además, porque el método no depende de que las células fetales estén en ninguna fase celular particular, el método proporciona un medio de detección rápido para determinar la presencia y también la naturaleza de la anomalía cromosómica. Además, el enfoque es independiente del sexo (es decir, no requiere la presencia de un cromosoma Y) e independiente de
30 polimorfismo (es decir, no se determina una proporción alélica). Por tanto, las composiciones y métodos de la divulgación representan enfoques no invasivos, mejorados universales para determinar de forma precisa la cantidad de ácido nucleico fetal presente en una muestra materna.
Diseño y ventajas el ensayo
35 Hay una necesidad para la detección precisa y cuantificación de ADN fetal aislado de forma no invasiva de una muestra materna. La presente divulgación se aprovecha de la presencia de ácido nucleico fetal libre de células circulante (ADNflc) en plasma o suero materno. Para ser comercial y clínicamente práctico, los métodos descritos en el presente documento deben consumir solo una pequeña porción del ADN fetal disponible limitado. Por ejemplo,
40 menos del 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% o menos de la muestra. Además, el enfoque se debe desarrollar preferiblemente en un formato de ensayo multiplex en que se incluyen uno o más (preferiblemente todos) de los siguientes ensayos:
 Ensayos para la detección de la cantidad total de equivalentes genómicos presente en la muestra, es decir,
45 ensayos que reconocen especies de ADN tanto maternas como fetales;  Ensayos para la detección de ADN fetal aislado de un embarazo masculino, es decir, secuencias específicas para el cromosoma Y;  Ensayos específicos para regiones identificadas como diferencialmente metiladas entre feto y madre; o  Ensayos específicos para regiones que se sabe están hipermetiladas en todos los tejidos que se van a
50 investigar, que puede servir como un control para eficacia de restricción.
Otras características del ensayo pueden incluir una o más de las siguientes:
 Para cada ensayo, un oligonucleótido competidor, específico de diana, que es idéntico, o sustancialmente
55 idéntico, a la secuencia diana aparte de una característica distinguible del competidor, tal como una diferencia en uno o más nucleótidos relativo a la secuencia diana. Este oligonucleótido cuando se añade en la reacción de PCR se coamplificará con la diana y una proporción obtenida entre estos dos amplicones de PCR indicará el número de secuencias de ADN específicas de diana (por ejemplo, ADN fetal de un locus específico) presentes en la muestra materna.
60  Las longitudes de los amplicones deben ser preferiblemente de longitud similar para no sesgar la amplificación hacia los fragmentos más cortos. Sin embargo, siempre que la eficacia de amplificación sea aproximadamente igual, se pueden usar diferentes longitudes.  Se pueden seleccionar dianas diferencialmente metiladas de las tablas 1A-1C o de cualquier otra diana que se sabe está diferencialmente metilada entre madre y feto. Estas dianas pueden estar hipometiladas en
ADN aislado de mujeres no embarazadas e hipermetiladas en muestras obtenidas de muestras fetales. Estos ensayos servirán como controles para la eficacia de restricción.  Los resultados obtenidos de los diferentes ensayos se pueden usar para cuantificar uno o más de los siguientes: 5
o Número total de genomas amplificables presentes en la muestra (cantidad total de equivalentes
genómicos); o La fracción fetal de los genomas amplificables (concentración o porcentaje fetal); o
o Diferencias en el número de copia entre secuencias de ADN derivadas del feto (por ejemplo, entre el cromosoma fetal 21 y un cromosoma de referencia tal como el cromosoma 3).
Ejemplos de ensayos usados en la prueba
A continuación hay un esbozo de las etapas de reacción usadas para realizar un método descrito en el presente
15 documento, por ejemplo, como se proporciona en la figura 10. Este esbozo no pretende limitar el ámbito de la invención. Más bien proporciona un ejemplo usando la tecnología MassARRAY® de Sequenom®.
1) Aislamiento de ADN de muestras de plasma.
2) Digestión de las dianas de ADN usando enzimas de restricción sensibles a metilación (por ejemplo, HhaI y HpaII). Para cada reacción el ADN disponible se mezcló con agua hasta un volumen final de 25 µl. Se añadieron 10 µl de una mezcla de reacción que consistía en 10 unidades de HhaI, 10 unidades de HpaII y un tampón de reacción. La muestra se incubó a una temperatura óptima para las enzimas de restricción. HhaI y HpaII digieren ADN no metilado (y no digerirán ADN hemi-o metilado por completo). Después de la digestión, las enzimas se
25 desnaturalizaron usando una etapa de calor. 3) Amplificación genómica -Se realizó PCR en un volumen total de 50 µl añadiendo reactivos de PCR (tampón, dNTPs, cebadores y polimerasa). Se proporcionan cebadores de PCR y de extensión ejemplares posteriormente. Además, se añadió oligonucleótido competidor sintético a concentraciones conocidas. 4) Replicados (opcional) – Después de la PCR la reacción de 50 µl se separó en dos reacciones paralelas de 5 µl (replicados) para minimizar la variación introducida durante las etapas tras la PCR de la prueba. Las etapas tras PCR incluyen SAP, extensión de cebador (tecnología MassEXTEND®), tratamiento con resina, dispensar espectrochip y MassARRAY. 5) Cuantificación de los genomas amplificables – Se usó la tecnología MassARRAY® de Sequenom para determinar la cantidad de producto de amplificación para cada ensayo. Después de la PCR, se usó un ensayo
35 de extensión de base única para interrogar las regiones amplificadas (incluyendo los oligonucleótidos competidores introducidos en la etapa 3). Se introdujeron cebadores de extensión específicos diseñados para hibridar directamente adyacentes al sitio de interés. Véase los cebadores de extensión proporcionados posteriormente. Estos oligonucleótidos de ADN se denominan cebadores iPLEX® MassEXTEND®. El la reacción de extensión, los cebadores iPLEX se hibridaron a los moldes de ADN complementarios y se extendieron con una ADN polimerasa. Mezclas de terminación especiales que contienen diferentes combinaciones de desoxi-y didesoxinucleótidos trifosfato junto con enzima y tampón, dirigieron la extensión limitada de los cebadores iPLEX. La extensión de cebadores se produce hasta que un didesoxinucleótido complementario se incorpora. La reacción de extensión generó productos de cebadores de longitud variable, cada uno con un peso molecular
45 único. Como resultado, los productos de extensión se pueden simultáneamente separar y detectar usando espectrometría de masas de desorción/ionización laser aistida por matriz, tiempo de vuelo (MALDI-TOF), en el MassARRAY® Analyzer Compact. Después de esta separación y detección, el software propietario de SEQUENOM analiza automáticamente los datos. 6) Calcular la cantidad y concentración de ácido nucleico fetal – Se proporcionan métodos para calcular la cantidad total de equivalentes genómicos presentes en la muestra, la cantidad (y concentración) de ácido nucleico fetal aislado de un embarazo masculino, y la cantidad (y concentración) de ácido nucleico fetal basado en dianas diferencialmente metiladas posteriormente y en las figuras 18 y 19.
El protocolo anterior se puede usar para realizar uno o más de los aspectos descritos a continuación. Además de las
55 secuencias proporcionadas inmediatamente después, se proporciona un esquema multiplex que interroga múltiples dianas en la tabla X posteriormente.
1) Ensayo para la cuantificación del número total de equivalentes genómicos amplificables en la muestra
Se seleccionaron dianas en genes de mantenimiento no localizados en los cromosomas 13, 18, 21, X o Y. Las dianas deben estar en un gen de copia única y no contener ningún sitio de reconocimiento para las enzimas de restricción sensibles a metilación.
Las secuencias subrayadas con sitios de cebadores de PCR, cursiva es el sitio para el cebador de extensión de 65 base única y letra negrita (C) es el nucleótido extendido en ADN humano.
ApoE Cromosoma 19:45409835-45409922 secuencia diana de ADN con nucleótido C interrogado en negrita. Todas las posiciones cromosómicas proporcionadas en esta sección son de UCSC Genome Build, febrero 2009.
5 ApoE Cebador directo: 5'-ACGTTGGATG-TTGACAGTTTCTCCTTCCCC (el cebador contiene un MassTag de 10 pb 5’ separado por un guion).
ApoE cebador inverso: 5'-ACGTTGGATG-GAATGTGACCAGCAACGCAG (el cebador contiene un MassTag de 10 pb 5’ separado por un guion).
10 ApoE cebador de extensión: 5'-GCAGGAAGATGAAGGTT [C/T] El cebador extiende C en dianas de ADN humano y T en dianas de ADN sintético.
ApoE oligonucleótido competidor: 15 5’-GATTGACAGTTTCTCCTTCCCCAGACTGGCCAATCACAGGCAGGAAGATGAAGGTTTTGTGGGCTGCGTTGC GGTCACATTCCTGGC (La T en negrita en la posición 57 es diferente del ADN humano).
2) Ensayo para la cuantificación del número total secuencias del cromosoma Y en la muestra
20 Se seleccionaron dianas específicas para el cromosoma Y, sin secuencias similares o parálogas en otro sitio en el genoma. Las dianas deben estar preferiblemente en un gen de copia única y no contener ningún sitio de reconocimiento para la(s) enzima(s) de restricción sensible(s) a metilación.
Las secuencias subrayadas con sitios de cebadores de PCR, y nucleótido(s) en cursiva es el sitio para el cebador de 25 extensión de base única y lla etra en negrita (C) es el nucleótido extendido en ADN humano.
30 SRY cebador directo: 5'-ACG-TGGATAGTAAAATAAGTTTCGAACTCTG (el cebador contiene un MassTag de 3 pb 5’ separado por un guion).
SRY cebador inverso: 5'-GAAGCATATGATTGCATTGTCAAAAAC
35 SRY cebador de extensión: 5'-aTTTCAATTTTGTCGCACT [C/T] El cebador extiende C en dianas de ADN humano y T en dianas de ADN sintético. La “a” minúscula en 5’ es un nucleótido no complementario.
3) Ensayo para la cuantificación de secuencias de ADN metilado fetal presentes en la muestra
Se seleccionaron dianas en regiones que se sabe están diferencialmente metiladas entre ADN materno y fetal. Se seleccionaron secuencias que contienen varios sitios de restricción para enzimas sensibles a metilación. Para este
45 estudio se usaron las enzimas HhaI (GCGC) y HpaII (CCGG).
Las secuencias subrayadas son sitios de cebadores de PCR, cursiva es el sitio para el cebador de extensión de base única y letra negrita (C) es el nucleótido extendido en ADN humano, letra minúscula son sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción sensibles a metilación.
50 TBX3 en chr21:115124905-115125001
TBX3 cebador directo: 5'-ACGTTGGATG-TCTTTGTCTCTGCGTGCCC (el cebador contiene un MassTag de 10 pb 55 5’ separado por un guion).
TBX3 cebador inverso: 5'-ACGTTGGATG-TTAATCACCCAGCGCATGGC (el cebador contiene un MassTag de 10 pb 5’ separado por un guion).
TBX3 cebador de extensión: 5'-CCCCTCCCGGTGGGTGATAAA [C/T] El cebador extiende C en dianas de ADN humano y T en dianas de ADN sintético. La “a” minúscula en 5’ es un nucleótido no complementario.
TBX3 oligonucleótido competidor sintético: 5’
4) Ensayo control para eficacia de enzimas de restricción
Se seleccionaron dianas en regiones que se sabe no están metiladas en cualquier tejido que se va a investigar. Se 10 seleccionaron secuencias para contener no más de un sitio para cada enzima de restricción que se va a usar.
Las secuencias subrayadas son sitios de cebadores de PCR, nucleótido(s) en cursiva representan el sitio para el cebador de extensión de base única y letra negrita (G) es el nucleótido extendido inverso en ADN humano, letra minúscula son sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción sensibles a metilación.
HhaI cebador directo: 5'-ACGTTGGATG-CCATTGGCCGTCCGCCGTG (el cebador contiene un MassTag de 10 pb 20 5’ separado por un guion).
HhaI cebador inverso: 5'-ACGTTGGATG-TCCTGGGTTTTGGGGTGGGAA (el cebador contiene un MassTag de 10 pb 5’ separado por un guion).
25 HhaI cebador de extensión: 5'-TTCCAGCTGTGGTTCTCTC
30 Experimentos de validación
Se midió la sensibilidad y precisión de la presente divulgación usando tanto un sistema modelo como muestras químicas. En las diferentes muestras, se corrió un ensayo multiplex que contiene 2 ensayos para cuantificación de número de copia total, 3 ensayos para cuantificación de metilación, 1 ensayo específico para cromosoma Y, y 1
35 ensayo control de digestión. Véase la tabla X. Se proporciona otro esquema multiplex con ensayos adicionales en la tabla Y.
Sistema modelo usando ADN genómico
Para determinar la sensibilidad y precisión del método cuando se determina el número total de copias genómicas amplificables en una muestra, se ensayó un subconjunto de diferentes muestras de ADN aisladas de la sangre de mujeres no embarazadas. Cada muestra se diluyó para contener aproximadamente 2500, 1250, 625 o 313 copias por reacción. El número total de copias genómicas amplificables se obtuvo tomando la proporción ADN/competidor media obtenida de los tres ensayos de número de copia total. Los resultados de las cuatro muestras diferentes se muestran en la figura 12.
Para optimizar la reacción, se desarrolló un sistema modelo para simular muestras de ADN aisladas de plasma. Estas muestras contenían un número constante de ADN no metilado materno y se les añadió diferentes cantidades de ADN metilado placentario masculino. A las muestras se les añadieron cantidades que variaban aproximadamente del 0 al 25% relativo al ADN no metilado materno. Los resultados se muestran en las figuras 13A y B. La fracción de ADN placentario se calculó usando las proporciones obtenidas de los ensayos de metilación (figura 13A), marcadores SRY (figura 13B) y ensayos de número de copia total. Las secuencias de los cebadores para los ensayos de metilación (TBX), ensayos de cromosoma Y (SRY) y número de copia total (APOE) se proporcionan anteriormente. El sistema modelo demostró que el método basado en metilación rindió igual que el método del cromosoma Y (marcadores SRY), validando de esta manera el método basado en metilación como un cuantificador fetal independiente del sexo.
Muestras de plasma
Para investigar la sensibilidad y precisión de los métodos en muestras clínicas, 33 muestras de plasma obtenidas de mujeres embarazas con un feto masculino se investigaron usando el esquema multiplex de la tabla X. Para cada reacción, se usó un cuarto del ADN obtenido de una extracción de 4 ml para cumplir el requisito importante de que solo se usa una parte de la muestra total.
Cuantificación del número de copia total
Los resultados de la cuantificación del número de copia total se pueden ver en las figuras 14A y B. En la figura 14A, se muestra el número de copia para cada muestra. Dos muestras (no. 25 y 26) tienen un número de copia total significativamente mayor que todas las otras muestras. En general, se obtuvo una media de aproximadamente 1300 copias amplificables/ml de plasma (intervalo 766-2055). La figura 14B muestra un gráfico de cajas y bigotes de los valores determinados, resumiendo los resultados.
Correlación entre los resultados obtenidos de los marcadores de metilación y el marcador del cromosoma Y
En las figuras 15A y B, se representan los números de copias fetales para cada muestra. Como todas las muestras eran de embarazos masculinos, los números de copia se pueden calcular usando los marcadores de metilación o los específicos del cromosoma Y. Como se puede ver en la figura 15B, el gráfico de cajas y bigotes de los valores determinados indicaba diferencia mínima entre las dos medidas diferentes.
Los resultados que muestran la correlación entre los resultados obtenidos de los marcadores de metilación y el marcador del cromosoma Y (SRY) se muestran en la figura 16. De nuevo, el método basado en metilación rindió igual al método del cromosoma Y (marcadores SRY), validando adicionalmente el método basado en metilación como un cuantificador fetal independiente del sexo e independiente de polimorfismo. Los ensayos multiplexados divulgados en la tabla X se usaron para determinar la cantidad de nucleico fetal.
Por último, se determinó la eficacia de digestión usando la proporción de digestión para el control frente al competidor y comparando este valor respecto a los ensayos del número de copia total medio. Véase, la figura 17. Aparte de la muestra 26 todas las reacciones indican que la eficacia está por encima del 99%.
Análisis de datos
Se hizo el análisis de espectros de masa usando Typer 4 (un producto de software de Sequenom). La altura del pico (señal sobre ruido) para cada analito de ADN individual y ensayo competidor se determinó y exportó para análisis adicional.
El número total de moléculas presentes para cada amplicón se calculó dividiendo el pico específico de ADN por el pico específico de competidor para dar una razón (El pico de “ADN” en las figuras 18 y 19 se puede pensar como el pico de analito para un ensayo determinado). Puesto que el número de moléculas de competidor añadido a la reacción se conoce, el número total de moléculas de ADN se puede determinar multiplicando la razón por el número de moléculas de competidor añadidas.
La fracción (o concentración) de ADN fetal en cada muestra se calculó usando los marcadores específicos de cromosoma Y para embarazos masculinos y la media de la fracción metilada para todos los embarazos.
Brevemente, para cromosoma Y, se obtuvo la razón dividiendo el pico de analito (ADN) por el pico de competidor y multiplicando esta razón por el número de moléculas de competidor añadidas a la reacción. Este valor se dividió por una razón similar obtenida de la determinación del número total de equivalentes genómicos amplificables (usando el/los ensayo(s) para cantidad total). Véase la figura 18. Puesto que la cantidad total de ácido nucleico presente en una muestra es una suma de ácido nucleico materno y fetal, la contribución fetal se puede considerar que es una fracción de la contribución materna de fondo, mayor. Por tanto, trasladando esto a la ecuación mostrada en la figura 18, la fracción fetal (k) del ácido nucleico total presente en la muestra es igual a la ecuación: k=2xR/(1-2R), donde R es la razón entre la cantidad de cromosoma Y y la cantidad total. Puesto que el cromosoma Y es haploide y los ensayos para la cantidad total se determinan usando dianas diploides, este cálculo se limita a una fracción fetal menor del 50% de la fracción materna.
En la figura 19, se muestra un cálculo similar para la concentración fetal usando marcadores específicos de metilación (véase ensayos para cuantificación de metilación). En contraste a los marcadores específicos del cromosoma Y, estos marcadores son de dianas diploides, por tanto, las limitaciones expresadas para el ensayo específico de cromosoma Y se pueden omitir. Por tanto, la fracción fetal (k) se puede determinar usando la ecuación k=R/(1-R), donde R es la razón entre el ensayo de metilación y el ensayo total.
Simulación
Se realizó un primer cálculo de poder sencillo que asume un sistema de medida que usa 20 marcadores del cromosoma 21, y 20 marcadores de uno o más otros autosomas. Empezando con 100 copias de ADN fetal, una desviación estándar de medida de 25 copias y la probabilidad para un error de tipo I es menor de 0,001, se encontró que los métodos descritos en el presente documento serán capaces de diferenciar un conjunto de cromosomas diploide de uno triploide en el 99,5% de todos los casos. La implementación práctica de tal enfoque se podría, por ejemplo, lograr usando espectrometría de masas, un sistema que usa un enfoque de PCR competitiva para medidas del número de copia absoluta. El método puede correr 20 ensayos en una única reacción y se ha mostrado que tiene una desviación estándar en medidas repetidas de aproximadamente el 3 al 5%. Este método se usó en combinación con métodos conocidos para diferenciar ácido nucleico metilado y sin metilar, por ejemplo, usando agentes de unión a metilo para separar ácido nucleico o usando enzimas sensibles a metilación para digerir ácido nucleico materno. La figura 8 muestra la eficacia de la proteína MBD-FC (un agente de unión a metilo) para capturar y por tanto separar ADN metilado en presencia de un exceso de ADN sin metilar (véase la figura 8).
Se realizó un segundo análisis de poder estadístico para evaluar el poder predictivo de un ejemplo del método de diagnóstico fetal basado en metilación descrito en el presente documento. Se diseñó la simulación para demostrar la verosimilitud de diferenciar un grupo de marcadores específicos de cromosoma 21 trisómico de un grupo de marcadores de referencia (por ejemplo, autosomas excluyendo el cromosoma 21). Muchos parámetros influyen en la capacidad para distinguir las dos poblaciones de marcadores de forma fiable. Para la presente simulación, se eligieron valores para cada parámetro que se ha mostrado que son los más probables que se produzcan basado en experimentación. Se usaron los siguientes parámetros y valores respectivos:
Números de copia
Números de copia maternos = 2000
Números de copia fetales para cromosoma diferentes del 21, X e Y = 200
Números de copia fetales para cromosoma 21 en caso de feto euploide = 200
Números de copia fetales para cromosoma 21 en caso de feto T21 aneuploide = 300
Porcentaje de ADN fetal (antes del enriquecimiento basado en metilación) = 10% (véase anteriormente)
Frecuencia de metilación
Porcentaje medio de metilación en una región diana para ADN materno = 10%
Porcentaje medio de metilación en una región diana para ADN fetal = 80%
Porcentaje medio de ADN materno no metilado y no digerido (es decir, una función de eficacia de restricción (entre otras cosas) = 5%
Número de ensayos que se dirigen al cromosoma 21 = 10
Número de ensayos que se dirigen a cromosomas diferentes del 21, X e Y = 10
Los resultados se muestran en la figura 20. Se muestra la relación entre el coeficiente de variación (CV) en el eje x y el poder para distinguir las poblaciones de ensayo usando una prueba de la t sencilla (eje y). Los datos indican que en el 99% de todos los casos, se pueden distinguir las dos poblaciones (euploide frente a aneuploide) a un nivel significativo de 0,001 siempre que CV del 5% o menor. Basado en esta simulación, el método representa un método
diagnóstico no invasivo poderoso para la detección prenatal de aneuploidía fetal que es independiente del sexo y funcionará en todos los grupos étnicos (es decir, sin sesgo alélico).
Ejemplo 3 – Dianas diferencialmente metiladas adicionales
Dianas diferencialmente metiladas no localizadas en el cromosoma 21
Se seleccionaron dianas diferencialmente metiladas adicionales para análisis adicional basado en análisis de micromatrices previos. Véase el ejemplo 1 para una descripción del análisis de micromatriz. Durante el cribado de micromatrices, se definieron regiones diferencialmente metiladas (DMR) entre tejido placentario y CMSP. Se seleccionaron regiones para confirmación con EpiTYPER basado en estar hipermetilado en placenta relativo a CMSP. Después de seleccionar la direccionalidad del cambio, se eligieron regiones basadas en significación estadística con regiones diseñadas que empiezan con la más significativa y van hacia abajo en términos de significación. Estos estudios se realizaron en ocho muestras apareadas de CMSP y placenta. Se proporcionan dianas no del cromosoma 21 adicionales en la tabla 1B junto con una secuencia genómica representativa de cada diana en la tabla 4B.
Dianas diferencialmente metiladas localizadas en el cromosoma 21
El cribado de micromatriz descubrió solo un subconjunto de DMR localizadas en el cromosoma 21. La cobertura del cromosoma 21 por la micromatriz, sin embargo, era insuficiente. Por tanto, un análisis adicional se completó para examinar todas las 356 islas CpG en el cromosoma 21 usando ajustes estándar de buscador genómico de UCSC. Como se muestra en la tabla 1C posteriormente, algunas de estas dianas solapaban con las ya examinadas en la tabla 1A. Más específicamente, se investigaron sitios CpG localizados en el cromosoma 21 incluyendo ~1000 pb antes y después de cada CpG usando la tecnología EpiTYPER® de Sequenom. Véase el ejemplo 1 “Validación usando EpiTYPER™ de Sequenom®” para una descripción de la tecnología EpiTYPER® de Sequenom. Estos estudios se realizaron en ocho muestras apareadas de CMSP y placenta. Además, puesto que las DMR también pueden estar localizadas fuera de islas CpG definidas, se realizó minería de datos en datos de micromatrices públicamente disponibles para identificar potenciales regiones candidatas con las siguientes características: hipermetiladas en placenta relativo a sangre materna, no localizadas en una isla CpG definida, contener más de 4 dinucleótidos CpG, y contener una secuencia de reconocimiento para enzimas de restricción sensibles a metilación. Las regiones que cumplían estos criterios se examinaron después usando la tecnología EpiTYPER® de Sequenom en ocho muestras apareadas en CMSP y placenta. Se proporcionan dianas en el cromosoma 21 adicionales en la tabla 1C, junto con una secuencia genómica representativa de cada diana en la tabla 4C.
Las tablas 1B y 1C proporcionan una descripción de las diferentes dianas, incluyendo su localización y si se analizaron durante las diferentes fases del análisis, es decir, análisis de micromatriz, análisis de EpiTYPER 8 y análisis de EpiTYPER 73. Un “SI” indica que se analizó y un “NO” indica que no se analizó. La definición de cada columna en la tabla 1B y 1C se enumera a continuación.
 Nombre de la región: Cada región se nombra por el/los gen(es) que residen en el área definida o cerca. Las regiones donde no se enumera nombre de gen, sino más bien solo contienen un locus no tienen genes refseq en la proximidad.
 Región génica: Para esas regiones contenidas en proximidad o dentro de un gen, la región génica explica
adicionalmente la relación de esta región con el gen cerca.  Crom: El cromosoma en que se localiza la DMR usando el hg18build del navegador de genoma de UCSC.  Inicio: La posición de inicio de la DMR designada por el hg18build del navegador de genoma de UCSC.  Fin: La posición final de la DMR designada por el hg18build del navegador de genoma de UCSC.  Análisis de micromatriz: Describe si esta región de determinó también/inicialmente que estaba
diferencialmente metilada por análisis de micromatriz. La fracción metilada de diez muestras apareadas de placenta y CMSP se aisló usando la proteína MBD-Fc. Las dos fracciones tisulares se marcaron después con Alexa Fluor 555-aha-dCTP (CMSP) o Alexa Fluor 647-aha-dCTP (placenta) usando BioPrime Total Genomics Labelling System™ y se hibridaron a micromatrices de islas CpG de Agilent®. Muchas regiones examinadas en estos estudios no estaban contenidas en la micromatriz inicial.
 Muestras de EpiTYPER 8: Describe si esta región se analizó y determinó que estaba diferencialmente metilada en ocho muestras apareadas de placenta y células mononucleares de sangre periférica (CMSP) usando tecnología EpiTYPER. Las regiones que se eligieron para examen se basaron en múltiples criterios. Primero, se seleccionaron regiones basado en datos del análisis de micromatriz. En segundo lugar, se emprendió un examen exhaustivo de todas las islas CpG localizadas en el cromosoma 21. Por último, se examinaron regiones en el cromosoma 21 que tenían menor frecuencia CpG que las localizadas en islas CpG.
 Muestras de EpiTYPER 73: Describe si esta región se analizó posteriormente usando tecnología EpiTYPER en una cohorte de muestras que consistía en 73 muestras apareadas de placenta y CMSP. Todas las regiones seleccionadas para análisis en esta segunda cohorte de muestras se seleccionaron basadas en los resultados de la experimentación descrita en la columna EpiTYPER 8. Más específicamente, las
regiones en esta cohorte adicional mostraron un perfil de metilación similar al determinado en el análisis de muestras de EpiTYPER 8. Por ejemplo, todas las regiones enumeradas en las tablas 1B-1C muestran diferentes niveles de metilación de ADN en una porción significativa de los dinucleótidos CpG examinados en la región definida. La metilación diferencial de ADN de sitios CpG se determinó usando una prueba de la
5 T de datos emparejados con esos sitios considerados diferencialmente metilados si el valor p (cuando se compara tejido placentario con CMSP) es p<0,05.  EpiTYPER previamente validado: Describe si esta región o una parte de esta región se validó usando EpiTYPER durante experimentación previa (véanse los ejemplos 1 y 2).  Metilación relativa placenta a materna: Describe la dirección de la metilación diferencial. Las regiones 10 marcadas como “hipermetilación” están más metiladas en la región designada en muestra de placenta relativas a CMSP e “hipometilación” están más metiladas en la región designada en muestras de CMSP:
***
La tecnología ilustrativamente descrita en el presente documento se puede practicar en ausencia de cualquier elemento no divulgado específicamente en el presente documento. Por tanto, por ejemplo, en cada caso en el 5 presente documento cualquiera de los términos “comprender”, “consistir esencialmente en” y “consistir en” se pueden sustituir con cualquiera de los otros dos términos. Los términos y expresiones que se han empleado se usan como términos de descripción y no de limitación, y el uso de tales términos y expresiones no excluye cualquier equivalente de las características mostradas y descritas o partes de las mismas, y varias modificaciones son posibles dentro del ámbito de la tecnología reivindicada. El término “un” o “una” se puede referir a uno o una 10 pluralidad de los elementos que modifica (por ejemplo, “un reactivo” puede significar uno o más reactivos) a menos que esté contextualmente claro si se describe uno de los elementos o más de uno de los elementos. El término “aproximadamente” como se usa en el presente documento se refiere a un valor dentro del 10% de parámetro subyacente (es decir, más o menos el 10%), y el uso de término “aproximadamente” al principio de una sucesión de valores modifica cada uno de los valores (es decir, “aproximadamente 1, 2 y 3” se refiere a aproximadamente 1,
15 aproximadamente 2 y aproximadamente 3). Por ejemplo, un peso de “aproximadamente 100 gramos” puede incluir pesos entre 90 gramos y 110 gramos. Además, cuando se describe una lista de valores en el presente documento (por ejemplo, aproximadamente el 50%, 60%, 70%, 80%, 85% o 86%) la lista incluye todos los valores intermedios y fraccionales de los mismos (por ejemplo, el 54%, 85,4%).

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un método para determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en una muestra que comprende:
    a) poner en contacto ácido nucleico presente en una muestra de una mujer embarazada, muestra que comprende ácido nucleico fetal y ácido nucleico materno diferencialmente metilado, la combinación del ácido nucleico fetal y ácido nucleico materno comprende el ácido nucleico total en la muestra, con un reactivo que digiere específicamente ácido nucleico no metilado, enriqueciendo de esta manera el ácido nucleico fetal; y b) determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en la muestra en una reacción multiplex mediante (i) análisis de la cantidad de ácido nucleico fetal en una pluralidad de loci seleccionados de los loci de SEQ ID NO: 90163, 176, 179, 180, 184, 188, 189, 190, 191, 193, 195, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 221, 223, 225, 226, 231, 232, 233, 235, 239, 241, 257, 258, 259, y 261, (ii) determinar la cantidad de ácido nucleico total, (iii) determinar la cantidad de ácido nucleico del cromosoma y, si está presente, y (iv) determinar la eficacia de digestión del reactivo.
  2. 2.
    El método de la reivindicación 1, en donde la pluralidad de loci comprende uno o más loci seleccionado de los loci de SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 163.
  3. 3.
    El método de la reivindicación 1, en donde la pluralidad de loci comprende los loci de SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 158 y SEQ ID NO: 163.
  4. 4.
    El método de la reivindicación 1, 2 o 3, en donde el reactivo que digiere específicamente ácido nucleico no metilado es una enzima de restricción sensible a metilación.
  5. 5.
    El método de la reivindicación 1, en donde determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en la muestra comprende comparar la cantidad de ácido nucleico fetal en (b) con la cantidad total de ácido nucleico.
  6. 6.
    El método de la reivindicación 1, en donde la cantidad de ácido nucleico fetal se compara con la cantidad de ácido nucleico del cromosoma Y.
  7. 7.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde determinar la cantidad de ácido nucleico fetal en (b) comprende introducir uno o más competidores a concentraciones conocidas en una reacción de amplificación.
  8. 8.
    El método de la reivindicación 7, que comprende determinar la cantidad absoluta de ácido nucleico fetal en la muestra.
  9. 9.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde determinar la cantidad de ácido nucleico fetal comprende el uso de uno o más procesos seleccionados de métodos de espectrometría de masas, RT-PCR, PCR digital, métodos basados en matrices, métodos de secuenciación, métodos basados en nanoporos, método de conteo basados en ácido nucleico unido a bolas, métodos basados en competidor y métodos para separar ácido nucleico usando agentes que se unen a ácido nucleico basado en el estado de metilación.
  10. 10.
    El método de la reivindicación 9, en donde determinar la cantidad de ácido nucleico fetal comprende el uso de un método de espectrometría de masas.
  11. 11.
    El método de la reivindicación 10, que comprende analizar uno o más picos de masa en un espectro.
  12. 12.
    El método de la reivindicación 9, en donde determinar la cantidad de ácido nucleico fetal comprende el uso de un método de secuenciación.
  13. 13.
    El método de la reivindicación 12, en donde el método de secuenciación comprende secuenciación por síntesis.
  14. 14.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la cantidad de ácido nucleico fetal se usa junto con un método diagnóstico para determinar un rasgo fetal, en donde el método diagnóstico requiere que una cantidad o concentración absoluta determinada de ácido nucleico fetal satisfaga ciertos requisitos de sensibilidad o especificidad clínica.
  15. 15.
    El método de la reivindicación 14, en donde el rasgo fetal es una aneuploidía fetal.
    FIGURA 1
    FIGURA 2
    Proteína MBD
    FIGURA 3
    FIGURA 7
    FIGURA 8
    FIGURA 9A
    FIGURA 9B
    FIGURA 9C
    FIGURA 9D
    FIGURA 9E
    FIGURA 9F
    FIGURA 9G
    FIGURA 9H
    FIGURA 9I
    FIGURA 9J
    FIGURA 9K
    FIGURA 9L
    FIGURA 10
    FIGURA 11
    FIGURA 12
    FIGURA 13A
    FIGURA 13B
    FIGURA 14A-B
    Figura 14A Figura 14B
    FIGURA 15A-B
    Figura 15A Figura 15B
    FIGURA 16
    FIGURA 17
    FIGURA 20
ES10817598.5T 2009-09-16 2010-03-18 Procesos y composiciones para el enriquecimiento basado en metilación de ácido nucleico fetal de una muestra materna útil para diagnósticos prenatales no invasivos Active ES2650666T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US561241 2000-04-28
US12/561,241 US8476013B2 (en) 2008-09-16 2009-09-16 Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
PCT/US2010/027879 WO2011034631A1 (en) 2009-09-16 2010-03-18 Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2650666T3 true ES2650666T3 (es) 2018-01-19

Family

ID=43759623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10817598.5T Active ES2650666T3 (es) 2009-09-16 2010-03-18 Procesos y composiciones para el enriquecimiento basado en metilación de ácido nucleico fetal de una muestra materna útil para diagnósticos prenatales no invasivos

Country Status (10)

Country Link
US (7) US8476013B2 (es)
EP (3) EP2478119B1 (es)
JP (7) JP5873434B2 (es)
CN (1) CN102648292A (es)
AU (1) AU2010295968B2 (es)
CA (3) CA3024967C (es)
ES (1) ES2650666T3 (es)
HK (1) HK1254596A1 (es)
IN (1) IN2012DN03139A (es)
WO (1) WO2011034631A1 (es)

Families Citing this family (166)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US7888127B2 (en) 2008-01-15 2011-02-15 Sequenom, Inc. Methods for reducing adduct formation for mass spectrometry analysis
EP2271772B1 (en) * 2008-03-11 2014-07-16 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
US8962247B2 (en) * 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
ES2599967T3 (es) * 2008-09-16 2017-02-06 Sequenom, Inc. Procedimientos y composiciones para el enriquecimiento basado en metilación de ácido nucleico fetal de una muestra materna útiles para diagnósticos prenatales no invasivos
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US8835358B2 (en) * 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
ES2577017T3 (es) 2009-12-22 2016-07-12 Sequenom, Inc. Procedimientos y kits para identificar la aneuploidia
CA2786174A1 (en) * 2010-01-26 2011-08-04 Nipd Genetics Ltd Methods and compositions for noninvasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
EP2572003A4 (en) 2010-05-18 2016-01-13 Natera Inc METHOD FOR NONINVASIVE PRANATAL PLOIDIE ASSIGNMENT
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US8700338B2 (en) 2011-01-25 2014-04-15 Ariosa Diagnosis, Inc. Risk calculation for evaluation of fetal aneuploidy
US11203786B2 (en) 2010-08-06 2021-12-21 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US20140342940A1 (en) 2011-01-25 2014-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of Target Nucleic Acids using Hybridization
US10167508B2 (en) 2010-08-06 2019-01-01 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
US20120190557A1 (en) * 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Risk calculation for evaluation of fetal aneuploidy
US20130040375A1 (en) 2011-08-08 2013-02-14 Tandem Diagnotics, Inc. Assay systems for genetic analysis
US10533223B2 (en) 2010-08-06 2020-01-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US20130261003A1 (en) 2010-08-06 2013-10-03 Ariosa Diagnostics, In. Ligation-based detection of genetic variants
US11031095B2 (en) 2010-08-06 2021-06-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Assay systems for determination of fetal copy number variation
US11270781B2 (en) 2011-01-25 2022-03-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination
ES2943669T3 (es) * 2011-01-25 2023-06-15 Hoffmann La Roche Cálculo de riesgo para la evaluación de aneuploidía fetal
US9994897B2 (en) 2013-03-08 2018-06-12 Ariosa Diagnostics, Inc. Non-invasive fetal sex determination
US8756020B2 (en) 2011-01-25 2014-06-17 Ariosa Diagnostics, Inc. Enhanced risk probabilities using biomolecule estimations
US10131947B2 (en) 2011-01-25 2018-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies
JP2014506465A (ja) 2011-02-09 2014-03-17 バイオ−ラド ラボラトリーズ，インコーポレイティド 核酸の分析
CN103492589B (zh) 2011-02-24 2016-06-15 香港中文大学 多胎妊娠的分子测试
US8450061B2 (en) 2011-04-29 2013-05-28 Sequenom, Inc. Quantification of a minority nucleic acid species
WO2012177792A2 (en) 2011-06-24 2012-12-27 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of a genetic variation
US8712697B2 (en) 2011-09-07 2014-04-29 Ariosa Diagnostics, Inc. Determination of copy number variations using binomial probability calculations
US9984198B2 (en) 2011-10-06 2018-05-29 Sequenom, Inc. Reducing sequence read count error in assessment of complex genetic variations
EP3922731A3 (en) 2011-10-06 2022-01-05 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10424394B2 (en) 2011-10-06 2019-09-24 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10196681B2 (en) 2011-10-06 2019-02-05 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US20140242588A1 (en) 2011-10-06 2014-08-28 Sequenom, Inc Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9367663B2 (en) 2011-10-06 2016-06-14 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US8688388B2 (en) 2011-10-11 2014-04-01 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CA2851537C (en) 2011-10-11 2020-12-29 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP2805280B1 (en) 2012-01-20 2022-10-05 Sequenom, Inc. Diagnostic processes that factor experimental conditions
EP3578697B1 (en) 2012-01-26 2024-03-06 Tecan Genomics, Inc. Compositions and methods for targeted nucleic acid sequence enrichment and high efficiency library generation
WO2013130512A2 (en) 2012-02-27 2013-09-06 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
JP6375230B2 (ja) 2012-02-27 2018-08-15 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド 分子計数のための組成物およびキット
WO2013130857A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 Bio Dx, Inc. Defining diagnostic and therapeutic targets of conserved fetal dna in maternal circulating blood
EP3401399B1 (en) 2012-03-02 2020-04-22 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2013131083A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Winthrop-University Hospital METHOD FOR USING PROBE BASED PCR DETECTION TO MEASURE THE LEVELS OF CIRCULATING DEMETHYLATED β CELL DERIVED DNA AS A MEASURE OF β CELL LOSS IN DIABETES
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
US10289800B2 (en) 2012-05-21 2019-05-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Processes for calculating phased fetal genomic sequences
US10504613B2 (en) 2012-12-20 2019-12-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CA2874195C (en) 2012-05-21 2020-08-25 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CN102676513A (zh) * 2012-05-28 2012-09-19 武汉大学 一种胎儿表观遗传学标志物及其应用
US10497461B2 (en) 2012-06-22 2019-12-03 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US20150011396A1 (en) * 2012-07-09 2015-01-08 Benjamin G. Schroeder Methods for creating directional bisulfite-converted nucleic acid libraries for next generation sequencing
WO2014011928A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
JP2015522293A (ja) 2012-07-19 2015-08-06 アリオサ ダイアグノスティックス インコーポレイテッドＡｒｉｏｓａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 多重化連続ライゲーションに基づく遺伝子変異体の検出
US20150275300A1 (en) * 2012-09-26 2015-10-01 Agency For Science, Technology And Research Biomarkers for down syndrome prenatal diagnosis
US10482994B2 (en) 2012-10-04 2019-11-19 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2014055790A2 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2014089368A1 (en) * 2012-12-05 2014-06-12 Bio-Rad Laboratories, Inc Methods for polymerase chain reaction copy number variation assays
US20130309666A1 (en) 2013-01-25 2013-11-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US20130189684A1 (en) 2013-03-12 2013-07-25 Sequenom, Inc. Quantification of cell-specific nucleic acid markers
US9305756B2 (en) 2013-03-13 2016-04-05 Agena Bioscience, Inc. Preparation enhancements and methods of use for MALDI mass spectrometry
US11060145B2 (en) 2013-03-13 2021-07-13 Sequenom, Inc. Methods and compositions for identifying presence or absence of hypermethylation or hypomethylation locus
ES2939547T3 (es) 2013-04-03 2023-04-24 Sequenom Inc Métodos y procedimientos para la evaluación no invasiva de variaciones genéticas
US20140336055A1 (en) 2013-05-07 2014-11-13 Sequenom, Inc. Genetic markers for macular degeneration disorder treatment
AU2014268377B2 (en) 2013-05-24 2020-10-08 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
KR102299305B1 (ko) 2013-06-21 2021-09-06 시쿼넘, 인코포레이티드 유전적 변이의 비침습 평가를 위한 방법 및 프로세스
KR20230074639A (ko) 2013-08-28 2023-05-30 벡톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 대량의 동시 단일 세포 분석
IL304949A (en) 2013-10-04 2023-10-01 Sequenom Inc Methods and processes for non-invasive evaluation of genetic variations
US10438691B2 (en) 2013-10-07 2019-10-08 Sequenom, Inc. Non-invasive assessment of chromosome alterations using change in subsequence mappability
JP2017504307A (ja) 2013-10-07 2017-02-09 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド アレイ上のフィーチャーをデジタルカウントするための方法およびシステム
EP3055423B1 (en) * 2013-10-11 2019-12-25 Cellectis Method for detecting nucleic acid sequences of interest using talen protein
EP3736344A1 (en) 2014-03-13 2020-11-11 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CN106460070B (zh) 2014-04-21 2021-10-08 纳特拉公司 检测染色体片段中的突变和倍性
EP2942400A1 (en) 2014-05-09 2015-11-11 Lifecodexx AG Multiplex detection of DNA that originates from a specific cell-type
CN107223159A (zh) 2014-05-09 2017-09-29 科戴克斯生命股份公司 源自特定细胞类型的dna的检测及相关方法
EP2942401A1 (en) 2014-05-09 2015-11-11 Lifecodexx AG Detection of DNA that originates from a specific cell-type
EP3598452B1 (en) 2014-05-30 2023-07-26 Sequenom, Inc. Chromosome representation determinations
AU2015292311B2 (en) * 2014-07-25 2022-01-20 University Of Washington Methods of determining tissues and/or cell types giving rise to cell-free DNA, and methods of identifying a disease or disorder using same
EP3175000B1 (en) 2014-07-30 2020-07-29 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10174383B2 (en) 2014-08-13 2019-01-08 Vanadis Diagnostics Method of estimating the amount of a methylated locus in a sample
EP3191606B1 (en) * 2014-09-12 2020-05-27 Illumina, Inc. Methods for detecting the presence of polymer subunits using chemiluminescence
CA2964158A1 (en) 2014-10-10 2016-04-14 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2016065295A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-28 Dae Hyun Kim Enrichment of small nucleic acids
ES2824700T3 (es) 2015-02-19 2021-05-13 Becton Dickinson Co Análisis unicelular de alto rendimiento que combina información proteómica y genómica
CN107208158B (zh) 2015-02-27 2022-01-28 贝克顿迪金森公司 空间上可寻址的分子条形编码
KR101546366B1 (ko) 2015-03-16 2015-08-25 의료법인 제일의료재단 태아 특이적 후성학적 메틸화 마커 검출용 조성물 및 검출방법
EP4180535A1 (en) 2015-03-30 2023-05-17 Becton, Dickinson and Company Methods and compositions for combinatorial barcoding
WO2016172373A1 (en) 2015-04-23 2016-10-27 Cellular Research, Inc. Methods and compositions for whole transcriptome amplification
WO2016183106A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
CA2986200A1 (en) 2015-05-22 2016-12-01 Nipd Genetics Public Company Limited Multiplexed parallel analysis of targeted genomic regions for non-invasive prenatal testing
WO2016196229A1 (en) 2015-06-01 2016-12-08 Cellular Research, Inc. Methods for rna quantification
JP6940484B2 (ja) 2015-09-11 2021-09-29 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド ライブラリー正規化のための方法および組成物
DK3168309T3 (da) 2015-11-10 2020-06-22 Eurofins Lifecodexx Gmbh Detektion af føtale kromosomale aneuploidier under anvendelse af dna-regioner med forskellig metylering mellem fosteret og det gravide hunkøn
WO2017192387A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Cellular Research, Inc. Accurate molecular barcoding
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
EP3465502B1 (en) 2016-05-26 2024-04-10 Becton, Dickinson and Company Molecular label counting adjustment methods
WO2017205826A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Sequenom, Inc. Methods for detecting genetic variations
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
WO2018013837A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 The Regents Of The University Of California Methods of producing nucleic acid libraries
CA3030894A1 (en) 2016-07-27 2018-02-01 Sequenom, Inc. Methods for non-invasive assessment of genomic instability
US11200963B2 (en) 2016-07-27 2021-12-14 Sequenom, Inc. Genetic copy number alteration classifications
KR102638006B1 (ko) 2016-09-26 2024-02-20 셀룰러 리서치, 인크. 바코딩된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 시약을 이용한 단백질 발현의 측정
WO2018064486A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Counsyl, Inc. Noninvasive prenatal screening using dynamic iterative depth optimization
US11485996B2 (en) 2016-10-04 2022-11-01 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
IL265769B2 (en) * 2016-10-19 2023-12-01 Univ Hong Kong Chinese Estimation of gestational age using methylation and size profile of maternal plasma DNA
CN109906274B (zh) 2016-11-08 2023-08-25 贝克顿迪金森公司 用于细胞标记分类的方法
CN109952612B (zh) 2016-11-08 2023-12-01 贝克顿迪金森公司 用于表达谱分类的方法
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
IL302912A (en) * 2016-12-22 2023-07-01 Guardant Health Inc Methods and systems for analyzing nucleic acid molecules
WO2018132610A1 (en) 2017-01-13 2018-07-19 Cellular Research, Inc. Hydrophilic coating of fluidic channels
EP4235676A3 (en) 2017-01-20 2023-10-18 Sequenom, Inc. Methods for non-invasive assessment of genetic alterations
EP3571614A1 (en) 2017-01-20 2019-11-27 Sequenom, Inc. Methods for non-invasive assessment of copy number alterations
WO2018136881A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Sequenom, Inc. Sequencing adapter manufacture and use
JP7237003B2 (ja) 2017-01-24 2023-03-10 セクエノム， インコーポレイテッド 遺伝子片の評価のための方法およびプロセス
EP3577232A1 (en) 2017-02-01 2019-12-11 Cellular Research, Inc. Selective amplification using blocking oligonucleotides
EP3596233B1 (en) 2017-03-17 2022-05-18 Sequenom, Inc. Methods and processes for assessment of genetic mosaicism
CN110662845A (zh) * 2017-05-01 2020-01-07 小利兰·斯坦福大学托管委员会 使用磁阻生物传感器阵列表征dna甲基化
KR102438495B1 (ko) 2017-06-05 2022-09-01 백톤 디킨슨 앤드 컴퍼니 단일 세포를 위한 샘플 인덱싱
CN107451419B (zh) * 2017-07-14 2020-01-24 浙江大学 通过计算机程序模拟产生简化dna甲基化测序数据的方法
US11519024B2 (en) 2017-08-04 2022-12-06 Billiontoone, Inc. Homologous genomic regions for characterization associated with biological targets
US11646100B2 (en) 2017-08-04 2023-05-09 Billiontoone, Inc. Target-associated molecules for characterization associated with biological targets
US10426424B2 (en) 2017-11-21 2019-10-01 General Electric Company System and method for generating and performing imaging protocol simulations
JP6447765B1 (ja) * 2017-11-21 2019-01-09 株式会社リコー 検査デバイス及びデバイス
EP3486330A1 (en) 2017-11-21 2019-05-22 Ricoh Company, Ltd. Device for measuring ranges of copy numbers
US11946095B2 (en) 2017-12-19 2024-04-02 Becton, Dickinson And Company Particles associated with oligonucleotides
AU2019207900A1 (en) 2018-01-12 2020-07-09 Claret Bioscience, Llc Methods and compositions for analyzing nucleic acid
WO2019182891A1 (en) * 2018-03-19 2019-09-26 Illumina, Inc. Methods and compositions for selective cleavage of nucleic acids with recombinant nucleases
WO2019213237A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Becton, Dickinson And Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
EP3788171B1 (en) 2018-05-03 2023-04-05 Becton, Dickinson and Company High throughput multiomics sample analysis
WO2019236726A1 (en) 2018-06-06 2019-12-12 The Regents Of The University Of California Methods of producing nucleic acid libraries and compositions and kits for practicing same
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
US11639517B2 (en) 2018-10-01 2023-05-02 Becton, Dickinson And Company Determining 5′ transcript sequences
WO2020097315A1 (en) 2018-11-08 2020-05-14 Cellular Research, Inc. Whole transcriptome analysis of single cells using random priming
US11492660B2 (en) 2018-12-13 2022-11-08 Becton, Dickinson And Company Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
US11371076B2 (en) 2019-01-16 2022-06-28 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
WO2020154247A1 (en) 2019-01-23 2020-07-30 Cellular Research, Inc. Oligonucleotides associated with antibodies
SG11202110468YA (en) 2019-04-05 2021-10-28 Claret Bioscience Llc Methods and compositions for analyzing nucleic acid
WO2020214642A1 (en) 2019-04-19 2020-10-22 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
CN114051534A (zh) 2019-07-22 2022-02-15 贝克顿迪金森公司 单细胞染色质免疫沉淀测序测定
WO2021067484A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 Guardant Health, Inc. Compositions and methods for analyzing cell-free dna in methylation partitioning assays
AU2020363787A1 (en) 2019-10-09 2022-04-21 Claret Bioscience, Llc Methods and compositions for analyzing nucleic acid
EP4052259A1 (en) 2019-10-31 2022-09-07 Sequenom, Inc. Application of mosaicism ratio in multifetal gestations and personalized risk assessment
US11773436B2 (en) 2019-11-08 2023-10-03 Becton, Dickinson And Company Using random priming to obtain full-length V(D)J information for immune repertoire sequencing
EP4090763A1 (en) 2020-01-13 2022-11-23 Becton Dickinson and Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
CN112662761A (zh) * 2020-03-05 2021-04-16 博尔诚（北京）科技有限公司 一种检测3种实质性器官肿瘤的探针组合物
CN115605614A (zh) 2020-05-14 2023-01-13 贝克顿迪金森公司（Us） 用于免疫组库谱分析的引物
WO2021262805A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Claret Bioscience, Llc Methods and compositions for analyzing nucleic acid
CN111593119A (zh) * 2020-06-28 2020-08-28 成都市妇女儿童中心医院 用于检测母体血液中胎儿游离DNA β-地中海贫血突变的探针及试剂盒
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
WO2022076574A1 (en) 2020-10-08 2022-04-14 Claret Bioscience, Llc Methods and compositions for analyzing nucleic acid
CN116635533A (zh) 2020-11-20 2023-08-22 贝克顿迪金森公司 高表达的蛋白和低表达的蛋白的谱分析
EP4256565A1 (en) 2020-12-02 2023-10-11 Illumina Software, Inc. System and method for detection of genetic alterations
CN113061653A (zh) * 2021-05-07 2021-07-02 济南国科医工科技发展有限公司 用于产前无创检测21三体综合征的pcr扩增组合物及检测试剂盒
WO2023086967A1 (en) * 2021-11-12 2023-05-19 Guardant Health, Inc. Method of analysis of methylated dna-binding proteins

Family Cites Families (267)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2187108A (en) 1938-05-27 1940-01-16 Du Pont Process of purifying lead nitrate solutions
JPS5727375B2 (es) 1973-06-01 1982-06-10
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
DE2712230C2 (de) 1977-03-19 1985-05-23 Bayer Ag, 5090 Leverkusen Verzweigte Segmentpolymere
US4109496A (en) 1977-12-20 1978-08-29 Norris Industries Trapped key mechanism
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
JPS58129411A (ja) 1982-01-27 1983-08-02 Nippon Kogaku Kk <Nikon> リアフオ−カスコンバ−ジヨンレンズ
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
GB8311018D0 (en) 1983-04-22 1983-05-25 Amersham Int Plc Detecting mutations in dna
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5656493A (en) 1985-03-28 1997-08-12 The Perkin-Elmer Corporation System for automated performance of the polymerase chain reaction
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4868103A (en) 1986-02-19 1989-09-19 Enzo Biochem, Inc. Analyte detection by means of energy transfer
DE122007000007I1 (de) 1986-04-09 2007-05-16 Genzyme Corp Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern
US4851331A (en) 1986-05-16 1989-07-25 Allied Corporation Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase
US5202231A (en) 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
US5525464A (en) 1987-04-01 1996-06-11 Hyseq, Inc. Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes
US4873316A (en) 1987-06-23 1989-10-10 Biogen, Inc. Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5048530A (en) 1988-08-17 1991-09-17 Robert Hurwitz Method of using an amniocentesis needle with improved sonographic visibility
US5720928A (en) 1988-09-15 1998-02-24 New York University Image processing and analysis of individual nucleic acid molecules
DE68925966T2 (de) 1988-12-22 1996-08-29 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5075212A (en) 1989-03-27 1991-12-24 University Of Patents, Inc. Methods of detecting picornaviruses in biological fluids and tissues
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5766849A (en) 1989-07-11 1998-06-16 Gen-Probe Incorporated Methods of amplifying nucleic acids using promoter-containing primer sequence
GB2236186B (en) 1989-08-22 1994-01-05 Finnigan Mat Gmbh Process and device for laser desorption of analyte molecular ions, especially of biomolecules
WO1991006666A1 (en) 1989-11-06 1991-05-16 Cell Genesys, Inc. Production of proteins using homologous recombination
US5641628A (en) 1989-11-13 1997-06-24 Children's Medical Center Corporation Non-invasive method for isolation and detection of fetal DNA
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
WO1991010674A1 (en) 1990-01-12 1991-07-25 Scripps Clinic And Research Foundation Nucleic acid enzymes for cleaving dna
US6013431A (en) 1990-02-16 2000-01-11 Molecular Tool, Inc. Method for determining specific nucleotide variations by primer extension in the presence of mixture of labeled nucleotides and terminators
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
DK51092D0 (da) 1991-05-24 1992-04-15 Ole Buchardt Oligonucleotid-analoge betegnet pna, monomere synthoner og fremgangsmaade til fremstilling deraf samt anvendelser deraf
DE4214112A1 (de) 1991-08-02 1993-02-04 Europ Lab Molekularbiolog Neues verfahren zur sequenzierung von nukleinsaeuren
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
DE69326967T2 (de) 1992-01-17 2000-06-15 Lakowicz Joseph R Phasenmodulationsenergieübertragungsfluoroimmunassay
GB9208733D0 (en) 1992-04-22 1992-06-10 Medical Res Council Dna sequencing method
GB9211979D0 (en) 1992-06-05 1992-07-15 Buchard Ole Uses of nucleic acid analogues
DE69316369D1 (en) 1992-07-27 1998-02-19 Hybridon Inc Oligonukleotid alkylphosphonothiate
DE69333969T2 (de) 1992-10-30 2006-09-14 The General Hospital Corp., Boston Wechselwirkendes Fallensystem zur Isolierung von Proteinen
US6194144B1 (en) 1993-01-07 2001-02-27 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry
US5605798A (en) 1993-01-07 1997-02-25 Sequenom, Inc. DNA diagnostic based on mass spectrometry
WO1994016101A2 (en) 1993-01-07 1994-07-21 Koester Hubert Dna sequencing by mass spectrometry
CA2154358A1 (en) 1993-01-21 1994-08-04 Hybridon, Inc. Integrated oligonucleotides
US6045996A (en) 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US6156501A (en) 1993-10-26 2000-12-05 Affymetrix, Inc. Arrays of modified nucleic acid probes and methods of use
US5849542A (en) 1993-11-17 1998-12-15 Amersham Pharmacia Biotech Uk Limited Primer extension mass spectroscopy nucleic acid sequencing method
AU694187B2 (en) 1994-02-07 1998-07-16 Beckman Coulter, Inc. Ligase/polymerase-mediated genetic bit analysis TM of single nucleotide polymorphisms and its use in genetic analysis
US5637684A (en) 1994-02-23 1997-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphoramidate and phosphorothioamidate oligomeric compounds
EP0760002B1 (en) 1994-04-25 2003-08-27 Avitech Diagnostics, Inc. Detection of mutation by resolvase cleavage
US5851770A (en) 1994-04-25 1998-12-22 Variagenics, Inc. Detection of mismatches by resolvase cleavage using a magnetic bead support
US5834189A (en) 1994-07-08 1998-11-10 Visible Genetics Inc. Method for evaluation of polymorphic genetic sequences, and the use thereof in identification of HLA types
ES2222465T3 (es) * 1994-07-15 2005-02-01 Cephalon, Inc. Calpaina activa expresada por baculovirus.
US5589330A (en) 1994-07-28 1996-12-31 Genzyme Corporation High-throughput screening method for sequence or genetic alterations in nucleic acids using elution and sequencing of complementary oligonucleotides
US5849483A (en) 1994-07-28 1998-12-15 Ig Laboratories, Inc. High throughput screening method for sequences or genetic alterations in nucleic acids
US5662813A (en) 1994-10-21 1997-09-02 Bioseparations, Inc. Method for separation of nucleated fetal erythrocytes from maternal blood samples
US5807718A (en) 1994-12-02 1998-09-15 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules
DE69535789D1 (de) 1995-01-09 2008-08-28 Boehringer Ingelheim Int Il-2r-assoziiertes polypeptid und dafür kodierende dna-molekülen
US6239273B1 (en) 1995-02-27 2001-05-29 Affymetrix, Inc. Printing molecular library arrays
DE19515552A1 (de) 1995-04-27 1996-10-31 Europ Lab Molekularbiolog Simultane Sequenzierung von Nukleinsäuren
US5962674A (en) 1995-06-01 1999-10-05 Hybridon, Inc. Synthesis of oligonucleotides containing alkylphosphonate internucleoside linkages
US5955599A (en) 1995-06-01 1999-09-21 Hybridon, Inc. Process for making oligonucleotides containing o- and s- methylphosphotriester internucleoside linkages
US5614622A (en) 1995-06-01 1997-03-25 Hybridon, Inc. 5-pentenoyl moiety as a nucleoside-amino protecting group, 4-pentenoyl-protected nucleotide synthons, and related oligonucleotide syntheses
US6140482A (en) 1995-06-01 2000-10-31 Hybridon, Inc. Primary phosphoramidate internucleoside linkages and oligonucleotides containing the same
US5981186A (en) 1995-06-30 1999-11-09 Visible Genetics, Inc. Method and apparatus for DNA-sequencing using reduced number of sequencing mixtures
US5637683A (en) 1995-07-13 1997-06-10 Cornell Research Foundation, Inc. Nucleic acid analog with amide linkage and method of making that analog
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
JP3193301B2 (ja) 1995-09-14 2001-07-30 麒麟麦酒株式会社 生理活性タンパク質ｐ１６０
US5869242A (en) 1995-09-18 1999-02-09 Myriad Genetics, Inc. Mass spectrometry to assess DNA sequence polymorphisms
GB9519638D0 (en) * 1995-09-26 1995-11-29 Dynal As Method
CA2248084A1 (en) 1996-03-04 1997-09-12 Genetrace Systems, Inc. Methods of screening nucleic acids using mass spectrometry
AU2217597A (en) 1996-03-18 1997-10-22 Sequenom, Inc. Dna sequencing by mass spectrometry
US6759217B2 (en) 1996-03-26 2004-07-06 Oncomedx, Inc. Method enabling use of extracellular RNA extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer
US6329179B1 (en) 1996-03-26 2001-12-11 Oncomedx, Inc. Method enabling use of extracellular RNA extracted from plasma or serum to detect, monitor or evaluate cancer
CA2253710A1 (en) 1996-04-25 1997-10-30 Spectrametrix Inc. Analyte assay using particulate labels
US5928906A (en) 1996-05-09 1999-07-27 Sequenom, Inc. Process for direct sequencing during template amplification
US5786146A (en) 1996-06-03 1998-07-28 The Johns Hopkins University School Of Medicine Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids
IL127560A0 (en) 1996-06-14 1999-10-28 Sarnoff Corp Method for polynucleotide sequencing
WO1998008858A1 (en) 1996-08-26 1998-03-05 Hybridon, Inc. Improved reagents and process for synthesis of oligonucleotides containing phosphorodithioate internucleoside linkages
US5849546A (en) 1996-09-13 1998-12-15 Epicentre Technologies Corporation Methods for using mutant RNA polymerases with reduced discrimination between non-canonical and canonical nucleoside triphosphates
US5886165A (en) 1996-09-24 1999-03-23 Hybridon, Inc. Mixed backbone antisense oligonucleotides containing 2'-5'-ribonucleotide- and 3'-5'-deoxyribonucleotides segments
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
US6057134A (en) 1996-10-07 2000-05-02 Ambion, Inc. Modulating the efficiency of nucleic acid amplification reactions with 3' modified oligonucleotides
US7285422B1 (en) 1997-01-23 2007-10-23 Sequenom, Inc. Systems and methods for preparing and analyzing low volume analyte array elements
US6024925A (en) 1997-01-23 2000-02-15 Sequenom, Inc. Systems and methods for preparing low volume analyte array elements
DE69735112T2 (de) 1996-11-06 2006-09-07 Sequenom, Inc., San Diego Verfahren zur Analyse und Vorrichtung
US6140053A (en) 1996-11-06 2000-10-31 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry via exonuclease degradation
ES2192672T3 (es) 1996-11-18 2003-10-16 Takeshi Imanishi Nuevos analogos de nucleotidos.
US6017702A (en) 1996-12-05 2000-01-25 The Perkin-Elmer Corporation Chain-termination type nucleic acid sequencing method including 2'-deoxyuridine-5'-triphosphate
US5876934A (en) 1996-12-18 1999-03-02 Pharmacia Biotech Inc. DNA sequencing method
US6046005A (en) 1997-01-15 2000-04-04 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid sequencing with solid phase capturable terminators comprising a cleavable linking group
US20010051341A1 (en) 1997-03-04 2001-12-13 Isis Innovation Limited Non-invasive prenatal diagnosis
GB9704444D0 (en) 1997-03-04 1997-04-23 Isis Innovation Non-invasive prenatal diagnosis
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US5849497A (en) 1997-04-03 1998-12-15 The Research Foundation Of State University Of New York Specific inhibition of the polymerase chain reaction using a non-extendable oligonucleotide blocker
US6143496A (en) 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
US5739314A (en) 1997-04-25 1998-04-14 Hybridon, Inc. Method for synthesizing 2'-O-substituted pyrimidine nucleosides
ATE320505T1 (de) 1997-05-30 2006-04-15 Xenomics Verfahren zur bestimmung von nukleinsäuresequenzen in urin
DE69823206T2 (de) 1997-07-25 2004-08-19 Affymetrix, Inc. (a Delaware Corp.), Santa Clara Verfahren zur herstellung einer bio-informatik-datenbank
DE69827154T2 (de) 1997-08-15 2006-03-09 Affymetrix, Inc. (n.d.Ges.d.Staates Delaware), Santa Clara Polymorphismuserkennung mit hilfe cluster-analyse
DE19754482A1 (de) 1997-11-27 1999-07-01 Epigenomics Gmbh Verfahren zur Herstellung komplexer DNA-Methylierungs-Fingerabdrücke
US5998143A (en) 1997-12-05 1999-12-07 The Perkin-Elmer Corporation Cycle sequencing thermal profiles
EP1053352B1 (en) 1998-02-04 2002-09-18 Variagenics, Inc. Mismatch detection techniques
SG71920A1 (en) * 1998-04-27 2000-04-18 Texas Instruments Inc Method and apparatus for driving a polyphase brushless dc motor
US6183958B1 (en) 1998-05-06 2001-02-06 Variagenics, Inc. Probes for variance detection
US6723564B2 (en) 1998-05-07 2004-04-20 Sequenom, Inc. IR MALDI mass spectrometry of nucleic acids using liquid matrices
US20030022207A1 (en) 1998-10-16 2003-01-30 Solexa, Ltd. Arrayed polynucleotides and their use in genome analysis
US6140054A (en) 1998-09-30 2000-10-31 University Of Utah Research Foundation Multiplex genotyping using fluorescent hybridization probes
US6610492B1 (en) 1998-10-01 2003-08-26 Variagenics, Inc. Base-modified nucleotides and cleavage of polynucleotides incorporating them
NO986133D0 (no) 1998-12-23 1998-12-23 Preben Lexow FremgangsmÕte for DNA-sekvensering
US6136541A (en) 1999-02-22 2000-10-24 Vialogy Corporation Method and apparatus for analyzing hybridized biochip patterns using resonance interactions employing quantum expressor functions
US6142681A (en) 1999-02-22 2000-11-07 Vialogy Corporation Method and apparatus for interpreting hybridized bioelectronic DNA microarray patterns using self-scaling convergent reverberant dynamics
ES2269113T3 (es) 1999-03-24 2007-04-01 Exiqon A/S Sintesis mejorada de -2.2.1 / biciclo-nucleosidos.
US6368834B1 (en) 1999-04-06 2002-04-09 Genome Technologies, Llc PCR genome walking with synthetic primer
EP1173622B1 (en) 1999-04-30 2005-06-15 Methexis Genomics N.V. Diagnostic sequencing by a combination of specific cleavage and mass spectrometry
KR20010001577A (ko) 1999-06-07 2001-01-05 윤종용 고분자 광산발생제를 이용한 올리고펩티드 핵산 탐침의 제조방법
KR100865105B1 (ko) 1999-06-28 2008-10-24 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 마이크로 가공된 탄성중합체 밸브 및 펌프 시스템
US6440706B1 (en) 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
AU6629200A (en) 1999-08-25 2001-03-19 Philip P Garner Alpha-helical peptide nucleic acid alpha-pna
US20050287592A1 (en) 2000-08-29 2005-12-29 Yeda Research And Development Co. Ltd. Template-dependent nucleic acid polymerization using oligonucleotide triphosphates building blocks
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
AU7751600A (en) 1999-10-06 2001-05-10 Amersham Biosciences Corp. Method for detecting mutations using arrayed primer extension
US6221600B1 (en) 1999-10-08 2001-04-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial oligonucleotide PCR: a method for rapid, global expression analysis
EP1235932A2 (en) 1999-10-08 2002-09-04 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for performing large numbers of reactions using array assembly
US6297016B1 (en) 1999-10-08 2001-10-02 Applera Corporation Template-dependent ligation with PNA-DNA chimeric probes
US20030190644A1 (en) 1999-10-13 2003-10-09 Andreas Braun Methods for generating databases and databases for identifying polymorphic genetic markers
US6709816B1 (en) 1999-10-18 2004-03-23 Affymetrix, Inc. Identification of alleles
US6660229B2 (en) 2000-06-13 2003-12-09 The Trustees Of Boston University Use of nucleotide analogs in the analysis of oligonucleotide mixtures and in highly multiplexed nucleic acid sequencing
WO2002018616A1 (en) 2000-09-01 2002-03-07 Hitachi Chemical Co., Ltd. Adjusting the efficiency of nucleic acid template amplification by attenuated pcr with template-mimic oligonucleotides
US6664056B2 (en) 2000-10-17 2003-12-16 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive prenatal monitoring
US6929911B2 (en) 2000-11-01 2005-08-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method for determining genetic affiliation, substructure and gene flow within human populations
US20060136142A1 (en) 2000-11-02 2006-06-22 Kurt Berlin Systems, methods and computer program products for guiding selection of a therapeutic treatment regimen based on the methylation status of the DNA
DE10061348C2 (de) 2000-12-06 2002-10-24 Epigenomics Ag Verfahren zur Quantifizierung von Cytosin-Methylierungen in komplex amplifizierter genomischer DNA
EP1229128A1 (en) 2001-01-31 2002-08-07 Boehringer Mannheim Gmbh New method for genotype determination
DE10112515B4 (de) 2001-03-09 2004-02-12 Epigenomics Ag Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern mit hoher Sensitivität
CA2444994A1 (en) 2001-04-20 2002-10-31 Karolinska Innovations Ab Methods for high throughput genome analysis using restriction site tagged microarrays
DE10130800B4 (de) 2001-06-22 2005-06-23 Epigenomics Ag Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung mit hoher Sensitivität
US20030054386A1 (en) 2001-06-22 2003-03-20 Stylianos Antonarakis Method for detecting diseases caused by chromosomal imbalances
US20050037388A1 (en) 2001-06-22 2005-02-17 University Of Geneva Method for detecting diseases caused by chromosomal imbalances
MXPA04000432A (es) 2001-07-15 2004-10-27 Keck Graduate Inst Amplificacion de fragmentos de acido nucleico empleando agentes de mella.
DK1421215T3 (da) 2001-07-25 2011-06-27 Oncomedx Inc Fremgangsmåder til evaluering af patologiske tilstande under anvendelse af ekstracellulært RNA
TWI257426B (en) 2001-08-20 2006-07-01 Takara Bio Inc Nucleic acid amplification methods
US6927028B2 (en) 2001-08-31 2005-08-09 Chinese University Of Hong Kong Non-invasive methods for detecting non-host DNA in a host using epigenetic differences between the host and non-host DNA
DE10201138B4 (de) 2002-01-08 2005-03-10 Epigenomics Ag Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierungsmustern durch exponentielle Ligation hybridisierter Sondenoligonukleotide (MLA)
US20030211522A1 (en) 2002-01-18 2003-11-13 Landes Gregory M. Methods for fetal DNA detection and allele quantitation
KR20040102024A (ko) 2002-03-01 2004-12-03 라브겐, 인코퍼레이티드 유전적 장애의 검출 방법
US6977162B2 (en) 2002-03-01 2005-12-20 Ravgen, Inc. Rapid analysis of variations in a genome
DE60310697D1 (de) 2002-03-15 2007-02-08 Epigenomics Ag Entdeckungs- und diagnoseverfahren mit 5-methylcytosin-dna-glycosylase
US6908755B2 (en) * 2002-03-21 2005-06-21 Ken-Shwo Dai Human megakaryocyte-associated tyrosine kinase (MATK)-related gene variant associated with lung cancers
US20050164193A1 (en) 2002-03-25 2005-07-28 Epigenomics Ag Method for the analysis of methylation patterns within nucleic acids by means of mass spectrometry
US7081339B2 (en) 2002-04-12 2006-07-25 Primera Biosystems, Inc. Methods for variation detection
US7442506B2 (en) 2002-05-08 2008-10-28 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US20030211483A1 (en) 2002-05-09 2003-11-13 Schroeder Benjamin G. Methods for the enrichment of low-abundance polynucleotides
WO2004013284A2 (en) 2002-08-02 2004-02-12 Tufts University A method to assess genomic dna methylation using high-performance liquid chromatography-electospray ionization mass spectrometry
CN1703521B (zh) 2002-09-06 2011-11-16 波士顿大学信托人 基因表达的定量
CN1774511B (zh) 2002-11-27 2013-08-21 斯昆诺有限公司 用于序列变异检测和发现的基于断裂的方法和系统
CN101245376A (zh) 2003-01-17 2008-08-20 香港中文大学 作为妊娠相关病症的诊断标志物的循环mRNA
CA2513889A1 (en) 2003-01-29 2004-08-19 454 Corporation Double ended sequencing
JP2006521086A (ja) 2003-02-28 2006-09-21 ラブジェン， インコーポレイテッド 遺伝子疾患の検出方法
AU2003900944A0 (en) 2003-02-28 2003-03-13 The University Of Queensland Cell isolation & enrichment
AU2004217872B2 (en) 2003-03-05 2010-03-25 Genetic Technologies Limited Identification of fetal DNA and fetal cell markers in maternal plasma or serum
US20050009059A1 (en) 2003-05-07 2005-01-13 Affymetrix, Inc. Analysis of methylation status using oligonucleotide arrays
WO2005010145A2 (en) 2003-07-05 2005-02-03 The Johns Hopkins University Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations
DE602004019941D1 (de) 2003-07-31 2009-04-23 Sequenom Inc Verfahren für multiplex-polymerasekettenreaktionen auf hohem niveau und homogenen massenverlängerungsreaktionen zur genotypisierung von polymorphismen
AU2003263660A1 (en) 2003-08-29 2005-03-16 Pantarhei Bioscience B.V. Prenatal diagnosis of down syndrome by detection of fetal rna markers in maternal blood
EP2354253A3 (en) 2003-09-05 2011-11-16 Trustees of Boston University Method for non-invasive prenatal diagnosis
KR20060101470A (ko) * 2003-09-22 2006-09-25 트라이소겐 바이오테크놀로지 리미티드 파트너쉽 좌위 복제 수에서의 변동을 검출하기 위한 방법 및 이에유용한 키트
CN1930303B (zh) 2003-10-08 2013-11-20 波士顿大学信托人 染色体异常的产前诊断试剂盒
EP1524321B2 (en) 2003-10-16 2014-07-23 Sequenom, Inc. Non-invasive detection of fetal genetic traits
ES2383970T3 (es) 2003-10-21 2012-06-27 Orion Genomics, Llc Fragmentación enzimática diferencial
JP2007515947A (ja) 2003-10-30 2007-06-21 タフツ−ニュー イングランド メディカル センター 羊水中の無細胞胎児ｄｎａを使用する出生前診断
US20070111233A1 (en) 2003-10-30 2007-05-17 Bianchi Diana W Prenatal diagnosis using cell-free fetal DNA in amniotic fluid
EP1721014B1 (en) 2004-02-18 2013-07-17 Trustees Of Boston University Method for detecting and quantifying rare mutations/polymorphisms
US20100216153A1 (en) 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
JP4492156B2 (ja) 2004-03-03 2010-06-30 ニプロ株式会社 血清アルブミンドメインを含む蛋白質
EP2395098B1 (en) 2004-03-26 2015-07-15 Agena Bioscience, Inc. Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis
US7608394B2 (en) 2004-03-26 2009-10-27 Sequenom, Inc. Methods and compositions for phenotype identification based on nucleic acid methylation
US7468249B2 (en) 2004-05-05 2008-12-23 Biocept, Inc. Detection of chromosomal disorders
DE602005017781D1 (de) 2004-06-01 2009-12-31 Univ North Carolina Rekonstituierter histon-methyltransferase-komplex und verfahren zur identifizierung von modulatoren dafür
US7709194B2 (en) 2004-06-04 2010-05-04 The Chinese University Of Hong Kong Marker for prenatal diagnosis and monitoring
US20060166228A1 (en) 2004-07-30 2006-07-27 Page David C Markers of alterations in the Y chromosome and uses therefor
JP2008513031A (ja) 2004-09-20 2008-05-01 プロテオジェニックス， インコーポレイテッド 胎児異数性の診断
US7415644B2 (en) 2004-10-22 2008-08-19 International Business Machines Corporation Self-repairing of microprocessor array structures
WO2006056478A1 (en) 2004-11-29 2006-06-01 Klinikum Der Universität Regensburg Kits and methods for detecting methylated dna
WO2006056480A2 (en) * 2004-11-29 2006-06-01 Klinikum Der Universität Regensburg Means and methods for detecting methylated dna
AU2006224971B2 (en) 2005-03-18 2009-07-02 Boston University A method for the detection of chromosomal aneuploidies
CA3007182A1 (en) 2005-03-18 2006-09-21 The Chinese University Of Hong Kong Markers for prenatal diagnosis, monitoring or predicting preeclampsia
US20070048755A1 (en) 2005-03-22 2007-03-01 New York University Assay for determining the sex of primates
CA2617738A1 (en) 2005-08-02 2007-02-08 Sequenom, Inc. Methods and compositions for disease prognosis based on nucleic acid methylation
US20070122823A1 (en) 2005-09-01 2007-05-31 Bianchi Diana W Amniotic fluid cell-free fetal DNA fragment size pattern for prenatal diagnosis
TR201910868T4 (tr) 2006-02-02 2019-08-21 Univ Leland Stanford Junior Dijital analizle invazif olmayan fetal genetik tarama.
WO2007100911A2 (en) 2006-02-28 2007-09-07 University Of Louisville Research Foundation Detecting fetal chromosomal abnormalities using tandem single nucleotide polymorphisms
CN101421410A (zh) * 2006-03-06 2009-04-29 纽约市哥伦比亚大学托管会 从混合的胎儿-母体来源中特异性扩增胎儿dna序列
US20070243549A1 (en) 2006-04-12 2007-10-18 Biocept, Inc. Enrichment of circulating fetal dna
US7901884B2 (en) 2006-05-03 2011-03-08 The Chinese University Of Hong Kong Markers for prenatal diagnosis and monitoring
US7754428B2 (en) * 2006-05-03 2010-07-13 The Chinese University Of Hong Kong Fetal methylation markers
EP2029777B1 (en) 2006-05-31 2017-03-08 Sequenom, Inc. Methods and compositions for the extraction of nucleic acid from a sample
US20080070792A1 (en) 2006-06-14 2008-03-20 Roland Stoughton Use of highly parallel snp genotyping for fetal diagnosis
CN101501251A (zh) 2006-06-16 2009-08-05 塞昆纳姆股份有限公司 扩增、检测和定量样品中核酸的方法和组合物
US7902345B2 (en) 2006-12-05 2011-03-08 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
US8133701B2 (en) 2006-12-05 2012-03-13 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
US8262900B2 (en) 2006-12-14 2012-09-11 Life Technologies Corporation Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays
WO2008098142A2 (en) 2007-02-08 2008-08-14 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for rhd typing, gender determination and nucleic acid quantification
WO2008103763A2 (en) 2007-02-20 2008-08-28 Sequenom, Inc. Methods and compositions for cancer diagnosis and treatment based on nucleic acid methylation
GB0703996D0 (en) 2007-03-01 2007-04-11 Oxitec Ltd Nucleic acid detection
AU2008230813B2 (en) 2007-03-26 2014-01-30 Sequenom, Inc. Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
WO2008157264A2 (en) 2007-06-15 2008-12-24 Sequenom, Inc. Combined methods for the detection of chromosomal aneuploidy
CA3176319A1 (en) 2007-07-23 2009-01-29 The Chinese University Of Hong Kong Analyzing tumor dna in a cell-free sample
EP2195452B1 (en) 2007-08-29 2012-03-14 Sequenom, Inc. Methods and compositions for universal size-specific polymerase chain reaction
WO2009032779A2 (en) 2007-08-29 2009-03-12 Sequenom, Inc. Methods and compositions for the size-specific seperation of nucleic acid from a sample
US8748100B2 (en) 2007-08-30 2014-06-10 The Chinese University Of Hong Kong Methods and kits for selectively amplifying, detecting or quantifying target DNA with specific end sequences
CN101883851A (zh) * 2007-09-21 2010-11-10 生物概念股份有限公司 胎儿细胞和核酸的鉴定和分离
CN101889096B (zh) 2007-10-04 2015-10-21 联邦科学及工业研究组织 核酸扩增
AU2008308457A1 (en) 2007-10-04 2009-04-09 Halcyon Molecular Sequencing nucleic acid polymers with electron microscopy
US8093063B2 (en) 2007-11-29 2012-01-10 Quest Diagnostics Investments Incorporated Assay for detecting genetic abnormalities in genomic nucleic acids
EP2620511B1 (en) 2008-01-17 2018-02-28 Sequenom, Inc. Single molecule nucleic acid sequence analysis processes
EP2271772B1 (en) 2008-03-11 2014-07-16 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
US8206926B2 (en) 2008-03-26 2012-06-26 Sequenom, Inc. Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
CN102245760A (zh) 2008-07-07 2011-11-16 牛津纳米孔技术有限公司 酶-孔构建体
ES2620431T3 (es) 2008-08-04 2017-06-28 Natera, Inc. Métodos para la determinación de alelos y de ploidía
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
ES2599967T3 (es) 2008-09-16 2017-02-06 Sequenom, Inc. Procedimientos y composiciones para el enriquecimiento basado en metilación de ácido nucleico fetal de una muestra materna útiles para diagnósticos prenatales no invasivos
EP2334812B1 (en) 2008-09-20 2016-12-21 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by sequencing
US20100240054A1 (en) 2008-09-22 2010-09-23 Biocept, Inc. Identification and isolation of fetal cells and nucleic acid
CA2743211A1 (en) 2008-11-12 2010-05-20 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. Methods and systems of using exosomes for determining phenotypes
WO2010065470A2 (en) 2008-12-01 2010-06-10 Consumer Genetics, Inc. Compositions and methods for detecting background male dna during fetal sex determination
CN102428191A (zh) 2009-03-18 2012-04-25 塞昆纳姆股份有限公司 热稳定性内切核酸酶在产生报道分子中的应用
US8771948B2 (en) 2009-04-03 2014-07-08 Sequenom, Inc. Nucleic acid preparation compositions and methods
US8211735B2 (en) * 2009-06-08 2012-07-03 International Business Machines Corporation Nano/microwire solar cell fabricated by nano/microsphere lithography
US8563242B2 (en) 2009-08-11 2013-10-22 The Chinese University Of Hong Kong Method for detecting chromosomal aneuploidy
AU2015252141A1 (en) 2009-09-16 2015-12-03 Sequenom Center For Molecular Medicine Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
HUE034854T2 (en) 2009-11-05 2018-03-28 Univ Hong Kong Chinese Fetal genomic analysis from maternal biological samples
EP3406737B1 (en) 2009-11-06 2023-05-31 The Chinese University of Hong Kong Size-based genomic analysis
ES2577017T3 (es) 2009-12-22 2016-07-12 Sequenom, Inc. Procedimientos y kits para identificar la aneuploidia
EP2848703A1 (en) 2010-01-19 2015-03-18 Verinata Health, Inc Simultaneous determination of aneuploidy and fetal fraction
AU2011207561B2 (en) 2010-01-19 2014-02-20 Verinata Health, Inc. Partition defined detection methods
CA2786174A1 (en) 2010-01-26 2011-08-04 Nipd Genetics Ltd Methods and compositions for noninvasive prenatal diagnosis of fetal aneuploidies
EP2534263B1 (en) 2010-02-09 2020-08-05 Unitaq Bio Methods and compositions for universal detection of nucleic acids
US20140186827A1 (en) 2010-05-14 2014-07-03 Fluidigm, Inc. Assays for the detection of genotype, mutations, and/or aneuploidy
WO2011143659A2 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Fluidigm Corporation Nucleic acid isolation methods
EP2572003A4 (en) 2010-05-18 2016-01-13 Natera Inc METHOD FOR NONINVASIVE PRANATAL PLOIDIE ASSIGNMENT
US8603742B2 (en) 2010-07-06 2013-12-10 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Methods for the diagnosis of fetal disease
EP2596127A2 (en) 2010-07-23 2013-05-29 Esoterix Genetic Laboratories, LLC Identification of differentially represented fetal or maternal genomic regions and uses thereof
CN103384725A (zh) 2010-12-23 2013-11-06 塞昆纳姆股份有限公司 胎儿遗传变异的检测
US20120219950A1 (en) 2011-02-28 2012-08-30 Arnold Oliphant Assay systems for detection of aneuploidy and sex determination
US8450061B2 (en) 2011-04-29 2013-05-28 Sequenom, Inc. Quantification of a minority nucleic acid species
US9139874B2 (en) 2011-07-07 2015-09-22 Life Technologies Corporation Bi-directional sequencing compositions and methods
US9367663B2 (en) 2011-10-06 2016-06-14 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP3922731A3 (en) 2011-10-06 2022-01-05 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CA2851537C (en) 2011-10-11 2020-12-29 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP3401399B1 (en) 2012-03-02 2020-04-22 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
WO2013176958A1 (en) 2012-05-21 2013-11-28 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
CA2874195C (en) 2012-05-21 2020-08-25 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2014011928A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US11060145B2 (en) 2013-03-13 2021-07-13 Sequenom, Inc. Methods and compositions for identifying presence or absence of hypermethylation or hypomethylation locus
EP3736344A1 (en) 2014-03-13 2020-11-11 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CN106544407B (zh) 2015-09-18 2019-11-08 广州华大基因医学检验所有限公司 确定受体cfDNA样本中供体来源cfDNA比例的方法
JP6447765B1 (ja) 2017-11-21 2019-01-09 株式会社リコー 検査デバイス及びデバイス

Also Published As

Publication number Publication date
US20130296180A1 (en) 2013-11-07
US20150275304A1 (en) 2015-10-01
HK1254596A1 (zh) 2019-07-26
JP2018038438A (ja) 2018-03-15
JP2016000057A (ja) 2016-01-07
US20130150249A1 (en) 2013-06-13
US20100105049A1 (en) 2010-04-29
JP2013505019A (ja) 2013-02-14
JP6039034B2 (ja) 2016-12-07
JP2023033606A (ja) 2023-03-10
US20130143211A1 (en) 2013-06-06
EP2478119B1 (en) 2017-07-26
JP2017000165A (ja) 2017-01-05
US20200362414A1 (en) 2020-11-19
WO2011034631A1 (en) 2011-03-24
CA3024967A1 (en) 2011-03-24
EP3330382A1 (en) 2018-06-06
EP3722440A1 (en) 2020-10-14
JP2020174678A (ja) 2020-10-29
EP2478119A1 (en) 2012-07-25
JP5873434B2 (ja) 2016-03-01
AU2010295968B2 (en) 2015-08-20
JP2015091262A (ja) 2015-05-14
CN102648292A (zh) 2012-08-22
US20120277119A1 (en) 2012-11-01
US10738358B2 (en) 2020-08-11
CA3024967C (en) 2021-07-27
CA2774342C (en) 2019-01-15
AU2010295968A1 (en) 2012-04-19
JP6513622B2 (ja) 2019-05-15
IN2012DN03139A (es) 2015-09-18
US8476013B2 (en) 2013-07-02
EP2478119A4 (en) 2013-01-23
CA3122552A1 (en) 2011-03-24
CA2774342A1 (en) 2011-03-24
EP3330382B1 (en) 2020-03-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2650666T3 (es) Procesos y composiciones para el enriquecimiento basado en metilación de ácido nucleico fetal de una muestra materna útil para diagnósticos prenatales no invasivos
US20200208212A1 (en) Processes and Compositions for Methylation-Based Enrichment of Fetal Nucleic Acid From a Maternal Sample Useful for Non-Invasive Prenatal Diagnoses
JP6634105B2 (ja) 非侵襲性の出生前診断のために有用な、母体サンプル由来の胎児核酸のメチル化に基づく濃縮のためのプロセスおよび組成物
JP2015521862A (ja) 非侵襲性の出生前診断に有用な母体サンプル由来の胎児核酸のメチル化に基づく富化のためのプロセスおよび組成物
AU2017251674B2 (en) Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses