JP2014506465A - 核酸の分析 - Google Patents
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Abstract
核酸の分析のための改善された方法、組成物およびキットを本明細書において提供する。これらの改善された方法、組成物およびキットは、サンプル中の核酸のコピー数推定を可能にし得る。サンプル中の標的核酸の2つ以上のコピーの連鎖(例えば、該2つ以上のコピーが同じ染色体上にあるのか、または異なる染色体上にあるのか)を決定するための、または対立遺伝子をフェージングするための方法、組成物およびキットも本明細書において提供する。
Description
相互参照
この出願は、2011年2月9日に出願された米国仮特許出願第61/441,209号;2011年2月18日に出願された同第61/444,539号;2011年3月18日に出願された同第61/454,373号;2011年4月15日に出願された同第61/476,115号;2011年4月25日に出願された同第61/478,777号;2011年5月9日に出願された同第61/484,197号;ならびに2011年5月25日に出願された同第61/490,055号(これらの出願の全ては、それらの全体が参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
この出願は、2011年2月9日に出願された米国仮特許出願第61/441,209号;2011年2月18日に出願された同第61/444,539号;2011年3月18日に出願された同第61/454,373号;2011年4月15日に出願された同第61/476,115号;2011年4月25日に出願された同第61/478,777号;2011年5月9日に出願された同第61/484,197号;ならびに2011年5月25日に出願された同第61/490,055号(これらの出願の全ては、それらの全体が参考として本明細書に援用される)の利益を主張する。
被験体からのサンプル中の標的核酸のコピー数を決定することにより、様々な臨床応用に有用な情報を得ることができる。しかし、標的核酸のコピー数を決定するための一部のアッセイは、標的核酸の複数のコピーがサンプル中の同じポリヌクレオチド上にある場合、標的核酸のコピー数を過小推定することがある。例えば、デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)の場合、標的配列の2個のコピーを含む空間的に孤立したポリヌクレオチドは、標的核酸の1個のコピーしか有さないとカウントされることがある。標的核酸配列の連鎖(例えば、標的核酸配列の複数のコピーがサンプル中の同じポリヌクレオチド上にあるのかどうか)を考慮に入れる、dPCRアッセイなどのアッセイでの核酸標的配列のコピー数推定のための改善された方法、組成物およびキットが必要とされている。
隣接多型のハプロタイプまたはフェージングの知識は、様々な設定に有用であり得る。人の各々の体細胞において各染色体タイプは1対の個々の染色体の二倍で表されるので、ヒトは二倍体生物である。この対の一方のコピーはその人の父親から遺伝され、他方のコピーはその人の母親から遺伝される。したがって、殆どの遺伝子は、各二倍体細胞に2個のコピーとして存在する。しかし、前記コピーは、配列の変動が該コピー間で発生して、対立遺伝子として公知の別個の配列を形成する、多くの遺伝子座を一般に有する。
染色体対の個々の染色体各々についての対立遺伝子のパターン、ハプロタイプ、を知ることは、多くの場合、有用であり得る。例えば、ある人が遺伝子内の2つの異なる遺伝子座に不活性化変異を有する場合、該変異は、同じ個々の染色体上に一緒に存在する場合にはあまり重要でないだろうが、染色体対の個々の染色体両方の間に分布している場合は大きな効果を発揮するだろう。最初のケースでは、遺伝子の一方のコピーは、2つの異なる遺伝子座で不活性化されるが、他方のコピーは、活性遺伝子産物を供給するために利用可能である。第二のケースでは、遺伝子の各コピーが不活性化変異の1つを有し、そのためいずれの遺伝子コピーも活性遺伝子産物を供給しない。問題となる遺伝子によっては、遺伝子の両方のコピーの変異は、数ある中でも生育不能表現型、疾患リスク増加、またはある種の薬物の代謝不能をはじめとする、様々な生理的帰結につながり得る。
ハプロタイプに関する情報は、生命科学応用のための、医療分野のための、および法医学などの応用マーケットに関する有用な情報であり得る。ヒト(および非ヒト)遺伝学の多くの状況でハプロタイプ決定(haplotyping)の問題が生ずる。例えば、多くの遺伝的関連性がハプロタイプに結びつけられ、それ故、ハプロタイプによって予測される。HLA(ヒト白血球抗原)領域は、特定の遺伝性疾患が主要組織適合性複合体の様々なハプロタイプと関連づけられている1つの顕著な例である。
従来の遺伝子型決定技術は、配列変動、例えばSNP(一塩基多型)、の異なる遺伝子座を互いに孤立して照合する。したがって、これらの技術は、遺伝物質のサンプルにおいて一対の別個の対立遺伝子が2つの連鎖遺伝子座の各々に存在することを確信的に決定することができる。しかし、これらの技術は、2つの遺伝子座からの対立遺伝子のどの組み合わせが同じ染色体コピー上に位置するのかを告げることはできない。この障害を克服するためにハプロタイプを決定するための新規アプローチが必要とされている。
同様に、サンプル中の2つの標的核酸配列間での断片化の確率の決定、核酸(例えば、DNA、RNA)のサンプル中の分解レベルの決定、選択的スプライシングの評価、または逆位、転座もしくは欠失の検出のための新規方法が必要とされている。
一部の態様において、本開示は、標的核酸のコピー数の変動を検出する方法であって、a.少なくとも1つの薬剤と、第一および第二の標的核酸を含む複数のポリヌクレオチドを含むサンプルとを接触させる工程;b.前記薬剤が、前記2つの標的核酸が同じポリヌクレオチド上に位置するときに該2つの標的核酸間の特異的に選択された標的部位を開裂させて、その結果、該2つの標的核酸を分離できるようにする条件に、前記サンプルを供する工程;c.前記薬剤と接触した前記サンプルを複数の空間的に孤立した区画に分ける工程;d.前記標的核酸を含む空間的に孤立した区画の数を計数する工程;ならびにe.前記計数する工程に基づき前記標的核酸のコピー数を決定する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、前記空間的に孤立した区画は、エマルジョン中の液滴である。一部の実施形態において、前記標的核酸は、1液滴につき約5コピー未満、1液滴につき約4コピー未満、1液滴につき約3コピー未満、1液滴につき約2コピー未満、または1液滴につき約1コピー未満の平均濃度で存在する。一部の実施形態において、前記特異的に選択された標的部位は、前記第一の標的核酸と前記第二の標的核酸との間に位置する。一部の実施形態において、前記方法は、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を増幅反応に供する工程をさらに含む。
本態様の一部の実施形態において、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸は、同一のまたはほぼ同一の配列を有する。一部の実施形態において、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸は、異なる配列を有する。一部の実施形態において、前記特異的に選択された標的部位は、制限酵素での消化が可能な部位である。一部の実施形態において、前記薬剤は、1つ以上の制限酵素である。一部の実施形態において、前記特異的に選択された部位および前記第一の標的核酸は、同じ遺伝子内に位置する。一部の実施形態において、前記標的核酸は、疾患または障害と相関する。一部の実施形態において、前記方法は、参照核酸を含む空間的に孤立した区画の数を計数(カウント)する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記参照核酸は、前記サンプルが由来するゲノム内に固定コピー数で存在する。一部の実施形態において、前記参照核酸は、ハウスキーピング遺伝子である。一部の実施形態において、前記参照核酸は、前記サンプルが由来する二倍体ゲノム1つにつき2コピーで存在する。一部の実施形態において、前記標的核酸のコピー数を決定する工程は、計数された標的核酸の数を計数された参照核酸の数で割ることを含む。
本態様の一部の実施形態において、前記薬剤は、前記標的核酸の配列を切断しない。一部の実施形態において、前記薬剤は、前記参照核酸の配列を切断しない。一部の実施形態において、前記標的核酸は、単一ポリヌクレオチド上に複数のコピーで存在する。一部の実施形態において、前記1つ以上の制限酵素は、前記2つの標的配列の間に1つより多い認識配列を有する。一部の実施形態において、前記1つ以上の制限酵素は、有意なスター活性を呈さない。一部の実施形態において、前記1つ以上の制限酵素は、2つ以上の制限酵素を含む。一部の実施形態では、ソフトウェアを使用して、前記1つ以上の制限酵素を選択する。一部の実施形態では、前記ポリヌクレオチドを消化した後に前記1つ以上の制限酵素を熱不活化する。一部の実施形態において、標的断片の二本鎖性を維持するために、前記熱不活化の温度は、該制限された標的断片の融点より低い。一部の実施形態では、前記1つ以上の制限酵素による核酸の消化の効率を測定するために対照制限酵素消化(digest)を行う。一部の実施形態では、前記サンプル中の断片化される連鎖した標的配列の百分率を決定する。
もう1つの態様において、本開示は、核酸のコピー数の変動を検出する方法であって、a.複数のポリヌクレオチドを含むサンプルを提供する工程(該複数は、該複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つのポリヌクレオチド内に位置する第一および第二の標的核酸を含む);b.前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が同じポリヌクレオチド中に存在するとき、前記少なくとも1つのポリヌクレオチドを前記第一の標的核酸と第二の標的核酸との間で開裂させて、開裂されたサンプルを形成する工程;c.前記開裂されたサンプルを複数の空間的に孤立した領域に分ける工程;d.前記標的核酸を含む空間的に孤立した領域の数を計数する工程;ならびにe.少なくとも2つの標的核酸のうちの2つが同じポリヌクレオチドの同じ領域内に位置する場合、前記標的核酸のコピー数を前記計数する工程に基づき決定する工程を含む方法を提供する。
一部の実施形態では、1メガベース未満の塩基が前記2つの標的核酸を隔てている。一部の実施形態では、1キロベース未満の塩基が前記2つの標的核酸を隔てている。一部の実施形態では、前記開裂を制限酵素で果たす。一部の実施形態において、前記複数の空間的に孤立した領域は、エマルジョン中の液滴である。一部の実施形態において、前記方法は、工程dの計数の前にPCR反応を行う工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記方法は、シークエンシング反応を含まない。
もう1つの態様において、前記方法は、標的核酸のコピー数の変動を検出する方法であって、a.(i)複数のポリヌクレオチド(該ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、第一標的核酸、および該第一標的核酸のコピーを含む)と(ii)前記標的核酸を検出するための蛍光標識を有するプローブと(iii)PCR反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを得る工程;b.平均で5未満の標的核酸を含む複数の空間的に孤立した区画に前記サンプルを分ける工程;c.前記標的核酸を検出するために前記サンプルをPCR増幅反応に供する工程;d.前記PCR反応のための試薬のいずれかが限界になる前に前記蛍光標識の蛍光強度を検出する工程(この場合、区画内のより高い蛍光強度がポリヌクレオチド上の1つより多くの標的核酸の存在の指標となる);e.前記標的核酸の1個のコピーを示す閾値より上の蛍光強度を有する区画の数を計数する工程;f.前記標的核酸の複数のコピーを示す閾値より上の蛍光強度を有する区画の数を計数する工程;ならびにg.(i)工程eおよび工程fにおいて得た数に基づいて前記標的核酸のコピー数を算出する工程、または(ii)2つの標的核酸が同じポリヌクレオチド上に存在するかどうかを決定する工程のいずれかを含む方法を含む。
一部の実施形態において、前記標的核酸のコピー数増加は、疾患または障害と相関する。
さらにもう1つの態様において、本開示は、同じポリヌクレオチド上に存在する場合の複数の標的核酸を同定する方法であって、a.第一および第二の標的核酸を含む複数のポリヌクレオチドを含むサンプルを少なくとも2つのサブサンプルを分ける工程;b.前記第一の標的核酸と第二の標的核酸を、それらが同じポリヌクレオチド上に存在する場合に物理的に分離することが可能な薬剤と第一のサブサンプルとを接触させる工程;c.工程bの後、前記第一のサブサンプルを第一セットの区画に分ける工程;d.前記第一セットの区画の中の前記標的核酸を含む区画の数を決定する工程;e.第二のサブサンプルを第二セットの区画に分ける工程;f.前記第二セットの区画の中の標的核酸を含む区画の数を決定する工程;ならびにg.工程dで得た値と工程fで得た値を比較して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、同じポリヌクレオチド内に存在するかどうかを決定する工程を含む方法を提供する。
一部の実施形態において、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸は、同じ配列を含む。一部の実施形態において、前記薬剤は制限酵素である。一部の実施形態では、工程dにおいて得た数が、工程fにおいて得た数より有意に高いとき、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の連鎖が示される。一部の実施形態において、前記制限酵素は、前記第一の標的核酸と前記第二の標的核酸との間の部位を認識する。一部の実施形態において、前記第一および第二の標的配列は、互いの1メガベース未満以内に位置する。一部の実施形態では、前記サンプルを1つ以上の制限酵素と接触させた後、サブサンプルを分ける前に24時間未満の間、該サンプルを保管する。一部の実施形態において、前記標的配列は、前記第二のサブサンプルでは物理的に分離しない。一部の実施形態では、前記方法は、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、同じ染色体上にあるのか、または異なる染色体上にあるのかを決定する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記第一の標的核酸の配列は、前記第二の標的核酸の配列と異なる。一部の実施形態において、前記第一の標的核酸の配列は、前記第二の標的核酸の遺伝的変異である。一部の実施形態において、前記遺伝的変異は、一塩基多型である。一部の実施形態において、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸は、同じ遺伝子内にある。一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも2つは染色体である。一部の実施形態において、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸は、別々の染色体上に位置する。一部の実施形態において、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸は、同じ染色体上に位置する。一部の実施形態において、前記染色体の少なくとも一方は、前記第一の標的核酸の2個のコピーを含む。一部の実施形態において、前記染色体の少なくとも一方は、前記の第一標的核酸の少なくとも3個のコピーを含む。他の実施形態において、染色体は、前記第一の標的核酸の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のコピーを含む。一部の実施形態において、前記制限酵素のうちの1つ以上は、メチル感受性制限酵素である。
さらにもう1つの態様において、本開示は、サンプル中のポリヌクレオチドの断片化の確率を決定する方法であって、a.(i)複数のポリヌクレオチド(該ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、第一の標的核酸および第二の標的核酸を含む)と(ii)前記第一の標的核酸を検出するための第一の標識プローブと(iii)前記第二の標的核酸を検出するための第二の標識プローブと(iii)PCR反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを得る工程;b.前記サンプルを、平均で5未満の標的ポリヌクレオチドを含む複数の空間的に孤立した区画に分ける工程;c.前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を検出するために、前記サンプルをPCR増幅反応に供する工程;d.前記区画内の標識プローブを検出する工程;e.工程dに基づき、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の両方を含む区画の数を計数する工程;ならびにf.前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の両方を含む区画の数と前記サンプルの断片化の程度とを相関させる工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸は、1メガベース以内で離れている。一部の実施形態において、健常被験体では、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が1キロベースより多い塩基によって隔てられている。一部の実施形態において、前記方法は、第一および第二の標的核酸の両方を含有する区画の期待数を、該標的核酸が物理的に連鎖している場合に算出する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記断片化の確率は、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の両方を含有する区画数の減少と正に相関する。
さらにもう1つの異なるが関連のある態様において、本開示は、ポリヌクレオチドのサンプル中の2つの遺伝的に連鎖した遺伝子座の断片化の確率を決定するための方法であって、a.前記サンプルを用いてデジタルPCR(dPCR)を行う工程(この場合のdPCRは、ポリヌクレオチドを分離されたユニットに分離することを含む);b.第一の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数と第一の遺伝子座および第二の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数の第一の合計を決定する工程;c.第二の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数と第一の遺伝子座および第二の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数の第二の合計を決定する工程;ならびにd.前記第一の合計および前記第二の合計をアルゴリズムにインプットして、断片化される前記サンプル中の前記2つの遺伝的に連鎖した遺伝子座の百分率を決定する工程を含む方法を提供する。
一部の実施形態において、前記サンプル中のポリヌクレオチドは、部分的に分解される。一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドはDNAである。一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドはRNAである。一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、DNAとRNAの混合物を含む。
本開示は、第一の標的核酸が第二の標的核酸と同じポリヌクレオチド上に存在する確率を決定するための方法であって、a)ポリヌクレオチドのサンプルを少なくとも2つのサブサンプルに分割する工程;b)第一のサブサンプルに関して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸をショートサイクルPCRで事前増幅させる工程;c)前記第一のサブサンプルを第一セットの区画に分ける工程;d)前記第一のサブサンプルからの前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を一緒に含有する区画の数を計数する工程;e)第二のサブサンプルを第二セットの区画に分ける工程;f)前記第二のサブサンプルからの前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を一緒に含有する区画の数を計数する工程;ならびにg)工程fの値と工程dの値を比較して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が同じポリヌクレオチド上で連鎖している確率を決定する工程を含む方法も提供する。
一部の実施形態において、前記ショートサイクルPCRは、24サイクル未満のPCR反応を含む。一部の実施形態において、前記方法は、アルゴリズムを使用して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が同じポリヌクレオチド上でフェージングされるかまたは存在する確率を決定する工程をさらに含む。
もう1つの態様において、本開示は、染色体からの標的核酸の欠失の確率を同定する方法であって、(a)(i)1対の染色体であって、該染色体の少なくとも一方が第一の標的核酸を含有し、かつ両方の染色体が同じマーカー核酸を含有するような染色体と(ii)第一の標的核酸を検出するための第一の標識プローブと(iii)前記マーカー核酸を検出するための第二の標識プローブと(iii)PCR反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを複数の区画に細分する工程;(b)増幅反応を行って、前記区画内の前記第一の標的核酸および前記マーカー核酸を検出する工程;(c)前記マーカー核酸を含有し、標的核酸を含有しない区画の数を計数する工程;ならびに(d)工程cの値に基づき前記染色体の少なくとも一方からの標的核酸の欠失の確率を決定する工程を含み、工程cにおけるより高い値が、前記標的核酸が前記一対の染色体の一方に不在である確率の増大と相関する方法を提供する。
一部の実施形態において、前記標的核酸は、前記染色体の少なくとも一方の上に複数のコピーで存在すると推測される。一部の実施形態において、前記マーカーおよび前記標的核酸は、前記染色体の少なくとも一方の上に互いに極めて近接して位置する。一部の実施形態において、前記マーカーと前記標的核酸は、5000塩基対以内、離れている。一部の実施形態において、前記マーカー核酸は、一塩基多型を含む。一部の実施形態において、前記方法は、別のアッセイを行って、異なるポリヌクレオチドの断片化を決定する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記方法は、工程dの決定を補助するために前記別のアッセイの結果を使用する工程をさらに含み、欠失の確率が高いことの決定が、前記異なるポリヌクレオチドが断片化されていることの決定によって強化される。一部の実施形態において、前記方法は、別のアッセイを行って、前記サンプル中の高分子量DNAの存在を決定する工程をさらに含む。
さらにもう1つの態様において、本開示は、ポリヌクレオチドからの標的領域の欠失または転座の確率を同定する方法であって、(a)(i)第一のマーカー核酸および第二のマーカー核酸を含むと推測されるポリヌクレオチドであって、前記第一のマーカー核酸および前記第二のマーカー核酸が少なくとも1メガベースの塩基によって隔てられており、ならびに前記標的領域が前記第一のマーカー核酸および前記第二のマーカー核酸間に位置すると推測されるものであるポリヌクレオチドと(ii)前記第一のマーカー核酸を検出するための第一の標識プローブと(iii)前記第二のマーカー核酸を検出するための第二の標識プローブと(iii)PCR反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを複数の区画に細分する工程;(b)増幅反応を行って、前記区画内の前記第一のマーカー核酸および前記第二のマーカー核酸を検出する工程;(c)前記区画内の前記第一のマーカー核酸および前記第二のマーカー核酸の両方を含有する区画の数を計数する工程;ならびに(d)工程cの値に基づいて前記標的領域の欠失または転座の確率を決定する工程を含み、工程cにおけるより高い値が、前記標的核酸が前記ポリヌクレオチドに不在である確率の増大と相関する方法を提供する。一部の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、染色体である。一部の実施形態において、前記標的領域は、野生型被験体に存在することが公知の染色体の特異的領域である。一部の実施形態において、前記方法は、別のアッセイを行って、異なるポリヌクレオチドの断片化を決定する工程をさらに含む。一部の実施形態において、前記方法は、工程dの決定を補助するために前記別のアッセイの結果を使用する工程をさらに含み、欠失または転座の確率が高いことの決定が、前記異なるポリヌクレオチドが断片化されていないことの決定によって強化される。
1つの態様において、本開示は、ハプロタイプ分析方法であって、(a)核酸を含有する水性相を複数の別個の容積に分配する工程;(b)前記核酸内の配列変動を呈する第一の多型性遺伝子座および第二の多型性遺伝子座の各々から少なくとも1つの対立遺伝子配列を前記容積内で増幅させる工程;(c)同じ容積内の両方の遺伝子座からの対立遺伝子配列の共増幅の少なくとも1つの測定値を決定する工程;ならびに(d)共増幅の前記少なくとも1つの測定値に基づき、前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座のハプロタイプを選択する工程を含む方法を提供する。
この態様の一部の実施形態において、前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座は、前記核酸の標的領域内に含有され、前記分配する工程が、1容積につき数コピー未満の標的領域という平均濃度をもたらす結果となる。一部の実施形態において、前記分配する工程は、1容積につき約1コピー未満の標的領域という平均濃度をもたらす結果となる。
この態様の一部の実施形態において、前記少なくとも1つの測定値を決定する工程は、同じ容積からの第二の遺伝子座の対立遺伝子特異的増幅データと相関する第一の遺伝子座の対立遺伝子特異的増幅データについての少なくとも1つの相関係数を決定する工程を含む。場合によっては、前記少なくとも1つの測定値を決定する工程は、同じ容積からの第二の遺伝子座の対立遺伝子特異的増幅データとそれぞれ相関する第一の遺伝子座の第一の対立遺伝子配列および第二の対立遺伝子配列の対立遺伝子特異的増幅データについての第一の相関係数および第二の相関係数を決定する工程を含み、ならびに前記ハプロタイプを選択する工程は、その第一の相関係数と第二の相関係数を互いに比較する工程に基づく。場合によっては、前記少なくとも1つの測定値を決定する工程は、前記第一の遺伝子座の特定の対立遺伝子配列と前記第二の遺伝子座の特定の対立遺伝子配列との共増幅を呈する容積の数を決定する工程を含み、ならびに前記ハプロタイプを選択する工程は、共増幅を呈する容積の数に基づく。前記容積の数を決定する工程は、前記第一の遺伝子座の第一の対立遺伝子配列または第二の対立遺伝子配列と前記第二遺伝子座の特定の対立遺伝子配列とのそれぞれの共増幅を呈する、容積の第一の数および容積の第二の数を決定する工程をさらに含むことがあり、ならびに前記ハプロタイプを選択する工程は、容積の第一および第二の数に基づく。
一部の実施形態において、前記少なくとも1つの測定値を決定する工程は、個々の容積からの各々の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを収集すること、ならびに同じ容積からの第一の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを第二の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データとを相関させることを含む。
この態様の一部の実施形態において、前記分配する工程は、前記容積が液滴であるエマルジョンを形成する工程を含む。一部の実施形態において、前記収集する工程は、前記エマルジョンの個々の液滴から対立遺伝子特異的増幅データを収集することを含むことがある。
一部の実施形態において、前記エマルジョンを形成する工程は、前記水性相をオリフィスに通して、該水性相の単分散液滴を生じさせる工程を含む。一部の実施形態において、前記分配する工程は、直径が約10から1000マイクロメートルである液滴を形成する工程を含む。一部の実施形態において、前記分配する工程は、少なくとも約1000容積を形成する工程を含む。場合によっては、前記分配する工程は、増幅された各対立遺伝子配列に特異的にハイブリダイズすることができる光学的に区別可能な蛍光プローブを含む水性相を分配する工程を含む。
一部の実施形態において、前記核酸は、二倍体被験体から得られる、または二倍体被験体に由来する。場合によっては、前記核酸は、被験体から得た遺伝物質である。場合によっては、前記核酸は、被験体から得たRNAの逆転写によって得たcDNAを含む。場合によっては、前記被験体が多細胞生物である。場合によっては、前記被験体は人である。
一部の実施形態において、前記増幅させる工程は、前記第一の遺伝子座から1対の異なる対立遺伝子配列を増幅させる工程を含み、および前記データを収集する工程は、個々の液滴中の該対の各対立遺伝子配列の増幅を区別するデータを収集する工程を含む。
一部の実施形態において、前記相関させる工程は、前記第一の遺伝子座の各対立遺伝子配列についての対立遺伝子特異的増幅データを前記第二の遺伝子座の対立遺伝子配列についての対立遺伝子特異的増幅データと別々に相関させる工程を含む。
場合によっては、前記相関させる工程は、閾値を前記対立遺伝子特異的増幅データに適用してそれをバイナリ形式に変換する工程をさらに含み、該バイナリ形式のデータを用いて該相関工程を行う。場合によっては、前記相関させる工程は、両方の遺伝子座からの特定の対立遺伝子配列の共増幅を呈する容積の数を決定する工程をさらに含む。場合によっては、前記相関させる工程は、前記第二の遺伝子座対立遺伝子配列と前記第一の遺伝子座からの第一の対立遺伝子配列の共増幅を呈する容積の第一の数、および前記第二の遺伝子座対立遺伝子配列と前記第一の遺伝子座からの第二の対立遺伝子配列の共増幅を呈する液滴の第二の数を決定する第一の工程と、容積の第一の数と第二の数を比較する第二の工程とをさらに含む。
一部の実施形態において、前記ハプロタイプを選択する工程は、前記第一の遺伝子座についてのどの対立遺伝子特異的増幅データが、前記第二の遺伝子座についてのかかる対立遺伝子特異的増幅データとのより高い相関を呈するか、に基づく。一部の実施形態において、前記ハプロタイプを選択する工程は、前記第一の遺伝子座から増幅されたそれぞれの別個の対立遺伝子配列に対応する相関係数に基づく。一部の実施形態において、前記ハプロタイプを選択する工程は、前記相関させる工程が、同じ容積内の前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座の特定の対立遺伝子配列の共増幅について負の相関を示すか、正の相関を示すかに基づく。
もう1つの態様において、本開示は、ハプロタイプ分析用システムであって、(a)核酸を含む水性相の液滴を形成するように構成された液滴発生器と、(b)個々の液滴からの各々の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを収集するように構成された検出器と、(c)同じ容積からの第一の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データと第二の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データとを相関させるように、ならびにその対立遺伝子特異的増幅データの相関に基づいて該第一および第二の遺伝子座についての核酸のハプロタイプを選択するように構成されたプロセッサとを備えるシステムを提供する。
一部の態様において、本開示は、ゲノムDNAのサンプル中のCpGアイランドのメチル化の程度を決定する方法であって、a.CpGアイランドによって第二の標的核酸から隔てられている第一の標的核酸を含むゲノムDNAのサンプルを得る工程;b.前記ゲノムDNAサンプルとメチル感受性制限酵素とを該ゲノムDNA中の非メチル化核酸の消化を可能にするのに好適な条件下で接触させる工程;c.前記サンプルと前記第一の標的核酸の存在を検出するプローブとを接触させる工程;d.前記サンプルと前記第二の標的核酸の存在を検出するプローブとを接触させる工程;e.前記サンプルを複数の空間的に孤立した区画に分ける工程;f.それらの区画内で、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の検出に好適な増幅反応を行う工程;g.前記第一と第二両方の標的核酸を含む区画の数を決定する工程;h.工程gで得た数と第一または第二の標的核酸を含む区画の数とを比較する工程;ならびにi.工程hでの比較から、前記ゲノムDNAサンプル中のCpGアイランドのメチル化の程度を決定する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態において、前記ゲノムDNAは、ヒトゲノムDNAである。一部の実施形態において、前記ゲノムDNAは、母体DNAおよび胎児DNAを含む。一部の実施形態において、前記ゲノムDNAは、胎児DNAを含む。
参照による援用
本明細書中で言及するすべての出版物、特許および特許出願は、各々個々の出版物、特許または特許出願が参照により援用されていると具体的にかつ個々に示されている場合と同じ程度に、参考として本明細書に援用されている。
本明細書中で言及するすべての出版物、特許および特許出願は、各々個々の出版物、特許または特許出願が参照により援用されていると具体的にかつ個々に示されている場合と同じ程度に、参考として本明細書に援用されている。
本発明の新規特徴を詳細に添付の特許請求の範囲に示す。本発明の原理を用いる例証となる実施形態を示す後続の詳細な説明および添付の図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のよりよい理解が得られるだろう。
発明の詳細な説明
概観
一般に、核酸配列を分析するための、例えばデジタル分配する(digital partitioning)ための、方法、組成物およびキットを本明細書において提供する。例えば、サンプル、例えばゲノム、中の標的核酸配列のコピー数を推定するための方法、組成物およびキットを本明細書において提供する。サンプル、例えばゲノム、中の1つ以上の標的配列の連鎖またはハプロタイプ情報を決定するための方法、組成物およびキットも本明細書において提供する。ハプロタイプ決定情報は、1つの標的配列の複数のコピーが単一のまたは複数の染色体上にあるのか否かに関する情報であり得る。同じ区画内の異なる標的の併置の概念を用いて、フェーズ、すなわち、ある変異またはSNPの特定の対立遺伝子が、別の変異またはSNPの対立遺伝子に物理的に連鎖しているかどうか、を推断することは、実用的であり得る。もう1つの態様では、核酸サンプル(例えば、ゲノムDNAサンプル、RNAサンプル、mRNAサンプル、DNAサンプル、cRNAサンプル、cDNAサンプル、miRNAサンプル、siRNAサンプル)における断片化または分解の程度を、例えば併置シグナルのデジタル分析により、決定するための方法、組成物およびキットを本明細書において提供する。もう1つの態様では、核酸メチル化状態の分析、選択的スプライシングの分析、逆位、転座および欠失の発見のための方法を本明細書において提供する。
概観
一般に、核酸配列を分析するための、例えばデジタル分配する(digital partitioning)ための、方法、組成物およびキットを本明細書において提供する。例えば、サンプル、例えばゲノム、中の標的核酸配列のコピー数を推定するための方法、組成物およびキットを本明細書において提供する。サンプル、例えばゲノム、中の1つ以上の標的配列の連鎖またはハプロタイプ情報を決定するための方法、組成物およびキットも本明細書において提供する。ハプロタイプ決定情報は、1つの標的配列の複数のコピーが単一のまたは複数の染色体上にあるのか否かに関する情報であり得る。同じ区画内の異なる標的の併置の概念を用いて、フェーズ、すなわち、ある変異またはSNPの特定の対立遺伝子が、別の変異またはSNPの対立遺伝子に物理的に連鎖しているかどうか、を推断することは、実用的であり得る。もう1つの態様では、核酸サンプル(例えば、ゲノムDNAサンプル、RNAサンプル、mRNAサンプル、DNAサンプル、cRNAサンプル、cDNAサンプル、miRNAサンプル、siRNAサンプル)における断片化または分解の程度を、例えば併置シグナルのデジタル分析により、決定するための方法、組成物およびキットを本明細書において提供する。もう1つの態様では、核酸メチル化状態の分析、選択的スプライシングの分析、逆位、転座および欠失の発見のための方法を本明細書において提供する。
コピー数変動の推定
1つ以上の標的配列のコピー数変動は、多数の疾患および障害において一定の役割を果し得る。標的配列のコピー数変動を分析するための1つの方法は、デジタル分析、例えばデジタルPCRまたは液滴デジタルPCR、による方法である。しかし、標的配列のコピー数のデジタル分析は、サンプル中の標的核酸の複数のコピーが同じポリヌクレオチド上にあると、そのサンプル中の標的核酸配列のコピー数を過小推定することがある。例えば、複数のコンパートメント(例えば、区画、空間的に孤立した領域)を有するデジタルPCRアッセイの場合、各コンパートメントが平均で約0、1、2または数個の標的ポリヌクレオチドを受け取るようにサンプル中の核酸を分配することができる。各区画は、1区画(例えば、液滴)につき平均で標的核酸の5、4、3、2または1個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175または200の区画(例えば、液滴)に含まれる標的核酸のコピー数が0である。ポリヌクレオチドを含有するコンパートメントの数を計数することができる。しかし、標的核酸配列の2個のコピーが単一ポリヌクレオチド上にある場合、そのポリヌクレオチドを含有するコンパートメントは、1つの標的配列しか有さないとカウントされることがある。
1つ以上の標的配列のコピー数変動は、多数の疾患および障害において一定の役割を果し得る。標的配列のコピー数変動を分析するための1つの方法は、デジタル分析、例えばデジタルPCRまたは液滴デジタルPCR、による方法である。しかし、標的配列のコピー数のデジタル分析は、サンプル中の標的核酸の複数のコピーが同じポリヌクレオチド上にあると、そのサンプル中の標的核酸配列のコピー数を過小推定することがある。例えば、複数のコンパートメント(例えば、区画、空間的に孤立した領域)を有するデジタルPCRアッセイの場合、各コンパートメントが平均で約0、1、2または数個の標的ポリヌクレオチドを受け取るようにサンプル中の核酸を分配することができる。各区画は、1区画(例えば、液滴)につき平均で標的核酸の5、4、3、2または1個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175または200の区画(例えば、液滴)に含まれる標的核酸のコピー数が0である。ポリヌクレオチドを含有するコンパートメントの数を計数することができる。しかし、標的核酸配列の2個のコピーが単一ポリヌクレオチド上にある場合、そのポリヌクレオチドを含有するコンパートメントは、1つの標的配列しか有さないとカウントされることがある。
標的核酸配列を物理的に分離するための方法を本明細書において提供する。多くの場合、本明細書において提供する方法は、単一ポリヌクレオチド上の標的配列の複数のコピーの存在に起因する標的配列のコピー数の過小推定を回避する。図1は、コピー数推定方法の1つの実施形態の概要(101)を図示するものであり、本開示において提供するこの図および残りの図は、例証のみを目的とするものであり、本発明を制限することを意図したものではない。図1における工程を任意の好適な順序および組み合わせで行うことができ、ならびに本開示の任意の他の工程と一体化させることができる。ポリヌクレオチドの第一のサンプルを得る(121);この第一のサンプルは、例えばゲノムDNAサンプルであり得る。第一のサンプル中の標的核酸配列を(例えば、第一のサンプルを1つ以上の制限酵素と接触させることにより)物理的に分離することができる(141)。その第一のサンプルを複数の区画に分けることができる(161)。標的配列を有する区画の数を計数することができる(181)。その標的のコピー数を推定することができる(201)。
前記標的核酸は同一であることがあり、または他の場合、前記標的核酸は異なることがある。場合によっては、前記標的核酸は、同じ遺伝子内に位置する。場合によっては、前記標的核酸は、遺伝子の異なるコピー(同一のまたはほぼ同一のコピー)中に各々位置する。さらに他の場合、標的配列はイントロン内に、または遺伝子間の領域に位置する。ときとして、1つの標的配列は遺伝子内に位置し、第二の標的配列はその遺伝子の外部に位置する。場合によっては、標的配列はエキソン内に位置する。
場合によっては、ゲノムは1つの標的配列を含む。場合によっては、ゲノムは2つ以上の標的配列を含む。ゲノムが2つ以上の標的配列を含むとき、該標的配列は、約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%以上同一、または100%同一である。
2つの標的配列の物理的分離は、核酸配列上の特定の部位を開裂させることによる標的配列の物理的分離を含み得る。場合によっては、標的核酸配列の物理的分離は、1つ以上の制限酵素と第一のサンプルを接触させることを含むことがある。標的核酸配列の物理的分離は、標的核酸配列間に位置する部位でのポリヌクレオチドの消化を含むことがある。場合によっては、前記標的核酸配列は、各々、遺伝子内に位置する。場合によっては、消化の標的になる部位は、2つの遺伝子間に位置する。場合によっては、消化に選ばれる部位は、遺伝子内に位置し、および場合によっては、該遺伝子は、標的配列を含有する遺伝子と同じ遺伝子である。他の場合、消化に選ばれる部位は、標的配列のものとは異なる遺伝子内に位置する。場合によっては、標的配列および消化の標的になる部位は同じ遺伝子内に位置し、該標的配列は、該消化の標的になる部位の上流に位置する。他の場合、標的配列および消化の標的になる部位は同じ遺伝子内に位置するが、該標的配列は、該消化の標的になる部位の下流に位置する。場合によっては、1つ以上の制限酵素での核酸サンプルの処理により標的核酸を分離することができる。場合によっては、剪断により標的核酸を分離することができる。場合によっては、音波処理により標的核酸を分離することができる。
物理的分離工程(例えば、1つ以上の制限酵素での消化)後、そのサンプルを複数の区画に分配することができる。その複数の区画の各々が、約0、1、2または数個の標的ポリヌクレオチドを含むことができる。各区画は、1区画(例えば、液滴)につき平均で標的核酸の5、4、3、2または1個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175または200個の液滴が、標的核酸の0個のコピーを有する。
多くの場合、標的核酸を前記区画内で増幅させる。場合によっては、この増幅は、1つ以上のTaqManプローブの使用を含む。
もう1つの実施形態において、前記方法は、参照核酸配列を含む区画の数を計数する工程をさらに含む。参照核酸配列は、1ゲノムにつき一定数のコピーで存在することが公知であり、サンプル中の標的核酸配列のゲノムコピーの数を推定するために使用することができる。もう1つの実施形態において、前記コピー数の推定は、標的配列を含む区画の数を参照核酸配列を含む区画の数と比較することを含み得る。もう1つの実施形態では、参照配列に対する標的核酸配列の濃度の比によってCNV推定値を決定する。
もう1つの実施形態において、前記方法は、第二のサンプルを分析する工程をさらに含み、該第二のサンプルと第一のサンプルは、同じサンプルに由来する(例えば、核酸サンプルを第一のサンプルと第二のサンプルに分割する)。前記方法は、前記第二のサンプルを1つ以上の制限酵素と接触させる工程をさらに含まない場合がある。場合によっては、前記方法は、前記第二のサンプルを複数の区画に分ける工程をさらに含む。前記方法は、標的配列を含む第二のサンプルの区画の数を計数する工程をさらに含むことがある。もう1つの実施形態において、前記方法は、参照配列を含む第二のサンプルの区画の数を計数する工程をさらに含む。もう1つの実施形態において、前記方法は、第二のサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程を含む。もう1つの実施形態において、前記第二のサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、前記標的配列を有する第二のサンプルからの区画の数と前記参照配列を有する第二のサンプルからの区画の数を比較することを含む。
第一のサンプルからの標的配列のコピー数と第二のサンプル中の標的配列のコピー数を比較して、第二のサンプル中の標的配列のコピー数が過小推定されたかどうかを決定することができる。コピー数が過小推定された程度は、照合したコピーがすべて1つの染色体上にあったかどうかの指標となり得、または少なくとも1個のコピーが1つの相同染色体上にあり、少なくとも1個のコピーが他の相同染色体上にあったかどうかの指標となり得る。1つの二倍体ゲノムにつき、1により近い値は最初の場合を示すことができ、2により近い値は第二の場合を示すことができる。
増幅によってコピー数差を決定するさらなる方法は、例えば、米国特許出願公開第2010/0203538号明細書に記載されている。コピー数変動を決定するための方法は、米国特許第6,180,349号明細書およびTaylorら(2008)PLoS One 3(9):e3179に記載されている。
本明細書に記載する方法を利用するとき、様々な特徴が考慮され得る:
サンプル調製:考慮すべき核酸の特性としては、二次構造、アンプリコン長、および断片化の程度を挙げることができる。アッセイを行って核酸サンプルの断片化の程度を決定することができる。核酸サンプルの断片化の程度が高すぎる場合には、そのサンプルを分析から外すことができる。サンプル中の核酸の二次構造を排除する工程をとることもできる。例えば、サンプルの温度を調節することによって、またはサンプルに添加剤を添加することによって、核酸の二次構造を調整することができる。可能性のあるアンプリコンが、効率的に増幅させるために長すぎるかどうかを決定することができる。1つの実施形態では、バイオアナライザー(bioanalyzer)を使用して核酸(例えば、DNA)断片化を評価することができる。もう1つの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して核酸(例えば、DNA)断片化を評価することができる。
サンプル調製:考慮すべき核酸の特性としては、二次構造、アンプリコン長、および断片化の程度を挙げることができる。アッセイを行って核酸サンプルの断片化の程度を決定することができる。核酸サンプルの断片化の程度が高すぎる場合には、そのサンプルを分析から外すことができる。サンプル中の核酸の二次構造を排除する工程をとることもできる。例えば、サンプルの温度を調節することによって、またはサンプルに添加剤を添加することによって、核酸の二次構造を調整することができる。可能性のあるアンプリコンが、効率的に増幅させるために長すぎるかどうかを決定することができる。1つの実施形態では、バイオアナライザー(bioanalyzer)を使用して核酸(例えば、DNA)断片化を評価することができる。もう1つの実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して核酸(例えば、DNA)断片化を評価することができる。
ダイナミックレンジ:区画または空間的に孤立した領域の数を増加させることで、方法のダイナミックレンジを増大させることができる。テンプレート核酸をダイナミックレンジに希釈することができる。
正確度:同種サンプルを使用する場合、CNV値は整数値になると予想することができる(自己参照)。ドロップアウト増幅は、不正確な濃度測定およびしたがって不正確なCNV決定の原因となり得る。高GCアッセイには添加剤(例えば、DMSO)を加えることができる。
多重化:実験を多重化することができる。例えば、本明細書において提供する方法で2色を使用することができる:FAM:BHQおよびNFQ−MGBアッセイ;VIC:NFQ−MGB、TAMRA。HEX:BHQ。5’および3’標識を使用することができ、内部標識色素を使用することができる。場合によっては、本明細書において提供する方法で使用する色の数は2色より多い、例えば、3、4、5、6、7、8、9または10色より多い。
精度:幾つかの方法において精度を増大させることができる。場合によっては、dPCR実験における液滴の数を増加させることで、標的核酸と参照核酸間の濃度の小さな差を分析する能力を増加させることができる。ソフトウェアは、個々のウェルから複製物をプールすることにより「メタウェル(metawell)」分析を可能にすることができる。場合によっては、本明細書において提供する方法は、30%、20%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%または1%未満であるコピー数の差の検出を可能にする。
アッセイの展望:本明細書に記載する標的遺伝子アッセイを、市販のまたは特別設計の標的遺伝子アッセイと併用することができる。
本明細書に記載するコピー数変動は、核酸配列の喪失を伴うこともあり、または獲得を伴うこともある。コピー数変動は、遺伝されることもあり、またはデノボ変異によって引き起こされることもある。CNVは、1つ以上の異なる種類であることがある。例えば、Redonら(2006)Global variation in copy number in the human genome.Nature 444 pp.444−454を参照されたし。CNVは、単純デノボ欠失に起因することもあり、単純デノボ重複に起因することもあり、または欠失と重複の両方に起因することもある。CNVは、多対立遺伝子バリアント(multi−allelic variant)の組み合わせに起因することもある。CNVは、デノボ獲得に伴う複合CNVであることもある。CNVは、約0、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個の、または約0、1、2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10個より多くの隣接遺伝子を含むことがある。CNVは、約1から約10、約1から約5、約1から約4、約1から約3、約1から約2、約0から約10、約0から約5、または約0から約2個の隣接遺伝子を含むことがある。コピー数変動は、約100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、500,000、750,000、100万、500万もしくは1000万の、または約100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、500,000、750,000、100万、500万もしくは1000万より多い塩基対の獲得または喪失を伴うことがある。場合によっては、コピー数変動は、核酸配列の約1,000から約10,000,000、約10,000から約10,000,000、約100,000から約10,000,000、約1,000から約100,000、または約1,000から約10,000塩基対の獲得または喪失を伴うことがある。コピー数変動は、核酸配列の欠失、挿入または重複であることがある。場合によっては、コピー数変動は、タンデム重複であることがある。
もう1つの実施形態では、分配されたサンプルのリアルタイムPCRまたはddPCRによって生成された蛍光シグナルからCNVハプロタイプを推定することができる。試薬が限界になり得るリアルタイムPCRまたはddPCR実験の後期の前、標的配列のより高いコピー数を有する区画は、該標的配列のより低いコピー数を有する区画より高いシグナルを有することができる。1つの実施形態では、サンプル(例えば、連鎖実験で使用したサンプルのサブサンプル)を分配することができ、それらの区画(例えば、液滴)を用いてPCRを行うことができる。区画が標的および/または参照核酸配列について指数増幅されると、区画の平均蛍光強度を決定することができる。この平均強度は、標的の開始コピーの数に相当し得る。複数の標的が単一ポリヌクレオチド鎖に沿って連鎖している場合、この鎖を捕捉する区画(例えば、液滴)における強度は、標的の単一コピーしか有さない鎖を捕捉する区画(例えば、液滴)のものより高いだろう。より高い平均強度(amplitude)を有する陽性液滴の過剰な存在は、複数のCNVコピーを有するハプロタイプの存在を示唆し得る。逆に、低い平均強度しか有さない陽性液滴の存在は、単一CNVコピーを有するハプロタイプしかそのサンプル中に存在しないことを示唆し得る。もう1つの実施形態では、CNVを推定するために用いるサイクル数を区画のサイズおよび区画内の試薬の量に基づいて最適化することができる。例えば、少ない試薬量を有する小さい区画のほうが、多い試薬量を有すると予想される大きい区画より少ない増幅サイクルですむだろう。
前記方法は、ポリヌクレオチド上の互いに近くにある、例えば約10、9、8、7、6、5、4、5、2、1、0.7 0.5、0.3、0.2、0.1、0.05もしくは0.01メガベース以上離れていない、またはポリヌクレオチド上の互いに非常に近くにある、例えば、約10、9、8、7、6、5、4、3、2もしくは1キロベース以上離れていない標的コピーでさえ分析できるので、有用であり得る。場合によっては、前記方法は、ポリヌクレオチド上の互いに非常に近くにある、例えば、約1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900または950塩基対(bp)以内離れている標的コピーの分析に有用である。場合によっては、前記方法は、ゼロ(0)個の塩基対によって隔てられている標的コピーの分析に有用である。場合によっては、前記方法を同一の、ほぼ同一の、および完全に異なる標的に適用することができる。
1つ以上の標的配列のコピー数を推定するための方法のさらなる実施形態を本明細書に記載する。
標的配列の連鎖の決定
本明細書に記載する方法は、2つ以上の標的配列がポリヌクレオチド上で連鎖しているかどうかを示すことができる(例えば、これらの方法を用いて、標的配列の連鎖を決定することができる)。1つの実施形態では、標的配列コピーを(例えば、1つ以上の制限酵素を用いて)物理的に分離して、デジタル読み出しのために該コピーを独立して区画に分配することができるようにする工程、および未消化のDNAの読み出しを消化されたDNAからの読み出しと共に用いて、標的コピーがどのように連鎖しているかを推定する工程を含む方法を提供する。例えば、本明細書に記載する方法を用いて、標的配列が同じ染色体上に存在するのか、または異なる染色体上に存在するのかを決定することができる(例えば図2を参照されたし)。図2は、母性染色体が標的配列の2個のコピーを含むが、対応する父性染色体はコピーを含まない核(左)を図示するものであり、右の核の場合は、母性染色体および対応する父性染色体各々が標的の1個のコピーを含む。
本明細書に記載する方法は、2つ以上の標的配列がポリヌクレオチド上で連鎖しているかどうかを示すことができる(例えば、これらの方法を用いて、標的配列の連鎖を決定することができる)。1つの実施形態では、標的配列コピーを(例えば、1つ以上の制限酵素を用いて)物理的に分離して、デジタル読み出しのために該コピーを独立して区画に分配することができるようにする工程、および未消化のDNAの読み出しを消化されたDNAからの読み出しと共に用いて、標的コピーがどのように連鎖しているかを推定する工程を含む方法を提供する。例えば、本明細書に記載する方法を用いて、標的配列が同じ染色体上に存在するのか、または異なる染色体上に存在するのかを決定することができる(例えば図2を参照されたし)。図2は、母性染色体が標的配列の2個のコピーを含むが、対応する父性染色体はコピーを含まない核(左)を図示するものであり、右の核の場合は、母性染色体および対応する父性染色体各々が標的の1個のコピーを含む。
図3aは、方法の実施形態のワークフローを工程のいずれの順序にも縛られることなく図示する。1つの態様では、a)複数のポリヌクレオチドを含むサンプルを少なくとも2つのサブサンプルを分ける工程(322);b)第一のサブサンプル中の物理的に連鎖している標的配列を物理的に分離する工程(324);c)前記第一のサブサンプルを第一セットの複数の区画に分ける工程(326);d)前記第一のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程(328);e)第二のサブサンプルを第二セットの複数の区画に分ける工程(330);f)第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程(332);g)第一のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数と第二のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数を比較して、サンプル中の標的配列のハプロタイプを決定する工程(334)を含む方法(320)を提供する。
1つの実施形態において、前記第一のサブサンプル中の物理的に連鎖している標的配列を物理的に分離する工程は、該第一のサブサンプルを1つ以上の制限酵素と接触させることを含む。もう1つの実施形態において、前記ポリヌクレオチドを含むサンプルを1つ以上の制限酵素と接触させることは、少なくとも2つの標的核酸配列間の核酸配列を消化することを含む。場合によっては、物理的に連鎖している標的核酸を、核酸サンプルと1つ以上の制限酵素を接触させることにより分離することができる。場合によっては、物理的に連鎖している標的核酸を剪断により分離することができる。場合によっては、物理的に連鎖している標的核酸を音波処理により分離することができる。
もう1つの実施形態において、前記第一および第二のサブサンプルの複数の区画の各々は、約0、1、2または数個の標的ポリヌクレオチドを含む。各区画は、1区画(例えば、液滴)につき平均で標的核酸の5、4、3、2、または1個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175または200の区画(例えば、液滴)に含まれる標的核酸のコピー数が0である。
もう1つの実施形態では、標的配列を前記区画内で増幅させる。
もう1つの実施形態において、前記第一のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、標的配列を含む第一のサブサンプルの区画の数を計数することを含む。もう1つの実施形態において、前記第一のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、参照核酸配列を含む第一のサブサンプルの区画の数を計数することを含む。もう1つの実施形態において、前記第一のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、標的配列を含む第一のサブサンプルの区画の数を、該第一のサブサンプル中の参照核酸配列を含む区画の数と比較することを含む。
もう1つの実施形態において、前記方法は、前記第二のサブサンプルを1つ以上の制限酵素と接触させる工程をさらに含まない。もう1つの実施形態において、前記第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、標的配列を含む第二のサブサンプルの区画の数を計数することを含む。もう1つの実施形態において、前記第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、参照配列を含む第二のサブサンプルの区画の数を計数することを含む。もう1つの実施形態において、前記第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、前記標的配列を有する第二のサブサンプルからの区画の数を、前記参照配列を有する第二のサブサンプルからの区画の数と比較することを含む。もう1つの実施形態において、前記第一および第二のサブサンプルについての参照配列は、同じ配列または異なる配列である。
もう1つの実施形態において、前記標的配列のハプロタイプを決定する工程は、前記第一のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数を、前記第二のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数と比較することを含む。もう1つの実施形態において、前記ハプロタイプは、単一ポリヌクレオチド上に標的配列の2個のコピーを含み、その相同ポリヌクレオチド上にコピーを含まない。もう1つの実施形態において、前記ハプロタイプ決定工程は、第一のポリヌクレオチド上に標的配列の1個のコピーを含み、第二の(ことによると相同)ポリヌクレオチド上に標的配列の第二のコピーを含む。
多くの場合、第一のサブサンプル中のコピー数と第二のサブサンプル中のコピー数の差が大きいほど、染色体の一方がその標的のコピーを保有しない可能性が高い。
図3bは、方法のもう1つの実施形態のワークフローを工程のいずれの順序にも縛られることなく図示する。1つの態様では、a)複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのサンプルを得て(338)少なくとも2つのサブサンプルにする工程(340);b)第一のサブサンプル中の標的配列をショートサイクルPCRで事前増幅させる工程(342);c)第一のサブサンプルを第一セットの複数の区画に分ける工程(344);d)第一のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程(346);e)事前増幅されていない第二のサブサンプル(348)を第二セットの複数の区画に入れる工程(350);f)第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程(352);g)第一のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数を第二のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数と比較して、サンプル中の標的配列の連鎖を決定する工程(354)を含む方法(336)を提供する。
場合によっては、標的を分離するために用いる事前増幅は、短い事前増幅工程を行って標的核酸の別の非連鎖アンプリコンを生成することを必然的に伴う特異的標的増幅(Specific Target Amplification:STA)(Qinら(2008)Nucleic Acids Research 36 e16)である。
1つの実施形態において、前記第一のサブサンプル中の標的配列を事前増幅させる工程は、DNAポリメラーゼ、ヌクレオチド、および標的配列に特異的なプライマーを含む反応混合物と第一のサブサンプルを接触させること、およびその標的配列を限定数のサイクルにわたり増幅させることを含む。必要に応じて、前記方法は、参照配列のためのプライマーを使用することおよび、必要に応じて、その参照配列を限定数のサイクルにわたり増幅させることも含む。一部の実施形態において、前記サイクル数の数は、4〜25サイクルにわたり得る。場合によっては、前記サイクル数は、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5または4サイクル未満である。前記サイクル数は、液滴サイズ、および利用可能な試薬の量に依存して様々であり得る。例えば、より小さいサイズのものである区画(例えば、液滴)には少数のサイクルしか必要としない。
事前増幅された第一のサブサンプルを、各区画が平均で1個未満の標的ポリヌクレオチドを含む複数の区画に分配することができる。各区画は、1区画(例えば、液滴)につき平均で標的核酸の5、4、3、2、または1個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175または200の区画(例えば、液滴)に含まれる標的核酸のコピー数が0である。
もう1つの実施形態において、前記第一のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、参照核酸配列を含む第一のサブサンプルの区画の数を計数することを含む。もう1つの実施形態において、前記第一のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、標的配列を含む第一のサブサンプルの区画の数を、該第一のサブサンプル中の参照核酸配列を含む区画の数と比較することを含む。
もう1つの実施形態において、前記方法は、第二のものを事前増幅工程に供する工程をさらに含まない。もう1つの実施形態では、前記第二のサブサンプルを、各区画が平均で約0、1、2または数個の標的ポリヌクレオチドを含有する複数の区画に分配する。各区画は、1区画(例えば、液滴)につき平均で標的核酸の5、4、3、2、または1個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175または200の区画(例えば、液滴)に含まれる標的核酸のコピー数が0である。もう1つの実施形態において、前記第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、標的配列を含む第二のサブサンプルの区画の数を計数することを含む。もう1つの実施形態において、前記第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、参照配列を含む第二のサブサンプルの区画の数を計数することを含む。もう1つの実施形態において、前記第二のサブサンプル中の標的配列のコピー数を推定する工程は、前記標的配列を有する第二のサブサンプルからの区画の数と前記参照配列を有する第二のサブサンプルからの区画の数を比較することを含む。もう1つの実施形態において、前記第一および第二のサブサンプルについての参照配列は、同じ配列または異なる配列である。
もう1つの実施形態において、前記標的配列のハプロタイプを決定する工程は、前記第一のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数を前記第二のサブサンプル中の標的配列の推定コピー数と比較することを含む。もう1つの実施形態において、前記ハプロタイプは、単一ポリヌクレオチド上に標的配列の2個のコピーを含み、その相同ポリヌクレオチド上にコピーを含まない。もう1つの実施形態において、前記ハプロタイプは、第一のポリヌクレオチド上に標的配列の1個のコピーを含み、第二の(ことによると相同)ポリヌクレオチド上に標的配列の第二のコピーを含む。
第一のサブサンプル中のコピー数と第二のサブサンプル中のコピー数の差が大きいほど、染色体の一方がその標的のコピーを保有しない可能性が高い。
さらにもう1つの態様において、本開示は、同じポリヌクレオチド上に存在する場合の複数の標的核酸を同定する方法であって、a.第一および第二の標的核酸を含む複数のポリヌクレオチドを含むサンプルを少なくとも2つのサブサンプルに分離する工程;b.前記第一の標的核酸と第二の標的核酸を、それらが同じポリヌクレオチド上に存在する場合に物理的に分離することが可能な薬剤と第一のサブサンプルを接触させる工程;c.工程bの後、前記第一のサブサンプルを第一セットの区画に分ける工程;d.前記第一セットの区画の中の前記標的核酸を含む区画の数を決定する工程;e.第二のサブサンプルを第二セットの区画に分ける工程;f.前記第二セットの区画の中の標的核酸を含む区画の数を決定する工程;ならびにg.工程dで得た値と工程fで得た値を比較して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、同じポリヌクレオチド内に存在するかどうかを決定する工程を含む方法を提供する。
前記サンプルは、1対の標的が同じ染色体上にある場合、それらが溶液中でもほぼ連鎖していることができるような十分に高い分子量のものであり得る。サンプル中の核酸(例えば、DNA)が完全に断片化している場合、読み出しは、標的の0、1または2コピー(整数)であり得る。しかし、核酸(例えば、DNA)は部分的に分解されることがあるので、コピー数は非整数値にわたることがあり、2より大きい数にわたることもある。別の工程をとって、例えばゲル、バイオアナライザー、サイズ排除クロマトグラフィーまたはデジタルPCRコロケーション法(マイルポストアッセイ(milepost assay))の使用により、サンプルの核酸断片化を評価することができる。核酸サンプルが過剰に断片化していると判明した場合、これは、連鎖についての情報を収集することができる尤度を減少させる。
このアプローチを用いて、より少ないコピー数状態、例えば2、3、4、を決定することができる。
もう1つの実施形態では、同じ標的配列を検出するために2つの異なる標識(VICおよびFAM)を有するプローブを使用する、標的核酸配列の連鎖決定方法を提供する。例えば、核酸配列を複数の空間的に孤立した区画に分けることができ、それらの区画内で標的核酸を増幅させることができ、2つの異なるプローブを使用して標的配列を検出することができる。核酸サンプルを、平均で約0、1、2または数個の標的ポリヌクレオチドが各区画にあるように分配することができる。各区画は、1区画(例えば、液滴)につき平均で標的核酸の5、4、3、2、または1個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175または200の区画(例えば、液滴)に含まれる標的核酸のコピー数が0である。
区画が、ポリヌクレオチド上に連鎖している2つの標的を含む場合、該区画は、VICのみについてのシグナル(VIC/VIC)、FAMのみについてのシグナル(FAM/FAM)、またはVICおよびFAMについてシグナルを有することがある。FAMおよびVIC標的のランダム分散から予想されるものと比較してある区画におけるVICおよびFAMシグナルを有する区画の過剰存在量は、そのサンプルが、ポリヌクレオチド上に連鎖している少なくとも2つの標的を有するポリヌクレオチドを含有することを示し得る。VICおよびFAMシグナル両方を有する区画の過剰存在量がないことは、サンプル中の2つの標的核酸配列が連鎖していないことを示し得る。
共局在
サンプルの分配、および区画内の複数の標的を分析する能力は、そのサンプル中の標的が空間的にクラスター化している場合、検出を可能にすることができる。これは、標的の特定の組み合わせを有する区画の数が、標的が区画内にランダムに分布している場合に予想されるものと比較して統計的に過剰であるかどうかを評価することによって行うことができる。かかる区画の過剰存在量の程度を用いて、標的の組み合わせの濃度を推定することができる。
サンプルの分配、および区画内の複数の標的を分析する能力は、そのサンプル中の標的が空間的にクラスター化している場合、検出を可能にすることができる。これは、標的の特定の組み合わせを有する区画の数が、標的が区画内にランダムに分布している場合に予想されるものと比較して統計的に過剰であるかどうかを評価することによって行うことができる。かかる区画の過剰存在量の程度を用いて、標的の組み合わせの濃度を推定することができる。
例えば、デジタルPCR(例えば、ddPCR)を用いて次の2つの標的:AおよびBを測定することができる。例えば、4タイプの液滴があるだろう:両方の標的について陰性の液滴、Aについて陽性の液滴、Bについて陽性の液滴、および両方について陽性の液滴。ランダム分布のもとでは、二重陽性液滴の数は、(全液滴数)*(少なくともBを有する液滴の割合)*(少なくともAを有する液滴の割合)に近いはずである。二重陽性液滴の数が、期待値を有意に超える場合、サンプル中の2つの標的が互いに近接していると推断することができる。この結果は、標的AおよびBが、例えば、同じポリヌクレオチド上にあることで、同じタンパク質/核酸複合体の一部であることで、同じエキソソームの一部であることで、または同じ細胞の一部であることで、物理的に連鎖していることを意味し得る。
区画内の特定の標的の存在を、その標的に特異的なフルオロフォアをプローブベースTaqManアッセイスキームの一部として使用することにより、評価することができる。例えば、2つの標的AおよびBを測定するとき、AのためにFAMを使用し、BのためにVICを使用することができる。一部の実施形態では、エンドポイント蛍光を用いて同じフルオロフォアまたはインターカレート色素で異なる標的を評価して、Aを含有する区画と、Bを含有するものと、AおよびBを含有するものとを区別することができる。
選択的スプライシング
選択的スプライシングは、真核生物生物学の周知の特徴である。この現象は、細胞タイプ、細胞状態または外部シグナルに多くの場合依存して異なる構成でのエキソンを利用することにより、異なる転写物が同じゲノム領域から構築されると発生する。例えば、ある特定の遺伝子は、2つのエキソン(エキソンAおよびB)および3つの可能性のある転写物(Aのみを含有する転写物1、Bのみを含有する転写物2、AおよびBを含有する転写物3)を有し得る。どの転写物が実際に発現されるのか、およびそれらのレベルを特定することができることは、基礎生物学、疾患、診断および療法についての本発明者らの理解のために多くの含意を有し得る。
選択的スプライシングは、真核生物生物学の周知の特徴である。この現象は、細胞タイプ、細胞状態または外部シグナルに多くの場合依存して異なる構成でのエキソンを利用することにより、異なる転写物が同じゲノム領域から構築されると発生する。例えば、ある特定の遺伝子は、2つのエキソン(エキソンAおよびB)および3つの可能性のある転写物(Aのみを含有する転写物1、Bのみを含有する転写物2、AおよびBを含有する転写物3)を有し得る。どの転写物が実際に発現されるのか、およびそれらのレベルを特定することができることは、基礎生物学、疾患、診断および療法についての本発明者らの理解のために多くの含意を有し得る。
関心対象の2つ以上のエキソンを有するRNA分子の濃度を測定することにより、共局在を用いて選択的スプライシングを検出し、定量することができる。例えば、1つのアッセイは1つのエキソンが標的にすることができ、その一方でもう1つのアッセイは、もう1つのエキソンを標的にすることができる。2つのアッセイの統計的に有意な共局在は、両方のエキソンを含有するRNA分子の存在を示唆し得る。このようにして、可能性のある転写物分子上のさらなるエキソンおよび位置を標的にすることおよび評価することができる。
再配列
もう1つの実施形態では、ポリヌクレオチド上で通常は互いにはるかに離れている2つのアッセイ(アンプリコン)(例えば、染色体上の数百万のbpによって隔てられている2つの遺伝子)を構築することができる。一方のアッセイは、1つのチャネル(例えば、FAM)に基づき、他方のアッセイは、もう1つのチャネル(例えば、VIC)に基づく。デジタル増幅法、例えばdPCRまたはddPCR、では、通常、同じ区画(例えば、液滴)内での共局在は、ベースライン統計的期待値より上で観察されないはずである。FAMとVICの共局在が(例えば、本明細書に記載する連鎖分析を考量して)発生したら、それは、2つの遺伝子座がゲノム上で互いの近傍にあった目安であり得る。この結果は、遺伝子座が通常ある場所に依存して逆位を示すこともあり、または転座を示すこともある。前記アッセイは、それらのエンドポイント蛍光が十分異質であるならば同じチャネルで多重化することもできる。複数の逆位/転座事象を捕えるために、または所与の転座が異なる切断点に伴って存在し得る事実を説明するために、2つより多くのアッセイを多重化してもよい。
もう1つの実施形態では、ポリヌクレオチド上で通常は互いにはるかに離れている2つのアッセイ(アンプリコン)(例えば、染色体上の数百万のbpによって隔てられている2つの遺伝子)を構築することができる。一方のアッセイは、1つのチャネル(例えば、FAM)に基づき、他方のアッセイは、もう1つのチャネル(例えば、VIC)に基づく。デジタル増幅法、例えばdPCRまたはddPCR、では、通常、同じ区画(例えば、液滴)内での共局在は、ベースライン統計的期待値より上で観察されないはずである。FAMとVICの共局在が(例えば、本明細書に記載する連鎖分析を考量して)発生したら、それは、2つの遺伝子座がゲノム上で互いの近傍にあった目安であり得る。この結果は、遺伝子座が通常ある場所に依存して逆位を示すこともあり、または転座を示すこともある。前記アッセイは、それらのエンドポイント蛍光が十分異質であるならば同じチャネルで多重化することもできる。複数の逆位/転座事象を捕えるために、または所与の転座が異なる切断点に伴って存在し得る事実を説明するために、2つより多くのアッセイを多重化してもよい。
がんおよび胎児における欠陥をはじめとする様々な状態の診断および予後判定に再配列の検出を用いることができる。再配列の検出を用いて、被験体のための1つ以上の治療的処置を選択することができる。例えば、転座t(9;22)(q34.1;q11.2)の検出は、慢性骨髄性白血病(CML)と関連づけられる、BCR−ABL融合タンパク質の生成につながり得る。BCR−ABLを発現するCML患者は、イマチニブ(imatinib)(Gleevec)で処置することができる。
本明細書に記載する方法で検出することができる再配列としては、例えば、逆位、転座、重複、または欠失が挙げられる(例えば、図50を参照のこと)。
デジタル実験によって生成された連鎖(ハプロタイプ)情報の確認
もう1つの実施形態において、サンプルのデジタル分析および制限酵素消化物を用いて決定された連鎖情報を、1以上の他のアッセイによって確認することができる。1つの実施形態では、本明細書に記載する分配サンプルのリアルタイムPCRまたはddPCR実験中のシグナル生成を使用して、連鎖情報を確認することができる。1つの実施形態では、サンプル(例えば、連鎖実験において使用したサンプルのサブサンプル)を分配することができ、それらの区画(例えば、液滴)を用いてPCRを行うことができる。区画が標的および/または参照核酸配列について指数増幅されると、区画の平均蛍光強度を決定することができる。標的核酸配列の複数(例えば、2個)の連鎖コピーを伴うポリヌクレオチドを有する区画は、標的核酸配列の1個だけのコピーを有する液滴より高い蛍光強度を有することができる。
もう1つの実施形態において、サンプルのデジタル分析および制限酵素消化物を用いて決定された連鎖情報を、1以上の他のアッセイによって確認することができる。1つの実施形態では、本明細書に記載する分配サンプルのリアルタイムPCRまたはddPCR実験中のシグナル生成を使用して、連鎖情報を確認することができる。1つの実施形態では、サンプル(例えば、連鎖実験において使用したサンプルのサブサンプル)を分配することができ、それらの区画(例えば、液滴)を用いてPCRを行うことができる。区画が標的および/または参照核酸配列について指数増幅されると、区画の平均蛍光強度を決定することができる。標的核酸配列の複数(例えば、2個)の連鎖コピーを伴うポリヌクレオチドを有する区画は、標的核酸配列の1個だけのコピーを有する液滴より高い蛍光強度を有することができる。
もう1つの実施形態では、ロングレンジPCRを用いて連鎖情報を確認することができる。例えば、PCRを用いて、同じ染色体上の標的核酸配列の2つのタンデムに配列されたコピー(シス配置)の存在を検出することができ、およびそれを用いて、別の染色体上の標的核酸配列の欠失を検出することができる。1つの実施形態では、増幅領域(標的のタンデムコピーを有すると推測される領域)外のプライマーを使用することができる。もう1つの実施形態では、DNAポリヌクレオチドを液滴に分配することができる。DNAポリヌクレオチドの液滴への分配は、次の2タイプのDNA種の検出を可能にすることができるので有益であり得る:a)標的がタンデムに配列されているDNAセグメントおよびb)標的が欠失しているDNAセグメント。同様の反応をバルクで(例えば、ポリヌクレオチドを分配せずに)行うと、標的が欠失しているDNAを表す、より小さいPCR産物が、標的配列がタンデムに配列されているDNAセグメントを表すPCR産物に競り勝つことがある。結果として、1つのPCR産物しか生成することができない。これらのPCR産物のサイズの差を、例えばゲル電気泳動またはバイオアナライザーを使用して、推定することができる。
場合によっては、標的核酸配列のコピーがタンデムに配列されているDNAは、大きすぎて(例えば、サイズが>20KB)うまくPCR増幅されないことがある。これらの場合、標的核酸配列が欠失しているDNAセグメントを表す、より小さなPCR産物しか増幅されないことが多い。標的核酸配列が長すぎてPCR産物を生成できない場合、標的核酸配列の欠失を含有する染色体を用いてPCRを行うことができる。この場合、PCRが、配列が欠失している領域を超えると産物が生成され得るが、その標的配列が存在すると、プライマー間の距離が長すぎる場合があるため、産物が生成されないことがある。
一部の実施形態では、ロングレンジPCRを用いて、連鎖を分解することができ、またはコピー数推定を決定することができる。場合によっては、ロングレンジPCRを本明細書において提供する方法と併用する。場合によっては、親または他の類縁の遺伝子型を(単独で、または本明細書において提供する方法との組み合わせで)使用して、標的個体のコピー数状態を推断することができる。
場合によっては、前記方法は、組換えDNA技術を用いて染色体領域をクローニングする工程、および前記染色体領域の個々のコピーをシークエンシングする工程を含むことがある。一部の実施形態において、前記方法は、(a)次世代シークエンシングを使用して、近接した間隔で配置されており(例えば、約2000ヌクレオチド未満、約1000ヌクレオチド未満、約500ヌクレオチド未満、約200ヌクレオチド未満、または約100ヌクレオチド未満)かつ同じシークエンシングリード内に一緒に存在する、多型に関連した情報を同定する工程および(b)本明細書において提供する方法を用いて、さらに離れている(例えば、約5、10、50、100、150、200、250、300、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2500、3000、3500、4000、4500または5000ヌクレオチドを超えて離れている)多型に関連した情報を同定する工程を含む。一部の実施形態において、前記方法は、本明細書において提供する方法を用いて、さらに離れている(例えば、約5、10、50、100、150、200、250、300、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2500、3000、3500、4000、4500または5000ヌクレオチドを超えて離れている)多型に関連した情報を同定する工程を含む。場合によっては、前記方法は、本明細書に提供する方法を被験体の親または他の近親者についての遺伝子型情報の使用と併用して、メンデルの遺伝の法則を用いてフェーズ情報を推断する工程を含む。しかし、このアプローチは、すべての多型をフェージングできない。一部の実施形態は、連鎖決定への統計的アプローチと併用される、本明細書に提供する方法を含む。
場合によっては、前記方法は、組換えDNA技術を用いて染色体領域をクローニングする工程、および前記染色体領域の個々のコピーをシークエンシングする工程を含むことがある。一部の実施形態において、前記方法は、(a)次世代シークエンシングを使用して、近接した間隔で配置されており(例えば、約2000ヌクレオチド未満、約1000ヌクレオチド未満、約500ヌクレオチド未満、約200ヌクレオチド未満、または約100ヌクレオチド未満)かつ同じシークエンシングリード内に一緒に存在する、多型に関連した情報を同定する工程および(b)本明細書において提供する方法を用いて、さらに離れている(例えば、約5、10、50、100、150、200、250、300、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2500、3000、3500、4000、4500または5000ヌクレオチドを超えて離れている)多型に関連した情報を同定する工程を含む。一部の実施形態において、前記方法は、本明細書において提供する方法を用いて、さらに離れている(例えば、約5、10、50、100、150、200、250、300、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2500、3000、3500、4000、4500または5000ヌクレオチドを超えて離れている)多型に関連した情報を同定する工程を含む。場合によっては、前記方法は、本明細書に提供する方法を被験体の親または他の近親者についての遺伝子型情報の使用と併用して、メンデルの遺伝の法則を用いてフェーズ情報を推断する工程を含む。しかし、このアプローチは、すべての多型をフェージングできない。一部の実施形態は、連鎖決定への統計的アプローチと併用される、本明細書に提供する方法を含む。
ハプロタイプ
ハプロタイプは、単一染色体上(例えば、同じ染色体コピー上)ならびに/または核酸および/もしくは遺伝物質の同じ小片上に一緒にまたは連鎖している状態で存在する2つ以上の対立遺伝子を指し得る。フェージングは、対立遺伝子が同じ染色体上に一緒に存在するか否かを決定するプロセスである。ゲノム内のどの対立遺伝子が連鎖しているか決定うすることは、どのように遺伝子が遺伝されるのかを考究するのに有用であり得る。本開示は、分配されたサンプルの増幅によるハプロタイプ分析用のシステム(方法および装置を含む)を提供する。
ハプロタイプは、単一染色体上(例えば、同じ染色体コピー上)ならびに/または核酸および/もしくは遺伝物質の同じ小片上に一緒にまたは連鎖している状態で存在する2つ以上の対立遺伝子を指し得る。フェージングは、対立遺伝子が同じ染色体上に一緒に存在するか否かを決定するプロセスである。ゲノム内のどの対立遺伝子が連鎖しているか決定うすることは、どのように遺伝子が遺伝されるのかを考究するのに有用であり得る。本開示は、分配されたサンプルの増幅によるハプロタイプ分析用のシステム(方法および装置を含む)を提供する。
図4は、ハプロタイプ分析の例示的方法(20)を行うことができる工程を列挙するフローチャートを示す。これらの工程を任意の好適な順序および組み合わせで行うことができ、ならびに本開示の任意の他の工程と一体化させることができる。一般に、染色体の二倍体以上の相補体を有する被験体から、サンプルを得ることができる(22)。そのサンプルを分配することができる(24)。サンプルを分配する工程は、そのサンプルの核酸を含む水性相を分配または分割することを含み得る。1対(以上)の多型性遺伝子座を増幅させることができる(26)。各多型性遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを収集することができる(28)。多型性遺伝子座についてのおよび同じ容積からの増幅データを相関させることができる(30)。多型性遺伝子座についてのハプロタイプを選択することができる(32)。
人などの被験体から得たサンプルを用いてハプロタイプ分析方法を行うことができる。そのサンプルの核酸を含有する水性相を複数の別個の容積、例えば液滴、に分配することができる。各容積は、平均で約1ゲノム当量未満の核酸を含有することができるので、各容積は、第一の多型性遺伝子座の対立遺伝子および連鎖している第二の多型性遺伝子座の対立遺伝子の平均で約1個未満のコピーを含有する。前記核酸における第一の多型性遺伝子座および第二の多型性遺伝子座の各々から少なくとも1つの対立遺伝子配列を増幅させることができる。各遺伝子座についての区別可能な対立遺伝子特異的増幅データを個々の容積から収集することができる。第一の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを、同じ容積からの第二の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データと相関させることができる。その対立遺伝子特異的増幅データの相関に基づいて、前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座の各々についての核酸のハプロタイプを選択することができる。一般に、前記方法は、同じ容積内での別個の遺伝子座からの対立遺伝子配列の共増幅に、該対立遺伝子配列が被験体のハプロタイプを構成する場合、依存することがあり、および逆に、それらが被験体のハプロタイプを構成しない場合、共増幅がないことがある。
ハプロタイプ分析用のシステムは、本明細書に開示する方法を行うことが可能であり得る。前記システムは、核酸を含む水性相の液滴を形成するように構成された液滴発生器を備えることができる。前記システムは、個々の液滴からの遺伝子座の各々についての対立遺伝子特異的増幅データを収集するように構成された検出器を備えることができる。前記システムは、プロセッサをさらに備えることができる。前記プロセッサを、同じ容積からの第一の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データと第二の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを相関させるように、かつ、その対立遺伝子特異的増幅データの相関に基づいて核酸のハプロタイプを選択するように構成することができる。
必要に応じて、前記サンプルをサブサンプルに分割することができる。必要に応じて、第一のサブサンプルを、多型性遺伝子座間の部位を開裂させることができる制限酵素と接触させることができ、第二のサブサンプルを必要に応じて制限酵素に曝露することができる。必要に応じて、前記第一のサブサンプルからの対立遺伝子特異的増幅データを前記第二のサブサンプルからの対立遺伝子特異的増幅データと相関させることができる。
本開示のさらなる態様を後続のセクションにて提示する:(I)定義、(II)システム概観、(III)連鎖しているSNPによって作られる可能性のある例示的ハプロタイプ、(IV)液滴内での増幅に関する例示的ハプロタイプ分析、および(V)選択実施形態。
I.定義
本開示において用いる専門用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。しかし、以下の用語は、下で説明するような追加の意味を有することがある。
本開示において用いる専門用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有する。しかし、以下の用語は、下で説明するような追加の意味を有することがある。
配列変動(sequence variation)は、集団のメンバー中または被験体および/もしくはサンプルの染色体タイプのコピー間/中で見いだされるゲノム配列の任意の相違であり得る。配列変動は、多型性と呼ばれることもある。
遺伝子座は、ゲノムの特定の領域、一般に、約1キロベース未満または約100ヌクレオチド未満の比較的短い領域であり得る。
多型性遺伝子座は、配列変動が集団内に存在するならびに/または被験体および/もしくはサンプル中に存在する遺伝子座であり得る。多型性遺伝子座は、ゲノムの同じ位置に共存する2つ以上の別個の配列によって生成され得る。前記別個の配列は、数ある中でも、1つ以上のヌクレオチド置換、欠失/挿入、および/または任意の数のヌクレオチド、一般には比較的少数のヌクレオチド、例えば約50、10もしくは5ヌクレオチド未満、の重複によって互いに異なり得る。例示的実施形態において、多型性遺伝子座は、一塩基多型(「SNP」)、すなわち集団内で様々である単一ヌクレオチド位置、によって作られる。
対立遺伝子は、多型性遺伝子座に共存する2つ以上の形態の一方であり得る。対立遺伝子は、バリアントと呼ばれることもある。対立遺伝子は、多型性遺伝子座に存在する、主要なまたは優勢な形態であることもあり、あるいは少数のまたはさらには非常に稀な形態であることもある。したがって、同じ多型性遺伝子座からの一対の対立遺伝子が集団内に任意の好適な比で、例えば約1:1、2:1、5:1、10:1、100:1、1000:1などで存在し得る。
対立遺伝子配列は、対立遺伝子を特徴づける、包含するおよび/またはオーバラップさせる一続きのヌクレオチドであり得る。対立遺伝子配列の増幅を利用して、対応する対立遺伝子がサンプル区画内の多型性遺伝子座に存在するかどうかを決定することができる。
ハプロタイプは、単一染色体上(例えば、同じ染色体コピー上)ならびに/または核酸および/もしくは遺伝物質の同じ小片上に一緒にまたは連鎖している状態で存在する2つ以上の対立遺伝子であり得る;ハプロタイプは、単一染色体上に一緒にまたは連鎖している状態で存在する2つ以上の標的核酸を指すこともある。前記標的核酸は、同じこともあり、または異なることもある。
連鎖は、別個の多型性遺伝子座に由来する対立遺伝子間またはそれらの中の接続であることもあり、および同一またはほぼ同一である標的核酸間またはそれらの中の接続でもあることもある。連鎖を示す(および/または連鎖している)多型性遺伝子座は、一般に、染色体の同じコピー上に一緒に存在するそれぞれの対立遺伝子であって、同じコピー上に互いの比較的近くに、例えば、数ある中でも、約10、1または0.1メガ塩基以内にあり得る対立遺伝子を含む。
II.ハプロタイプ分析のためのシステム概観
図4は、ハプロタイプ分析の例示的方法20において行うことができる工程を列挙するフローチャートを示す。前記工程を任意の順序でおよび組み合わせで行うことができ、ならびに本開示の任意の他の工程と一体化させることができる。
図4は、ハプロタイプ分析の例示的方法20において行うことができる工程を列挙するフローチャートを示す。前記工程を任意の順序でおよび組み合わせで行うことができ、ならびに本開示の任意の他の工程と一体化させることができる。
22に示すように、サンプルを得ることができる。前記サンプルは、被験体、一般には染色体の二倍体以上の相補体を有する被験体、から得ることができる。言い換えると、前記被験体は、典型的に、該被験体の細胞内の少なくとも2セットの染色体および少なくとも一対の各タイプの染色体を有する。例えば、ヒトの体細胞は、各々、23染色体対(2セットの染色体)および合計46の染色体になるように2コピーの第1染色体、第2染色体、第3染色体などを含有する。
24に示すように、サンプルを分配することができる。サンプルを分配する工程は、該サンプルの核酸を含む水性相を分配または分割することを含む。分配は、区画と呼ばれることもある複数の別個のおよび別々の容積に水性相を分割する。前記容積は、流体、例えば連続相(例えば、油)、によって互いに隔てられていることがある。あるいは、前記容積は、壁、例えばサンプルホルダーの壁、によって互いに隔てられていることがある。前記容積は、逐次的に形成されることもあり、または並列に形成されることもある。一部の実施形態において、前記容積は、エマルジョンの分散相を形成する液滴である。
26に示すように、1対(以上)の多型性遺伝子座を増幅させることができる。より詳細には、各々の多型性遺伝子座からの少なくとも1つの対立遺伝子配列を増幅させることができる。各対立遺伝子配列は、その遺伝子座の対応する対立遺伝子に特有のものである。一部の実施形態では、各遺伝子座から1つの対立遺伝子配列のみを増幅させることができ、または前記遺伝子座の少なくとも1つから1対の対立遺伝子配列を増幅させることができる。増幅される特定の対立遺伝子配列および別個の対立遺伝子配列の数は、水性相を分配する前に水性相に含まれている特定のプライマーセットによって決まるだろう。
28に示すように、各多型性遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを収集することができる。前記データは、個々の容積内の各々の対立遺伝子配列の区別可能な増幅(またはそれがないこと)に関連することがある。増幅される各々の対立遺伝子配列に特異的に対応するおよびハイブリダイズすることができる区別可能なプローブからデータを検出することができる。前記容積からのデータを並行して収集することができ、または逐次的に収集することができる。例示的実施形態では、増幅シグナルの光学的検出によってデータを収集することができる。例えば、光学的検出としては、各対立遺伝子配列の区別可能な増幅を表す蛍光シグナルの検出が挙げられる。
30に示すように、多型性遺伝子座についてのおよび同じ容積からの増幅データを相関させることができる。相関により、一般に、どの対立遺伝子配列が、個々の容積内に一緒存在する、およびしたがって、被験体の遺伝物質中の同じ染色体コピー上に元々互いに連鎖している状態で存在する可能性が最も高いのかが決まる。相関は、同じ容積内での別個の対立遺伝子配列の共増幅に対応する少なくとも1つの相関係数の決定を含むことがある。場合によっては、相関は、同じ遺伝子座の1対の対立遺伝子配列の各々と別の遺伝子座の対立遺伝子配列についての共増幅に対応する1対の相関係数の決定を含むことがある。相関は、相関係数の互いのおよび/もしくは閾値との比較を含むこともあり、または相関係数が負であるのか、正であるのかの決定を含むことがある。一部の実施形態では、増幅陽性シグナルと増幅陰性シグナルを区別する閾値を適用することによりバイナリ形式に変換された増幅データを用いて相関を行うことができる。その上に、または代替的に、相関は、異なるセットの対立遺伝子配列の共増幅を呈する容積の数の比較、および/または対立遺伝子配列の一方のみについての増幅を提示する数に対する1セットの対立遺伝子配列についての共増幅を呈する容積の数の比較を含むことがある。
一部の実施形態では、28および30に示す工程の一方または両方を、同じ容積内の両方の遺伝子座からの対立遺伝子配列の共増幅の少なくとも1つの測定値を決定する工程に置き換えることができる。共増幅の任意の好適な測定値(単数または複数)を使用することができ、例えば、同じ容積からの多型性遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データの相関によって得た少なくとも1つの相関係数を使用することができる。他の例では、前記共増幅の測定値は、各遺伝子座からの対立遺伝子配列についての少なくとも1つの共増幅数または頻度を表す少なくとも1つの値であり得る。増幅データを相関させるおよび共増幅の測定値を決定するさらなる態様は、本開示の他の箇所、例えばセクションIVに記載する。
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを含有するサンプルを2つ以上のサブサンプルに分割することができる。2つの多型性遺伝子座間の部位で開裂する制限酵素に第一のサブサンプルを曝露することができる。その後、その第一のサブサンプルを複数の区画に分配することができる。その後、本明細書に記載するように、各多型性遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを収集することができる。2つの多型性遺伝子座間の部位で開裂する制限酵素に曝露されていない第二のサブサンプルを複数の区画に分配することができる。その後、各多型性遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅を収集することができる。前記第一のサブサンプルからの増幅データと第二のサブサンプルからの増幅データを相関させて、それらの多型性遺伝子座についてのハプロタイプを決定することができる。
32に示すように、多型性遺伝子座についてのハプロタイプを選択することができる。選択は、増幅データの相関に基づくことがあり、および/または共増幅の少なくとも1つの測定値に基づくことがある。調査している多型性遺伝子座についての1セットの可能性のあるハプロタイプの中からハプロタイプを選択することができる。選択されるハプロタイプは、一般に、被験体の同じ染色体上の互いに連鎖している可能性が高い少なくとも1対の特定の対立遺伝子の呼称を含む。
図5は、図4の方法20を行うための例示的システム40の選択態様の略図を示す。このシステムは、液滴発生器(DG)42、サーモサイクラ(TC)44、検出器(DET)46およびプロセッサ(PROC)48を備えることができる。矢印50〜54は、液滴の移動(50および52)およびデータの移動(54)をそれぞれ示すためにシステム要素間に延びている。
液滴発生器42は、核酸を含む水性相の液滴を形成することができる。これらの液滴を逐次的に形成することができ、または並行して形成することができる。
サーモサイクラ44は、対立遺伝子配列の増幅、例えばPCR増幅、を駆動するために複数の加熱および冷却サイクルに液滴を曝露することができる。このサーモサイクラは、数ある中でも、すべての液滴を並行して増幅させる回分式サーモサイクラであることがあり、または液滴を逐次的に増幅させるフロー式サーモサイクラであることがある。
検出器46は、増幅データ、例えば液滴からの対立遺伝子特異的増幅データ、を収集する。この検出器は、例えば、蛍光検出器であることがあり、液滴を逐次的にまたは並行して検出することができる。
プロセッサ48は、コントローラと呼ばれることもあり、検出器46と連通していることがあり、ならびにプロセッサ48を、検出器からの増幅データをプロセッシングするようにプログラムすることができる。前記プロセッサは、デジタルプロセッサであることがあり、前記プロセッサを、検出器からの生データをプロセッシングするように、例えば、バックグラウンドを減算するように、および/または液滴サイズに基づいて液滴データを正規化するようにプログラムすることができる。同様に、または代替的に、前記プロセッサを、閾値を適用してデータをバイナリ形式に変換するように、増幅データの相関を行うように、共増幅の1つ以上の測定値を算出および/もしくは比較するように、前記相関および/もしくは測定値に基づいてハプロタイプを選択するように、またはこれらの任意の組み合わせのためにプログラムすることができる。
液滴発生器、サーモサイクラ、検出器およびコントローラのさらなる態様は、参考として本明細書に援用されている、2010年7月8日に発行された米国特許出願公開第2010/0173394号A1明細書に記載されている。
III.連鎖しているSNPによって作られる可能性のある例示的ハプロタイプ
図6は、二倍体被験体60の遺伝物質が2つの異なる遺伝子座の各々に2つの異なるヌクレオチドを有する、連鎖しているSNPによって作られるハプロタイプ決定状況を概略的に図示する。ハプロタイプ決定の目的は、各染色体コピー上で第一の遺伝子座のどのヌクレオチドが第二の遺伝子座のどのヌクレオチドと組み合わせられているのかを決定することである。
図6は、二倍体被験体60の遺伝物質が2つの異なる遺伝子座の各々に2つの異なるヌクレオチドを有する、連鎖しているSNPによって作られるハプロタイプ決定状況を概略的に図示する。ハプロタイプ決定の目的は、各染色体コピー上で第一の遺伝子座のどのヌクレオチドが第二の遺伝子座のどのヌクレオチドと組み合わせられているのかを決定することである。
被験体60は、1対の一塩基多型66、68によって作られる2つの代替的ハプロタイプ構成62、64のいずれかを有し得る。各構成は、2つのハプロタイプを表す:構成62は、ハプロタイプ(G、C)および(A、T)を有し、構成64は、ハプロタイプ(G、T)および(A、C)を有する。被験体の細胞70は、同じタイプの1対の染色体コピー72、74を含む。(前記細胞内に存在し得る他のタイプの染色体を示していない)。染色体コピー72、74は、配列の点で互いにほぼ同一であるが、これらのコピーは、2つの染色体コピーが配列の点で異なる配列変動の多くの遺伝子座、例えば多型性遺伝子座76、78、も概して有する。遺伝子座76、78は、ゲノム領域または標的領域80に含有され、これを細胞70の核内に点線の囲み枠によって概要を示し、そして遺伝子座76、78についての遺伝子型82を表す混成配列として前記細胞の近傍に拡大して示す。(表現を単純にするために、各染色体コピーの1本の鎖のみと標的領域を図6(および図7)に示す)。
遺伝子型82を任意の適する遺伝子型決定技術によって、ハプロタイプ分析前に、またはハプロタイプ分析の一部として、決定することができる。遺伝子型82は、遺伝子座76の単一の多型ヌクレオチドが、染色体コピー72および74上の「G」および「A」であり(またはその逆であり)、遺伝子座78については「C」および「T」であることを示す。しかし、前記遺伝子型は、前記2つの遺伝子座の個々のヌクレオチドが染色体コピー72、74上でどのように組み合わせられているかを示さない。したがって、前記遺伝子型は、可能性のある代替ハプロタイプ構成62、64によって生産されることがある。本明細書に開示されるハプロタイプ分析は、可能性のあるどのハプロタイプが被験体の遺伝物質中に存在するかの決定を可能にする。
IV.液滴内での増幅を伴う例示的ハプロタイプ分析
図7は、図4の方法の例示的バージョン88の実施を概略的に図示する。ここでは、図6の被験体からの遺伝物質を分析して、前のセクションにおいて説明した可能性のある代替的ハプロタイプ構成を区別する。
図7は、図4の方法の例示的バージョン88の実施を概略的に図示する。ここでは、図6の被験体からの遺伝物質を分析して、前のセクションにおいて説明した可能性のある代替的ハプロタイプ構成を区別する。
サンプル90を得、それを92に示す。前記サンプルを、被験体の核酸96を含む水性相94内に配置する。この図には、単純化のために、ゲノム領域80を含有する断片98しか描かれていない。断片98は、遺伝子座76、78の両方から対立遺伝子配列104〜110を含むことができないのがほんの少数(例えば、不完全断片100、102)だけであるのに十分な長さである(図6も参照されたし)。水性相を対立遺伝子配列104〜110のPCR増幅用に構成することができる。
液滴112を形成し、それを114に示す。前記液滴はエマルジョン116の一部であり得、このエマルジョン116は、液滴を互いに隔てる連続相118を含む。前記液滴は、単分散性、すなわち実質的に同じサイズのもの、であり得る。好適であり得る単分散の例示的な程度は、参考として本明細書に援用されている、2010年7月8日に発行された米国特許出願公開第2010/0173394号A1明細書に記載されている。
断片98は、それらが形成されるときに液滴内にランダムに分布し得る。分配される水性相中での断片98の妥当な希釈時、および液滴サイズの妥当な選択で、標的領域80の平均約1個未満のコピーまたは分子が各液滴に含有される。したがって、幾つかの液滴、例えば、120に示す空の液滴は、標的のコピーを含有せず、多くは、標的領域の1個だけのコピーを含有し、幾つかは、標的の2個以上のコピーを含有し(例えば、122に示す液滴)、および幾つかは、標的領域の対立遺伝子配列の一方のみを含有する(例えば、124に示す液滴)。
対立遺伝子配列を増幅させることができ、それを126に示す。ここでは、2つの対立遺伝子配列、104および108、を遺伝子座76から増幅し、対立遺伝子配列110だけを遺伝子座78から増幅させる(図6も参照されたし)。各対立遺伝子配列の増幅コピーを104’、108’および110’に示す。他の実施形態では、数あるなかでも、1つだけの対立遺伝子配列を各遺伝子座から増幅させることができ、または少なくとも2つの対立遺伝子配列を各遺伝子座から増幅させることができる。(例えば、対立遺伝子配列110を増幅させるのと同じプライマーで対立遺伝子配列106を増幅させることができるが、表現を単純にするために対立遺伝子配列106の増幅をここには示さない)。
対立遺伝子特異的増幅データを液滴から収集することができ、それを130に示す。この実施例では、異なる、区別可能な蛍光色素であって、各々が異なる対立遺伝子特異的プローブ内に含まれており、各対立遺伝子配列104’、108’、110’についての増幅シグナルをもたらすものである蛍光色素を用いて、蛍光データを収集する。詳細には、色素FAM、VICおよびROXは、対立遺伝子配列104、108および110の増幅にそれぞれ関係づけられるFAMシグナル、VICシグナルおよびROXシグナル132〜136を発する。他の実施形態では、4つの対立遺伝子配列104〜110のすべての、または2つだけの対立遺伝子配列(各遺伝子座から1つ)の、対立遺伝子特異的増幅を検出することができる。
増幅データを収集し(140に示す)、および/または同じ液滴内での対立遺伝子配列の共増幅の少なくとも1つの測定値を決定する。グラフ142、144は、共増幅の測定値の相関および/または決定のアプローチを概略的に図示する。グラフ142は、個々の液滴についての(プロット内に点によって表す)FAMおよびROXシグナル強度のプロットであり、一方、グラフ144は、個々の液滴についてのVICおよびROXシグナル強度のプロットである。所与のシグナルタイプ(およびしたがって所与の対立遺伝子配列)について増幅陰性(「−」)および増幅陽性(「+」)液滴を表すシグナル値をこれらのグラフの各軸に隣接して示す。
線146、148は、各グラフの増幅データの線形関係へのベストフィットを表す。しかし、前記2つのフィットは、反対の極性の関連相関係数を有する。グラフ142中の増幅データは、同じ液滴中での対立遺伝子配列104(FAMシグナルによって報告される)と対立遺伝子配列110(ROXシグナルによって報告される)の共増幅に負の相関関係があるので、負の相関係数をもたらす。対照的に、グラフ144中の増幅データは、同じ液滴中での対立遺伝子配列108(VICシグナルによって報告される)と対立遺伝子配列110(ROXシグナルによって報告される)の共増幅に正の相関関係があるので、正の相関係数をもたらす。これらの相関係数を互いに比較して、ハプロタイプを選択することができる。例えば、どちらの相関係数のほうが大きい(例えば、より1.0に近い)か、および/またはどちらが正であるか(一方だけが正である場合)に基づいて、ハプロタイプを選択することができる。ここで、VICおよびROXシグナルの正の相関に基づいて、対立遺伝子配列104および106を含む第一のハプロタイプと、対立遺伝子配列108および110を含む第二のハプロタイプを選択することができる。一部の実施形態では、1つの相関のみに基づいて、例えば、相関係数が正であるか、負であるかに基づいて、または定義済みの値と相関係数の比較に基づいて、ハプロタイプを選択することができる。
図8は、図7の増幅データを相関させる代替アプローチを図示する棒グラフ160を示す。各タイプの液滴シグナル(FAM、VICおよびROX)を、各対立遺伝子配列についての増幅陽性液滴(「1」を割り当てる)と増幅陰性液滴(「0」を割り当てる)を区別する閾値と比較することにより、図7の増幅データをバイナリ形式に変換した。グラフ160は、単独でのまたは組み合わせでの様々な対立遺伝子配列についての増幅陽性液滴の数を提供するためのバイナリ形式のデータを表にしている。162で示す左側の2本のバーにより、対立遺伝子配列番号104(FAM)のみを含有する液滴の数と、対立遺伝子配列104(FAM)および110(ROX)両方を含有するものの数とを比較することができる。左側のデータは、対立遺伝子配列104の増幅が対立遺伝子配列110の増幅とあまり相関しないことを示す。言い換えると、対立遺伝子配列104および110は、同じ液滴内で共増幅されない傾向がある。164で示す右側の2本のバーにより、対立遺伝子配列108(VIC)のみを含有する液滴の数と、対立遺伝子配列108(VIC)および110(ROX)両方を含有するものの数とを比較することができる。右側のデータは、対立遺伝子配列108の増幅が対立遺伝子配列110の増幅とよく相関することを示す。言い換えると、対立遺伝子配列108および110は、同じ液滴内で共増幅される傾向がある。別々にまたは併せて考えて、左側の対のバーおよび右側の対のバーは、対立遺伝子配列108が対立遺伝子配列110に関連するハプロタイプを示す。
遺伝的に連鎖した遺伝子座を含むサンプルを、本明細書に示す方法、組成物またはキットによる分析前に、断片化に供することができる。例えば、機械的剪断により、該サンプルをシリンジに通すことにより、音波処理により、熱処理(例えば、90℃で30分)により、および/または(例えば、DNase、RNase、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、制限酵素での)ヌクレアーゼ処理により、遺伝的に連鎖した遺伝子座を含むサンプルを断片化することができる。遺伝的に連鎖した遺伝子座を含むサンプルを、分析前に、プロセッシングに供さないこともあり、限られたプロセッシングに供することもある。
もう1つの実施形態では、液滴デジタルPCR(ddPCR)を用いて、2つのゲノム遺伝子座、例えば、共通染色体上の2つの遺伝子、を標的にするデュプレックス反応を行うことができる。液滴は、その蛍光にしたがって4つの集団に分類され得る。例えば、FAM標識プローブを使用して一方の遺伝子座を検出し、VIC標識プローブを使用してもう一方の遺伝子座を検出する場合、その4集団は、FAM+/VIC+、FAM+/VIC−、FAM−/VIC+、およびFAM−/VIC−であり得る。これらの各々の集団に関する液滴の数を比較することにより、遺伝子座が同じ液滴に同時分離する頻度を決定することが可能である。ポアソン統計学を用いて、2つの分離された遺伝子座が偶然に同じ液滴内にある事例に対する実際に互いに連鎖している種の百分率を推定することができる。
遺伝的に連鎖した遺伝子座であって、本明細書に記載する方法、組成物およびキットを用いて検査して、それらがサンプル中で依然として連鎖しているのか、サンプル中で分離しているのかを決定することができる遺伝子座の数は、約、少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10であり得、または約2、3、4、5、6、7、8、9もしくは10より多いことがあり得る。遺伝的に連鎖した遺伝子座であって、本明細書に記載する方法、組成物およびキットを用いて検査して、それらがサンプル中で依然として連鎖しているのか、サンプル中で分離しているのかを決定することができる遺伝子座の数は、約2から約10、約2から約8、約2から約6、約2から約4、約3から約10、約3から約8、約3から約6、約4から約10、または約4から約6であり得る。
遺伝的に連鎖した遺伝子座の各々の間の塩基対の数は、約、少なくとも約10bp、25bp、50bp,75bp、100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp、10,000bp、15,000bp、20,000bp、33,000bp、50,000bp、75,000bp、100,000bp、250,000bp、500,000bp、750,000bp、1,000,000bp、1,250,000bp、1,500,000bp、2,000,000bp、5,000,000bpもしくは10,000,000bpであり得、または約10bp、25bp、50bp,75bp、100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、6000bp、7000bp、8000bp、9000bp、10,000bp、15,000bp、20,000bp、33,000bp、50,000bp、75,000bp、100,000bp、250,000bp、500,000bp、750,000bp、1,000,000bp、1,250,000bp、1,500,000bp、2,000,000bp、5,000,000bpもしくは10,000,000bp未満であり得る。遺伝的に連鎖した遺伝子座の各々の間の塩基対の数は、約10から約10,000,000bp、約100から約10,000,000bp、約1,000から約10,000,000bp、約1,000から約1,000,000bp、約1,000から約500,000bp、約1,000から約100,000bp、約3000から約100,000bp、約1000から約33,000bp、約1,000から約10,000bp、または約3,000から約33,000bpであり得る。各遺伝的に連鎖した対立遺伝子間の塩基対の数が0bpであることもある。
一部の実施形態において、ハプロタイプ決定方法は、2つの異なる遺伝子座の2つの対立遺伝子が同じ空間的に孤立した区画に共局在するかどうか検査する工程を含む。1つの実施形態では、前記2つの遺伝子座の追加の対立遺伝子を分析することができる。例えば、2つの異なる遺伝子座の2つの対立遺伝子が、デジタル実験において共局在しない場合、該2つの遺伝子座の1つ以上の他の対立遺伝子を分析して、共局在についての陽性対照を得ることができる。例えば、母性遺伝染色体が、遺伝子座1にある対立遺伝子A、および遺伝子座1から100bp離れた遺伝子座2に対立遺伝子Yを有すると仮定する。対応する父性遺伝染色体に関しては、対立遺伝子Bが遺伝子座1にあり、対立遺伝子Zが遺伝子座2にあると仮定する。これらの核酸を含む核酸サンプルを空間的に孤立した区画に分け、対立遺伝子Aおよび対立遺伝子Zについての増幅を行った場合、対立遺伝子Aと対立遺伝子Zは連鎖していないため、対立遺伝子Aおよび対立遺伝子Zについての増幅シグナルは、単一区画にめったに共局在しないかまたは決して共局在しないはずである。デジタル分析を行って、対立遺伝子Aと対立遺伝子Yが母性遺伝染色体上で連鎖していること、または対立遺伝子Bと対立遺伝子Zが父性遺伝染色体上で連鎖していることを確認することができる。
2色を用いるハプロタイプ決定
本明細書に示す実施形態は、フェージングを測定するための3色系の使用を実証するが、2色系を使用してフェージングを測定することもできる。例えば、2つのヘテロ接合性SNP(AaおよびBb)をフェージングする必要がある場合、Aを標的にするFAMアッセイおよびBを標的にするVICアッセイを設計することができる。AとB両方を含有する過剰な区画はAとBの間の連鎖の指標となり、これは、2つのハプロタイプが、A−Bおよびa−bであることを示唆する。かかる過剰の不在は、ハプロタイプの代替的組み合わせ:A−bおよびa−Bを示唆し得る。DNAはこの後述の推論を行うのに十分高分子量のものであると判断することができる。前記ハプロタイプの代替的組み合わせを確認するために、対立遺伝子の異なる組み合わせを標的にするもう1つのデュプレックスアッセイを別のウェルで実行する必要がある場合がある。例えば、Aを標的にするFAMアッセイおよびbを標的にするVICアッセイを実行することができる。Aとb両方を含有する過剰な区画はAとbの間の連鎖の指標となり、これは、2つのハプロタイプが、A−bおよびa−Bであることを示唆する。
本明細書に示す実施形態は、フェージングを測定するための3色系の使用を実証するが、2色系を使用してフェージングを測定することもできる。例えば、2つのヘテロ接合性SNP(AaおよびBb)をフェージングする必要がある場合、Aを標的にするFAMアッセイおよびBを標的にするVICアッセイを設計することができる。AとB両方を含有する過剰な区画はAとBの間の連鎖の指標となり、これは、2つのハプロタイプが、A−Bおよびa−bであることを示唆する。かかる過剰の不在は、ハプロタイプの代替的組み合わせ:A−bおよびa−Bを示唆し得る。DNAはこの後述の推論を行うのに十分高分子量のものであると判断することができる。前記ハプロタイプの代替的組み合わせを確認するために、対立遺伝子の異なる組み合わせを標的にするもう1つのデュプレックスアッセイを別のウェルで実行する必要がある場合がある。例えば、Aを標的にするFAMアッセイおよびbを標的にするVICアッセイを実行することができる。Aとb両方を含有する過剰な区画はAとbの間の連鎖の指標となり、これは、2つのハプロタイプが、A−bおよびa−Bであることを示唆する。
参照配列
コピー数の分析を伴う方法(または本明細書に記載する他の応用)において、特定の配列(例えば、標的)が、例えば所与のゲノム中で、見つかる回数をカウントすることは有用である。一部の実施形態では、標的核酸配列の濃度とあらゆるゲノム中に何らかの固定数のコピーで存在することが公知である参照核酸配列の濃度とを評価する(または比較する)ことにより、この分析を行う。前記参照には、1つの二倍体ゲノムにつき2コピーで存在するハウスキーピング遺伝子(例えば、基本的な細胞機能の維持に必要とされる遺伝子)を使用することができる。前記標的の濃度または量を前記参照の濃度または量で割ることにより、1ゲノムあたりの標的コピー数の推定値を得ることができる。1つ以上の参照を使用して標的連鎖を決定することもできる。
コピー数の分析を伴う方法(または本明細書に記載する他の応用)において、特定の配列(例えば、標的)が、例えば所与のゲノム中で、見つかる回数をカウントすることは有用である。一部の実施形態では、標的核酸配列の濃度とあらゆるゲノム中に何らかの固定数のコピーで存在することが公知である参照核酸配列の濃度とを評価する(または比較する)ことにより、この分析を行う。前記参照には、1つの二倍体ゲノムにつき2コピーで存在するハウスキーピング遺伝子(例えば、基本的な細胞機能の維持に必要とされる遺伝子)を使用することができる。前記標的の濃度または量を前記参照の濃度または量で割ることにより、1ゲノムあたりの標的コピー数の推定値を得ることができる。1つ以上の参照を使用して標的連鎖を決定することもできる。
本明細書に記載する方法において参照として使用することができるハウスキーピング遺伝子としては、転写因子、転写リプレッサー、RNAスプライシング遺伝子、翻訳因子、tRNAシンセターゼ、RNA結合タンパク質、リボソームタンパク質、RNAポリメラーゼ、タンパク質プロセッシングタンパク質、熱ショックタンパク質、ヒストン、細胞周期調節因子、アポトーシス調節因子、がん遺伝子、DNA修復/複製遺伝子、炭水化物代謝調節因子、クエン酸サイクル調節因子、脂質代謝調節因子、アミノ酸代謝調節因子、ヌクレオチド合成調節因子、NADHデヒドロゲナーゼ、シトクロムCオキシダーゼ、ATPase、ミトコンドリアタンパク質、リソソームタンパク質、プロテオソームタンパク質、リボヌクレアーゼ、オキシダーゼ/レダクターゼ、細胞骨格タンパク質、細胞接着タンパク質、チャネルまたは輸送体、受容体、キナーゼ、成長因子、組織壊死因子などをコードする遺伝子を挙げることができる。本明細書に記載する方法において使用することができるハウスキーピング遺伝子の具体例としては、例えば、HSP90、ベータ−アクチン、tRNA、rRNA、ATF4、RPP30およびRPL3が挙げられる。
標的の連鎖を決定するための、別の遺伝子座に遺伝的に連鎖している遺伝子座のうちの1つは、一般的な参照、例えばRPP30であり得る。任意の遺伝的に連鎖した遺伝子座を本明細書に記載する方法において使用することができる。
単一コピー参照核酸(例えば、遺伝子)を使用してコピー数変動を決定することができる。ダイナミックレンジを拡大するために、多コピー参照核酸(例えば、遺伝子)を使用してコピー数を決定することができる。例えば、多コピー参照遺伝子は、ゲノム内に約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000もしくは100,000個のコピー、または約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000もしくは100,000個より多くのコピーを含むことができる。複数の異なる核酸(例えば、複数の異なる遺伝子)を参照として使用することができる。
核酸断片化の確率の決定
デジタル分析を行って、核酸サンプル中の2つのマーカー間での断片化の程度を決定することができる。図9は、ワークフロー(900)を図示する。図9における工程を任意の好適な順序および組み合わせで行うことができ、本開示の任意の他の工程と一体化させることができる。ポリヌクレオチドのサンプルを得ることができる(920)。各区画が平均で約0、1、2または数個の標的ポリヌクレオチドしか含有しないように、複数の区画にサンプルを分けることができる(940)。各区画は、1区画(例えば、液滴)につき平均で標的核酸の5、4、3、2、または1個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175または200の区画(例えば、液滴)に含まれる標的核酸のコピー数が0である。
デジタル分析を行って、核酸サンプル中の2つのマーカー間での断片化の程度を決定することができる。図9は、ワークフロー(900)を図示する。図9における工程を任意の好適な順序および組み合わせで行うことができ、本開示の任意の他の工程と一体化させることができる。ポリヌクレオチドのサンプルを得ることができる(920)。各区画が平均で約0、1、2または数個の標的ポリヌクレオチドしか含有しないように、複数の区画にサンプルを分けることができる(940)。各区画は、1区画(例えば、液滴)につき平均で標的核酸の5、4、3、2、または1個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175または200の区画(例えば、液滴)に含まれる標的核酸のコピー数が0である。
前記区画をアッセイして、第一の標的配列および第二の標的配列を有する区画を計数することができ(960)、アルゴリズムを使用して、該第一の標的配列と第二の標的配列との間での断片化を予測することができる(980)。
2つの異なる遺伝子座(T1およびT2)が異なるポリヌクレオチド上にある場合、ポリヌクレオチドを有するサンプル(920)は、T1のみを有するポリヌクレオチドおよびT2のみを有するポリヌクレオチドを含有することとなる(図10Aも参照されたし)。しかし、T1およびT2が同じポリヌクレオチド上にある場合、T1およびT2を有するポリヌクレオチドを含有するサンプルは、次の3種を有する場合がある:T1を有する断片化ポリヌクレオチド、T2を有する断片化ポリヌクレオチド、およびT1とT2を有する断片化ポリヌクレオチド(図10B)。T1とT2の間の距離が長いほど、T1とT2の間での断片化の確率が高くなる。そのサンプルを分配することができる(図9:940)。デジタル分析、例えばデジタルPCRまたは液滴デジタルPCR、を行うことができ、T1、T2ならびにT2およびT2についてのシグナルを有する区画を計数することができる(960)。アルゴリズムを開発し、使用して、T1とT2の間での断片化の確率を決定することができる(980)。前記アルゴリズムは、T1とT2間の塩基または塩基対の数を、公知の場合、使用することができる。この方法を用いて、DNAサンプルの断片化の程度を決定することができる。T1およびT2についてのシグナルを含有する複数の区画があり、それが、T1およびT2が同じ区画内にあると予想される区画数より多い場合、この観察結果は、T1とT2が連鎖していることを示し得る。
連鎖情報がサンプル中に保存されるDNAが十分高分子量のものであることを保証するために核酸(例えば、DNA)サンプルで上記方法を用いることは、有利であり得る。
DNAを使用する、本明細書に記載するいずれの方法においても、アッセイを行ってサンプル中のDNAの断片化を推定することができ、そのDNAの断片化に関する情報をそれらの方法に組込むことができる。もう1つの実施形態では、サンプル中のDNAの断片化の程度に基づいてアッセイの結果を正規化することができる。
例えばゲル、バイオアナライザー、またはサイズ排除クロマトグラフィーによって、核酸断片化を測定することもできる。
メチル化負荷の測定
マイルポストアッセイを用いて、CpGアイランドのメチル化状態を決定することができる。1つの実施形態では、ddPCRによって測定することができるアンプリコンの連鎖の使用(マイルポストアッセイ)を含む方法を本明細書において提供する。アンプリコン間の距離は、10kbより長い距離にわたり得るので、CpGアイランドについて観察されるサイズの範囲を十分に網羅する。
マイルポストアッセイを用いて、CpGアイランドのメチル化状態を決定することができる。1つの実施形態では、ddPCRによって測定することができるアンプリコンの連鎖の使用(マイルポストアッセイ)を含む方法を本明細書において提供する。アンプリコン間の距離は、10kbより長い距離にわたり得るので、CpGアイランドについて観察されるサイズの範囲を十分に網羅する。
CpGアイランドは、プロモーター配列におけるものを含めて、ヒト遺伝子の5’領域において一般的である。CpGアイランドのメチル化は、X染色体不活性化および刷り込み中の遺伝子サイレンシングに一定の役割を果たすことができる。プロモーター領域CpGアイランドの異常なメチル化は、新形成の際の腫瘍サプレッサー遺伝子の転写不活性化と関連づけることができる。例えば、腫瘍抑制遺伝子p16、hMLH1およびTHBS1の異常メチル化が観察された。マイクロサテライト不安定性とプロモーター関連CpGアイランドメチル化との間には関連性がある。メチル化状態の決定は、母体血漿中の胎児DNA負荷量の決定に一定の役割を果たすことができる。CpG配列のメチル化は、がんのマーカーである。
図11は、CpGアイランドのメチル化状態を決定する方法のワークフロー(1100)を図示する。図11における工程を任意の好適な順序および組み合わせで行うことができ、本開示の任意の他の工程と一体化させることができる。ポリヌクレオチドのサンプルを得ることができる(1110)。そのポリヌクレオチドサンプルをメチル化感受性酵素で処理することができる(1120)。各区画が平均で約0、1、2または数個の標的ポリヌクレオチドしか含有しないように、複数の区画にサンプルを分配することができる(1130)。各区画は、1区画(例えば、液滴)につき平均で標的核酸の5、4、3、2、または1個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175または200の区画(例えば、液滴)に含まれる標的核酸のコピー数が0である。CpGアイランドの5’および3’末端に隣接する核酸配列を増幅させることができる(1140)。それらの区画をアッセイして、CpGアイランドに隣接する配列が同じ区画内にあるのか、異なる区画内にあるのかを決定して(1150)、メチル化状態を決定することができる(1160)。CpGがメチル化される場合、それは、メチル化感受性酵素によって開裂されず、隣接する配列(マイルポスト)は同じ区画にあることができる。CpGがメチル化されていない場合、CpGアイランドは、メチル化感受性酵素によって開裂され得、隣接配列(マイルポスト)は異なる区画にあることができる。もう1つの実施形態では、メチル化配列を開裂させることができるが、非メチル化配列を開裂させることはできないメチル化感受性酵素によって、メチル化CpGアイランドを開裂させることができる。もう1つの実施形態では、非メチル化配列によりメチル化配列を認識(例えば、結合)することができるメチル化感受性酵素によって、メチル化CpGアイランドを開裂させることができる。
もう1つの実施形態において、マイルポスト(マーカー)は、CpGアイランド内にあることがある。もう1つの実施形態において、マイルポスト(マーカー)は、単一CpG配列に隣接していることがある。もう1つの実施形態において、マイルポスト(マーカー)は、約または少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400または500個のCpGに隣接していることがある(例えば、一方のマーカーは、CpGの5’であり、他方のマーカーは、CpGの3’である)。
もう1つの実施形態では、CpGアイランドの脱メチル化を決定することができる。CpGアイランドのメチル化状態を一定の時間にわたり(例えば、異なる時点、例えば日、月、年、に取ったサンプルにおいて)測定することができる。異なる個体からのサンプル間でCpGアイランドのメチル化状態を比較することができる。
CpGは、ホスホジエステル結合によってグアニンに連結されたシトシンであることがあり、およびCpGアイランドは、かかるジヌクレオチド配列のクラスターであることがある。CpGアイランド、またはCGアイランドは、高頻度のCpG部位を含有するゲノムの領域であり得る。CpGアイランドは、約100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900または6000塩基対の長さであることがあり、約100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900または6000塩基対未満の長さであることがあり、または約100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3100、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、5100、5200、5300、5400、5500、5600、5700、5800、5900または6000塩基対より長い長さであることがある。CpGアイランドは、約100から約6000bp、約100から約5000bp、約100から約4000bp、約100から約3000bp、約100から約2000bp、約100から約1000bp、約300から約6000bp、約300から約5000bp、約300から約4000bp、約300から約3000bp、約300から約2000bp、または約300から約1000bpであることがある。1つの実施形態において、CpGアイランドは、少なくとも50%のC+G含有率および少なくとも0.6の実測CpG/期待CpG比を有する、少なくとも200bpの長さのDNAストレッチであり得る(Gardiner−Garden,M.およびFrommer M.(1987)J.Mol.Biol.196:261−282)。もう1つの実施形態において、CpGアイランドは、55%以上のG+C含有率および少なくとも0.65の実測CpG/期待CpG比を有する、500bpより長いDNAストレッチであり得る(Takai D.およびJones P.(2001)PNAS 99:3740−3745)。
メチル化シトシンを同定するための1つの方法では、亜硫酸水素塩処理を用いてシトシンをウラシルに変換するが、メチル化シトシンは保護される。その後のPCRによりウラシルをチミジンに変換し、その結果、関心対象の同じ領域についての異なる配列アウトプットを得る。あるいは、亜硫酸水素塩処理によるC−>Tの変換は、アンプリコンの融解温度を変化させることがあり、増幅後の融点曲線分析によってそれを測定することができる。しかし、この方法での感度の限界は、約1〜5%である。その上、完全変換には大規模な亜硫酸水素塩処理が必要であり、これはDNAの破壊をもたらし得る。
前記方法の1つの実施形態では、関心対象のCpGアイランドに隣接する2つのアンプリコン(例えば、FAMおよびVIC標識されたもの)を設計する。DNAサンプルを1つ以上のメチル化感受性制限酵素で消化し、消化されたサンプルと未消化のサンプルをデジタルPCR、例えばddPCR、によって分析することができる。未消化のサンプルはFAMおよびVICアンプリコンの100%連鎖を呈するはずであり、消化されたサンプルはFAMおよびVICアンプリコンの0%連鎖を呈し、メチル化状態の差を示す。このシステムの拡張精度は、2サンプル間のメチル化状態の少なくとも約1/10、1/50、1/100、1/200、1/300、1/400、1/500、1/600、1/700、1/800、1/900、1/1000、1/2000、1/3000、1/4000、1/5000、1/6000、1/7000、1/8000、1/9000、1/10,000の差を検出できる。図12は、前記方法の実施形態を図示する。
増幅される領域は、CpGアイランドの5’または3’末端の約または少なくとも約1、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450または500bp以内にあり得る。
本明細書において提供する方法、組成物およびキットで1つ以上のメチル化感受性制限酵素を使用することができる。前記1つ以上のメチル化感受性酵素としては、例えば、DpnI、Acc65I、KpnI、ApaI、Bsp120I、Bsp143I、MboI、BspOI、NheI、Cfr9I、SmaI、Csp6I、RsaI、Ecl136II、SacI、EcoRII、MvaI、HpaII、MSpJI、LpnPI、FsnEI、DpnII、McrBcまたはMspIを挙げることができる。1つの実施形態において、メチル化感受性酵素は、メチル化されない核酸を開裂させることができるが、メチル化された核酸を開裂させることはできない。前記1つ以上のメチル化感受性酵素は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25のメチル化感受性酵素であり得る。
一部の実施形態では、核酸をDamメチル化およびまたはDcmメチル化に供する。
表1は、DNAを開裂する制限酵素の能力がCpGメチル化によって遮断され得るまたは損なわれ得る制限酵素のリストを含む。
分離
標的配列の物理的分離を配列特異的または非配列特異的様式で行うことができる。標的配列を分離するための非配列特異的手段としては、シリンジ、音波処理、熱処理(例えば、90℃で30分)、および何らかのタイプのヌクレアーゼ処理(例えば、DNase、RNase、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼでの処理)の使用が挙げられる。
標的配列の物理的分離を配列特異的または非配列特異的様式で行うことができる。標的配列を分離するための非配列特異的手段としては、シリンジ、音波処理、熱処理(例えば、90℃で30分)、および何らかのタイプのヌクレアーゼ処理(例えば、DNase、RNase、エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼでの処理)の使用が挙げられる。
制限酵素
核酸配列の分離の配列特異的方法は、1つ以上の制限酵素の使用を伴うことがある。本明細書に記載する任意の方法で1つ以上の制限酵素を使用することができる。例えば、制限酵素を使用して標的コピーを分離して、数ある中でも、コピー数状態を正確に推定することができ、フェージングを評価することができ、ハプロタイプを生成することができ、または連鎖を決定することができる。標的核酸配列間の核酸(例えば、DNAまたはRNA)を制限するが、増幅または分析すべき領域を制限しないように、1つ以上の酵素を選択することができる。一部の実施形態では、制限酵素が標的配列内で、例えば、標的配列の5’末端または3’末端内で開裂するように、制限酵素を選択することができる。例えば、標的配列が、スペーサー配列なしでタンデムに配列されている場合、該標的の物理的分離は、該標的配列内の配列の切断を伴うことがある。コピー数推定、連鎖決定、ハプロタイプ決定、RNAもしくはDNA分解の検査、またはメチル化負荷、例えばCpGアイランドのメチル化負荷、の決定のためのデジタル分析(例えばddPCR)反応において消化サンプルを使用することができる。
核酸配列の分離の配列特異的方法は、1つ以上の制限酵素の使用を伴うことがある。本明細書に記載する任意の方法で1つ以上の制限酵素を使用することができる。例えば、制限酵素を使用して標的コピーを分離して、数ある中でも、コピー数状態を正確に推定することができ、フェージングを評価することができ、ハプロタイプを生成することができ、または連鎖を決定することができる。標的核酸配列間の核酸(例えば、DNAまたはRNA)を制限するが、増幅または分析すべき領域を制限しないように、1つ以上の酵素を選択することができる。一部の実施形態では、制限酵素が標的配列内で、例えば、標的配列の5’末端または3’末端内で開裂するように、制限酵素を選択することができる。例えば、標的配列が、スペーサー配列なしでタンデムに配列されている場合、該標的の物理的分離は、該標的配列内の配列の切断を伴うことがある。コピー数推定、連鎖決定、ハプロタイプ決定、RNAもしくはDNA分解の検査、またはメチル化負荷、例えばCpGアイランドのメチル化負荷、の決定のためのデジタル分析(例えばddPCR)反応において消化サンプルを使用することができる。
広範な応用、例えば、CNV決定のためのデジタルPCR(例えばddPCR)および本明細書に記載する任意の他の方法のために、制限酵素を選択することができ、非常に多数のサンプルおよびアッセイタイプにわたって最適な条件を同定および検証することができる
コンピュータソフトウェアを使用して、本明細書に記載する方法、組成物および/またはキットのための1つ以上の制限酵素を選択することができる。例えば、前記ソフトウェアは、Qtoolソフトウェアであることがある。
コンピュータソフトウェアを使用して、本明細書に記載する方法、組成物および/またはキットのための1つ以上の制限酵素を選択することができる。例えば、前記ソフトウェアは、Qtoolソフトウェアであることがある。
本明細書に記載する方法、組成物および/またはキットにおいて使用する1つ以上の制限酵素は、New England BioLabs(登録商標)Inc.(www.neb.comを参照されたし)から入手できる制限酵素をはじめとする任意の制限酵素であり得る。制限酵素は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、または高忠実度(HF)制限酵素であることがある。制限酵素は、I型、II型、III型もしくはIV型酵素またはホーミングエンドヌクレアーゼであることがある。場合によっては、高スター活性条件下で制限消化がおこる。場合によっては、低スター活性条件下で制限消化がおこる。
I型酵素は、認識部位から遠隔部位で開裂することができ;機能するためにATPとS−アデノシル−L−メチオニンの両方を必要とし得;ならびに制限活性とメチラーゼ活性の両方を有する多機能性タンパク質であり得る。I型制限エンドヌクレアーゼについての認識配列は、二部構成であるか、または分断型である(interrupted)ことがある。制限エンドヌクレアーゼのサブユニット構成は、ペナトメリック(penatmeric)複合体であることがある。I型制限エンドヌクレアーゼの共活性化因子および活性化因子としては、例えば、マグネシウム、AdoMet(S−アデノシルメチオニン;SAM SAMe、SAM−e)およびATPが挙げられる。I型制限エンドヌクレアーゼは、認識部位から遠い可変的な開裂部位で開裂することができる。I型制限エンドヌクレアーゼの例としては、例えば、EcoKI、EcoAI、EcoBI、CfrAI、StyLTII、StyLTIIIおよびStySPIを挙げることができる。
II型酵素は、認識部位内で開裂させるまたは認識部位から短い特定の距離をおいて開裂することがあり、マグネシウムを必要とし得、およびメチラーゼとは無関係に機能することができる。II型制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、パリンドローム型または分断パリンドロームであることがある。II型制限エンドヌクレアーゼのサブユニット構造は、ホモ二量体であることがある。II型制限エンドヌクレアーゼでの開裂部位の開裂は、結果として3’オーバーハング、5’オーバーハング、または平滑末端を有する断片を生じさせ得る。II型制限エンドヌクレアーゼの例としては、例えば、EcoRI、BamHI、KpnI、NotI、pstI、SmaIおよびXhoIが挙げられる。
IIb型、IIs型およびIIe型をはじめとする、II型制限酵素の幾つかのサブタイプがある。
IIb型制限エンドヌクレアーゼは、二部構成または分断型である認識配列を有することがある。IIb型制限エンドヌクレアーゼのサブユニット構造は、ヘテロ三量体であり得る。IIb型制限エンドヌクレアーゼの補因子および活性化因子としては、マグネシウムおよびAdoMet(メチル化用)を挙げることができる。IIb型制限エンドヌクレアーゼは、両方の鎖上の認識部位の両側の定義された、対称の、短い距離離れた開裂部位で開裂し、3’オーバーハングを残すことができる。IIb型制限エンドヌクレアーゼの例としては、例えば、BcgI、Gsp24I、CjeIおよびCjePIが挙げられる。
IIe型制限エンドヌクレアーゼは、パリンドローム型、不正確さのあるパリンドローム型、または非パリンドローム型である認識部位を有することができる。IIe型制限エンドヌクレアーゼのサブユニット構造は、ホモ二量体または単量体であることがある。IIe型制限エンドヌクレアーゼの補因子および活性化因子としては、マグネシウムを挙げることができ、およびエンドヌクレアーゼに対してシスまたはトランスで作用することができる第二の認識部位がアロステリック作用因子として作用し得る。IIe型制限酵素は、開裂部位を、認識配列について定義された様式でまたは短距離離隔して、開裂することができる。活性化剤DNAを使用して開裂を完了することができる。IIe型制限酵素の例としては、例えば、NaeI、NarI、BspMI、HpaII、Sa II、EcoRII、Eco57I、AtuBI、Cfr9I、SauBMKIおよびKsp632Iが挙げられる。
IIs型制限酵素は、非パリンドローム型である認識配列を有することがある。前記認識配列は、隣接していてかつ不正確ではないことがある。IIs型制限エンドヌクレアーゼのサブユニット構造は、単量体であることがある。IIs型制限酵素と共に使用することができる補因子は、マグネシウムであり得る。IIs型制限酵素は、開裂部位を、認識配列外の少なくとも1つの開裂部位について定義された様式で、開裂することができる。IIs型制限酵素の例としては、例えば、FokI、Alw26I、BbvI、BsrI、EarI、HphI、MboII、SfaNIおよびTth111Iが挙げられる。
III型酵素は、認識部位から短い距離を隔てて開裂することができ、およびATPを必要とし得る。S−アデノシル−L−メチオニンは、III型酵素との反応を刺激することができるが、必須ではない。III型酵素は、修飾メチラーゼとの複合体の一部として存在することがある。III型制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、非パリンドローム型であることがある。III型制限エンドヌクレアーゼと共に使用することができる補因子および活性化因子としては、例えば、マグネシウム、ATP(加水分解されていないもの)、および可変距離離れた逆向きの第二の非修飾部位が挙げられる。III型制限エンドヌクレアーゼの例としては、例えば、EcoP15I、EcoPI、HinfIIIおよびStyLTIが挙げられる。
IV型酵素は、メチル化DNAを標的にすることができる。IV型制限酵素の例としては、例えば、大腸菌(E.coli)のMcrBCおよびMrr系が挙げられる。
前記制限酵素は、ホーミングエンドヌクレアーゼであり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼは、二本鎖DNaseであり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼは、大きい非対称認識部位(例えば、12〜40塩基対)を有することがある。ホーミングエンドヌクレアーゼのコーディング配列は、イントロンまたはインテインに埋め込まれていることがある。インテインは、それ自体を切除し、残りの部分(エクステイン)をペプチド結合で再接合する「タンパク質イントロン」であり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼは、その認識配列内の一部の配列縮重を許容することができる。ホーミングエンドヌクレアーゼの特異性は、10〜12塩基対であり得る。ホーミングエンドヌクレアーゼの例としては、I−CeuI、I−SceI、I−Ppol、PI−SceI、PI−PspIおよびPI−SceIが挙げられる。
本明細書における方法、組成物および/またはキットにおいて使用する制限酵素は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体などであることがある。
本明細書に記載する方法、組成物および/またはキットにおいて使用する1つ以上の制限酵素は、ハイブリッドまたはキメラタンパク質の成分であることがある。例えば、酵素活性(例えば、エンドヌクレアーゼ活性)を含む制限酵素のドメインを別のタンパク質、例えばDNA結合タンパク質、と融合させることができる。前記DNA結合タンパク質により、前記ハイブリッドはDNAの特異的配列を標的にすることができる。酵素活性を有するドメインの核酸開裂活性は、配列特異的であることがあり、または配列非特異的であることもある。例えば、IIs型制限エンドヌクレアーゼFokIからの非特異的開裂ドメインをハイブリッドヌクレアーゼの酵素(開裂)ドメインとして使用することができる。酵素活性を有するドメインが開裂することができる配列は、DNA結合ドメインによるDNAへの前記ハイブリッドの物理的係留によって限定され得る。前記DNA結合ドメインは、真核生物または原核生物転写因子からのものであることがある。前記DNA結合ドメインは、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24もしくは25塩基対の、または少なくとも約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24もしくは25塩基対の連続核酸配列を認識することができる。場合によっては、前記制限酵素は、4塩基カッター、6塩基カッター、または8塩基カッターである。前記DNA結合ドメインは、約9から約18塩基対の配列を認識することができる。前記DNA結合ドメインは、例えば、ジンクフィンガーDNA結合ドメインであり得る。前記ハイブリッドは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ)であり得る。前記ハイブリッドタンパク質は、多量体(例えば、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体など)として機能することができる。
本明細書に記載する方法、組成物および/またはキットにおいて使用することができる具体的な制限酵素の例としては、AaaI、AagI、AarI、AasI、AatI、AatII、AauI、AbaI、AbeI、AbrI、AccI、AccII、AccIII、Acc16I、Acc36I、Acc65I、Acc113I、AccB1I、AccB2I、AccB7I、AccBSI、AccEBI、AceI、AceII、AceIII、AciI、AclI、AclNI、AclWI、AcpI、AcpII、AcrII、AcsI、AcuI、AcvI、AcyI、AdeI、AeuI、AfaI、Afa22MI、Afa16RI、AfeI、AflI、AflII、AflIII、AgeI、AgeI−HF、AglI、AhaI、AhalI、AhalII、AhaB8I、AhdI、AhlI、AhyI、AitI、AjnI、AjoI、AleI、AlfI、AliI、AliAJI、AloI、AluI、AlwI、Alw21I、Alw26I、Alw44I、AlwNI、AlwXI、Ama87I、AcoI、AocII、AorI、Aor13HI、Aor51HI、AosI、AosII、ApaI、ApaB1、ApaCI、ApaLI、ApaORI、ApeKI、ApiI、ApoI、ApyI、AquI、AscI、AseI、AselII、AsiSI、AvaI、AvaII、AvrII、BaeGI、BaeI、BamHI、BamHI−HF、BanI、BanII、BbsI、BbvCI、BbvI、BccI、BceAi、BcgI、BciVI、BclI、BcoDI、BfaI、BfuAI、BfuCI、BglI、BglII、BlpI、BmgBI、BmrI、BmtI、BpmI、Bpu10I、BpuEI、BsaAI、BsaBI、BsaHI、BsaI、BsaI−HF、BsaJI、BsaWI、BsaXI、BseRI、BseYI、BsgI、BsiEI、BsiHKAI、BsiWI、BslI、BsmAI、BSmBI、BsmFI、BsmI、BsoBI、Bsp1286I、BspCNI、BspDI、BspEI、BspHI、BspMI、BspQI、BsrBI、BsrDI、BsrFI、BsrGI、BsrI、BssHII、BssKI、BssSI、BstAPI、BstBI、BsteII、BstNI、BstUI、BstXI、BstYI、BstZ17I、Bsu36I、BtgI、BtgZI、BtsCI、BtsI、BtsIMutI、Cac8I、ClaI、CspCI、CviAII、CviKI−1、CviQI、DdeI、DpnI、DpnII、DraI、DraIII、DraIII−HF(商標)、DrdI、EaeI、EagI、EagI−HF(商標)、EarI、EciI、Eco53kI、EcoNI、EcoO109I、EcoP15I、EcoRI、EcoRI−HF(商標)、EcoRV、EcoRV−HF(商標)、FatI、FauI、Fnu4HI、FokI、FseI、FspEI、FspI、HaeII、HaeIII、HgaI、HhaI、HincII、HindIII、HindIII−HF(商標)、HinfI、HinP1I、HpaI、HpaII、HphI、Hpy166II、Hpy188I、Hpy188III、Hpy99I、HpyAV、HpyCH4III、HpyCH4IV、HpyCH4V、I−CeuI、I−SceI、KasI、KpnI、KpnI−HF(商標)、LpnPI、MboI、MboII、MfeI、MfeI−HF(商標)、MluCI、MluI、MlyI、MmeI、MnlI、MscI、MseI、MslI、MspA1I、MspI、MspJI、MwoI、NaeI、NarI、Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、NciI、NcoI、NcoI−HF(商標)、NdeI、NgoMIV、NheI、NheI−HF(商標)、NlaIII、NlaIV、NmeAIII、NotI、NotI−HF(商標)、NruI、NsiI、NspI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII、PacI、PaeR7I、PciI、PflFI、PflMI、PhoI、PI−PspI、PI−SceI、PleI、PmeI、PmlI、PpuMI、PshAI、PsiI、PspGI、PspOMI、PspXI、PstI、PstI−HF(商標)、PvuI、PvuI−HF(商標)、PvuII、PvuII−HF(商標)、RsaI、RsrII、SacI、SacI−HF(商標)、SacII、SalI、SalI−HF(商標)、SapI、Sau3AI、Sau96I、SbfI、SbfI−HF(商標)、ScaI、ScaI−HF(商標)、ScrFI、SexAI、SfaNI、SfcI、SfiI、SfoI、SgrAI、SmaI、SmlI、SnaBI、SpeI、SphI、SphI−HF(商標)、SspI、SspI−HF(商標)、StuI、StyD4I、StyI、StyI−HF(商標)、SwaI、TaqαI、TfiI、TliI、TseI、Tsp45I、Tsp509I、TspMI、TspRI、Tth111I、XbaI、XcmI、XhoI、XmaI、XmnIおよびZraIが挙げられる。
本明細書に記載する方法、組成物および/またはキットにおいて使用する1つ以上の制限酵素は、様々な源に由来し得る。例えば、1つ以上の制限酵素を組換え核酸から生成することができる。前記1つ以上の制限酵素を異種宿主における(例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞における)組換え核酸から生成することができる。前記1つ以上の制限酵素を異種宿主における組換え核酸から生成し、その異種宿主から精製することができる。前記1つ以上の制限酵素を天然源、例えば細菌または古細菌、から精製することができる。1つより多くの制限酵素を使用する場合、該制限酵素のうちの少なくとも1つは、組換え源からのものであり得、および該1つより多くの制限酵素のうちの少なくとも1つは、天然源からのものであり得る。
前記1つ以上の制限酵素についての認識部位は、任意の様々な配列のものであり得る。例えば、前記1つ以上の制限酵素についての認識部位は、パリンドローム配列であることがある。前記1つ以上の制限酵素についての認識部位は、部分的パリンドローム配列であることがある。一部の実施形態において、前記1つ以上の制限酵素についての認識部位は、パリンドローム配列ではない。前記1つ以上の制限酵素についての認識部位は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20塩基もしくは塩基対であることがあり、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20塩基もしくは塩基対より多いことがある。制限酵素についての認識部位は、約2から約20、約5から約20、約5から約15、約5から約10、約7から約20、約7から約15、または約7から約10塩基または塩基対であることがある。
2つ以上の制限酵素を使用して、ポリヌクレオチドを消化することができる。前記2つ以上の制限酵素は、同じ認識部位を認識することがあり、または異なる認識部位を認識することもある。単一のポリヌクレオチド上の2つの標的核酸配列間に単一の制限酵素のための1つ以上の認識部位があることがある。単一のポリヌクレオチド上の2つの標的核酸配列間に単一の制限酵素のための約または少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9,10もしくはそれより多くの認識部位があることがある。単一のポリヌクレオチド上の2つの標的核酸配列間に2つ以上の異なる制限酵素認識部位があることがある。単一のポリヌクレオチド上の2つの標的核酸配列間に約1、2、3、4、5、6、7、8、9,10もしくはそれより多くの、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9,10もしくはそれより多くの異なる制限酵素認識部位があることがある。単一のポリヌクレオチド上の2つの標的核酸配列間に1つ以上の異なる制限酵素認識部位があることがある。単一のポリヌクレオチド上の2つの標的核酸配列間に約1、2、3、4、5、6、7、8、9,10もしくはそれより多くの、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9,10もしくはそれより多くの制限酵素認識部位があることがある。
制限酵素消化物は、1つ以上のアイソシゾマーを含むことがある。アイソシゾマーは、同じ配列を認識する制限エンドヌクレアーゼである。アイソシゾマーは、異なる開裂部位を有することがあり、これらの酵素は、ネオシゾマーと呼ばれる。
一部の実施形態において、制限酵素による開裂は、平滑末端を生じさせる結果となる。一部の実施形態において、制限酵素による開裂は、平滑末端を生じさせる結果とならない。一部の実施形態において、制限酵素による開裂は、それぞれが5’オーバーハングを有する2つの断片を生じさせる結果となる。一部の実施形態において、制限酵素による開裂は、それぞれが3’オーバーハングを有する2つの断片を生じさせる結果となる。
制限酵素開裂部位の上流および下流の配列を増幅させるように、1以上の増幅反応のためのプライマーを設計することができる。
1つの実施形態において、制限酵素は、標的核酸配列または参照アンプリコンを切断しない。参照配列、例えばゲノム配列、を使用して、制限酵素が核酸配列を切断するかどうかを予測することができる。もう1つの実施形態において、制限酵素は、標的核酸配列を切断する。この開裂は、標的配列内の、該標的配列の5’または3’末端の付近(約5、10、15、25、50または100bp以内)で生じ得る。
もう1つの実施形態において、制限酵素は、標的または参照核酸配列またはアンプリコンを、該配列またはアンプリコンが1つ以上のSNPを含有する場合でさえ、切断しない。SNP情報は、幾つかのデータベースから得ることができ、dbSNP(www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)から最も容易に得ることができる。
1つ以上のメチル化感受性制限酵素を、本明細書において提供する方法、組成物およびキットで使用することができる。前記1つ以上のメチル化感受性酵素としては、例えば、DpnI、Acc65I、KpnI、ApaI、Bsp120I、Bsp143I、MboI、BspOI、NheI、Cfr9I、SmaI、Csp6I、RsaI、Ecl136II、SacI、EcoRII、MvaI、HpaIIまたはMspIを挙げることができる。一部の実施形態において、メチル化感受性制限酵素は、メチル化されていない核酸を開裂させることができるが、メチル化されている核酸を開裂させることができない。
核酸配列の選択領域を特異的消化するように、本開示において使用する制限酵素を選択することができる。1つの実施形態において、1つ以上の制限酵素は、標的核酸配列または標的アンプリコン間で切断する。認識配列が標的核酸配列または標的アンプリコンの付近に、例えば1回または複数回、出現する、1つ以上の酵素を選択することができる。1つの実施形態では、これらの認識配列がSNPの存在による影響を確実に受けないように気をつける。
1つの実施形態において、制限酵素は、効率的だが特異的な(スター活性のない)カッターである。適切な酵素力価測定実験を行うことによりこの特性を、消化時間および酵素濃度と共に、事前に決定することができる。1つの実施形態において、制限酵素は、スター活性を有することがある。スター活性は、定義された認識配列と同一ではないが類似している配列の開裂であり得る。
制限酵素の「ユニット」の数の、核酸(例えば、DNAまたはRNA)の量に対する比は、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、155、160、165、170、175、180. 185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、12,000、14,000、15000、16,000、18,000もしくは20,000ユニット/μgの核酸であるか、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、155、160、165、170、175、180. 185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、12,000、14,000、15000、16,000、18,000もしくは20,000ユニット/μgの核酸であり得る。制限酵素のユニットの数の、核酸の量に対する比は、約1から約20,000、約1から約10,000、約1から約5,000、約100から約10,000、約100から約1,000、約50から約500、または約50から約250ユニット/μgであり得る。
ポリヌクレオチドを含むサンプルと共に1つ以上の制限酵素を約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59もしくは60分間、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59もしくは60分間より長くインキュベートすることができる。ポリヌクレオチドを含むサンプルと共に1つ以上の制限酵素を約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47もしくは48時間、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47もしくは48時間より長くインキュベートすることができる。ポリヌクレオチドを含むサンプルと共に1つ以上の制限酵素を約1から約60分間、約1分間から約48時間、約1分間から約24時間、約1分間から約20時間、約1分間から約16時間、約0.5時間から約6時間、約0.5時間から約3時間、約1時間から約10時間、約1時間から約5時間、または約1時間から約3時間インキュベートすることができる。
制限酵素消化を約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64もしくは65℃の温度で、または約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64もしくは65℃より高い温度で行うことができる。制限酵素消化を約10から約65℃、約20から約65℃、約30から約65℃、約37から約65℃、約40から約65℃、約50から約65℃、約25℃から約37℃、または約30℃から約37℃の温度で行うことができる。
1つ以上の制限酵素を使用する制限酵素消化のpHは、約2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12または12.5であることがある。制限酵素消化のpHは、約5から約9、約5から約8、約5から約7、約6から約9、または約6から約8であることがある。
制限酵素消化には、1つ以上の緩衝剤を含む場合がある。前記1つ以上の緩衝剤は、例えば、トリス−HCl、ビス−トリス−プロパン−HCl、TAPs、ビシン、トリス、トリス−酢酸、トリス−HCl、トリシン、TAPSO、HEPES、TES、MOPS、PIPES、カコジル酸塩、SSC、リン酸バッファー、コリジン、酢酸ベロナール、MES.、ADA、ACES、コラミンクロリド、アセトアミドグリシン、グリシンアミド、マレイン酸塩、CABS、ピペルジン(piperdine)、グリシン、クエン酸塩、グリシルグリシン、リンゴ酸塩、ギ酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、ピリジン、ピペラジン、ヒスチジン、ビス−トリス、エタノールアミン、炭酸塩、MOPSO、イミダゾール、BIS−TRISプロパン、BES、MOBS、トリエタノールアミン(TEA)、HEPPSO、POPSO、ヒドラジン、Trizma(トリス)、EPPS、HEPPS、ビシン、HEPBS、AMPSO、タウリン(AES)、ホウ酸塩、CHES、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール(AMP)、水酸化アンモニウムまたはメチルアミンであってよい。溶液中の緩衝剤の濃度は、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または100mMであることがある。溶液中の緩衝剤の濃度は、約10から約t100mM、約10から約75mM、約25から約75mM、または約10から約50mMであることがある。
1つ以上の制限酵素を使用する制限酵素消化には、ウシ血清アルブミン(BSA)を含む場合がある。制限消化におけるBSAの濃度は、約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9または10mg/mLであることがあり、または約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9または10mg/mLより高いことがある。制限消化におけるBSAの濃度は、約0.01から約10mg/mL、約0.01から約1mg/mL、約0.05から約1mg/mL、または約0.05から約0.5mg/mLであることがある。
1つ以上の制限酵素を使用する制限酵素消化には、グリセロールを含むことがある。グリセロールは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24もしくは25パーセントの濃度(容積対容積)であるか、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24もしくは25パーセントの濃度(容積対容積)であることがある。制限酵素消化におけるグリセロールの濃度は、約1から約25%、約1から約20%、約1から約15%、約1から約10%、または約1から約5%であることがある。
制限酵素消化物は、1つ以上の有機溶媒、例えば、DMSO、エタノール、エチレングリコール、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミドまたはスファラン(suphalane)を含むことがある。制限酵素消化には1つ以上の有機溶媒を含まないことがある。
制限酵素消化には、1つ以上の二価カチオンを含むことがある。前記1つ以上の二価カチオンは、例えば、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Co2+、またはZn2+であってよい。
制限消化には、1つ以上の塩を含むことがある。前記1つ以上の塩としては、例えば、酢酸カリウム、塩化カリウム、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウムまたは塩化ナトリウムを挙げることができる。前記1つ以上の塩の各々の濃度は、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、155、160、165、170、175、180. 185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245もしくは250mMであることがあり、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、155、160、165、170、175、180. 185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245もしくは250mMより高いことがある。前記1つ以上の塩の各々の濃度は、約5から約250、約5から約200、約5から約150、約5から約100、約10から約100、約10から約90、約10から約80、約10から約70、約10から約60、または約10から約50mMであることがある。
制限消化には、1つ以上の還元剤を含むことがある。前記1つ以上の還元剤は、タンパク質中のジスルフィド結合の形成を阻害することができる。還元剤は、例えば、ジチオトレイトール(DTT)、2−メルカプトエタノール(BME)、2−メルカプトエチルアミン−HCl、トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン(tris(2−carboxythyl)phosphine)(TCEP)、またはシステイン−HClであってよい。制限酵素消化における前記1つ以上の還元剤の濃度は、約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20もしくは25mMであることがあり、または約0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20もしくは25mMより高いことがある。制限酵素消化における前記1つ以上の還元剤の濃度は、約0.01から約25mM、約0.01から約15mM、約0.01から約10mM、約0.01から約5mM、約0.1から約5mM、または約0.5から約2.5mMであることがある。
1つより多くの制限酵素を核酸の制限酵素消化において使用することができる。例えば、制限酵素のうちの1つ以上が核酸を効率的に切断しない場合、またはそれらが(例えば、SNPのため)必ずしもすべてのサンプルにわたって例外なくよく働くとは限らない場合、複数回の消化(multiple−digests)を用いることができる。制限消化において使用することができる異なる制限酵素の数は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20であるか、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19もしくは20であることがある。制限酵素消化において使用することができる異なる制限酵素の数は、例えば、約1から約20、約1から約15、約1から約10、約1から約7、約1から約6、約1から約5、約1から約4、約1から約3、または約1から約2であることがある。
アンプリコンまたは標的を含有する断片のサイズが比較的小さいときのほうが、PCRがうまくいく証拠がいくつかある。それ故、アンプリコンまたは標的の付近に切断部位を有する制限酵素を選択することが望ましいことがある。例えば、制限酵素認識部位または開裂部位は、ポリヌクレオチド上の標的のうちの1つについての5’末端または3’末端から、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、155、160、165、170、175、180.185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、12,000、14,000、15000、16,000、18,000もしくは20,000塩基対以内、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、155、160、165、170、175、180.185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、12,000、14,000、15000、16,000、18,000もしくは20,000塩基対未満にあることがある。制限酵素認識部位または開裂部位は、標的核酸配列の5’末端または3’末端から約1から約10,000、約1から約5,000、約1から約2,500、約1から約1,000、約1から約100、約100から約1000、約100から約500または約100から約250bpの範囲内にあることがある。
単一のサンプルを複数のCNVについて分析することができる。この場合、完全セットのCNVのためによく働くことになる最小数の消化を選択することが望ましいことがある。1つの実施形態では、任意のアンプリコンまたは標的核酸配列内では切断しないが、それらのうちの各々1つの付近に認識部位または開裂部位を有する、単一制限酵素カクテルを見出すことができる。制限酵素認識部位または開裂部位は、ポリヌクレオチド上の標的のうちの1つについての5’末端または3’末端から、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、155、160、165、170、175、180.185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、12,000、14,000、15000、16,000、18,000もしくは20,000塩基対以内、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、155、160、165、170、175、180.185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、12,000、14,000、15000、16,000、18,000もしくは20,000塩基対未満にあることがある。制限酵素認識部位または開裂部位は、ポリヌクレオチド上の標的のうちの1つについての5’末端または3’末端から約1から約20,000、約10からから約20,000、約100から約20,000、約1000から約20,000、約10から約10,000、約10から約1000、約10から約100、約50から約20,000、約50から約1000、約50から約500、約50から約250、約50から約150、または約50から約100塩基対の範囲内にあることがある。
適切なソフトウェアを記載かつ/または使用することにより、制限酵素選択プロセスを自動化することおよび、使用者、例えば実験生物学者が上記の基準を考慮して最も適切な酵素を選択するためのインターフェースを提供することが可能となる。追加の考慮事項、例えば、酵素費用、酵素効率、制限酵素のバッファー相溶性、メチル化感受性、核酸のセグメント内の開裂部位の数、または入手可能性をそのソフトウェアによって採用することができる。前記ソフトウェアをコンピュータで使用することができる。アルゴリズムをコンピュータ可読媒体で生成し、それを使用して核酸消化用の1つ以上の制限酵素を選択することができる。コンピュータをインターネットに接続し、それを使用して、制限エンドヌクレアーゼの選択を可能にし得るウェブサイトにアクセスすることができる。ウェブツールを使用することで、アンプリコンの周囲で切断する制限酵素を選択して、CNV推定のために連鎖遺伝子コピーを分離することができる。例えば、酵素およびアッセイをデータベースに記憶することができ、制限酵素の選択は自動であり得る。考慮され得る追加の統計量としては、例えば、最短断片長、%GC含有率、アンプリコン周囲(または内)での切断頻度、および酵素の費用が挙げられる。QToolを使用して、1つ以上の制限酵素の選択を支援することができる。図13および14は、制限酵素を選択する際に考慮され得る情報を図示する。
データ分析のためのアッセイ記憶のために、研究者は、アッセイを位置またはプライマー配列によって入力することができる。QToolは、アンプリコン配列および公知SNPを自動的に取得し、記憶し、熱力学的パラメータを計算することができる。研究者は、アッセイをもっと使用する場合、確定サンプルCNVおよびアニーリング温度をはじめとする追加データを入力することができる。
単一のチューブで逐次的にまたは一緒に行う、1つより多くの酵素による消化が、困難な標的の切断を確実に完了するのに役立つこともある。1つのサンプルの一連の制限酵素消化を異なる酵素、例えば約1、2、3、4、5、6、7、8、9または10の酵素で行うことができる。
その制限酵素消化の後に消化物中の1つ以上の制限酵素を不活性化することができる。一部の実施形態では、前記1つ以上の制限酵素は、熱への曝露によって不活性化されないことがある。殆どの制限酵素は、制限後、制限反応の温度を上昇させることによって熱不活化することができる。熱不活化のための温度は、例えば、約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100℃であることがあり、または約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100℃より上であることがある。前記熱不活化のための温度は、約50から約100、約50から約90、約60から約90、約65から約90、約65から約85、または約65から約80℃であることがある。熱不活化の継続時間は、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、80、90、100、110、120、180、240もしくは300分間であることがあり、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、80、90、100、110、120、180、240もしくは300分間より長いこともある。前記熱不活化の継続時間は、約5から約300、約5から約200、約5から約150、約5から約100、約5から約75、約5から約50、約5から約40、約5から約30、約5から約35、約5から約25、約5から約20、または約10から約20分間であることがある。前記熱不活化の温度は、二本鎖テンプレートコピーを維持するために、制限された標的断片の融点より低くてよい。
制限酵素消化に対し1つ以上のキレート剤を添加することにより、該制限酵素消化を停止させることができる。前記1つ以上のキレート剤は、例えば、EDTA、EGTA、クエン酸、またはホスフェートであってよい。制限酵素消化における前記1つ以上のキレート剤の濃度は、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100mMであるか、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100mMであってよい。前記1つ以上のキレート剤の濃度は、約1から約100mM、約1から約75mM、または約25から約75mMであってよい。
対照アッセイおよびテンプレートを使用して、制限酵素消化工程の効率を測定することができる。
サンプル
本明細書において提供する方法、組成物およびキットを使用して分析されるサンプルは、核酸(例えば、ウイルス)を含む非細胞エンティティーに由来することもあり、または細胞に基づく生物(例えば、古細菌、細菌または真核生物ドメインのメンバー)に由来することもある。場合によっては、病院、研究所、臨床検査所または医学研究所からサンプルを得ることができる。前記サンプルは、核酸、例えばRNAまたはDNA、を含み得る。前記サンプルは、無細胞核酸を含み得る。場合によっては、ドアまたはベンチトップなどの表面のスワブからサンプルを得る。
本明細書において提供する方法、組成物およびキットを使用して分析されるサンプルは、核酸(例えば、ウイルス)を含む非細胞エンティティーに由来することもあり、または細胞に基づく生物(例えば、古細菌、細菌または真核生物ドメインのメンバー)に由来することもある。場合によっては、病院、研究所、臨床検査所または医学研究所からサンプルを得ることができる。前記サンプルは、核酸、例えばRNAまたはDNA、を含み得る。前記サンプルは、無細胞核酸を含み得る。場合によっては、ドアまたはベンチトップなどの表面のスワブからサンプルを得る。
サンプルは、被験体、例えば、植物、真菌、真正細菌、古細菌、プロテストまたは動物からのものであってもよい。前記被験体は、生物であってよく、単細胞生物または多細胞生物のいずれであってもよい。前記被験体は、培養細胞であってもよく、これは、数ある中でも、初代細胞であってもよいし、または樹立細胞系からの細胞であってもよい。サンプルを最初に多細胞生物から任意の好適な形態で単離することができる。前記動物は、魚類、例えばゼブラフィッシュ、であってよい。前記動物は、哺乳動物であってよい。前記哺乳動物は、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、マウス、ラットまたはブタであってよい。前記哺乳動物は、霊長類、例えば、ヒト、チンパンジー、オランウータンまたはゴリラであってよい。前記ヒトは、男性であってもよく、または女性であってもよい。サンプルは、ヒト胚またはヒト胎児からのものであってよい。前記ヒトは、乳児、小児、ティーンエージャー、成人または老人であってよい。前記女性は、妊娠していることがあり、妊娠していると推測されることがあり、または妊娠するつもりであることがある。
サンプルは、健常である被験体(例えば、ヒト被験体)からのものであってよい。一部の実施形態では、サンプルを被験体(例えば、妊婦)から少なくとも妊娠第4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25または26週に採取する。一部の実施形態において、前記被験体は、遺伝性疾患に罹患しており、遺伝性疾患の保因者であり、または遺伝性疾患を発現するもしくは伝えるリスクがあり、この場合の遺伝性疾患は、遺伝的バリエーション、例えば、変異、挿入、付加、欠失、転座、点変異、トリヌクレオチド反復異常および/または一塩基多型(SNP)に関連づけることができる任意の疾患である。他の実施形態では、サンプルを出産可能年齢の女性患者から採取し、場合によっては、前記女性患者は、妊娠しておらず、または妊娠状態不明である。さらに他の場合、前記被験体は、男性患者、妊婦の夫である男性、または特定の遺伝子異常のリスクのある、特定の遺伝子異常を有すると診断された、もしくは特定の遺伝子異常を有する男性患者である。場合によっては、前記女性患者は、遺伝性疾患もしくは遺伝的バリエーションに罹患している、または遺伝性疾患もしくは遺伝的バリエーションの保因者である、または特定の遺伝子異常のリスクがある、または特定の遺伝子異常を有すると診断された、または特定の遺伝子異常を有することが分かっている。場合によっては、遺伝性疾患または遺伝的バリエーションに関する前記女性患者の状態が不明であることがある。さらなる実施形態では、遺伝子配列のコピー数変動に関する状態が分かっているまたは不明である任意の小児または成人患者からサンプルを採取する。場合によっては、前記小児または成人患者は、遺伝性疾患もしくは遺伝的バリエーションに罹患しているまたは遺伝性疾患もしくは遺伝的バリエーションの保因者であることが分かっている。
サンプルは、特定の疾患、障害もしくは状態を有する被験体からのものであることがあり、または特定の疾患、障害もしくは状態を有すると推測される(または有するリスクがある)被験体からのものであることもある。例えば、サンプルは、がん患者、がんを有すると推測される患者、またはがんを有するリスクがある患者からのものであることがある。前記がんは、例えば、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、副腎皮質がん腫、カポジ肉腫、肛門がん、基底細胞がん腫、胆管がん、膀胱がん、骨がん、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、脳がん、頭蓋咽頭腫、上衣芽細胞腫、上衣腫、髄芽細胞腫、髄上皮種(medulloeptithelioma)、松果体実質腫瘍、乳がん、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頸がん、脊索腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、結腸がん、結腸直腸がん、皮膚T細胞リンパ腫、非浸潤性乳管がん腫、子宮内膜がん、食道がん、ユーイング肉腫、眼がん、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、線維性組織球腫、胆嚢がん、胃がん、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頚部がん、心臓がん、肝細胞(肝臓)がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、口唇がん、口腔がん、肺がん、非小細胞がん腫、小細胞がん腫、黒色腫、口内がん(mouth cancer)、骨髄異型性症候群、多発性骨髄腫、髄芽細胞腫、鼻腔がん、副鼻腔がん、神経芽細胞腫、鼻咽頭がん、口のがん(oral cancer)、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細胞新生物、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、横紋筋肉腫、唾液腺がん、セザール症候群、皮膚がん、非黒色腫、小腸がん、軟組織肉腫、扁平上皮がん腫、睾丸がん、咽喉がん、胸腺腫、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、またはウィルムス腫瘍であることがある。サンプルは、がん患者のがんからのものであることもあり、および/またはがん患者の正常組織からのものであることもある。
サンプルは、遺伝性疾患、障害または状態が分かっている被験体からのものであることがある。場合によっては、前記被験体は、遺伝子(例えば、CFTR、第VIII因子(F8遺伝子)、ベータグロビン、血色素症(hemachromatosis)、G6PD、神経線維腫症、GAPDH、ベータアミロイドまたはピルビン酸キナーゼ遺伝子)または遺伝子の一部が野生型である、または変異体であることが分かっている。場合によっては、前記被験体の状態が分かっており、または分かっておらず、該被験体を遺伝子、例えば、CFTR、第VIII因子(F8遺伝子)、ベータグロビン、血色素症、G6PD、神経線維腫症、GAPDH、ベータアミロイドまたはピルビン酸キナーゼ遺伝子の変異または遺伝的バリエーションの存在について試験する。
サンプルは、房水、硝子体液、胆汁、全血、血清、血漿、母乳、脳脊髄液、耳垢、内リンパ(enolymph)、外リンパ、胃液、粘液、腹水、唾液、皮脂、精液、汗、涙、膣分泌物、嘔吐物、糞便または尿であることがある。病院、研究所、臨床検査所または医学研究所からサンプルを得ることができる。被験体からサンプルを採取することができる。前記サンプルは、核酸を含み得る。前記核酸は、例えば、ミトコンドリアDNA、ゲノムDNA、mRNA、siRNA、miRNA、cRNA、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、tRNA、rRNAまたはCDNAであり得る。前記サンプルは、無細胞核酸を含むことがある。前記サンプルは、細胞系、ゲノムDNA、無細胞血漿、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプル、または瞬間冷凍サンプルであることがある。ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルは、核酸を抽出する前に脱パラフィンすることができる。サンプルは、器官、例えば心臓、皮膚、肝臓、肺、乳房、胃、膵臓、膀胱、結腸、胆嚢、脳などからのものであることがある。
核酸がRNAであるとき、該RNAの源は、本明細書に記載する任意の源であり得る。例えば、前記RNAは、無細胞mRNAであることがあり、組織生検の、コア生検の、細針吸引の、凍結乾燥のまたはホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)のサンプル由来のものであることがある。FFPEサンプルは、RNAを抽出する前に脱パラフィンすることができる。抽出したRNAを分析前に約30、31、32、33、34、35、36、37 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99℃に加熱することができる。抽出したRNAをこれらのいずれかの温度に、約15分間、30分間、45分間、60分間、1.5時間、2時間、2.5時間、3時間、3.5時間、4時間、4.5時間、5時間、5.5時間、6時間、6.5時間、7時間、7.5時間、8時間、8.5時間、9時間、9.5時間もしくは10時間、または少なくとも約15分間、30分間、45分間、60分間、1.5時間、2時間、2.5時間、3時間、3.5時間、4時間、4.5時間、5時間、5.5時間、6時間、6.5時間、7時間、7.5時間、8時間、8.5時間、9時間、9.5時間もしくは10時間、加熱することができる。
様々な下流での応用にRNAを使用することができる。例えば、RNAをリバーストランスクリプターゼでcDNAに変換し、該cDNAを必要に応じてPCR、例えばリアルタイムPCR、に供することができる。前記RNAまたはcDNAを等温増幅反応、例えば等温線形増幅反応、において使用することができる。前記RNA、結果として得られるcDNA、またはそれらから増幅された分子を、マイクロアレイ実験、遺伝子発現実験、ノーザン分析、サザン分析、シークエンシング反応、次世代シークエンシング反応などにおいて使用することができる。特定のRNA配列を分析してもよいし、またはRNA配列を包括的に分析してもよい。
当業者が利用可能な手段によってサンプルから核酸を抽出することができる。
増幅について競合するようにサンプルを加工することができる。例示的サンプル加工としては、核酸を放出させるためのサンプルにおける細胞の溶解、サンプルの精製(例えば、増幅を阻害し得る他のサンプル成分から核酸を単離するために)、サンプルの希釈/濃縮、ならびに/またはサンプルと増幅用の試薬との組み合わせを挙げることができ、該増幅用の試薬は、例えばDNA/RNAポリメラーゼ(例えば、PCR増幅用の熱安定性DNAポリメラーゼ)、dNTP(例えば、dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP(および/またはdUTP))、各対立遺伝子配列もしくは多型性遺伝子座を増幅させるためのプライマーセット、増幅すべき各対立遺伝子配列に特異的にハイブリダイズすることができるプローブ(例えば、蛍光プローブ、例えば、数ある中でも、TAQMANプローブもしくは分子ビーコンプローブ)、Mg2+、DMSO、BSA、緩衝剤もしくはこれらの任意の組み合わせである。一部の実施例では、サンプルを制限酵素、ウラシル−DNAグリコシラーゼ(UNG)、リバーストランスクリプターゼまたは任意の他の核酸プロセッシング酵素と併用することができる
標的ポリヌクレオチド
本明細書に記載する方法を、1つ以上の標的核酸分子を分析または検出するために使用することができる。用語ポリヌクレオチド、または文法上の相当語句は、共有結合で互いに連結されている少なくとも2つのヌクレオチドを指すことができる。本明細書に記載する核酸は、ホスホジエステル結合を含有し得るが、場合によっては、下で(例えば、プライマーおよびプローブ、例えば標識プローブ、の構築の中で)概説するように、例えば、ホスホルアミド(Beaucageら、Tetrahedron 49(10):1925(1993)およびその中の参考文献;Letsinger,J.Org.Chem.35:3800(1970);Sprinzlら、Eur.J.Biochem.81:579(1977);Letsingerら、Nucl.Acids Res.14:3487(1986);Sawaiら、Chem.Lett.805(1984);Letsingerら、J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988);ならびにPauwelsら、Chemica Scripta 26:141 91986))、ホスホロチオアート(Magら、Nucleic Acids Res.19:1437(1991);ならびに米国特許第5,644,048明細書)、ホスホロジチオアート(Briuら、J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989)、O−メチルホスホロアミダイト(O−methylphophoroamidite)連結(Eckstein、Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach、Oxford University Press参照)ならびにペプチド核酸(本明細書では「PNA」とも呼ぶ)主鎖および連結(Egholm、J.Am.Chem.Soc. 114:1895(1992);Meierら、Chem.Int.Ed.Engl.31:1008(1992);Nielsen、Nature、365:566(1993);Carlssonら、Nature 380:207(1996)参照、これらのすべてが参照により援用されている)を含む代替主鎖を有し得る核酸類似体を含む。他の類似体核酸としては、ロックド核酸(本明細書では「LNA」とも呼ぶ)、Koshkinら、J.Am.Chem.Soc.120.13252 3(1998);陽性主鎖(Denpcyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097(1995);非イオン性主鎖(米国特許第5,386,023号、同第5,637,684号、同第5,602,240号、同第5,216,141号および同第4,469,863号明細書;Kiedrowshiら、Angew.Chem.Intl.Ed.English 30:423(1991);Letsingerら、J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988);Letsingerら、Nucleoside &Nucleotide 13:1597(1994);第2および3章、ASC Symposium Series 580、「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、編集Y.S.SanghuiおよびP.Dan Cook;Mesmaekerら、Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.4:395(1994);Jeffsら、J.Biomolecular NMR 34:17(1994);Tetrahedron Lett.37:743(1996))および非リボース主鎖(米国特許第5.235,033号および同第5,034,506号明細書、ならびに第6および7章、ASC Symposium Series 580、「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、編集Y.S.SanghuiおよびP.Dan Cookに記載されているものを含む)を含む二環式構造を有するものが挙げられる。1つ以上の炭素環式糖を含有する核酸も核酸の定義内に含まれる(Jenkinsら、Chem.Soc.Rev.(1995)pp.169 176を参照されたし)。幾つかの核酸類似体が、Rawls、C&E News、1997年6月2日号、35頁に記載されている。「ロックド核酸」も核酸類似体の定義内に含まれる。LNAは、2’−O原子と4’−C原子を接続するメチレン橋架けによってリボース環が「ロックされている」核酸類似体の1クラスである。これらの参考文献のすべてが参照により本明細書に明確に援用されている。リボース−ホスフェート主鎖のこれらの修飾を行って、生理環境におけるかかる分子の安定性および半減期を増すことができる。例えば、PNA:DNAおよびLNA−DNAハイブリッドは、より高い安定性を呈示することができ、それ故、一部の実施形態においてそれらを使用することができる。前記標的核酸は、明記したように一本鎖であることがあり、もしくは二本鎖であることがあり、または二本鎖もしくは一本鎖配列両方の部分を含有することがある。応用に依存して、核酸は、DNA(例えば、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNAおよびcDNAを含む)、RNA(例えば、mRNAおよびrRNAを含む)またはハイブリッドであることがあり、前記核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、およびウラシル、アデニン、チミジン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン(xathanine)ヒポキサンチン(hypoxathanine)、イソシトシン、イソグアニンなどをはじめとする塩基の任意の組み合わせを含有する。
標的ポリヌクレオチド
本明細書に記載する方法を、1つ以上の標的核酸分子を分析または検出するために使用することができる。用語ポリヌクレオチド、または文法上の相当語句は、共有結合で互いに連結されている少なくとも2つのヌクレオチドを指すことができる。本明細書に記載する核酸は、ホスホジエステル結合を含有し得るが、場合によっては、下で(例えば、プライマーおよびプローブ、例えば標識プローブ、の構築の中で)概説するように、例えば、ホスホルアミド(Beaucageら、Tetrahedron 49(10):1925(1993)およびその中の参考文献;Letsinger,J.Org.Chem.35:3800(1970);Sprinzlら、Eur.J.Biochem.81:579(1977);Letsingerら、Nucl.Acids Res.14:3487(1986);Sawaiら、Chem.Lett.805(1984);Letsingerら、J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988);ならびにPauwelsら、Chemica Scripta 26:141 91986))、ホスホロチオアート(Magら、Nucleic Acids Res.19:1437(1991);ならびに米国特許第5,644,048明細書)、ホスホロジチオアート(Briuら、J.Am.Chem.Soc.111:2321(1989)、O−メチルホスホロアミダイト(O−methylphophoroamidite)連結(Eckstein、Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach、Oxford University Press参照)ならびにペプチド核酸(本明細書では「PNA」とも呼ぶ)主鎖および連結(Egholm、J.Am.Chem.Soc. 114:1895(1992);Meierら、Chem.Int.Ed.Engl.31:1008(1992);Nielsen、Nature、365:566(1993);Carlssonら、Nature 380:207(1996)参照、これらのすべてが参照により援用されている)を含む代替主鎖を有し得る核酸類似体を含む。他の類似体核酸としては、ロックド核酸(本明細書では「LNA」とも呼ぶ)、Koshkinら、J.Am.Chem.Soc.120.13252 3(1998);陽性主鎖(Denpcyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097(1995);非イオン性主鎖(米国特許第5,386,023号、同第5,637,684号、同第5,602,240号、同第5,216,141号および同第4,469,863号明細書;Kiedrowshiら、Angew.Chem.Intl.Ed.English 30:423(1991);Letsingerら、J.Am.Chem.Soc.110:4470(1988);Letsingerら、Nucleoside &Nucleotide 13:1597(1994);第2および3章、ASC Symposium Series 580、「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、編集Y.S.SanghuiおよびP.Dan Cook;Mesmaekerら、Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.4:395(1994);Jeffsら、J.Biomolecular NMR 34:17(1994);Tetrahedron Lett.37:743(1996))および非リボース主鎖(米国特許第5.235,033号および同第5,034,506号明細書、ならびに第6および7章、ASC Symposium Series 580、「Carbohydrate Modifications in Antisense Research」、編集Y.S.SanghuiおよびP.Dan Cookに記載されているものを含む)を含む二環式構造を有するものが挙げられる。1つ以上の炭素環式糖を含有する核酸も核酸の定義内に含まれる(Jenkinsら、Chem.Soc.Rev.(1995)pp.169 176を参照されたし)。幾つかの核酸類似体が、Rawls、C&E News、1997年6月2日号、35頁に記載されている。「ロックド核酸」も核酸類似体の定義内に含まれる。LNAは、2’−O原子と4’−C原子を接続するメチレン橋架けによってリボース環が「ロックされている」核酸類似体の1クラスである。これらの参考文献のすべてが参照により本明細書に明確に援用されている。リボース−ホスフェート主鎖のこれらの修飾を行って、生理環境におけるかかる分子の安定性および半減期を増すことができる。例えば、PNA:DNAおよびLNA−DNAハイブリッドは、より高い安定性を呈示することができ、それ故、一部の実施形態においてそれらを使用することができる。前記標的核酸は、明記したように一本鎖であることがあり、もしくは二本鎖であることがあり、または二本鎖もしくは一本鎖配列両方の部分を含有することがある。応用に依存して、核酸は、DNA(例えば、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNAおよびcDNAを含む)、RNA(例えば、mRNAおよびrRNAを含む)またはハイブリッドであることがあり、前記核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、およびウラシル、アデニン、チミジン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン(xathanine)ヒポキサンチン(hypoxathanine)、イソシトシン、イソグアニンなどをはじめとする塩基の任意の組み合わせを含有する。
本明細書において提供する方法および組成物を用いて、ポリヌクレオチド(例えば、DNA、RNA、ミトコンドリアDNA、ゲノムDNA、mRNA、siRNA、miRNA、cRNA、一本鎖DNA、二本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、tRNA、rRNA、cDNAなど)の量を評価することができる。前記方法および組成物を使用して、第二のポリヌクレオチドの量と比較して第一のポリヌクレオチド量を評価することができる。前記方法を用いて、溶液中の合成プラスミドの量を分析することができ;被験体から得たまたはある環境から得たサンプル中の病原性生物(例えば、微生物、細菌、ウイルス、寄生虫、レトロウイルス、レンチウイルス、HIV−1、HIV−2、インフルエンザウイルスなど)を検出することができる。ポリヌクレオチドの稀な集団がより大きなポリヌクレオチド集団内に存在する他の応用にも前記方法を用いることができる。
本明細書において提供する方法、組成物およびキットを使用して被験体のサンプルが分析される、該被験体のサンプル(例えば、ゲノム)中の標的核酸配列のコピーの数は、0であることがあり、あるいは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、5000、10,000、20,000、50,000もしくは100,000であるか、または少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、5000、10,000、20,000、50,000もしくは100,000であることもある。本明細書において提供する方法、組成物およびキットを使用して被験体のサンプルが分析される、該被験体のゲノム中の標的核酸配列のコピーの数は、約1から約20、約1から約15、約1から約10、約1から約7、約1から約5、約1から約3、約1から約1000、約1から約500、約1から約250、約1から約100、約10から約1000、約10から約500、約10から約250、約10から約100、約10から約50、約10から約20、約0から約100、約0から約50、約0から約25または約0から約10であることがある。
前記標的核酸配列は、1つの染色体上にあることがある。標的核酸が、ヒト被験体に由来するサンプル中にある場合、該標的核酸配列は、第1染色体、第2染色体、第3染色体、第4染色体、第5染色体、第6染色体、第7染色体、第8染色体、第9染色体、第10染色体、第11染色体、第12染色体、第13染色体、第14染色体、第15染色体、第16染色体、第17染色体、第18染色体、第19染色体、第20染色体、第21染色体、第22染色体、X染色体またはY染色体のうちの1つ以上の上にあることがある。前記標的核酸は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22もしくは23個の染色体上にあることがあり、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22もしくは23個より多くの染色体上にあることもある。標的核酸配列の2個以上のコピーが同じまたは異なる染色体上にあることがある。ヒト被験体の場合、標的核酸配列の2個以上のコピーが第1染色体、第2染色体、第3染色体、第4染色体、第5染色体、第6染色体、第7染色体、第8染色体、第9染色体、第10染色体、第11染色体、第12染色体、第13染色体、第14染色体、第15染色体、第16染色体、第17染色体、第18染色体、第19染色体、第20染色体、第21染色体、第22染色体、X染色体またはY染色体上にあることがある。前記標的核酸配列の2個以上のコピーは、被験体の1つのポリヌクレオチド(例えば、染色体)上にあることもあるが、前記標的核酸は、該被験体から採取されたサンプル中で、該サンプルの取り扱いに起因して(例えば、断片化により)分離されていることもある。
前記標的核酸の2個のコピーが同じポリヌクレオチド上、例えば同じ染色体上にあるとき、該2個のコピーは、該ポリヌクレオチド上で約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、百万、2百万、3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万、9百万、1千万、2千万、3千万、4千万、5千万、6千万、7千万、8千万、9千万または1億塩基もしくは塩基対離隔して配置されていることがあり、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、百万、2百万、3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万、9百万、1千万、2千万、3千万、4千万、5千万、6千万、7千万、8千万、9千万または1億塩基もしくは塩基対より大きく離隔して配置されていることもり、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、百万、2百万、3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万、9百万、1千万、2千万、3千万、4千万、5千万、6千万、7千万、8千万、9千万または1億塩基もしくは塩基対未満離隔して配置されていることもある。2つの標的核酸は、約100から約100,000、約100から約10,000、約100から約1,000、約10から約10,000、または約10から約1,000塩基または塩基対離隔して配置されていることがある。
標的配列は、遺伝子であることがある。例えば、前記遺伝子は、ERBB2、EGFR、BRCA1、BRCA2、APC、MSH2、MSH6、MLH1、CYP2D6、低コピー反復(LCR)リッチ配列(例えば、Balikovaら(2008)Am J.Hum Genet.82:181−187参照)、TAS1R1、GNAT1、IMPDH1、OPN1SW、OR2A12、OR2A14、OR2A2、OR2A25、OR2A5、OR2A1、OR2A42、OR2A7、OR4F21、OR4F29、OR4C6、OR4P4、OR4S2、OR5D13、ROM1、TAS@R14、TAS2R44、TAS2R48、TAS2R49、TAS2R50、OR6C2、OR6C4、OR6C68、OR6C70、OR4M1、OR4Q3、OR4K1、OR4K2、OR4K5、OR4N2、OR4K13、OR4K14、OR4K15、OR4M2、OR4N4、OR1F1、ACTG1、FSCN2、OR2Z1、OR11H1、MYH9、SKI、TP73、TNFRSF25、RAB3B、VAV3、RALB、BOK、NAT6、TUSC2、TUSC4、TAB33B、C6orf210、ESR1、MAFK、MAD1L1、MYC、VAV2、MAP3K8、CDKN1C、WT1、WIT−1、C1QTNF4、MEN1、CCND1、ORAOV1、MLL2、C13orf10、TNFAIP2、AXIN1、BCAR1、TAX1BP3、NF1、PHB、MAFG、C1QTNF1、YES1、DCC、SH3GL1、TNFSF9、TNFSF7、TNFSF14、VAV1、RAB3A、PTOV1、BAX、RRAS、BCAS4、HIC2、NROB2、TTN、SGCB、SMA3、SMA4、SMN1、LPA、PARK2、GCK、GPR51、BSCL2、A2M、TBXA2R、FKRPまたはCOMTであることがある。
標的配列は、マイクロRNA、例えば、hsa−let−7g、hsa−mir−135a−1、hsa−mir−95、hsa−mir−218−1、hsa−mir−320、has−let−7a−1、has−let−7d、has−let−7f−1、has−mir−202、has−mir−130a、has−mir−130a、has−mir−338、has−mir−199a−1、has−mir−181c、has−mir−181d、has−mir−23a、has−mir−24−2、has−mir−27a、has−mir−150、has−mir−499、has−mir−124a−3、またはhas−mir−185をコードしていることがある。
標的配列は、Wongら(2007)Am J of Hum Genetics 80:91−104に収載されているいずれかの配列であることもある。
増幅および検出
本明細書に記載する方法は、核酸増幅を用いることができる。標的核酸の増幅を当該技術分野において公知の任意の手段によって行うことができる。増幅を熱サイクリングによって行うことができ、または等温的に行うことができる。例示的実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅を果たすことができる。
本明細書に記載する方法は、核酸増幅を用いることができる。標的核酸の増幅を当該技術分野において公知の任意の手段によって行うことができる。増幅を熱サイクリングによって行うことができ、または等温的に行うことができる。例示的実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅を果たすことができる。
使用することができるPCR技法の例としては、定量的PCR、定量的蛍光PCR(QF−PCR)、マルチプレックス蛍光PCR(MF−PCR)、リアルタイムPCR(RT−PCR)、シングルセルPCR、制限酵素断片長多型PCR(PCR−RFLP)、PCR−RFLP/RT−PCR−RFLP、ホットスタートPCR、ネステッドPCR、インサイチューコロニーPCR(in situ polony PCR)、インサイチュー・ローリングサークル増幅(RCA)、ブリッジPCR、ピコタイターPCR、デジタルPCR、液滴デジタルPCR、およびエマルジョンPCRが挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な増幅法としては、リガーゼ連鎖反応(LCR)、転写増幅、分子反転プローブ(MIP)PCR、自立配列複製法、標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅、コンセンサス配列プライムドポリメラーゼ連鎖反応(CP−PCR)、アービトラリリー・プライムド・ポリメラーゼ連鎖反応(AP−PCR)、縮重オリゴヌクレオチドプライムドPCR(DOP−PCR)および核酸ベース配列増幅(NABSA)が挙げられる。本明細書で使用することができる他の増幅方法としては、米国特許第5,242,794号、同第5,494,810号、同第4,988,617号および同第6,582,938号明細書に記載されているものが挙げられる。ビーズを用いて標的核酸の増幅を行うことができる。他の実施形態では、ビーズを用いて増幅を行わない。等温増幅、例えば、等温線形増幅によって増幅を行ってもよい。ポリメラーゼの添加前に2分間、反応を95℃に加熱する、またはサイクル1の第一の加熱工程までポリメラーゼを不活性に保つことができる、ホットスタートPCRを行ってもよい。ホットスタートPCRを用いて、非特異的増幅を最少にすることができる。増幅のための他の戦略および態様は、参考として本明細書に援用されている、2010年7月8日に公開された米国特許出願公開第2010/0173394号A1明細書に記載されている。
標的配列および参照配列の増幅のための技法は当該技術分野において公知であり、米国特許第7,048,481号明細書に記載されている方法を含む。簡単に言うと、前記技法は、場合により1液滴につき平均で約5、4、3、2または1未満の標的核酸分子(ポリヌクレオチド)を各々が含有する小液滴にサンプルを分け、各液滴内の核酸を増幅し、標的核酸配列の存在を検出する方法および組成物を含み得る。場合によっては、増幅される配列は、ゲノムDNA自体ではなくゲノムDNAに対するプローブ上に存在する。場合によっては、少なくとも200、175、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10または0個の液滴に含まれる標的核酸のコピー数が0である。
増幅反応についての情報をデータベースに入力することができる。例えば、図15Aおよび15Bは、データベースに入力することができるアッセイ情報を図示する。
プライマー
二次構造および自己ハイブリダイゼーションを回避するために公知のパラメータに従ってプライマーを設計することができる。異なるプライマー対を、ほぼ同じ温度で、例えば別のプライマー対の約1、2、3、4、5、6、7、8、9または10℃以内で、アニールし、融解することができる。場合によっては、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、500、1000、5000、10,000個より多くの、またはそれより多くのプライマーを最初に使用する。かかるプライマーは、本明細書に記載する遺伝子標的にハイブリダイズすることが可能であり得る。一部の実施形態では、約2から約10,000、約2から約5,000、約2から約2,500、約2から約1,000、約2から約500、約2から約100、約2から約50、約2から約20、約2から約10、または約2から約6個のプライマーを使用する。
二次構造および自己ハイブリダイゼーションを回避するために公知のパラメータに従ってプライマーを設計することができる。異なるプライマー対を、ほぼ同じ温度で、例えば別のプライマー対の約1、2、3、4、5、6、7、8、9または10℃以内で、アニールし、融解することができる。場合によっては、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、200、500、1000、5000、10,000個より多くの、またはそれより多くのプライマーを最初に使用する。かかるプライマーは、本明細書に記載する遺伝子標的にハイブリダイズすることが可能であり得る。一部の実施形態では、約2から約10,000、約2から約5,000、約2から約2,500、約2から約1,000、約2から約500、約2から約100、約2から約50、約2から約20、約2から約10、または約2から約6個のプライマーを使用する。
様々な方法によってプライマーを調製することができ、それらの方法としては、当該技術分野において周知の方法を用いる適切な配列のクローニングおよび直接化学合成(Narangら、Methods Enzymol.68:90(1979);Brownら、Methods Enzymol.68:109(1979))が挙げられるが、これらに限定されない。Integrated DNA Technologies、Operon Technologies、Amersham Pharmacia Biotech、SigmaおよびLife Technologiesなどの供給業者からプライマーを入手することもできる。前記プライマーは、同一の融解温度を有することがある。プライマーの融解温度は、約30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、81、82、83、84または85℃であることがある。一部の実施形態において、前記プライマーの融解温度は、約30から約85℃、約30から約80℃、約30から約75℃、約30から約70℃、約30から約65℃、約30から約60℃、約30から約55℃、約30から約50℃、約40から約85℃、約40から約80℃、約40から約75℃、約40から約70℃、約40から約65℃、約40から約60℃、約40から約55℃、約40から約50℃、約50から約85℃、約50から約80℃、約50から約75℃、約50から約70℃、約50から約65℃、約50から約60℃、約50から約55℃、約52から約60℃、約52から約58℃、約52から約56℃、または約52から約54℃である。
前記プライマーの長さを5’末端または3’末端で延長または短縮して、所望の融解温度を有するプライマーを生成することができる。プライマー対のプライマーの一方が他方のプライマーより長いことがある。プライマー対の中のプライマーの3’アニーリング長が異なることがある。また、各プライマー対のアニーリング位置を、それらのプライマー対の配列および長さが所望の融解温度を生じさせるように設計することができる。25塩基対より小さいプライマーの融解温度を決定するための方程式がウォレスの法則(Td=2(A+T)+4(G+C))である。Array Designer Software(Arrayit Inc.)、Oligonucleotide Probe Sequence Design Software for Genetic Analysis(Olympus Optical Co.)、NetPrimer、およびHitachi Software EngineeringからのDNAsisをはじめとする(しかしこれらに限定されない)コンピュータプログラムを使用してプライマーを設計することもできる。Net Primer(http://www.premierbiosoft.com/netprimer/index.htmlの無料ウェブベースプログラム)などのソフトウェアプログラムを使用して、各プライマーのTM(融解またはアニーリング温度)を算出することができる。約サイクル1、2、3、4、5、約サイクル6から約サイクル10、約サイクル10から約サイクル15、約サイクル15から約サイクル20、約サイクル20から約サイクル25、約サイクル25から約サイクル30、約サイクル30から約サイクル35、または約サイクル35から約サイクル40をはじめとする(しかしこれらに限定されない)任意の増幅サイクル後に、プライマーのアニーリング温度を再び算出し、上昇させることができる。最初の増幅サイクル後、プライマーの5’半分を関心対象の各遺伝子座からの産物に組み込むことができ、かくして各プライマーの5’半分と3’半分の配列両方に基づいてTMを再び算出することができる。
約サイクル1、2、3、4、5、約サイクル6から約サイクル10、約サイクル10から約サイクル15、約サイクル15から約サイクル20、約サイクル20から約サイクル25、約サイクル25から約サイクル30、約サイクル30から約サイクル35、または約サイクル35から約サイクル40をはじめとする(しかしこれらに限定されない)任意の増幅サイクル後に、プライマーのアニーリング温度を再び算出し、上昇させることができる。最初の増幅サイクル後、プライマーの5’半分を関心対象の各遺伝子座からの産物に組み込むことができ、かくして各プライマーの5’半分と3’半分の配列両方に基づいてTMを再び算出することができる。
DNAポリメラーゼ
大腸菌DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼ1のクレノウ断片、T7 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Pfx DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、バクテリオファージ29、REDTaq(商標)、ゲノムDNAポリメラーゼまたはシーケナーゼをはじめとする(しかしこれらに限定されない)、プライマー伸長を触媒する任意のDNAポリメラーゼを使用することができる。熱安定性DNAポリメラーゼを使用してもよい。前記DNAポリメラーゼは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有することがある。前記DNAポリメラーゼは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を保有することがある。前記DNAポリメラーゼは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性と5’→3’エキソヌクレアーゼ活性の両方を保有することがある。
大腸菌DNAポリメラーゼ、大腸菌DNAポリメラーゼ1のクレノウ断片、T7 DNAポリメラーゼ、T4 DNAポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Pfu DNAポリメラーゼ、Pfx DNAポリメラーゼ、Tth DNAポリメラーゼ、Vent DNAポリメラーゼ、バクテリオファージ29、REDTaq(商標)、ゲノムDNAポリメラーゼまたはシーケナーゼをはじめとする(しかしこれらに限定されない)、プライマー伸長を触媒する任意のDNAポリメラーゼを使用することができる。熱安定性DNAポリメラーゼを使用してもよい。前記DNAポリメラーゼは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を有することがある。前記DNAポリメラーゼは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を保有することがある。前記DNAポリメラーゼは、3’→5’エキソヌクレアーゼ活性と5’→3’エキソヌクレアーゼ活性の両方を保有することがある。
サーモサイクリング
任意の数のPCRサイクル、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44もしくは45のサイクル、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44もしくは45より多くのサイクル、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44もしくは45未満のサイクルを用いてDNAを増幅させることができる。前記増幅サイクル数は、約1から約45、約10から約45、約20から約45、約30から約45、約35から約45、約10から約40、約10から約30、約10から約25、約10から約20、約10から約15、約20から約35、約25から約35、約30から約35、または約35から約40であることがある。
任意の数のPCRサイクル、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44もしくは45のサイクル、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44もしくは45より多くのサイクル、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44もしくは45未満のサイクルを用いてDNAを増幅させることができる。前記増幅サイクル数は、約1から約45、約10から約45、約20から約45、約30から約45、約35から約45、約10から約40、約10から約30、約10から約25、約10から約20、約10から約15、約20から約35、約25から約35、約30から約35、または約35から約40であることがある。
液滴内に含有されているサンプルを用いてサーモサイクリング反応を行うことができる。前記液滴は、サーモサイクリング中、無損傷のままであることができる。液滴は、サーモサイクリング中、約10,000液滴/mL、100,000液滴/mL、200,000液滴/mL、300,000液滴/mL、400,000液滴/mL、500,000液滴/mL、600,000液滴/mL、700,000液滴/mL、800,000液滴/mL、900,000液滴/mLまたは1,000,000液滴/mLより高い密度で、無損傷のままであることができる。他の場合、サーモサイクリング中に2つ以上の液滴が合体することがある。他の場合、100個より多くの、または1,000個より多くの液滴がサーモサイクリング中に合体することがある。
プローブ
当該技術分野において公知の方法によって汎用プローブを設計することができる。一部の実施形態において、前記プローブは、ランダム配列である。アッセイにおいて標的ポリヌクレオチドを、またはサンプル中にある可能性がある他の非標的ポリヌクレオチド(例えば、標的ポリヌクレオチドによって占有されている領域外のゲノムDNA)に結合しないことを保証するように、汎用プローブを選択することができる。
当該技術分野において公知の方法によって汎用プローブを設計することができる。一部の実施形態において、前記プローブは、ランダム配列である。アッセイにおいて標的ポリヌクレオチドを、またはサンプル中にある可能性がある他の非標的ポリヌクレオチド(例えば、標的ポリヌクレオチドによって占有されている領域外のゲノムDNA)に結合しないことを保証するように、汎用プローブを選択することができる。
本明細書に記載する方法において標的核酸配列または参照核酸配列を検出するためにプローブ(例えば、Taqmanプローブ)に対して使用する標識(蛍光体、色素)は、例えば、6−カルボキシフルオレセイン(FAM)、テトラクロロフルオレセイン(tetrachlorofluorescin)(TET)、4,7,2’−トリクロロ−7’−フェニル−6−カルボキシフルオレセイン(VIC)、HEX、Cy3、Cy 3.5、Cy 5、Cy 5.5、Cy 7、テトラメチルローダミン、ROXおよびJOEであることがある。前記標識は、Alexa Fluor色素、例えば、Alexa Fluor 350、405、430、488、532、546、555、568、594、633、647、660、680、700および750であることがある。前記標識は、Cascade Blue、Marina Blue、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Oregon Green 488、Oregon Green 488−X、Pacific Blue、Rhodamine Green、Rhodol Green、Rhodamine Green−X、Rhodamine Red−XおよびTexas Red−Xであることがある。前記標識は、プローブの5’末端にあることもあり、プローブの3’末端にあることもあり、プローブの5’および3’両末端にあることもあり、またはプローブの内側にあることもある。独自の標識を使用して実験中に異なる遺伝子座各々を検出することができる。
プローブ、例えばTaqmanプローブは、クエンチャー、例えば3’クエンチャーを含むことがある。前記3’クエンチャーは、例えば、TAMARA、DABCYL、BHQ−1、BHQ−2またはBHQ−3であることがある。場合によっては、本明細書において提供する方法で使用するクエンチャーは、ブラックホールクエンチャー(BHQ)である。場合によっては、前記クエンチャーは、浅い方の溝への結合剤(minor groove binder)(MGB)である。場合によっては、前記クエンチャーは、蛍光クエンチャーである。他の場合、前記クエンチャーは、非蛍光クエンチャー(NFQ)である。
プローブは、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39もしくは40塩基長であるか、または少なくとも約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39もしくは40塩基長であり得る。プローブは、約8から約40、約10から約40、約10から約35、約10から約30、約10から約25、約10から約20、約15から約40、約15から約35、約15から約30、約15から約25、約15から約20、約18から約40、約18から約35、約18から約30、約18から約25、または約18から22塩基であることがある。
試薬および添加剤
PCR反応を行うための溶液および試薬は、緩衝剤を含むことがある。緩衝溶液は、約1、5、10、15、20、30、50、100もしくは200mMのトリス、約1、5、10、15、20、30、50、100もしくは200mMより多くのトリス、または約1、5、10、15、20、30、50、100もしくは200mM未満のトリスを含むことがある。場合によっては、塩化カリウムの濃度は、約10、20、30、40、50、60、80、100、200mMであることがあり、または約10、20、30、40、50、60、80、100、200mMより高いこともあり、または約10、20、30、40、50、60、80、100、200mM未満であることもある。緩衝溶液は、約15mMのトリスと50mMのKClを含むことがある。前記ヌクレオチドは、dATP、dCTP、dGTP、dTTPをはじめとするデオキシリボヌクレオチド三リン酸分子を、各々、約50、100、200、300、400、500、600もしくは700μMの濃度で、約50、100、200、300、400、500、600もしくは700μMより高い濃度で、または約50、100、200、300、400、500、600もしくは700μM未満の濃度で含むことがある。場合によっては、非標準ヌクレオチド、例えばdUTP、を増幅反応に、約50、100、200、300、400、500、600もしくは700、800、900もしくは1000μMの濃度、約50、100、200、300、400、500、600もしくは700、800、900もしくは1000μMより高い濃度、または約50、100、200、300、400、500、600もしくは700、800、900または1000μM未満の濃度まで添加する。場合によっては、塩化マグネシウム(MgCl2)を増幅反応に、約1.0.2.0、3.0、4.0もしくは5.0mMの濃度、約1.0.2.0、3.0、4.0もしくは5.0mMより高い濃度、または約1.0.2.0、3.0、4.0もしくは5.0mM未満の濃度で添加する。MgCl2の濃度は、約3.2mMであることがある。
PCR反応を行うための溶液および試薬は、緩衝剤を含むことがある。緩衝溶液は、約1、5、10、15、20、30、50、100もしくは200mMのトリス、約1、5、10、15、20、30、50、100もしくは200mMより多くのトリス、または約1、5、10、15、20、30、50、100もしくは200mM未満のトリスを含むことがある。場合によっては、塩化カリウムの濃度は、約10、20、30、40、50、60、80、100、200mMであることがあり、または約10、20、30、40、50、60、80、100、200mMより高いこともあり、または約10、20、30、40、50、60、80、100、200mM未満であることもある。緩衝溶液は、約15mMのトリスと50mMのKClを含むことがある。前記ヌクレオチドは、dATP、dCTP、dGTP、dTTPをはじめとするデオキシリボヌクレオチド三リン酸分子を、各々、約50、100、200、300、400、500、600もしくは700μMの濃度で、約50、100、200、300、400、500、600もしくは700μMより高い濃度で、または約50、100、200、300、400、500、600もしくは700μM未満の濃度で含むことがある。場合によっては、非標準ヌクレオチド、例えばdUTP、を増幅反応に、約50、100、200、300、400、500、600もしくは700、800、900もしくは1000μMの濃度、約50、100、200、300、400、500、600もしくは700、800、900もしくは1000μMより高い濃度、または約50、100、200、300、400、500、600もしくは700、800、900または1000μM未満の濃度まで添加する。場合によっては、塩化マグネシウム(MgCl2)を増幅反応に、約1.0.2.0、3.0、4.0もしくは5.0mMの濃度、約1.0.2.0、3.0、4.0もしくは5.0mMより高い濃度、または約1.0.2.0、3.0、4.0もしくは5.0mM未満の濃度で添加する。MgCl2の濃度は、約3.2mMであることがある。
非特異的ブロッキング剤、例えばBSAまたはウシ皮膚からのゼラチンを使用することができ、その場合、ゼラチンまたはBSAは、おおよそ0.1から約0.9% w/vの濃度範囲で存在する。他の可能なブロッキング剤としては、ベータラクトグロブリン、カゼイン、ドライミルク、または他の一般的なブロッキング剤を挙げることができる。場合によっては、BSAおよびゼラチンの好ましい濃度は、約0.1% w/vである。
一部の実施形態において、増幅反応は、非特異的バックグラウンド/ブロッキング核酸(例えば、サケ精子DNA)、バイオプリザバティブ(biopreservative)(例えば、アジ化ナトリウム)、PCR増進剤(例えば、ベタイン、トリハロースなど)および阻害剤(例えば、RNAse阻害剤)をはじめとする(しかしこれらに限定されない)1つ以上の添加剤も含むことがある。前記1つ以上の添加剤としては、例えば、2−ピロリドン、アセトアミド、N−メチルピロリドン(NMP)、B−ヒドロキシエチルピロリドン(HEP)、プロピオンアミド、NN−ジメチルアセトアミド(DMA)、N−メチルホルムアミド(MMP)、NN−ジメチルホルムアミド(DMF)、ホルムアミド、N−メチルアセトアミド(NMA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ポリエチレングリコール、ベタイン、テトラメチルアンモニウムクロリド(TMAC)、7−デアザ−2’−デオキシグアノシン、ウシ血清アルブミン(BSA)、T4遺伝子32タンパク質、グリセロール、または非イオン性洗浄剤(Triton X−100、Tween 20、Nonidet P−40(NP−40)、Tween 40、SDS(例えば、約0.1%SDS))、サケ精子DNA、アジ化ナトリウム、ベタイン(N,N,N−トリメチルグリシン;[カルボキシメチル]トリメチルアンモニウム)、ホルムアミド、トレハロース、ジチオトレイトール(DTT)、ベータメルカプトエタノール(BME)、植物多糖類、またはRNase阻害剤を挙げることができる。
一部の実施形態において、増幅反応は、1つ以上の緩衝剤を含む。前記1つ以上の緩衝剤は、例えば、TAPS、ビシン、Tris、トリシン、TAPSO、HEPES、TES、MOPS、PIPES、カコジル酸塩、SSC、ADA、ACES、コラミンクロリド、アセトアミドグリシン、グリシンアミド、マレイン酸塩、リン酸塩、CABS、ピペルジン、グリシン、クエン酸塩、グリシルグリシン、リンゴ酸塩、ギ酸塩、コハク酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、ピリジン、ピペラジン、ヒスチジン、ビス−トリス、エタノールアミン、炭酸塩、MOPSO、イミダゾール、BIS−TRISプロパン、BES、MOBS、トリエタノールアミン(TEA)、HEPPSO、POPSO、ヒドラジン、Trizma(トリス)、EPPS、HEPPS、ビシン、HEPBS、AMPSO、タウリン(AES)、ホウ酸塩、CHES、2−アミノ−2−メチル−1−プロパノール(AMP)、水酸化アンモニウム、メチルアミンまたはMESを含み得る。
場合によっては、非イオン性エチレンオキシド/プロピレンオキシドブロックコポリマーを増幅反応に、約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%または1.0%の濃度で添加する。一般的なバイオサーファクタントとしては、非イオン性界面活性剤、例えば、Pluronic F−68、Tetronics、Zonyl FSNが挙げられる。Pluronic F−68が約0.5% w/vの濃度で存在することがある。
場合によっては、硫酸マグネシウムを塩化マグネシウムの代わりに類似した濃度で用いることができる。様々な供給業者からの広範な一般商用PCRバッファーを前記緩衝溶液の代わりに用いることができる。
検出
蛍光剤によって吸収され得る励起光を発生させるためのモジュールはもちろん、蛍光剤によって放射される光を検出するためのモジュールも装備した様々な検出デバイスを使用して、蛍光検出を果たすことができる。場合によっては、サンプル(例えば、液滴)をバルクで検出することができる。例えば、サンプルをプラスチックチューブに配分することができ、プラスチックチューブからのバルク(bulk)蛍光を測定する検出器の中にそれらのチューブを配置する。場合によっては、1つ以上のサンプル(例えば、液滴)を、プレート、例えば96ウェルプレートまたは384ウェルプレート、の1つ以上のウェルに分配することができ、蛍光プレート読取装置を使用して個々のウェルの蛍光を検出することができる。
蛍光剤によって吸収され得る励起光を発生させるためのモジュールはもちろん、蛍光剤によって放射される光を検出するためのモジュールも装備した様々な検出デバイスを使用して、蛍光検出を果たすことができる。場合によっては、サンプル(例えば、液滴)をバルクで検出することができる。例えば、サンプルをプラスチックチューブに配分することができ、プラスチックチューブからのバルク(bulk)蛍光を測定する検出器の中にそれらのチューブを配置する。場合によっては、1つ以上のサンプル(例えば、液滴)を、プレート、例えば96ウェルプレートまたは384ウェルプレート、の1つ以上のウェルに分配することができ、蛍光プレート読取装置を使用して個々のウェルの蛍光を検出することができる。
場合によっては、前記検出器は、個々の液滴が検出器に入り、検出を受け、その後、検出器を出る、液滴サンプルのためのハンドリング機能をさらに備える。例えば、フロー・サイトメトリー・デバイスを液滴サンプルからの蛍光検出での使用に適応させることができる。場合によっては、液滴移動を制御するためにポンプを装備したマイクロ流体デバイスを使用して、一列縦隊の液滴から蛍光を検出する。場合によっては、液滴を二次元の表面に配列し、その表面に対して検出器を移動して、単一液滴を含有する各位置での蛍光を検出する。
コンピュータ
蛍光検出データの収集後、コンピュータを使用してデータを記憶し、加工することができる。コンピュータ実行可能なロジックを利用して、バックグランド蛍光の減算、標的および/または参照配列の割り当てならびにデータの定量化などの機能を遂行することができる。コンピュータは、分子プロファイリングからの診断結果の表示、記憶、取得もしくは算出;ゲノムもしくは核酸発現分析からの生データの表示、記憶、取得もしくは算出;または本発明の方法において有用な任意のサンプルもしくは患者情報の表示、記憶、取得もしくは算出に有用であり得る。
蛍光検出データの収集後、コンピュータを使用してデータを記憶し、加工することができる。コンピュータ実行可能なロジックを利用して、バックグランド蛍光の減算、標的および/または参照配列の割り当てならびにデータの定量化などの機能を遂行することができる。コンピュータは、分子プロファイリングからの診断結果の表示、記憶、取得もしくは算出;ゲノムもしくは核酸発現分析からの生データの表示、記憶、取得もしくは算出;または本発明の方法において有用な任意のサンプルもしくは患者情報の表示、記憶、取得もしくは算出に有用であり得る。
デジタル分析
デジタル読み出しアッセイ、例えばデジタルPCR、を用いて、サンプル中の標的の分配および該標的を含有する区画の同定により標的(例えば、標的核酸配列)をカウントすることができる。デジタル読み出しは、所与の区画が関心対象の標的を含有するかどうかを特定する点で二者択一的分析であるが、標的の幾つのコピーが区画内にあるかを必ずしも示すとは限らない。例えば、2つの標的を含有する単一のポリヌクレオチドが1区画内にあることもあるが、通常の分析条件下では区画が1つの標的を含有するとしか考えない。同じポリヌクレオチド上の標的が多数の塩基対によって隔てられている場合、一部の標的核酸配列は、サンプルの精製中に断片化によって分離されることがあり−−一部の連鎖している標的核酸配列は、サンプル調製後に物理的連鎖を保てないことがある。デジタルPCRは、一般に、例えばVogelsteinおよびKinzler(1999)PNAS 96:9236−9241に、記載されている。この技術の応用としては、例えば、高分解能CNV測定、ゲノムワイド関連研究の追跡調査、細胞遺伝学分析、がん組織におけるCNV変化(alteration)、およびCNV連鎖分析が挙げられる。
デジタル読み出しアッセイ、例えばデジタルPCR、を用いて、サンプル中の標的の分配および該標的を含有する区画の同定により標的(例えば、標的核酸配列)をカウントすることができる。デジタル読み出しは、所与の区画が関心対象の標的を含有するかどうかを特定する点で二者択一的分析であるが、標的の幾つのコピーが区画内にあるかを必ずしも示すとは限らない。例えば、2つの標的を含有する単一のポリヌクレオチドが1区画内にあることもあるが、通常の分析条件下では区画が1つの標的を含有するとしか考えない。同じポリヌクレオチド上の標的が多数の塩基対によって隔てられている場合、一部の標的核酸配列は、サンプルの精製中に断片化によって分離されることがあり−−一部の連鎖している標的核酸配列は、サンプル調製後に物理的連鎖を保てないことがある。デジタルPCRは、一般に、例えばVogelsteinおよびKinzler(1999)PNAS 96:9236−9241に、記載されている。この技術の応用としては、例えば、高分解能CNV測定、ゲノムワイド関連研究の追跡調査、細胞遺伝学分析、がん組織におけるCNV変化(alteration)、およびCNV連鎖分析が挙げられる。
一般に、dPCRは、サンプルからの個々のポリヌクレオチドを空間的に孤立させる(または分配する)工程、および各区画を用いてポリメラーゼ連鎖反応を行う工程を伴うことがある。前記区画は、例えば、ウェル(例えば、マイクロウェルプレートのウェル)、キャピラリー、エマルジョンの分散相、チャンバ(例えば、小型化チャンバのアレイの中のチャンバ)、液滴、または核酸結合表面であることがある。各区画が約0、1または2個の標的ポリヌクレオチドを有するようにサンプルを配給することができる。各区画は、1区画(例えば、液滴)につき平均で標的核酸の5、4、3、2または1個未満のコピーを有することができる。場合によっては、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175または200の区画(例えば、液滴)に含まれる標的核酸のコピー数が0である。PCR増幅後、PCR産物を有するまたは有さない区画の数を計数することができる。区画の総数は、約500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、150,000、200,000、500,000、750,000もしくは1,000,000であることがあり、または約500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、150,000、200,000、500,000、750,000もしくは1,000,000より多いこともある。区画の総数は、約500から約1,000,000、約500から約500,000、約500から約250,000、約500から約100,000、約1000から約1,000,000、約1000から約500,000、約1000から約250,000、約1000から約100,000、約10,000から約1,000,000、約10,000から約100,000、または約10,000から約50,000であることがある。
1つの実施形態において、前記デジタルPCRは、液滴デジタルPCRである。液滴デジタルPCR実験の一部の実施形態では、標的ポリヌクレオチドの約0.00001、0.00005、0.00010、0.00050、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9または10個未満のコピーを検出することができる。場合によっては、標的ポリヌクレオチドの約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450または500個未満のコピーを検出する。場合によっては、本明細書に記載する液滴を1、2、3、4、5、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900または1000液滴/秒より速い速度で発生させる。
液滴デジタルPCR(ddPCR(商標))は、次世代シークエンサーまたはマイクロアレイによって同定されたコピー数変動を検証するための実際的な解決策を提供することができる。ddPCR(商標)を用いる方法は、一人の人にCNV分析のための多くのサンプル、例えば、数百ものサンプルを1回の勤務シフト中にスクリーニングする能力を授けることができる。1つの実施形態では、該標的核酸配列(例えば、第一の遺伝子)と単一コピー参照核酸配列(例えば、第二の遺伝子)の両方を検出する試薬を含むデュプレックスTaqMan(登録商標)アッセイを組み立てる前に1つ以上の制限酵素を使用して標的核酸配列のタンデムコピーを分離することを含む、ddPCR(商標)ワークフローを提供する。ddPCRを用いるときには、反応混合物を約500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、150,000、200,000、500,000、750,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000、9,000,000もしくは10,000,000ナノリットルの液滴、約500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、150,000、200,000、500,000、750,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000、9,000,000もしくは10,000,000ナノリットル未満の液滴、または約500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、150,000、200,000、500,000、750,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000、6,000,000、7,000,000、8,000,000、9,000,000もしくは10,000,000ナノリットルより大きい液滴に分配し、それらを終点までサーモサイクリングした後、分析することができる。場合によっては、前記液滴は、1ナノリットルより大きく、他の場合、前記液滴は、1ナノリットル未満(例えば、ピコリットル)である。1反応あたりの液滴の数は、約1000から約1,000,000、約1000から約750,000、約1000から約500,000、約1000から約250,000、約1000から約100,000、約1000から約50,000、約1000から約30,000、約1000から約10,000、約10,000から約1,000,000、約10,000から約750,000、約10,000から約500,000、約10,000から約250,000、約10,000から約100,000、約10,000から約50,000、または約10,000から約30,000であることがある。1反応あたりの液滴の数は、約20,000から約1,000,000、約20,000から約750,000、約20,000から約500,000、約20,000から約250,000、約20,000から約200,000、約20,000から約50,000、約50,000から約100,000、約50,000から約200,000、または約50,000から約300,000であることがある。
分析を2色読取装置で行うことができる。陽性にカウントされる液滴の画分により、標的および参照核酸配列(例えば、遺伝子)の絶対濃度を測定することが可能になり得る。この情報を用いて、相対コピー数を決定することができる。例えば、1ウェルにつき少なくとも20,000のPCR複製は、高次のコピー数差を解明するための統計的検出力をもたらすことができる。この低コスト法は、隣接コピー数状態のオーバラップなしに整数にわたる95%信頼区間を有するコピー数測定値を確実に生じさせることができる。この技術は、コピー数変動に関する連鎖を決定することができ、この技術を用いて、遺伝子コピーが同じ染色体上にあるのか、または異なる染色体上にあるのかを決定することができる。
前記容積は、任意の好適なサイズを有し得る。一部の実施形態において、前記容積は、約10から1000マイクロメートルの直径または特徴的断面寸法を有することがある。
分配される核酸は、任意の好適な特徴を有することができる。前記核酸としては、数ある中でも、被験体の遺伝物質(例えば、被験体のゲノムDNAおよび/またはRNA)、被験体のメッセンジャーRNA、および/または被験体のRNAに由来するcDNAを挙げることができる。前記核酸は、任意の好適な平均長を有することができる。一般に、前記平均長は、染色体上の分析すべき多型性遺伝子座間の距離より実質的に長い。この平均長では、被験体内で連鎖している対立遺伝子が、多くの場合、単離された核酸においても連鎖しており、したがって、水性相に分配したときに同じ容積に一緒に分布する傾向がある。一部の実施形態において、各プライマーセットは、多型性遺伝子座から少なくとも一対の別個の対立遺伝子を増幅させることが可能であり得る。
任意の好適な平均核酸濃度を含有するように各体積を分配することができる。一般に、水性相中での好適な出発核酸濃度と併用で、前記分配プロセスは、1容積につき平均で約数ゲノム当量未満の核酸を有する容積を生じさせる。前記方法を、1容積につき平均で1ゲノム当量より多い当量(例えば、1容積につき約2ゲノム当量)で行うことができるが、1容積につき平均で約1ゲノム当量未満に濃度を限定することにより、分析は、一般に、より効率的になり、より信頼性が高くなり、バックグラウンドを殆ど伴わない。したがって、各容積は、各多型性遺伝子座を含む標的領域の平均約1個未満のコピーもしくは分子、および/または各多型性遺伝子座の任意の対立遺伝子配列の平均で約1個未満のコピーを含有し得る。
統合高速フロースルー・サーマルサイクラ・デバイスを、本明細書に記載する方法において使用することができる。例えば、2009年9月23日出願の国際出願第PCT/US2009/005317号パンフレットを参照されたし。かかる統合デバイスでは、2、3または4つの温度ゾーンを保持するシリンダーの周囲にキャピラリーが巻き付いている。液滴は、そのキャピラリーを通って流れるにつれて、異なる温度ゾーンにさらされて、熱サイクリングを果たす。液滴が各温度ゾーンに入ると、その小容積の各液滴が超高速温度転移を生じさせる。
本明細書に記載する方法、組成物およびキットと共に使用するためのデジタルPCRデバイス(例えば、液滴デジタルPCRデバイス)は、複数のシグナルを検出することができる(例えば、その全体が参考として本明細書に援用されている、2011年3月18日出願の米国仮特許出願第61/454,373号を参照されたし)。
液滴デジタルPCRは、毎秒数千もの別個の強健なな微小液滴リアクターの生成を伴うことができる。ddPCRは、研究者が直ちにアクセスできるデジタルデータを作成することができるインストールベース計器を備えた標準的熱サイクリングを伴うことができる。各液滴の迅速な照合により、最初のサンプル中に存在する標的分子のカウントを得ることができる。
図16は、ddPCR実験についての一般的ワークフローの一例を図示する。図16に示すように、このプロセスは、サンプルを複数の区画(例えば、液滴)に分配する工程によって開始し、サーマルサイクラにおけるそのサンプルの熱サイクリングがそれに続く。その後、読取装置(例えば、光学読取装置)を使用して液滴の蛍光を検出することができる。
液滴発生
本開示は、液滴デジタルPCRを使用する組成物および方法を含む。本明細書に記載する液滴は、米国特許第7,622,280号明細書に記載されているエマルジョン組成物(または2つ以上の不混和性流体の混合物)、および2009年9月23日出願の国際出願第PCT/US2009/005317号パンフレットに記載されているデバイスによって発生される液滴を含む。本明細書において用いる場合、用語エマルジョンは、不混和性液体(例えば、油と水)の混合物を指し得る。油相および/または油中水型エマルジョンは、水性液滴内の反応混合物のコンパートメント形成を可能にする。前記エマルジョンは、連続油相内に水性液滴を含むことができる。本明細書において提供するエマルジョンは、液滴が連続水性相中の油滴である水中油型エマルジョンであることがある。各コンパートメントが、その内容物を蒸発しないようにおよび他のコンパートメントの内容物と合体しないように保護することで、コンパートメント間での混合を防止するように、本明細書において提供するエマルジョンを設計する。
本開示は、液滴デジタルPCRを使用する組成物および方法を含む。本明細書に記載する液滴は、米国特許第7,622,280号明細書に記載されているエマルジョン組成物(または2つ以上の不混和性流体の混合物)、および2009年9月23日出願の国際出願第PCT/US2009/005317号パンフレットに記載されているデバイスによって発生される液滴を含む。本明細書において用いる場合、用語エマルジョンは、不混和性液体(例えば、油と水)の混合物を指し得る。油相および/または油中水型エマルジョンは、水性液滴内の反応混合物のコンパートメント形成を可能にする。前記エマルジョンは、連続油相内に水性液滴を含むことができる。本明細書において提供するエマルジョンは、液滴が連続水性相中の油滴である水中油型エマルジョンであることがある。各コンパートメントが、その内容物を蒸発しないようにおよび他のコンパートメントの内容物と合体しないように保護することで、コンパートメント間での混合を防止するように、本明細書において提供するエマルジョンを設計する。
本明細書に記載する混合物またはエマルジョンは、安定していることもあり、または不安定であることもある。前記エマルジョンは、比較的安定していて合体が最少であり得る。小液滴が結合して漸進的により大きなものを形成すると、合体が起こる。場合によっては、液滴発生器から発生した液滴の約0.00001%、0.00005%、0.00010%、0.00050%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、6%、7%、8%、9%または10%未満が他の液滴と合体する。前記エマルジョンにはフロック形成(分散相がフレーク状で懸濁液から出てくるプロセス)も僅かであり得る。
本明細書に記載の小反応容積へのサンプルの分割は、低減量の試薬の使用を可能にすることができ、それによって、分析の材料費を低下させることができる。分配によりサンプルの複雑さを低減させることで、検出のダイナミックレンジを向上させることもできる。なぜなら、より存在量の高い分子を存在量の低い分子から別のコンパートメントに分けることにより、より存在量が低い分子が反応試薬により大きな比率で接近することができるようになり、その結果、より存在量が低い分子の検出が増進されるからである。
約0.001、0.01、0.05、0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150、160、180、200、300、400もしくは500マイクロメートルの、約0.001、0.01、0.05、0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150、160、180、200、300、400もしくは500マイクロメートル未満の、または約0.001、0.01、0.05、0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、100、120、130、140、150、160、180、200、300、400もしくは500マイクロメートルより大きい平均直径を有する液滴を発生させることができる。液滴は、約0.001から約500、約0.01から約500、約0.1から約500、約0.1から約100、約0.01から約100、または約1から約100マイクロメートルの平均直径を有することもある。マイクロチャネルクロスフローフォーカシング(microchannel cross−flow focusing)または物理的撹拌を用いるエマルジョン液滴の生成のマイクロ流体方法が単分散エマルジョンまたは多分散エマルジョンのいずれかを生成することは公知である。前記液滴は、単分散液滴であることがある。前記液滴を該液滴のサイズが該液滴の平均サイズのプラスマイナス5%より大きく変動しないように発生させることができる。場合によっては、前記液滴を、該液滴のサイズが該液滴の平均サイズのプラスマイナス2%より大きく変動しないように発生させることができる。液滴発生器は、液滴の全集団の平均サイズのプラスマイナス約0.1%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%または10%より大きくサイズが変動する液滴のない液滴の集団を、単一サンプルから発生することができる。
より高い機械的安定性は、マイクロ流体操作およびより高剪断の流体加工(例えば、マイクロ流体キャピラリーでの、または流路の90℃の曲り角、例えば弁、を通るもの)に有用であり得る。プレおよびポスト熱処理液滴またはカプセルは、標準的ピペット操作および遠心分離に対して機械的安定であり得る。
水性サンプルに油相を流すことにより液滴を形成することができる。前記水性相は、PCR反応を行うための緩衝溶液および試薬(ヌクレオチド、プライマー、蛍光検出用のプローブ(単数または複数)、テンプレート核酸、DNAポリメラーゼ酵素、および必要に応じてリバーストランスクリプターゼ酵素を含む)を含むことがある。
前記水性相は、本明細書に記載する1つ以上の緩衝液および/または添加剤を含むことがある。
前記水性相中の増幅用プライマーは、約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7もしくは2.0μMの濃度、約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7もしくは2.0μMより高い濃度、または約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.5、1.7もしくは2.0μM未満の濃度を有することがある。前記水性相中のプライマー濃度は、約0.05から約2、約0.1から約1.0、約0.2から約1.0、約0.3から約1.0、約0.4から約1.0、または約0.5から約1.0μMであることがある。前記プライマーの濃度は、約0.5μMであることがある。前記水性相は、蛍光検出用の1つ以上のプローブを、約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8もしくは2.0μMの濃度、約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8もしくは2.0μMより高い濃度、または約0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8もしくは2.0μM未満の濃度で含むことがある。前記水性相は、蛍光検出用の1つ以上のプローブを約0.05から約2.0、約0.1から約2.0、約0.25から約2.0、約0.5から約2.0、約0.05から約1、約0.1から約1、または約0.1から約0.5μMの濃度で含むことがある。前記蛍光検出用のプローブの濃度は、約0.25μMであることがある。PCRにおける標的核酸濃度に適用できる範囲は、約1pgと約500ngの間である。
前記油相は、フッ素化された基油を含み、過フッ素化ポリエステルなどのフッ素化界面活性剤との併用によりこの基油をさらに安定させることができる。場合によっては、前記基油は、HFE 7500、FC−40、FC−43、FC−70または別の一般的なフッ素化油のうちの1つ以上であり得る。場合によっては、アニオン性界面活性剤は、Ammonium Krytox(Krytox−AM)、Krytox FSHのアンモニウム塩、またはKrytox−FSHのモルホリノ誘導体である。Krytox−ASは、約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%もしくは4.0% w/wの濃度、約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%もしくは4.0% w/wより高い濃度、または約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%もしくは4.0% w/w未満の濃度で存在することがある。一部の好ましい実施形態において、Krytox−ASの濃度は、1.8%である。他の好ましい実施形態において、Krytox−ASの濃度は、1.62%である。Krytox−FSHのモルホリノ誘導体は、約0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%もしくは4.0% w/wの濃度で存在することがある。Krytox−FSHのモルホリノ誘導体の濃度は、約1.8%であることがある。Krytox−FSHのモルホリノ誘導体の濃度は、約1.62%であることがある。
前記油相は、油の特性、例えば蒸気圧または粘度または表面張力、を調整するための添加剤をさらに含むことがある。非限定的な例としては、ペルフルオロオクタノールおよび1H,1H,2H,2H−ペルフルオロデカノールが挙げられる。1H,1H,2H,2H−ペルフルオロデカノールを約0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%、2.25%、2.50%、2.75%もしくは3.00% w/wの濃度、約0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%、2.25%、2.50%、2.75%もしくは3.00% w/wより高い濃度、または約0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、1.00%、1.25%、1.50%、1.75%、2.00%、2.25%、2.50%、2.75%もしくは3.00% w/w未満の濃度まで添加することができる。1H,1H,2H,2H−ペルフルオロデカノールを約0.18% w/wの濃度まで添加することができる。
前記エマルジョンを配合して、液体様界面膜を有する高単分散液滴を生成することができ、該液滴を加熱によって固体様界面膜を有するマイクロカプセルに変換することができる。かかるマイクロカプセルは、PCR増幅などの反応プロセスを通してそれらの内容物を保持することができるバイオリアクターとして動作することができる。マイクロカプセル形態への変換を加熱によって行うことができる。例えば、かかる変換を約50、60、70、80、90または95℃より高い温度で行うことができる。場合によっては、サーモサイクラを使用してこの加熱を行う。加熱プロセスの間、流体または鉱油オーバーレイを使用して蒸発を防止することができる。加熱前に過剰な連続相油を除去してもよいし、またはしなくてもよい。これらの生体適合性カプセルは、広範な熱的および機械的加工にわたって耐合体性および/または耐フロック形成性であり得る。
変換後、これらのカプセルを約3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35もしくは40℃で、約3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35もしくは40℃より上で、または約3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35もしくは40℃未満で保管することができる。前記カプセルは、生物医学的応用、例えば、高分子の安定なデジタル化されたカプセル化、特に、核酸もしくはタンパク質の混合物を含有する、または両方を一緒に含有する水性生体液;薬物およびワクチン送達;生体分子ライブラリー;臨床画像診断応用ならびにその他に有用であり得る。
前記マイクロカプセルは、1つ以上のポリヌクレオチドを含有することができ、特に高温で、合体に耐性であり得る。したがって、PCR増幅反応を非常に高密度(例えば、1単位容積あたりの反応の数)でおこなうことができる。場合によっては、1mLあたりで約100,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、2,500,000、5,000,000または10,000,000より多くの別々の反応を行うことができる。場合によっては、複数の反応を単一のウェル、例えばマイクロタイタープレートのウェルで、反応容積間の相互混合なく、行うことができる。前記マイクロカプセルは、PCR反応の発生を可能にするのに必要な他の成分、例えばプライマー、プローブ、dNTP、DNAまたはRNAポリメラーゼなど、も含有することがある。これらのカプセルは、広範な熱的および機械的プロセッシングにわたって耐合体性および耐フロック形成性を呈示する。
1つの実施形態では、DNAのサイズを低減させた後、例えば、消化、熱処理または剪断によって、液滴発生を向上させることができる。
図17は、a)側部からの油の流入によって液滴を狭窄させる場合の液滴形成、およびb)液滴をバルク流体から引き離す場合の伸長/局部絞りを示す、幾つかの液滴画像を表示する。
図18は、増大するDNA負荷量の影響を示す。図18は、流量に対して最大伸長をプロットしている。液滴がちょうど離れるときのクロスの中心からその液滴の最も遠い範囲までの伸長を測定する。ある程度の液滴伸長は許容され得るが、それが過剰になると、液滴をバルク流体につなぐ長い「糸」が引き出される。液滴が離れると、この糸はつぶれて微小液滴になって、望ましくない多分散性をもたらし得る。極端な場合、液滴は離れず、その代り、水性相が連続相としてチャネルの中央を流下し、その一方で油はチャネル壁に沿って流れるので、液滴は形成されない。
伸長を減少させる1つの方法は、流量を減少させることである。流量の減少は、より低い処理能力およびまた液滴サイズ増大という望ましくな副作用を有することがある。紫(B)、緑色がかった青(E)および緑(A)の曲線は、ゼロDNAを有する。これらのサンプルは、チャネルへのそれらの伸長を実質的に増大することなく高い流量を許容することができる。
青(D)、橙(F)および赤(C)の曲線は、より高いDNA負荷量を有する。これらの条件については、より高い流量がチャネルへの液滴伸長を生じさせる。低流量を用いて、過剰な液滴伸長を回避することができる。
図19は、液滴特性を調査するための実験における未消化サンプル1〜10および消化サンプル11〜20を示す。DNA負荷量を最も右の列に示し、圧力(流量にほぼ比例)を第二行に示す。この表は、色分けされており、文字をコードしている:J(赤)は噴出を示し、E(黄)は伸長を示し、およびN(緑)は正常な(噴出および伸長のない)液滴発生を示す。認めることができるように、(制限酵素での)消化は、高DNA負荷量および高流量においてさえ、液滴発生を向上させる結果となった。
図19は、液滴特性を調査するための実験における未消化サンプル1〜10および消化サンプル11〜20を示す。DNA負荷量を最も右の列に示し、圧力(流量にほぼ比例)を第二行に示す。この表は、色分けされており、文字をコードしている:J(赤)は噴出を示し、E(黄)は伸長を示し、およびN(緑)は正常な(噴出および伸長のない)液滴発生を示す。認めることができるように、(制限酵素での)消化は、高DNA負荷量および高流量においてさえ、液滴発生を向上させる結果となった。
応用
本明細書に記載する方法を障害または疾患の診断または予後判定のために使用することができる。
本明細書に記載する方法を障害または疾患の診断または予後判定のために使用することができる。
本明細書において提供する方法および組成物は、ヒト被験体と非ヒト被験体の両方に有用であり得る。本明細書において提供する方法および組成物の応用は非常に多い;例えば、高分解能CNV測定、ゲノムワイド関連研究の追跡調査、細胞遺伝学分析、がん組織におけるCNV変化、CNV連鎖分析、ならびにハプロタイプ分析。
本明細書において提供する応用は、胎児または胚の遺伝子の特徴の診断、予測、決定または評価のための応用を含む。場合によっては、これらの応用は、体外受精または他の生殖補助医療(Assisted Reproductive Technology)によって生成された胚中の核酸を診断、予測、決定または評価するために用いることができる。さらに、本明細書において提供する方法は、発育中の胎児のゲノム内のCNVまたは遺伝学的フェージングを評価するための情報を出産を控えた両親(例えば、妊婦)に提供するために用いることができる。他の場合、本明細書において提供する方法は、未来の子孫の可能性ある遺伝性状に関する両親への助言に役立てるために用いることができる。場合によっては、前記方法を生殖補助医療と併用することができる。例えば、体外受精によって生成された胚から採取したサンプルにおけるCNVまたは遺伝学的フェージングを評価するためにその情報を用いることができる。
がん細胞では1つ以上のCNVを見出すことができる。例えば、非小細胞肺がんではEGFRコピー数が増加され得る。CNVを治療の効力と関連づけることができる。例えば、HER2遺伝子コピー数増加は、進行非小細胞肺がんでのゲフィチチブ療法への応答を強化することができる。Cappuzzo F.ら(2005)J.Clin.Oncol.23:5007−5018を参照されたし。高EGFR遺伝子コピー数により、ラパチニブおよびカペシタビンへの感受性増加を予測することができる。Fabiら(2010)J.Clin.Oncol.28:15s(2010 ASCO Annual Meeting)を参照されたし。高HGFR遺伝子コピー数は、セツキシマブおよびパニツムマブへの感受性増加と関連づけられる。
1つの実施形態では、本明細書に記載する方法を用いて標的配列のコピーの数を決定する工程、および該決定に基づいて治療法を設計する工程を含む方法を提供する。1つの実施形態において、前記標的はEGFRであり、前記治療法は、セツキシマブ、パニツムマブ、ラパチニブおよび/またはカペシタビンの投与を含む。もう1つの実施形態において、前記標的はERBB2であり、前記治療法は、トラスツズマブ(Herceptin)を含む。
コピー数変動は、ヒト間の遺伝的バリエーションの一因となり得る。例えば、Shebat J.ら(2004)Science 305:525−528を参照されたし。
コピー数変動と関連づけられる疾患としては、例えば、ディジョージ/口蓋心顔面症候群(22q11.2欠失)、プラダー・ウィリー症候群(15q11−q13欠失)、ウィリアムズ・ビューレン症候群(7q11.23欠失)、ミラー・ディーカー症候群(MDLS)(17p13.3微小欠失)、スミス・マゲニス症候群(SMS)(17p11.2微小欠失)、神経線維腫症1型(NF1)(17q11.2微小欠失)、Phelan−McErmid症候群(22q13欠失)、レット症候群(X染色体q28上のMECp2の機能喪失型変異)、メルツバッハー病(PLP1のCNV)、脊髄性筋萎縮症(SMA)(第5染色体q13上のテロメアSMN1のホモ接合不在)、ポットキ・ラプスキ症候群(PTLS、第17染色体p.11.2の重複)を挙げることができる。PMP22遺伝子の追加のコピーをシャルコー・マリー・トゥース・ニューロパチーIA型(CMT1A)および圧迫性麻痺傾向を伴う遺伝性ニューロパチー(HNPP)と関連づけることができる。本明細書に記載するCNVの検出方法は、本明細書に記載するおよび参照により援用されている出版物に記載されているCNV障害を診断するために使用することができる。前記疾患は、Lupski J.(2007)Nature Genetics 39:S43−S47に記載されている疾患であり得る。
異数性(aneuploides)、例えば、胎児異数性としては、例えば、13トリソミー、18トリソミー、21トリソミー(ダウン症候群)、クラインフェルター症候群(XXY)、1つ以上の染色体のモノソミー(X染色体モノソミー、ターナー症候群)、Xトリソミー、1つ以上の染色体のトリソミー、1つ以上の染色体のテトラソミーまたはペンタソミー(例えば、XXXX、XXYY、XXXY、XYYY、XXXXX、XXXXY、XXXYY、XYYYYおよびXXYYY)、三倍体性(すべての染色体が3つ、例えば、ヒトの場合は69染色体)、四倍体性(すべての染色体が4つ、例えば、ヒトの場合は92染色体)、および多倍体性を挙げることができる。一部の実施形態において、異数性は、部分異数性(segmental aneuploidy)であることがある。部分異数性としては、例えば、1p36重複、dup(17)(p11.2p11.2)症候群、ダウン症候群、ペリツェウス・メルツバッヘル病、dup(22)(q11.2q11.2)症候群、およびネコ眼症候群を挙げることができる。場合によっては、異常遺伝子型、例えば、胎児の遺伝子型は、性染色体または常染色体の1つ以上の欠失に起因し、この欠失は、ネコ鳴き症候群、ウォルフ・ヒルシュホーン、ウィリアムズ・ビューレン症候群、シャルコー・マリー・トゥース病、圧迫性麻痺傾向を伴う遺伝性ニューロパチー、スミス・マゲニス症候群、神経線維腫症、アラジール症候群、口蓋心顔面症候群、ディジョージ症候群、ステロイドスルファターゼ欠損症、カルマン症候群、線状皮膚欠損を伴う小眼球症、副腎低形成、グリセロールキナーゼ欠損症、ペリツェウス・メルツバッヘル病、Y上の精巣決定因子、無精子症(Azospermia)(a因子)、無精子症(b因子)、無精子症(c因子)、または1p36欠失などの状態を生じさせる結果となり得る。一部の実施形態において、染色体数の減少は、XO症候群を生じさせる結果となる。
過剰なゲノムDNAコピー数変動がリー・フラウメニがん素因症候群において見出された(Shlienら(2008)PNAS 105:11264−9)。CNVは、CHARGE(コロボーム、心奇形、後鼻腔閉鎖、遅延、性器、および耳奇形)、ピータース・プラス、ピット・ホプキンス、および血小板減少・橈骨欠損症候群(例えば、Ropers HH(2007) Am J of Hum Genetics 81:199−207を参照されたし)をはじめとする、先天異常症候群に関連づけられる。コピー数変動とがんの関係は、例えば、Shlien A.およびMalkin D.(2009)Genome Med.1(6):62に記載されている。コピー数変動は、例えば、自閉症、統合失調症および特発性学習障害と関連づけられる。例えば、Sebat J.ら(2007)Science 316:445−9;Pinto J.ら(2010)Nature 466:368−72;Cook E.H.およびScherer S.W.(2008)Nature 455:919−923を参照されたし。
コピー数変動を一定の治療法に対するがん患者の耐性と関連づけることができる。例えば、チミジル酸シンターゼの増幅は、転移性結腸直腸がん患者において5−フルオロウラシル処置に対する耐性をもたらす結果となり得る。Wangら(2002)PNAS USA、第99巻、pp.16156−61を参照されたし。
CCL3L1の高コピー数は、HIV感染へのより低い感受性と関連づけられる(Gonzalez E.ら(2005)Science 307:1434−1440)。FCGR3B(CD16細胞表面免疫グロブリン受容体)の低コピー数は、全身性エリテマトーデスへの感受性を増大させ得る(Aitman T.J.ら(2006)Nature 439:851−855)。常染色体優性小耳症は、第4染色体p16でのコピー数可変領域の5個のタンデムコピーに関連していることが判明した(Balikova I.(2008)Am J. Hum Genet.82:181−187)。本明細書に記載する方法、組成物およびキットは、これらの状態のいずれかを調査するためにも使用することができる。
高デンプン食を摂る集団からの個体は、一般に、低デンプン食を摂る集団からの個体より多いアミラーゼ遺伝子(AMY1)コピーを有する(Perry H.ら(2007)Nature Genetics 39:1256−1260)。したがって、コピー数は、進化中に陽性選択を受け得る。本明細書に記載する方法、組成物およびキットは、進化の研究に用いることができる。
疾患と関連づけられるコピー数変動の他の例としては、例えば、21トリソミー(ダウン症候群)、18トリソミー(エドワード症候群)および13トリソミー(パトー症候群)が挙げられる。
核酸が連鎖しているのか、または分離している(フラグメント化されている)のかを決定することで、様々な応用のための有用な情報を提供することができる。例えば、本明細書に記載する方法は、障害または疾患、例えば、遺伝性障害を診断または予後判定するために用いることができる。本明細書に記載する方法は、胎児の障害、例えば、胎児の異数性を診断および予後判定するために用いることができる。
本明細書に記載する方法は、感染、例えば、ウイルスまたは細菌感染を評価するのに有用であり得る。例えば、前記方法は、2つの変異が単一のウイルスもしくは細菌内に存するかどうか、または2つ以上の変異が異なる個体のウイルスもしくは細菌内にあるかどうかを決定するために用いることができる。
本明細書に記載する方法は、トランスジェニックマウスの産生をモニターするのに有用であり得る。例えば、前記方法は、導入遺伝子がトランスジェニック生物のゲノムに1回導入されたのか、複数回導入されたのかを決定するために用いることができる。
アポトーシス
核酸が連鎖しているのか、または分離している(フラグメント化されている)のかの決定を、アポトーシスを研究するために、またはアポトーシスに関係する疾患を診断もしくは予後判定するために用いることができる。アポトーシスは、プログラムされた細胞死の過程である。アポトーシスの徴候としては、例えば、小疱形成、細胞膜非対称性および付着の喪失、細胞収縮、核断片化、染色質凝縮、ならびに染色体DNA断片化を挙げることができる。アポトーシス中、内因性エンドヌクレアーゼ(例えば、Ca2+およびMg2+依存性エンドヌクレアーゼ)は、染色質DNAを約180〜200塩基対のヌクレオソーム間断片または約180〜200塩基対の集まりに開裂させることができる。本明細書に記載する方法、組成物および/またはキットを使用して、異なるアポトーシス期の異なる形態の遺伝物質の断片化状態を決定することができる。本明細書に記載する方法は、例えばフローサイトメトリー、蛍光アッセイまたは(TUNEL)(ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング)をはじめとする1つ以上の他のアポトーシス分析方法と共に用いることができる。
核酸が連鎖しているのか、または分離している(フラグメント化されている)のかの決定を、アポトーシスを研究するために、またはアポトーシスに関係する疾患を診断もしくは予後判定するために用いることができる。アポトーシスは、プログラムされた細胞死の過程である。アポトーシスの徴候としては、例えば、小疱形成、細胞膜非対称性および付着の喪失、細胞収縮、核断片化、染色質凝縮、ならびに染色体DNA断片化を挙げることができる。アポトーシス中、内因性エンドヌクレアーゼ(例えば、Ca2+およびMg2+依存性エンドヌクレアーゼ)は、染色質DNAを約180〜200塩基対のヌクレオソーム間断片または約180〜200塩基対の集まりに開裂させることができる。本明細書に記載する方法、組成物および/またはキットを使用して、異なるアポトーシス期の異なる形態の遺伝物質の断片化状態を決定することができる。本明細書に記載する方法は、例えばフローサイトメトリー、蛍光アッセイまたは(TUNEL)(ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング)をはじめとする1つ以上の他のアポトーシス分析方法と共に用いることができる。
アポトーシスは、外因性もしくはデス受容体経路を伴うことがあり、または内因性もしくはミトコンドリア経路を伴うことがあり、ならびに/またはT細胞媒介細胞傷害性およびパーフォリン−グランザイム依存性細胞死を伴う経路を伴うことがある。デス受容体経路は、デスリガンドのデス受容体への結合を含むことがある(例えば、FasL(脂肪酸シンセターゼリガンド、TNFSF6、Apo1、アポトーシス抗原リガンド1、CD95L、CD178、APT1LG1)/FasR(脂肪酸シンセターゼ受容体、TNFRSF6、ATP1、CD95);TNF−α(腫瘍壊死因子アルファ、TNFリガンド、TNFA、カケクチン)/TNFR1(腫瘍壊死因子受容体1、TNF受容体、TNFRSF1A、p55 TNFR、CD120a);Apo3L(Apo3リガンド、TNFSF12、Apo3リガンド、TWEAK、DR3LG)/DR3(デス受容体3、TNFRSF12、Apo3、WSL−1、TRAMP、LARD、DDR3);Apo2L(Apo2リガンド、TNFSF10、TRAIL、TNF関連アポトーシス誘導性リガンド)/DR4(デス受容体4、TNFRSF10A、TRAILR1、APO2);ならびにApo2L/DR5(デス受容体5、TNFRS10B、TRAIL−R2、TRICK2、KILLER、ZTNFR9)。TNF受容体は、システインリッチ細胞外ドメインおよび細胞質「デスドメイン」を含むことができる。Fas受容体へのFasの結合は、FADDアダプタータンパク質の結合を生じさせる結果となり得る。TNF受容体へのTNFリガンドの結合は、TRADD(TNF受容体関連デスドメイン)アダプタータンパク質の結合、ならびにFADD(Fas関連デスドメイン、MORT1)およびRIP(受容体相互作用性タンパク質、RIPK1)の動員を生じさせる結果となり得る。そのとき、FADDは、デスエフェクタードメインとの二量体化によってプロカスパーゼ−8と会合してデス誘導シグナル伝達複合体(DISC)を形成することができる。この作用は、プロカスパーゼ−8の自己触媒性活性化を生じさせる結果となり得る。カスパーゼ−8の活性化は、以下に記載するアポトーシスの「実行フェーズ」を生じさせる結果となり得る。
デス受容体媒介アポトーシスは、FADDに結合し得るcFLIP(Casper、I−FLICE、FLAME−1、CASH、CLARP、MRIT)およびカスパーゼ−8(FLICE、FADD様Ice、Mach−1、Mch5)によって阻害され得る。Tosoは、T細胞におけるFas誘導アポトーシスをカスパーゼ−8プロセッシングの阻害によって阻止することができる。
パーフォリン/グランザイム経路において、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)は、膜貫通型細孔形成分子であるパーフォリンを分泌し、その後、その細孔を通して細胞質顆粒を標的細胞に放出することにより、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞を死滅させることができる。セリンプロテアーゼであるグランザイムAおよびグランザイムBは、前記顆粒の成分であり得る。グランザイムBは、プロカスパーゼ−10を開裂させ、それによってそれを活性化することができ、かつICAD(カスパーゼ活性化DNAseのインヒビター)を開裂させることができる。グランザイムBは、Bidを開裂させることおよびシトクロムc放出を誘導することによりミトコンドリア経路において役割を果たすことができる。グランザイムBはまた、カスパーゼ−3を直接活性化することができる。グランザイムAは、DNAse NM23−H1を介してDNAニッキングを活性化することができ、そのNM23−H1はSET複合体によって阻害することができる。グランザイムAは、SET複合体を開裂させてNM23−H1の阻害を解除することができる。
内因性アポトーシス経路は、非受容体媒介刺激を有し得、この刺激は、陽性様式で作用することもあり、または陰性様式で作用することもある。例えば、一定の因子(例えば、成長因子、ホルモン、サイトカイン)の不在がアポトーシスを誘導することができる。陽性の様式で作用することができる刺激としては、例えば、放射線、フリーラジカル、ウイルス感染、毒素、低酸素、および高体温が挙げられる。これらの刺激は、ミトコンドリア透過性遷移(MPT)細孔の開口、ミトコンドリア膜内外電位差の喪失、および膜間腔からサイトゾルへのアポトーシス促進タンパク質の放出を生じさせ得る。放出されるタンパク質の1つ群は、シトクロムc、Smac/DIABLO、およびセリンプロテアーゼHtrA2/Omiを含み、これらは、カスパーゼ依存性ミトコンドリア経路を活性化することができる。シトクロムcは、Apaf−1およびプロカスパーゼ−9を結合し、活性化して、アポトソームを形成することができ、ならびにカスパーゼ−9を活性化することができる。Smac/DIABLOおよびHtrA2/Omiは、IAP(アポトーシスタンパク質のインヒビター)を阻害することにより、アポトーシスを促進することができる。アポトーシス促進タンパク質の2番目の群、AIF、エンドヌクレアーゼGおよびCADは、アポトーシス中にミトコンドリアによって放出され得る。AIFは、核に移動することができ、DNAを約50から約300kbの小片に断片化させることができる。AIFは、末梢核染色質の凝縮(「第I期」凝縮)を生じさせることができる。エンドヌクレアーゼGは、核に移動し、そこで核染色質を開裂させてオリゴヌクレオソームDNA断片を形成することができる。AIFおよびエンドヌクレアーゼGは、カスパーゼとは無関係に機能することができる。CADは、ミトコンドリアにより放出され、核に移動することができ、そこでオリゴヌクレオソームDNA断片化および高度の染色質凝縮(「第II期」凝縮)をもたらすことができる。
タンパク質のBcl−2ファミリーは、ミトコンドリア膜透過性を調節することができる。Bcl−2ファミリータンパク質は、アポトーシス促進性であることもあり、抗アポトーシス性であることもある。抗アポトーシスタンパク質としては、Bcl−2、Bcl−x、Bcl−XL、Bcl−XS、Bcl−2およびBACが挙げられる。アポトーシス促進タンパク質としては、例えば、Bcl−10、Bax、Bak、Bid、Bad、Bim、BikおよびBlkが挙げられる。タンパク質のBcl−2ファミリーは、ミトコンドリア膜透過性の改変によりミトコンドリアからのシトクロムc放出を調節することができる。タンパク質14−3−3は、Badのリン酸化状態に基づいてBadを調節することができる。
Badは、Bcl−XIまたはBcl−2とヘテロ二量体化することができ、これは、それらの保護作用を中和し、細胞死を促進することができる。Bcl−2およびBcl−XIがBadによって隔離されない場合、Bcl−2およびBcl−XIは、ミトコンドリアからのシトクロムc放出を防止することができる。Bcl−XIおよびApaf−1へのAvenの結合は、プロカスパーゼ−9の活性化を防止することができる。
他のBcl2ファミリーメンバーとしては、PumaおよびNoxaが挙げられる。PumaおよびNoxaは、p53媒介アポトーシスにおいて役割を果たすことができる。また、MYCは、p53依存的および非依存的様式でアポトーシスを調節することができる。
デス受容体経路(外因性)およびミトコンドリア経路(内因性)は、実行フェーズで終了し得る。カスパーゼ−3、カスパーゼ−6、およびカスパーゼ−7は、実行カスパーゼとして機能することができ、PARP、サイトケラチン、フォドリン、NuMA、ゲルソリンおよびその他をはじめとする基質を開裂させることができる。カスパーゼ−3は、開始因子のカスパーゼ、例えば、カスパーゼ−8、カスパーゼ−9またはカスパーゼ−10によって活性化され得る。カスパーゼ−3は、エンドヌクレアーゼCADを、その阻害剤、ICAD、を開裂させることによって活性化することができる。CADは、核内の染色体DNAを分解し、染色質凝縮を生じさせることができる。アポトーシスは、アポトーシス細胞の食作用性取り込みを伴うことがあり、これは、リン脂質非対称性の認識およびホスファチジルセリンの外在化を伴い得る。
アポトーシスの概観は、例えば、Elmore S.(2007)Apoptosis:A Review of Programmed Cell Death.Toxicologic pathology 35:495−516(その全体が参考として本明細書に援用されている)において見出すことができる。
本明細書に記載する方法、組成物およびキットを、自食作用中のDNA断片化を分析するために使用することができる。
チェックポイント、DNA損傷、および細胞周期
遺伝子座が連鎖しているのか、または分離している(フラグメント化されている)のかの決定を、DNA損傷修復、二本鎖切断修復、相同組換え、マイクロホモロジー媒介末端結合、一本鎖アニーリング(SSA)、切断誘導複製、または非相同末端結合(NHEJ)を研究するために用いることができる。本明細書に記載する方法をこれらのプロセスと関連づけられる疾患の診断および予後判定に用いることができる。
遺伝子座が連鎖しているのか、または分離している(フラグメント化されている)のかの決定を、DNA損傷修復、二本鎖切断修復、相同組換え、マイクロホモロジー媒介末端結合、一本鎖アニーリング(SSA)、切断誘導複製、または非相同末端結合(NHEJ)を研究するために用いることができる。本明細書に記載する方法をこれらのプロセスと関連づけられる疾患の診断および予後判定に用いることができる。
DNA損傷は、環境因子から生ずることもあり、内因性または正常代謝プロセスから生ずることもある。DNAを損傷させ得る内因性因子としては、例えば、反応性酸素種および複製エラーが挙げられる。生理的二本鎖DNA切断は、V(D)J組換え切断およびクラススイッチ切断を挙げることができる。病的二本鎖DNA切断は、電離放射線、酸化性フリーラジカル、ニック全体にわたっての複製、脆弱部位での偶発性酵素作用、トポイソメラーゼ機能不全、および機械的ストレスの結果として生ずることがある。DNA損傷を生じさせることがある環境または外因性因子としては、紫外線照射、X線、ガンマ線、DNA挿入剤、一部の植物毒素、ウイルス、熱破壊、および化学療法が挙げられる。減数分裂細胞は、酵素Spo11をはじめとする、さらなるDSB源を有し得る。
二本鎖DNA切断を例えばNHEJによって修復することができる。NHEJに関与し得る因子としては、例えば、Ku70/86、DNA−PKc、Artemis、pol μおよびλ、XRCC4、DNAリガーゼIV、XRC44、ならびにXLF−Cernunnosが挙げられる。二本鎖切断部の形成後、Kuは、その切断部に結合してDNA複合体を形成し得る。このDNA末端複合体は、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼおよびリガーセ活性を動員することができる。DNAの末端のKuは、DNA−PKcと安定した複合体を形成することができる。DNA−PKcは、5’エンドヌクレアーゼ活性、3’エンドヌクレアーゼ活性、およびヘアピン開放活性(opening activity)を含むことができる。Artemisは、5’エンドヌクレアーゼ活性を含むことができる。PALF(APLF)の3’エンドヌクレアーゼは、NHEJにおいて役割を果たすことができる。ポリメラーゼミューおよびラムダは、Ku:DNA複合体をそれらのBRCTドメインによって結合することができる。DNAリガーゼIVは、ギャップ全体にわたってライゲートすることができ、不適合DNA末端をライゲートすることができ、かつ一本鎖DNAをライゲートすることができる。NHEJは、鎖の切断を伴い得る。XRCC4は、四量体化することができ、およびPNK(ポリヌクレオチドキナーゼ)、APTX(アプラタキシン、中断したライゲーション産物の脱アデニル化に役割を果たすことができるタンパク質)およびPALFは、XRCC4と相互作用することができる。NHEJによる二本鎖DNA切断修復は、例えば、その全体が参考として本明細書に援用されている、Lieber,M(2011)のAnnu.Rev.Biochem.79:181−211に総説されている。NHEJを細胞周期の任意の時点で行うことができる。
NHEJタンパク質は、V(D)J組換えにおいて役割を果たすことができる。タンパク質RAG1およびRAG2は、V(D)J組換えにおいて役割を果たすことができる。クラススイッチ組換えは、B細胞においてV(D)J組換え後に行うことができ、かつ免疫グロブリン重鎖遺伝子を交換するために用いることができる。このプロセスは、活性化誘導デアミナーゼ(AID)、RNaseH、ウラシルグリコシラーゼ、APE1およびExo1を伴い得る。
二本鎖DNA切断を相同指向修復(homology−directed repair)(例えば、相同組換えまたは一本鎖アニーリング)によって修復することができる。これらのプロセスに関与し得る因子の例としては、RAD50、MRE11、Nbs1(まとめて、MRN複合体);RAD51(B、C、D)、XRCC2、XRCC3、RAD52、RAD54BおよびBRCA2が挙げられる。細胞周期のSおよびG2期中には極めて近接して2つの姉妹染色分体が存在し、そのため相同指向修復は、これらの期においてより一般的であり得る。
ATMおよびATRキナーゼは、損傷したDNAを認識することができる。DNA−PKと共にこれらのキナーゼは、H2AXをリン酸化し、γH2AXフォーカスを生じさせることができる。ATRは、複製フォーク停止または嵩高い損傷部のプロセッシングの結果として生ずる一本鎖DNA領域によって活性化され得る。ATRは、ATRIPと相互作用することができる。9−1−1複合体(Rad9、Hus1およびRad1)は、ATRによる基質リン酸化において役割を果たすことができる。RPAは、ssDNAを結合することができ、ATRによる基質リン酸化において役割を果たすことができる。
ATMは、DNA末端をMRNによって認識することができる。リン酸化したH2AXは、MDC1、ユビキチンリガーゼRNF8およびRNF168、ならびに53BP1を動員することができる。ATMは、Chk2およびp53をリン酸化することができる。
チェックポイントおよび細胞周期調節も本明細書に記載する方法、組成物およびキットを用いて分析することができる。細胞は、細胞周期を進めることができ、該細胞周期は、G1期、S期(DNA合成)、G2期およびM期(有糸分裂)を含み得る。分裂を停止した細胞は、G0期(静止期)にあり得る。チェックポイントを用いて、細胞周期を停止させ、DNA損傷の修復を可能にすることができ、その後、細胞周期を継続することが可能になる。DAN損傷チェックポイントは、G1期とS期の境界およびG2期とM期の境界で生じ得る。もう1つのチェックポイントは、S期内チェックポイントである。
他のプロセス
核酸が連鎖しているのか、または分離している(フラグメント化されている)のかの決定を、DNA複製および転写などのプロセスにおけるポリメラーゼ(例えば、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、リバーストランスクリプターゼ)を研究するために用いることができる。例えば、ポリメラーゼのプロセッシング能力を決定することができる(例えば、完全長である初期の鎖の、部分長である初期の鎖に対する百分率を決定するために、遺伝子の前半のコピー数を後半のコピー数に対してカウントすることにより、トランケートバージョンの遺伝子が幾つ存在するかを測定することができる)。合成は5’から3’へと起こるので、合成される産物の前半(5’末端)のほうが、後半(3’末端)より多く産生されると予想される。
核酸が連鎖しているのか、または分離している(フラグメント化されている)のかの決定を、DNA複製および転写などのプロセスにおけるポリメラーゼ(例えば、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、リバーストランスクリプターゼ)を研究するために用いることができる。例えば、ポリメラーゼのプロセッシング能力を決定することができる(例えば、完全長である初期の鎖の、部分長である初期の鎖に対する百分率を決定するために、遺伝子の前半のコピー数を後半のコピー数に対してカウントすることにより、トランケートバージョンの遺伝子が幾つ存在するかを測定することができる)。合成は5’から3’へと起こるので、合成される産物の前半(5’末端)のほうが、後半(3’末端)より多く産生されると予想される。
サンプル中の遺伝子座が連鎖しているのか、または分離している(フラグメント化されている)のかを決定することは、1つ以上の制限酵素、RNAzyme、DNAzyme、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、RNase、DNaseなどを研究して、これらの酵素による開裂(例えば、2つの連鎖標的への分離)の効率を決定するのに有用であり得る。
遺伝子座が連鎖しているのか、または分離している(フラグメント化されている)のかを決定することは、RNAスプライシング、遺伝子再配列、遺伝子の局在、およびがんの際のDNA再配列の研究に有用であり得る。前記遺伝子再配列は、例えば、染色体転座であることがある。前記転座は、非相同染色体間の物質の交換を行ない得る相互転座(非ロバートソン型転座)であることがある。前記転座は、ロバートソン型転座であることがある。ロバートソン型転座は、動原体付近で融合する2つの末端動原体型染色体の再配列を伴い得る。疾患に関連づけられる転座としては、例えば、t(8;14)(q24;a32)(バーキットリンパ腫;c−mycとIGHの融合);t(11;14)(q13;q32)(マントル細胞リンパ腫;サイクリンD1とIGHの融合);t(14;18)(q32;q21)(濾胞性リンパ腫;IGHとBcl−2の融合);t(10;(様々))(q11;(様々))(乳頭状甲状腺がん(papillary thyroid cancer);第10染色体上にRETがん原遺伝子を伴う);t(2;3)(q13;p25)(濾胞性甲状腺がん;PAX8とPPARγ1の融合));t(8;21)(q22;q22)(急性骨髄芽球性白血病);t(9;22)(q34;q11)フィラデルフィア染色体(慢性骨髄性白血病;急性リンパ芽球性白血病;ETOとAML1の融合);t(15;17)(急性前骨髄球性白血病(acute promyolocytic leukemia));PMLとRAR−αの融合);t(12;15)(p13;q25)(急性骨髄性白血病、先天性線維肉腫、分泌性乳がん腫;TELとTrkC受容体の融合);t(9;12)(p24;p13)(CML、ALL;JAKとTELの融合);t(12;21)(p12;q22)(ALL;TELとAML1の融合);t(11;18)(q21;q21)(MALTリンパ腫;Bcl−2とMLTの融合);ならびにt(1;11)(q42.1;q14.3)(統合失調症)が挙げられる。
本明細書に記載するコピー数変動分析を用いて、出生前の状態、例えば、胎児異数性、例えば13トリソミー、18トリソミーまたは21トリソミーを診断することができる。
法医遺伝学用材料の分解(断片化)の程度の決定は、貴重なサンプルを浪費する前にどの分析が首尾よく行うことができるかを決定するのに役立ち得る。核酸が連鎖しているのか、または分離している(フラグメント化されている)のかを決定することは、DNAのランダム剪断に起因する完全整数値のコピー数推定値から予想される欠損を決定するのに有用であり得る。
種の併置
マイクロRNAと他のRNAの併置を決定するための方法を本明細書において提供する。例えば、マイクロRNAおよび他のタイプのRNAは、血液中のエキソソームにパッケージされていることがある。エキソソームは、タンパク質とRNAの両方を含むことができる30〜90nmの小胞であり得る。例えばマイクロRNAを含めて、RNAは、タンパク質複合体内に共にパッケージされていることがある。1つの実施形態では、転写物がエキソソームまたはタンパク質複合体内に共局在するかどうかを決定するための方法を提供する。
マイクロRNAと他のRNAの併置を決定するための方法を本明細書において提供する。例えば、マイクロRNAおよび他のタイプのRNAは、血液中のエキソソームにパッケージされていることがある。エキソソームは、タンパク質とRNAの両方を含むことができる30〜90nmの小胞であり得る。例えばマイクロRNAを含めて、RNAは、タンパク質複合体内に共にパッケージされていることがある。1つの実施形態では、転写物がエキソソームまたはタンパク質複合体内に共局在するかどうかを決定するための方法を提供する。
1つの実施形態では、関心対象のエキソソームまたはタンパク質複合体を保存するように、例えばホルムアルデヒドと架橋させることにより、血漿または血漿の誘導体をプロセッシングし、その後、その血漿を複数の空間的に孤立した区画に分配する。エキソソームを破壊することができ、タンパク質を消化することができ、それらの区画内でPCR反応を(逆転写と併用で)行うことができる(例えば、ddPCR)。PCR反応は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10もしくはそれより多くの標的核酸配列を増幅させることができる。標的核酸配列が同じ区画に共局在する場合、標的転写は、同じタンパク質複合体中に存在した可能性がある。もう1つの実施形態では、サンプルをエキソソームまたはタンパク質複合体を保存するためのプロセスに付さずに対照を行う。1つの実施形態では、エキソソームの破裂(破壊)を温度調整によって果たすことができる。もう1つの実施形態では、エキソソームの破裂(破壊)を、エキソソームまたはタンパク質複合体破壊剤を有する区画内に内部エマルジョンを放出することによって果たすことができる。
もう1つの実施形態では、無細胞DNAの2つ以上の種の併置を決定する方法を提供する。無細胞DNA分子は、血液または血漿サンプル中で凝集することがある。凝集した無細胞DNA分子を有するサンプルを空間的に孤立した領域に分配することができ、凝集を破壊することができ、2つ以上の異なる無細胞DNA分子についての増幅を行うことができ、かつそれらの区画を分析して、無細胞DNA分子が同じ区画にあるのか否か、または異なる区画にあるのか否かを決定することができる。
本明細書において提供する方法により、特定のRNA、DNAまたはタンパク質標的が血漿中で共に移動するかどうかの決定が可能になる。追加の蛍光チャネルにより、2つ以上(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20もしくはそれより多く)の標的の併置を同時に測定することが可能になり得る。例えば、3つの異なる蛍光体を有するプローブを使用して、3つの標的核酸配列にわたって併置頻度を決定することができる。
標的配列の欠失の検出
併置により連鎖情報を獲得するための方法を提供する。この方法は、標的核酸配列の欠失があるかどうかを決定するために、またはCNVコピーのハプロタイプ決定のために用いることができる。マーカー配列(例えばVIC標識プローブで検出されるもの)は、コピー数変動領域内の標的配列(例えばFAM標識プローブで検出されるもの)外だがその付近にあることができる。核酸を含むサンプルを複数の空間的に孤立した領域に分配することができ、前記マーカーおよび標的核酸配列を(例えば、増幅およびプローブでの検出によって)検出することができる。VIC(マーカー)およびFAM(標的)の併置を図49に描いたように分析することができる。VICおよびFAMが、ある区画に常に共局在する場合、標的配列の欠失がない可能性がある(図49B)。FAMと共局在していないVICのみを有する区画がある場合、この結果は、標的配列の欠失を示唆する(図49A)。
併置により連鎖情報を獲得するための方法を提供する。この方法は、標的核酸配列の欠失があるかどうかを決定するために、またはCNVコピーのハプロタイプ決定のために用いることができる。マーカー配列(例えばVIC標識プローブで検出されるもの)は、コピー数変動領域内の標的配列(例えばFAM標識プローブで検出されるもの)外だがその付近にあることができる。核酸を含むサンプルを複数の空間的に孤立した領域に分配することができ、前記マーカーおよび標的核酸配列を(例えば、増幅およびプローブでの検出によって)検出することができる。VIC(マーカー)およびFAM(標的)の併置を図49に描いたように分析することができる。VICおよびFAMが、ある区画に常に共局在する場合、標的配列の欠失がない可能性がある(図49B)。FAMと共局在していないVICのみを有する区画がある場合、この結果は、標的配列の欠失を示唆する(図49A)。
消化核酸の保管
消化核酸(例えば、DNA)の保管の長さは、コピー数変動測定値に影響を及ぼし得る。長期保管は、推定されるコピー数の低減の原因になり得る。例えば、長期保管は、核酸分解を生じさせる結果となることがある。消化核酸サンプルの保管の長さは、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100時間であることがあり、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100時間未満であることがある。消化核酸サンプルの保管の長さは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100日間であることがあり、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100日間未満であることがある。消化核酸サンプルの保管の長さは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100年間であることがあり、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100年間未満であることがある。
消化核酸(例えば、DNA)の保管の長さは、コピー数変動測定値に影響を及ぼし得る。長期保管は、推定されるコピー数の低減の原因になり得る。例えば、長期保管は、核酸分解を生じさせる結果となることがある。消化核酸サンプルの保管の長さは、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100時間であることがあり、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100時間未満であることがある。消化核酸サンプルの保管の長さは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100日間であることがあり、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100日間未満であることがある。消化核酸サンプルの保管の長さは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100年間であることがあり、または約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99もしくは100年間未満であることがある。
図20Aおよび20Bは、保管された消化DNAのMRGPRX1 CNV値のドリフトを図示する。図20Aにおいて、消化サンプルは、一貫して整数より下のCNV値を示す。図20Bにおいて、CNV値は、より整数に近かった(実施例20を参照されたし)。
1つの実施形態において、消化DNAの4℃での長期間にわたる保管は、CN推定値の質に影響を及ぼし得る(例えば、コピー数推定値は、経時的により小さくなり得、例えば、6.0の推定CNVを有する標的を有するサンプルは、3週間、4℃で保管すると、5.7のCNVを生じさせ得る)。
核酸サンプル(例えば、消化核酸サンプル)の保管温度は、約4、0、−10、−20、−30、−40、−50、−60、−70、−80、−90、−100、−110、−120、−130、−140、−150、−160、−170、−180、−190もしくは−200℃であることがあり、または約4、0、−10、−20、−30、−40、−50、−60、−70、−80、−90、−100、−110、−120、−130、−140、−150、−160、−170、−180、−190もしくは−200℃未満であることがある。
1つの実施形態では、消化DNAを緩衝溶液(例えば、10mMトリス、pH8.0)中で保管することができる。
CNV分析に対する核酸長の影響
サンプル中の長い核酸の存在は、標的核酸配列が連鎖していない場合(例えば、それらが異なる染色体上にある場合)でさえ、コピー数変動値に影響を及ぼすことがある。例えば制限消化、熱処理、剪断、音波処理、濾過などによる、サンプル中の核酸サイズの縮小は、コピー数変動実験の結果を向上させることができる。核酸長の縮小はまた、PCRのための標的利便性を向上させることができる。
サンプル中の長い核酸の存在は、標的核酸配列が連鎖していない場合(例えば、それらが異なる染色体上にある場合)でさえ、コピー数変動値に影響を及ぼすことがある。例えば制限消化、熱処理、剪断、音波処理、濾過などによる、サンプル中の核酸サイズの縮小は、コピー数変動実験の結果を向上させることができる。核酸長の縮小はまた、PCRのための標的利便性を向上させることができる。
高い核酸負荷量で、核酸長の縮小を用いて、液滴デジタルPCR実験での一貫した液滴形成を確保することができる。長い核酸を有する核酸の負荷量が多いと、液滴形成は低減されるまたは妨げられることがあり、流れが生ずる結果となり得る。例えば、音波処理、熱処理、制限酵素消化、濾過または剪断によって、核酸長を縮小することができる。
液滴デジタルPCRを用いて、制限酵素効率および特異性を測定することができる。
本願は、あらゆる目的のため次の資料をその全体において参照として援用している:2006年5月9日発行の米国特許第7,041,481号明細書;2010年7月8日公開の米国特許出願公開第2010/0173394号A1明細書;ならびにJoseph R.Lakowicz、PRINCIPLES OF FLUORESCENCE SPECTROSCOPY(第2版、1999)。
キット
本発明において提供する方法を行うためのキットを本明細書において提供する。これらのキットは、1つ以上の制限酵素、デバイス、バッファー、試薬、および使用のための指示を備えることができる。キットは、制限酵素、バッファー、塩および使用のための指示を備えることができる。キットは、1つ以上のプライマーおよび1つ以上のプローブを備えることができる。1つの実施形態において、キットは、少なくとも1つの制限酵素、4つのプライマーおよび2つのプローブを備える。もう1つの実施形態において、キットは、少なくとも1つの制限酵素、少なくとも4つのプライマーおよび少なくとも1つのプローブを備える。もう1つの実施形態において、キットは、少なくとも1つの制限酵素、少なくとも4つのプライマーおよび少なくとも2つのプローブを備える。
本発明において提供する方法を行うためのキットを本明細書において提供する。これらのキットは、1つ以上の制限酵素、デバイス、バッファー、試薬、および使用のための指示を備えることができる。キットは、制限酵素、バッファー、塩および使用のための指示を備えることができる。キットは、1つ以上のプライマーおよび1つ以上のプローブを備えることができる。1つの実施形態において、キットは、少なくとも1つの制限酵素、4つのプライマーおよび2つのプローブを備える。もう1つの実施形態において、キットは、少なくとも1つの制限酵素、少なくとも4つのプライマーおよび少なくとも1つのプローブを備える。もう1つの実施形態において、キットは、少なくとも1つの制限酵素、少なくとも4つのプライマーおよび少なくとも2つのプローブを備える。
関連技術
本明細書に記載する方法において従来の技術を用いることができる。かかる従来の技術は、標準的な実験室マニュアル、例えば、Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(第I−IV巻)、Using Antibodies:A Laboratory Manual、Cells:A Laboratory Manual、PCR Primer:A Laboratory Manual、and Molecular Cloning:A Laboratory Manual(すべてCold Spring Harbor Laboratory Pressからのもの);Stryer、L.(1995)Biochemistry(第4版)Freeman、New York;Gait、「Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach」、1984、IRL Press、London、Nelson and Cox(2000)、Lehninger、(2004)Principles of Biochemistry、第4版、W.H.Freeman Pub.、New York、N.Y.およびBergら(2006)Biochemistry、第6版、W.H.Freeman Pub.、New York、N.Y.において見出すことができ、これらのすべては、あらゆる目的のためにそれら全体が参考として本明細書に援用されている。
本明細書に記載する方法において従来の技術を用いることができる。かかる従来の技術は、標準的な実験室マニュアル、例えば、Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(第I−IV巻)、Using Antibodies:A Laboratory Manual、Cells:A Laboratory Manual、PCR Primer:A Laboratory Manual、and Molecular Cloning:A Laboratory Manual(すべてCold Spring Harbor Laboratory Pressからのもの);Stryer、L.(1995)Biochemistry(第4版)Freeman、New York;Gait、「Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach」、1984、IRL Press、London、Nelson and Cox(2000)、Lehninger、(2004)Principles of Biochemistry、第4版、W.H.Freeman Pub.、New York、N.Y.およびBergら(2006)Biochemistry、第6版、W.H.Freeman Pub.、New York、N.Y.において見出すことができ、これらのすべては、あらゆる目的のためにそれら全体が参考として本明細書に援用されている。
例えば蛍光インサイチューハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーション、アレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション、SNPアレイを用いるバーチャル核型分析、および次世代シークエンシングをはじめとする様々な手段によって、コピー数変動を検出することができる。デジタルPCRによってコピー数変動を決定する方法は、例えば米国特許出願公開第2009/0239308号明細書に記載されている。核酸を希釈することによるデジタルPCRによってコピー数変動を検出することができる。個々のDNA分子を別々の反応チャンバに分配することができるナノ流体チップ(デジタルアレイ)(例えば、Fluidigmナノ流体チップ)を使用することによるデジタルPCRによってコピー数変動を検出することができる。液滴デジタルPCRによってコピー数変動を検出することができる。本明細書に記載する方法は、1つ以上の上述の技術を用いて行ったコピー数変動分析の結果を確認するために用いることができる。
コピー数変動を決定するために用いることができる次世代シークエンシング技術としては、例えば、DNAナノボールシークエンシング(ローリングサークル複製を用いて、DNAナノボールへとゲノムDNAの小断片を増幅させる)(例えば、Complete Genomicsによって用いられている)、ナノ細孔シークエンシング(例えば、Oxford Nanopore Technologiesによって用いられている)(Soni G.V.およびMeller A.(2007)Clin.Chem.53:1996−2001)、イオン半導体シークエンシング(Ion Torrent Systems)(米国特許出願公開第2009/0026082号明細書)、SOLiDシークエンシング(ライゲーションによるシークエンシング;例えば、Applied Biosystemsによって使用されている)、Illumina(Solexa)シークエンシング(ブリッジ増幅を用いる)、454パイロシークエンシング(例えば、Roche Diagnosticsによって用いられている)(Margulies,M.ら、2005 Nature、437:376−380)、真の単分子シークエンシング(true single molecule sequencing)(例えば、Helicosによって用いられている)(Harris T.D.ら(2008)Science 320:106−109)、またはPacific Biosciencesによって用いられている単分子リアルタイムシークエンシング(SMRT)が挙げられる。本明細書に記載する方法、組成物および/またはキットは、これらの方法のうちの1つによって行ったCNV分析を追跡調査するために用いることができる。
範囲を「約」1つの特定の値から、および/または「約」もう1つの特定の値までと本明細書中で表現することがある。このような範囲を表現するとき、別の実施形態は、1つの特定の値から、および/または他の特定の値までを含む。類似して、先行詞「約」の使用により値を近似値で表すとき、その特定の値が別の実施形態を構成することは理解される。さらに、各々の範囲の終点が他の終点に対して有意でもあり、他の終点とは無関係に有意でもあることは、理解される。本明細書において用いる場合の用語「約」は、その特定の使用状況の中で述べている数値からプラスまたはマイナス15%である範囲を指す。例えば、約10は、8.5から11.5の範囲を含むこととなる。
別の定義がない限り、本明細書において用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様のまたは等価の任意の方法および材料も本発明の実施または試験の際に使用することができるが、今般、代表的例証的方法および材料を記載する。
実施例1
アミラーゼCNV分析
本明細書に記載する方法を用いて、アミラーゼ遺伝子のコピー数変動を決定することができる。アミラーゼは、多糖類の結合を加水分解することができる酵素である。群間のコピー数変動は、食事に基づく進化的変化を示唆する。アミラーゼアッセイは、別個のCNV状態に対応する別個の推定値を生じさせる。15のCoriell参照DNAサンプルでの結果は、この遺伝子についてのコピー数のヒトでの高い差異を明示する。図21参照。
アミラーゼCNV分析
本明細書に記載する方法を用いて、アミラーゼ遺伝子のコピー数変動を決定することができる。アミラーゼは、多糖類の結合を加水分解することができる酵素である。群間のコピー数変動は、食事に基づく進化的変化を示唆する。アミラーゼアッセイは、別個のCNV状態に対応する別個の推定値を生じさせる。15のCoriell参照DNAサンプルでの結果は、この遺伝子についてのコピー数のヒトでの高い差異を明示する。図21参照。
Coriell Institute for Medical Researchからのサンプルを使用する。サンプルDNAを10U/μg DNAのAluIで、37℃で1時間消化する。約20〜100μgの消化されたDNAを各ddPCR反応に負荷する。各サンプルを三重反復でプロセッシングし、データをマージして図21に示す値に達する。アミラーゼアッセイのためのフォワードプライマーの配列は、5’−TTCTGAGATTTATCTAGAGGCTGGGA−3’であり、リバースプライマーは、5’−CCCTGACAGACCGACAAGAC−3’であり、およびプローブは、5’−6FAM−CTGGTTCAGGAGCCCT−MGB−NFQ−3’である。上記アッセイはRPP30 に対して反復する:FWDプライマー:5’−GATTTGGACCTGCGAGCG−3’、REVプライマー 5’−GCGGCTGTCTCCACAAGT−3’、およびプローブ 5’−VIC−CTGACCTGAAGGCTCT−MGB−NFQ−3’。次の熱サイクリング条件を用いる:95℃10分間(94℃30秒間+60℃1分間)を55サイクル。
実施例2
CCL3L1 CNV分析
本明細書に記載する方法を用いて、CCL3L1遺伝子のコピー数変動を決定することができる。CCL3L1のコピー数変動は、HIV−1感受性に関係づけられているが、これらの関連性は、標準的qPCRを用いる不正確なコピー数評価に起因して一致性がなかった。CCL3L遺伝子クラスターは、特異的増幅を困難にすることができる5つの偽遺伝子を含む。整数ベースのCNV分析は、正しい定量に忠実度を加える。Alkanら((2009)Nat.Genetics.41:1061−1067)は、NA18507がCCL3L1の5.7個のコピーを有することを見出した。ここでの分析では、「6」を横切るエラーバーを有する5.94個のコピーが見出された。図22を参照されたし。本明細書に記載する方法は、遺伝子を標的にするアッセイを的確に設計する能力、およびこの遺伝子を遊離させ、その一方ではまた偽遺伝子を切断して、コピー数推定値を上昇させる偽陽性の機会を低減させるような制限酵素を的確に選択する能力をもたらす。
CCL3L1 CNV分析
本明細書に記載する方法を用いて、CCL3L1遺伝子のコピー数変動を決定することができる。CCL3L1のコピー数変動は、HIV−1感受性に関係づけられているが、これらの関連性は、標準的qPCRを用いる不正確なコピー数評価に起因して一致性がなかった。CCL3L遺伝子クラスターは、特異的増幅を困難にすることができる5つの偽遺伝子を含む。整数ベースのCNV分析は、正しい定量に忠実度を加える。Alkanら((2009)Nat.Genetics.41:1061−1067)は、NA18507がCCL3L1の5.7個のコピーを有することを見出した。ここでの分析では、「6」を横切るエラーバーを有する5.94個のコピーが見出された。図22を参照されたし。本明細書に記載する方法は、遺伝子を標的にするアッセイを的確に設計する能力、およびこの遺伝子を遊離させ、その一方ではまた偽遺伝子を切断して、コピー数推定値を上昇させる偽陽性の機会を低減させるような制限酵素を的確に選択する能力をもたらす。
57℃のアニーリング温度を用いることで、結果として、一部の偽遺伝子を増幅し、期待値より約1大きいCNV値を得ることができる。
CCL3L1については、815ngの各精製ヒトゲノムDNAサンプル(Coriell)を、10μL中の7.5ユニットのMseI(NEB)で1時間、37℃で消化する。消化物をTE緩衝液で3.5倍希釈して35μLにし、その後、20μL ddPCR反応につき69ng(3μL)をアッセイする。修飾CCL3L1アッセイ配列19は、(フォワードプライマー)5’−GGGTCCAGAAATACGTCAGT−3’;(リバースプライマー)5’−CATGTTCCCAAGGCTCAG−3’;ならびに(プローブ)6FAM−TTCGAGGCCCAGCGACCTCA−MGBNFQである。RPP30参照アッセイ(フォワードプライマー)5’−GATTTGGACCTGCGAGCG−3’;(リバースプライマー)5’−GCGGCTGTCTCCACAAGT−3’;ならびに(プローブ)VIC−CTGACCTGAAGGCTCT− MGBNFQを用いてすべてのCNVアッセイを反復する。熱サイクリング条件は、95℃10分間(1サイクル)、95℃30秒間および60℃60秒間(40サイクル)、98℃10分間(1サイクル)、および12℃での保持。Sudmant,P.H.;Kitzman,J.O.;Antonacci,F.;Alkan,C.;Malig,M.;Tsalenko,A.;Sampas,N.;Bruhn,L.;Shendure,J.;Eichler,E.E.Science 2010、330、641−646も参照されたし。
実施例3
MRGPRX1 CNV分析
本明細書に記載する方法を用いて、MRGPRX1遺伝子についてのコピー数変動を決定することができる。Mas関連Gタンパク質共役受容体メンバーX1は、ヒトにおいてMRGPRX1遺伝子によってコードされているタンパク質である。MRGPRX1は、痒み感および痛覚に関与する感覚ニューロン特異的受容体である。MRGPRX1タンパク質は、疼痛の遮断に関与すると考えられ、そのため欠失は慢性疼痛と関連づけられる。図23Aおよび23Bは、MRGPRX1遺伝子についてのコピー数変動を図示する。
MRGPRX1 CNV分析
本明細書に記載する方法を用いて、MRGPRX1遺伝子についてのコピー数変動を決定することができる。Mas関連Gタンパク質共役受容体メンバーX1は、ヒトにおいてMRGPRX1遺伝子によってコードされているタンパク質である。MRGPRX1は、痒み感および痛覚に関与する感覚ニューロン特異的受容体である。MRGPRX1タンパク質は、疼痛の遮断に関与すると考えられ、そのため欠失は慢性疼痛と関連づけられる。図23Aおよび23Bは、MRGPRX1遺伝子についてのコピー数変動を図示する。
MRGPRX1については、4.4μgの各精製ヒトゲノムDNAサンプル(Coriell)を、50μL中の10ユニットのRsaI(NEB)で1時間、37℃で消化した。消化物をTE緩衝液(pH8.0)で8倍希釈して400μLにし、その後、20μL ddPCR反応につき33ng(3μL)をアッセイした。MRGPRX1アッセイ配列は、(フォワードプライマー)5’−TTAAGCTTCATCAGTATCCCCCA−3’、(リバースプライマー)5’−CAAAGTAGGAAAACATCATCACAGGA−3’、および(プローブ)6FAM−ACCATCTCTAAAATCCT−MGBNFQであった。RPP30参照アッセイ(フォワードプライマー)5’−GATTTGGACCTGCGAGCG−3’、(リバースプライマー)5’−GCGGCTGTCTCCACAAGT−3’、および(プローブ)VIC−CTGACCTGAAGGCTCT−MGBNFQを用いてCNVアッセイを反復した。熱サイクリング条件は、95℃×10分間(1サイクル)、94℃×30秒間および60℃×60秒間(40サイクル)、98℃×10分間(1サイクル)、および12℃での保持であった(Hindson Bら(2011)Anal.Chem.83:8604−8610も参照されたし)。
実施例4
CYP2D6 CNV分析
本明細書に記載する方法を用いて、CYP2D6遺伝子についてのコピー数変動を決定することができる。シトクロムP450混合機能オキシダーゼ系のメンバーであるシトクロムP450 2D6(CYP2D6)は、体内での生体異物代謝に関与する。CYP2D6コピー数は、薬物の代謝と関連づけられる。不良な薬物代謝を生じさせる結果となり得るCYP2D6機能は、殆どまたは全くない。多量のCYP2D6機能は、広範囲の薬物代謝を生じさせる結果となり得る。CYP2D6遺伝子の複数のコピーを発現させ、通常より大きいCYP2D6機能(超高速代謝群)を生じさせる結果となり得る。図24Aおよび24Bは、CYP2D6についてのコピー数変動を図示する。
CYP2D6 CNV分析
本明細書に記載する方法を用いて、CYP2D6遺伝子についてのコピー数変動を決定することができる。シトクロムP450混合機能オキシダーゼ系のメンバーであるシトクロムP450 2D6(CYP2D6)は、体内での生体異物代謝に関与する。CYP2D6コピー数は、薬物の代謝と関連づけられる。不良な薬物代謝を生じさせる結果となり得るCYP2D6機能は、殆どまたは全くない。多量のCYP2D6機能は、広範囲の薬物代謝を生じさせる結果となり得る。CYP2D6遺伝子の複数のコピーを発現させ、通常より大きいCYP2D6機能(超高速代謝群)を生じさせる結果となり得る。図24Aおよび24Bは、CYP2D6についてのコピー数変動を図示する。
CYP2D6については、4.4μgの各精製ヒトゲノムDNAサンプル(Coriell)を、50μL中の10ユニットのRsaI(NEB)で1時間、37℃で消化した。消化物をTE緩衝液(pH8.0)で8倍希釈して400μLにし、その後、20μL ddPCR反応につき33ng(3μL)をアッセイした。CYPD2D6(Hs00010001_cn)をプライマーとFAM−MGBNFQプローブの20×プレミックスとして購入した(Applied Biosystems)。RPP30参照アッセイ(フォワードプライマー)5’−GATTTGGACCTGCGAGCG−3’、(リバースプライマー)5’−GCGGCTGTCTCCACAAGT−3’、および(プローブ)VIC−CTGACCTGAAGGCTCT−MGBNFQを用いて、CNVアッセイを反復した。熱サイクリング条件は、95℃×10分間(1サイクル)、94℃×30秒間および60℃×60秒間(40サイクル)、98℃×10分間(1サイクル)、および12℃での保持であった(Hindson Bら(2011)Anal.Chem.83:8604−8610も参照されたし)。
実施例5
脊髄性筋萎縮症CNV分析
脊髄性筋萎縮症(SMA)は、SMN1およびSMN2によってコードされている運動ニューロンタンパク質の少ない生存量に起因する脊髄エリアの運動ニューロン減少によって生じ得る。SMN1およびSMN2は、欠失および増幅に付される。これらの遺伝子は、SMN2から転写される完全長転写物のレベルを低減させる1つのヌクレオチドを除いて、同一である。SMAは、SMN1コピーの減少によって生じ得る。疾患重症度は、SNM2がSMN1減少をどれ程よく補償するかに関係し得る。対立遺伝子特異的遺伝子検出および鑑別のためのアッセイを設計することができる(例えば、ddPCRを含む)。
脊髄性筋萎縮症CNV分析
脊髄性筋萎縮症(SMA)は、SMN1およびSMN2によってコードされている運動ニューロンタンパク質の少ない生存量に起因する脊髄エリアの運動ニューロン減少によって生じ得る。SMN1およびSMN2は、欠失および増幅に付される。これらの遺伝子は、SMN2から転写される完全長転写物のレベルを低減させる1つのヌクレオチドを除いて、同一である。SMAは、SMN1コピーの減少によって生じ得る。疾患重症度は、SNM2がSMN1減少をどれ程よく補償するかに関係し得る。対立遺伝子特異的遺伝子検出および鑑別のためのアッセイを設計することができる(例えば、ddPCRを含む)。
遺伝形質は、常染色体劣性であり得る。1/6,000の出生がSMAに冒され得、1/40人が欠陥SMN1の保因者である。0および1型は、2歳より前に結果として死亡がもたらされ得る。2〜4型は、2歳より後に結果として発症がもたらされ得る(重度から軽度の脱力)。
図25および26は、単純勾配プレートを使用して同定した最適共通アニーリング温度を図示する。図27は、SM1およびSMN2コピー数を図示する。
独立したデュプレックス(SMN1/Her2およびSMN2/Tert)を使用して、SMN1およびSMN2コピー数を決定する。デュプレックスからのSMN1/SMN2コピーの比を用いて、測定コピー数値を確認する。トライアンギュレーション(triangulation)によって検証を行う(例えば、図28の上部の概略図を参照されたし)。トライアンギュレーションは、2つの異なる参照を用いてCNVを評価することにより標的のCNVを検証し得ることを意味し得る。例えば、2つの異なる参照の比(CNV)を、それらを一緒に反復することにより測定することができる。それによって、予想される2コピー/二倍体ゲノムを含有しない参照を使用してCNVを推定する可能性を回避することができる。3つの異なる標的のコピー数をCNVの決定の際に評価することができ、それによって、CNV推定値の誤差を生ずる可能性をはるかに低くすることができる。
この実験のために、Her2(FAM)アッセイに対して反復した(duplexed)SMN1(VIC)を使用してSMN1コピー数を評価した。CviQIを使用して、おおよそ50ng/アッセイのDNAを消化した。標準的なPCRプロトコルを行った。TERT(VIC)を検出するためのアッセイに対して反復したSMN2(FAM)を使用してSMN2コピー数を決定した。SMN1(VIC)とSMN2(FAM)のデュプレックスを行うことにより、SMN1/SMN2の比を決定した。CviQIを使用し、およそ50ng/アッセイを用いて、DNAを消化する。熱サイクリング条件は、95℃10分間(1サイクル)、94℃30秒間および60℃60秒間(40サイクル)、98℃10分間(1サイクル)および12℃での保持である。
図28は、SMN1およびSMN2についてのコピー数変動を図示する。
同じプライマー対を使用し、プローブを変えることにより、SMN遺伝子の検出を行うことができる。共通プライマー対は、FWDプライマー:5’−ATAGCTATTTTTTTTAACTTCCTTTATTTTCC−3’;REVプライマー 5’−TGAGCACCTTCCTTCTTTTTGA−3’である。SMN1プローブ配列は、5’−VIC−TTGTCTGAAACCCTG−MGB−NFQ−3’であるのに対して、SMN2プローブ配列は、5’−6FAM−TTTTGTCTAAAACCC−3’である。Tert参照遺伝子FWDプライマーは、5’−GGCACACGTGGCTTTTCG−3’であり、REVプライマーは、5’−GGTGAACCTCGTAAGTTTATGCAA−3’である。プローブは、5’−VIC−TCAGGACGTCGAGTGGACACGGTG−MGB−NFQ−3’である。Her2アッセイ配列は、FWDプライマー5’−CCCTGAGCAAAGAGTCACAGATAAA−3’、REVプライマー 5’−TGCCAGGGTCTGAGTCTCT−3’、プローブ:5’−6FAM−ACTGCGTTTGTCCTGG−MGB−NFQ−3’である。
実施例6
Her2 CNV分析
乳がんの30%がHer2増幅を有する。Her2+がんは、高侵襲性であるが、Herceptinに応答することができる。HER2レベルは、広範に試験されているが、既存の技術に伴う多くの欠点がある。Her2は、ERBB2としても公知であり、GRB7から20KB離開しており、このGRB7も幾つかのがんにおいて過発現されることが多い。2つの臨床的に関連する遺伝子を標的にするアッセイにより、各コピー数決定を検証することができる。予想外ではなく、一方のサンプルはHer2(ERBB2)についてのみ増幅され、もう一方はモザイク現象を提示する。図29を参照されたし。
Her2 CNV分析
乳がんの30%がHer2増幅を有する。Her2+がんは、高侵襲性であるが、Herceptinに応答することができる。HER2レベルは、広範に試験されているが、既存の技術に伴う多くの欠点がある。Her2は、ERBB2としても公知であり、GRB7から20KB離開しており、このGRB7も幾つかのがんにおいて過発現されることが多い。2つの臨床的に関連する遺伝子を標的にするアッセイにより、各コピー数決定を検証することができる。予想外ではなく、一方のサンプルはHer2(ERBB2)についてのみ増幅され、もう一方はモザイク現象を提示する。図29を参照されたし。
正常および腫瘍乳房組織サンプル各々からの精製DNA(20ng)(D8235086−Biochain)を10μL中で0.2ユニットのNlaIIIにより1時間、37℃で消化した。その制限DNAを20μLのddPCR反応につき8.8ng(4.4μL)でddPCRマスターミックスに直接添加した。ERBB2(Hs02803918_cn)およびGRB7(Hs02139994_cn)アッセイをプライマーとFAM−MGBNFQプローブの20×プレミックスとして購入し(Applied Biosystems)、上に記載したRPP30参照アッセイを用いて反復した。熱サイクリング条件は、95℃×10分間(1サイクル)、94℃×30秒間および60℃×60秒間(40サイクル)、98℃×10分間(1サイクル)、および12℃での保持であった(Hindson Bら(2011) Anal.Chem.83:8604−8610も参照されたし)。
実施例7
連鎖分析
標的核酸配列のコピー数(CN)が、消化後の特定のアッセイについて2.0である場合、(A)一方の染色体上に該標的の2個のコピーおよびもう一方の上に0個があるのか、それとも(B)該標的核酸配列の1個のコピーが2つの異なる染色体の各々の上にあるのかは不明確である。未消化のDNAを使用するアッセイ操作を用いてこれらの2つの可能性を解明することができる。未消化のDNAを使用すると、原則的に、配列させたものが(A)(1つの染色体上に標的核酸配列の2個のコピー)である場合には1のCNになるはずであり、配列させたものが(B)(2つの異なる染色体の各々の上に1個のコピー)である場合には2のCNになるはずである。サンプル中のDNAは断片化されている場合があるので、結果は、正確でないことがある−−(A)は、CNについて1.0より高いが、おそらく2.0より有意に低い読取りを生じさせることがあり、(B)は、正確に2.0を生じさせるはずである。
連鎖分析
標的核酸配列のコピー数(CN)が、消化後の特定のアッセイについて2.0である場合、(A)一方の染色体上に該標的の2個のコピーおよびもう一方の上に0個があるのか、それとも(B)該標的核酸配列の1個のコピーが2つの異なる染色体の各々の上にあるのかは不明確である。未消化のDNAを使用するアッセイ操作を用いてこれらの2つの可能性を解明することができる。未消化のDNAを使用すると、原則的に、配列させたものが(A)(1つの染色体上に標的核酸配列の2個のコピー)である場合には1のCNになるはずであり、配列させたものが(B)(2つの異なる染色体の各々の上に1個のコピー)である場合には2のCNになるはずである。サンプル中のDNAは断片化されている場合があるので、結果は、正確でないことがある−−(A)は、CNについて1.0より高いが、おそらく2.0より有意に低い読取りを生じさせることがあり、(B)は、正確に2.0を生じさせるはずである。
出発材料の断片化が高度であるほど、(A)においてもたらされるCN読取りは2.0に近くなることになる。例として、所与のアッセイについては、連鎖コピーは、約10kbだけ隔てられており、本発明者らの断片化分析に基づき10kbセグメントの30%が断片化されていることが予想される。その場合、シナリオ(A)は1.3の読取りを、およびシナリオ(B)は2.0の読取りを生じさせるはずである。
実施例8
連鎖分析
CN読取りが、消化後に3.0である場合、(A)一方の染色体上に3個のコピーおよびもう一方の上に0個があるのか、それとも(B)一方の上に2個およびもう一方の上に1個があるのかは不明確である。同じアッセイを未消化のDNAで実行し、10kb離隔および30%断片化という上と同じパラメータを仮定すると、シナリオ(A)は、1.6コピーの読取り(=0.7*0.3*2+0.7*0.3*1+0.3*0.7*2+0.3*0.3*3)を生じさせることとなり、これに対して(B)は、2.3コピーの読取りを生じさせることとなる。
連鎖分析
CN読取りが、消化後に3.0である場合、(A)一方の染色体上に3個のコピーおよびもう一方の上に0個があるのか、それとも(B)一方の上に2個およびもう一方の上に1個があるのかは不明確である。同じアッセイを未消化のDNAで実行し、10kb離隔および30%断片化という上と同じパラメータを仮定すると、シナリオ(A)は、1.6コピーの読取り(=0.7*0.3*2+0.7*0.3*1+0.3*0.7*2+0.3*0.3*3)を生じさせることとなり、これに対して(B)は、2.3コピーの読取りを生じさせることとなる。
デジタルPCR−リアルタイムハイブリッド(例えば、LifeのBiotroveアレイ)のために、未消化のDNAからの追加の連鎖情報の抽出を試みることができる。例えば、各区画内でのリアルタイム曲線を分析することにより、標的のコピーを2個、3個等々含有する区画の数を推定することができる。
終点蛍光を検査して、標的核酸配列の2個のコピーを有するセグメントが、標的核酸配列の1個のコピーを有するセグメントより高い強度を生じさせるかどうかを決定することができる。シナリオ(A)のもとでは、閾値(thereshould)は、より少ない正量(positives)であるが、これらの正量は、平均してより高い蛍光を有するはずである。
前記サイクル数を微調整して(例えば、1個のコピーを保有するセグメントが終点に達しないようにそれを行うことにより)、最高離隔を獲得することができる。
実施例9
CNV=2であるサンプルをハプロタイプ決定する(例えば、遺伝子のシス配置コピーとトランス配置コピーを区別する)ために用いることができるddPCRの確認
染色体のハプロタイプ決定戦略は、1)消化サンプルのCNVと未消化サンプルのCNVを(例えば、ddPCRを用いて)比較すること;2)液滴が指数増幅されている一方で(任意の試薬が限界になる(これは、PCRの後のほうのサイクル中に起こることがある)前に)該液滴の平均蛍光強度を検査すること、および3)ロングレンジPCRを行って、同じ染色体上の遺伝子(もしくは標的)の2個のコピーの存在(シス配置)を検出すること、または、遺伝子(もしくは標的、もしくは重複領域)が長すぎる場合には、他の染色体を検査して関心対象の遺伝子(もしくは標的)についての欠失を確認すること(例えば、欠失セクションを横断するPCRはうまくいくが、適所に遺伝子(もしくは標的)があるPCRは、プライマー間の距離が長すぎるため、うまくいかない)を含む。
CNV=2であるサンプルをハプロタイプ決定する(例えば、遺伝子のシス配置コピーとトランス配置コピーを区別する)ために用いることができるddPCRの確認
染色体のハプロタイプ決定戦略は、1)消化サンプルのCNVと未消化サンプルのCNVを(例えば、ddPCRを用いて)比較すること;2)液滴が指数増幅されている一方で(任意の試薬が限界になる(これは、PCRの後のほうのサイクル中に起こることがある)前に)該液滴の平均蛍光強度を検査すること、および3)ロングレンジPCRを行って、同じ染色体上の遺伝子(もしくは標的)の2個のコピーの存在(シス配置)を検出すること、または、遺伝子(もしくは標的、もしくは重複領域)が長すぎる場合には、他の染色体を検査して関心対象の遺伝子(もしくは標的)についての欠失を確認すること(例えば、欠失セクションを横断するPCRはうまくいくが、適所に遺伝子(もしくは標的)があるPCRは、プライマー間の距離が長すぎるため、うまくいかない)を含む。
一般プロトコルガイドライン
1)ddPCR:制限酵素消化サンプルを未消化サンプルと比較し、その結果を、シス配置コピーを有するサンプルのうちの未消化サンプルについての推定CNVの有意な降下について検査する。ポアソンの統計学についてのスイートスポット(ポアソン補正因子の統計誤差の最小量があるポイント)にDNAを含めることができる。20,000個の液滴についてのスイートスポットは、約1.6cpd(copy per droplet:液滴あたりのコピー)であり得る。
1)ddPCR:制限酵素消化サンプルを未消化サンプルと比較し、その結果を、シス配置コピーを有するサンプルのうちの未消化サンプルについての推定CNVの有意な降下について検査する。ポアソンの統計学についてのスイートスポット(ポアソン補正因子の統計誤差の最小量があるポイント)にDNAを含めることができる。20,000個の液滴についてのスイートスポットは、約1.6cpd(copy per droplet:液滴あたりのコピー)であり得る。
2)蛍光に基づく確認:適切なサイクル(単数または複数)(これは、実験により決定することができ、およびアッセイ効率に依存してアッセイごとに異なることがある)で、シス配置サンプルを含有する小滴の平均強度がトランス配置サンプルのものより高い(これは、2個の連鎖コピーが同じ液滴中に含有される場合に起こる)かどうかを検査することができる。この実験には、低cpdを用いることができる。0.1cpdを目指して、2個の連鎖していないコピーが同じ液滴中にある機会を最少にすることができる。良好な光学系を用いて、蛍光強度のバンド形成を認めることができる(2個のコピーを有する液滴は、1個のコピーしか有さない液滴の2倍明るいはずである)。蛍光を例えば、約サイクル1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50で検査することができる。蛍光を1サイクルより多いサイクルで検査することができる。例えば、蛍光を2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50の異なるサイクルで検査することができる。例えば、蛍光をサイクル25、28、31および40で測定することができる。
3)ロングレンジPCRによる連鎖の確認。一般に、CNVにおける増幅領域のサイズは、2つのタンデム配置遺伝子(または標的)のPCR増幅を可能にできないほど大きいことがある。したがって、並んでいる標的の2個のコピーではなく遺伝子(または標的)欠失の存在を検出する方が容易であり得る。この分析のために、増幅されると推測される領域外にある、互いに向かい合っているプライマーを選択することができる。ロングレンジポリメラーゼを使用してもよい。適切な長さの伸長時間を用いてPCRを行うことができる(長すぎるまたは短すぎる時間は反応を失敗させることがあることに留意されたし)。このロングレンジPCRをバルクで行うこともでき、または液滴で行うこともできる。
図30は、各々が制限酵素で切断されたまたは切断されていない6つのサンプルについてのコピー数推定を図示する。このデータは、サンプル4および5は同じ染色体上に連鎖している2つの標的配列を有するが、他のサンプルは両方の染色体上に単一標的配列を含有することを示唆している。
サンプルD1234090(結腸)、D1234106(食道)およびD1234152(肺)は、BioChain Institute Incからのものである。サンプルNA18853、NA19108およびNA18507は、Coriell Institute for Medical Researchからのものである。Coriellサンプルは、Bリンパ球DNAを含む。
1マイクログラムのDNAにつき約10UのRsaIを使用し、1時間、37℃で消化を続けた。40サイクル後に液滴読取装置を使用して液滴の蛍光を読取った。
MRGPRX1アッセイ配列は、(フォワードプライマー)5’−TTAAGCTTCATCAGTATCCCCCA−3’;(リバースプライマー)5’−CAAAGTAGGAAAACATCATCACAGGA−3’;ならびに(プローブ)6FAM−ACCATCTCTAAAATCCT−MGBNFQであり得る。RPP30参照アッセイ(フォワードプライマー)5’−GATTTGGACCTGCGAGCG−3’、(リバースプライマー)5’−GCGGCTGTCTCCACAAGT−3’、および(プローブ)VIC−CTGACCTGAAGGCTCT−MGBNFQを用いてCNVアッセイを反復することができる。熱サイクリング条件は、95℃×10分間(1サイクル)、94℃×30秒間および60℃×60秒間(40サイクル)、98℃×10分間(1サイクル)、および12℃での保持であり得る(Hindson Bら(2011)Anal.Chem.83:8604−8610も参照されたし)。
図31は、MRGPRX1およびRPP30についての、ddPCR実験における25サイクル後の蛍光強度の分析を図示する。事象数は、液滴のカウントを指す。
図32は、ddPCR実験における4つのサンプルについての三重反復測定のサイクル25での平均蛍光を図示する。一方の染色体上に2つの標的およびもう一方の上に0個を有すると推測されるサンプル(NA18853およびNA19108)は、染色体上に1コピーの標的を有する(トランス配置)と推測されるサンプル(NA18507およびD1234106)より高い蛍光を有する。
図33は、MRGPRX1およびRPP30についての、ddPCR実験における28サイクル後の蛍光強度の分析を図示する。
図34は、ddPCR濃度およびコピー数変動の比較を図示する。サンプルNA18853およびNA19108では、非切断サンプルについてのCNV低減が28サイクルで観察される。VIC(RPP30)濃度、FAM(MRGPRX1)濃度およびMRGPRX1コピー数についてのシグナルを示す。
図35は、ddPCR実験における28サイクル後の、4つのサンプルについての三重反復測定の平均蛍光を図示する。一方の染色体上に2個の標的、およびもう一方の上に0個の標的を有すると推測されるサンプル(18853および19108)は、2つの染色体の各々の上に標的の1個のコピーを有する(トランス配置)と推測されるサンプル(18507およびBC106)より高い蛍光を有する。
図36は、ddPCR実験における31、34および40サイクル後の、4つのサンプルについての三重反復測定の平均蛍光を図示する。一方の染色体上に2個の標的、およびもう一方の上に0個の標的を有すると推測されるサンプル(NA18853およびNA19108)は、2つの染色体の各々の上に標的の1個のコピーを有する(トランス配置)と推測されるサンプル(NA18507およびD1234106)より高い蛍光をサイクル31で有するが、サイクル34および40では有さない。
要するに、前記ddPCR実験は、サンプル18853および19108が単一染色体上にMRGPRX1の2個の連鎖コピーを有するという考えを支持する。
液滴デジタルPCR実験からの標的の連鎖に関する発見を支持するためにロングレンジPCR実験も行う。CN=1サンプルは、欠失領域の増幅についての対照として役立ち得る。
図37は、ロングレンジPCR実験についての実験構成を図示する。シナリオAおよびBについてのロングレンジPCRは、プライマー間の距離が長すぎるため、失敗すると予想される。しかし、PCRは、MRGPRX1が欠失している染色体を含有するシナリオCについてはうまくいくはずである。矢印はプライマーを示す。
図38は、ddPCRによる連鎖を確認するための6つのサンプルでのロングレンジPCR実験のバイオアナライザー画像を図示する(構成の概略図については図39を参照されたし)。各レーンにおける約1500でのバンドは、MRGPRX1 PCR産物(MRGPRX1配列に対する内部のプライマー)である。プライマーをMRGPRX1配列に対して外部にアニールするようにも設計した。サンプル11994および18573は、1のコピー数を有する:一方の染色体がMRGPRX1のコピーを含有し、もう一方が欠失を含有する。3000と1500の間のPCR産物は、おそらく、この欠失を有する染色体からの増幅からのものである。サンプル19239および18507は、異なる染色体上にMRGPRX1の2個のコピーを有する。これらのサンプルは、おそらくMRGPRX1遺伝子の存在がPCRについて産物を生成するには長すぎる(25KB)ため、3000と1500の間にバンドを有さない。サンプル19108および18553は、同じ染色体上のMRGPRX1の2個のコピーと、MRGPRX1が欠失している染色体とを有する。3000と1500の間のPCR産物は、おそらく、この欠失を有する染色体からの増幅からのものである。これらのデータは、前記液滴デジタルPCR実験の結果を裏づける。
図39は、6つのサンプルについてのロングレンジPCR結果およびMRGPRX1コピー数結果を図示する。上部の概略図は、PCRプライマー位置、およびPCR産物の予想長を図示する。サンプルS1およびS2は、一方の染色体上にMRGPRX1の1個のコピー、およびもう一方の染色体上に欠失を有する。プライマーは、MRGPRX1遺伝子に対して内部にあり、約1.6kbの産物を生成することができる。プライマーはまた、MRGPRX1遺伝子に対して外部にアニールする。サンプルS3およびS4は、MRGPRX1の2個のコピーをトランスで(異なる染色体上に)有する。最も外側のプライマーからのPCR産物は、約24kbであると推定される。サンプルS5およびS6は、一方の染色体上にMRGPRX1の2個のコピー、およびもう一方の染色体上にMRGPRX1の欠失を有する。欠失を有する染色体上の最も外側のプライマーを使用して生成されるPCR産物の長さは、約2.7kbである。PCR構成の概略図の下に、ロングレンジPCR結果の実例がある。すべてのサンプルは、1.6kbの内部MRGPRX1プライマーからの産物に対応するPCR産物を有する。サンプルS1、S2、S5およびS6は、染色体欠失を有するサンプルからの約2.7kbのPCR産物を有する。サンプルS3およびS4は、約2.7kbのPCR産物を有さない。MRGPRX1の1または2個のコピーを含む染色体上の最も外側のプライマーを使用するPCRは、プライマー間の距離のため失敗する。ロングレンジPCRの実例の下に、制限酵素消化を伴うまたは伴わない、ddPCRによって決定されたMRGPRX1コピー数の実例がある(RE=制限酵素消化;ND=消化なし)。サンプルS1およびS2は、サンプルが制限酵素で消化されても、されなくても、MRGPRX1の1個のコピーを有すると推定される。サンプルS3およびS4は、サンプルが消化されても、されなくても、MRGPRX1の約2個のコピーを有すると推定される。サンプルS5およびS6は、サンプルが消化されるとMRGPRX1の約2個のコピーを有するが、サンプルが消化されないと2個未満のコピーを有すると推定される。サンプルが消化されるか否かに依存する、S5およびS6におけるコピー数推定の差は、MRGPRX1のこれらの2個のコピーが同じ染色体上にあることを示唆する。
ロングレンジPCRについてのプロトコルは、以下である:Agilent PfuUltraII Fusion HS DNAポリメラーゼを、次の熱サイクリング条件を用いて使用した:2分間95℃(1サイクル)、20秒間95℃、20秒間60℃、75秒間72℃(40サイクル)、72℃で3分間(1サイクル)。200nMでのプライマー、250uMのdNTP、100ngのDNA、1uLのPfuUltraII fusion HS DNAポリメラーゼ、1XのAgilent供給マスターミックスを50uLの反応物に含めた。フォワードプライマーの配列は、5’−GATCTAGCTAAGAGACAGAGATAGACACATG−3’であり、リバースプライマー配列は、5’−cagtatttttgcactgctttcctcat−3’であった。
図40は、推定コピー数の消化サンプルからの百物率差を図示する。
実施例10
断片化を決定するためのアルゴリズム
この実施例では、2つの異なるタイプの標的核酸を分析している。一方をFAMプローブで検出し、一方をVICで検出している。2つの標的核酸配列は、同じポリヌクレオチド上にあると仮定する。サンプル中には、3タイプのDNA断片が存在し得る:1)Fam−Vic一緒にあわせて(細断されていない)、2)Fam断片、および3)Vic断片。幾つかの確率が実測され(FAM−VICクロスプロットにおけるカウント)、目標は、濃度を推定することである。フォワードを先ず行う。濃度を与え、カウントを計算する。その後、逆を行い、異なる濃度値を試してみて、実際のカウントを与えるものを選択する。
断片化を決定するためのアルゴリズム
この実施例では、2つの異なるタイプの標的核酸を分析している。一方をFAMプローブで検出し、一方をVICで検出している。2つの標的核酸配列は、同じポリヌクレオチド上にあると仮定する。サンプル中には、3タイプのDNA断片が存在し得る:1)Fam−Vic一緒にあわせて(細断されていない)、2)Fam断片、および3)Vic断片。幾つかの確率が実測され(FAM−VICクロスプロットにおけるカウント)、目標は、濃度を推定することである。フォワードを先ず行う。濃度を与え、カウントを計算する。その後、逆を行い、異なる濃度値を試してみて、実際のカウントを与えるものを選択する。
マイルポストアッセイ分析−断片化の確率
問題の陳述
2つの異なる遺伝子座が異なる分子上にあるならば、2つの種(FAMプローブおよびVICプローブに対応する)があり得る。異なる遺伝子座が同じ分子上にあるならば、3つの種−断片化FAM、断片化VIC、および連鎖FAM−VIC−があり得る(図41を参照されたし)。
2つの色素があり、そのため不正確さがあり得る。3つすべての種の濃度を計算する必要がある。
アルゴリズム:FAMカウント対VICカウントの2×2表を得る。断片化FAMの濃度および1つの種があるかのごとき連鎖FAM−VICの濃度を計算する。断片化VICの濃度および1つの種があるかのごとき連鎖FAM−VICの濃度を計算する。種々の濃度の連鎖FAM−VIC(これらから断片化FAMおよびVICの濃度を見出すことができる)を試し、実測されたカウントを用いて確率表のベストフィットを見出す:
実施例12
断片化分析
ddPCRを用いて、2つのゲノム遺伝子座、例えば共通染色体上の2つの遺伝子を標的にするデュプレックス反応を行うことができる。液滴をそれらの蛍光に従って4集団にカテゴリー分けすることができる(FAM+/VIC+、FAM+/VIC−、FAM−/VIC+、およびFAM−/VIC−)。これらの集団に関する液滴の数を比較することにより、標的が同じ液滴に相互に分離する頻度を決定することが可能である。ポアソン統計学を用いて、2つの分離されたコピーが偶然に同じ液滴内にある事例に対する実際に互いに連鎖している種の百分率を推定することができる。
断片化分析
ddPCRを用いて、2つのゲノム遺伝子座、例えば共通染色体上の2つの遺伝子を標的にするデュプレックス反応を行うことができる。液滴をそれらの蛍光に従って4集団にカテゴリー分けすることができる(FAM+/VIC+、FAM+/VIC−、FAM−/VIC+、およびFAM−/VIC−)。これらの集団に関する液滴の数を比較することにより、標的が同じ液滴に相互に分離する頻度を決定することが可能である。ポアソン統計学を用いて、2つの分離されたコピーが偶然に同じ液滴内にある事例に対する実際に互いに連鎖している種の百分率を推定することができる。
遺伝子座が共通の参照(RPP30)から1K、3K、10K、33Kおよび100K離隔しているアッセイを設計する。2つの遺伝子座が1K、10Kおよび100Kまで隔てられている研究を行った。これら3つのデュプレックス(または1つだけのデュプレックス)を有する未切断(制限酵素消化されていない)DNAをプロセッシングし、4つの異なる液滴集団をカウントして、統計分析を用いて遺伝物質の断片化状態を評価することができる。コピー数変動研究についての95%信頼限界が常に整数値にわたるとは限らない理由の説明に役立てるためにこれらのデータを用いることができる。
実施例13
DNA断片化の計算のためのまたはデジタルPCR多重化のためのアルゴリズム
標的間の完全断片化
2つの色素、FAMおよびVICそれぞれに対応する2つのDNA標的T1およびT2。この実施例では、T1およびT2は常に別々のDNA断片上にある。T1およびT2標的を有するDNA断片の数は、それぞれM1およびM2である。図42Aを参照されたし。
DNA断片化の計算のためのまたはデジタルPCR多重化のためのアルゴリズム
標的間の完全断片化
2つの色素、FAMおよびVICそれぞれに対応する2つのDNA標的T1およびT2。この実施例では、T1およびT2は常に別々のDNA断片上にある。T1およびT2標的を有するDNA断片の数は、それぞれM1およびM2である。図42Aを参照されたし。
複数の区画を用いるデジタルPCR実験において、FAMおよびVIC陽性区画のカウントは、それぞれN1およびN2である。1区画に複数のDNA断片がある場合があるので、N1およびN2は、それぞれM1およびM2より小さい。区画の総数はNである。予測されたとおりの区画のカウントを表2に示す。
T2およびT2分子の数、それぞれM1およびM2を次のように計算することができる:
M1=−N log(1−p1)
M2=−N log(1−p2)
(Pが正であるN個デジタル区画を仮定すると、分子の数は、M=−N log(1−P/N)である)。
M1=−N log(1−p1)
M2=−N log(1−p2)
(Pが正であるN個デジタル区画を仮定すると、分子の数は、M=−N log(1−P/N)である)。
標的間での断片化なし
T1とT2両方が常に同じDNA断片上にあるならば、(おそらく、それらの遺伝子座は、染色体の同じ部分上の互いの相当近くにあるため、および制限酵素消化はT1とT2の間で消化しなかったため)それらは連鎖している。図42Bを参照されたし。したがって、N1=N2。
T1とT2両方が常に同じDNA断片上にあるならば、(おそらく、それらの遺伝子座は、染色体の同じ部分上の互いの相当近くにあるため、および制限酵素消化はT1とT2の間で消化しなかったため)それらは連鎖している。図42Bを参照されたし。したがって、N1=N2。
T1およびT2分子の数を次のよう計算するにことができる(式中、p1=N1/N):
M1=−N log(1−p1)
M2=−N log(1−p1)。
M1=−N log(1−p1)
M2=−N log(1−p1)。
部分断片化
中間の状況では、T1およびT2は、幾つかの断片の上で連鎖しているが、ことによると離隔断片上にもある。図42Cを参照されたし。
中間の状況では、T1およびT2は、幾つかの断片の上で連鎖しているが、ことによると離隔断片上にもある。図42Cを参照されたし。
連鎖しているT1およびT2断片のM3分子、別々のT1断片のM1分子、および別々のT2断片のM2分子がある場合、区画のカウントについての下記の表を作ることができる:
実施例14
マイルポストアッセイでの血漿中のDNAの質の評価
より高いDNA収量を有するサンプル中の余分のDNAは、たいていはサイズが大きいようである。図43に示すように、DNA収量がおよそ2kGE(ゲノム当量)/mLであるとき、DNAの大体半分は1Kb未満のサイズであり;該収量が極めて高い(10kGE/mL以上の)とき、DNAの90%は1Kbより大きい。これは、小さいDNAの濃度が比較的一定していることを示唆している。これは、より高い収量が細胞DNAからの混入に起因することをさらに示唆している。
マイルポストアッセイでの血漿中のDNAの質の評価
より高いDNA収量を有するサンプル中の余分のDNAは、たいていはサイズが大きいようである。図43に示すように、DNA収量がおよそ2kGE(ゲノム当量)/mLであるとき、DNAの大体半分は1Kb未満のサイズであり;該収量が極めて高い(10kGE/mL以上の)とき、DNAの90%は1Kbより大きい。これは、小さいDNAの濃度が比較的一定していることを示唆している。これは、より高い収量が細胞DNAからの混入に起因することをさらに示唆している。
実施例15
血漿中の大きいDNAによる混入はCNV値に影響を及ぼす
大きいサイズのDNAの混入は、測定されたCNV値を低下させ得る。上部の図(図44)は、測定されたCNV値とDNAサイズとの良好な相関を示す。このサイズの影響は、DNAの前処理によって大きく除かれる(下部の図、菱形)。予備データは、CNV測定前のDNAの適切な断片化で、異なる種間の測定されたCNV値が同一になることを示す(ここではデータを示さない)。
血漿中の大きいDNAによる混入はCNV値に影響を及ぼす
大きいサイズのDNAの混入は、測定されたCNV値を低下させ得る。上部の図(図44)は、測定されたCNV値とDNAサイズとの良好な相関を示す。このサイズの影響は、DNAの前処理によって大きく除かれる(下部の図、菱形)。予備データは、CNV測定前のDNAの適切な断片化で、異なる種間の測定されたCNV値が同一になることを示す(ここではデータを示さない)。
実施例16
CNV分析のための制限酵素力価測定
制限酵素(RE)の力価を測定して、試験アッセイにおけるCNV分析のためのそれらの使用を決定することができる。17の制限酵素(殆どが4カッター)を分析する。図45を参照されたし。制限酵素濃度は、4倍希釈系列:20、5、1.25、0.31、0.08 、0.02および0.005U/(μg DNA)を含む;未消化対照+バッファー;1濃度につき4反復ddPCR;DNAインプット:0.5cpd。効率的/完全制限消化を0.02U/μg DNAほどもの低い濃度で果たすことができる。効率的RE濃度範囲は、標的および酵素によって様々であり得る。5U/μg DNAは、CNV分析のためのより普遍的な消化プロトコルを可能にする、殆どの制限酵素についての最高ddPCR濃度をもたらすようである。試験した17すべての制限酵素に関して、20U RE/μg DNAで非特異的RE活性は観察されなかった。図46を参照されたし。
CNV分析のための制限酵素力価測定
制限酵素(RE)の力価を測定して、試験アッセイにおけるCNV分析のためのそれらの使用を決定することができる。17の制限酵素(殆どが4カッター)を分析する。図45を参照されたし。制限酵素濃度は、4倍希釈系列:20、5、1.25、0.31、0.08 、0.02および0.005U/(μg DNA)を含む;未消化対照+バッファー;1濃度につき4反復ddPCR;DNAインプット:0.5cpd。効率的/完全制限消化を0.02U/μg DNAほどもの低い濃度で果たすことができる。効率的RE濃度範囲は、標的および酵素によって様々であり得る。5U/μg DNAは、CNV分析のためのより普遍的な消化プロトコルを可能にする、殆どの制限酵素についての最高ddPCR濃度をもたらすようである。試験した17すべての制限酵素に関して、20U RE/μg DNAで非特異的RE活性は観察されなかった。図46を参照されたし。
実施例17
難しいddPCR CNVアッセイを最適化するためのプロトコルの開発
温度勾配の使用により、最適なアニール温度の決定が可能になり得る。GC添加剤(GC additive)の使用は、二次構造を低減させることができ、この二次構造は、別の方法で、ポリメラーゼ活性を遮断することがあり、または競合する非特異的増幅産物の形成をもたらすことがある。添加剤の一例は、GC Rich Enhancer Solution(5X)(Roche)である。図47を参照されたし。
難しいddPCR CNVアッセイを最適化するためのプロトコルの開発
温度勾配の使用により、最適なアニール温度の決定が可能になり得る。GC添加剤(GC additive)の使用は、二次構造を低減させることができ、この二次構造は、別の方法で、ポリメラーゼ活性を遮断することがあり、または競合する非特異的増幅産物の形成をもたらすことがある。添加剤の一例は、GC Rich Enhancer Solution(5X)(Roche)である。図47を参照されたし。
実施例18
ddPCRでの制限酵素活性の測定
Alu IおよびMse Iは、広範な濃度にわたって許容可能に動作する。完全切断が発生すると推測される酵素濃度で少量の残留標的が残存する。NEB酵素とFermentas酵素は両方ともよく動作するが、Fermentas酵素のほうが多少有効である。Fermentas酵素は、使用の容易さの点で有利である。
ddPCRでの制限酵素活性の測定
Alu IおよびMse Iは、広範な濃度にわたって許容可能に動作する。完全切断が発生すると推測される酵素濃度で少量の残留標的が残存する。NEB酵素とFermentas酵素は両方ともよく動作するが、Fermentas酵素のほうが多少有効である。Fermentas酵素は、使用の容易さの点で有利である。
図48の左のパネルは、NEWおよびFermentasから購入したAlu Iを使用するアッセイを描写するものである。このアッセイにおいて使用するプライマーは、FWDプライマー5’−GGCCCTCATCCACCATAACAC−3’、REVプライマー5’−GTGTGGAGCAGAGCTTGGT−3’であり得る。プローブは、5’−6FAM−TCCGAAAGAGCTGGTC−MGB−NFQ−3’であり得; Alu Iは、このアプリコン配列を2回切断する。図48の右のパネルは、Mse Iを使用するアッセイを描写するものである。このアッセイにおいて使用するプライマーは、5’−CTCCCTCTCCATAGCTACTTAAGGA−3’、REV 5’−CAAGGAGCCCTAACCAATGGA−3’であり得、一方、プローブは5’−6FAM−AAGGCAGAGATTAAAG−MGB−NFQ−3’であり得る。Mse Iは、このアプリコン配列を2回切断する。図48に示すように、Alu IまたはMseIのいずれかは、参照遺伝子を切断する。この実験では、サンプルに添加するRE量の力価を測定する。REが高レベルで存在するとき、REは、アッセイが増幅させるように設計されている標的を消化するはずである。標的が消化されるにつれて陽性液滴数が減少する。標的が消化されると、陽性液滴は殆どまたは全く現れない。図48を参照されたし。
実施例19
併置によるハプロタイプ決定
併置によりハプロタイプ決定情報を獲得するための方法を提供する。この方法は、標的核酸配列の欠失があるかどうかを決定するために用いることができる。(例えば、VIC標識プローブで検出される)マーカー配列は、コピー数変動領域内の、(例えば、FAM標識プローブで検出される)標的配列の付近だが、外側であり得る。核酸を含むサンプルを複数の空間的に孤立した領域に分配することができ、マーカーおよび標的配列を(例えば、増幅、およびプローブでの検出によって)検出することができる。図49に描写するように、VIC(マーカー)およびFAM(標的)の併置を分析することができる。VICおよびVAMが1つの区画内に常に共局在する場合には、標的配列の欠失が存在しない可能性がある(図49B)。FAMと共局在していないVICのみを有する区画がある場合、この結果は、標的配列の欠失を示唆する(図49A)。
併置によるハプロタイプ決定
併置によりハプロタイプ決定情報を獲得するための方法を提供する。この方法は、標的核酸配列の欠失があるかどうかを決定するために用いることができる。(例えば、VIC標識プローブで検出される)マーカー配列は、コピー数変動領域内の、(例えば、FAM標識プローブで検出される)標的配列の付近だが、外側であり得る。核酸を含むサンプルを複数の空間的に孤立した領域に分配することができ、マーカーおよび標的配列を(例えば、増幅、およびプローブでの検出によって)検出することができる。図49に描写するように、VIC(マーカー)およびFAM(標的)の併置を分析することができる。VICおよびVAMが1つの区画内に常に共局在する場合には、標的配列の欠失が存在しない可能性がある(図49B)。FAMと共局在していないVICのみを有する区画がある場合、この結果は、標的配列の欠失を示唆する(図49A)。
実施例20
DNAサンプルの保管
図20Aおよび20Bは、保管された消化DNAのMRGPRX1 CNV値のドリフトを図示する。図20Aにおいて、消化サンプルは、一貫して整数より下のCNV値を示す。図20Bにおいて、CNV値は、より整数に近かった。分析したサンプルには、Coriell精製DNAサンプル:NA11994、NA18507、NA18502、NA19221、NA19205、NA18916およびNA19108が含まれた。図20Aに描写したサンプルは、図20Bにおけるサンプルとは異なる日に分析した。簡単に言うと、RsaIを使用してサンプルを消化し、標準的なddPCR熱サイクリング条件を用いた:95℃10分間(1サイクル)、94℃30秒間および60℃1分間(40サイクル)、98℃10分間(1サイクル)、12℃での保持。
DNAサンプルの保管
図20Aおよび20Bは、保管された消化DNAのMRGPRX1 CNV値のドリフトを図示する。図20Aにおいて、消化サンプルは、一貫して整数より下のCNV値を示す。図20Bにおいて、CNV値は、より整数に近かった。分析したサンプルには、Coriell精製DNAサンプル:NA11994、NA18507、NA18502、NA19221、NA19205、NA18916およびNA19108が含まれた。図20Aに描写したサンプルは、図20Bにおけるサンプルとは異なる日に分析した。簡単に言うと、RsaIを使用してサンプルを消化し、標準的なddPCR熱サイクリング条件を用いた:95℃10分間(1サイクル)、94℃30秒間および60℃1分間(40サイクル)、98℃10分間(1サイクル)、12℃での保持。
MRGPRX1アッセイ配列は、(フォワードプライマー)5’−TTAAGCTTCATCAGTATCCCCCA−3’、(リバースプライマー)5’−CAAAGTAGGAAAACATCATCACAGGA−3’、および(プローブ)6FAM−ACCATCTCTAAAATCCT−MGBNFQであった。RRP30(VIC標識したもの)に対してサンプルを反復した;RPP30参照アッセイ(フォワードプライマー)5’−GATTTGGACCTGCGAGCG−3’、(リバースプライマー)5’−GCGGCTGTCTCCACAAGT−3’、および(プローブ)VIC−CTGACCTGAAGGCTCT−MGBNFQ。DNAを直ぐに(消化の24時間以内に)プロセッシングした。
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明したが、かかる実施形態を単に例として提供したことは当業者には明らかである。今や、本発明を逸脱しない非常に多数の変形、変更および置換が当業者に想起される。本明細書に記載する本発明の実施形態に対する様々な代案を本発明の実施の際に用いることができることは、理解されるはずである。後続の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義すると解釈されるものとし、また本特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物が、本特許請求の範囲よって包含されると解釈されるものとする。
Claims (116)
- 標的核酸のコピー数の変動を検出する方法であって、
a.少なくとも1つの薬剤と、第一の標的核酸および第二の標的核酸を含む複数のポリヌクレオチドを含むサンプルとを接触させる工程;
b.前記薬剤が、前記2つの標的核酸が同じポリヌクレオチド上に位置するときに前記2つの標的核酸間の特異的に選択された標的部位を開裂させて、その結果、前記2つの標的核酸を分離できるようにする条件に、前記サンプルを供する工程;
c.前記薬剤と接触した前記サンプルを複数の空間的に孤立した区画に分ける工程;
d.前記標的核酸を含む空間的に孤立した区画の数を計数する工程;ならびに
e.前記計数する工程に基づき前記標的核酸のコピー数を決定する工程
を包含する、方法。 - 前記空間的に孤立した区画が、エマルジョン中の液滴である、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸が、1液滴につき約5コピー未満の平均濃度で存在する、請求項2に記載の方法。
- 前記特異的に選択された標的部位が、前記第一の標的核酸と前記第二の標的核酸との間に位置する、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を増幅反応に供する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、同一配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、異なる配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記特異的に選択された標的部位が、制限酵素での消化が可能な部位である、請求項1に記載の方法。
- 前記薬剤が、1つ以上の制限酵素である、請求項1に記載の方法。
- 前記特異的に選択された部位および前記第一の標的核酸が、同じ遺伝子内に位置する、請求項1に記載の方法。
- 前記標的核酸が、疾患または障害と相関する、請求項1に記載の方法。
- 参照核酸を含む空間的に孤立した区画の数を計数する工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記参照核酸が、前記サンプルが由来するゲノム内に固定コピー数で存在する、請求項12に記載の方法。
- 前記参照核酸が、ハウスキーピング遺伝子である、請求項12に記載の方法。
- 前記参照核酸が、前記サンプルが由来する二倍体ゲノム1つにつき2コピーで存在する、請求項12に記載の方法。
- 前記標的核酸のコピー数を決定する工程が、計数された標的核酸の数を計数された参照核酸の数で割ることを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記薬剤が、前記標的核酸の配列を切断しない、請求項1に記載の方法。
- 前記薬剤が、前記参照核酸の配列を切断しない、請求項12に記載の方法。
- 前記標的核酸が、単一ポリヌクレオチド上に複数のコピーで存在する、請求項1に記載の方法。
- 前記1つ以上の制限酵素が、前記2つの標的配列の間に1つより多い認識配列を有する、請求項9に記載の方法。
- 前記1つ以上の制限酵素が、有意なスター活性を呈さない、請求項9に記載の方法。
- 前記1つ以上の制限酵素が、2つ以上の制限酵素を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記1つ以上の制限酵素を選択するためにソフトウェアが使用される、請求項9に記載の方法。
- 前記1つ以上の制限酵素が、前記ポリヌクレオチドを消化した後に熱不活化される、請求項9に記載の方法。
- 前記熱不活化の温度が、制限された標的断片の融点よりも、前記標的断片の二本鎖性を維持するために、低い、請求項24に記載の方法。
- 前記1つ以上の制限酵素による核酸の消化の効率を測定するために対照制限酵素消化が行われる、請求項9に記載の方法。
- 前記サンプル中の断片化される連鎖した標的配列の百分率が決定される、請求項1に記載の方法。
- 核酸のコピー数の変動を検出する方法であって、
a.複数のポリヌクレオチドを含むサンプルを提供する工程であって、前記複数のポリヌクレオチドは、前記複数のポリヌクレオチドのうちの少なくとも1つのポリヌクレオチド内に位置する第一の標的核酸および第二の標的核酸を含む、工程;
b.前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が同じポリヌクレオチド中に存在するとき、前記少なくとも1つのポリヌクレオチドを前記第一の標的核酸と前記第二の標的核酸との間で開裂させて、開裂されたサンプルを形成する工程;
c.前記開裂されたサンプルを複数の空間的に孤立した領域に分ける工程;
d.前記標的核酸を含む空間的に孤立した領域の数を計数する工程;ならびに
e.少なくとも2つの前記標的核酸のうちの2つが同じポリヌクレオチドの同じ領域内に位置する場合、前記計数する工程に基づき前記標的核酸のコピー数を決定する工程
を包含する、方法。 - 1メガベース未満の塩基が、前記2つの標的核酸を隔てている、請求項28に記載の方法。
- 1キロベース未満の塩基が、前記2つの標的核酸を隔てている、請求項28に記載の方法。
- 前記開裂する工程が、制限酵素で果たされる、請求項28に記載の方法。
- 前記複数の空間的に孤立した領域が、エマルジョン中の液滴である、請求項28に記載の方法。
- 工程dの計数する工程の前にPCR反応を行う工程をさらに含む、請求項28に記載の方法。
- シークエンシング反応を含まない、請求項28に記載の方法。
- 標的核酸のコピー数の変動を検出する方法であって、
a.(i)複数のポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、第一標的核酸、および前記第一標的核酸のコピーを含む、複数のポリヌクレオチドと(ii)前記標的核酸を検出するための蛍光標識を有するプローブと(iii)PCR反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを得る工程;
b.平均で5未満の標的核酸を含む複数の空間的に孤立した区画に前記サンプルを分ける工程;
c.前記標的核酸を検出するために前記サンプルをPCR増幅反応に供する工程;
d.前記PCR反応のための前記試薬のいずれかが限界になる前に前記蛍光標識の蛍光強度を検出する工程であって、ここで、区画内のより高い蛍光強度がポリヌクレオチド上の1つより多くの標的核酸の存在の指標となる、工程;
e.前記標的核酸の1個のコピーを示す閾値より上の蛍光強度を有する区画の数を計数する工程;
f.前記標的核酸の複数のコピーを示す閾値より上の蛍光強度を有する区画の数を計数する工程;ならびに
g.(i)工程eおよび工程fにおいて得た数に基づいて前記標的核酸のコピー数を算出する工程、または(ii)2つの標的核酸が同じポリヌクレオチド上に存在するかどうかを決定する工程のいずれか
を包含する、方法。 - 前記標的核酸のコピー数増加が、疾患または障害と相関する、請求項35に記載の方法。
- 同じポリヌクレオチド上に存在する場合の複数の標的核酸を同定する方法であって、
a.第一の標的核酸および第二の標的核酸を含む複数のポリヌクレオチドを含むサンプルを少なくとも2つのサブサンプルを分ける工程;
b.前記第一の標的核酸と第二の標的核酸を、それらが同じポリヌクレオチド上に存在する場合に物理的に分離することが可能な薬剤と第一のサブサンプルとを接触させる工程;
c.工程bの後、前記第一のサブサンプルを第一セットの区画に分ける工程;
d.前記第一セットの区画の中の前記標的核酸を含む区画の数を決定する工程;
e.第二のサブサンプルを第二セットの区画に分ける工程;
f.前記第二セットの区画の中の標的核酸を含む区画の数を決定する工程;ならびに
g.工程dで得た値と工程fで得た値を比較して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、同じポリヌクレオチド内に存在するかどうかを決定する工程
を包含する、方法。 - 前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、同じ配列を含む、請求項37に記載の方法。
- 前記薬剤が、制限酵素である、請求項37に記載の方法。
- 工程dにおいて得た数が、工程fにおいて得た数より有意に高いとき、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の連鎖が示される、請求項37に記載の方法。
- 前記制限酵素が、前記第一の標的核酸と前記第二の標的核酸との間の部位を認識する、請求項39に記載の方法。
- 第一の標的配列および第二の標的配列が、互いに1メガベース未満以内に位置する、請求項37に記載の方法。
- 前記サンプルを1つ以上の制限酵素と接触させた後、前記サブサンプルを分ける前に24時間未満の間、前記サンプルが保管される、請求項39に記載の方法。
- 前記標的配列が、前記第二のサブサンプルでは物理的に分離されない、請求項37に記載の方法。
- 前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が同じ染色体上にあるのか、または異なる染色体上にあるのかを決定する工程をさらに含む、請求項37に記載の方法。
- 前記第一の標的核酸の配列が、前記第二の標的核酸の配列と異なる、請求項37に記載の方法。
- 前記第一の標的核酸の配列が、前記第二の標的核酸の遺伝的変異である、請求項46に記載の方法。
- 前記遺伝的変異が、一塩基多型である、請求項47に記載の方法。
- 前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、同じ遺伝子内にある、請求項46に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも2つが染色体である、請求項35に記載の方法。
- 前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、別々の染色体上に位置する、請求項50に記載の方法。
- 第一の標的核酸および第二の標的核酸が、同じ染色体上に位置する、請求項50に記載の方法。
- 前記染色体の少なくとも一方が、前記第一の標的核酸の2個のコピーを含む、請求項50に記載の方法。
- 前記染色体の少なくとも一方が、前記第一の標的核酸の少なくとも3個のコピーを含む、請求項50に記載の方法。
- 前記制限酵素のうちの1つ以上が、メチル感受性制限酵素である、請求項39に記載の方法。
- サンプル中のポリヌクレオチドの断片化の確率を決定する方法であって、
a.(i)複数のポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドの少なくとも1つは、第一の標的核酸および第二の標的核酸を含む、複数のポリヌクレオチドと(ii)前記第一の標的核酸を検出するための第一の標識プローブと(iii)前記第二の標的核酸を検出するための第二の標識プローブと(iii)PCR反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを得る工程;
b.前記サンプルを、平均で5未満の標的ポリヌクレオチドを含む複数の空間的に孤立した区画に分ける工程;
c.前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を検出するために、前記サンプルをPCR増幅反応に供する工程;
d.前記区画内の前記標識プローブを検出する工程;
e.工程dに基づき、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の両方を含む区画の数を計数する工程;ならびに
f.前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の両方を含む区画の数と前記サンプルの断片化の程度とを相関させる工程
を包含する、方法。 - 前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が、1メガベース以内で離れている、請求項56に記載の方法。
- 健常被験体では、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が1キロベースより多い塩基によって隔てられている、請求項56に記載の方法。
- 第一の標的核酸および第二の標的核酸の両方を含有する区画の期待数を、前記標的核酸が物理的に連鎖している場合に算出する工程をさらに含む、請求項56に記載の方法。
- 前記断片化の確率が、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸の両方を含有する区画数の減少と正に相関する、請求項56に記載の方法。
- ポリヌクレオチドのサンプル中の2つの遺伝的に連鎖した遺伝子座の断片化の確率を決定するための方法であって、
a.前記サンプルを用いてデジタルPCR(dPCR)を行う工程であって、ここで、前記dPCRは、前記ポリヌクレオチドを分離されたユニットに分離することを含む、工程;
b.第一の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数と前記第一の遺伝子座および第二の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数との第一の合計を決定する工程;
c.前記第二の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数と前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座の存在を示すシグナルを有するユニットの数との第二の合計を決定する工程;ならびに
d.前記第一の合計および前記第二の合計をアルゴリズムにインプットして、断片化されている前記サンプル中の前記2つの遺伝的に連鎖した遺伝子座の百分率を決定する工程
を包含する、方法。 - 前記サンプル中の前記ポリヌクレオチドが、部分的に分解される、請求項56または61に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドがDNAである、請求項56または61に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドがRNAである、請求項56または61に記載の方法。
- 前記ポリヌクレオチドが、DNAとRNAの混合物を含む、請求項56または61に記載の方法。
- ハプロタイプ分析方法であって、
(A)核酸を含有する水性相を複数の別個の容積に分配する工程;
(B)前記核酸内の配列変動を呈する第一の多型性遺伝子座および第二の多型性遺伝子座の各々から少なくとも1つの対立遺伝子配列を前記容積内で増幅させる工程;
(C)同じ容積内の両方の遺伝子座からの対立遺伝子配列の共増幅の少なくとも1つの測定値を決定する工程;ならびに
(D)共増幅の前記少なくとも1つの測定値に基づき、前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座のハプロタイプを選択する工程
を包含する、方法。 - 前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座が、前記核酸の標的領域内に含有され、前記分配する工程が、1容積につき数コピー未満の前記標的領域という平均濃度をもたらす結果となる、請求項66に記載の方法。
- 前記分配する工程が、1容積につき約5コピー未満の前記標的領域という平均濃度をもたらす結果となる、請求項67に記載の方法。
- 前記核酸が、二倍体被験体から得られる、または二倍体被験体に由来する、請求項66に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの測定値を決定する工程が、同じ容積からの前記第二の遺伝子座の対立遺伝子特異的増幅データと相関する前記第一の遺伝子座の対立遺伝子特異的増幅データについての少なくとも1つの相関係数を決定する工程を含む、請求項66に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの測定値を決定する工程が、同じ容積からの前記第二の遺伝子座の対立遺伝子特異的増幅データとそれぞれ相関する前記第一の遺伝子座の第一の対立遺伝子配列および第二の対立遺伝子配列の対立遺伝子特異的増幅データについての第一の相関係数および第二の相関係数を決定する工程をさらに含み、かつ前記ハプロタイプを選択する工程が、前記第一の相関係数と前記第二の相関係数を互いに比較する工程に基づく、請求項66に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの測定値を決定する工程が、前記第一の遺伝子座の特定の対立遺伝子配列と前記第二の遺伝子座の特定の対立遺伝子配列との共増幅を呈する容積の数を決定する工程を含み、かつ前記ハプロタイプを選択する工程が、前記容積の数に基づく、請求項66に記載の方法。
- 前記容積の数を決定する工程が、前記第一の遺伝子座の第一の対立遺伝子配列または第二の対立遺伝子配列と前記第二遺伝子座の特定の対立遺伝子配列とのそれぞれの共増幅を呈する、容積の第一の数および容積の第二の数を決定する工程を含み、かつ前記ハプロタイプを選択する工程が、容積の第一の数および容積の第二の数に基づく、請求項66に記載の方法。
- 前記分配する工程が、前記容積が液滴であるエマルジョンを形成する工程を含む、請求項66に記載の方法。
- ハプロタイプ分析方法であって、
(A)核酸を含有する水性相を複数の別個の容積に分配する工程;
(B)前記核酸内の標的領域に含有される第一の多型性遺伝子座および第二の多型性遺伝子座の各々から少なくとも1つの対立遺伝子配列を前記容積内で増幅させる工程;
(C)個々の容積からの各々の前記遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを収集する工程;
(D)同じ容積からの前記第一の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データと前記第二の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを相関させる工程;ならびに
(E)前記相関させる工程に基づき、前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座についての前記標的領域のハプロタイプを選択する工程
を包含する、方法。 - 前記分配する工程が、エマルジョンを形成する工程を含み、かつ前記収集する工程が、前記エマルジョンの個々の液滴からのデータを収集する工程を含む、請求項75に記載の方法。
- 前記エマルジョンを形成する工程が、前記水性相をオリフィスに通して、前記水性相の単分散液滴を生じさせる工程を含む、請求項75に記載の方法。
- 前記分配する工程が、各容積に平均で約1コピー未満の前記標的領域を配置する、請求項75に記載の方法。
- 前記分配する工程が、各容積に平均で約1ゲノム当量未満の前記核酸を配置する、請求項75に記載の方法。
- 前記分配する工程が、少なくとも約1000容積を形成する工程を含む、請求項75に記載の方法。
- 前記分配する工程が、直径が約10から1000マイクロメートルである液滴を形成する工程を含む、請求項75に記載の方法。
- 前記分配する工程が、増幅された各対立遺伝子配列に特異的にハイブリダイズすることができる光学的に区別可能な蛍光プローブを含む水性相を分配する工程を含む、請求項75に記載の方法。
- 前記核酸が、被験体から得た遺伝物質である、請求項75に記載の方法。
- 前記被験体が多細胞生物である、請求項83に記載の方法。
- 前記被験体が人である、請求項83に記載の方法。
- 前記核酸が、被験体から得たRNAの逆転写によって得たcDNAを含む、請求項75に記載の方法。
- 前記増幅させる工程が、前記第一の遺伝子座から1対の異なる対立遺伝子配列を増幅させる工程を含み、かつ前記データを収集する工程が、個々の液滴中の前記対の各対立遺伝子配列の増幅を区別するデータを収集する工程を含む、請求項75に記載の方法。
- 前記相関させる工程が、前記第一の遺伝子座の各対立遺伝子配列についての対立遺伝子特異的増幅データを前記第二の遺伝子座の対立遺伝子配列についての対立遺伝子特異的増幅データと別々に相関させる工程を含む、請求項75に記載の方法。
- 前記ハプロタイプを選択する工程が、前記第一の遺伝子座についてのどの対立遺伝子特異的増幅データが前記第二の遺伝子座についてのかかる対立遺伝子特異的増幅データとのより高い相関を呈するかに基づく、請求項75に記載の方法。
- 前記収集する工程が、前記容積から逐次的にデータを収集する工程を含む、請求項75に記載の方法。
- 前記相関させる工程が、前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座の増幅データについての少なくとも1つの相関係数を決定する工程を含み、ならびに前記ハプロタイプを選択する工程が、前記少なくとも1つの相関係数に基づく、請求項75に記載の方法。
- 前記ハプロタイプを選択する工程が、前記第一の遺伝子座から増幅されたそれぞれの別個の対立遺伝子配列に対応する相関係数に基づく、請求項91に記載の方法。
- 閾値を前記対立遺伝子特異的増幅データに適用してそれをバイナリ形式に変換する工程をさらに含み、前記相関させる工程が、前記バイナリ形式のデータを用いて行われる、請求項75に記載の方法。
- 前記相関させる工程が、両方の遺伝子座からの特定の対立遺伝子配列の共増幅を呈する容積の数を決定する工程を含む、請求項93に記載の方法。
- 前記相関させる工程が、(1)前記第二の遺伝子座対立遺伝子配列と前記第一の遺伝子座からの第一の対立遺伝子配列の共増幅を呈する容積の第一の数、および前記第二の遺伝子座対立遺伝子配列と前記第一の遺伝子座からの第二の対立遺伝子配列の共増幅を呈する液滴の第二の数を決定する工程、および(2)容積の前記第一の数と前記第二の数を比較する工程を含む、請求項94に記載の方法。
- 前記ハプロタイプを選択する工程が、前記相関させる工程が、同じ容積内の前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座の特定の対立遺伝子配列の共増幅について負の相関を示すか、正の相関を示すかに基づく、請求項75に記載の方法。
- ハプロタイプ分析方法であって、
(A)核酸を含む水性相を複数の別個の容積に分配する工程;
(B)前記核酸内の第一の多型性遺伝子座および第二の多型性遺伝子座の各々から対立遺伝子配列を前記容積内で増幅させる工程;
(C)個々の容積中の各対立遺伝子配列についての対立遺伝子特異的増幅データを収集する工程;ならびに
(D)前記増幅データが同じ容積内の前記対立遺伝子配列の増幅について負の相関を示すか、正の相関を示すかに少なくとも一部は基づいて、前記核酸のハプロタイプを選択する工程
を包含する、方法。 - ハプロタイプ分析方法であって、
(A)核酸を含有する水性相を、複数の液滴に、前記核酸の標的領域が1液滴につき約1コピー未満の平均濃度で存在するように分配する工程;
(B)前記核酸の配列変動を呈し、かつ前記標的領域に含有される第一の多型性遺伝子座および第二の多型性遺伝子座の各々から少なくとも1つの対立遺伝子配列を前記液滴内で増幅させる工程;
(C)同じ液滴内での両方の遺伝子座からの対立遺伝子配列の共増幅の少なくとも1つの測定値を決定する工程;ならびに
(D)共増幅の前記少なくとも1つの測定値に基づき前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座についての前記標的領域のハプロタイプを選択する工程
を包含する、方法。 - 前記増幅させる工程が、前記第一の遺伝子座から第一の対立遺伝子配列および第二の対立遺伝子配列を増幅させる工程を含み、かつ前記決定する工程が、前記第一の対立遺伝子配列についての共増幅の第一の測定値および前記第二の対立遺伝子配列についての共増幅の第二の測定値を決定する工程を含み、かつ前記ハプロタイプを選択する工程が、共増幅の前記第一の測定値および前記第二の測定値の比較に基づく、請求項98に記載の方法。
- ハプロタイプ分析用システムであって、
核酸を含む水性相の液滴を形成するように構成された液滴発生器と、
個々の液滴からの各々の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データを収集するように構成された検出器と、
同じ容積からの第一の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データと第二の遺伝子座についての対立遺伝子特異的増幅データとを相関させ、かつ前記対立遺伝子特異的増幅データの相関に基づいて前記第一の遺伝子座および前記第二の遺伝子座についての前記核酸のハプロタイプを選択するように構成されたプロセッサと
を備える、システム。 - 第一の標的核酸が第二の標的核酸と同じポリヌクレオチド上に存在する確率を決定するための方法であって、
a)ポリヌクレオチドのサンプルを少なくとも2つのサブサンプルに分割する工程;
b)第一のサブサンプルにおいて、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸をショートサイクルPCRで事前増幅させる工程;
c)前記第一のサブサンプルを第一セットの区画に分ける工程;
d)前記第一のサブサンプルからの前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を一緒に含有する区画の数を計数する工程;
e)第二のサブサンプルを第二セットの区画に分ける工程;
f)前記第二のサブサンプルからの前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸を一緒に含有する区画の数を計数する工程;ならびに
g)工程fの値と工程dの値を比較して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が同じポリヌクレオチド上で連鎖している確率を決定する工程
を包含する、方法。 - 前記ショートサイクルPCRが、24サイクル未満のPCR反応を含む、請求項101に記載の方法。
- アルゴリズムを使用して、前記第一の標的核酸および前記第二の標的核酸が同じポリヌクレオチド上でフェージングされる確率を決定する工程をさらに含む、請求項101に記載の方法。
- 染色体からの標的核酸の欠失の確率を同定する方法であって、
(a)(i)1対の染色体であって、前記染色体の少なくとも一方が第一の標的核酸を含有し、かつ両方の染色体が同じマーカー核酸を含有する、1対の染色体と(ii)前記第一の標的核酸を検出するための第一の標識プローブと(iii)前記マーカー核酸を検出するための第二の標識プローブと(iii)PCR反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを複数の区画に細分する工程;
(b)増幅反応を行って、前記区画内の前記第一の標的核酸および前記マーカー核酸を検出する工程;
(c)前記マーカー核酸を含有し、標的核酸を含有しない区画の数を計数する工程;ならびに
(d)工程cの値に基づき前記染色体の少なくとも一方からの前記標的核酸の欠失の確率を決定する工程を包含し、
ここで、工程cにおけるより高い値は、前記標的核酸が前記一対の染色体内の前記染色体の一方に不在である確率の増大と相関する、方法。 - 前記標的核酸が、前記染色体の少なくとも一方の上に複数のコピーで存在すると推測される、請求項104に記載の方法。
- 前記マーカー核酸および前記標的核酸が、前記染色体の少なくとも一方の上に互いに極めて近接して位置する、請求項104に記載の方法。
- 前記マーカー核酸と前記標的核酸とが、5000塩基対以内、離れている、請求項106に記載の方法。
- 前記マーカー核酸が、一塩基多型を含む、請求項104に記載の方法。
- 別のアッセイを行って、異なるポリヌクレオチドの断片化を決定する工程をさらに含む、請求項104に記載の方法。
- 工程dの決定を補助するために前記別のアッセイの結果を使用する工程をさらに含み、欠失の確率が高いことの決定が、前記異なるポリヌクレオチドが断片化されていることの決定によって強化される、請求項109に記載の方法。
- 別のアッセイを行って、前記サンプル中の高分子量DNAの存在を決定する工程をさらに含む、請求項104に記載の方法。
- ポリヌクレオチドからの標的領域の欠失または転座の確率を同定する方法であって、
(a)(i)第一のマーカー核酸および第二のマーカー核酸を含むと推測されるポリヌクレオチドであって、ここで、前記第一のマーカー核酸および前記第二のマーカー核酸が少なくとも1メガベースの塩基によって隔てられており、かつ前記標的領域が前記第一のマーカー核酸と前記第二のマーカー核酸との間に位置すると推測される、ポリヌクレオチドと(ii)前記第一のマーカー核酸を検出するための第一の標識プローブと(iii)前記第二のマーカー核酸を検出するための第二の標識プローブと(iii)PCR反応を可能にするための試薬とを含むサンプルを複数の区画に細分する工程;
(b)増幅反応を行って、前記区画内の前記第一のマーカー核酸および前記第二のマーカー核酸を検出する工程;
(c)前記区画内の前記第一のマーカー核酸および前記第二のマーカー核酸の両方を含有する区画の数を計数する工程;ならびに
(d)工程cの値に基づいて前記標的領域の欠失または転座の確率を決定する工程を包含し、
ここで、工程cにおけるより高い値は、前記標的核酸が前記ポリヌクレオチドに不在である確率の増大と相関する、方法。 - 前記ポリヌクレオチドが染色体である、請求項112に記載の方法。
- 前記標的領域が、野生型被験体に存在することが公知の染色体の特異的領域である、請求項112に記載の方法。
- 別のアッセイを行って、異なるポリヌクレオチドの断片化を決定する工程をさらに含む、請求項112に記載の方法。
- 工程dの決定を補助するために前記別のアッセイの結果を使用する工程をさらに含み、欠失または転座の確率が高いことの決定が、前記異なるポリヌクレオチドが断片化されていないことの決定によって強化される、請求項116に記載の方法。
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US8592221B2 (en) | 2007-04-19 | 2013-11-26 | Brandeis University | Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems |
EP4047367A1 (en) | 2008-07-18 | 2022-08-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method for detecting target analytes with droplet libraries |
US9921154B2 (en) | 2011-03-18 | 2018-03-20 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multiplexed digital assays |
CA2760439A1 (en) | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Good Start Genetics, Inc. | Methods and compositions for evaluating genetic markers |
US9399797B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-07-26 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
CA2810252C (en) | 2010-09-10 | 2019-03-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Detection of rna-interacting regions in dna |
US9163281B2 (en) | 2010-12-23 | 2015-10-20 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction |
CA2826748C (en) * | 2011-02-09 | 2020-08-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method of detecting variations in copy number of a target nucleic acid |
WO2012112606A1 (en) | 2011-02-15 | 2012-08-23 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Detecting methylati0n in a subpopulation of genomic dna |
WO2012112804A1 (en) | 2011-02-18 | 2012-08-23 | Raindance Technoligies, Inc. | Compositions and methods for molecular labeling |
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US8658430B2 (en) | 2011-07-20 | 2014-02-25 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulating droplet size |
CN103732761A (zh) | 2011-08-03 | 2014-04-16 | 伯乐实验室公司 | 使用透化处理的细胞过滤小核酸 |
CA2852665A1 (en) | 2011-10-17 | 2013-04-25 | Good Start Genetics, Inc. | Analysis methods |
EP2798089B1 (en) | 2011-12-30 | 2018-05-23 | Bio-rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for performing nucleic acid amplification reactions |
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US10227635B2 (en) | 2012-04-16 | 2019-03-12 | Molecular Loop Biosolutions, Llc | Capture reactions |
CN103571825B (zh) * | 2012-08-09 | 2016-03-16 | 财团法人工业技术研究院 | 用于生物样本处理之组合物及使用其之核酸扩增方法 |
CA2881685C (en) | 2012-08-14 | 2023-12-05 | 10X Genomics, Inc. | Microcapsule compositions and methods |
US10584381B2 (en) | 2012-08-14 | 2020-03-10 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US10323279B2 (en) | 2012-08-14 | 2019-06-18 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US11591637B2 (en) | 2012-08-14 | 2023-02-28 | 10X Genomics, Inc. | Compositions and methods for sample processing |
US9701998B2 (en) | 2012-12-14 | 2017-07-11 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
US9388465B2 (en) * | 2013-02-08 | 2016-07-12 | 10X Genomics, Inc. | Polynucleotide barcode generation |
US9422602B2 (en) * | 2012-08-15 | 2016-08-23 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for determining nucleic acid degradation |
US9970052B2 (en) | 2012-08-23 | 2018-05-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital assays with a generic reporter |
US9157124B2 (en) * | 2012-09-18 | 2015-10-13 | Institute For Cancer Research | Systems and methods for diagnosing a predisposition to develop colon cancer |
WO2014093714A1 (en) | 2012-12-14 | 2014-06-19 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for using oils for analysis and detection of molecules |
US10533221B2 (en) | 2012-12-14 | 2020-01-14 | 10X Genomics, Inc. | Methods and systems for processing polynucleotides |
WO2014121239A2 (en) | 2013-02-01 | 2014-08-07 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multiplexed digital assay with data exclusion for calculation of target levels |
CN105143462A (zh) * | 2013-02-05 | 2015-12-09 | 生物纳米基因有限公司 | 用于单分子分析的方法 |
US8778609B1 (en) | 2013-03-14 | 2014-07-15 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for analyzing nucleic acids |
US9347095B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-05-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital assays for mutation detection |
US10385394B2 (en) * | 2013-03-15 | 2019-08-20 | The Translational Genomics Research Institute | Processes of identifying and characterizing X-linked disorders |
US9856525B2 (en) | 2013-03-15 | 2018-01-02 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital assays with associated targets |
EP2971117B1 (en) * | 2013-03-15 | 2018-08-08 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Multiplexed digital assay for variant and normal forms of a gene of interest |
US20140303005A1 (en) * | 2013-04-05 | 2014-10-09 | Raindance Technologies, Inc. | Rare cell analysis after negative selection |
US9328384B2 (en) | 2013-05-13 | 2016-05-03 | Elitechgroup B.V. | Droplet digital PCR with short minor groove probes |
EP3005200A2 (en) | 2013-06-03 | 2016-04-13 | Good Start Genetics, Inc. | Methods and systems for storing sequence read data |
CA2916657C (en) * | 2013-06-25 | 2023-08-29 | Carl Wittwer | Methods of performing polymerase chain reaction and related uses thereof |
CN105555972B (zh) | 2013-07-25 | 2020-07-31 | 伯乐生命医学产品有限公司 | 遗传测定 |
WO2015048571A2 (en) * | 2013-09-26 | 2015-04-02 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for chromosome mapping |
US11901041B2 (en) | 2013-10-04 | 2024-02-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analysis of nucleic acid modification |
WO2015058008A2 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-23 | California Institute Of Technology | Enhanced nucleic acid identification and detection |
US10851414B2 (en) | 2013-10-18 | 2020-12-01 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for determining carrier status |
US11041203B2 (en) | 2013-10-18 | 2021-06-22 | Molecular Loop Biosolutions, Inc. | Methods for assessing a genomic region of a subject |
EP3074537A4 (en) * | 2013-11-26 | 2017-07-26 | Bio-rad Laboratories, Inc. | Methods for detecting nucleic acid proximity |
US9944977B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-04-17 | Raindance Technologies, Inc. | Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample |
US11053548B2 (en) | 2014-05-12 | 2021-07-06 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for detecting aneuploidy |
EP4053292A1 (en) | 2014-06-26 | 2022-09-07 | 10X Genomics, Inc. | Methods of analyzing nucleic acids from individual cells or cell populations |
WO2016040446A1 (en) | 2014-09-10 | 2016-03-17 | Good Start Genetics, Inc. | Methods for selectively suppressing non-target sequences |
EP3224595A4 (en) | 2014-09-24 | 2018-06-13 | Good Start Genetics, Inc. | Process control for increased robustness of genetic assays |
CN107636173A (zh) | 2014-11-05 | 2018-01-26 | 加州理工学院 | 生物体对药物的响应的微流体测量 |
EP3271480B8 (en) | 2015-01-06 | 2022-09-28 | Molecular Loop Biosciences, Inc. | Screening for structural variants |
CN104745718B (zh) * | 2015-04-23 | 2018-02-16 | 北京中仪康卫医疗器械有限公司 | 一种检测人类胚胎染色体微缺失和微重复的方法 |
GB201513492D0 (en) | 2015-07-30 | 2015-09-16 | Arcis Biotechnology Holdings Ltd | Method and composition |
WO2017017457A1 (en) * | 2015-07-30 | 2017-02-02 | Arcis Biotechnology Holdings Limited | Method and composition using a quaternary ammonium compound |
US10724100B2 (en) | 2015-09-16 | 2020-07-28 | Institute For Cancer Research | Systems and methods for treating patients having a genetic predisposition to develop prostate cancer |
CN115369161A (zh) * | 2015-12-04 | 2022-11-22 | 10X 基因组学有限公司 | 用于核酸分析的方法和组合物 |
CN105368957A (zh) * | 2015-12-14 | 2016-03-02 | 无锡药明康德生物技术股份有限公司 | Cho细胞基因拷贝数的微滴数字pcr定量检测方法 |
WO2017106768A1 (en) * | 2015-12-17 | 2017-06-22 | Guardant Health, Inc. | Methods to determine tumor gene copy number by analysis of cell-free dna |
JP2019509018A (ja) * | 2016-01-22 | 2019-04-04 | グレイル, インコーポレイテッドGrail, Inc. | 変異に基づく病気の診断および追跡 |
JP7064665B2 (ja) | 2016-03-07 | 2022-05-11 | ファーザー フラナガンズ ボーイズ ホーム ドゥーイング ビジネス アズ ボーイズ タウン ナショナル リサーチ ホスピタル | 非侵襲的分子対照 |
CN105969762A (zh) * | 2016-04-21 | 2016-09-28 | 奥美德诺(北京)基因科技有限公司 | 用于高gc含量的基因组扩增反应试剂及其应用、试剂盒 |
CN111051511A (zh) | 2017-08-04 | 2020-04-21 | 十亿至一公司 | 用于与生物靶相关的表征的靶相关分子 |
US11519024B2 (en) | 2017-08-04 | 2022-12-06 | Billiontoone, Inc. | Homologous genomic regions for characterization associated with biological targets |
EP3697927B1 (en) | 2017-10-19 | 2022-12-14 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital amplification assays with unconventional and/or inverse changes in photoluminescence |
AU2020272770A1 (en) * | 2019-04-09 | 2021-10-28 | Arc Bio, Llc | Compositions and methods for nucleotide modification-based depletion |
WO2020239876A1 (en) * | 2019-05-27 | 2020-12-03 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Method of digital multiplex detection and/or quantification of biomolecules and use thereof |
WO2021011943A2 (en) * | 2019-07-16 | 2021-01-21 | Meliolabs Inc. | Methods and devices for single-cell based digital high resolution melt |
US11427874B1 (en) | 2019-08-26 | 2022-08-30 | Epi One Inc. | Methods and systems for detection of prostate cancer by DNA methylation analysis |
CN114728256A (zh) * | 2019-11-14 | 2022-07-08 | 生物辐射实验室股份有限公司 | 通过非终点扩增进行的单细胞的靶标拷贝数的分区型确定 |
US11162136B1 (en) * | 2020-04-15 | 2021-11-02 | Enumerix, Inc. | Systems and methods for generation of emulsions with suitable clarity with applications of use |
CN112481371A (zh) * | 2020-12-11 | 2021-03-12 | 长沙金域医学检验实验室有限公司 | 一种检测plp1基因拷贝数变异的试剂盒 |
WO2022177851A1 (en) * | 2021-02-16 | 2022-08-25 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Sars cov-2 infectivity determination assay |
CN117794646A (zh) | 2021-06-04 | 2024-03-29 | 伊努梅里斯公司 | 用于单细胞条形码化和测序的组合物、方法和系统 |
WO2023010131A1 (en) * | 2021-07-30 | 2023-02-02 | Ultima Genomics, Inc. | Methods and systems for obtaining and processing sequencing data |
WO2023067110A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Tataa Biocenter Ab | Methods and compositions for detection of mutant nucleic acid sequences |
US11834714B2 (en) | 2021-12-20 | 2023-12-05 | Enumerix, Inc. | Detection and digital quantitation of multiple targets |
WO2023249949A1 (en) * | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Materials and Machines Corporation of America | Sample extraction tube for method for detection of rna or dna |
Family Cites Families (156)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4437975A (en) | 1977-07-20 | 1984-03-20 | Mobil Oil Corporation | Manufacture of lube base stock oil |
US4469863A (en) | 1980-11-12 | 1984-09-04 | Ts O Paul O P | Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof |
US4683194A (en) * | 1984-05-29 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Method for detection of polymorphic restriction sites and nucleic acid sequences |
US4883750A (en) | 1984-12-13 | 1989-11-28 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
US5242794A (en) | 1984-12-13 | 1993-09-07 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
US5235033A (en) | 1985-03-15 | 1993-08-10 | Anti-Gene Development Group | Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof |
US5034506A (en) | 1985-03-15 | 1991-07-23 | Anti-Gene Development Group | Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
IL86724A (en) | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
JP2774121B2 (ja) | 1987-07-31 | 1998-07-09 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 標的ポリヌクレオチド配列の選択的増幅 |
CA1340807C (en) | 1988-02-24 | 1999-11-02 | Lawrence T. Malek | Nucleic acid amplification process |
JP2650159B2 (ja) | 1988-02-24 | 1997-09-03 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | 核酸増幅方法 |
US4988617A (en) | 1988-03-25 | 1991-01-29 | California Institute Of Technology | Method of detecting a nucleotide change in nucleic acids |
US5216141A (en) | 1988-06-06 | 1993-06-01 | Benner Steven A | Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages |
ZA899593B (en) | 1988-12-16 | 1990-09-26 | Siska Diagnostics Inc | Self-sustained,sequence replication system |
US5494810A (en) | 1990-05-03 | 1996-02-27 | Cornell Research Foundation, Inc. | Thermostable ligase-mediated DNA amplifications system for the detection of genetic disease |
US5602240A (en) | 1990-07-27 | 1997-02-11 | Ciba Geigy Ag. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
US5386023A (en) | 1990-07-27 | 1995-01-31 | Isis Pharmaceuticals | Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling |
JPH06500471A (ja) | 1990-08-24 | 1994-01-20 | ザ・ユニバーシティ・オブ・テネシー・リサーチ・コーポレーション | Dna増幅フィンガープリント法 |
WO1992007095A1 (en) | 1990-10-15 | 1992-04-30 | Stratagene | Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes |
US5426180A (en) | 1991-03-27 | 1995-06-20 | Research Corporation Technologies, Inc. | Methods of making single-stranded circular oligonucleotides |
US5644048A (en) | 1992-01-10 | 1997-07-01 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Process for preparing phosphorothioate oligonucleotides |
US5593826A (en) | 1993-03-22 | 1997-01-14 | Perkin-Elmer Corporation, Applied Biosystems, Inc. | Enzymatic ligation of 3'amino-substituted oligonucleotides |
WO1994024143A1 (en) | 1993-04-12 | 1994-10-27 | Northwestern University | Method of forming oligonucleotides |
US5432054A (en) | 1994-01-31 | 1995-07-11 | Applied Imaging | Method for separating rare cells from a population of cells |
SE9400522D0 (sv) | 1994-02-16 | 1994-02-16 | Ulf Landegren | Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences |
US5637684A (en) | 1994-02-23 | 1997-06-10 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Phosphoramidate and phosphorothioamidate oligomeric compounds |
WO1995027066A2 (en) * | 1994-03-31 | 1995-10-12 | Univ Leeds | Dna encoding ubiquitin conjugating enzymes |
US5866337A (en) | 1995-03-24 | 1999-02-02 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method to detect mutations in a nucleic acid using a hybridization-ligation procedure |
SE506908C2 (sv) | 1995-09-08 | 1998-03-02 | Ulf Landegren Inst F Medicinsk | Medicinsk användning av padlockprober |
US6953663B1 (en) | 1995-11-29 | 2005-10-11 | Affymetrix, Inc. | Polymorphism detection |
US7256020B2 (en) | 1996-11-29 | 2007-08-14 | Third Wave Technologies, Inc. | Methods and compositions for detecting target sequences |
SE9601676D0 (sv) | 1996-04-30 | 1996-04-30 | Ulf Landegren | Improved probing of specific mucleic acids |
US6017704A (en) | 1996-06-03 | 2000-01-25 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids |
US5786146A (en) | 1996-06-03 | 1998-07-28 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Method of detection of methylated nucleic acid using agents which modify unmethylated cytosine and distinguishing modified methylated and non-methylated nucleic acids |
GB9704444D0 (en) | 1997-03-04 | 1997-04-23 | Isis Innovation | Non-invasive prenatal diagnosis |
US6143496A (en) * | 1997-04-17 | 2000-11-07 | Cytonix Corporation | Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly |
WO1998056952A1 (en) | 1997-06-09 | 1998-12-17 | University Of Southern California | A cancer diagnostic method based upon dna methylation differences |
EP1985714B1 (en) | 1998-03-25 | 2012-02-29 | Olink AB | Method and kit for detecting a target molecule employing at least two affinity probes and rolling circle replication of padlock probes |
US6203989B1 (en) | 1998-09-30 | 2001-03-20 | Affymetrix, Inc. | Methods and compositions for amplifying detectable signals in specific binding assays |
US6143504A (en) | 1998-10-27 | 2000-11-07 | Arch Development Corporation | Methods and compositions for the diagnosis of fragile X syndrome |
US6331393B1 (en) | 1999-05-14 | 2001-12-18 | University Of Southern California | Process for high-throughput DNA methylation analysis |
US6180349B1 (en) | 1999-05-18 | 2001-01-30 | The Regents Of The University Of California | Quantitative PCR method to enumerate DNA copy number |
WO2001004360A2 (en) | 1999-07-09 | 2001-01-18 | Uab Research Foundation | Retroviral recombination assays and uses thereof |
US6440706B1 (en) | 1999-08-02 | 2002-08-27 | Johns Hopkins University | Digital amplification |
US6586177B1 (en) | 1999-09-08 | 2003-07-01 | Exact Sciences Corporation | Methods for disease detection |
US7060499B1 (en) * | 1999-09-30 | 2006-06-13 | Izumu Saito | DNA containing variant FRT sequences |
US7332275B2 (en) | 1999-10-13 | 2008-02-19 | Sequenom, Inc. | Methods for detecting methylated nucleotides |
US6582938B1 (en) | 2001-05-11 | 2003-06-24 | Affymetrix, Inc. | Amplification of nucleic acids |
US6790328B2 (en) | 2000-01-12 | 2004-09-14 | Ut-Battelle, Llc | Microfluidic device and method for focusing, segmenting, and dispensing of a fluid stream |
US20020151040A1 (en) | 2000-02-18 | 2002-10-17 | Matthew O' Keefe | Apparatus and methods for parallel processing of microvolume liquid reactions |
WO2001077383A2 (en) | 2000-04-11 | 2001-10-18 | Mats Bo Johan Nilsson | Nucleic acid detection medium |
US7659054B1 (en) * | 2000-05-23 | 2010-02-09 | Nuvelo, Inc. | Methods for genetic analysis of DNA to detect sequence variances |
US6475736B1 (en) * | 2000-05-23 | 2002-11-05 | Variagenics, Inc. | Methods for genetic analysis of DNA using biased amplification of polymorphic sites |
US6596493B1 (en) | 2000-08-15 | 2003-07-22 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | Diagnosis and treatment of tumor-suppressor associated disorders |
JP3353149B2 (ja) | 2000-08-28 | 2002-12-03 | ホーコス株式会社 | 工作機械の主軸装置 |
WO2002057491A2 (en) | 2000-10-24 | 2002-07-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Direct multiplex characterization of genomic dna |
US7767881B2 (en) * | 2001-07-02 | 2010-08-03 | Banyu Pharmaceutical Co., Ltd. | Utilization of histamine receptor h3 gene participating in body weight or food intake control |
WO2003008623A2 (en) | 2001-07-15 | 2003-01-30 | Keck Graduate Institute | Methylation analysis using nicking agents |
US6632611B2 (en) * | 2001-07-20 | 2003-10-14 | Affymetrix, Inc. | Method of target enrichment and amplification |
GB2378245A (en) | 2001-08-03 | 2003-02-05 | Mats Nilsson | Nucleic acid amplification method |
US6927028B2 (en) | 2001-08-31 | 2005-08-09 | Chinese University Of Hong Kong | Non-invasive methods for detecting non-host DNA in a host using epigenetic differences between the host and non-host DNA |
US20040014067A1 (en) | 2001-10-12 | 2004-01-22 | Third Wave Technologies, Inc. | Amplification methods and compositions |
US20030124592A1 (en) | 2001-10-24 | 2003-07-03 | Bioprofile, Llc | Methods for detecting genetic haplotypes by interaction with probes |
GB0127564D0 (en) | 2001-11-16 | 2002-01-09 | Medical Res Council | Emulsion compositions |
CA2467460A1 (en) | 2001-11-19 | 2003-05-30 | Parallele Bioscience, Inc. | Multiplex oligonucleotide addition and target amplification |
US6977162B2 (en) | 2002-03-01 | 2005-12-20 | Ravgen, Inc. | Rapid analysis of variations in a genome |
US20040005710A1 (en) | 2002-03-09 | 2004-01-08 | Ho-Sun Son | Method for producing recombinant viruses using site-specific recombination |
US20040005614A1 (en) | 2002-05-17 | 2004-01-08 | Nurith Kurn | Methods for fragmentation, labeling and immobilization of nucleic acids |
WO2004003173A2 (en) | 2002-07-01 | 2004-01-08 | Cleveland State University | Method for detecting mutated polynucleotides within a large population of wild-type polynucleotides |
US9740817B1 (en) * | 2002-10-18 | 2017-08-22 | Dennis Sunga Fernandez | Apparatus for biological sensing and alerting of pharmaco-genomic mutation |
US10229244B2 (en) | 2002-11-11 | 2019-03-12 | Affymetrix, Inc. | Methods for identifying DNA copy number changes using hidden markov model based estimations |
US7822555B2 (en) | 2002-11-11 | 2010-10-26 | Affymetrix, Inc. | Methods for identifying DNA copy number changes |
JP2006519977A (ja) | 2002-11-11 | 2006-08-31 | アフィメトリックス インコーポレイテッド | Dnaコピー数変化を同定するための方法 |
US7700325B2 (en) * | 2003-01-17 | 2010-04-20 | Trustees Of Boston University | Haplotype analysis |
US7041481B2 (en) | 2003-03-14 | 2006-05-09 | The Regents Of The University Of California | Chemical amplification based on fluid partitioning |
US7718364B2 (en) | 2003-03-25 | 2010-05-18 | John Wayne Cancer Institute | DNA markers for management of cancer |
US20060078893A1 (en) | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Medical Research Council | Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control |
US7288373B2 (en) | 2003-05-02 | 2007-10-30 | Human Genetic Signatures Pty Ltd. | Treatment of methylated nucleic acid |
US7300755B1 (en) * | 2003-05-12 | 2007-11-27 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Methods for haplotyping genomic DNA |
CA2530506A1 (en) | 2003-07-04 | 2005-01-13 | Johnson & Johnson Research Pty. Limited | Method for detection of alkylated cytosine in dna |
WO2005010145A2 (en) | 2003-07-05 | 2005-02-03 | The Johns Hopkins University | Method and compositions for detection and enumeration of genetic variations |
JP2007506429A (ja) | 2003-09-23 | 2007-03-22 | アトム・サイエンシズ・インコーポレーテッド | ポリマー核酸のハイブリダイゼーションプローブ |
ES2432025T3 (es) | 2003-10-09 | 2013-11-29 | Epigenomics Ag | Conversión mejorada de ADN con bisulfito |
US7910296B2 (en) | 2003-10-21 | 2011-03-22 | Orion Genomics Llc | Methods for quantitative determination of methylation density in a DNA locus |
GB0327909D0 (en) | 2003-12-02 | 2004-01-07 | Babraham Inst | Methods |
EP1727911B1 (en) | 2004-03-26 | 2013-01-23 | Sequenom, Inc. | Base specific cleavage of methylation-specific amplification products in combination with mass analysis |
US20050250147A1 (en) | 2004-05-10 | 2005-11-10 | Macevicz Stephen C | Digital profiling of polynucleotide populations |
EP1756307A1 (en) | 2004-05-20 | 2007-02-28 | Trillion Genomics Limited | Use of mass labelled probes to detect target nucleic acids using mass spectrometry |
DE102004029700A1 (de) | 2004-06-15 | 2006-02-09 | Epigenomics Ag | Verfahren zur Quantifizierung methylierter DNA |
US7695941B2 (en) | 2005-06-16 | 2010-04-13 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Multiplexed polymerase chain reaction for genetic sequence analysis |
US20060073511A1 (en) | 2004-10-05 | 2006-04-06 | Affymetrix, Inc. | Methods for amplifying and analyzing nucleic acids |
WO2007044091A2 (en) | 2005-06-02 | 2007-04-19 | Fluidigm Corporation | Analysis using microfluidic partitioning devices |
US7368242B2 (en) | 2005-06-14 | 2008-05-06 | Affymetrix, Inc. | Method and kits for multiplex hybridization assays |
US20060292585A1 (en) | 2005-06-24 | 2006-12-28 | Affymetrix, Inc. | Analysis of methylation using nucleic acid arrays |
WO2007008605A1 (en) | 2005-07-08 | 2007-01-18 | Niman Henry L | Identifying and predicting influenza variants and uses thereof |
WO2007037678A2 (en) * | 2005-09-29 | 2007-04-05 | Keygene N.V. | High throughput screening of mutagenized populations |
US7537897B2 (en) | 2006-01-23 | 2009-05-26 | Population Genetics Technologies, Ltd. | Molecular counting |
PT2385143T (pt) | 2006-02-02 | 2016-10-18 | Univ Leland Stanford Junior | Rastreio genético fetal não-invasivo por análise digital |
ATE508209T1 (de) | 2006-02-28 | 2011-05-15 | Univ Louisville Res Found | Erkennung von chromosomabnormalitäten im fötus mit hilfe der tandem-einzelnukleotid- polymorphismen |
DK1991698T3 (en) | 2006-03-01 | 2014-03-10 | Keygene Nv | "High-throughput" -sekvensbaseret detection of SNPs using ligeringsassays |
US20100092981A1 (en) | 2006-04-03 | 2010-04-15 | Genzyme Corporation | Methods of detecting hypermethylation |
US8828661B2 (en) | 2006-04-24 | 2014-09-09 | Fluidigm Corporation | Methods for detection and quantification of nucleic acid or protein targets in a sample |
US7754428B2 (en) | 2006-05-03 | 2010-07-13 | The Chinese University Of Hong Kong | Fetal methylation markers |
US9074242B2 (en) * | 2010-02-12 | 2015-07-07 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
EP2530168B1 (en) | 2006-05-11 | 2015-09-16 | Raindance Technologies, Inc. | Microfluidic Devices |
CA2651510C (en) | 2006-05-12 | 2016-08-09 | Cepheid | Dna recombination junction detection |
US8137912B2 (en) | 2006-06-14 | 2012-03-20 | The General Hospital Corporation | Methods for the diagnosis of fetal abnormalities |
EP4108780A1 (en) | 2006-06-14 | 2022-12-28 | Verinata Health, Inc. | Rare cell analysis using sample splitting and dna tags |
EP3406736B1 (en) | 2006-06-14 | 2022-09-07 | Verinata Health, Inc. | Methods for the diagnosis of fetal abnormalities |
US9012390B2 (en) | 2006-08-07 | 2015-04-21 | Raindance Technologies, Inc. | Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants |
US8568979B2 (en) * | 2006-10-10 | 2013-10-29 | Illumina, Inc. | Compositions and methods for representational selection of nucleic acids from complex mixtures using hybridization |
US20090068648A1 (en) | 2006-10-13 | 2009-03-12 | Zohar Yakhini | Method and system for determining a quality metric for comparative genomic hybridization experimental results |
AU2007310412B2 (en) * | 2006-10-27 | 2013-02-14 | Decode Genetics Ehf. | Cancer susceptibility variants on Chr8q24.21 |
US8262900B2 (en) | 2006-12-14 | 2012-09-11 | Life Technologies Corporation | Methods and apparatus for measuring analytes using large scale FET arrays |
US9290803B2 (en) | 2007-04-12 | 2016-03-22 | University Of Southern California | DNA methylation analysis by digital bisulfite genomic sequencing and digital methylight |
US20100130369A1 (en) * | 2007-04-23 | 2010-05-27 | Advanced Liquid Logic, Inc. | Bead-Based Multiplexed Analytical Methods and Instrumentation |
US20110033848A1 (en) * | 2007-06-07 | 2011-02-10 | Simons Haplomics Limited | Epigenetic methods |
EP2173509A4 (en) | 2007-06-25 | 2013-11-06 | Affymetrix Inc | STRUCTURED MICROCODES |
US8685642B2 (en) * | 2007-07-30 | 2014-04-01 | Agilent Technologies, Inc. | Allele-specific copy number measurement using single nucleotide polymorphism and DNA arrays |
US20090053719A1 (en) * | 2007-08-03 | 2009-02-26 | The Chinese University Of Hong Kong | Analysis of nucleic acids by digital pcr |
AU2008295992B2 (en) | 2007-09-07 | 2014-04-17 | Fluidigm Corporation | Copy number variation determination, methods and systems |
US20110015084A1 (en) | 2007-10-25 | 2011-01-20 | Monsanto Technology Llc | Methods for Identifying Genetic Linkage |
US8518640B2 (en) * | 2007-10-29 | 2013-08-27 | Complete Genomics, Inc. | Nucleic acid sequencing and process |
US20090286286A1 (en) | 2007-11-06 | 2009-11-19 | Ambergen , Inc. | Methods for controlling amplification |
WO2009105531A1 (en) * | 2008-02-19 | 2009-08-27 | Gene Security Network, Inc. | Methods for cell genotyping |
US9487822B2 (en) | 2008-03-19 | 2016-11-08 | Fluidigm Corporation | Method and apparatus for determining copy number variation using digital PCR |
EP4047367A1 (en) | 2008-07-18 | 2022-08-24 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method for detecting target analytes with droplet libraries |
EP3358019B1 (en) | 2008-08-12 | 2019-09-25 | Stokes Bio Limited | Methods for digital pcr |
WO2010030929A1 (en) | 2008-09-12 | 2010-03-18 | Navigenics, Inc. | Methods and systems for incorporating multiple environmental and genetic risk factors |
US8476013B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-07-02 | Sequenom, Inc. | Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses |
US8962247B2 (en) | 2008-09-16 | 2015-02-24 | Sequenom, Inc. | Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses |
US9156010B2 (en) | 2008-09-23 | 2015-10-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Droplet-based assay system |
US9598725B2 (en) | 2010-03-02 | 2017-03-21 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Emulsion chemistry for encapsulated droplets |
US20120252015A1 (en) | 2011-02-18 | 2012-10-04 | Bio-Rad Laboratories | Methods and compositions for detecting genetic material |
US20110159499A1 (en) | 2009-11-25 | 2011-06-30 | Quantalife, Inc. | Methods and compositions for detecting genetic material |
US20120171683A1 (en) | 2010-03-02 | 2012-07-05 | Ness Kevin D | Analysis of fragmented genomic dna in droplets |
CN102405402A (zh) | 2008-09-23 | 2012-04-04 | 阔达生命有限公司 | 基于液滴的测定系统 |
US8450063B2 (en) | 2009-01-28 | 2013-05-28 | Fluidigm Corporation | Determination of copy number differences by amplification |
DE102009027370A1 (de) | 2009-07-01 | 2011-01-05 | Robert Bosch Gmbh | Verfahren zur Herstellung eines Elektromotors |
US8563242B2 (en) | 2009-08-11 | 2013-10-22 | The Chinese University Of Hong Kong | Method for detecting chromosomal aneuploidy |
AU2010315037B9 (en) | 2009-11-05 | 2015-04-23 | Sequenom, Inc. | Fetal genomic analysis from a maternal biological sample |
US9494520B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-11-15 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
MX349568B (es) * | 2010-11-30 | 2017-08-03 | Univ Hong Kong Chinese | Deteccion de aberraciones geneticas o moleculares asociadas con el cancer. |
WO2012078792A2 (en) * | 2010-12-07 | 2012-06-14 | Stanford University | Non-invasive determination of fetal inheritance of parental haplotypes at the genome-wide scale |
CA2826748C (en) | 2011-02-09 | 2020-08-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method of detecting variations in copy number of a target nucleic acid |
WO2012112804A1 (en) * | 2011-02-18 | 2012-08-23 | Raindance Technoligies, Inc. | Compositions and methods for molecular labeling |
WO2012116331A2 (en) | 2011-02-25 | 2012-08-30 | Illumina, Inc. | Methods and systems for haplotype determination |
EP2689029A1 (en) * | 2011-03-22 | 2014-01-29 | Life Technologies Corporation | Identification of linkage using multiplex digital pcr |
JP6196974B2 (ja) | 2011-09-30 | 2017-09-13 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | データを視覚化し評価する方法およびシステム |
HU229967B1 (hu) | 2011-12-20 | 2015-03-30 | Kps Diagnosztika Zrt | Eljárás töredezett nukleinsavak szekvenciájának meghatározására |
EP2805281A4 (en) | 2012-01-18 | 2015-09-09 | Singular Bio Inc | METHOD FOR ILLUSTRATING LINEAR MOLECULES FOR DETECTING STRUCTURE VARIATIONS AND SEQUENCING |
US20140162266A1 (en) * | 2012-12-05 | 2014-06-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods for polymerase chain reaction copy number variation assays |
CN105555972B (zh) | 2013-07-25 | 2020-07-31 | 伯乐生命医学产品有限公司 | 遗传测定 |
WO2015048571A2 (en) | 2013-09-26 | 2015-04-02 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for chromosome mapping |
US9670530B2 (en) * | 2014-01-30 | 2017-06-06 | Illumina, Inc. | Haplotype resolved genome sequencing |
-
2012
- 2012-02-09 CA CA2826748A patent/CA2826748C/en active Active
- 2012-02-09 EP EP18210691.4A patent/EP3483285B1/en active Active
- 2012-02-09 US US13/385,277 patent/US9127312B2/en active Active
- 2012-02-09 AU AU2012214312A patent/AU2012214312A1/en not_active Abandoned
- 2012-02-09 EP EP12744865.2A patent/EP2673380B1/en active Active
- 2012-02-09 CN CN201280017616.9A patent/CN103562407A/zh active Pending
- 2012-02-09 EP EP21178237.0A patent/EP3940084A1/en active Pending
- 2012-02-09 JP JP2013553578A patent/JP2014506465A/ja active Pending
- 2012-02-09 WO PCT/US2012/024573 patent/WO2012109500A2/en active Application Filing
-
2015
- 2015-09-08 US US14/848,311 patent/US10167509B2/en active Active
-
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-
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Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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