ES2222465T3

ES2222465T3 - Calpaina activa expresada por baculovirus.

Info

Publication number: ES2222465T3
Application number: ES95926185T
Authority: ES
Inventors: Sheryl L. Meyer; Richard W. Scott; Robert Siman
Original assignee: Cephalon LLC
Current assignee: Cephalon LLC
Priority date: 1994-07-15
Filing date: 1995-07-06
Publication date: 2005-02-01
Anticipated expiration: 2015-07-06
Also published as: JPH10503645A; US5869336A; DE69533135T2; EP0773991A4; WO1996002634A1; US6057143A; AU3003395A; PT773991E; EP0773991B1; CA2194763A1; DE69533135D1; EP0773991A1; JP4429385B2; DK0773991T3; ATE268816T1

Abstract

LA PRESENTE INVENCION ESTA DIRIGIDA A CALPAINA ENZIMATICAMENTE ACTIVO DE MAMIFERO PRODUCIDO EN CELULAS DE INSECTO MEDIANTE ELEMENTOS RECOMBINANTES. SE DESCRIBEN VECTORES RECOMBINANTES Y BACULOVIRUS QUE CONTIENEN CADN QUE CODIFICA LA SUBUNIDAD DE 80 KDA, LA SUBUNIDAD DE 30 KDA, Y AMBAS SUBUNIDADES. TAMBIEN SE DESCRIBEN METODOS PARA PRODUCIR CALPAIN RECOMBINANTE ENZIMATICAMENTE ACTIVO DE MAMIFERO.

Description

Calpaína activa expresada por baculovirus.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la calpaína humana recombinante enzimáticamente activa y su procedimiento de preparación usando tecnología recombinante en un sistema de baculovirus-célula de insecto.

Antecedentes de la invención A. Calpaína

La calpaína es una proteasa neutra activada por calcio, también conocida como CANP; EC 3.4.22.17. Es una cisteína proteasa intracelular que se expresa de manera ubicua en los tejidos de los mamíferos (Aoki y col., FEBS Letters 205: 313-317, 1986). Se ha implicado a la calpaína en muchas enfermedades degenerativas que incluyen, aunque no se limitan a, neurodegeneración (enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington y enfermedad de Parkinson), amiotrofia, accidente cerebrovascular, lesión de las neuronas motoras, lesión aguda del sistema nervioso central (SNC), distrofia muscular, reabsorción ósea, agregación plaquetaria e inflamación.

La calpaína de los mamíferos, incluyendo la calpaína humana, es multimérica. Está formada por dos subunidades diferentes, que son una subunidad de 30 kDa y una subunidad de 80 kDa, y, por lo tanto, es un heterodímero. Hay dos formas de calpaína, calpaína I (\mu-calpaína, \muCANP) y calpaína II (m-calpaína, mCANP), que se diferencian por su sensibilidad a la concentración de calcio necesaria para la activación. La calpaína I sólo precisa concentraciones micromolares bajas de calcio para su activación, mientras que la calpaína II precisa concentraciones micromolares altas o milimolares (Aoki y col., supra., y DeLuca y col., Biochim. Biophys. Acta 1216: 81-83, 1993). La misma subunidad de 30 kDa es común a las dos formas. Las dos calpaínas humanas difieren en las secuencias del ADN que codifica su subunidad de 80 kDa, y comparten una homología de 62%. Hay datos de que la subunidad de 80 kDa es inactiva, pero se autolisa a una forma activa de 76 kDa en presencia de calcio (Zimmerman y col., Biochem. Biophys. Acta 1078: 192-198, 1991).

R. Siman, en Neurotoxicity of Excitatory Amino Acids, A. Guidotti, ed., Raven Press, Ltd., Nueva York (1990), describió la función de la calpaína I en la neurotoxicidad inducida por aminoácidos excitadores (AAE), que finalmente lleva a la muerte célula neuronal. Siman anticipó la propuesta de que la activación de la calpaína I es un episodio temprano en el proceso neurodegenerativo y no sólo simplemente una respuesta secundaria a la muerte neuronal. Siman además describió que en ese momento sólo se disponía de un bloqueante altamente selectivo de la calpaína, la calpastatina. Sin embargo, las células no captan fácilmente calpastatina, porque es una proteína globulosa de gran tamaño, aproximadamente 280 kDa. Siman también describió que los inhibidores de proteasas de una especificidad más amplia, incluyendo la leupeptina, eran ineficaces para reducir la degradación proteica inducida por AAE in vivo. La leupeptina fue ineficaz probablemente porque no pudo entrar en las células.

Iwamoto y col., Brain Research, 561: 177-180 (1991), describieron que la activación de la calpaína puede ser un factor importante en la proteólisis anormal que subyace a la acumulación de placas y de marañas en el tejido cerebral de personas que sufren demencia de tipo Alzheimer.

Saito y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2628-2632 (1993) describieron que la pérdida sináptica y la muerte celular neuronal se corresponden en gran medida con el grado de deterioro cognitivo en la enfermedad de Alzheimer. También describieron que la calpaína I estaba significativamente activada en el cerebro humano postmortem de pacientes con enfermedad de Alzheimer, y que el grado de activación se correspondía con las regiones el cerebro que mostraban la mayor cantidad de degeneración. Se indicó que las influencias de la activación de la calpaína pueden contribuir a la patología neurofibrilar y al procesamiento anormal de las proteínas precursoras del amiloide antes de producir pérdida de las sinapsis o muerte celular en las poblaciones neuronales más vulnerables. Debido a la asociación entre la calpaína y las enfermedades degenerativas nerviosas, la modulación farmacológica de las calpaínas por los inhibidores merece consideración como posible estrategia terapéutica en esas enfermedades, por ejemplo, en la enfermedad de Alzheimer.

Rami y col., Brain Research, 609: 67-70 (1993). describieron que tanto el inhibidor I de la calpaína como la leupeptina protegían a las neuronas frente a la lesión isquémica y tóxica que se debe a la isquemia que se induce cuando se pinzan las dos arterias carótidas y se reduce la tensión arterial de las ratas.

Lee y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7233-7237 (1991), aportan datos de que la proteólisis activada por calcio es un acontecimiento importante en el proceso de muerte celular post-isquémica y describieron que la inhibición de la proteólisis activada por calcio mediante el inhibidor proteolítico leupeptina protegía frente a la degeneración de las neuronas vulnerables del hipocampo después de la isquemia. Se seleccionó la leupeptina porque era el único inhibidor de las proteasas que se había mostrado previamente que bloqueaba una respuesta de calpaína desencadenada por un traumatismo in vivo (Seubert y col., Brain Res., 459: 226-232, 1988). Sin embargo, los autores advirtieron que la utilidad terapéutica de la modulación de la proteólisis activada por calcio dependerá probablemente del desarrollo de inhibidores de las proteasas más permeables, potentes y específicos.

Como es evidente de lo anterior, los inhibidores específicos de la calpaína pueden suponer un medio para tratar las enfermedades neurodegenerativas en las que está implicada la calpaína. La calpastatina ofrece una utilidad escasa debido a su impermeabilidad celular. Los inhibidores de las proteasas de especificidad más amplia pueden no actuar in vivo y/o pueden tener efectos adversos indeseables. Así, se deben identificar otros inhibidores de la calpaína, y una fuente fácil, conveniente y segura de calpaína favorecerá la investigación en búsqueda de esos inhibidores.

B. ADNc de calpaína

La calpaína humana recombinante enzimáticamente activa para hacer estudios en busca de inhibidores ofrece las ventajas de 1) ser una fuente considerablemente más conveniente y fácilmente disponible de grandes cantidades del enzima, 2) ser más fácil de purificar y 3) estar libre de los problemas de seguridad que se deben abordar cuando la fuente es un tejido humano, especialmente células sanguíneas humanas, es decir, virus potencialmente peligrosos. La calpaína humana natural se aísla actualmente a partir de eritrocitos humanos y se puede purificar hasta lo que los autores caracterizan como homogeneidad aparente (Hatanaka y col., Biomed. Res., 4: 381-388, 1983). Sin embargo, aparte de los problemas evidentes con la fuente, el procedimiento de purificación puede ser bastante tedioso, debido a las bajas concentraciones de calpaína en relación con la cantidad de material inicial. Además, la calpaína natural se aísla en presencia de un inhibidor endógeno (calpastatina) que se debe separar durante la purificación. Una buena fuente de grandes cantidades de calpaína enzimáticamente activa potenciaría mucho la investigación en búsqueda de inhibidores de la calpaína mediante 1) el incremento de la disponibilidad de calpaína para su uso en ensayos reproducibles de inhibidores de la calpaína y 2) la facilitación de la cristalización del enzima, lo que permite el diseño de inhibidores racionales. Un sistema recombinante para la producción facilita aún más la producción de mutantes dirigidos para ayudar a los estudios estructurales. Por lo tanto, es necesario un sistema recombinante para producir calpaína activa.

El problema de la producción de la calpaína enzimáticamente activa por medios recombinante es el de expresar dos productos génicos diferentes (la subunidad de 80 kDa y la subunidad de 30 kDa), conseguir un procesamiento y plegado adecuados de los productos individuales, y obtener la combinación adecuada de los dos productos para producir moléculas enzimáticamente activas. Como se ha afirmado en el análisis previo, se ha implicado a la calpaína activada en la muerte de células neuronales. Entonces, lamentablemente cabría esperar que cualquier calpaína enzimáticamente activa que se produzca en un sistema recombinante sea deletérea o letal para ese sistema de expresión. Cabría esperar que cualquier efecto deletéreo sobre el sistema de expresión aumentara a medida que se expresara más producto activado. De manera notable, muchas células de mamíferos producen un inhibidor endógeno de la calpaína, que puede ejercer un control importante sobre la actividad de una proteasa que de otra manera sería letal.

Aoki y col., supra, describieron la secuencia de aminoácidos completa de la subunidad de 80 kDa de la calpaína humana I (\muCANP), que dedujeron a partir de la secuencia de un clon de ADNc de la calpaína humana. El clon de ADNc de la calpaína humana se aisló de la biblioteca de ADNc de músculo esquelético humano usando como sonda un ADNc para la subunidad mayor de la \muCANP de conejo. No se describe la expresión del ADNc.

Imajoh y col., Biochemistry, 27: 8122-8128 (1988), describieron el aislamiento de un clon de ADNc para la subunidad mayor de la calpaína humana II procedente de una biblioteca de músculo esquelético humano usando sondas con CANP de pollo y mCANP de conejo. Se describió que la proteína deducida tenía esencialmente las mismas características estructurales que las que se habían descrito para la \muCANP y para la CANP del pollo. Las similitudes de la secuencia de aminoácidos de la mCANP humana con la \muCANP humana y la CANP del pollo se describieron como 62% y 66%, respectivamente. No se describe ni se indica la expresión del ADNc.

Ohno y col., Nucleic Acids Research, 14: 5559 (1986), describieron la secuencia de un ADNc que codifica la subunidad menor (30 kDa) de la proteasa humana activada por calcio aislada a partir de una biblioteca de ADNc de bazo humano. Las comparaciones con la secuencia de aminoácidos descrita de las secuencias del conejo y del cerdo mostraron diferencias de sólo 3%.

DeLuca y col., supra., describieron la clonación molecular y la expresión bacteriana del ADNc de la subunidad de 80 kDa de la calpaína II de la rata (mCANP). El ADNc codifica una proteína que se ha mostrado que tiene una identidad de secuencia de 93% con la calpaína humana II, y una identidad de 61% con la calpaína humana I. La expresión del ADNc se realizó en bacterias E. coli en un vector de expresión fagémido. Puesto que el producto expresado era insoluble e inactivo después de la sonicación celular, no se pudo utilizar para hacer el cribado de los inhibidores de la calpaína.

C. Sistemas de expresión de baculovirus

V. Luckow, Current Opinion in Biotechnology, 4: 546-572 (1993), y Kidd y col., Applied Biochem. and Biotech., 42: 137-159 (1993), han revisado recientemente los sistemas de baculovirus para la expresión de productos génicos humanos y el uso de baculovirus como vectores de expresión, respectivamente. Luckow analizó la producción de diferentes tipos de proteínas, incluyendo enzimas. Sin embargo, sólo se menciona la producción de un enzima proteolítico, a saber, la metaloproteasa estromelisina. Al contrario que calpaína, este enzima no es multimérico.

Kidd y col. analizaron el uso de proteínas producidas por baculovirus para el análisis estructural con rayos X y para el ensamblado de subunidades para formar moléculas funcionales con múltiples subunidades. Diversos ejemplos mostraron el ensamblado adecuado de las subunidades para producir moléculas funcionales. Aunque el autor afirmó de manera general que la expresión de los baculovirus da lugar a la integridad estructural de las moléculas plegadas y a la función biológica completa en prácticamente todos los casos, no se describió el ensamblado de las subunidades de enzimas diméricos o multiméricos en un enzima funcional. Además, en otros casos que implicaban moléculas con múltiples subunidades, por ejemplo, Na,K,ATPasa, a veces el ensamblado de las subunidades no fue eficiente. (Véase DeTomaso y col., infra.).

Otros autores han descrito la expresión de enzimas en el sistema de baculovirus. Vernet y col., J. Biol. Chem., 27: 16661-16666 (1990), describieron la secreción de un precursor de papaína a partir de células de insectos. La papaína es una cisteína proteasa. El gen de la prepropapaína se clonó en el vector de transferencia IpDC125 detrás del promotor poliédrico. El constructo recombinante se incorporó mediante recombinación homóloga en el interior del genoma del virus de la poliedrosis Autographa californica. Se recuperó un precursor enzimáticamente inactivo de papaína a partir de células Sf9 de Spodoptera frugiperda infectadas con el baculovirus recombinante. No se produjo un procesado adecuado del precursor de papaína para producir un enzima activo en las células infectadas.

Fertig y col., Cytotechnology, 11: 67-75 (1993) describieron la producción de procalicreína, que es un precursor de calicreína, una serina proteasa. Se produjo la procalicreína en células de insectos de Spodoptera frugiperda (Sf9) y Mamestra brassicae (IZD-Mb503) infectadas con un virus recombinante de la poliedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV), cepa E2. Para obtener un enzima activo, la procalicreína que se obtuvo se activó in vitro usando tripsina.

Button y col., Gene, 133: 75-81 (1993) describieron la producción de la metaloproteinasa GP63 de Leishmania major en un sistema de expresión de baculovirus-célula de insecto. El enzima se secretó a partir de células de Spodoptera frugiperda (Sf9) infectadas con un virus recombinante de la poliedrosis nuclear Autographa californica (AcNPV) como una proteasa latente que se activó posteriormente hasta la actividad proteinasa completa por medio de un tratamiento con HgCl_{2}.

Hirowatari y col., Arch. Virol., 133: 349-356 (1993), describieron la expresión de un polipéptido que se cree que exhibe dos actividades proteinasa víricas necesarias para el procesado de la proteína precursora vírica del virus de la hepatitis C (VHC). El polipéptido se expresó en la línea celular de insecto Sf21 infectada con un baculovirus recombinante. Se utilizó el vector de transferencia de baculovirus pVL941. Las actividades proteinasa se infirieron a partir de la presencia de una proteína procesada de 70 kDa.

Aunque, que sepan los inventores, todavía no se ha descrito la producción de proteasas multiméricas enzimáticamente activa en el sistema de baculovirus, el sistema de baculovirus se ha usado para expresar enzimas multiméricos funcionales distintos a las proteasas. DeTomaso y col., J. Biol. Chem., 268(2): 1470-1478 (1993), describen la expresión de Na- K-ATPasa funcional de rata usando el sistema de expresión de baculovirus. Se eligió un sistema de expresión que usa células de insecto porque algunas células de insecto tienen concentraciones escasas o nulas de Na, K-ATPasa. Se eligió un sistema de baculovirus porque las células infectadas con baculovirus producen cantidades elevadas de proteína extraña. Se utilizaron células Sf9 derivadas de Spodoptera frugiperda. El baculovirus fue Autographa californica. Sin embargo, puesto que la actividad del enzima de las células de insecto fue sólo de 20%-25% de la actividad de la médula externa del riñón de perro, los autores concluyeron que una porción del enzima que se expresaba era inactiva.

Wen-Ji y col.,J. Biol. Chem., 268(13): 9675-9680 (1993), describen la expresión de la proteína funcional de mamíferos farnesiltransferasa en un sistema de baculovirus usando células Sf9. La actividad expresa específica de la proteína expresada fue 510 nM/mg/h, que se afirma que es esencialmente idéntica a la que se ha descrito para el enzima del cerebro de rata. Sin embargo, se observó que las cantidades de proteína que se obtenían a partir del tejido natural no habían permitido previamente el ensayo directo de la concentración de proteína, de modo que ésta fue la primera vez que se determinó la actividad específica de la proteína usando un ensayo estándar de proteínas.

No hay descripción o indicación de la expresión de una proteasa enzimáticamente activa, multimérica y potencialmente mortal como calpaína en ningún sistema de expresión. Se espero que la expresión de la calpaína I, en particular, sería difícil y precisaría la presencia de un inhibidor, puesto que la calpaína I se activa a concentraciones extremadamente bajas de Ca^{2+}, que se podrían conseguir durante el ciclo de infección. Sorprendentemente, los presentes inventores encontraron de manera inesperada que se puede expresar calpaína enzimáticamente activa en el sistema de baculovirus, y en ausencia de un inhibidor.

Resumen de la invención

La presente invención se dirige a la producción de calpaína de mamíferos enzimáticamente activa por medios recombinantes. Se describe específicamente la producción de calpaína I humana recombinante enzimáticamente activa en un sistema de baculovirus-célula de insecto. La calpaína que se produce de esa manera se puede usar de forma beneficiosa en ensayos para hacer el cribado de posibles inhibidores de la calpaína, adelantando así la técnica al permitir una selección rápida y eficiente de los inhibidores de la calpaína que se pueden usar para tratar las enfermedades en las que se ha implicado a la calpaína, y para ofrecer suficiente calpaína como para que se pueda cristalizar para el diseño racional de inhibidores de la calpaína. La calpaína que se produce de esta manera también se puede usar en otras aplicaciones, incluyendo como producto para ablandar la carne y como disolvente de los coágulos sanguíneos.

En un aspecto, la presente invención se dirige a la calpaína de mamíferos enzimáticamente activa producida por tecnología recombinante.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a vectores plasmídicos que comprenden ADNc que codifica calpaína de mamíferos para la producción de calpaína de mamíferos recombinante enzimáticamente activa.

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a baculovirus recombinantes que comprenden ADNc que codifica calpaína de mamíferos para la producción de calpaína de mamíferos recombinante enzimáticamente activa.

En otro aspecto adicional, la presente invención se refiere a un procedimiento para producir calpaína de mamíferos enzimáticamente activa por medios recombinantes usando un sistema de baculovirus-célula de insecto.

Breve descripción de las Figuras

La Figura 1 representa la estrategia de clonación para la subunidad de calpaína de 30 kDa.

La Figura 2 representa la estrategia de clonación para la subunidad de calpaína I de 80 kDa.

La Figura 3 representa la estrategia de clonación para el doble constructo.

La Figura 4 representa la expresión de las subunidades en células Sf21 determinada mediante inmunotransferencia.

Las Figuras 5 a-d representa la medición de la actividad de la proteasa dependiente de calcio.

Las Figuras 6 a-b representan el procesado dependiente de calcio de la subunidad de 80 kDa inactiva a la forma activa de 76 kDa.

La Figura 7 representa la mejora de la expresión en un medio sin suero.

La Figura 8 representa la medición de la actividad proteasa dependiente de calcio de la subunidad de 80 kDa expresada sola.

La Figura 9 representa los perfiles de activación por calcio de la calpaína I humana recombinante y natural.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se dirige a la producción de calpaína I de mamíferos, específicamente calpaína I enzimáticamente activa, por medios recombinantes. "Calpaína", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere al heterodímero formado por las dos subunidades. Estas subunidades son la subunidad menor, que tiene un peso molecular de aproximadamente 30 kDa, y la subunidad mayor, que tiene un peso molecular de aproximadamente 80 kDa, dependiendo de su estado de activación. La referencia a la unidad de 80 kDa incluye al menos las formas de 77 kDa y 76 kDa que se obtienen por la autólisis de la subunidad de 80 kDa. Como será evidente para los expertos en la materia, las subunidades de las diferentes especies de mamíferos, incluso las subunidades de diferentes tejidos de la misma especie de mamíferos (Hatanaka, supra), pueden variar en peso molecular. Se incluyen estas variaciones.

"Enzimáticamente activa", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a la capacidad de hidrolizar de manera medible al menos un sustrato conocido de calpaína, incluyendo la propia calpaína, es decir, como consecuencia de la autólisis. La actividad enzimática se puede medir por cualquier medio aceptable para los expertos en la materia para hacer esas determinaciones incluyendo, aunque no se limita a, medios fluorescentes y colorimétricos. Se incluye la porción de cada subunidad que es suficiente para mantener la actividad enzimática como se ha descrito más arriba. El procedimiento según la presente invención facilita la determinación sencilla de las regiones de la secuencia codificante (ADNc) necesarias para la actividad enzima tica y los cambios de actividad que pueden deberse a la mutación intencional de la secuencia codificante. La frase "enzimáticamente activa después de su expresión", como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a la calpaína, o a una subunidad de la misma, que tiene una actividad enzimática medible después de su expresión sin que sea necesaria ninguna manipulación diferente a la presencia de calcio.

"Expresión", como se usa en la presente memoria descriptiva, incluye, pero no se limita a, la traducción in vitro del ADNc contenido en los vectores y en los virus según la invención en células de insecto y de otro tipo. Puesto que habitualmente hay algo de Ca^{2+} durante la expresión, particularmente en el caso de un medio que contiene suero, la calpaína que se producen esa manera es enzimáticamente activa en el momento de su expresión.

El término "recombinante", como se usa en la presente memoria descriptiva, incluye, pero no se limita a, una molécula, microorganismo, plásmido, fago u otro vector, que contiene una nueva combinación de secuencias de ADN. El término "microorganismo" incluye virus y bacterias. Los términos "plásmido", "fago" y "vector" se usan según su significado según lo conocen los expertos en la materia tal y como se define, por ejemplo, en A Dictionary of Genetic Engineering, Stephen G. Oliver y John M. Ward., eds., Cambridge University Press, Cambridge, 1988.

El término "mamíferos" incluye todos los animales de la clase filogenética "mammalia". Preferentemente, la calpaína es calpaína humana recombinante enzimáticamente activa. Más preferentemente, la calpaína es calpaína I humana recombinante enzimáticamente activa.

El baculovirus Autographa californica, virus de la poliedrosis nuclear (AcNPV), que se usa en la descripción siguiente, es ejemplar. Sin embargo, se pueden considerar otros baculovirus como el virus de la poliedrosis nuclear Bombyx mori (BmNPV), el virus de la poliedrosis nuclear Heliothis zea, el virus de la poliedrosis nuclear Lymantria dispar, así como el baculovirus Orcytes, y virus de las familias Poxviridae y Parvoviridae, Choristoneura y Amsacta, en lugar del AcNPV. Véase "Insect Cell Expression Technology", págs. 1-40, en Principles and Practice of Protein Engineering, Jeffrey L. Cleland y Charles S. Craik (eds.), John Wiley & Sons, 605 Third Avenue, Nueva York, NY 10158-0012.

Mientras que las células del insecto Spodoptera frugiperda se usaron para ilustrar la presente invención, se han establecido más de 400 líneas celulares de insecto y se pueden usar, especialmente las de Trichoplusia ni. Véase Cleland y Craik, supra. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente una célula de insecto adecuada para la expresión. También se contempla que se pueden utilizar otras células, como levaduras y células de mamífero, con el vector apropiado, y la selección de éste está dentro de la maestría en la materia.

Los genes heterólogos que van a expresar los baculovirus están habitualmente bajo el control de los promotores de la poliedrina o de los promotores P10 del AcNPV, porque los genes de la poliedrina y P10 no son esenciales para la replicación ni la maduración del virus y se transcriben mucho. Esto en modo alguno limita el uso de otros promotores para la práctica de esta invención. Véase Cleland y Craik, supra.

Se describe específicamente la expresión y la recuperación de la calpaína recombinante enzimáticamente activa. Esto fue inesperado, particularmente para la calpaína I, que se activa en presencia de cantidades micromolares de calcio, porque hay Ca^{2+} en el medio de cultivo tisular en el que se cultivan las células que se usan para su producción. Puesto que las células infectadas generalmente se vuelven "permeables", se esperó que el Ca^{2+} pudiera entrar en las células desde el medio circundante en una cantidad suficiente como para activar cualquier calpaína I producida que, a su vez, sería letal para las células y haría que la calpaína I se dirigiera frente a sí misma mediante autólisis.

Se ha determinado que la calpaína que se produce por medios recombinantes es completamente activa desde el punto de vista enzimológico y que tiene un perfil de actividad enzimática similar al de la calpaína natural, lo que es importante para el uso de esa calpaína obtenida por medios recombinantes en el cribado de posibles inhibidores terapéuticos de la calpaína. La calpaína producida por medios recombinantes mostró una sensibilidad similar a los inhibidores conocidos de la calpaína, y una ausencia de sensibilidad a los inhibidores de la serina o aspártico proteasa. La cantidad de calcio necesaria para conseguir ½ V_{max} fue esencialmente la misma para la calpaína natural y recombinante. De manera similar, las velocidades de hidrólisis del sustrato fueron similares, al igual que las actividades específicas (no se muestran los datos). De nuevo, esas características son importantes para el aprovechamiento completo de la calpaína según la invención.

Sorprendentemente, se determinó que la actividad específica de la subunidad de 80 kDa sola era aproximadamente 20%-25% de la del heterodímero. Previamente se había determinado que la actividad específica de la subunidad de 80 kDa disociada del heterodímero natural era sólo el 3% de la del heterodímero. (Kikuchi y col., Arch. Biochem. Biophys., 234: 639-645, 1984). Así, la estructura de la subunidad de 80 kDa producida por medios recombinantes parece ser diferente a la de la subunidad disociada de la calpaína natural, y puede representar de manera más cercana la estructura de la subunidad activa. Por lo tanto, la producción recombinante de las subunidades de calpaína facilita el estudio de la estructura de las subunidades individuales.

En la presente invención, se consiguió la expresión de la calpaína mediante la expresión de las subunidades de 80 kDa y de 30 kDa en las mismas células de insecto mediante la coinfección de las células con dos virus separados que comprenden un ADNc para cada subunidad de la calpaína, o mediante la infección de las células de insecto con un solo virus que comprende ADNc para las dos subunidades. También se descubrió que se expresa una mayor cantidad de la subunidad de 80 kDa cuando se coexpresa la subunidad de 30 kDa, de modo que la subunidad de 30 kDa puede tener un efecto estabilizador sobre la subunidad de 80 kDa.

Cuando las células se infectan con virus que contienen las dos subunidades de calpaína, todas las células infectadas deben expresar las dos subunidades. Independientemente de la multiplicidad de la infección (MI) añadida, cuando las células se infectan con virus que contienen sólo una subunidad o la otra, es necesaria una mayor MI para conseguir la expresión de ambas subunidades, por ejemplo, es necesaria una MI de 5 para cada virus para que el 99% de las células contenga una o más partículas de los dos virus y, de esta manera, exprese las dos subunidades. En una forma de realización preferida, la expresión se lleva a cabo mediante la coexpresión de las dos subunidades en una sola
célula.

Para construir los baculovirus de calpaína recombinantes, se prepararon sondas para parte de las regiones codificantes de las subunidades de 30 kDa y de 80 kDa mediante la reacción en cadena de la polimerasa (RCP) a partir de una biblioteca de ADNc y se usaron para hacer el cribado en una biblioteca de fagos de ADNc humano. Se aislaron los fagos que contenían la mayor parte de la región codificante de cada una de las subunidades y se subclonó el ADN inserto. Cualquier región que no estaba presente en los clones aislados se amplificó mediante RCP a partir de la biblioteca, se verificó la secuencia y se unió a los clones parciales para producir toda la región codificante de la calpaína. La biblioteca de ADNc humano que se eligió fue una biblioteca de bazo que se consiguió de Clontech (Palo Alto, CA, nº HL1134a). Se eligió una biblioteca de bazo basándose en la abundante expresión de calpaína I y II que se había descrito en el bazo de rata (Murachi y col., Trends Biochem. Sci., 8: 167-179, 1983).

La Tabla 1 presenta los cebadores de oligonucleótidos sintéticos que se usaron para la amplificación de porciones de las subunidades de la calpaína humana de 80 kDa y de 30 kDa. Se seleccionaron los cebadores basándose en las secuencias publicadas de ADNc para la subunidad de 80 kDa de la calpaína I (Aoki y col., FEBS Lett., 205: 313-317, 1986) y para la subunidad de 30 kDa (Ohno y col., Nucl. Acids Res., 14: 5559, 1986, que se incorpora a la presente memoria descriptiva como referencia). Además, los cebadores para la subunidad de 80 kDa de la calpaína I se seleccionaron basándose en la ausencia de similitud con la calpaína II humana relacionada, y los cebadores para la subunidad de 80 kDa de la calpaína II se eligieron basándose en la ausencia de similitud con la calpaína I humana. Se seleccionó que los cebadores internos estuvieran inmediatamente fuera de los puntos conocidos de la endonucleasa de restricción, lo que permitió la posterior digestión en esos puntos para subclonar en vectores plasmídicos los fragmentos obtenidos mediante RCP. Todas las secuencias de la Tabla 1 se presentan en sentido 5' a 3'. Una "S" después de la secuencia indica sentido. Una "AS" después de la secuencia indica antisentido. Los cebadores de la unidad de 30 kDa se indican con "30" y los cebadores de las subunidades de 80 kDa se denominan "80I" y "80II", respectivamente. Los números entre paréntesis debajo de los números de identificación de las secuencias representan las denominaciones internas de los laboratorios y éstas se usarán en los Ejemplos siguientes.

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Todas las reacciones en cadena de la polimerasa se realizaron en un ciclador térmico (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) usando 2,5 unidades de ADN polimerasa Taq (Promega, Madison, WI), 3 unidades de ADN polimerasa UlTma (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) o 2 unidades de ADN polimerasa Tli (Promega, Madison, WI) en presencia del tampón suministrado, 0,2 mM de dNTP (polimerasas ADN Taq y Tli) o 40 \muM de dNTP (ADN polimerasa UlTma), con la adición de MgCl_{2} 0,75-2 mM y 0,25 \muM de cada cebador. Después de una incubación desnaturalizadora inicial durante 5 min a 94ºC, se llevaron a cabo 30-35 ciclos de amplificación como se indica más adelante, seguidos de una extensión final a 72ºC durante 7 minutos. La plantilla fue 1-10 \mul de biblioteca de fagos lambda, o fago parcialmente purificado, añadido a un mínimo de 30 \mul de agua destilada. Se liberó el ADN para la amplificación mediante tres congelaciones posteriores en nieve carbónica de etanol seguidas por descongelación a 37ºC.

Ejemplo 1 Clonación de la subunidad de 30 kDa de la calpaína humana

La Figura 1 representa la estrategia para la clonación de la subunidad de 30 kDa de la calpaína humana. Se usaron los cebadores DL-13 5' > GGTGGAACGGCCATGCGCATC > 3' y SM-36 5' > CGGGATCCTTAGGAATACA
TAGTCAGCTGCAGCC > 3' para amplificar los pares de bases nº 163-805 del ADNc humano de 30 kDa procedente de la biblioteca \lambdagt10 de bazo humano HL1134a (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) para su uso como sonda. La numeración de los pares de bases (pb) de la secuencia se inicia tras considerar que el codón de iniciación "ATG" son los pares de bases nº 1-3. Las condiciones para la RCP fueron las que se indican más arriba, usando 30 ciclos de amplificación de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 55ºC y 1 minuto a 72ºC. Se aisló el fragmento de 643 pb a partir de agarosa de baja temperatura de fusión después de la electroforesis (SeaPlaque-GTG, FMC Bioproducts, Rockland, ME) y se purificó mediante extracción con fenol-cloroformo. Posteriormente se marcó el fragmento con [32]P-dCTP (Amersham, Arlington Heights, IL) mediante marcado con cebado aleatorio usando ADN polimerasa Klenow según el procedimiento suministrado (Promega Corp., Madison, WI) y se usó para hacer el cribado en la biblioteca como se señala a continuación.

Para el cribado se colocó la biblioteca en placas C600hfl suministradas por Clontech. Se colocaron aproximadamente 350.000 unidades formadoras de placas en 14 placas de Petri de 150 mm de diámetro. Se prepararon duplicados de nitrocelulosa a partir de estas placas según los procedimientos que describieron Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (segunda edición), pág. 1-1626, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Las reacciones de hibridación con la sonda marcada y desnaturalizada se realizaron durante la noche a 68ºC en 6 x SSC, fosfato sódico 50 mM, a pH 6,8, poli A 10 a 10 mg/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), heparina 0,2 mg/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y DSS al 0,5%, seguido por dos lavados con 3 x SSC y DDS al 0,1% durante 30 minutos a 55ºC. Las placas marcadas se detectaron mediante autorradiografía.

Se encontró que dos fagos tenían insertos que contenían una porción del ADNc de la subunidad de 30 kDa. Todo el extremo 5' del ADNc, que terminaba con el punto EcoRI interno en el pb nº 488, estaba presente en el fago lambda que se denominó 14.2.4. El fago lambda denominado 4.1.1 contenía la mayor parte de la región que codificaba la proteína. Posteriormente se usó el fago 4.1.1. purificado en la placa para amplificar mediante RCP el extremo 3' del ADNc. Se usaron los cebadores SM 37 5' > CACCCTGATCTGAAGAC > 3' y SM-36 5' > CGGGATCCTTAG
GAATACATAGTCAGCTGCAGCC > 3'. El cebador Sm-36 añade un punto de restricción BamHI inmediatamente 3' al codón de terminación y transforma el codón de terminación en "TAA". Se realizó la amplificación con ADN polimerasa UlTma (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) usando el tampón suministrado con la adición de dNTP 40 \muM y la adición de MgCl_{2} 0,75 mM (para 10 \mul de plantilla de fago; concentración final de Mg^{2+} 1,55 mM). Los ciclos de amplificación fueron como se señala a continuación: una etapa de desnaturalización de 2 minutos a 97ºC antes de la adición de la polimerasa, seguida de 30 ciclos de amplificación de 1 minuto a 95ºC, 45 segundos a 55ºC y 1 minuto a 72ºC. El fragmento que se obtuvo se digirió posteriormente con EcoRI y BamHI, se aisló a partir de agarosa de baja temperatura de fusión como se señala más arriba, y se subclonó en pFEM-4Z digerido con EcoRI y BamHI (Promega Corp., Madison, WI).

La porción 5' del gen se obtuvo en dos etapas. Primero, el ADN aislado a partir del fago lambda 14.2.4 purificado en placa se digirió con HindIII, que escinde el ADN lambda en la región 5' al inserto, y con BglII, que escinde el ADN lambda en la región 3' al inserto. El fragmento resultante de 2,5 kb se subclonó en pGEM-4Z digerido con BamHI e HindlII. Posteriormente se usó un par de oligonucleótidos sintéticos para modificar la región 5' al codón de iniciación añadiendo un punto BamHI para facilitar la clonación en los vectores de transferencia e insertando la secuencia de la región no traducida 5' del gen de la poliedrina inmediatamente antes del codón de iniciación en un intento de conseguir la traducción óptima del baculovirus. El plásmido que contiene el inserto lambda se digirió con XmaI, que escinde el punto de clonación múltiple del vector pGEM-42 5' al punto BamHI, y con HpaI, que escinde en el par de bases nº 13 en el ADNc de 30 kDa, que es 3' al punto BamHI, a fin de eliminar las secuencias del ADNc de calpaína 5' al punto HpaI. El plásmido digerido se aisló a partir de agarosa de baja temperatura de fusión como se indica más arriba. Se unieron entre sí dos oligonucleótidos, SM-65 5' > CCGGGATCCTATAAATATGTTCCTGGTT > 3' y SM-66 5' > AACCAGGAACATATTTATAGGATC > 3', como se muestra en la Figura 1, mediante coincubación en Tris-HCl 10 mM, pH 7,0, NaCl 50 mM a las siguientes temperaturas durante 10 minutos cada una: 90ºC, 65ºC, 42ºC, 37ºC y temperatura ambiente. Los oligonucleótidos unidos se ligaron posteriormente al plásmido digerido y linealizado y se hizo cribado en las colonias resultantes para buscar la presencia del punto BamHI que se añade con estos oligonucleótidos (Figura 1).

Posteriormente se ensambló el ADNc de toda la región codificante a partir de los dos plásmidos que se describen más arriba. El plásmido que contiene la porción 5' del ADNc se dirigió con EcoRI. Hay un punto de EcoRI en la región de clonación múltiple del vector 5' al punto XmaI y también un punto en el pb nº 488 en el ADNc de 30 kDa. Este fragmento EcoRI de aproximadamente 500 pb que contiene todas las adiciones al extremo 5' del ADNc de 30 kDa se aisló posteriormente a partir de agarosa de baja temperatura de fusión, como se señala más arriba, y se ligó al plásmido digerido con EcoRI que contiene la porción 3' del ADNc. Se obtuvo un plásmido con el fragmento EcoRI en la orientación correcta. El secuenciado de los didesoxinucleótidos del ADN (Sanger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1977) de toda la región codificante de 30 kDa verificó que el ADNc modificado codificaba la secuencia correcta de aminoácidos de la proteína calpaína humana (Ohno y col., Nucl. Acid Res., 14; 5559, 1986).

Posteriormente se digirió este plásmido con BamHI y el fragmento de 820 pb que contiene todo el ADNc de la calpaína de 30 kDa humana con sus modificaciones para la expresión del baculovirus: 1) adición de CCTATAAAT inmediatamente 5' al cordón de iniciación para mejorar potencialmente la transcripción, y 2) modificación del codón de terminación al AAT preferido por baculovirus (Luckow y col., Virology, 170: 31-39, 1989); se subclonó para la expresión de subunidades aisladas en el vector de transferencia pVL941 digerido con BamHI que contiene el promotor de la poliedrina. El plásmido resultante se denominó pVL941-hCANP30-6. Para la expresión de dos subunidades, se subclonó el fragmento de 820 pb en el vector pAcUW51 digerido con BamHI o BglII (PharMingen, San Diego, CA; denominados Bam-CANP30 y p51-Bgl-CANP30, respectivamente), un vector de transferencia que contenía los promotores p10 y de la poliedrina (véase la Figura 3). Se ha diseñado el vector pAcUAW-51 para expresar simultáneamente dos proteínas del mismo virus, insertando las dos en el locus de la poliedrina del baculovirus. Este vector contiene dos promotores, poliedrina y P10, que son promotores potentes que comienzan la transcripción en una fase muy tardía de la infección (es decir, después de 18-24 horas). Los promotores son insertados en el vector en una orientación opuesta para minimizar la deleción de los ADNc por recombinación homóloga debido a la duplicación del material genético (Weyer y col., J. Gen. Virol., 70: 203-208, 1991). Se verificó mediante análisis con enzimas de restricción que los plásmidos resultantes tienen sólo un inserto en la orientación correcta para su expresión (no se muestran los datos).

Ejemplo 2 Clonación de la subunidad de 80 kDa de la calpaína humana

La Figura 2 representa la estrategia para clonar la subunidad de 80 kDa de la calpaína humana I. Se prepararon los cebadores SM-40 5' > GTACACTTGAAGCGTGACTTC > 3' y SM-41 5' > CAGGCAGCAAACGAAATTGTC > 3' y se usaron para amplificar los pares de bases nº 1372-2037 del ADNc de 80 kDa humano de la biblioteca \lambdagt10 de bazo humano HL1134a (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) para su uso como sonda. Las condiciones para la RCP fueron las que se indican más arriba para la polimerasa Taq, en la que la solución se hace 2 mM con respecto a MgSO_{4} y con la adición de 5 \mul de la biblioteca lambda, usando 30 ciclos de amplificación de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 60ºC y 2 minutos a 72ºC. El fragmento amplificado con la RCP se aisló de los cebadores siguiendo las instrucciones que se suministran con el kit Wizard PCR prep (Promega, Madison, WI). Este fragmento se digirió con XmaI y SalI. El fragmento resultante de 538 pb se aisló a partir de un gel de agarosa Seakem-GTG 1%/NuSieve 2% (FMC BioProducts, Rockland, ME) usando el protocolo suministrado para el kit GenoClean II (B101, La Jolla, CA) y posteriormente se ligó al vector pGEM-4Z digerido con XmaI y con SalI (Promega, Madison, WI).

El ADN del clon parcial de ADNc de la subunidad de 80 kDa que se ha producido más arriba se digirió con EcoRI y con HindIII para liberar el inserto, seguido de aislamiento del fragmento usando el kit GeneClean II después de la electroforesis en un gel de agarosa Seakem-GTG 1%/NuSieve 2%. Posteriormente se marcó con [32]P-dCTP y se usó para hacer cribado de la biblioteca de bazo humano como se ha descrito más arriba. Se colocaron aproximadamente 500.000 unidades formadoras de placas en 10 placas de Petri de 150 mm de diámetro. Se prepararon duplicados de nitrocelulosa y se hibridaron con la sonda marcada y desnaturalizada durante una noche a 68ºC en la misma mezcla de hibridación, como se ha descrito más arriba para el cribado de 30 kDa, seguido por dos lavados con 2x SSC y DSS al 0,1% durante 15 minutos cada uno a temperatura ambiente y dos lavados con 1 x SSC y DSS al 0,1% durante una hora cada uno a 68ºC, con detección de las placas marcadas mediante autorradiografía.

Se encontró que un fago (lambda cal80-8A) tenía un inserto que contenía el 67% del extremo 3' de la región codificante del ADNc para la subunidad de 80 kDa. Se aisló el ADN a partir de un medio de cultivo líquido de fago purificado en placa siguiendo los procedimientos que se describen en Sambrok y col., supra, se digirió con XbaI y SalI, y el fragmento único de 1238 pb del ADNc de 80 kDa se aisló a partir de un gel de agarosa con SeaKem-GTG al 1% usando el protocolo que se suministra para el kit GeneClean II (B101, La Jolla, CA). Este fragmento se ligó al vector pBluescript® SK+ digerido con XbaI y SalI (Stratagene, La Jolla, CA) y se verificó la identidad del inserto mediante secuenciado de los didesoxinucleótidos del ADN (Sanger y col., supra) de las porciones del inserto.

Las otras secciones de la región codificante del ADNc se generaron mediante amplificación con RCP de la biblioteca de bazo humano (extremo 5') o del fago lambda cal80-8a purificado en placa (extremo 3'). Se hizo la amplificación del extremo 3' para eliminar las secuencias 3' no traducidas y para modificar el codón de terminación al codón preferido por el baculovirus TAA. Para lo primero, se usaron los cebadores SM-53 5' > CGCGGATCCTATAAATATGTCG
GAGGAGATCATCACGCCG > 3' y SM-49 5' > ATTTGCGGATGGTCCGGCTCTTGA > 3' para amplificar los pares de bases nº 1-1096 del ADNc de 80 kDa a partir de 10 ml de la biblioteca de bazo humano HL1134a. El cebador SM-53 añade un punto BamHI para facilitar la posterior clonación e inserta la secuencia inmediatamente antes del codón de iniciación en un intento de conseguir la traducción óptima del baculovirus. Para esto último se usaron los cebadores SM-40 5' > GTACACTTGAAGCGTGACTTC > 3' y SM-47 5' > CGGGATCCTTATGCAAACATGGT
CAGCTGCAACC > 3' para amplificar los pares de bases nº 1372-2143 del ADNc de 80 kDa a partir de 1 \mul del fago lambda cal80-8a. Las amplificaciones se realizaron con polimerasa UlTma (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) usando el tampón que se suministra con la adición de dNTP 40 \muM y de MgCl_{2} 1,5 mM. Los ciclos de amplificación fueron como se señala a continuación: etapa de desnaturalización de 5 minutos a 95ºC antes de la adición de la polimerasa, seguida de 30 ciclos de amplificación de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 60ºC y 2 minutos a 72ºC.

El fragmento de 1096 pb con el extremo 5' se aisló usando el kit GeneClean II después de la electroforesis en un gel de agarosa Seakem-GTG 1%/NuSieve 2%. Posteriormente se digirió este fragmento con BamHI y XbaI, se volvió a purificar después de la digestión usando el kit GeneClean II y se subclonó en un vector pBluescript® SK+ digerido con BamHI y XbaI (Stratagene, La Jolla, CA). El fragmento del extremo 3' amplificado mediante RPC se aisló de los cebadores siguiendo las instrucciones que se suministran con el kit Wizard PCR prep (Promega, Madison, WI). Este fragmento se digirió posteriormente con SalI y BamHI, el fragmento resultante de 137 pb se aisló a partir de un gel de agarosa Seakem-GTG 1%/NuSieve 2% (FMC Bioproducts, Rockland, ME) usando el protocolo que se suministra para el kit Mermaid (B101, La Jolla, CA) y posteriormente se ligó al vector pBluescript® SK+ digerido con SalI y BamHI (Stratagene, La Jolla, CA). El secuenciado de los didesoxinucleótidos del ADN (Sanger y col., supra) de estos dos insertos verificó que codificaban las secuencias correctas de aminoácidos (Aoki y col., FEBS Lett., 205: 313-317, 1986) para esa porción de la proteína y se usó para eliminar los clones con mutaciones producidas por la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

El fragmento BamHI y HbaI con el extremo 5' modificado de la región codificante, el fragmento XbaI y SalI con la porción media de la región codificante, y el fragmento SaiI y BamHI del extremo 3' de la región codificante se digirieron de sus vectores con los enzimas adecuados y los fragmentos se aislaron a partir de un gel de agarosa Seakem-GTG 1%/NuSieve 2% (FMC Bioproducts, Rockland, ME) usando el protocolo que se suministra para el kit GeneClean II (B101, La Jolla, CA). Posteriormente se mezclaron estos fragmentos en cantidades equimolares con el vector pVL941 (Luckow y Summers, Virology, 170: 31-39, 1989) que se había digerido con BamHI y que se había tratado con fosfatasa alcalina de camarón (U.S. Biochemical Corp., Cleveland, OH) siguiendo el protocolo del fabricante, y se ligaron entre sí. Un clon (denominación del plásmido pVL941-hCANPI80-4) que contenía el fragmento BamHI del tamaño correcto y en la orientación adecuada, según lo determinó el análisis con enzimas de restricción, se usó para la producción del baculovirus recombinante que expresa sólo la subunidad de 80 kDa (véase más adelante).

El plásmido pVL941-hCANPI80-4 también se digirió con BamHI y el fragmento de 2153 pb que contenía todo el ADNc de la calpaína I de 80 kDa humana se subclonó en el vector p51-Bg1-CANP30 digerido con BamHI o en el vector p51-Bam-CANP30 digerido con BglI para la producción de vectores únicos que contienen ADNc para las dos subunidades, es decir, constructos dobles (véase la Figura 3). Se verificó que los plásmidos resultantes (denominados p51-hCANPI-1 y p51-hCANPI-2, respectivamente) tenían sólo un nuevo inserto en la orientación correcta para la expresión mediante análisis con enzimas de restricción.

Lo que se ha descrito más arriba representa el procedimiento que se usó para clonar los ADNc para la calpaína humana I. Los expertos en la materia conocen otros diversos procedimientos comparables que podrían permitir obtener secuencias de ADNc de estos genes adecuadas para la expresión recombinante. También se podrían usar procedimientos similares para obtener el ADNc para la calpaína II para su expresión recombinante.

Se usó la misma estrategia para generar una sonda para el cribado de la biblioteca para obtener el ADNc de 80 kDa de la calpaína II. Imajoh y col., supra, describieron el ADNc de la región que codifica la subunidad de 80 kDa de la calpaína II. Se usaron los cebadores SM69 5' > CATTGATGATGGAGTCAGGAG > 3' y SM-70 5' > CTGAGAAACAGAGCCAAGAGA > 3' para amplificar los pb nº 1587-2075 a partir de la misma biblioteca de bazo humano. Las condiciones para la RCP se describen más arriba usando 2 unidades de ADN polimerasa Tli (Promega, Madison, WI) con la adición de MgCl_{2} y 10 \mul de la biblioteca lambda usando 30 ciclos de amplificación de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 55ºC y 1 minuto a 72ºC. El fragmento de 489 pb se aisló a partir de un gel de agarosa Seakem-GTG 1%/NuSieve 2% (FMC BioProducts, Rockland, ME) usando el protocolo que se suministra para el kit GenoClean II (B101, La Jolla, CA), se digirió con PstI y BamHI, y se usó el procedimiento que se acaba de describir para aislar el fragmento de 377 pb PstI y BamHI después de la electroforesis en gel de agarosa. El fragmento purificado se ligó al vector pGEM-4Z digerido con PstI y BamHI (Promega, Madison, WI).

Ejemplo 3 Producción de baculovirus recombinantes

El Dr. B.G. Corsaro, del Boyce Thompson Institute for Plant Research, Cornell University, Ithaca, NY, suministró las células de Spodoptera frugiperda (Sf21; Vaughn y col., In Vitro, 13: 213-217, 1977). Estas células se cultivaron en suspensión a 27ºC en un medio de Grace suplementado (JRH Biosciences, Lenexa, KS) con la adición de suero bovino fetal definido al 10% (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, UT). Se obtuvieron cultivos en monocapa para algunos estudios de expresión de ensayos en placa sembrando las células cultivadas en suspensión en matraces de cultivo tisular a las densidades indicadas para las aplicaciones.

Los baculovirus recombinantes se produjeron cotransfectando células Sf21 en un cultivo monocapa (aproximadamente 2 x 10^{6} células en un matraz de 25 cm^{3}) con 0,5 mg de ADN AcNPV linealizado (Baculogold®, PharMingen, San Diego, CA) y 2 mg de uno de los cuatro vectores que se han descrito más arriba (se enumeran más adelante en la Tabla 2) usando liposomas Insectin®, siguiendo el protocolo suministrado por InVitrogen (San Diego, CA). El sobrenadante del cultivo resultante que contenía principalmente baculovirus recombinantes se recogió 2-5 días después y se usó para preparar láminas de placas del virus extracelular.

TABLA II

Vector	Subunidad de calpaína	Promotor
pVL941-hCANP30-6	30 kDa	Poliédrico
pVL941-hCANPI80-4	80 kDa	Poliédrico
p51-hCANPI-1	30 kDa	Poliédrico
	80 kDa	p10
p51-hCANPI-2	30 kDa	p10
	80 kDa	Poliédrico

Las células Sf21 se cultivaron en platos de cultivo de 60 mm (2 x 10^{6} células/plato) y se infectaron durante una hora con 1 ml de diluciones seriadas 10 veces del sobrenadante del cultivo de cotransfección (10^{-2} a 10^{-5}) y posteriormente se cubrieron con 4 ml de una mezcla 1: 1 de medio de Grace suplementado 2x (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y agarosa Seakem al 2% (FMC Bioproducts, Rockland, ME). Se identificaron placas recombinantes putativas 5-7 días después mediante inspección visual para placas negativas para cuerpos de oclusión usando un microscopio de disección y un microscopio de inversión de fase después de la tinción durante 7 min con rojo neutro al 0,05% en STF de Dulbecco. Se verificó que las placas eran recombinantes mediante la hibridación de las secuencias de la calpaína humana I de 30 kDa o de 80 kDa marcadas con [32] P con gotas de lisados de células infectadas (Summers y Smith, A manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin 1555: 1-57, 1987). Posteriormente se expandió el virus recombinante en los dos primeros pasos en cultivos de Sf21 en monocapa, con pasos posteriores de los virus (mínimo de tres a máximo de 5) usando cultivos de Sf21 en suspensión. Todas las expansiones de los virus se realizaron infectando células Sf21 a una multiplicidad de infección (MI) de menos de 0,5 y recogiendo el medio que contenía las partículas víricas extracelulares 3-4 días después de la infección.

Se aislaron siete virus recombinantes purificados en placa (virus recombinantes denominados AcNPV-hCANP30-1 a -7, respectivamente) a partir de la transfección de las células con pVL-hCANP30-6. AcNPV-hCANP30-5 se depositó el 2 de junio de 1994, con la American Type Culture Colection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-1776 (de aquí en adelante "ATCC") y tiene la denominación de la ATCC ATCC VR 2459. Se aislaron seis virus recombinantes purificados en placa (virus recombinantes denominados AcNPV-hCANPI80-1 a -6, respectivamente) a partir de la transfección de células con pVL-hCANPI80-4, y todos ellos contenían sólo el ADN para la unidad de 80 kDa. AcNPV-hCANPI80-5 se depositó el 2 de junio de 1994, con la ATCC y tiene la denominación de la ATCC ATCC VR 2457. Se aislaron 12 virus recombinantes purificados en placa independientes (denominados AcNPV-hCANPI-1-2, 1-5, 1-7 y 1-8, y AcNPV-hCANPI-2-1 a 2-8, respectivamente) mediante la cotransfección de células con p51-hCANPI-1 y p51-hCANPI-2. De los virus recombinantes que se aislaron, sólo cinco contenían el ADN de las 2 subunidades de 30 kDa y 80 kDa. Estos 5 virus recombinantes fueron AcNPV-hCANPI-1-5, AcNPV-hCANPI-1-7, AcNPV-hCANPI-1-8, AcNPV-hCANPI-2-3 y AcNPV-hCANPI-2-5. AcNPV-hCANPI-2-5 se depositó el 2 de junio de 1994, con la ATCC y tiene la denominación de la ATCC ATCC VR 2458. Los 18 virus recombinantes seleccionados que se obtuvieron se examinaron posteriormente en busca de su capacidad de expresar la proteína calpaína como se describe más adelante. Todos los depósitos se hicieron bajo las condiciones del Tratado de Budapest para el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con el Objetivo de Procedimientos de Patentes. Todos los depósitos fueron estudiados por la ATCC y se determinó que eran viables en el momento del depósito.

Ejemplo 4 Expresión y recuperación de la calpaína recombinante de baculovirus

Se sembraron células Sf21 en 24 placas de pocillos a 1,5 x 10^{5} células/cm^{2} en medio de Grace suplementado con suero bovino fetal al 10%. Después de la unión de las células, se añadieron los virus (véase más adelante para las denominaciones específicas de los virus) a una MI de entre 1 y 5. Las células se recuperaron en algún momento después de las 24 horas. Con el presente sistema de expresión, se consiguió el rendimiento óptimo con la recuperación entre 36-48 horas después de la infección. Para la recuperación, se usó un tampón de lisis de Tris-HCl 50 mM, EDTA 10 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (FFMS) 0,1 mM, leupeptina 1 \mug/ml y NP-40 al 0,1%, a pH 7,4, seguido de centrifugación de los homogenados en tubo de Eppendorf a 14.000 x g durante 10 min a 4ºC y recuperación de la calpaína y de otras proteínas celulares. Las proteínas se desnaturalizaron añadiendo DSS al 0,2% y calentando las muestras durante 5 min a 95º. Posteriormente se almacenan las muestras a -70ºC antes del análisis.

La calpaína que se expresó y se recuperó se examinó mediante análisis con inmunotransferencia como se señala a continuación. Se separaron de 10 a 20 \mug de la proteína total mediante DSS-PAGE (Laemmli, 1970) usando genes de acrilamida al 10% o al 12,5% y se transfirieron a nitrocelulosa de 0,45 mm (Bio-Rad, Melville, NY) por el procedimiento de Towbin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354 (1979). Se detectó específicamente la proteína calpaína usando una dilución de 1: 1000 de suero policlonal anti-calpaína que detecta ambas subunidades (Siman y col., J. Neurosci. 10: 2400-2411, 1990). El antisuero se diluyó en Tris-HCl 20 mM a pH 7,4 con NaCl 150 mM y leche en polvo descremada Cranation al 5% (tampón de bloqueo). Se eliminó la unión inespecífica al anticuerpo lavando con Tris-HCl 20 mM a pH 7,4 con NaCl 150 mM y Tween-20 al 0,05%. Posteriormente se añadió IgG de cabra anti-conejo conjugada con fosfatasa alcalina (Bio-Rad, Melville, NY), diluida al 1: 2000 en un tampón de bloqueo. El anticuerpo secundario se detectó usando el kit de sustrato conjugado de fosfatasa alcalina (Bio-Rad, Melville, NY). Los resultados de los virus recombinantes AcNPV-hCANP30-5, AcNPV-hCANPI80-5 y AcNPV-hCANPI-2-5 se muestran en la Figura 4.

La expresión de la subunidad individual adecuada de calpaína resultante de las células infectadas con los virus AcNPV-hCANP30-5 y AcNPV-hCANPI80-5 solos se representa en las calles 2-3 y 4-5, respectivamente. Cuando las células se coinfectaron con dos virus, uno que contenía el constructo de ADN para la subunidad de calpaína de 30 kDa (AcNPV-hCANP30-5) y el otro que contenía el constructo de ADN para la subunidad de calpaína de 80 kDa (AcNPV-hCANPI80-5), se expresaron las 2 subunidades adecuadas de calpaína. Estos se representa en las calles 6-8. De manera similar, cuando las células se infectaron con AcNPV-hCANPI-2-5, que contenía el constructo de ADN para las 2 subunidades de 30 kDa y de 80 kDa de calpaína, se expresaron las 2 subunidades (calles 9-10). La capacidad de un suero anti-calpaína de detectar la proteína recombinante verificó que se había producido la auténtica proteína calpaína. La calle 1 representa la infección con el virus de tipo natural. No se detectó expresión de calpaína.

Sorprendentemente, la cantidad acumulada de la subunidad de 80 kDa ("catalítica") estaba aumentada de manera inesperada (según lo determinó la inspección visual) mediante la coexpresión con la subunidad de 30 kDa ("reguladora"), ya sea por la coinfección de las células con AcNPV-hCANP30-5 y AcNPV-hCANPI80-5 (calles 6-8) o por la expresión del doble constructo AcNPV-hCANPI-2-5 (calles 9-10), en comparación con la expresión en ausencia de la subunidad de 30 kDa (calles 4-5). Las investigaciones previas sobre la función de la subunidad de 30 kDa no habrían permitido predecir este efecto estabilizador sobre la otra subunidad.

El análisis de todos los virus recombinantes AcNPV-hCANP30 y AcNPV-hCANP80 de la misma manera que se describe arriba mostró niveles comparables de expresión de sus subunidades respectivas (no se muestran los datos). Mientras que los cinco aislados de virus AcNPV-hCANPI que contenían las 2 subunidades de calpaína expresaron la subunidad de calpaína de 80 kDa intacta, 4 de los virus aislados ( es decir, AcNPV-hCANPI-1-5, AcNPV-hCANPI-1-7, AcNPV-hCANPI-1-8 y AcNPV-hCANPI-2-3) no expresaban también cantidades detectables de la subunidad de 30 kDa de la calpaína (no se muestran los datos). La ausencia de la subunidad de 30 kDa fue evidente además por la reducción del nivel de expresión de la subunidad de 80 kDa, que fue comparable a la que se veía con los virus AcNPV-hCANPI80, en contraposición al aumento del nivel que se observa con la coinfección con los virus AcNPV-hCANP30 y AcNPV-hCANPI80 y con la infección con AcNPV-hCANPI-2-5. Que sólo cinco de los 12 virus de doble subunidad contuvieran secuencias de ADN para las 2 subunidades después de la recombinación y la selección de virus recombinantes y que, de esos cinco, sólo se encontrará que 1 coexpresa las 2 subunidades proteicas, indica la existencia de una presión de selección contra la expresión por la célula del insecto de la proteasa calpaína completa de dos subunidades. Esto podría ser la consecuencia de la letalidad de la calpaína.

Las bandas adicionales que se ven alrededor de las bandas de la subunidad de 80 kDa en la Figura 4 son la consecuencia de la actividad autolítica del enzima. Las 2 bandas visibles en las calles 6-8 representan las formas de 80 kDa y la resultante autolítica de 76 kDa, respectivamente. También se observan 2 bandas en las imágenes de las calles 9 y 10, pero no se puede ver en la figura. En las calles 4 y 5 se ven realmente tres bandas. Además de las formas de 80 kDa y de la resultante autolítica de 76 kDa, se forma un intermediario estable de 77 kDa a bajas concentraciones del enzima, y se había descrito previamente que se forma por la autólisis de la subunidad mayor en un heterodímero de calpaína I incubado con calcio en condiciones diluidas. (Inomata y col., J. Biol. Chem., 263: 19783-19787, 1988). Sin embargo, como es evidente a partir de la Figura 4, la mayor parte de la poliédrico recombinante está en la forma de 80 kDa, que es la deseable en el caso de la calpaína considerando la posible letalidad para el sistema. Puesto que la calpaína se autolisa a la forma activa en presencia de calcio, no es preciso ningún tratamiento separado para la activación aparte de la adición de calcio.

Ejemplo 5 Actividad enzimática de la calpaína recombinante de baculovirus

Se sembraron de nuevo las células Sf21 en 24 placas a 1,5 x 10^{5} células/centímetro cúbico y se infectaron con virus natural, se coinfectaron con AcNPV-hCANP30 y AcNPV-hCANPI80 o se infectaron con AcNPV-hCANPI-2-5 (MI = 5,7). Las proteínas intracelulares se recogieron 40 horas después de la infección con 100 \mug/pocillo del siguiente tampón de lisis: Tris-HCl 50 mM a pH 7,5, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, \beta-mercaptoetanol 5 mM y Triton-100 al 0,1% seguido por una centrifugación durante 10 min a 14.000 x g a 4º para sedimentar los núcleos y algunas membranas. Se midió la actividad enzimática in vitro de 20 \mul de cada extracto (12,5-20 \mug de proteína total) usando el sustrato peptídico sintético succinil-leucina-tirosina-aminometil cumarina (Succ-Leu-Tyr-AMC) a una concentración de 1 mM con y sin la adición de CaCl_{2} 5 mM, siguiendo el procedimiento de Sasaki y col., J. Biol. Chem., 259: 12489-12494 (1984). La actividad que se obtuvo se comparó con la actividad enzimática de 2 \mug de calpaína I humanas natural parcialmente purificada que se produjo según el procedimiento de Siman y col., supra.

La actividad en presencia de calcio también se midió con la adición del inhibidor I de calpaína 12,5 \muM siguiendo el procedimiento que describieron Sasaki y col., supra. Los resultados se representan en las Figuras 5 a-d. En las Figuras 5 a-d, los círculos abiertos representan la actividad sin la presencia de calcio. Los rombos sólidos representan la actividad con la presencia de calcio. Los cuadrados con una cruz en su interior representan la actividad con calcio y con el inhibidor de la calpaína I presente. Los datos de las Figuras 5a-d muestran 1) un aumento dependiente de calcio de la hidrólisis el sustrato por la calpaína natural que es inhibido por el inhibidor de la calpaína I (5a), 2) ausencia de hidrólisis del sustrato dependiente del calcio endógeno en células infectadas con el virus natural (5b), y 3) en las células coinfectadas con AcNPV-hCANP30 y AcNPV-hCANPI80 (5c) o infectadas con AcNPV-hCANPI-2-5 solo (5d) hay un aumento dependiente de calcio de la hidrólisis del sustrato que también es inhibido por el inhibidor I de calpaína, al igual que lo que se ve con el enzima natural. De acuerdo con estos resultados, la calpaína que se produce de manera recombinante tiene el mismo perfil de actividad enzimática que la calpaína natural. De nuevo esto es importante para la utilización efectiva de la calpaína enzimáticamente activa recombinante para hacer el cribado de un posible tratamiento inhibidor de la calpaína.

Ejemplo 6 Actividad enzimática autolítica de la calpaína recombinante de baculovirus

Se demostró la actividad enzimática autolítica de la calpaína recombinante mostrando que la calpaína recombinante autoprocesaba correctamente la subunidad de 80 kDa a la forma "activada" de 76 kDa. La forma de 76 kDa se produce en presencia de calcio mediante escisión autolítica y es indicativa de que es un enzima activo. Los lisados de células infectadas con el virus natural AcNPV, coinfectadas con AcNPV-hCANP30-5 y AcNPV-hCANPI80-5 o infectadas con AcNPV-hCANPI-2-5 que se prepararon en el Ejemplo 5 se incubaron con o sin la adición de CaCl_{2} 6,7 mM durante 5 min a temperatura ambiente, interrumpiendo la reacción añadiendo EDTA 6,7 mM e hirviendo las muestras en tampón de carga DSS-PAGE-gel antes del almacenamiento a -70ºC. Los resultados del PAGE de las preparaciones se representan en las Figuras 6a y b. En las Figuras 6a y b, la presencia y ausencia de calcio se indica por un "+" o "-", respectivamente. La Figura 6a representa una inmunotransferencia anti-calpaína I con y sin incubación in vitro con calcio. La preparación antisuero Ac nº 4 que se usó frente a la calpaína natural purificada. Detecta principalmente la subunidad de 80 kDa, aunque también se une al producto de escisión autolítica de 76 kDa. Las calles 1 y 2 contienen la subunidad de 80 kDa de la calpaína natural parcialmente purificada (purificada a partir de eritrocitos humanos como se ha descrito previamente, véase Kitahara y col., supra. La calle 3 contiene la fracción proteica de las células infectadas con el virus natural. Las calles 4 y 5 representan la fracción proteica de las células cotransfectadas con AcNPV-hCANP30-5 y AcNPV-hCANPI80-5. Las calles 6-7 representan la fracción proteica de las células transfectadas con AcNPV-hCANPI-2-5. En ausencia de calcio añadido, las calles 4 y 6 tienen dos bandas inmunorreactivas. La calle 1 (la calpaína I natural humana purificada a partir de eritrocitos humanos) tiene sólo una banda. Las bandas superiores de las calles 4 y 6 migran conjuntamente con la subunidad de 80 kDa de la calpaína I natural de eritrocitos humanos parcialmente purificada y las bandas inferiores migran conjuntamente con la calpaína I natural humana de 76 kDa que se ha incubado con calcio (calle 2). Las bandas inferiores, presentes incluso en ausencia de calcio, parecen ser calpaína activada de manera endógena, probablemente debido al flujo intracelulares de calcio desde el medio, puesto que algunas células se hacen permeables durante la infección. Se detecta una sola banda en todas las muestras incubadas con calcio (calles 2, 5 y 7), y miga de manera conjunta con la calpaína I natural humana de 76 kDa (calle 2) que también se ha incubado con calcio.

Los datos de la Figura 6b muestran que la proteína que migra como una banda de 76 kDa es el auténtico fragmento autocatalítico de 76 kDa adecuadamente escindido. La Figura 6b contiene los resultados de un análisis de inmunotransferencia de las mismas muestras que en 6a excepto que el anticuerpo AB#34 usado se generó frente a los primeros cinco aminoácidos del extremo N-terminal del fragmento de 76 kDa (anti-LGRHEC) (Saido y col., J. Biochem., 111: 81-96, 1992). Este anticuerpo reconoce específicamente sólo el enzima humano natural adecuadamente escindido (es decir, 76 kDa; calle 2) y no la calpaína de 80 kDa intacta (calle 1). Este antisuero detecta tanto las cantidades pequeñas de la subunidad mayor de calpaína I recombinante escindida endógenamente como la banda abundante única de 76 kDa después de la adición de calcio. Los resultados anteriores demuestran que toda la cantidad de la proteína recombinante de la subunidad de 80 kDa es capaz de activarse autocatalíticamente mediante la adición de calcio y que la subunidad activada está escindida de manera adecuada.

Ejemplo 7 Mejora de la expresión en un medio sin suero

El cultivo de células de insecto en frascos agitados se utiliza rutinariamente para la expresión con baculovirus de proteínas recombinantes debido a la mayor facilidad de manejo de grandes números de células en comparación con los cultivos monocapa. Se hizo una comparación entre la producción de calpaína en las células Sa21 cultivadas en medio de Grace suplementado con un 10% de suero bovino fetal definido frente a células Sf21 adaptadas a un medio sin suero mediante diluciones de dos veces para crecer en el medio ExCell-401 (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Las células Sf21 en fase logarítmica cultivadas en cada uno de los medios se centrifugaron a 150 x g durante 10 min para sedimentar las células y se volvieron a suspender a 10^{7} células por ml en su medio de crecimiento que contenía el virus AcNPV-hCANPI-2-5 a una MI = 2. Las células más el virus se incubaron a temperatura ambiente durante una hora y de manera ocasional se volvieron a suspender las células a mano y con suavidad . Se añadió toda la mezcla al medio adecuado en frascos agitados de 250 ml (Techne, Inc., Princeton, NJ) para conseguir un volumen final de 100 ml a una densidad celular de 1,5 x 10^{6} células por ml. Se incubaron infecciones duplicadas para cada medio a 27ºC con agitación, a una velocidad de 80 rpm para los cultivos que contenían suero y de 100 rpm para los cultivos sin suero. Se recogieron muestras de los cultivos a las 24 y a las 48 horas.

Se recogieron las muestras para permitir la medición de la actividad enzimática como se describe en el Ejemplo 5, después de la sedimentación de las células mediante centrifugación a 150 x g durante 10 min, con una nueva suspensión en suero salino tamponado con fosfato de Dulbecco (Mediatech, Inc., Herndon, VA), y posteriormente una nueva centrifugación a 150 x g durante 10 min. Se midieron las concentraciones totales de proteínas usando el ensayo de proteínas de Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc., Melville, NY) siguiendo el protocolo suministrado, con albúmina sérica bovina como estándar proteico de referencia. Las células adaptadas a un medio sin suero tuvieron una concentración y una actividad inesperadamente bajas de la proteína calpaína recombinante a las 24 horas, pero unas concentraciones inesperadamente mayores que los cultivos con suero a las 48 horas (Figura 7). Lo que es más importante, hubo proporcionalmente menos proteína activada de 76kDa a las 48 horas en los cultivos sin suero que en los cultivos que contenían suero (no se muestran los datos). La mayor cantidad de calpaína activada a las 48 horas en los cultivos que contenían suero hizo que fue imposible purificar calpaína inactivada intacta en ese momento (no se muestran los datos); según esto, el uso de un medio sin suero para la expresión permitió obtener un aumento de 3-4 veces de la concentración inicial de la calpaína recombinante para la purificación, en comparación con la concentración a las 24 horas en cultivos que contenían suero.

Ejemplo 8 Actividad enzimática de la subunidad de 80 kDa independiente

Para determinar la actividad relativa de la subunidad de 80 kDa producida por medios recombinantes, se examinó la actividad enzimática de la subunidad en extractos no fraccionados de células Sf21 infectadas con AcNPV-hCANPI80-5. Se sedimentaron 1,5 x 10^{3} células Sf21 mediante centrifugación a 150 x g, se eliminó el medio de cultivo, se volvieron a suspender con 3 x 10^{2} pfu de virus AcNPV-hCANPI80-5 en 10 ml de medio de Grace suplementado con suero bovino fetal y se incubaron durante una hora a 27ºC. Después de la incubación, las células más el medio más los virus se añadieron a 90 ml del mismo medio y se incubaron a 27ºC en un frasco agitado de 250 ml durante 24 horas. Las células se recogieron como el Ejemplo 5 y el extracto se examinó para medir su actividad enzimática, también como se describe en el Ejemplo 5. En la Figura 8 se representan los resultados de 33 \mug de extracto no fraccionado. En la Figura 8 los cuadrados abiertos representan la actividad sin la presencia de calcio. Los rombos abiertos representan la actividad con la presencia de calcio. Los círculos abiertos representan la actividad cuando hay calcio e inhibidor I de la calpaína. Posteriormente se introdujo la misma cantidad de actividad enzimática para la subunidad de 80 kDa recombinante y para la calpaína recombinante en DSS-PAGE y se determinó cualitativamente la cantidad de cada una de ellas mediante análisis de inmunotransferencia, como se describe en el Ejemplo 4, más arriba. Como se determina a partir de estos datos, es necesaria aproximadamente 4-5 veces más proteína de 80 kDa aislada para dar una actividad equivalente a la de la proteína heterodimérica. Así, se determinó experimentalmente que la actividad específica de la calpaína I recombinante de 80 kDa era aproximadamente 20%-25% de la de la calpaína I heterodimérica. Esto es aproximadamente siete veces mayor que la de la subunidad de 80 kDa disociada de la calpaína I natural (Kikuchi y col., supra). Se mostró que la actividad se inhibe completamente con el inhibidor I de la calpaína 12,5 \muM, al igual que la del enzima heterodimérico (Figura 8).

Ejemplo 9 Purificación de la calpaína enzimáticamente activa recombinante

Como se describe a continuación, se purificó la calpaína recombinante en cuatro etapas, incluyendo tres etapas cromatográficas, hasta una pureza de 94%, según lo determinó el análisis con HPLC de fase inversa. Las condiciones de cultivo celular fueron las que se describen en el Ejemplo 7. Las células se lisaron en una solución que contenía HEPES 10 mM, EDTA 2 mM, EGTA 2 mM, \beta-mercaptoetanol 5 mM, pepstatina 5 mM, PMSF 0,1 mM y aprotinina 10 mg/ml, a pH 7,5, y se homogeneizaros usando un homogeneizador Dounce de 40 ml (Wheaton, Milville, NJ). Posteriormente se centrifugó el material a 2100 x g durante 30 min para sedimentar los núcleos, seguido de una centrifugación a 38.700 x g para sedimentar las membranas. El sobrenadante se precipitó con sulfato de amonio y las proteínas que precipitaron entre un 30% a 45% de sulfato de amonio se volvieron a suspender en una solución tampón que contenía HEPES 10 mM, EDTA 2 mM, EGTA 2 mM, NaCl 10 mM y \beta-mercaptoetanol 5 mM, a pH 7,5, se dializó durante una noche frente al mismo tampón, y posteriormente se separó con las siguientes resinas usando técnicas estándar: Q-Sepharose Fast Flow, seguida de Phenyl Sepharose CL-4B (ambas de Pharmacia, Piscataway, NJ), posteriormente Mimetic Red 2 (American International Chemical, Natick, MA). Después de esa técnica se aislaron 5-6 mg de proteína altamente purificada a partir de 1 l de células. Se consiguió una purificación de 15,5 veces en tres (3) separaciones cromatográficas para obtener una proteína con un alto grado de pureza. La purificación de la calpaína a partir de eritrocitos humanos precisó una purificación de más de 22.000 veces con cuatro (4) etapas cromatográficas (Hatanaka y col., supra). Esto representa un avance importante de esta expresión recombinante, en que es capaz de purificar fácilmente mayores cantidades de calpaína de lo que se puede hacer fácilmente a partir de fuentes naturales. Para cada análisis se determinó la actividad enzimática monitorizando la velocidad de la hidrólisis del sustrato fluorógeno sintético Succ-Leu-Tyr-metoxil-\beta-naftilamina (Succ-Leu-Tyr-MNA) en presencia de Ca^{2+}, de manera similar al procedimiento que utilizaron Sasaki y col., supra, para medir la hidrólisis de Succ-Leu-Tyr-AMC. Los experimentos se realizaron en 96 placas de pocillos (Dynatech, nº cat. 011-010-7905, 14340 Sullyfield Circle, Chantilly, Virginia 22021) y la fluorescencia se detectó usando un fluorímetro lector de placas de 96 pocillos (excitación = 340 nM, emisión = 430 nM; Titertek Fluoroskan II, Finlandia).

Ejemplo 10 Sensibilidad comparativa a los inhibidores de la calpaína natural y de la calpaína enzimáticamente activa recombinante

Se comparó la sensibilidad de la calpaína I natural y de la calpaína I enzimáticamente activa recombinante frente a varios inhibidores conocidos de la calpaína I. Para evaluar la sensibilidad a los inhibidores, se prepararon caldos (concentrados 40 veces) de cada inhibidor que se iba a estudiar en DMSO anhidro al 100%, y se colocaron alícuotas de 5 \mul de las preparaciones de cada inhibidor en cada uno de tres pocillos de una placa de 96 pocillos. Se hicieron diluciones de cada una de las preparaciones del enzima en tampón de ensayo (es decir, Tris HCl 50 mM, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM y \beta-mercaptoetanol 5 mM, a pH 7,5, incluyendo Succ-Leu-Tyr-MNA 0,2 mM) y 175 \mul de cada una de las alícuotas de las diluciones en los mismos pocillos que contenían los caldos de los inhibidores independientes, así como pocillos de control positivos que contenían 5 \mul de DSMO, pero sin inhibidor. Para iniciar la reacción se añadieron 20 \mul de CaCl_{2} en tampón de ensayo a todos los pocillos de la placa, excepto a tres, que se utilizaron como controles basales de la señal de fondo. Se monitorizó la hidrólisis del sustrato cada 5 min hasta un total de 30 min. La hidrólisis del sustrato en ausencia de inhibidor fue lineal hasta los 15 min. La velocidad de la hidrólisis se determinó como el cambio de unidades de florescencia en el período de tiempo de 10 min entre los 5 y los 15 min. A cada una de las concentraciones de inhibidor que se estudiaron, la inhibición porcentual se determinó como la reducción porcentual de la velocidad de la hidrólisis del sustrato en presencia de inhibidor frente a la velocidad en su ausencia. En la Tabla 3, a continuación, se representa la concentración inhibidora al 50% (CI_{50}) para tres inhibidores conocidos estructuralmente diferentes de calpaína (Z-Leu-Phe-CONHEt, Z-Leu-Leu-Phe-CH_{2}S(+)Me_{2}Br(-) y Z-Leu-Nle-H). Obsérvese que la CI_{50} que se obtuvo para cada inhibidor de la calpaína frente a la poliédrico recombinante se aproximó a la que se encontró para el enzima natural. El orden de rango de potencia de los inhibidores fue el mismo. Los inhibidores prototípicos de las proteasas de serina (PMSF) y de ácido aspártico (pepstatina A) también se incluyeron en esta determinación. Tanto el enzima recombinante como el natural mostraron una inhibición no significativa de su actividad por esta clase de inhibidores específicos, como lo manifiesta el orden de magnitud 5-6 veces mayor de las diferencias de los valores de CI_{50} que se obtienen con respecto a los inhibidores conocidos de la calpaína.

2

Ejemplo 11 Comparación de la activación con calcio de la calpaína natural y recombinante

Para determinar la concentración de calcio necesaria para la actividad enzimática, se realizaron pruebas esencialmente como lo describen Kitahara y col., J. Biochem., 95: 1759-1766 (1984). Primero se dializaron las preparaciones del enzima durante una noche frente a clorhidrato de imidazol 110 mM/tampón EGTA 1 mM a pH 7,3 que contenía \beta-mercaptoetanol 5 mM. Se prepararon tampones de Ca^{2+}/EGTA concentrados 10 veces añadiendo cantidades variables de CaCl^{2+} al tampón de imidazol/EGTA. Se pusieron 20 \mul de cada tampón en tres pocillos de una placa de 96 pocillos. Se hicieron diluciones del enzima dializado en el tampón de imidazol/EGTA que contenía Succ-Leu-Tyr-MNA 1 mM y se añadieron 180 \mul de cada preparación a los pocillos que contenían los distintos tampones de Ca/EGTA. Se midió la hidrólisis del sustrato cada 5 min durante 30 min. Se determinó la ½ V_{max} como la velocidad de la hidrólisis del sustrato que era el 50% de la velocidad máxima que se conseguía en presencia de las cantidades variables de calcio. Los resultados se muestran en la Figura 9. La ½ V_{max} que se presenta se aproxima a la [Ca^{2+}] basándose en la K_{d} del EGTA para el calcio en este tampón a la fuerza iónica, pH y temperatura particulares (K_{d} = 5,5 x 10^{-6} M). La concentración de calcio necesaria para conseguir la ½ V_{max} fue esencialmente la misma para la calpaína natural y para la calpaína recombinante de esta invención, es decir, 15 \muM y 14 \muM, respectivamente. Los perfiles de activación de [Ca^{2+}] para los enzimas natural y recombinante fueron prácticamente idénticos. En la Figura 9, los cuadrados abiertos con círculos abiertos interiores representan la calpaína humana I recombinante (rhCANPI). Los cuadrados oscuros con círculos abiertos interiores representan la calpaína humana I natural (nhCANPI).

Ejemplo 12 Ensayo de los inhibidores de calpaína

La calpaína enzimáticamente activa recombinante se purifica, por ejemplo, como se ha descrito en el Ejemplo 9, más arriba. Entonces se puede utilizar la calpaína purificada en un ensayo para hacer el cribado de los posibles inhibidores de la calpaína. Las condiciones de ensayo puede ser similares a las que se describen en los Ejemplos 9 y 10, más arriba. Por Ejemplo, se puede usar Succ-Leu-Tyr-MNA como sustrato. El inhibidor de calpaína I se puede usar como control para ensayar la inhibición de la calpaína. Sin embargo, se pueden utilizar otros sustratos e inhibidores conocidos. (véase Sasaki, supra). Las muestras sin inhibidor de la calpaína I se pueden usar como controles de la actividad enzimática. Se ensaya cada uno de los compuestos que se va a estudiar como inhibidor de la calpaína, por Ejemplo, mediante el procedimiento que se ha descrito en el Ejemplo 10, en el que se ensayaron inhibidores conocidos. Sin embargo, se pueden utilizar otros procedimientos.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE: Meyer, Sheryl L.

\hskip3.9cm

Scott, Richard W.

\hskip3.9cm

Siman, Robert

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Calpaína recombinante enzimáticamente activa expresada en un sistema de baculovirus.

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 12

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(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Woodcock, Washburn, Kurtz, Mackiewicz y Norris

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(B): CALLE: One Liberty Place, 46th floor

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(C): CIUDAD: Filadelfia

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(D): PAÍS: Estados Unidos

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(E): CÓDIGO POSTAL: 19103

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(v): TIPO DE LECTURA INFORMÁTICA:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B): ORDENADOR: Compatible IBM

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): PROGRAMA: PatentIn Release 1.0, versión 1.25

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(vi): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: EE.UU. N/D

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C): CLASIFICACIÓN:

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(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

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(A): NOMBRE: Trujillo, Doreen Y.

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 35.719

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(D): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: CEPH-0013

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A): TELÉFONO: (215) 568-3100

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (215) 568-3439

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: Sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGATCCTT AGGAATACAT AGTCAGCTGC AGCC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCCTGATC TGAAGAC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTACACTTGA AGCGTGACTT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: Sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGCAGCAA ACGAAATTGT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: Sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGGGATCCTT ATGCAAACAT GGTCAGCTGC AACC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: Sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTTGCGGAT GGTCCGGCTC TTGA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGATCCT ATAAATATGT CGGAGGAGAT CATCACGCCG

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGGGATCCT ATAAATATGT TCCTGGTT

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 24 pares de bases:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: Sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACCAGGAAC ATATTTATAG GATC

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGGAACGG CCATGCGCAT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: No

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID.: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTGATGAT GGAGTCAGGA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. Nº ID.: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: No

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTI-SENTIDO: Sí

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. Nº ID. 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGAGAAACA GAGCCAAGAG A

\hfill

21

Claims

1. Un baculovirus recombinante que comprende ADNc que codifica calpaína I de mamíferos.

2. El baculovirus recombinante de la reivindicación 1, en el que dicho baculovirus es un vector de transferencia.

3. Un procedimiento para preparar calpaína de mamíferos recombinante que comprende:

(a): infectar células de insecto con un baculovirus recombinante que comprende ADNc que codifica calpaína I de mamíferos, y

(b): recuperar calpaína enzimáticamente activa a partir de dichas células.

4. El procedimiento de la reivindicación 3 en el que dicho baculovirus es el virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica.

5. El procedimiento de la reivindicación 3 en el que dichas células de insecto son células de Spodoptera frugiperda.

6. El procedimiento de las reivindicaciones 3 a 5 en el que dicha calpaína es calpaína humana.

7. Un procedimiento para preparar calpaína de mamíferos recombinante que comprende:

(a): preparar al menos un baculovirus que comprende ADNc que codifica una subunidad de calpaína de aproximadamente 80 kDa y ADNc que codifica una subunidad de calpaína de aproximadamente 30 kDa, siendo dicha calpaína la calpaína I,

(b): infectar células de insecto con dicho baculovirus recombinante,

(c): recoger dichas células después de al menos aproximadamente 24 horas de incubación, y

(d): recuperar la calpaína enzimáticamente activa a partir de dichas células recogidas.

8. El procedimiento de la reivindicación 7 en el que dicho baculovirus es el virus de la poliedrosis nuclear Autographa californica.

9. El procedimiento de la reivindicación 7 en el que dichas células de insecto son células de Spodoptera frugiperda.

10. Un procedimiento para preparar calpaína recombinante de mamíferos que comprende:

(a): preparar un primer baculovirus que comprende ADNc que codifica una subunidad de calpaína de aproximadamente 80 kDa y un segundo baculovirus que comprende ADNc que codifica una subunidad de calpaína de aproximadamente 30 kDa, y dicha calpaína es la calpaína I,

(b): infectar células de insecto con dichos primero y segundo baculovirus,

11. El procedimiento de la reivindicación 7 o de la reivindicación 10 en el que se usa un medio sin suero.

12. El procedimiento de las reivindicaciones 7 a 11 en el que dicha calpaína es calpaína humana.

13. El baculovirus de la reivindicación 1, en el que dicha calpaína es calpaína humana.

14. El baculovirus de la reivindicación 1, en el que dicho baculovirus comprende ADNc que codifica una subunidad de calpaína de 80 kDa y ADNc que codifica una subunidad de calpaína de 30 kDa.