一种微通道阵列板的制备方法、用其来获得液滴的装置和液
滴产生方法
技术领域
本发明涉及一种微通道阵列板的制备方法、用其来获得液滴的装置和液滴产生方法。
背景技术
乳液液滴技术是许多分子生物学实验中至关重要的一部分。均匀、稳定且能够兼容生物学实验的液滴已经在很多的技术和应用中体现。其中常见的有细胞培养、样品分离、数字聚合酶链式反应和乳液全基因组扩增等技术和方法。液滴技术很有可能成为下一代测序、第三代PCR反应和相关的高通量生物测试的技术基石。由液滴造成的许多隔离独立的溶液环境一方面可以形成许多的微小反应容器,将样品的用量大大减小;一方面也可以通过扩增的手段,数字化的检测含量极低的样本,是单分子扩增反应极佳的选择。
目前常见的油包水液滴产生的方法多是利用微流控芯片,然而此方法成本高,费时耗力,容易在实验室中造成样品污染。同时,微流控的方法要求良好的洁净环境,还需要精确的压力控制系统。即使将硬件和实验环境问题克服掉,微流控的方法将需要长时间的调试和摸索。这些缺点使得在生物分析化学实验室中常见的微流控装置难以得到更广泛的应用。针对上述问题,cn104741158A提出了一种利用惯性力产生微液滴的装置和方法,但该装置中使用毛细管阵列作为液滴化装置,毛细管阵列需拉制而成,成功率低,毛细管粗细不匀,易发生堵塞,实验平行性差,难以实现高通量生产。针对毛细管阵列的缺点,本发明提出一种微通道阵列板的制备方法以及用其来获得液滴的装置和液滴产生方法。
发明内容
本发明的第一方面在于提供一种微通道阵列板的制备方法。
一种微通道阵列板的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)取两种不同的光纤玻璃棒,其中一种不能被腐蚀液腐蚀,一种能够被腐蚀液腐蚀,将二者紧密排列,在高温下融化为一个整体,经过一次或多次拉制为长而细的玻璃棒,将拉细的玻璃棒切割为小片,得到微通道板毛坯;(2)对毛胚进行腐蚀除去芯料,得到带通孔的微通道板;(3)对微通道板进行疏水处理。
微通道阵列板的原料是光纤玻璃。玻璃中掺有锗、硼,钡,镧,镓,锑等元素,具有易热加工的特点。取两种不同的光纤玻璃,其中一种是不能在稀硝酸中被腐蚀的普通光纤玻璃,一种是可以被稀硝酸腐蚀的玻璃(称之为芯料)。两种玻璃都是正六边形或正方形的边棒状或者纤维状,然后紧密的六方或者四方排列在一起。之后,在高温下,玻璃棒融化在一起成为一个整体。然后这个整体继续在高温下,经过一次或多次拉制,成为极长但是极细的玻璃棒(即细丝),对边距离在4到6mm。在细丝排布的过程中有一次拉丝、两次拉丝甚至多次拉丝的办法,通常情况下采用一次拉丝。一次拉丝的办法只有一次丝排列,其中大部分的玻璃光纤丝/棒是不能被酸腐蚀的掺杂玻璃,而少部分的丝能够完全或者其内芯能够在酸性环境下被腐蚀掉。这些丝可以是正六边形或者正方形的柱体,分别以六方或者四方排列成一个拼合玻璃棒,其中六方排列更常见。拼合玻璃棒在两端有外力牵引的情况下,在800到3000摄氏度的条件下彼此融合成一个整体后在外力牵引下成为玻璃细棒或者细丝。二次拉丝则是重复以上拉丝步骤,将拉成的玻璃细棒或者细丝再次排列后拉丝。将拉制好的合适粗细的玻璃细棒切割打磨后得到玻璃片便可以成为微通道板的原料。将拉细的玻璃棒切割成1mm左右的小片,此后多次抛光,得到微通道板毛坯。
得到的毛坯要通过腐蚀才能得到通孔。腐蚀可采取两种种办法,硝酸腐蚀和酸碱交替腐蚀。若采用硝酸腐蚀,硝酸的浓度不超过1mol/L,其中0.3~0.5mol/L为宜;过程第一步,需将玻璃板放在稀硝酸中密封,在超声清洗仪中超声震荡40min以上,一般采用a.80kHz、b.45kHz、c.80kHz和45kHz 10分钟交替,三种方法其一;其中以c方案效果最佳。腐蚀时间一般在20~200hr,对于大多数芯料,100hr可以得到腐蚀完全的通孔。酸碱交替的腐蚀办法中,将毛坯在上述的硝酸溶液中浸泡1个小时后再在0.5mol/L烧碱浸泡一小时,反复交替5次以内可以得到通孔,此过程中采用超声震荡有助于腐蚀。其中使用的硝酸是金属氧化半导体纯净级别(MOS级),烧碱是分析纯级别,采用MilliQ超纯水稀释,腐蚀液中可以掺入少量氟离子。
微通道阵列板的制备过程如图1所示。其中图A为两种不同的六边形光纤玻璃拼接成一个六边形的棒状物,其中无色玻璃为普通玻璃,不能在稀硝酸存在下被腐蚀,而黑色的玻璃能够在稀硝酸存在下被腐蚀;B.拼接而成的六边形在高温下熔成一个整体;C.熔在一起的玻璃棒在高温下被拉长,成为很长很细的玻璃棒,但仍然保持六边形的结构;D.细长的玻璃棒被切割成1~2mm的薄片,随后经过多次打磨,得到光滑的表面:E.经过硝酸腐蚀之后,玻璃薄片中的芯料被腐蚀掉,留下均匀的孔洞。图中孔数不代表真实情况。一般情况下,孔洞的出口需要光滑平整,这是形成大小均匀的液滴的关键。
一般情况下玻璃表面的具有一些硅氧键和硅羟基,这些基团是亲水的。由于这些亲水基团的存在,水以及水溶液会在玻璃的表面铺展开来,从而与玻璃的表面具有一定的接触面积。而为了使从微通道出来的水具有球形的表面从而顺利的脱离,同时使得每次脱落的液滴大小一致,就必须排除水或者水溶液与玻璃表面浸润的影响,这就需要对微通道板进行疏水处理。同时除了不能浸润之外,由于本发明多用于生物应用,要求表面不会吸附、粘附如核酸和蛋白等物质,因此优选使用氟基的疏水试剂,优选氟代烷烃,更优选氟代硅烷对玻璃做表面修饰。氟代烷烃不亲水不亲油,能够保证较好的疏水性,同时对生物大分子的亲和性很差,可以极大的降低生物样品的吸附,并且容易清洁:在简单的清洗之后便可以反复使用,基本没有二次污染。氟基硅烷的另外一个优点是用量少,用很少的量就可以满足疏水性能的要求。微通道板的疏水表面是液滴有规律悬吊断裂的关键之一。为了让一般亲水的玻璃表面具有可观的疏水效果,一般采用化学气相沉积法对玻璃表面进行修饰。修饰的步骤大致包括浓硫酸双氧水清洗,超纯水清洗,干燥,氧自由基表面活化,化学气相熏蒸,老化和超纯水后清洗等步骤。除了气相熏蒸之外,还可以通过浸泡的方法,其步骤大致包括清洗,氧自由基活化,浸泡,老化,后清洗等。
具体的疏水处理步骤如下:
1.清洗
清洗的目的在于严格除去微通道板上的有机残留物和无机盐残留物,为均匀的化学沉积提供保障。
a)超声酸洗
配制25%的浓硫酸的30%双氧水溶液。将约15mL30%双氧水倒入50mL离心管后用滴管逐滴加入浓硫酸,在滴加的同时不停的轻轻的震荡离心管,让浓硫酸迅速与双氧水混合,同时让产生的热量扩散开来。加到离心管显示的20mL处时,停止滴加,在震荡过程过要防止液体飞溅,建议在通风橱中进行。
配制好上述洗液后逐个用镊子将微通道微通道板轻轻放入离心管中,每次不宜超过10片,以防止在下一步的超声过程中微阵列板相互碰撞过于激烈造成表面刮痕。后将离心管的盖子旋紧后,放在超声清洗仪中,采用自动模式,即在80kHz和45kHz中交替,周期为10s。清洗10min。也可以将上述配置好的浓硫酸双氧水溶液分装在1.5mL离心管中,其中加入1mL左右浓酸洗液和一个微通道板后按下盖子关紧即可。这样分装的效果可以从根本上避免微通道板之间的碰撞。
b)水洗干燥
要用超纯水洗去浓酸洗液。在超声过的离心管中加入超纯水,然后倒掉。在倒水的时候要防止玻璃薄片随水流倒出。这样用超纯水反复倾析5次后,将玻璃薄片转移至小玻璃瓶中,为接下来的烘干做准备。将装有玻璃薄片的玻璃小瓶放入真空干燥箱中。在抽真空的条件下加热烘干,一般设置温度70℃,至少半个小时。
2.氧自由基活化和气相熏蒸
将PVC蓝色胶膜(简称蓝膜)剪出一小块,将微通道板逐个侧放在蓝膜上,保证微通道板之间不会接触。将粘有微通道微通道通道板的蓝膜放在一个干净的载玻片上,后将载玻片放入氧自由基清洗仪,在抽真空后开动5min,80%以上功率。
在等待5min的过程中,取一只小离心管,加入不少于200μl氟代硅烷,然后将此小离心管放在一个小型真空干燥器中。待活化结束后将载玻片连同上面的蓝膜和微通道板放入上述真空干燥器中,打开小离心管盖子后迅速关上干燥器盖子。对真空干燥器超真空3min后关闭真空阀。在常温下熏蒸50min到1hr。
其中使用的氟代硅烷可以是三甲基氯硅烷,三全氟甲基氯硅烷,三甲氧基丙基硅烷,三甲氧基1H,1H,2H,2H-全氟辛基硅烷,丙基三氯硅烷,1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷,(2,4-二氟苯基乙炔基)三甲基硅烷,(3,5-二氟苯基乙炔基)三甲基硅烷,(3,5-双(三氟甲基)苯乙炔基)三甲基硅烷,三乙基(三氟甲基)硅烷,三乙氧基[4-(三氟甲基)苯基]硅烷,氯二甲基(五氟苯基)硅烷,1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷,1H,1H,2H,2H-全氟辛基二甲基一氯硅烷,辛基三氯硅烷或者辛基二甲基一氯硅烷,1H,1H,2H,2H-全氟十二烷基三氯硅烷,1H,1H,2H,2H-全氟癸基三乙氧基硅烷。
3.老化
将熏蒸完毕的微通道板拿出来,从蓝膜上逐个剥离重新放在小玻璃瓶中。在加热装置上以温度120℃加热5min。老化之后放入超纯水中超声清洗三分钟后干燥即可供使用。
4.质量检测
粗略检查:用移液器在老化好的微通道板上面滴加0.5μLMilliQ后观察水滴的形貌,接触角大于90度即可。
拍照测量:将上述形成的液滴用摄像机拍下来,在图片中测量其接触角。在拍摄过程中,要保证水滴的下表面在镜头中是俯视看到的,视线与液滴所在平面的夹角在0°以上5°以下。一般情况下接触角大于100度说明修饰成功。图2为微孔板质量检测图,左图接触角大于100度,修饰成功,右图不成功。
制备完成的微通道板如图3所示,图3为微通道板微孔板显微图片,左图为放大10倍,右图为放大40倍。
本发明的另一方面在于提供一种利用微通道阵列板产生液滴的装置,包括配合的微通道阵列板和收集装置,以及加速度产生装置,微通道阵列板中包含第一液体,收集装置中包含第二液体。
利用惯性力产生液滴的原理如下:在离心作用下,第一液体经过具有疏水表面的微通道,在微通道的末端断裂成一个个的小液滴,在空气中飞行很短距离后进入位于收集装置内的第二液体,形成乳化液滴。在微通道阵列板上方有用于乳液化的水相第一液体的液滴,而下方是空气,再下方则是含有表面活性剂的油相第二液体。在高速离心作用下,第一液体在微通道的下端不断的生成大小均一的液滴,这些液滴在空气中飞行很短距离(通常不超过1cm),期间由于表面张力形成类似球体的水珠,进而进入第二液体。由于第二液体中表面活性剂的存在,液滴可以在乳化液中长期稳定存在。表面活性剂溶于油而几乎不溶于水,但是有具有亲水的基团,使得表面活性剂在水油两相的界面形成一个单分子自组装膜,这个膜有效的维持了液滴的稳定性同时将水相中与外界分隔开来。让液滴保持球形形貌的原因还在于油给液滴提供了其重力80%左右的浮力支持。
液滴的大小可以通过调节微通道长度、半径,离心转速/离心加速度,第一液体粘度,第一液体表面张力来调节。生成液滴的速度一方面由离心转速的影响,一方面,当离心转速不变时,可以通过改变微通道板上通道的数目来改变生成液滴的速度。利用惯性力产生液滴的数学模型如下:
参数符号
微通道阵列板上有几何形状相同的微通道N个,与液体接触的面积为A
微通道
横截面是半径为R(m)的圆,
其面积a,
纵向长为l(m),
对流经的液体流阻为Z(Pa·s/m^3),
单位时间第一液体流过体积Q(m^3/s),
时间为t,开始离心时t=0;
流经的液体
表面张力γ(N*m),
密度ρ(kg/m^3),
第一液体粘度η,
在微通道阵列板的上方液体高度为h(m),当t=0时,h=h0,
总体积为U(m^3),
在液滴化装置出口的压力p(Pa);
液滴
半径为r,
直径为d,
体积V,
质量m;
其他:
自然对数的底数e
数学方程
液滴质量计算公式:假设重力与表面张力相等并且液滴拉断处与微通道的半径一致为R,有2π·γ·R=G·m
液滴质量-体积-半径计算公式,
在外加加速度为G时,液滴体积
半径计算公式
据此,我们调整离心转速或者改变微通道的半径R以改变生成的液滴的大小。
假设液体在众多微通道中流动遵循公式
流量
其中压强p=ρGh
流阻
进而单个微通道的流量可以表示为
据此,液面高度公式可以通过微积分得到,为
对于孔径为6μm的微孔板,通过不同大小的离心力作用,可以得到不同的大小的微乳液滴,
转速/rcf |
实验液滴直径/μm |
预测液滴直径/μm |
实际:预测 |
700 |
200 |
94 |
2.12 |
1000 |
175 |
84 |
2.09 |
3000 |
103 |
58 |
1.77 |
5000 |
75 |
49 |
1.53 |
7000 |
67 |
44 |
1.53 |
11000 |
56 |
38 |
1.49 |
13000 |
53 |
36 |
1.49 |
15000 |
49 |
34 |
1.44 |
预测值与实际值的差异可能是由于液体流动使得模型偏离静态假设导致。
当h接近于0时,认为液滴基本走完,我们取h=0.01×h0,此时99%的液体流过了微通道阵列板。实际操作中发现液滴的残余量极少,少于千分之一分析天平的检测限,即0.001g。
优选的,第一液体为水相液体,为用于生物反应的样品(可以是用于数字链式酶反应的混合液,细胞悬浮液,细菌悬浮液,用于基因组扩增的DNA溶液,用于RNA逆转录的混合液,用于蛋白质结晶的混合液,用于无机盐结晶的混合液,病原物溶液或悬浊液等),第二液体为含有表面活性剂的油相液体。
第二液体中的油相可以是矿物油(如低沸矿物油,轻矿物油),硅油(如低聚二甲基硅氧烷,环戊硅氧烷,脂肪基硅氧烷,苯基硅氧烷,氟代硅氧烷),脂肪酸甘油酯(双月桂酸甘油酯,油酸甘油酯,亚油酸甘油酯,硬脂酸甘油酯,亚麻酸甘油酯,异硬脂酸甘油酯,山梨酸甘油酯),碳酸双酯(如碳酸双4-甲基-辛酯,碳酸双十六酯,碳酸双山梨醇酯,碳酸双2-乙基己酯,碳酸双2-乙基辛酯,碳酸双2-乙基癸酯,碳酸双4-甲基-壬酯,碳酸双3-甲基-癸酯,碳酸双正辛酯),月桂酸异丙酯,月桂酸己酯,月桂酸庚酯,月桂酸辛酯,马来酸己酯,马来酸辛酯,棕榈酸异丙酯,棕榈酸丁酯,棕榈酸己酯,棕榈酸叔丁酯,山梨酸月桂醇酯,食用菜籽油,葵花籽油,蓖麻油,花生油,茶籽油中一种或几种的混合物。
第二液体中的表面活性剂可以是十六烷基磺酸钠,20,21,40,60,61,65,80,20,40,60,80,83,85,120,we09,em90,em120,em180,Dow5200,DowES-5300,Dowemulsifier 10,SML,WO 7,GI 34,GI PDI,Alkanol S 2 Pellets其中一种或者多种混合。.
优选的,第二液体中的油相为碳氢基油,其具有比水略小的密度,可以让水相液滴进入后沉到油相底面而不会留在油表面与接下来产生的液滴发生碰撞。油的较低粘度保障了液滴在进入油时不会被撞击力打碎。特定配方的油可以在10摄氏度左右发生固化,进而将乳液冻住,这样液滴可以长期保存在10摄氏度的环境中而保持良好的形态和分隔特性。
收集装置可以为离心管,八联排离心管或96孔板。一般采用的离心管为Eppendorf公司的1.5mL离心管或Qiagen公司的200μl PCR管,后者的使用需要通过转换支架与Eppendorf 1.5ml离心管配合。使用1.5ml离心管时,须保证液滴飞行距离不超过8mm,一般控制在5mm内为宜,需加入第二液体700到1200μl,优选1000μl。使用200μl PCR管时,一般加入150到250μl第二液体,优选240μl。
微通道阵列板也可以通过夹具与收集装置配合,放置于加速度产生装置上。夹具使微通道阵列板在离心时得到固定,同时起到密封的作用,确保微通道板中的液体不会从微通道板的微通道朝向收集装置的一端以外的位置流出,即确保第一液体只从微通道中流出。
与离心管配合的夹具包括螺栓和连接部件。微通道阵列板被夹紧在螺栓和连接部件之间,连接部件下端连接离心管。
其中螺栓包括公螺纹,连接部件包括母螺纹,公螺纹为螺栓的外螺纹,母螺纹为连接部件的内螺纹,公螺纹和母螺纹相互配合。螺栓内部为一通孔,从该通孔处向微通道阵列板中加入第一液体。连接部件包括自上端面形成的盲孔,盲孔在连接部件中形成内端面,使用时,微通道阵列板位于内端面之上。盲孔内壁有内螺纹即母螺纹,盲孔直径与微通道阵列板的外径相适应。内端面到下端面形成通孔,微通道阵列板产生的液滴由该通孔进入收集装置。该通孔为从上到下直径逐渐增大的圆锥孔,该圆锥孔最小直径小于内端面的内径。连接部件下端面外径与收集装置内径相适应。使用时,微通道板夹紧于螺栓的下端面与连接部件的内端面之间。
连接部件的高度为8~15mm,优选11mm。上端面外径10~13mm,优选12mm;内端面内径7~10mm,优选8.8mm。连接部件还具有一连接部件头,其外侧面做成轧花或者表面粗糙磨砂效果,以增加表面摩擦。盲孔深9mm,至少8mm,内螺纹规格可以是英制1/4-28,国标M4或者国标M5。从内端面继续往下打圆锥形通孔,直径从上到下直径逐渐放大,通孔直径最小处3mm,圆锥顶角至少50度,优选60度。
螺栓高度为12~18mm,优选14.5mm。螺栓头外径8~13mm,以10mm为宜。螺栓头高度约6.5mm螺栓头外侧面做成轧花或者表面粗糙磨砂效果,以增加表面摩擦。螺栓的杆部有与母螺纹配合的外螺纹即公螺纹,规格可以是英制1/4-28,国标M4或者国标M5。螺栓内部为一通孔,从该通孔处向微通道阵列板中加入第一液体。该通孔由自上而下依次为直径为7mm的孔,锥形孔,直径为3mm的孔,直径7mm的孔高度为3mm,锥形孔连接直径为7mm和直径为3mm的孔。加工时可先从下底面向上,打一个直径为3mm的通孔;再从上表面向下,打一个直径为7mm深度为3mm的孔,再从该孔往下打一个直径向下逐渐变小直到与3mm的通孔相切的锥面,锥面(单边)角度30度到50度,45度为宜。
螺栓和连接部件的材质可以为PEEK。
微通道板和连接部件的内端面之间还有一密封垫片,为外径5mm左右,内径3mm左右的圆环。厚度0.2到2mm,以1mm为宜。可由不掺玻璃纤维的PEEK(聚醚醚酮)塑料通过机械精加工得到,也可以用软板切割得到。其中聚四氟乙烯(Teflon)切割而成的垫片效果最好。垫片的材料还可以为橡胶。
装配微通道板和夹具时,先用镊子将微通道板平放在连接部件的内端面,再平放入一个垫片,后将螺栓拧紧即可。将固定好的微通道板与夹具的配合物称为夹持微通道板。如果拧紧后又拧松并将垫片拿出,要换一个新的垫片以免密封性不佳。
收集装置可以为热塑性材料,优选ABS、PP、POM、PC、PS、PVC、PA、PMMA等热塑性塑料或者TPV等热塑性橡胶,通过加热使微通道板与收集装置密封。
加速度产生装置为离心机,采用的离心机配有吊篮式离心管架,可提供至少160000米每平方秒的离心加速度。
本发明的第三方面在于提供一种利用微通道阵列板并行产生液滴的装置产生液滴的方法,其特征在于,包含如下步骤:使微通道微通道板与收集装置配合,放置于加速度产生装置上,在液滴化装置中加入第一液体、收集装置中加入第二液体,设置加速度产生装置的转速,产生液滴。
本发明的有益效果是,
1)产生液滴均匀。微通道阵列板的生产可以做到各个孔道的半径差异很小,其相对标准差可以控制在3%以内,且生产重复性高,前后批次小,从而能够在多通道多批次生成均匀的微乳液滴。
2)可调性。微通道微通道板的微通道微通道可以任意设计不同直径。通过离心力可微调液滴产生的大小。相比与微流芯片产生液滴时不明确的调整规律(通过调整两相气压或流速调整液滴大小),微通道微通道板上使用离心法产生液滴时,对液滴大小的调整具有明确简单的数学规律。
3)稳定性。一旦确定所用微通道板的孔径和离心力,液滴大小将不会再变化。可接受有微量固体杂质的样品如未过滤的生物样本处理液,如果出现堵塞情况,可以在简单清洗后继续使用。而微流控产生液滴的方法中,管路流阻,液体流阻,微扰等都会影响液滴直径,且只有一个液滴发生喷口,一旦堵塞则实验失败。毛细管由于其制备工艺造成端口容易堵塞。
4)可批量生产,结构简单,造价低。微通道板可由光纤拉制,批量磨刨,腐蚀,修饰;通道量的增加并不增加加工难度,可得到大量一致性的微通道阵列板,可一次性使用;PEEK夹具则可由注塑生产,成本低。相比之下,微流芯片需要MEMS工艺生产,键合,封装,工艺复杂成本高。而目前的毛细管要形成如此细小的端口,只能用硼玻璃在高温下拉出一个细端,再剪断,此工艺重现性差,产量低,且随通道数量增加加工难度大大增加。同时,微通道板的机械性能更强,便于包装;而毛细管微通道容易弯折破碎,操作复杂。
5)可控温。使用低温离心机则可(例如eppendorf 5430R);传统微流芯片方法若想要降温则需要把样品仓,管路,芯片和部分驱动装置都实现降温,操作复杂。
6)节约样品。微通道道阵列版的孔道体积极小,可能造成的样品残留极少,而微流芯片的进样管路中不可避免的存在无法消耗的样品,毛细管玻璃只在端口收细,长度是微通道道阵列版的几倍,造成了样品浪费。
7)高通量。微通道阵列板能够允许超过100甚至1000孔的设计,可以大大的提高液滴生成速度和通量,同时允许更加微缩的设计;还可以利用电子显微镜简单快捷大量的进行质量检测。
8)相比于微流控的办法和单孔针离心的办法,该发明可以将生物样品完全液滴化,不存在死体积,可以更大程度的利用生物样品,得到更多信息,反应更加全面真实的情况。
附图说明
以下结合附图及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
图1为微通道板的生产流程图。
图2为微通道板质量检测图,左图接触角大于100度,修饰成功,右图不成功。
图3为微通道板显微图片,左图为放大10倍,右图为放大40倍。
图4为螺栓、连接部件、垫片、微通道板与1.5ml离心管的装配图。
图5为螺栓、连接部件、垫片、微通道板与200ul离心管的装配图。
图6为利用微孔板产生A样品的液滴后进行30轮PCR之后的明场照片和荧光照片。
图7为利用微孔板产生B样品的液滴后进行30轮PCR之后的明场照片和荧光照片。
具体实施方式
实施例1微通道板与收集装置的配合
微通道板与1.5mL离心管配合
将1ml第二液体加入离心管中,由于第二液体极易产生气泡,务必要缓慢加入,形成气泡后,可以用1ml移液器换上新枪头后,快速对准气泡打出气体,气泡即被吹破。
装配图如图4所示。1螺栓,1.1螺栓头,1.2螺栓下端面,1.3公螺纹,1.4通孔,2垫片,3微通道阵列板,4连接部件,4.1连接部件头,4.2连接部件下端面,4.3母螺纹,4.4内端面,5 1.5mL离心管(此处将盖子省略)。两个螺纹旋紧后固定微通道板,轻放在装有第二液体的离心管中即可。
微通道板与200μl离心管配合
装配图如图5所示。螺栓、垫片、微通道阵列板和连接部件的位置关系同图4,6为200μl离心管,7为转换支架,8为1.5mL离心管。使用时,先将微通道板与垫圈一次平放入连接部件中,用螺栓拧紧得到一个微通道管,后在200μl离心管中加入200μl第二液体,剪去200μl离心管的盖子,用镊子夹住200μl离心管的上边后放入放有转换支架的1.5ml离心管中,最后将微通道管放在1.5ml离心管中,让后者的管沿托住微通道管即可。转换支架是3D打印得到的。
装配好后,产生液滴时用移液器从螺栓的通孔中向微通道板中加入20~100μl水相样品液。高速离心机中离心数分钟即可。其中离心机配备吊篮式转子,保证离心管的方向与离心力重力合力方向一致,才能让液滴落到离心管底部而不是黏附在管壁上。
实施例2
将本发明的装置产生的液滴用于基于TaqMan探针的数字链式酶反应(dPCR)检测微量DNA样品
该实施例中第二液体配方是月桂酸异丙酯/Abilem 180v/v 83/17溶液,收集装置是1.5ml离心管。
第一液体的配制方法
先配制如下混合液(1),其中引物是根据lambda phage DNA中一段长223bp的序列设计的引物,用于PCR扩增,同时TaqMan探针也是基于此段序列设计的。
得到混合液(1)后,取混合液99μl加入1μlDNA模板。此DNA模板是经过琼脂糖凝胶纯化后的产物,其浓度由Nanodrop确定。分别将1μl 1.00*10^6拷贝和1μl 1.00*10^5加入99μl混合液(1)中得到反应样液A和B。其中
|
A |
B |
DNA浓度 |
1.00*10^4/μl |
1.00*10^3/μl |
分别取上述A,B各20μl于螺栓的通孔处加入两个夹持微通道板上,离心13000rcf,4min后得到均匀微乳液滴。经过30轮PCR之后,将上述液滴平摊在疏水培养皿中在荧光显微镜下观察,分别如图6和图7所示。
A样品:同一视野下,图6左图为明场照片,右图是荧光照片(其中液滴大小直径平均50微米,体积CV18%),理论上每个液滴含有0.66个DNA分子,将有48.1%的液滴有荧光。实际测量值为49.0+/-0.5%。
B样品:同一视野下,图7左图为明场照片,右图是荧光照片(其中液滴大小直径平均65微米,体积CV23%),理论上每个液滴含有0.14个DNA分子,将有13%的液滴有荧光。实际测量值为15+/-0.9%。