CN117794646A - 用于单细胞条形码化和测序的组合物、方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于在收集容器内以极高的速率(例如，每分钟至少100万个液滴等)产生多个液滴的装置、方法和系统，多个液滴从包含单细胞集和被配置用于单细胞测定的功能化颗粒集的水性混合物产生。在产生后，多个液滴可以在收集容器的区域内稳定在适当位置中，从而为单细胞分析提供单管工作流程。此外，所实施的组合物被结构化以允许用功能化颗粒超载分区，使得分区的单细胞以允许可辨别的标记和下游分析的方式与功能化颗粒子集共定位。

Description

用于单细胞条形码化和测序的组合物、方法和系统
交叉引用
本申请要求2021年6月4日提交的美国临时申请号63/196,815的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开总体上涉及与样品处理和测序相关的领域，更具体而言，涉及用于此类领域中单细胞和/或其他目标表征的新的且有用的系统、方法和组合物。
背景技术
直到最近，随着在单细胞分辨率下表征细胞的技术的发展，已在细胞群体水平或组织水平上传统地研究细胞。以单细胞分辨率对细胞进行基因组、转录组或其他多组学表征在理解病理状况、表征疾病进展、免疫响应、进行探索性研究(例如，在生物体发育中)以及解决其他生物学问题方面具有许多应用。然而，目前以单细胞分辨率进行测序的方法存在捕获效率低和/或涉及专用装置(例如，微流体装置)的问题，这通常导致工作流程时间增加、准确度降低和/或运行成本增加。
发明内容
目前，涉及分区的单细胞分析方法和系统涉及高度复杂的设置，具有跨分区的单细胞样品分布和功能化颗粒分布的精确控制。大多数方法包括用条形码处理材料(例如，寡核苷酸、引物等)将单细胞封装在同一分区内，使得来自单细胞的所有核酸分子都用相同的条形码序列标记，并且使得在测序或其他处理后操作后，来自每个细胞的分子可以与相同的单细胞相关联。对于高通量单细胞测定，每个单细胞与许多含有相同细胞条形码序列的条形码分子(经由引发或连接)共定位。条形码分子通常由单个物理颗粒/珠递送到每个细胞，并且不期望多个珠/条形码与单个分区和细胞相关联。因此，单细胞分析平台通常旨在以1:1的方式在分区内共捕获细胞和功能化颗粒，或者欠载功能化颗粒，使得分区各自仅具有0或1个功能化颗粒。
因此，本公开描述了系统、方法和组合物的实施方案、变型和示例，用于以高效的方式以及较低的样品和颗粒分布设置复杂性打破单细胞样品处理的相关要求。
本公开的一个方面提供了装置、方法和组合物的实施方案、变型和示例，其消除了提供用于对单细胞材料进行条形码化的单个或少于一个功能化颗粒的要求(例如，其中此类要求通常与涉及流体装置和/或专用颗粒结构的技术相关)。特别地，本公开提供了用于单细胞材料的条形码化的系统和方法，其利用每个单细胞/分区提供的多于一个的功能化颗粒来起作用。
相关地，本公开的一个方面提供了用于快速产生分区(例如，来自样品流体的液滴、乳液的液滴)并跨分区分布单细胞和功能化颗粒的装置和方法的实施方案、变型和示例，其中，该装置包括：第一基材，其限定包括储存器入口和储存器出口的储存器；偶联到储存器出口并包括孔分布的膜；以及包括开口的支撑体，开口被配置成保持收集容器与储存器出口对齐。在操作过程中，第一基材可以与支撑体偶联并封闭收集容器，其中储存器出口与收集容器对齐和/或位于收集容器内。在操作过程中，储存器可以含有样品流体(例如，单细胞和功能化分子/颗粒的混合物)，其中对装置或样品流体施加的力以极高的速率在收集容器内产生多个液滴(例如，至少10,000个液滴/分钟、至少20,000个液滴/分钟、至少30,000个液滴/分钟、至少40,000个液滴/分钟、至少50,000个液滴/分钟、至少100,000个液滴/分钟、200,000个液滴/分钟、至少300,000个液滴/分钟、至少400,000个液滴/分钟、至少500,000个液滴/分钟、至少600,000个液滴/分钟、至少700,000个液滴/分钟、至少800,000个液滴/分钟、至少900,000个液滴/分钟、至少100万个液滴/分钟、至少200万个液滴/分钟、至少300万个液滴/分钟等)，其中液滴在收集容器内稳定在适当位置(例如，以密堆积形式，在平衡静止位置)中。值得注意的是，液滴在与各种数字分析和其他生物测定相关的宽温度范围内(例如，1℃至95℃、大于95℃、小于1℃)是稳定的，其中液滴在形态上保持一致，并且保持不与相邻液滴融合。此外，此类系统和方法以极快速和有效的方式对单细胞和功能化颗粒进行分区(每个分区具有多于一个功能化颗粒)。
本公开的一个方面提供了用于在收集容器内以极高的速率快速产生分区(例如，来自样品流体的液滴、乳液的液滴)的方法的实施方案、变型和示例，多个液滴中的每一个包括用于数字分析(例如，单细胞、核酸材料、蛋白质材料、氨基酸材料、所描述的其他分析物的数字分析)的水性混合物，其中在产生后，多个液滴在连续相中(例如，作为具有由收集容器限定的整体形态的乳液)稳定在适当位置(例如，以密堆积形式，在平衡静止位置等)中。在一些方面，可以通过驱动样品流体通过膜的孔分布来执行分区产生，其中施加的力可以是离心力(例如，在离心力的作用下)、与施加的压力相关联的力、磁力或以其他方式物理施加的力中的一种或多种。
关于单管工作流程，其中收集容器保持封闭(例如，收集容器没有出口，没有流体流出收集容器，以避免样品污染)，方法可以进一步包括根据测定方案将热传递到封闭的收集容器内的多个液滴，以及从封闭的收集容器内的多个液滴传递热。关于具有合适澄清度(例如，具有或不具有折射率匹配)的乳液的产生，方法可以进一步包括传输来自封闭的收集容器内的单个液滴的信号，用于读出(例如，通过光学检测平台，通过另一合适的检测平台)。
当方法包括将热传递到封闭的容器内的多个液滴，以及从封闭的容器内的多个液滴传递热时，液滴在与各种数字分析和其他生物测定相关的宽温度范围内(例如，1℃至95℃、大于95℃、小于1℃)是稳定的，其中液滴在形态上保持一致，并且保持不与相邻液滴融合。
分区产生方法的示例可以包括在具有一定体积容量(例如，小于50微升、50至100微升和更大等)的收集容器内产生极高数量的液滴(例如，大于100万个液滴、大于200万个液滴、大于300万个液滴、大于400万个液滴、大于500万个液滴、大于600万个液滴、大于700万个液滴、大于800万个液滴、大于900万个液滴、大于1000万个液滴、大于1500万个液滴、大于2000万个液滴、大于2500万个液滴、大于3000万个液滴、大于4000万个液滴、大于5000万个液滴、大于1亿个液滴等)，其中液滴具有与数字分析、单细胞捕获、目标检测、单个分子分区或其他应用相关的特征尺寸(例如，1-50微米、10-30微米等)。
相关地，本公开的一个方面提供了非天然存在的组合物的实施方案、变型和示例，用于促进单细胞的分离、从分离的单个细胞扩增核酸物质、构建测序文库和对核酸物质进行测序以表征单细胞。本公开提供了用于实现单细胞分析性能的组合物、方法和系统，其具有极大提高的捕获效率，而不利用复杂的微流体设置，并且以降低总成本的方式。然而，本公开的方面可替代地可以与用于以单细胞形式分离细胞的各种技术(例如，通过使用孔、通过使用液滴、通过使用其他分区元件等)协同使用。
本公开的一个方面提供了用于连接分区内的功能化颗粒或连接功能化颗粒的分子的方法的实施方案、变型和示例，其中功能化颗粒包括可以用于在分区中捕获的细胞材料的条形码化的分子序列，以及可以被释放/裂解以便与分区中其他功能化分子的互补序列杂交的分子序列，从而连接分区中的功能化颗粒。
本公开的方面进一步提供了功能化颗粒的实施方案、变型和示例，该功能化颗粒与分区中的相应功能化颗粒连接，同时防止自杂交。
本公开的一个方面提供了包括分区集的组合物的实施方案、变型和示例，其中一些分区含有多个功能化颗粒，而没有相关的捕获的单细胞(或单细胞衍生材料、单颗粒、单核等)，并且其中一些/大部分(例如，至少90％、其他合适的百分比的)分区含有至少一个功能化颗粒和相关的捕获的单细胞(或单细胞衍生的材料)，从而以功能化颗粒与分离的单细胞(或单细胞衍生的材料)之间大于1:1的比率在分离的单细胞上“超荷”功能化颗粒。
在实施方案中，本文公开的方法、系统、装置和组合物可以优化每个分区所需的功能化颗粒的数量(例如，基于泊松分布方面)，以及为每个分离的单个细胞提供独特条形码库所需的功能化颗粒的密度。
本公开的方面进一步提供了用于有效捕获和标记目标材料(例如，DNA、RNA、miRNA、蛋白质、小分子、单分析物、多分析物等)的方法和系统的实施方案、变型和示例，以便能够针对各种应用对单细胞进行基因组、蛋白质组和/或其他多组学表征。对于核酸目标，所述组合物的捕获探针可以包括核酸目标的互补分子。对于蛋白质目标或小分子目标，所述组合物的捕获探针可以包括与用于检测的特定核酸序列缀合的抗体或适体。
本公开的方面还赋予了在空间转录组学中实现应用的益处。例如，所述组合物、方法和系统可以用于随着时间推移对样品中的目标进行映射，以便理解疾病病理和进展(例如，目标的扩散和随着时间推移表达的变化)。
本公开的另一方面提供了一种包括机器可执行代码的非临时计算机可读介质，该机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时，实现上述或本文其他地方的任何方法。
本公开的另一方面提供了一种系统，其包括一个或多个计算机处理器和与其偶联的计算机存储器。计算机存储器包括机器可执行代码，该机器可执行代码在由一个或多个计算机处理器执行时，实现上述或本文其他地方的任何方法。
根据以下具体实施方式，本公开的附加的方面和优点对于本领域技术人员将显而易见，其中仅示出和描述了本公开的说明性实施方案。本公开能够具有其他的和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各个明显的方面进行修改，所有这些都不背离本公开。因此，附图和说明书将在本质上被视为是说明性的而非限制性的。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请都出于所有目的以引用的方式整体并入本文，其程度如同明确且单独地指示每个单独的出版物、专利或专利申请都以引用的方式并入一般。
此外，在提供值的范围的情况下，应理解此范围的上限与下限之间的各中间值，以及此陈述范围内的任何其他陈述值或中间值涵盖在本公开内。这些较小的范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围内，并且也涵盖在本公开内，受制于所述范围内任何特别排除的限制。在陈述的范围包括一个或两个限值时，排除了那些被包括的限值中的任一个或两个的范围也被包括在本公开内。
附图说明
图1A描绘了用于单细胞条形码化和测序的组合物的实施方案的示意图。
图1B描绘了含有功能化颗粒和单细胞分布的分区集的示意图。
图1C描绘了将具有功能化颗粒的分区的百分比与每个分区的平均颗粒数量相关联的示例模型输出。
图1D描绘了用于单细胞分区和处理的系统的实施方案的示意图。
图2描绘了将具有与单细胞偶联的独特条形码的颗粒百分比作为条形码多样性、颗粒总数和细胞占有率百分比的函数而相关的示例模型输出。
图3A和图3B描绘了用于单细胞条形码化和测序的颗粒变型的示意图。
图4A描绘了用于单细胞分区和处理的方法的实施方案。
图4B描绘了用于单细胞条形码化和测序的方法的实施方案。
图5A-图5D描绘了用于单细胞条形码化和测序的方法的步骤的变型。
图6示出被编程或以其他方式被配置成实现本文所提供的方法的计算机系统。
具体实施方式
尽管本文已经示出和描述了本发明的各种实施方案，但对于本领域技术人员明显的是，此类实施方案仅通过示例的方式提供。本领域技术人员可以在不背离本发明的情况下想到许多变型、改变和替代。应理解，可以采用针对本文所述的本发明实施方案的各种可替代方案。
1.概述
本公开涵盖与单细胞分区和分析相关的系统、装置、由此类系统和装置执行的方法以及支持此类方法的组合物。通常，装置的实施方案包括储存器、功能化膜/板和用于收集容器的支撑体的组装件，其中该组装件快速产生用于单细胞分区或其他使用应用的乳液液滴。由此类装置产生的液滴在封闭的收集容器内以三维形式被稳定，从而提供“单管”工作流程，该“单管”工作流程消除了从最初接收样品到将样品分布在极高数量的分区上、到在单个分区内进行反应、到检测由来自封闭的收集容器的单个分区的内容物产生的信号的样品交叉污染的风险。
本文公开的系统、方法和装置可以提供优于其他系统和方法的多种附加优势，并且此类系统、方法和装置进一步应用于跨不同知识领域的许多实际应用中。
本公开的装置、方法、系统和组合物可以以极高的速率产生多个液滴，其中液滴在收集容器内稳定在适当位置(例如，以密堆积形式，在平衡静止位置)中。值得注意的是，液滴在与各种单细胞和数字分析以及其他生物测定相关的宽温度范围内(例如，1℃至95℃、大于95℃、小于1℃)是稳定的，其中液滴在形态上保持一致，并且保持不与相邻液滴融合。乳液连续相中液滴的稳定进一步以乳液具有高度澄清度(例如，大于50％的透光率、大于60％的透光率、大于70％的透光率、大于80％的透光率、大于90％的透光率、大于99％的透光率等)的方式进行，使得来自收集容器内的乳液横截面的信号可以被询问(例如，使用3D成像技术、使用平面成像技术等)。
本文公开的装置、系统、方法和组合物可以进一步去除提供用于对单细胞材料进行条形码化的单个或少于一个功能化颗粒的要求(与涉及流体装置和/或专用颗粒结构的技术相关)。特别地，本公开提供了用于单细胞材料的条形码化的系统和方法，其利用每个单细胞/分区提供的多于一个的功能化颗粒来起作用。
相关地，本文公开的装置、系统和方法可以进一步快速产生分区(例如，来自样品流体的液滴、乳液的液滴)并跨分区分布单细胞和功能化颗粒，其中，该装置包括：第一基材，其限定包括储存器入口和储存器出口的储存器；偶联到储存器出口并包括孔分布的膜；以及包括开口的支撑体，开口被配置成保持收集容器与储存器出口对齐。在操作过程中，第一基材可以与支撑体偶联并封闭收集容器，其中储存器出口与收集容器对齐和/或位于收集容器内。在操作过程中，储存器可以含有样品流体(例如，单细胞和功能化分子/颗粒的混合物)，其中对装置或样品流体施加的力以极高的速率在收集容器内产生多个液滴(例如，至少10,000个液滴/分钟、至少20,000个液滴/分钟、至少30,000个液滴/分钟、至少40,000个液滴/分钟、至少50,000个液滴/分钟、至少100,000个液滴/分钟、至少200,000个液滴/分钟、至少300,000个液滴/分钟、至少400,000个液滴/分钟、至少500,000个液滴/分钟、至少600,000个液滴/分钟、至少700,000个液滴/分钟、至少800,000个液滴/分钟、至少900,000个液滴/分钟、至少100万个液滴/分钟、至少200万个液滴/分钟、至少300万个液滴/分钟等)，其中液滴在收集容器内稳定在适当位置(例如，以密堆积形式，在平衡静止位置)中。值得注意的是，液滴在与各种数字分析和其他生物测定相关的宽温度范围内(例如，1℃至95℃、大于95℃、小于1℃)是稳定的，其中液滴在形态上保持一致，并且保持不与相邻液滴融合。此外，此类系统和方法以极快速和有效的方式对单细胞和功能化颗粒进行分区(每个分区具有多于一个功能化颗粒)。
由所述系统、方法和装置处理的细胞材料可以包括以下中的一种或多种：干细胞、癌细胞、血细胞、外周血单个核细胞、其他免疫细胞、循环肿瘤细胞、乳腺癌细胞、来自任何合适组织来源的细胞或细胞材料、处于所期望细胞周期阶段的细胞、植物细胞或细胞材料、真菌细胞或细胞材料、囊泡(例如，合成衍生的囊泡)、病原体、细菌、病毒、病毒载体、亚细胞颗粒和/或其他类型的细胞、细胞材料以及具有与细胞相似的形态和/或特征的物体。
本文所述的组合物可以促进单细胞的分离和独特鉴定、来自分离的单个细胞的核酸物质的扩增、测序文库的构建和用于单细胞表征的核酸物质的测序。本公开可以提供用于实现单细胞分析性能的组合物、方法和系统，其具有极大提高的捕获效率，而不利用复杂的微流体设置，并且以降低总成本的方式。
然而，本公开的方面可以与用于以单细胞形式分离细胞的各种技术(例如，通过使用孔、通过使用液滴、通过使用其他分区元件等)协同使用。
本文描述了用于连接分区内的功能化颗粒的方法和组合物，其中功能化颗粒包括可以用于在分区中捕获的细胞材料的条形码化的分子序列，以及可以被释放/裂解以便与分区中其他功能化分子的互补序列杂交的分子序列，从而连接分区中的功能化颗粒。
本文公开了可以包含功能化颗粒的组合物，该功能化颗粒因此与分区中的相应功能化颗粒连接，同时防止自杂交。
本文进一步公开了包括分区集的组合物，其中一些分区含有多个功能化颗粒，而没有相关的捕获的单细胞(或单细胞衍生材料、单颗粒、单核等)，并且其中一些/大部分(例如，至少90％、其他合适的百分比的)分区含有至少一个功能化颗粒和相关的捕获的单细胞(或单细胞衍生的材料)，从而以功能化颗粒与分离的单细胞(或单细胞衍生的材料)之间大于1:1的比率在分离的单细胞上“超载”功能化颗粒。
如本文公开的方法、系统、装置和组合物可以优化每个分区所需的功能化颗粒的数量(例如，基于泊松分布方面)，以及为每个分离的单个细胞提供独特条形码库所需的功能化颗粒的密度。
本文公开的装置、系统、方法和组合物可以进一步提供有效捕获和标记目标材料(例如，DNA、RNA、miRNA、蛋白质、小分子、单分析物、多分析物等)的机制，以便能够针对各种应用对单细胞进行基因组、蛋白质组和/或其他多组学表征。对于核酸目标，所述组合物的捕获探针可以包括核酸目标的互补分子。对于蛋白质目标或小分子目标，所述组合物的捕获探针可以包括与用于检测的特定核酸序列缀合的抗体或适体。
本文公开的装置、系统、方法和组合物可以进一步实现在空间转录组学中的应用。例如，所述组合物、方法和系统可以用于随着时间推移对样品中的目标进行映射，以便理解疾病病理和进展(例如，目标的扩散和随着时间推移表达的变化)。
附加地或可替代地，本文公开的方法、系统、装置和组合物可以赋予任何其他合适的益处。
2.颗粒组合物
图1A显示了用于单细胞测序的示例组合物100，其包括：主体110，和偶联到主体110并被配置用于组合物100的功能化的分子115集。
组合物100用于，与用来自分区内的单细胞的材料分离的组合物100的其他变型一起，用条形码序列标记来自单细胞的所有核酸分子，该条形码序列可以用于在测序后将核酸分子与相应的单细胞独特关联。特别地，如图1B所示，组合物100被配置成以这样的方式使用：其中单细胞以非高占有率方案被分区(例如，少于20％的分区含有单细胞、少于19％的分区含有单细胞、少于18％的分区含有单细胞、少于17％的分区含有单细胞、少于16％的分区含有单细胞、少于15％的分区含有单细胞、少于10％的分区含有单细胞、5-10％的分区含有单细胞、少于5％的分区含有单细胞、另一合适百分比的分区含有单细胞)，但每个分区中包含组合物100的多种变型，从而以功能化颗粒与分离的单细胞(或单细胞衍生的材料)之间大于1:1的比率在分离的单细胞上“超载”组合物100。因此，样品的单细胞集可以具有第一数量，并且功能化颗粒集可以具有大于第一数量的第二数量，使得功能化颗粒集分布在单个分区内颗粒超载的分区上。
因此，组合物100可以用于提供目标材料(例如，与单细胞相关的所有核酸材料)的高捕获效率的机制，而无需复杂的系统设置。
在一些情况下，每个分区所需的颗粒数量可以基于泊松分布因子，其中，如图1C所示，根据泊松分布因子，对无任何颗粒的分区百分比与每个分区的平均颗粒数量之间的关系进行建模，产生每个分区至少10个颗粒(平均)的要求，以便99％的分区具有一个颗粒。在每个分区具有至少5个颗粒的额外约束下，建模的关系产生每个分区至少14个颗粒(平均)的要求，以便99.9％的分区具有至少5个颗粒。
在下文进一步详细描述的一些情况下，组合物100包括可以从基础基材(例如，主体110)裂解的功能化分子的子集，其中功能化分子的子集可以从基础基材(例如，主体110)释放，并与同一分区中组合物的其他变型的互补分子杂交，从而有效地提供一种机制，通过该机制，分区中的组合物可以彼此相关联(例如，“连接”)，并与捕获的目标材料相关联。在实施方案中，分区可以包括以下中的一个或多个：液滴(例如，乳液的液滴)、孔(例如，微流体孔、纳米流体孔)，或细胞、亚细胞结构(例如，细胞器)、寡核苷酸、其他单个目标或其他分析物的其他形式的物理分区。
因此，在一些情况(诸如图1A中所示的情况)下，分子115集可以包括分子第一子集120，其偶联到主体110并被配置用于目标分析物捕获，其中第一子集120的单元可以包括以下中的一个或多个：条形码片段(B)122、独特分子标识符(M)123和捕获部分(例如，探针)124。在一些情况下，分子115集可以包括被配置成从主体110释放的分子第二子集130，其中第二子集130的单元包括被配置成以受控方式从主体110释放第二子集的可裂解片段131、条形码片段(B)132、独特分子标识符(M)133和关联片段134。在一些情况下，分子115集可以包括偶联到主体110的分子第三子集140，其中第三子集130的单元包括条形码片段(B)142、独特分子标识符(M)143和互补关联片段144，互补关联片段144被配置成当第二子集130从主体110释放时，与分子第二子集130的单元(即，分区内功能化颗粒集的其他功能化颗粒)的关联片段134杂交(例如，优先杂交)。在应用中，组合物100可以作为颗粒集(例如，在溶液中)提供，其中该颗粒集中的每一个均偶联到用于各种单细胞测定的分子。如下文变型中所述，关联片段134和互补关联片段144可以被配置成使得分子不会以不期望的方式自杂交。
组合物100可以被配置用于与从单细胞进行目标捕获相关的过程和反应，包括以下中的一种或多种：用于与目标捕获相关的cDNA合成的逆转录反应(RT-反应)、用于cDNA扩增的扩增反应(例如，PCR)、高通量测序、连接、杂交、聚合酶延伸和其他合适的反应。
组合物100可以如下文第3节所述地使用，并且/或者可以根据其他合适的方法使用。
2.1颗粒-主体
主体110用于提供分子115集可以与其偶联的基材，以便关于实施相应的测定和反应为组合物100提供功能化，并在分区中关联所有颗粒和捕获的分析物。
关于形态，主体110可以具有微球体的形式。可替代地，主体110可以具有非球形形式(例如，椭圆形、棱柱形、多面体形、无定形等)主体，其中穿过主体110截取的横截面是非圆形的。然而，主体110可替代地可以具有另一种合适的形式。关于尺寸，主体110可以在尺寸上具有纳米到微米量级的直径(或特征宽度)。特别地，主体的大小可以关于每个分区的预期颗粒数量(例如，基于泊松分布特征)和分区的特征大小来调整。在变型中，在具有20-350微米的特征尺寸的分区内，主体110可以具有0.04微米至35微米的直径(例如，10微米的直径)。主体110可替代地可以具有其他合适的特征尺寸。在使用过程中，颗粒的溶液可以具有均匀(或近似均匀)的颗粒大小；可替代地，在使用过程中，颗粒的溶液可以具有不均匀的颗粒大小。
关于密度，主体110可以被配置成具有大于旨在与组合物100一起使用的工艺液体密度的密度(例如，关于特定反应或测定)，使得组合物100在操作期间通过重力沉降在工艺液体内。可替代地，主体110可以被配置成具有与旨在与组合物100一起使用的工艺液体密度相等的密度(例如，关于特定反应或测定)，使得组合物100在操作期间在工艺液体中处于平衡。仍可替代地，主体110可以被配置成具有小于旨在与组合物100一起使用的工艺液体密度的密度(例如，关于特定反应或测定)，使得组合物100在操作期间漂浮在工艺液体内。
关于热特性，主体110被配置成在温度下限(例如，与低温反应和过程相关、与储存相关等)和温度上限(例如，与高温反应和过程相关，诸如用于热循环)之间操作。然而，主体110可以被配置用于其他操作温度。
关于物理特性，主体110被配置成在溶液中(例如，在储存期间在缓冲液中、在进行测定期间在溶液中)维持结构。因此，主体110被配置成非膨胀和非浸出的。然而，在可替代实施方案中，主体110可以被配置成膨胀期望的量(例如，关于实现用于在应用中处理或使用的期望的大小或形态)、被配置成滤出用于执行测定的某些化合物(例如，处理试剂)，并且/或者在执行测定或其他过程期间以期望的方式溶解。此外，关于物理特性，主体110可以被配置成具有关于执行测定或其他过程的期望程度的亲水性(例如，在从亲水到疏水的范围上)。因此，主体110的变型可以具有合适类型的交联(例如，化学交联、物理交联等)和交联百分比(例如，30-99％交联)，以在使用条件下提供所期望水平的稳定性或可降解性。
关于其他表面特性，主体110可以被配置成具有所期望密度的结合位点，以便实现合适密度的功能化分子(例如，通过在主体110上提供附着点)。此外，主体110可以包括表面基团(例如，羟基基团、胺基团、羧基基团、硫化物基团、硅烷醇基团等)用于下文部分描述的分子偶联。
关于磁性特性，主体110可以被配置成响应于磁场(例如，关于涉及将颗粒保留在适当位置中以用于随后对来自样品的目标分析物进行映射的测定)。主体110的某些区域(例如，核心区域)可以是磁性的(例如，磁性的、顺磁性的等)，并且在主体110的变型中，主体110的某些区域(例如，外壳区域)可以是非磁性的。关于表面特性，主体110可以被配置成带电荷或不带电荷，以便于促进与样品的目标材料结合，或者促进涉及具有功能性的分子的制造，关于电穿孔应用。
关于光学特性，主体110可以被配置成无荧光(例如，以便不干扰基于光学的检测测定)。然而，在变型中，主体110可以被配置成光学可检测的(例如，经由非荧光模态、经由荧光模态、经由红外检测模态、经由热检测模态等)，例如用于跟踪目的。
关于机械特性，主体110可以被配置成具有所期望的硬度(例如，在莫氏硬度标度上测量、在另一硬度标度上测量)，以便在使用应用中保持所期望的硬度水平。附加地或可替代地，主体110可以被配置成具有与以下中的一个或多个相关的期望的机械特性：刚性、弹性行为(例如，在模量方面、在塑性和弹性变形方面等)、黏弹性行为、疲劳抗性、断裂抗性、剪切强度、抗压强度、拉伸强度、流变行为(例如，在磨损条件下)以及其他机械特性。
关于组成，主体110可以由以下中的一种或多种构成：聚合物(例如聚苯乙烯、聚苯乙烯-二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚乙二醇(PEG)等)、水凝胶、二氧化硅、硅、无孔玻璃、多孔玻璃、涂层玻璃、琼脂糖、丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、铁、钢或陶瓷材料和/或一种或多种合适材料的组合。如上文和下文所述，主体110的不同区域可以由不同的材料构成(例如，核心区域可以由第一材料构成，并且外壳区域可以由第二材料构成)和/或具有不同的功能(例如，磁性功能、受控降解功能、浮力功能、基于密度的功能等)。在一些实施方案中，可以存在多个区域，或者是多个外壳区域，或者是其他配置，诸如无定形或有序的空间排列。
2.2分子第一子集-目标捕获
如图1A所示，组合物100包括偶联到主体110并被配置用于目标分析物捕获的分子第一子集120(例如，单细胞分析物捕获分子)，其中第一子集120的单元可以包括以下中的一个或多个：条形码片段(B)122、独特分子标识符(M)123和捕获探针124(例如，捕获部分)。分子第一子集120用于为从被处理的样品中捕获目标提供所期望的化学物质(例如，结合化学物质)，其方式允许对捕获的目标材料进行后续处理和独特鉴定(例如，使用高通量测序技术)。分子第一子集120的分子可以是基于核酸的，具有天然和/或经修饰的核苷酸。附加地或可替代地，第一子集的分子可以包括寡核苷酸缀合的抗体(例如，用于蛋白质相关的分析)。
如图1A所示，分子第一子集120可以包括偶联到主体110(例如，用接头或锚定片段)的条形码片段(B)122，其用于提供鉴定分子所偶联的独特颗粒的标签。条形码片段(B)122被配置成对于每个颗粒是独特的。此外，条形码片段(B)122被配置成具有多样性，使得颗粒溶液中的每个颗粒可以被独特地鉴定(例如，基于泊松统计)。条形码片段(B)122或分子的其他片段可以通过化学分裂池(split-pool)合成、酶分裂池合成(例如，通过聚合酶延伸或连接)或另一合适的合成方法来合成。
用于产生功能化颗粒的示例方法可以实现乳液PCR(emPCR)以产生功能化颗粒。更详细地，方法50可以包括将正向和反向衔接子序列连接到上述分子片段的前体，其中任选的限制性酶识别位点邻近PCR引物位点，以提供与功能化颗粒产生的下游步骤相关的靶向消化/裂解机制(裂解机制的其他变型在下文中更详细地描述)。然后，前体分子可以偶联到珠主体，作为偶联到珠主体的正向引物和反向引物前体分子的分布，从而产生双引物偶联的珠。然后，该方法可以包括将双引物偶联的珠与核酸片段、乳液PCR试剂和具有与珠溶液不混溶的相(例如，油相)的游离引物混合。然后将乳液热循环以产生扩增产物，随后在限制性酶识别位点处消化/裂解。最后，特异性锚定引物可以在正向和反向链的末端处杂交。然后，在乳液珠条形码产生之后，该方法可以实现一种或多种基于连接的方法，以将UMI片段批量添加到功能化颗粒的分子中。
在可替代变型中，可以通过另一种合适的方法(例如，化学分裂池合成、酶分裂池合成等)合成功能化颗粒的分子。
在一些情况下，条形码片段(B)122可以具有5-35个碱基，以便为给定过程的溶液中所期望数量的颗粒提供足够数量的独特序列(即，使得每个颗粒可以被独特地鉴定)。此外，碱基的数量可以基于每个分区的预期颗粒的数量来调整，其中分区中的珠的关联(各自具有不同的条形码序列)产生了每个分区在条形码序列变型和长度方面的另一种独特性程度。然而，在可替代变型中，条形码片段(B)122可以具有其他合适数量的碱基。
关于条形码片段122的设计的更多细节，为了实现每个细胞的独特条形码库，分区内的每个颗粒应具有独特的条形码片段。如图2所示，对于功能化颗粒的特征集(通过该集可以表示使用中的功能化颗粒集)，具有与来自单细胞的目标材料偶联的独特条形码的颗粒的百分比可以是条形码多样性(d)和实施的颗粒数量(n)以及单个细胞对分区的占有率百分比(o)的函数。因此，百分比＝f(d,n,o)。在取自5％分区占有率(图2中的蓝线)和10％分区占有率(图2中的橙线)的模型函数的示例中：对于10％占有率情况，条形码多样性(d)应是所有分区中颗粒总数的5倍，以提供99％的颗粒，其中独特颗粒与来自单细胞的目标材料偶联(例如，如果百分比(p)大于99％，分区占有率百分比(o)小于10％，并且条形码多样性(d)大于功能化颗粒的第二数量(n)的五倍)；对于10％占有率情况，条形码多样性(d)应是所有分区中颗粒总数的10倍，以提供99.5％的颗粒，其中独特颗粒与来自单细胞的目标材料偶联；并且对于10％占有率情况，条形码多样性(d)应是所有分区中颗粒总数的50倍，以提供99.9％的颗粒，其中独特颗粒与来自单细胞的目标材料偶联。然而，可以以另一种合适的方式，基于条形码多样性(d)、所实施的颗粒数量(n)以及单个细胞对分区的占有率百分比(o)来调节所需的条形码多样性。
如图1A所示，分子第一子集120还可以包括独特分子标识符(M)123，其用于提供标签，该标签在组合物的使用过程中鉴定由捕获探针124捕获的独特分子。独特分子标识符(M)123被配置成具有多样性，使得其附近的目标分子可以被独特地标记(例如，基于泊松统计)。
独特分子标识符(M)123可以特定于各种测序平台(例如，下一代测序平台)。此外，分子第一子集120中的每一个均可以具有单个独特分子标识符(M)123或多个独特分子标识符(M)123片段(例如，以提供进一步的多样性)。独特分子标识符(M)123可以被配置成不以特定碱基(例如，GG)(或不太适于特定测序平台的其他序列)结尾；然而，条形码片段可以以另一种合适的方式配置。可以通过制造将偶联到特定主体110的所有分子上的独特分子标识符(M)123的序列配置成具有高度的一致性(例如，关于最小化无意的删除、取代或添加)，以便在使用期间产生低错误率。
此外，关于条形码片段(B)122，独特分子标识符(M)123和条形码片段(P)122的序列多样性可以通过制造随机序列集，或者可替代地，通过预定序列集来实现。
在一些情况下，独特分子标识符(M)123可以具有5-20个碱基，以便为旨在用于捕获的所期望数量的目标分子提供足够数量的独特序列(即，使得每个目标可以被独特地鉴定)；然而，在可替代变型中，独特分子标识符(M)123可以具有其他合适数量的碱基。独特分子标识符(M)123可以直接偶联到条形码片段(B)122(例如，如图1A所示)，或者可替代地可以关于沿着分子第一子集120的分子的位置进行配置。
如图1A所示，分子第一子集120可以包括捕获探针124，其用于从用分区中的颗粒分离的单个细胞捕获目标材料(例如，从所述单细胞集的裂解细胞捕获的目标核酸)。捕获探针124可以直接偶联到独特分子标识符(M)123，或者可替代地可以关于沿着分子第一子集120的分子的位置进行配置。在变型中，由捕获探针捕获的分析物可以包括：核酸(例如，DNA、mRNA、miRNA等)和/或附接到其他类型分子(例如，抗体、蛋白质、肽、化学品等)的寡核苷酸。
在一个变型中，如图3所示，捕获探针124可以被配置用于目标mRNA结合(例如，用于捕获polyA mRNA、基因特异性序列的dT、dTVN)。然后，目标mRNA的捕获可以随后进行逆转录，以将cDNA附加到分子第一子集120的捕获探针部分(例如，如图3A所示)。然后，在合成的cDNA扩增后，高通量测序可以用于读出使用分子第一子集120捕获的目标分子。在可替代变型中，在分子第一子集120中包含其他捕获探针类型可以配置分子第一子集120用于捕获以下中的一种或多种：DNA、其他RNA(例如，miRNA)、蛋白质(例如，抗体，使用TotalSeqTM分子)、小分子、单分析物、多分析物等)和/或其他目标材料。对于核酸目标，分子第一子集120的捕获探针124可以包括核酸目标的互补分子。对于蛋白质目标或小分子目标，组合物的捕获探针124可以包括核酸(例如，寡核苷酸缀合的抗体)，其中样品的目标(例如，蛋白质、肽、抗体、小分子等)用具有与捕获探针124的序列互补的序列的寡核苷酸标记。
组合物的单元可以被配置成具有足够数量的捕获探针124(例如，每个颗粒的总数、结合到溶液中颗粒的总数)，以有效捕获目标材料(例如，每个细胞约数万个mRNA分子、每个样品类型另一数量的目标)。在变型中，分区中的平均颗粒数量乘以每个颗粒的捕获探针124的数量可以是旨在捕获的目标数量的10-100倍(例如，根据摩尔浓度、根据另一个浓度单位等)。
在变型中，分子第一子集120的单元可以根据需要省略或包括附加的片段。例如，分子第一子集120中的一个或多个可以包括被配置成简化特定测序平台的文库制备步骤或测序过程的片段。更详细地，分子第一子集120的分子可以包括被配置成将分子偶联到主体110的锚/接头片段、用于聚合酶链反应的衔接子片段(例如，与用于IlluminaTM平台的P5/P7衔接子相关)、与衔接子相关的索引序列和/或其他序列。附加地或可替代地，在样品处理过程中(例如，在逆转录过程中等)可以添加额外的片段。分子第一子集120的单元可以附加地或可替代地包括其他序列(例如，用于其他处理平台)。
2.3分子的第二和第三子集-分区中颗粒的连接
在一些情况下，如图1A和图3A-图3B所示，分子115集可以包括偶联到主体110的分子第二子集130(例如，可释放分子)，其中第二子集130的单元包括被配置成以受控方式(例如，响应于触发物)从主体110释放第二子集的可裂解片段131、条形码片段(B)132、独特分子标识符(M)133和关联片段134。
在一些情况下，如图1A和图3A-图3B所示，分子115集可以包括偶联到主体110的分子第三子集140(例如，杂交分子)，其中第三子集130的单元包括条形码片段(B)142、独特分子标识符(M)143和互补关联片段144，互补关联片段144被配置成当第二子集130从主体110释放时，与分子第二子集130的单元的关联片段134(例如，功能化颗粒集的其他功能化颗粒的其他关联片段)杂交(例如，优先杂交、可杂交)。分子第二和第三子集用于彼此互补，并提供一种将在一个分区中捕获的所有颗粒与单细胞连接的机制。
第二子集130和第三子集140的分子可以是基于核酸的，具有天然和/或经修饰的核苷酸。第二子集130和第三子集140的分子可以与分子第一子集120的分子随机散布在主体110周围，或者可替代地可以相对于分子第一子集120的分子非随机分布在主体110周围(例如，以期望的比率以促进分子第二和第三子集的单元之间的连接反应)。
如图1A所示，分子第二子集130和第三子集140可以包括条形码片段(B)132、142，其用于提供鉴定分子所偶联的独特颗粒的标签。如上所述，条形码片段(B)132、142被配置成对于每个颗粒是独特的，并且被配置成具有多样性，使得颗粒溶液中的每个颗粒可以被独特地鉴定(例如，基于泊松统计)。条形码片段(B)132、142可以与用于目标捕获的分子第一子集120的条形码片段(B)122相同(例如，在序列上)(例如，以促进颗粒鉴定片段的合成效率)，或者可替代地可以与分子第一子集120的条形码片段(B)122不同。
如图1A所示，分子第二子集130和第三子集140可以包括独特分子标识符(M)133、143，其用于提供标签，该标签在组合物的使用过程中鉴定由捕获探针124捕获的独特分子。如上所述，独特分子标识符(M)133、143被配置成具有多样性，使得其附近的目标分子可以被独特地标记(例如，基于泊松统计)。独特分子标识符(M)133、143可以特定于各种测序平台(例如，下一代测序平台)，并且独特分子标识符(M)123可以被配置成不以特定碱基(例如，GG)(或不太适于特定测序平台的其他序列)结尾。可以通过制造将偶联到特定主体110的所有分子上的独特分子标识符(M)133、143的序列配置成具有高度的一致性(例如，关于最小化无意的删除、取代或添加)，以便在使用期间产生低错误率。UMI(M)133、143可以与分子第一子集120的UMI(M)123相同(例如，在序列上)，或者可替代地可以与分子第一子集120的UMI(M)123不同。此外，关于条形码片段(P)122，独特分子标识符(M)123和条形码片段(P)122的序列多样性可以通过制造随机序列集，或者可替代地，通过预定序列集来实现。
如图1和图3A-图3B所示，第二子集130包括可裂解片段131，其被配置成以受控方式从主体110释放第二子集，和关联片段134，其被配置成促进与分区中其他颗粒的互补片段的杂交，从而以可以在测序后鉴定的方式有效连接分区中的颗粒。分子第三子集140的单元包括互补关联片段144，其被配置成当第二子集130从主体110释放时，与分子第二子集130的单元的关联片段134杂交。此外，功能化颗粒的互补关联片段144可以被配置成不与功能化颗粒的关联片段134杂交，使得相应的功能化颗粒的分子不会自杂交。
可裂解片段131可以被配置成通过以下中的一种或多种可逆地裂解：酶促触发机制(例如，限制性酶、限制性核酸内切酶、限制性内切酶(restrictase)等)、光裂解触发机制(例如，使用UV波长光、使用其他光)、pH偏移触发机制、另一种化学裂解机制、热触发机制和另一种合适的裂解机制。因此，触发物可以包括选自以下的化合物：酶触发物、光裂解触发物、pH触发物和热触发物。在一个示例中，可裂解片段131包括二硫键，从而在碱性pH下通过二硫苏糖醇(DTT)提供受控的裂解机制，以便释放第二子集130的单元，用于与分子第三子集140的互补单元杂交。
如图1和图3A所示，关联片段134被配置成在可裂解片段131裂解后促进与分区中其他颗粒的互补片段的杂交，从而以可以在测序后鉴定的方式有效连接分区中的颗粒。分子第三子集140的单元包括互补关联片段144，其被配置成当第二子集130从主体110释放时，与分子第二子集130的单元的关联片段134杂交(在分区内的不同颗粒间)。
关联片段134可以包括寡核苷酸序列(例如，5-20个碱基长，另一种合适的长度)，如图3A中的[珠hyb]所描绘。互补关联序列144可以具有与关联序列134互补的寡核苷酸序列，如图3A中的[珠hyb’]所描绘。
在图3B所示的变型中，关联片段134和互补关联片段144(作为关联片段134的直接互补物)可以被配置成防止自杂交，使得颗粒的分子不会自杂交，或优先地在分区内的颗粒间杂交。因此，功能化颗粒的互补关联片段不与功能化颗粒的关联片段杂交(或非优先杂交)。因此，如图3B所示，第一颗粒110a的第一关联片段134a可以包括如图3B的[珠hyb 1]所描绘的寡核苷酸序列，其中第一互补关联序列144a偶联到第二颗粒110b并且具有与第一关联序列134a互补的寡核苷酸序列，如图3B的[珠hyb 1’]所描绘。类似地，第二颗粒110b的第二关联序列134b可以包括如图3B的[珠hyb 2]所描绘的寡核苷酸序列，其中第二互补关联序列144b偶联到第一颗粒110a并且具有与第一关联序列134b互补的寡核苷酸序列，如图3B的[珠hyb2’]所描绘。这种构造防止了最初结合到颗粒的分子的自杂交，并促进了一个分区内不同颗粒之间的杂交。虽然在图3B中描绘了两个关联序列/互补关联序列对，但还可以实施另一合适数量的关联序列/互补关联序列对，以便防止自杂交和/或防止分区内的颗粒不具有用于连接的互补序列的情况。例如，每个颗粒可以包括关联序列和非互补关联序列集，以便提高在可裂解部分具有互补结构以与之杂交的分区中分组的概率。
此外，在使用多个互补关联序列的变型中，相应的可裂解片段可以被配置成通过不同机制裂解，从而提供用于杂交的片段的受控释放的机制(例如，分阶段)，以便在分区内关联颗粒而不鼓励自杂交。
尽管上文描述了组合物100的实施方案、变型和示例，但组合物100可以以另一种合适的方式进行配置，从而以可鉴定的方式促进在分区中捕获的颗粒与单细胞材料的关联。
3.方法
如图4A所示，用于产生液滴的方法300的示例可以包括：在收集容器内以高速率产生多个液滴，其中多个液滴由包含单细胞集和被配置用于单细胞测定的功能化颗粒集的水性混合物产生S310。在实施方案中，在产生时，多个液滴以密堆积形式(例如，三维密堆积形式、六边形密堆积形式、矩形密堆积形式等)在收集容器的区域内，在连续相中稳定在适当位置中S320。
方法300的实施方案可以用于在单细胞分区和其他测定的情况下，以极高且前所未有的速率产生多个液滴，其中液滴在收集容器内稳定在适当位置(例如，以密堆积形式，在平衡静止位置)中。方法300的实施方案可以进一步用于以一致和受控的方式可靠地产生液滴(例如，作为具有很少至没有多分散性的单分散和均匀的液滴)，用于各种应用，包括在细胞、亚细胞和分子尺度上捕获目标材料；受益于液滴产生的样品分析；和/或其他合适的应用。方法300的实施方案可以用于使用非微流体的、一次性的或可重复使用的装置以具有成本有效性的方式产生液滴。
所述方法的实施方案、变型和示例可以由或通过图1D所示系统200的组件的实施方案、变型和示例来实施，该组件具有第一基材210，第一基材210限定了储存器214集(用于承载样品/混合物以产生液滴)，其各自具有储存器入口215和储存器出口216；一个或多个膜(或可替代地，液滴产生基材)220，其位于储存器214集的储存器出口附近，一个或多个膜220中的每一个均包括孔225的分布；以及任选地，密封体230，其位于一个或多个膜120附近并包括与储存器214集对齐的开口235集；以及任选地，一个或多个紧固件(包括紧固件240)，其被配置成将第一基材210、一个或多个膜220和任选的密封体230相对于收集容器250集保持在适当位置中。在变型中，系统100可以附加地包括第二基材260，其中一个或多个膜220和任选的密封体230通过一个或多个紧固件保持在第一基材210和第二基材260之间的适当位置中。
在变型中，孔120的分布可以在具有特定孔直径、孔深度(例如，相对于膜厚度)、纵横比、孔密度和孔取向的整体材料中产生，其中，结合流体参数，膜的结构可以实现所期望的流速特征，具有降低或消除的多分散性和融合，不损害单细胞但允许对单细胞进行分区的合适应力(例如，剪切应力)，以及液滴的稳定形成(例如，没有流体从膜的孔中喷出)。
在变型中，孔直径的范围可以为15微米至200微米，并且在示例中，孔可以具有可以为15微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、150微米、200微米、任何中间值或大于200微米(例如，使用具有合适厚度的膜)的平均孔直径。
在变型中，孔深度的范围可以为1微米至200微米(例如，与膜层的厚度相关)或更大，并且在示例中，孔深度(例如，如由膜厚度决定)可以为1微米、5微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、125微米、150微米、175微米、200微米或任何中间值。
在变型中，孔纵横比的范围可以为5:1至200:1，并且在示例中，孔纵横比可以为5:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、125:1、150:1、175:1、200:1或任何中间值。
在变型中，孔至孔间距的范围可以为20微米至200微米或更大，并且在示例中，孔至孔间距为20微米、30微米、40微米、50微米、60微米、70微米、80微米、90微米、100微米、125微米、150微米、175微米、200微米或更大。在具体示例中，孔至孔间距大于10微米。
在示例中，孔取向可以为基本垂直的(例如，在使用过程中，与主要重力相关)，或者与通过孔分布施加的力的方向对齐，或相对于膜或其他液滴产生基材120的参考平面成另一合适的角度。
附加地或可替代地，所述方法的实施方案、变型和示例可以由或通过2022年3月4日提交的美国申请号17/687,080和2022年2月8日授权的美国专利号11,242,558中所述的组件的实施方案、变型和示例来实施，这些专利申请各自通过这种引用整体并入本文。
3.1方法-液滴产生
关于步骤S310中以高速率产生液滴，方法300的变型可以使用上述系统元件的实施方案、变型和示例，以至少10,000个液滴/分钟、至少20,000个液滴/分钟、至少30,000个液滴/分钟、至少40,000个液滴/分钟、至少50,000个液滴/分钟、至少100,000个液滴/分钟、至少200,000个液滴/分钟、至少300,000个液滴/分钟、至少400,000个液滴/分钟、至少500,000个液滴/分钟、至少600,000个液滴/分钟、至少700,000个液滴/分钟、至少800,000个液滴/分钟、至少900,000个液滴/分钟、至少100万个液滴/分钟、至少200万个液滴/分钟、至少300万个液滴/分钟或更大的速率产生液滴。使用在上文以引用的方式并入的申请和专利中描述的膜或其他基材(例如，微通道阵列板)的实施方案、变型和示例，与孔密度、孔至孔间距、孔直径、膜厚度、孔纵横比、膜材料和/或其他特征相关地，可以以高速率产生液滴。
关于步骤S310中的液滴产生，可以在收集容器内产生极高数量的液滴，其中，在变型中，可以在收集容器内产生大于200万个液滴、大于300万个液滴、大于400万个液滴、大于500万个液滴、大于600万个液滴、大于700万个液滴、大于800万个液滴、大于900万个液滴、大于1000万个液滴、大于1500万个液滴、大于2000万个液滴、大于2500万个液滴、大于3000万个液滴、大于4000万个液滴、大于5000万个液滴、大于1亿个液滴、大于2亿个液滴、大于3亿个液滴或更多液滴。
在变型中，收集容器可以具有小于100微升或100至1毫升以及更大的体积容量。收集容器的示例可以包括PCR条带管或锥形管；然而，收集容器的其他变型和示例在上文以引用的方式并入的申请和专利中有所描述。在步骤S310中产生的液滴可以具有特征尺寸(例如，1-60微米、10-30微米、在所述范围内的中间值等)，其与单细胞捕获、目标检测、单个目标分区或其他应用相关。
在步骤S310中产生多个液滴可以包括驱动样品流体通过包括孔分布的膜或其他基材(例如，微通道阵列板)，该膜或其他基材与样品流体的储存器的储存器出口对齐或偶联。膜/基材可以偶联到样品流体的储存器的储存器出口，并且收集容器可以在基材的下游与基材对齐，以便接收产生的液滴。因此，所述方法可以包括在驱动包含单细胞集和功能化颗粒集的混合物通过具有孔分布的基材时，将该单细胞集和该功能化颗粒集分布在乳液的多个液滴上(例如，使用如上所述的系统和材料)。关于乳液的产生，混合物可以被驱动通过基材的孔进入一个或多个流体层，使得液滴在乳液中稳定。在单细胞被分区到多个液滴上之后，可以使用细胞计数法来确定包含在混合物中的合适数量的单细胞，使得产生的每个液滴可能含有一个或零个单细胞以及功能化颗粒集子集。
驱动样品流体可以包括施加离心力(例如，通过离心作用)以驱动样品流体通过膜的孔。在变型中，可以以1,000g、2,000g、3,000g、4,000g、5,000g、6,000g、7,000g、8,000g、9,000g、10,000g、11,000g、12,0000g、13,000g、14,000g、15,000g、16,000g、17,000g、18,000g、19,000g、20,000g、30,000g、任何中间值或大于30,000g施加离心力。旋转的持续时间可以是2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、任何中间值或大于50分钟，其中旋转持续时间是液滴化的样品流体量的函数。
然而，在可替代变型中，施加的力可以与施加的压力相关联、磁性施加或以其他方式物理施加，以驱动样品流体通过膜或其他基材。
关于用于产生乳液的收集容器内的样品流体和/或流体层的组分，收集容器内的样品流体和流体层可以具有特定密度、黏度、表面张力、水性、疏水性、不混溶性特征或其他特征中的一种或多种。根据应用，实施的流体可以具有1至3000kg/m3和中间值的密度、0.001至0.1Ns/m2的黏度以及0.01至1N/m的表面张力。样品流体和/或流体层可以进一步包括在上文以引用的方式并入的2021年11月2日授权的美国专利号11,162,136中描述的材料，其中，在一个这样的实施方案中，收集容器含有覆盖水层的油层，并且样品流体被驱动通过基材进入收集容器，以产生通过连续相彼此分离的多个液滴的乳液。此外，液滴和/或由所述液滴产生的所得乳液可以具有高度的且大于阈值水平的澄清度，具有或不具有折射率匹配。在变型中，在使用透射检测器测量乳液的澄清度时，乳液澄清度的阈值水平与大于50％的透射率、大于60％的透射率、大于70％的透射率、大于80％的透射率、大于90％的透射率、大于95％的透射率、大于99％的透射率等的透射率相关。
所述乳液的材料可以进一步防止单细胞内容物(例如，mRNA、核酸、核组分、蛋白质、其他分析物等)从一个分区泄漏到另一个分区，从而能够在整个样品处理和下游分析中隔离单细胞材料。
关于单细胞处理，除了单细胞集和功能化颗粒集(即，上文第2节所述的功能化颗粒组合物的实施方案、变型和示例)之外，样品流体(例如，样品和其他组分的水性混合物)可以附加地或可替代地包括以下中的一种或多种：固定溶液组分(例如，固定前溶液、固定后溶液)、缓冲液组分(例如，透化缓冲液)、裂解试剂、抑制剂试剂、混合物(例如，一级抗体混合物、二级抗体混合物)、染色剂(例如，荧光染色剂、组织染色剂)和/或用于细胞捕获或分析的任何其他合适的流体。
附加地或可替代地，在一些变型中，样品流体可以包括磁性组分，其可以用于促进源自单分区的细胞的经分区细胞/材料的纯化(例如，在下游处理期间)，或者通过磁性吸引或排斥来操纵含有单细胞材料的液滴。附加地或可替代地，磁性组件可以用于通过磁性吸引或排斥来操纵不含单细胞材料的液滴，使得不含单细胞材料的分区可以被从含有单细胞材料的分区中拉出、可控地破裂或以其他方式操纵。
例如，为了纯化，样品流体可以含有与亲和分子偶联的磁性颗粒的溶液，该亲和分子被配置成结合到不感兴趣的组分(例如，不期望的细胞、碎片、废物)，以便在后续处理步骤中促进磁性分离此类组分，或控制与单细胞材料无关的分区的破裂。可替代地，为了纯化，样品流体可以含有与亲和分子偶联的磁性颗粒的溶液，该亲和分子被配置成结合到感兴趣的组分(例如，目标细胞、其他目标分析物)，以便在后续处理步骤中促进磁性分离此类组分。附加地或可替代地，样品流体可以含有被配置成结合到感兴趣的组分(例如，目标细胞、其他目标分析物)的磁性颗粒的溶液，并且对收集容器(或在后续步骤中对样品的衍生物)施加磁场可以用于将感兴趣的组分和/或含有感兴趣的组分的分区吸引或排斥到收集容器或其他容器的期望表面以进行分析(例如，通过光学询问、用于取回等)。
在实施方案中，在产生时，多个液滴可以以密堆积形式(例如，三维密堆积形式、六边形密堆积形式、矩形密堆积形式等)在收集容器的区域内，在连续相中稳定在适当位置中S320。关于所述的膜/基材，产生多个液滴可以包括朝向收集容器的封闭端传输液滴(例如，来自一个或多个膜的孔的液滴的二维阵列)，从而以三维密堆积的形式朝向收集容器的封闭端稳定多个液滴。可替代地，多个液滴可以以非密堆积形式，朝向收集容器的封闭端或不同区域被稳定化(例如，在连续相中、在位于收集容器内的基质中、在收集容器内的网格中等)。例如，非密堆积的液滴或可以在封闭的收集容器内相对于彼此移动的液滴仍可以通过光学询问来处理，如下文更详细描述的(例如，通过相对于光学询问仪器的扫描路径固定封闭的收集容器的位置)。附加地或可替代地，关于密堆积或非密堆积形式，乳液的液滴可以通过固化(例如，用光、用热、用pH变化、用其他交联、通过电场、通过磁场等)乳液的分散相、连续相或两者而稳定在适当位置中。仍可替代地，液滴可以不稳定在适当位置中或可以不处于密堆积形式(例如，液滴可能在容器内相对于彼此移动，诸如对于油包水或水包油乳液等)。
在一些变型中，如图4A所示，方法300可以进一步包括：在热传递操作过程中，向收集容器内的多个液滴传递热以及从收集容器内的多个液滴传递热S330。热传递可以与冷储存(例如，冷藏、冷冻等)、裂解(例如，用于用裂解试剂裂解多个液滴内的单细胞集，并且其中在裂解过程中多个液滴中的单个液滴保持不与相邻液滴融合)、温育、培养、热循环(例如，在扩增过程中)、酶活化或另一种热传递操作相关联。在变型中，在热传递操作期间，温度可以在0℃至95℃之间变化，并且在特定示例中，温度可以在所述范围内的温度之间转变，同时保持液滴的稳定性。特别地，鉴于所述的液滴产生技术和材料，在热传递操作期间，多个液滴中的单个液滴保持不与密堆积形式的相邻液滴融合。
在一些变型中，如图4A所示，方法300可以进一步包括：对收集容器内的多个液滴进行光学询问操作S340，其中光学询问操作可以包括从多个液滴中的液滴读出信号(例如，光信号、荧光信号、色度信号等)。特别地，可以使用在以引用的方式并入的申请中描述的技术，对收集容器内的多个液滴的横截面进行读出。
在变型中，荧光信号(例如，来自分散相的液滴的经标记单细胞材料、来自分散相的液滴的其他经标记分析物、来自分散相的液滴的分析物的产物等)的读出可以通过3D扫描技术(例如，光幕成像、共焦显微镜等)和平面成像技术(例如，用于拍摄封闭容器横截面的图像)中的一种或多种来进行。附加地或可替代地，在一些应用中，与分散相的液滴相关的色度变化的读出可以通过3D成像技术(例如，使用光场成像的3D明场构建等)来进行。可以跨多个颜色通道(例如，2个颜色通道、3个颜色通道、4个颜色通道、5个颜色通道、6个颜色通道、7个颜色通道等)对多个液滴/收集容器的横截面集中的每一个进行读出。
对于颜色通道集中的每一个，可以对封闭的收集容器内的多个液滴的10个横截面、多个液滴的20个横截面、多个液滴的30个横截面、多个液滴的40个横截面、多个液滴的50个横截面、多个液滴的60个横截面、多个液滴的70个横截面、多个液滴的80个横截面、多个液滴的90个横截面、多个液滴的100个横截面、多个液滴的200个横截面、多个液滴的300个横截面、多个液滴的400个横截面、多个液滴的500个横截面、多个液滴的600个横截面、多个液滴的700个横截面、任何中间值或更多横截面进行与单细胞分析相关的读出。
在特定示例中，可以在5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟、30秒、20秒、10秒、5秒或更短的持续时间内进行与每个通道的数字分析(例如，计数、量化等)相关的读出，这取决于信噪比、光学传感器灵敏度、激发功率(例如，用于照射液滴和引发荧光的光源的激发功率)或其他特征中的一个或多个。
在其他变型中，可以从分散相的液滴读出非荧光信号。例如，由分散相的单个液滴内的反应产生的产物可以产生折射率、光吸收、光散射、光反射、光透射或其他光相互作用特征中的一个或多个的变化，这些变化不同于空的或未反应的液滴，以用于通过各种技术(例如，分光光度技术、浊度技术等)进行检测。
因此，取决于使用的应用，所述方法能够在现有技术10-100倍的宽动态范围内对单细胞进行数字分析。在与单细胞测定相关的示例中，本文公开的方法可以具有100万至1亿的动态范围，这是由于产生了极高数量的可以从中读取信号的均匀分区，并且由于以低分区占有率(例如，小于20％占有率、小于15％占有率、小于10％占有率、小于9％占有率、小于8％占有率、小于7％占有率、小于6％占有率、小于5％占有率等)进行分区的能力。在变型中，这种低占有率能够表征目标，诸如感兴趣的单细胞，而不需要用于分区误差或其他误差的泊松统计相关的校正因子。
在示例中，可以在所述持续时间内并以所述速率(例如，100万个液滴/分钟的量级)在封闭容器内产生大量的液滴(如所述)，并且可以以高速率(例如，每个通道小于1分钟，跨多个颜色通道)进行用于数字分析的每个通道的读出，由此使得能够在几分钟或几小时(持续时间如上所述)的量级上对数百万个分区的数字分析进行读出。
因此，对于用于数字分析的通道集中的每一个，通过读出所述液滴的数量来产生液滴的方法可以在1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时或任何中间值的持续时间内进行。在示例中，一旦已经进行了液滴产生和扩增/标记，则可以在5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、1分钟、30秒、20秒、10秒或更短时间内从每个通道读出信号，这取决于信噪比、光学传感器灵敏度、激发功率(例如，用于照射液滴和引发荧光的光源的激发功率)或其他特征中的一个或多个。
因此，通过读出液滴的数量来产生液滴的方法可以包括：在持续时间(例如，所述持续时间)内对来自样品的单细胞材料进行数字分析，其中进行数字分析包括：产生多个液滴(例如，在封闭的收集容器内，多个液滴包括从用于单细胞相关测定的样品和材料的组合产生的多个所述液滴)、单独分离多个液滴(例如，在乳液的连续相中)，接收热(例如，通过封闭的收集容器)，从而执行所述的一个或多个过程，并传输信号(例如，来自封闭的收集容器内包含多个液滴的乳液的横截面集)，以用于使用检测系统(例如，与封闭的收集容器相互作用的检测系统)的通道读出集。
下文进一步描述了附加的相关方法实施。
3.1.1方法-实施
如图4B所示，用于独特关联分区内容物的方法400可以包括：提供分布在分区集上的颗粒集，其中该分区集的分区子集含有来自分离的单细胞的目标材料，并且其中该颗粒集中的每一个包括用于捕获目标材料的分子第一子集，以及分子第二子集，分子第二子集被配置成在从颗粒集释放时与分子第三子集反应，以使得能够鉴定含有来自单细胞的目标材料的分区内的颗粒子集之间的关联S410；促进通过偶联到分区内的颗粒子集的分子第一子集选择性捕获目标材料S420；触发释放分子第二子集以与分子第三子集相互作用S430；产生可扩增模板集，其具有与分区内的颗粒子集相关联的连接的条形码片段，作为用于测序的珠连接的文库S440；在组合来自分区组的材料后，对可扩增模板集进行测序S450；在进行操作集时，从可扩增模板集产生连接的条形码的网络S460；从连接的条形码的网络，确定每个分区的颗粒特征集，其中该颗粒特征集包括描述特定分区内的颗粒的第一因子，以及描述特定分区内有多少颗粒的第二因子S470；以及根据颗粒特征集，从与特定分区的颗粒特征集相关的测序分析物中产生单细胞表达文库S480。
方法400的实施方案用于提供单细胞分析的新机制，其提供高捕获效率，而无需复杂或昂贵的实验设备。在变型中，方法400可以在低占有率方案中实施，其中分区集中仅有一个小子集含有单细胞和/或来自单细胞的目标材料，并且分区“超载”(如上所述)有被配置用于从单细胞捕获目标材料的功能化颗粒。因此，功能化颗粒具有相互作用的功能，其相互作用的方式允许在测序后的分区内鉴定特定的功能化颗粒。
方法400的实施方案还用于提供有效捕获和标记目标材料(例如，DNA、RNA、miRNA、蛋白质、小分子、单分析物、多分析物等)的机制，以便以单细胞分辨率表征分区的细胞。
可以通过上述组合物和/或其他合适的系统和组合物的实施方案、变型和示例来实现方法400。
3.1.1.1方法-用单细胞对功能化颗粒进行分区
步骤S410叙述：提供分布在分区集上的颗粒集，其中分区集的分区子集含有来自分离的单细胞的目标材料，并且其中颗粒集中的每一个包括用于捕获目标材料的分子第一子集，以及分子第二子集，其被配置成在从颗粒集释放时与分子第三子集反应，以使得能够鉴定含有来自单细胞的目标材料的分区内的颗粒子集之间的关联如上所述，可以使用液滴(例如，乳液的液滴)、孔(例如，微流体孔、纳米流体孔)，和/或细胞、亚细胞结构(例如，细胞器)、寡核苷酸、其他单个目标和/或其他分析物的其他形式的物理分区来进行分区。如所述，当细胞和颗粒分布在分区集上时，多个分区/液滴的子集中的每一个可以容纳单细胞集中的一个单细胞，以及功能化颗粒集子集(例如，在超载方案中)。
颗粒集可以包括上文第2节所述组合物的变型和示例。
3.1.1.2方法-从单细胞目标捕获物质
步骤S420叙述：促进通过偶联到分区内的颗粒子集的分子第一子集选择性捕获目标材料，如上所述，其用于实现偶联到功能化颗粒的核心体的分子子集的捕获探针，以从每个分区的单个细胞捕获目标材料。促进选择性捕获可以包括在合适的环境中(例如，关于溶液、温度、pH、组分浓度、流动、洗涤、试剂等)用功能化颗粒集处理样品。附加地或可替代地，促进选择性捕获可以包括其他合适的处理步骤(例如，样品组分的裂解、不期望的样品组分的洗涤等)。
在一种变型中，框S420可以包括捕获样品的目标mRNA(例如，使用具有dT、dTVN的捕获探针用于捕获polyA mRNA或基因特异性序列)，随后进行逆转录以将cDNA附加到捕获探针。在可替代变型中，框S420可以包括使用合适的捕获探针促进以下中的一种或多种的选择性捕获：DNA、其他RNA(例如，miRNA)、蛋白质(例如，抗体，使用TotalSeqTM分子)、小分子、单分析物、多分析物等)，和/或其他目标材料。因此，对于核酸目标，偶联到功能化颗粒的分子第一子集的捕获探针可以包括核酸目标的互补分子。对于蛋白质目标或小分子目标，偶联到功能化颗粒的分子第一子集的捕获探针可以包括核酸序列，其中样品的目标(例如，蛋白质、肽、抗体、小分子等)用具有与捕获探针124的序列互补的序列的寡核苷酸标记。
3.1.1.3方法-连接每个分区内的颗粒
步骤S430叙述：触发释放分子第二子集以与分子第三子集相互作用，其用于释放偶联到分区内每个颗粒的一部分分子，以与分区内其他颗粒上的互补分子杂交，从而能够在测序后鉴定分区内的颗粒。步骤S430可以包括通过以下来裂解分子第二子集：酶促机制(例如，限制性酶、限制性核酸内切酶、限制性内切酶等)、光裂解机制(例如，使用UV波长光、使用其他光)、pH偏移、另一种化学裂解机制、热或另一种合适的裂解机制。在图1A、图3A和图5A所示的示例中，分子第二子集中的每一个均可以包括二硫键，并且触发释放包括在碱性pH下使用二硫苏糖醇(DTT)，以便释放分子第二子集的单元，用于与分子第三子集的互补单元杂交。然而，触发释放可以以另一种合适的方式进行。
3.1.1.4方法-扩增和测序
步骤S440叙述：产生可扩增模板集，其具有与分区内的颗粒子集相关联的连接的条形码片段，作为用于测序的珠连接的文库，并且步骤S450叙述：在组合来自分区集的材料后，对可扩增模板集进行测序。步骤S440和S450用于杂交分区内不同颗粒的互补关联片段(上文描述)，其中杂交的分子产生具有多个条形码序列(即，来自每个参与颗粒的一个条形码序列)的可扩增模板。在图5B所示的示例中，释放的分子第二子集的分子可以与分区内其他颗粒上的分子第三子集的互补分子杂交，并且产生具有两个条形码序列(例如，B 1和B2的组合、B2和B3的组合、B1和B3的组合)的可扩增模板。在特定示例的变型中，可以实现分区内的其他数量的颗粒。
在步骤S450中，对可扩增模板集进行测序可以包括去分区或以其他方式组合分区(例如，破坏乳液以组合分区、从微孔或其他阵列提取材料以组合分区、组合液滴等)，以及实施高通量测序以读出可扩增模板(例如，通过PCR扩增后)。附加地或可替代地，可以使用其他测序方法来读出扩增的模板。在图5C所示的示例中，步骤S450可以包括在每个分区内进行带有模板转换的逆转录操作S451，随后是去分区、核酸纯化和文库扩增S452，随后是扩增产物纯化和大小选择(例如，假设珠连接的文库小于目标分析物捕获文库)S453，随后是在测序之前添加测序衔接子的后续步骤S454(如上所讨论)。
因此，步骤S450还可以包括由功能化颗粒集的捕获探针捕获的目标分子的测序(例如，合成cDNA的逆转录和扩增后，用于上述mRNA应用)。在一种变型中，高通量测序可以用于读出捕获的目标分子。附加地或可替代地，其他测序方法可以用于读出捕获的目标分子。
3.1.1.5方法-分区颗粒的表征和单细胞表征
步骤S460叙述：在进行操作集时，从可扩增模板集产生连接的条形码的网络。关于分区内多个颗粒与单细胞材料的计算连接，图5D描绘了根据步骤S440的实施方案产生的珠连接的库，其中具有多个条形码序列的模板可以通过生物信息学过程集解码。可能的连接数等于n！，其中n是每个分区的颗粒数量。因此，过程集可以用于为每个分区确定每个分区的颗粒特征集，其中颗粒特征集包括描述每个分区内的颗粒的第一因子，以及描述每个分区内有多少颗粒的第二因子(如在步骤S470中)。一旦确定了每个分区的颗粒特征集，则可以实施步骤S480以从与每个分区的颗粒特征集相关的测序分析物中产生单细胞表达文库。特别地，S480可以包括将分区的相关条形码序列映射到具有相同条形码序列并且具有与分区相关的颗粒数量的经测序单细胞目标，组装测序目标并且为与单细胞相关的分区产生单细胞表达文库(例如，关于基因组表达、关于转录组学、关于其他多组学等)。
然而，方法400可以包括其他合适的步骤和/或实现其他下游应用。
4.计算机系统
本公开提供了被编程以实现本公开方法的计算机系统。图6示出了计算机系统601，其被编程或以其他方式配置成例如，在收集容器内以期望的速率和期望的形态特征产生多个液滴(例如，从包括单细胞集和功能化颗粒集的水性混合物)，向收集容器内的多个液滴传递热和从收集容器内的多个液滴传递热，对收集容器内的多个液滴进行光学询问操作，并且/或者进行一个或多个单细胞测定过程/分析。
计算机系统601可以调节本公开的分析、计算和产生的各个方面，例如，在收集容器内以期望的速率和期望的形态特征产生多个液滴(例如，从包括单细胞集和功能化颗粒集的水性混合物)，向收集容器内的多个液滴传递热和从多个液滴传递热、对收集容器内的多个液滴进行光学询问操作，并且/或者进行一个或多个单细胞测定过程/分析。计算机系统601可以是用户的电子装置或相对于电子装置远程定位的计算机系统。电子装置可以是移动电子装置。
计算机系统601包括中央处理单元(CPU，本文也称为“处理器”和“计算机处理器”)605，其可以是单核或多核处理器，或者用于并行处理的多个处理器。计算机系统601还包括存储器或存储位置610(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元615(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口620(例如，网络适配器)以及外围装置625，诸如高速缓存、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器610、存储单元615、接口620和外围装置625通过通信总线(实线)(诸如主板)与CPU 605通信。存储单元615可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据储存库)。借助于通信接口620，计算机系统601可以可操作地偶联到计算机网络(“网络”)630。网络630可以是因特网、互联网和/或外联网，或者与因特网通信的内联网和/或外联网。
在一些实施方案中，网络630是电信和/或数据网络。网络630可以包括一个或多个计算机服务器，其可以实现分布式计算，诸如云计算。例如，一个或多个计算机服务器可以使网络630(“云”)上的云计算能够进行本公开的分析、计算和产生的各个方面，例如，以多分散性的预定速率或变型在收集容器内产生多个液滴。这种云计算可以由云计算平台提供，例如像亚马逊网络服务(Amazon Web Services，AWS)、微软Azure、谷歌云平台(GoogleCloud Platform)和IBM cloud。在一些实施方案中，借助于计算机系统601，网络630可以实现对等网络，这可以使偶联到计算机系统101的装置表现为客户端或服务器。
CPU 605可以包括一个或多个计算机处理器和/或一个或多个图形处理单元(GPU)。CPU 605可以执行一系列机器可读的指令，这些指令可以体现在程序或软件中。指令可以存储在存储器位置(诸如存储器610)中。指令可以被引导到CPU 605，其可以随后编程或以其他方式配置CPU 605以实施本公开内容的方法。由CPU 605进行的操作的示例可以包括提取、解码、执行和写回。
CPU 605可以是电路(诸如集成电路)的一部分。系统601的一个或多个其他组件可以包括在电路中。在一些实施方案中，电路是专用集成电路(ASIC)。
存储单元615可以存储文件，诸如驱动程序、文库和保存的程序。存储单元615可以存储用户数据，例如，用户偏好和用户程序。在一些实施方案中，计算机系统601可以包括计算机系统601外部的一个或多个附加数据存储单元，诸如位于通过内联网或因特网与计算机系统601通信的远程服务器上。
计算机系统601可以通过网络630与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统601可以与用户的远程计算机系统通信。远程计算机系统的示例包括个人计算机(例如，便携式PC)、平板或平板式PC(例如，iPad、/>Galaxy Tab)、电话、智能电话(例如，/>iPhone、支持安卓的装置、/>)或个人数字助理。用户可以经由网络630访问计算机系统601。
如本文所述的方法可以通过存储在计算机系统1101的电子存储位置上(例如像，存储在存储器610或电子存储单元1115上)的机器(例如，计算机处理器)可执行代码来实现。机器可执行或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，代码可由处理器605执行。在一些实施方案中，可以从存储单元615检索代码并且将其存储在存储器610上以供处理器605访问。在一些情况下，可以排除电子存储单元615，而将机器可执行指令储存在存储器610上。
代码可以被预编译和配置用于与具有适于执行代码的处理器的机器一起使用，或者可以在运行时被编译。可以用编程语言提供代码，可以选择编程语言以使代码能够以预编译或实时编译的方式执行。
本文提供的系统和方法的实施方案(诸如计算机系统601)可以在编程中实现。技术的各个方面可以被认为是“产品”或“制品”，通常是机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式，其被承载或包含在一种类型的机器可读介质中。机器可执行代码可以存储在电子存储单元(诸如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘)上。“存储”类型的介质可以包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器或其相关模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器或磁盘驱动器，它们可以在任何时候为软件编程提供非暂时性存储。软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其他电信网络进行通信。例如，此类通信可以使得能够将软件从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器中，例如，从管理服务器或主计算机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以承载软件元件的另一种类型的介质包括光、电和电磁波，诸如通过有线和光学陆线网络以及经过各种空中链路在本地装置之间的物理接口上使用的。携带此类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所用，除非限于非临时性的、有形的“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”的术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，机器可读介质(诸如计算机可执行代码)可以采取许多形式，包括有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如，光盘或磁盘，如任何一个或多个计算机等中的任何存储装置，诸如可以用于实现附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这种计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内总线的电线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号的形式，或者声波或光波的形式，如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些声波或光波。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、软磁盘、硬盘、磁带、任何其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、具有孔图案的任何其他物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储芯片或盒式磁带、传输数据或指令的载波、传输此类载波的电缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多可以涉及将一个或多个指令的一个或多个序列传送到处理器以供执行。
计算机系统601可以包括电子显示器635或与电子显示器635通信，电子显示器635包括用户界面(UI)640，用于提供例如，指示以下的视觉显示：在收集容器内产生多个液滴，向收集容器内的多个液滴传递热和从多个液滴传递热，对收集容器内的多个液滴进行光学询问操作，并且/或者进行一个或多个单细胞测定过程/分析。UI的示例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于web的用户界面。
本公开的方法和系统可以通过一种或多种算法来实现。算法可以在由中央处理单元605执行时通过软件来实现。例如，算法可以在收集容器内产生具有期望特征的多个液滴。
5.结论
附图说明了根据优选实施方案、示例配置及其变型的系统、方法和计算机程序产品的可能实施的架构、功能和操作。在这方面，流程图或框图中的每个框可以代表代码的模块、片段或部分，其包括用于实现一个或多个指定逻辑功能的一个或多个可执行指令。还应注意，在一些替代实施方式中，框中标注的功能可以不按照图中标注的顺序发生。例如，连续示出的两个框实际上可以基本上同时执行，或者框有时可以以相反的顺序执行，这取决于所涉及的功能。还将注意到，框图和/或流程图图示中的每个框以及框图和/或流程图图示中框的组合可以由进行指定功能或动作的基于专用硬件的系统或者专用硬件和计算机指令的组合来实现。
从前述内容中应理解，尽管已说明和描述了特定实施方式，但可以对其进行各种修改，并在本文中予以考虑。本发明还不意在受限于本说明书内提供的具体实施例。虽然已经参考上述具体说明描述了本发明，但是对本文中优选实施方案的描述和示例说明不意在以限制性意义进行解释。此外，应理解，本发明的所有方面不限于本文中所述的具体描绘、配置或相对比例，其取决于各种条件和变量。本发明实施方案的形式和细节的各种修改对于本领域技术人员来说是将是显而易见的。因此，设想本发明还应覆盖任何这种修改、变型和等同方案。所附权利要求意在限定本发明的范围并且意在由此覆盖处于这些权利要求的范围内的方法和结构及它们的等同方案。

Claims (22)

1.一种方法，其包括：
以每分钟至少50,000个液滴的速率在收集容器内产生多个液滴，其中所述多个液滴由包含单细胞集和被配置用于单细胞测定的功能化颗粒集的水性混合物产生。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多个液滴的子集中的每一个均包括所述单细胞集中的一个单细胞，以及所述功能化颗粒集的子集。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中产生所述多个液滴包括驱动样品流体通过包括孔分布的基材，所述基材偶联到所述样品流体的储存器的储存器出口，并且所述收集容器在所述基材的下游与所述基材对齐。
4.如权利要求3所述的方法，其中驱动所述样品流体通过所述基材包括在离心机内旋转所述样品流体、所述基材和所述收集容器，从而在离心力的作用下驱动所述样品流体通过所述基材并进入所述收集容器。
5.如权利要求3或4所述的方法，其中所述收集容器含有覆盖水层的油层，并且其中驱动所述样品流体通过所述基材进入所述收集容器产生通过连续相彼此分离的所述多个液滴的乳液。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述单细胞集具有第一数量，并且其中所述功能化颗粒集具有大于所述第一数量的第二数量。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述单细胞集占据所述多个液滴的少于15％。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述功能化颗粒集由功能化颗粒的特征集表示，所述功能化颗粒的特征集可以由具有独特条形码的功能化颗粒的百分比(p)来表征，并且其中p由条形码多样性(d)、由第一数量的单细胞占据的分区的占有率百分比(o)和所述功能化颗粒集中功能化颗粒的第二数量(n)产生。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中独特的所述功能化颗粒集的百分比(p)大于99％，并且其中由第一数量的单细胞占据的液滴的占有率百分比(o)小于10％，并且条形码多样性(d)大于所述功能化颗粒集中功能化颗粒的第二数量(n)的五倍。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述功能化颗粒集中的功能化颗粒包括：
主体，
偶联到所述主体的单细胞分析物捕获分子第一子集，
偶联到所述主体的可释放分子第二子集，和
偶联到所述主体的杂交分子第三子集，其可与所述分子第二子集的分子杂交。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述分子第一子集的第一分子包括条形码片段、独特分子标识符和捕获部分。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述捕获部分被配置用于与所述单细胞测定相关联的目标mRNA结合。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，
其中所述分子第二子集的第二分子响应于触发物而从所述主体释放，并且包括条形码片段和关联片段；并且
其中所述分子第三子集的第三分子包括所述条形码片段和互补关联片段，所述互补关联片段被配置成优先与所述功能化颗粒集的其他功能化颗粒的关联片段杂交。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述功能化颗粒的所述互补关联片段不与所述功能化颗粒的所述关联片段杂交。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述触发物包括选自以下的化合物：酶触发物、光裂解触发物、pH触发物和热触发物。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述水性混合物进一步包括裂解试剂。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其进一步包括：将热传递到所述收集容器，从而用裂解试剂裂解所述多个液滴内的所述单细胞集，并且其中所述多个液滴中的单个液滴在裂解过程中保持不与相邻液滴融合。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述功能化颗粒集被配置用于从所述单细胞集的经裂解细胞中捕获目标核酸。
19.一种方法，其包括：
在离心力的作用下，以每分钟至少20,000个液滴的速率在收集容器内产生多个液滴，其中所述多个液滴由包含单细胞集和被配置用于单细胞测定的功能化颗粒集的水性混合物产生，并且其中所述单细胞集具有第一数量，该第一数量大于所述功能化颗粒集的功能化颗粒的第二数量；
在所述多个液滴中的液滴内杂交所述功能化颗粒集的功能化颗粒子集的分子的互补区域，从而在所述液滴内共关联所述功能化颗粒子集；并且
捕获与所述液滴内的所述功能化颗粒子集共定位的单细胞的目标。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述水性混合物进一步包括裂解试剂，所述方法进一步包括：将热传递到所述收集容器，从而用所述裂解试剂裂解所述多个液滴内的所述单细胞集，并且其中所述多个液滴中的单个液滴在裂解过程中保持不与相邻液滴融合。
21.一种方法，其包括：
在驱动包含单细胞集和功能化颗粒集的混合物通过具有孔分布的基材时，将所述单细胞集和所述功能化颗粒集分布在乳液的多个液滴上。
22.如权利要求21所述的方法，其中驱动所述混合物通过所述基材包括在离心力的作用下驱动所述混合物通过所述基材。
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