CN105854965B - 一种用于离心法产生油包水液滴的油相组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于离心法产生油包水液滴的油相组合物，其由以下组分组成,含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂7‑15％，矿物油0‑10％，余量为碳酸二乙基己酯；或由以下组分组成：长链烷烃酯85％‑95％，含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂5‑15％；或由硅油和表面活性剂组成。本发明还提供了以上述油相组合物为第二液体通过离心法产生油包水液滴的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于产生液滴的油相组合物，以及以该油相组合物作为第二液体通过离心法产生油包水液滴的方法。
背景技术
微流控是现在普遍适用的实现液滴化的方法，但其有局限性，例如无法实现高通量，微流芯片制备及使用时对环境洁净度要求高、操作繁琐等。因此我们提出了离心法产生液滴(参见CN104741158A)。在离心法中，要求油相的密度小于水以使液滴化装置产生的水相液滴快速下沉，从而减少液滴之间的碰撞，同时液滴要有良好的热稳定性(例如PCR反应需95℃)与生物兼容性以保障后续反应的发生。这就对应的需要一类新的油相配方。
现在基于微流平台形成稳定液滴的油相主要有三类：氟油类，包括FC 3283、FC40、FC70等；烃类油，包括矿物油、烷烃等；硅油类。三类油相中都需要加入表面活性剂以稳定乳液。然而硅油无法与PDMS兼容，对微流芯片的材料要求比较高，且与其配合使用的表面活性剂研究较少；现有的烃类油配方的热稳定性较好，但其在95℃高温下仍存在液滴融合现象。氟油适合微流，稳定性较好且具有很好的生物相容性，但由于其密度远大于水，因此不适用于离心法。近年来，以矿物油和表面活性剂为组合的油相配方在emulsion PCR和BEAMing PCR中应用广泛。然而在本试验中，发现该类配方虽然可以在微流芯片中作为连续相几乎无损的产生尺寸均一的水相液滴，也可以通过离心法产生均一稳定的液滴，但产生的液滴热稳定性无法达到PCR反应的温度条件。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种油相组合物，既适用于离心法，又具有良好的稳定性，能够保障后续反应的发生。所用的试剂成本低，易得。本发明的油相组合物和离心法的配合为液滴的产生提供了比微流控更快速、高通量、便捷的方法。该油配方能与含有盐离子的缓冲液形成稳定的乳液，并可以一段时间内在室温下稳定存在；密度小于水，适用于离心法产生液滴；且抗热，可以经过PCR循环(高至95℃)而不出现液滴融合现象，因此可以用来进行PCR反应，也就更适用于温度要求不高的生物反应，例如多重置换扩增(multipledisplacement amplification,MDA)，以及全基因组扩增(Whole Genome Amplification)反应。除了DNA、RNA反应外，液滴还可以进行单细胞、细菌、蛋白质的分离等。同时本发明的油相配方也适用于微流芯片等产生液滴的方法。
通过液滴化装置和离心力产生装置，我们将水相的第一液体在离心力的作用下形成小液滴并进入位于收集装置中的第二液体中，得到稳定的油包水液滴，液滴也可以通过微流装置产生。第一液体可以为用于生物反应的样品，例如用于数字链式酶反应的混合液，细胞悬浮液，细菌悬浮液，用于基因组扩增的DNA溶液，用于RNA逆转录的混合液，用于蛋白质结晶的混合液，用于无机盐结晶的混合液，病原物溶液或悬浊液，用于聚合反应的混合液，用于凝胶化反应的混合液等，第二液体为含有表面活性剂的油相组合物。在油-水界面，表面活性剂的存在可以稳定液滴防止融合。在这其中，表面活性剂起到两点作用：一是在油包水液滴的界面上形成亲水基团朝内、亲油基团朝外的表面活性剂分子层，在液滴与液滴之间形成空间上的排斥力从而防止融合；二是液滴靠近过程中，油相的排液运动导致液滴表面存在活性剂分子浓度梯度，从而产生Marangoni效应，减弱了油相的排液运动从而稳定液滴。
本发明提供一种用于离心法产生油包水液滴的油相组合物，其特征在于，由以下组分组成,含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂7-15％，矿物油0-10％，余量为碳酸二乙基己酯。
所述含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂含CETYL PEG/PPG-10/1DIMETHICONE或类似结构。选自WE09以及EM180，EM90,BC2426(KCCGroup),Kobo Products公司的DIDW系列，Silok Chemical公司的2215、2216以及2216C表面活性剂中的一种或多种。
本发明还提供一种用于离心法产生油包水液滴的油相组合物，其特征在于，由以下组分组成，长链烷烃酯85％-95％，含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂5-15％。
所述长链烷烃酯为含碳数10以上的烷烃酯。选自棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯、棕榈酸异丙酯、月桂酸甲酯、月桂酸乙酯、月桂酸丙酯、月桂酸异戊酯、月桂酸丁酯、油酸甲酯、油酸乙酯、油酸甘油酯、硬脂酸甲酯、硬脂酸乙酯、硬脂酸乙烯酯、硬脂酸丁酯、硬脂酸甘油酯中的一种或多种。优选凝固点在-10-20℃的长链烷烃酯，例如棕榈酸异丙酯、月桂酸丁酯、月桂酸甲酯、月桂酸乙酯、硬脂酸丁酯中的一种或多种。在此种凝固点条件下，得到的液滴油相体系可以保存在凝固点以下例如4℃冰箱中以大大延长样品的保存时间至一周左右而不需要过于严苛的低温条件，需要应用时则取出至室温下则可融化得到完整的液相液滴体系。
所述含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂含CETYL PEG/PPG-10/1DIMETHICONE或类似结构。选自WE09以及EM90,BC2426(KCCGroup),Kobo Products公司的DIDW系列，Silok Chemical公司的2215、2216以及2216C表面活性剂中的一种或多种。
本发明还提供一种用于离心法产生油包水液滴的油相组合物，其特征在于，由硅油和表面活性剂组成，其中表面活性剂由以下物质组成：5225C Formulation Aid含量为20-50％，ES-5227 DM Formulation Aid含量约为10-40％，ES-5612的含量为2-15％，ES-5226 DM Formulation Aid含量约为10-30％。硅油为317667硅油、378321硅油。
本发明还提供一种以前述的油相组合物为第二液体通过离心法产生油包水液滴的方法，其特征在于，包含如下步骤：在液滴化装置中加入第一液体，在收集装置中加入第二液体，设置加速度产生装置的转速，产生液滴，第一液体为5-100ul，第二液体为300-1500μL，控制位于液滴化装置内的第一液体的下液面与第二液体的上液面之间垂直距离小于1厘米以降低液滴在进入油相组合物液面时碰碎的几率，液滴化装置中含有离心孔板，孔板孔径为3-10um，离心力为5000-20000rcf，可产生均匀大小的直径为30-200μm液滴，液滴的大小主要通过离心孔板孔径大小和离心力大小决定。
本发明的有益效果是，1)本发明适用于离心法快速大量产生均匀液滴，并且产生的乳液体系耐高温，同时可在室温下稳定存在。若选取酯类的凝固点在-10-20℃之间，例如棕榈酸异丙酯、月桂酸丁酯、月桂酸甲酯、月桂酸乙酯、硬脂酸丁酯中的一种或多种，则可将产生得到的乳液体系以固态在凝固点(例如PCR反应最后停止温度4℃)以下保存，大大延长了液滴保存的时间可至一周，使用时从冰箱内取出室温下即可重新转变为液相的乳液体系；2)本发明同时适用于微流控装置例如微流芯片中与反应液形成均匀稳定的液滴，以进行各类生物反应。3)本发明可与水相反应液以普通油包水液滴的形成方法例如搅拌、震荡等形成稳定抗热的乳液体系。
附图说明
以下结合附图及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
图1为离心法产生液滴的装置示意图。
图2为碳酸二乙基己酯-ABIL WE09-矿物油组成的油相组合物的三相图。
图3为Dolomite微流芯片(100μm孔径)产生液滴的明场图。
图4为离心法产生的液滴PCR反应后明场(上)以及荧光显微镜下拍摄图(下)。
具体实施方式
第一液体为PCR反应液，其组成为：1×PCR buffer,5mM MgCl2,0.4mM dNTP,1％Platinum Taq Polymerase。在现有技术使用以碳酸双酯、矿物油和表面活性剂的组合作为油相组合物的基础上调整各组分用量，以期寻找满足密度和热稳定性要求的，可通过离心法与PCR反应液得到稳定乳液体系的油相组合物比例。实施例1－34的成分含量如表1所示。
表1实施例1－34的油相组合物配方(v/v)
使用CN 104741158 A中的液滴的产生装置(如图1所示)，其中附图标记1为液滴化管子，2为收集管，3为第一液体，4为第二液体。以PCR反应液为第一液体，实施例1－34中油相混合物作为第二液体，第二液体位于收集装置中，第一液体在离心力作用下进入第二液体，产生液滴。第二液体即油相组合物用量为1000μL左右，第一液体即水相组合物量为20μL左右，控制水相组合物下液面与油相组合物的上液面之间垂直距离小于1厘米以降低液滴在进入油相组合物液面时碰碎的几率。离心孔板孔径约为6um左右，在13000rcf离心力下可产生均匀大小的直径为50μm液滴。液滴的大小主要通过离心孔板孔径大小和离心力大小决定。而液滴稳定存在的关键因素就是油相组合物的成分。
通过三相图(参见图2)对实施例1－34的油相组合物进行大范围筛查和比较，发现：虚线圆圈范围内的油相组合物与PCR反应液配合热稳定性较好，实线圆圈范围内的油相组合物与PCR反应液配合产生小液滴较少，两者重合即抗热且产生小液滴少的区域集中在右下方，即矿物油含量远少于碳酸二乙基己酯或不含有矿物油，ABIL WE09含量在7～15％的区域。表面活性剂ABIL WE09的含量不能太高，大于33％时在离心法中导致油相粘度大，从而使得液滴生成后在进入油相过程中产生很多小液滴，无法应用到后续反应，将ABILWE09的含量控制在15％及以下时可获得合适大小的液滴。而ABIL WE09含量过小易导致液滴融合，小于7％时融合严重。提高Mineral Oil的含量会使得乳液体系倾向于在经过高温循环后融合，即热稳定性差，且同时使得粘度增大液滴容易碰碎，故为同时保证液滴的完整性和抗热稳定性应将其含量控制在10％以下。
为进一步探寻热稳定性更佳的油相组合物，尝试寻找与活性剂ABIL WE09和碳酸二乙基己酯结构类似的化合物。WE09以及EM180都属于具有长链烷基且极性基团种类和比例相似的硅氧链非离子型活性剂，因此于类似体系中均可以应用，在试验中发现CETYL PEG/PPG-10/1 DIMETHICONE结构或类似结构的活性剂在稳定碳氢油与水的混合乳液中具有较好的效果，其HLB值约在2-7之间，适合形成稳定的油包水乳液体系。除WE09以及EM180外，还有EM90,BC2426(KCC Group),Kobo Products公司的DIDW系列，Silok Chemical公司的2215、2216以及2216C等具有CETYL PEG/PPG-10/1DIMETHICONE结构或类似结构的活性剂均可适用。
另外发现，长链烷基的酯与表面活性剂形成的组合物也具有较好的结果，例如棕榈酸酯、月桂酸酯、油酸酯以及硬脂酸酯类中粘度较小且密度小于1的酯中的一种或多种。实施例35为一种用于离心法产生油包水液滴的油相组合物，由85－95％的棕榈酸异丙酯和5－15％的EM 180组成。该油相组合物与PCR反应液形成的乳液稳定性和抗热性能均较好。此外由于棕榈酸异丙酯凝固点合适(11～13℃)，故形成的液滴可以保存在11℃以下凝固的油相中一个星期依然保持稳定状态，这大大增加了液滴保存的时间，利于样品的保存。而例如实施例1中的油相配方，由于其凝固点在-30℃左右故较难在一般冰箱内保存，液化条件下液滴稳定的时间约20h。因此要求酯的凝固点在-10-20℃为佳。满足这一条件的酯有棕榈酸异丙酯、月桂酸丁酯、月桂酸甲酯、月桂酸乙酯、硬脂酸丁酯等。通过与实施例1－34相同的方式产生液滴，经PCR反应后明场和荧光照片如图4所示。使用实施例35中的油相组合物和PCR反应液通过Dolomite微流芯片(100μm孔径)产生液滴，其直径约为80μm，如图3所示。可见，该油相混合物无论是作为离心法的第二液体，还是作为微流芯片产生液滴中的连续相，产生的液滴都具有较好的单分散性和耐高温性能。
发现，由硅油和表面活性剂组成的油相组合物也适于作为离心法产生液滴的第二液体。其中硅油为粘度较小的硅油，例如317667硅油(viscosity 5cSt，Sigma-Aldrich)以及378321硅油(viscosity 10cSt，Sigma-Aldrich),其密度约为0.93g/mL(25℃)，满足离心法产生液滴的密度需求。在众多硅油活性剂中，选取DowSilicone Emulsifiers中适用于硅油的活性剂5200 Formulation Aid,5225C Formulation Aid,BY 11-030,ES-5612,FZ-2233,ES-5226 DM Formulation Aid以及ES-5227 DM Formulation Aid进行试验。试验中发现，在低粘度的硅油体系中，5225C Formulation Aid，ES-5612，ES-5226 DMFormulation Aid以及ES-5227 DM Formulation Aid与硅油形成的油相组合物具有较好的结果。其中各表面活性剂与硅油含量比例约为：5225C Formulation Aid含量为20-50％(w/w)，硅油为80-50％(w/w)；ES-5227DM Formulation Aid含量约为10-40％(w/w)，硅油为90-60％(w/w)；ES-5612的含量为2-15％(w/w)，硅油含量为98-85％(w/w)；ES-5226 DMFormulation Aid含量约为10-30％(w/w)，硅油含量为90-70％(w/w)。使用与实施例1-35相同的方法产生液滴，液滴大小均匀，能够稳定存在，且热稳定性较好。
Claims (8)
1.一种用于离心法产生油包水液滴的油相组合物，其特征在于，由硅油和表面活性剂组成，其中表面活性剂选自5225C Formulation Aid，ES-5227DM Formulation Aid，ES-5612Formulation Aid，ES-5226 DM Formulation Aid中的一种或多种，硅油为317667硅油或378321硅油，表面活性剂为5225C Formulation Aid时，表面活性剂含量为20-50％(w/w)，硅油为80-50％(w/w)；表面活性剂为ES-5227DM Formulation Aid时，表面活性剂含量为10-40％(w/w)，硅油为90-60％(w/w)；表面活性剂为ES-5612Formulation Aid时，表面活性剂含量为2-15％(w/w)，硅油含量为98-85％(w/w)；表面活性剂为ES-5226DMFormulation Aid时，表面活性剂含量为10-30％(w/w)，硅油含量为90-70％(w/w)。
2.一种以权利要求1所述的油相组合物为第二液体通过离心法产生油包水液滴的方法，其特征在于，包含如下步骤：在液滴化装置中加入第一液体，在收集装置中加入第二液体，设置加速度产生装置的转速，产生液滴，第一液体为5-100μL，第二液体为300-1500μL，控制位于液滴化装置内的第一液体的下液面与第二液体的上液面之间垂直距离小于1厘米以降低液滴在进入油相组合物液面时碰碎的几率，液滴化装置中含有离心孔板，孔板孔径为3-10μm，离心力为5000-20000rcf，可产生均匀大小的直径为30-200μm液滴，液滴的大小主要通过离心孔板孔径大小和离心力大小决定。
3.一种以油相组合物为第二液体通过离心法产生油包水液滴的方法，其特征在于，包含如下步骤：在液滴化装置中加入第一液体，在收集装置中加入第二液体，设置加速度产生装置的转速，产生液滴，第一液体为5-100μL，第二液体为300-1500μL，控制位于液滴化装置内的第一液体的下液面与第二液体的上液面之间垂直距离小于1厘米以降低液滴在进入油相组合物液面时碰碎的几率，液滴化装置中含有离心孔板，孔板孔径为3-10μm，离心力为5000-20000rcf，可产生均匀大小的直径为30-200μm液滴，液滴的大小主要通过离心孔板孔径大小和离心力大小决定；所述油相组合物由以下组分组成，含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂7-15％，矿物油0-10％，余量为碳酸二乙基己酯，其中矿物油含量不为0；或油相组合物由以下组分组成，长链烷烃酯85％-95％，含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂5-15％。
4.根据权利要求3的通过离心法产生油包水液滴的方法，其中，所述含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂含CETYL PEG/PPG-10/1 DIMETHICONE。
5.根据权利要求3的通过离心法产生油包水液滴的方法，其中，所述含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂选自WE09以及EM 180，EM90，BC2426(KCCGroup)，Kobo Products公司的DIDW系列，Silok Chemical公司的2215、2216以及2216C表面活性剂中的一种或多种。
6.根据权利要求3的通过离心法产生油包水液滴的方法，当油相组合物由长链烷烃酯85％-95％，含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂5-15％组成时，所述长链烷烃酯的凝固点在-10-20℃。
7.根据权利要求3的通过离心法产生油包水液滴的方法，当油相组合物由长链烷烃酯85％-95％，含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂5-15％组成时，所述长链烷烃酯含碳数在10以上。
8.根据权利要求3的通过离心法产生油包水液滴的方法，当油相组合物由长链烷烃酯85％-95％，含长链烷基的硅氧链非离子型表面活性剂5-15％组成时，所述长链烷烃酯选自棕榈酸甲酯、棕榈酸乙酯、棕榈酸异丙酯、月桂酸甲酯、月桂酸乙酯、月桂酸丙酯、月桂酸异戊酯、月桂酸丁酯、油酸甲酯、油酸乙酯、油酸甘油酯、硬脂酸甲酯、硬脂酸乙酯、硬脂酸乙烯酯、硬脂酸丁酯、硬脂酸甘油酯中的一种或多种。
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