KR20060101470A - 좌위 복제 수에서의 변동을 검출하기 위한 방법 및 이에유용한 키트 - Google Patents

좌위 복제 수에서의 변동을 검출하기 위한 방법 및 이에유용한 키트 Download PDF

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Abstract

좌위 복제 수의 변동을 확인하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 상기 좌위에서 적어도 하나의 메틸화 상태를 결정함으로써 수행되는바, 상기 최소한 하나의 유전자의 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태는 좌위 복제 수에서의 변동을 나타낸다.
좌위 복제 수 변동, 메틸화, 염색체 이상, 출산 전 진단

Description

좌위 복제 수에서의 변동을 검출하기 위한 방법 및 이에 유용한 키트{METHODS AND KITS USEFUL FOR DETECTING AN ALTERATION IN A LOCUS COPY NUMBER}
본 발명은, 삼염색체 (trisomies)와 같은 염색체 이상을 유도하는 좌위 복제 수 이상(locus copy number abnormalities) (예를 들어, 증폭 상태)를 검출하는 데 유용한 방법 및 키트에 관한 것이다.
유전적 성분이 환경 요인보다 우세한 질병 상태를 유전병이라고 불리며, 통상 다음 세 가지 경우에 속하게 된다: (i) 하나 이상의 염색체의 부존재, 과도 존재, 또는 배열 이상을 특징으로 하는 질병; (ii) 단일 돌연변이성 유전자에 의해 주로 야기되며, 상염색체 우성, 상염색체 열성 또는 X 염색체 유전형 (X-linked)으로 다시 분류되는 멘델성 또는 단순 유전 질환; 및 (iii) 다중 유전자 및 환경적 요인의 상호 작용에 의해 야기되는 다중요인성 질병.
배수성은 유산아 중 50% 넘는 비율에서 발견되는 가장 흔한 상염색체 이상 증상이다 [McConnell HD, Carr DH. 인간 자연 유산의 세포유전적 연구의 최근 성과 (Recent advances in the cytogenetic study of human spontaneous abortions). Obstet Gynecol. 1975 May;45(5):547-52]. 삼염색체는 태아 또는 배아 상태에서 치명적인 반면, 상염색체성 삼염색체는 태아가 생존하여 출산이 될 수 있는 삼염색체이다.
다운 증후군은 삼염색체 21로 또한 알려지고 있으며, 출산 전에 진단될 수 있는 가장 흔한 유전질환 중의 하나이다. 이것은 이 질환을 안고 태어나는 아이들의 정신적 지진 및 많은 육체적 심리적 이상의 원인이다. 수많은 아이가 선천적인 심장이상 및 위장관 이상을 가지고 태어나지만, 이것은 수술로 고쳐질 수 있다. 육체적 특징은 평평한 뒤통수와 사시, 낮은 콧등, 작은 손과 발, 출생시 목 뒤의 두꺼운 피부층, 적은 근육 및 손바닥의 유인원성 손금을 포함한다 [Down syndrome, (1994) National Down Syndrome Congress. Atlanta, GA: NDSC].
미국에서의 다운 증후군의 비율은 10,000명 신생아 중 9.2명이다. 비록 다운 증후군 발생 이유가 여전히 잘 정리되어 있지 않지만, 높아지는 임신부 나이가 하나의 요인으로 작용한다는 것은 정설로 굳어지고 있다.
따라서, 21 삼염색체를 가지는 배아를 임신할 위험은 임신부가 35세가 넘어가면 기하급수적으로 증가한다. 미국에서 임신부들의 출산 나이가 증가함에 따라, 자궁에서 다운 증후군으로 진단된 아이들을 가질 위험에 있는 임신부의 비율이 전 더욱 훨씬 높아지고 있다. 그러므로 35세 이상의 모든 임신부들은 잠재적으로 다운 증후군의 높은 위험에 있다고 고려되며 검사를 받아야 할 것이다.
다운 증후군에 대하여 현재 출산 전 검사방법은 다양하고, 혈청 검사, 초음파, 침습 검사, 유전적 상담 및 염색체 연구를 포함한다. 다운 증후군의 임신 진단, 특히 첫 3달 내의 진단을 향상시키기 위해 많은 연구가 행해졌지만, 현재까지 다운 증후군을 100% 정확히 진단하는 것으로 판명난 것은 없다.
하기에, 현재의 다운 증후군의 임신 중 스크리닝 및 진단 방법을 요약한다.
비침습 검사
태아의 초음파 영상화 - 이 검사는 임신 12 내지 18주 사이에 행해진다. 이것은 목덜미 투명대(nucaltranslucency)(예를 들어, 목덜미 두께 증가 또는 비대), 긴 뼈 및 첫째와 둘째 발가락 사이의 간격이 짧아진 것을 찾는 것이다. 태아 삼염색체성 조건을 검출하기 위한 초음파 검사의 민감도는 염색체 이상, 초음파 검사 시의 임신기간, 조회에 대한 이유, 양성 초음파성 발견물에 대한 기준, 및 초음파 검사의 질에 따라 가변적이라는 것이 알려져 있다. 대략적으로, 하나 또는 그 이상의 초음파 검사 발견물은 삼염색체 21(다운 증후군)을 가진 태아의 50% 내지 70%에서 확인될 수 있다. 따라서, 초음파 검사 표식자의 존재 또는 부존재는 태아 다운 증후군의 위험을 수정할 수 있고 유전적 초음파 검사의 기초가 된다. 모성 생화학적 표식자 및 초음파 검사 표식자는 크게 보아 독립적이기 때문에, 이를 조합하여 위험 추정하게 되면 단독으로 했을 때보다 더 높은 검출률을 나타내게 된다.
임신부 혈청 검사 - 임신부 혈청 검사는 혈청 α-페토프로테인(fetoprotein) (AFP, 이것의 낮은 혈청농도는 다운 증후군을 나타낸다); 인간융모성 생식선 자극호르몬(human chorionic gonadotropin) (hCG, 이것의 높은 혈청 농도는 다운 증후군을 나타낸다); 및 비접합 에스트리올(unconjugated estriol) (uE3, 이것의 낮은 혈청 농도는 다운 증후군을 나타낸다)에서 보이는 삼중(triple) 표식자 검사를 포함하는 다중 표식자 스크리닝 검사로 알려져 있다. 최근 네 번째 표식자로서 인히빈 에이(inhibin A)가 추가되었고, 이의 높은 혈청 농도는 다운 증후군으로 진단되고 있다 [Wald, Watt, 및 Hackshaw, (1999) The New England Journal of Medicine, vol. 341, no. 7. 461-4693]. 상기 삼중 표식자 검사에 인히빈 에이를 더하여 사중(Quadruple) 표식자 검사라고 한다. 임신부 나이 매개 변수와 더불어 이러한 표식자들을 사용하여 약 70%의 검출률 및 약 5%의 오차율로 다운 증후군을 진단할 수 있다. AFP 검사 및 초음파를 첫 번 3개월에 사용하는 반면, 이러한 표식자들을 사용하여 두 번째 3개월 기간에 다운 증후군을 진단할 수 있다.
상기 사중 검사는 현재 목덜미 투명대 초음파 검사 및 혈장 단백질-A (PAPP-A)와 연계된 임신 검사로써 이용되고 있다. 이러한 방법은 검출률을 5%의 오차율에서 85%로 증가시킬 수 있고, 이에 따라 현재 이용가능한 다운 증후군에 대한 가장 신뢰성 있는 비침습적 검출 검사를 제공한다 [Wald, Kennard, Hackshaw and McGuire, (1998) Health Technology Assessment, vol 2, no. 1.1-124.]. 그러나 현재 이용가능한 혈청 표식자들은, 불명확하고 가끔 해석하기 어려운 통계적 결과를 제공한다는 것이 인지되어야 할 것이다.
침습 적 검사
양수 검사 - 양수 검사는 양수를 흡인하여 두 번째 3개월 기간에서 태아 이상을 검사하는 침습 적 과정이다. 이 검사는 다운 증후군과 같은 유전적 이상을 가진 아이를 가질 위험이 큰, 나이가 많은 임신부에게 권장된다. 양수 검사에 대한 참조 사항은 AFP가 비정상적으로 낮거나 높은 농도를 포함한다. 양수 검사는 통상 두 번째 3개월 기간에 수행되지만, 임신 11주차와 같이 빠른 기간에 수행될 수도 있다. 임신 약 16주차에 양수 샘플을 취한다. 20% 양막 세포만이 검사에 적합하기 때문에, 중기 분석에 충분한 분열 세포를 얻기 위해 샘플을 배양할 필요가 있다. 그러므로 1-3주 후에 결과가 이용 가능해지고, 이는 두 번째-세 번째 3개월 말에서 임신부의 염려 및 걱정을 증가시키는 결과를 낳는다. 핵형 분석(karyotyping)은 다운 증후군 외의 다른 염색체 질환을 검출한다. 그러나 200여 건의 임신 사례 중 약 1건이 양수 검사로 인하여 잘못된 판단이 초래된다.
융모 샘플링( Chorionic villi sampling) - 융모 샘플링은 태반을 형성하고 태아의 의해 형성되어 태아 세포를 포함하고 있는 융모막의 샘플을 취하는 것을 포함한다. 이러한 검사는 첫 번째 3 달 기간의 끝에 (즉, 10-12주)에 수행될 수 있다. 이러한 검사는 경부 적(transcervically) 또는 경복 적(transabdominally)으로 수행된다. 두 방법 다 동등하게 안전하고 효과적이다. 이러한 과정은 빠르고 (24시간 내에 결과를 얻을 수 있다) 그리고 거의 아프지 않다. 다음, 상기 샘플 (즉, 미배양된 샘플)을 현미경하에서 분석하여 특히 염색체 이상을 관찰한다. CVS의 장점은 첫 번째 3달 기간 내에 일찍이 시험하고 그리고 임신부 세포 오염의 위험이 감소한다는 것이다. 단점은 실패의 위험이 크다는 것과 비용이 많이 든다는 것이다. 비록 AFP가 주목될 때, CVS를 수행하는 것이 너무 늦다고 하더라도, 임신부 혈청 표식자를 주목하는 것이 여전히 중요하다. 양성적인 결과는 60 내지 70%의 검출률로 다운 증후군과 같은 유전적 질병을 검출한다. CVS의 1%는 한정된 태반성 모자이크 현상(placental mosaicism)을 나타내며 여기서, 직접적인 또는 배양된 CVS로부터 얻어진 결과는 태아의 것과 다르다는 것이 알려져 있다. 배양된 CVS는 태반에 더 가까운 직접적인 CVS 보다 태아 쪽에 더 밀접하게 연관된 세포에서 성장된 것이다. 실패할 위험이 양수 검사보다 더 높다. 더욱이, CVS 동안 다리와 손의 절단의 위험이 상대적으로 높다.
미 배양된 양막 세포의 간기 (Interphase) 형광 동소 교잡법(fluorescence in situ hybridization: FISH) - 형광 동소 교잡법(FISH)을 사용하여 양수의 슬라이드를 분석할 수 있다. 이 시험은 미배양된 간기 세포 상에 실시되고 숫자로 표시되는 염색체 이상을 검출할 수 있다. 24시간 이내에 결과를 볼 수 있다. 염색체 21 임계 부위로부터 유도된 탐색자를 사용하여 다운 증후군을 진단한다. 다른 탐색자를 사용하여 배수성(ploidity)를 시험한다. 탐색자 위치는 두 개의 신호가 겹쳐짐에 따라, 특정 전위(translocation)의 경우에 오류-음성적 결과를 초래하게 될 수 있다.
정량적 중합효소 사슬 반응 ( PCR ) 진단 - 이 방식은 다운 증후군에서 비분리(nondisjunction)의 연구에 유용하다는 것이 증명되었다. 전형적으로 사용되는 것은 21 염색체 내에서의 다형성 (GT)n 반복체 및 Alu 서열이다 [Petersen (1991) Am J Hum Genet, 48: 65-71; Celi (1994); Messari (1996) Hum Genet, 97: 150-155]. 따라서, 예를 들어, 내경관 플러싱으로 임신 7주간과 9주간 사이에 얻어진 경부 세포 (TCC) 샘플에서 추출한 태아 DNA를 사용할 수 있다. 융모 상피세포 (trophoblast)를 이용하는 것이 Y 염색체-특이성 DNA 서열의 PCR 증폭 및 부계-특이성 마이크로새틀라이트 대립 유전자(microsatellite allele)의 검출에 유용하다. 이러한 방법은 태아의 성별을 정확히 예측할 수 있다. 삼염색체 21 태아는 형광 동소 교잡법 (FISH) 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제-1 (SOD-1)의 반-정량적 PCR 분석법을 사용하여 TCCs에서 진단되었다. 나중에, 정량적 형광 중합효소 사슬 반응 (PCR)이 X 및 Y 염색체에서 유도된 DNA 서열을 검출하는 것과 함께, 삼염색체 21 및 18을 동시에 진단할 수 있다는 것이 증명되었다. 양수, 태아 혈, 또는 조직으로부터 추출된 DNA 샘플을 정량 형광 PCR로 증폭하여 염색체 21 및 18 각각 상에 존재하는 두 개의 위치에 대하여 특이적인 다형성 적 소 연쇄 반복배열 (STR)을 검출하였다. 증폭 산물의 정량적 분석으로 삼염색체 21 및 18의 진단이 가능하고, 염색체 X 및 Y로부터 유도된 DNA 서열의 PCR 증폭을 사용하여 성별 분석이 가능하다. 염색체 21 삼염색체의 검출을 위해 두 세트의 STR 표식자를 사용함으로써, 정량적 형광성 다중 PCR이 선택된 염색체 이상에 대해 신속한 출산 전 진단에 유용하다는 것이 밝혀졌다 [Pertl Obstet Gynecol. (2001) Sep; 98 (3): 483-90].
다른 연구에서, 잉여 양수로부터 DNA를 추출하고, 염색체 21에 위치된 세 개의 소 연쇄 반복배열 표식자(small-tandem-repeat marker)를 사용하여 상기 DNA를 형광에 기초한 PCR 반응으로 증폭시켰다. 이 반응 산물을 DNA 서열분석기 상에서 분석하여 두 개 내지 세 개의 염색체 21 복제물이 존재한다는 것을 밝혔다. 이러한 방법을 사용하여 총 99.6% 정보가 세 가지 표식자로 얻어졌다 (Verma 1998). 형광 PCR 산물에 의한 염색체 정량 분석을 비 다형성 목표 유전자상에서 또한 실시하였다. 라힐(Rahil) 등 (2002)은 DSCRl(다운 증후군 결정 부위 1: Down Syndrome Critical Region 1), DCC(직장 육종암에서의 결핍: Deleted in Colorectal Carcinoma), 및 RB1(망막아 세포종 1: Retinoblastoma 1)의 부분에 대하여 공동 증폭 분석함으로써 각각 염색체 21, 18 및 13에서 이수성에 대하여 분자 적으로 검출할 수 있게 한다는 것을 확립하였다. 400 건의 양수에 대하여 맹목적 전망을 하고 정량 분석을 하였다. 모든 샘플에 대하여 후속 적인 핵형 분석을 하였고 분자 적 결과는 양성적 또는 음성적 오류 결과 없이 세포 유전적 데이터와 일치하였다. 따라서, PCR을 태아 DNA 상에 사용하는 염색체 정량 분석으로 이수성을 진단하는 것은 유효하고도 신뢰성 있는 방법이다. 그러나 모계의 DNA가 상기 염색체 정량 분석을 가릴 수 있기 때문에 이러한 방법들은 태아 DNA 순도에 매우 민감하다.
단일 세포에서의 이수성의 검출 - 이 방법은 이식 전 유전 진단에 사용된다. 용해된 단일 세포들로부터 DNA를 얻고 축퇴 된 올리고누클레오타이드-프라임 PCR (DOP-PCR)을 사용하여 상기 DNA를 증폭하였다. 닉 번역(nick translation) 방법을 사용하여 증폭 산물에 표지하고 정상적인 참조 게놈성 DNA와 혼성화 시켰다. 비교 게놈성 혼성화 (CGH) 형광 비율 프로필을 사용하여 0.75 및 1.25의 컷오프 임계치를 가지는 이수성을 결정하였다. 염색체 13, 18 또는 21에 대해 삼염색체성이라고 알려진 단일 세포를 이러한 기술로 분석하였다 [Voullaire et al (1999), Tabet (2001), Rigola et al (2001)].
핑거프린팅 시스템은 이식 전 유전 진단을 수행하는 다른 방법의 하나이다. 대립 형질성 크기 범위 및 최소 PCR 스터터(stutter) 인공물로 알려진, 높은 이형접합성(heterozygosity)를 가진 테트라누클레오타이드 마이크로새틀라이트 표식자를 염색체 X, 13, 18 및 21에 대하여 선택하고 다중 형광 (FL)-PCR 형태에 최적화시킨다 [Katz et al (2002) Hum Reprod. 17 (3): 752-9]. 그러나, 이러한 방법들은 모계 혈청으로부터 얻어진 태아 세포의 순수한 부분을 분리하는 것이 아직까지 이용 가능하지 않은 기술적 과정을 요하기 때문에 시험관 내 수정에 대하여는 제한적이다.
모계 순환 기내의 태아 세포 - 이러한 기술의 주된 장점은 비침습적이고 따라서 이러한 과정 자체는 임신 상태에 대하여 위험을 내포하지 않는다는 것이다. 이것은 태아 DNA가 5주에서 검출되기 때문에 CVS보다 잠재적으로 더 일찍 수행될 수 있다.
오로지 몇몇의 태아 세포들(융모 상피세포, 임파구 및 핵형 적혈구)이 모계 순환기에서 발견되며, 그러므로, 이러한 세포들을 선택하고 집성할 필요성이 있다. 집성 기술은 유동/자기 분류, 및 이중-밀도 원심분리를 포함한다. 천만 개의 모계 세포당 약 1 내지 2개의 태아 세포가 있고, 이러한 태아 세포의 50%는 핵형 분석에 적합하지 않다. 분명하게도, 임파구들은 수년간 모계 순환기에 잔존하고, 그러므로 결과가 이전의 임신에 영향을 받기 때문에 그러한 세포들이 이러한 기술에 사용되기에 적합하지 않다. 이러한 방법은 전통적인 핵형 분석법에 비해, 단일 염색체를 조사하게 된다.
a) FISH는 가능한 많은 세포에서 신호/세포의 수를 조사하여 3개 신호를 가지는 세포의 비율을 얻을 수 있다. 상기 탐침자의 혼성화 효율은 나타난 신호의 수에 극적으로 영향을 끼칠 수 있다 (이로써 결과를 왜곡시킬 수 있다).
b) 프라임 동소 라벨링 (PRINS)은 특이성이고 미표지 된 DNA 프라이머를 상보성 게놈 위치에 동소 적으로 (in situ) 어닐링 시키고 및 표지 된 누클레오타이드를 이용한 PCR로 후속 적으로 연장하는 것에 기초하고 있다.
다운 증후군을 진단하는 다른 방법들은 10주 차에 수집된 체강 유체물을 이용하는 데 이는 배양과 핵형 분석 및 자궁강 세척/경부 세포 샘플링을 요한다. 후자는 양수 검사 또는 CVS보다 덜 침습 적이다. 그러나 이러한 방법들은 임신부를 오염 또는 감염시키게 된다.
따라서, 일반적으로 염색체 이상 (즉, 삼염색체)의 출산 전 진단 및 더 상세하게는 다운 증후군의 출산 전 진단이 복잡하고, 뛰어난 기술적 숙련을 요하나, 완전히 효과적 이지는 않고, 유산을 초래할 수도 있다. 다운 증후군에 대하여 명확한 출산 전 검사방법이 없다는 사실로 인해, 건강한 태아의 임신을 하지 못할 위험성이 높다.
따라서, 염색체 이상을 초래하며, 상술한 한계를 가지지 않는 좌위(locus) 증폭을 검출하는 방법에 대한 필요성이 광범위하게 인지되고 있고 또한 이를 가진다면 매우 유리할 것으로 보인다.
본 발명의 일 관점에 따라서, 좌위 복제 수에서 변동을 확인하는 방법을 제공하는바, 상기 방법은 좌위에서 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하고, 이는, 적어도 하나의 유전자의 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태가 좌위 복제 수에서의 변동을 나타내는 것을 특성으로 한다.
후술하는 본 발명의 바람직한 구체예의 구체적인 특성에 따라서, 상기 좌위 복제 수에서의 변동은 이수성 및 배수성(polyploidy)으로 구성되는 군으로부터 선택된 염색체 이상의 결과이다.
본 발명의 다른 관점에 따라서, 피험자에게서 좌위 복제 수 변동을 확인하는 방법을 제공하는바, 상기 방법은: (a) 상기 피험자의 염색체 DNA를 수득하고; 및 (b) 상기 염색체 DNA의 좌위에서 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 적어도 하나의 유전자의 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태는 상기 좌위의 복제 수에서의 변동을 나타내며, 이로써 피험자에게서의 좌위 복제 수의 변동을 확인하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 관점에 따라서, 좌위 복제 수에서의 변동을 출산 전에 확인하는 방법이 제공되는바, 상기 방법은: (a) 좌위를 포함하는 태아 또는 배아성 염색체 DNA를 수득하고; 및 (b) 상기 좌위를 포함하는 태아 또는 배아 염색체 DNA에서의 적어도 하나의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 적어도 하나의 유전자의 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태는 상기 좌위의 복제 수에서의 변동을 나타내며, 이로써 좌위 복제 수의 변동을 확인하는 것을 특징으로 한다.
설명된 바람직한 구체예에서의 다른 구체적인 특징에 따라서, 상기 태아 또는 배아 염색체 DNA를 수득하는 것은: (i) 양수 검사; (ii) 태아 생검법(biopsy); (iii) 융모 샘플링; 및/또는 모계 생검법에 의해 수행된다.
설명된 바람직한 구체예에서의 다른 구체적인 특징에 따라서, 상기 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 것은: (i) 제한 효소 절단 메틸화 검출; (ii) 바이설페이트-기초된 메틸화 검출; (iii) 질량 분광분석; (iv) 서열 분석; 및/또는 (v) 마이크로어레이(microarray) 분석으로 수행된다.
본 발명의 다른 관점에 따라서, 다운 증후군을 출산 전에 진단하는 방법을 제공하는바, 상기 방법은: (a) 태아 또는 배아 염색체 21을 수득하고; 및 (b) 태아 또는 배아 염색체 21에서의 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 적어도 하나의 유전자는 선택되지만 다운 증후군에서 증폭되지 않는 반면 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태는 태아 또는 배아 염색체 21의 증폭을 나타내며, 이로써, 다운 증후군을 출산 전에 진단하는 것을 특징으로 한다.
설명된 바람직한 구체예의 또 다른 구체적 특성에 따라서, 상기 적어도 하나의 유전자는 APP 및 시스타티오닌-β-합성효소(synthase)로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 관점에 따라서, "생존 양립성(compatible with life)" 유전자를 확인하는 방법을 제공하는바, 상기 방법은: (a) 증폭된 염색체 서열 부위에서 복수 개의 유전자의 메틸화 상태를 결정하고; 및 (b) 상기 복 수개의 유전자 중에서, 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태를 나타내는 유전자를 확인하고, 이로써 생존 양립성 유전자를 확인하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 추가적인 관점에 따라서, 생존 양립성 유전자를 확인하는 방법이 제공되는바, 상기 방법은: (a) 증폭된 염색체 서열 부위에서 복수 개의 유전자의 발현 수준을 결정하고; 및 (b) 상기 복수 개의 유전자 중, 소정의 임계치 이하로 발현 수준을 나타내는 유전자를 확인하고, 이로써 생존 양립성 유전자를 확인하는 것을 포함한다.
설명된 바람직한 구체예에서의 다른 특징에 따라서, 상기 복수 개의 유전자의 발현 수준을 결정하는 것은 mRNA 수준에서 행하여 진다.
설명된 바람직한 구체예에서의 또 다른 특징에 따라서, 상기 복수 개의 유전자의 발현 수준을 결정하는 것은 단백질 수준에서 행하여 진다.
본 발명의 다른 관점에 따라서, 포장물, 및 상기 포장물에 포함되어 있는 좌위 복제 수에서의 변동을 검출하기 위한 시약을 포함하는 제조물을 제공하는바, 상기 시약은 좌위에서 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정할 수 있고, 상기 적어도 하나의 유전자의 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태는 좌위 복제 수에서 변동을 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 관점에 따라서, 좌위 복제 수에서의 변동 확인용 키트를 제공하는바, 상기 키트는 좌위에서, APP 및 시스타치오닌-β-합성효소로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 시약을 포함하고, 여기서, 상기 적어도 하나의 유전자의 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태는 좌위 복제 수에서의 변동을 나타내는 것을 특징으로 한다.
설명된 바람직한 구체예에서 다른 특징에 따라서, 좌위 복제 수에서의 변동은 이수성 및 다수성으로 구성되는 군으로부터 선택된 염색체 이상의 결과이다.
본 발명은 좌위 증폭을 확인하는 방법과 키트를 제공함으로써 현재 알려진 기술들의 단점을 명확히 드러낼 수 있다.
별다른 언급이 없으면, 여기서 사용된 모든 기술적 및 학문적 용어들은 본 발명이 속한 분야의 통상의 기술을 가진 자에게 공통으로 인지되고 있는 의미와 동일한 의미가 있다. 비록 여기서 설명된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실제 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적절한 방법과 재료가 하기에 설명되어 있다. 분쟁의 경우, 용어 정의를 포함하는 본 명세서는 조정될 것이다. 더불어, 재료, 방법, 실시예들은 예증적으로만 사용될 뿐으로 제한성을 가지는 것으로 의도된 것이 아니다.
여기서, 본 발명은 실증예의 방법만으로써, 첨부된 도면을 참조하여 설명된다. 도면을 상세히 참조하여, 특정물은 실시예에 의해서 그리고 본 발명의 구체예의 예증적 논의의 목적으로만 제시되는 것으로, 본 발명의 핵심적 및 개념적 관점에서 가장 유용하고 쉽게 이해될 수 있다고 고려된 것을 제공하는 과정에서 제시된 것들임을 밝혀둔다. 이와 관련하여, 본 발명의 기본적 이해에 필요한 것보다 더 상세히 본 발명의 구조적 상세를 나타내기 위해 어떠한 시도도 하지 않고, 도면에 나타난 설명은 당해 분야의 기술자들에게 본 발명의 수 개 형태가 실제 어떻게 구현되는 가를 명백하게 하는 것으로 취하여 진 것이다.
도면에서:
도 la는 프로모터 부위로부터 인체 APP 부위의 첫 번째 엑손까지 뻗쳐있는 APP 프로모터의 뉴클레오타이드 서열이다. +1은 전사 출발 위치를 표시한다. 프라이머 1 (서열 번호: 1) 및 2 (서열 번호: 2)용으로 사용되는 서열은 이중으로 밑줄쳐져 있다. 9bp 크기의 GC 가 풍부한 요소의 6개 복제물에 밑줄쳐져 있다. C위 의 점은 증폭된 프로모터 부위 (-251 내지 +22)에 있는 CpG 더블렛 내의 시토신을 표시한다.
도 lb는 도 1a에 제시된 DNA 서열의 메틸화 상태를 검출하는데 사용된 프라이머들의 뉴클레오타이드 서열이다. 프라이머 1 (a-b)-각각 황산화 후 또는 전의 프라이머 1 (서열 번호: 1, APP-F)의 서열을 표시한다; 프라이머 2c-e- 황산화 후 (c), 안티센스 방향으로 (d) 또는 황산화 전 (e)의 프라이머 2 (서열 번호: 2, APP-R)를 표시한다.
도 2a 내지 b는 안드로겐 수용체 엑손 1의 천연 (도 2a) 및 바이설파이트 개질 (도 2b)의 서열의 뉴클레오타이드 서열이다. 도 2a - #는 순방향 프라이머의 위치를 표시한다; ##는 역방향 프라이머의 위치를 표시한다; *는 HpaII 위치를 표시한다; **는 Hhal 위치를 표시한다. 도 2b - 녹색의 광휘 부분은 CpG 섬을 표시한다; 분홍 밑줄-CpG 위치를 표시한다; (#)는 AR-F-1 (서열 번호: 60)의 위치를 표시한다; (*)는 AR-F-34 프라이머 (서열 번호: 61)의 위치를 표시한다; (**)는 AR-R-282 프라이머 (서열 번호: 62)의 위치를 표시한다.
도 3은 남성, 여성 및 클라인펠터(Kleinfelter) 증후군을 지닌 피험체에서 안드로겐 수용체 메틸화 상태를 제한 효소에 기반하여 분석한 결과물을 가시화시키는 아가로즈 젤을 찍은 사진이다. 레인 1-DNA 마커; 레인 2-천연 대조군; 레인 3-XX 미절단; 레인 4-XY 미절단; 레인 5-XY 미절단; 레인 6-삼염색체 X 미절단; 레인 7-XX 절단; 레인 8-XY 절단; 레인 9-XY 절단; 레인 10-삼염색체 X 절단.
도 4a 내지 b는 천연 (도 4a) 및 바이설파이트 개질 (도 4b) DSCAM 프로모터 의 뉴클레오타이드 서열이다. (#)-순방향 프라이머의 위치를 표시한다; ($)-역방향 프라이머의 위치를 표시한다; 녹색 광휘부는 CpG 섬을 나타낸다.
도 5a 내지 b는 천연 (도 5a) 및 바이설파이드 개질 (도 5b) IFNAR1 프로모터의 뉴클레오타이드 서열이다. 녹색의 광휘 부분은 CpG 섬을 가리킨다. (*)은 IFNR-f4-bis (서열 번호: 247)의 위치를 표시한다; (**)는 IFNR-nes-f-bis (서열 번호: 249)의 위치를 표시한다; (***)는IFNR-r4-bis (서열 번호: 248)의 위치를 표시한다.
본 발명은 염색체 이상을 초래하는 좌위 복제 수 이상을 확인하는데 사용될 수 있는 방법과 키트에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 삼염색체와 같은 좌위 증폭을 임신 전에 검출하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 원리 및 실제는 도면 및 후술하는 설명을 참조함으로 더 잘 이해될 것이다.
본 발명의 적어도 하나의 구체예를 설명하기 전에, 본 발명은 상기 설명에서 나타난 또는 실시예에서 예증되어진 세세한 것으로 이를 적용시키는 것에 한정되지 않는다는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명은 다른 구체예로 시행할 수 있고 또는 다양한 방법으로 실현 또는 구현될 수 있다. 또한, 여기서 사용된 구절 및 용어들은 설명의 목적으로만 사용되며 제한적인 것으로 간주하지 말아야 한다는 것임을 밝혀둔다.
유전적 질병은 비정배수성(aneuploidy), 정배수성(euploidy) 및 배수성 (polyploidy)과 같은 염색체 수에서의 다양성에 의해 흔하게 야기되는 병리적 조건이다.
염색체 수 또는 이의 부분에서의 그러한 변동은 보통 배아 또는 태아에 치명적이다. 삼염색체 21 (다운 증후군), 18 (에드워드 증후군(Edward's syndrome)), 13 (파타우 증후군(Patau syndrome)) 및 성 염색체들만이 생존하여 태어날 수 있는 상염색체성 삼염색체이다. 삼염색체 21과 달리, 삼염색체 13 및 18 질병은 훨씬 심각한 임상적 현상을 보이는 경향이 있고 단지 생후 일 년 내에 거의 죽는다. 삼염색체 질환을 가진 태아에 다발 병변이 존재하나, 주어진 삼염색체에 대해 전형적인 것으로 나타나는 단일 이형은 없다. 오히려, 한가지 특정 진단을 제공하는 한 다발의 임상적 증상이 존재한다. 더욱이, 이러한 환자들의 특정 다발 증상은 삼염색체 세포 라인에 대해 모자이크성이기 때문에, 다양한 표현형이 가능하다.
오늘날, 임의의 삼염색체성 질환에 대한 특정 처치, 요법 또는 치료가 없는 실정이다.
이러한 이유로, 일반적으로 염색체 이상, 상세하게는 출산 전 삼염색체의 조기 진단이 절실히 요구되고 있다.
삼염색체의 출산 전 진단에 대한 현재 이용 가능한 방법은 초음파 양막 세포 또는 융모성 세포의 세포 유전적 분석을 포함한다. 초음파 분석법은 높은 양성 오류율에 의해 제한적이고, 침습성 검사는 전적으로 유효하지 않고, 고도의 기술적 숙련을 요하고 또한 낙태를 초래할 수 있다. 택일적으로, 임신부 혈장에서 순환하 는 태아 염색체를 이용하여 진단하는 것은 임신부에게는 발견되지 않고 태아에게만 발견되는 유전자 또는 돌연변이에 제한된다.
후술하는 실시예 단원에서 더욱 설명되는 바와 같이, 본 발명자는 염색체 이상에 대한 신규한 진단 양식을 모색하는 중에, 상염색체성 삼염색체 또는 단염색체는 이의 과발현이 생존 양립성이 아닌 유전자가 침묵(silencing) 되면, 출생 후까지 생존하게 한다는 것을 발견하였다.
DNA 메틸화는 원핵 및 진핵 유기체 둘 다에서 유전자 발현이 침묵하게 되는 가역적 기작이다. 유전자 발현의 이러한 수준에서의 제어는 메틸트랜스퍼라제가 메틸기를 특히 프로모터 서열 부위에 있는 시토신 피리미딘 고리의 다섯 번째 탄소에 부가하는 능력에 의해 실현된다 [Adams (1995) Bioessays 17 (2): 139-45]. 진핵 세포에서 메틸화된 서열은 항상 불활성이다(Methylated sequences in Eukaryotic cells are usually inactive) [Gold and Pedersen (1994)].
비정상적 DNA 메틸화는 암에서 널리 퍼져 있는 현상이고 종양발생기 동안 일어나는 가장 빠른 변화 중에 있다는 것이 명백히 밝혀지고 있다 [Stirzaker (1997) Cancer Res. 57 (11): 2229-37]. DNA 메틸화는 또한 유전자 각인 (gene imprinting), 배아 발달, X-염색체 침묵 및 세포 주기 제어에서 중심적 역할을 담당하고 있는 것으로 나타난다 [Costello (2001) J. Med. Genet. 38 (5): 285-303]. 유전자 메틸화의 정상적 패턴의 확립 실패는 정신 지체의 주요 형태인 레트 증후군 (Rett syndrome), 프레더-윌리 증후군(Prader-Willi syndrome), 안젤만 증후군 (Angelman's syndrome), ICF 증후군 및 베크위스-위드만 증후군(Beckwith-Wiedmann syndrome)을 포함하는 수많은 유전적 질병에 대한 원인이다.
유전자 침묵에 있어서 DNA 메틸화가 중심적 역할을 하는 관점에서 보면, 동일한 기작을 사용하여 과발현이 치명적인 (즉, 생존과 양립되지 않는) 유전자를 침묵하게 하는 것은 매우 타당하며, 이것은 유전자 메틸화 상태를 결정하는 것은 좌위 증폭을 검출하는데 사용될 수 있다는 것을 제시하고 있다.
실제, 다운 증후군의 임상적 표현형 (즉, 정신지체, 선천성 심장질환 등)을 담당하는, 염색체 21 상의 유전자들이 DS 환자에 있어서 삼염색체성 수준으로 표현되는 반면, 마이크로어레이 분석에서 결정되는 바와 같이, 다운 증후군 환자에게서 염색체 21 상의 유전자의 일반적인 유전자 표현이 심각하게 차이가 나지 않는다 [Gross SJ, Ferrera JC, Morrow B, Dar P, Funke B, Khabele D, Merkatz I. 삼염색체 21 태반의 유전자 표현 프로파일: 출산 전 진단의 비침습적 기술의 계획에 대한 잠재적 접근(Gene expression profile of trisomy 21 placentas: a potential approach for designing noninvasive techniques of prenatal diagnosis.) Am J Obstet Gynecol. 2002 Aug; 187 (2): 457-62].
이러한 발견은 DNA 메틸화가 염색체 21의 여분의 복제물 상의 활발한 유전자들을 침묵하게 하는 작용을 하는 것을 제시하고 있다. 이러한 가정은 다운 증후군 환자에서 염색체 21의 h2-칼포닌 유전자가 염색체 21의 세 개 복제물 중 하나의 복제물에서 메틸화되어 과발현이 되지 않다는 것을 보여준 쿠라미츠 및 그 동료의 발견에 의해서 또한 지지가 되고 있다 [Kuromitsu (1997) Mol. Cell Biol. 2: 707- 12].
좌위 복제 수에서의 변동 및 메틸화 상태 사이의 이러한 새롭게 확인된 연결 고리는, 처음으로, 실시하기 간단하고, 비용 효율적이고, 개별 피험자에게 위험을 주지 않거나 최소화하는 분자 생물학적 기술을 사용하여 염색체 이상을 효과적으로 검출할 수 있게 한다.
따라서, 본 발명의 일 관점에 따라서, 좌위 복제 수에서의 변동을 확인하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는바, 용어 "좌위"는 염색체상의 유전자 위치 또는 부위를 지칭한다. 본 발명의 이러한 관점에 따른 방법은 염색체 1-22, X 및 Y 상에 위치하는 좌위의 획득, 이하 좌위 증폭, 또는 손실을 검출할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 구절 "좌위 증폭"은 좌위 복제 수에서의 증가를 지칭한다. 본 발명의 이러한 관점에 따른 좌위 증폭 및 좌위 결핍은 염색체 구조 (예를 들어, 복제(duplication), 역위(inversion), 전위(translocation), 삭제(deletion), 삽입(insertion))에서의 변화로부터 및/또는 염색체 수 (>2n) 또는 이의 부분 (또한 염색체 표식자로 지칭)에서의 증가나 감소로부터 유래할 수 있다. 염색체 수의 증가는 이수성 특성일 수 있고, 이는 하나 이상의 염색체의 획득 또는 손실을 포함하지만, 염색체의 전체적인 세트를 포함하지 않는다(즉, 삼염색체 및 사염색체). 택일적으로, 좌위 증폭은 세 개 이상의 완전한 염색체 세트가 존재하는 배수성으로부터 유래 될 수 있다.
몸체의 특정 세포 타입에서만 일어나는 염색체 수의 변화 (즉 모자이크 현상) 또한 본 발명의 이러한 관점에 따라서 검출될 수 있는 것으로 이해될 것이다 [Modi D, Berde P, Bhartiya D. Down syndrome: 염색체성 모자이크 현상에 대한 연구(a study of chromosomal mosaicism). Reprod Biomed Online. 2003 Jun;6(4): 499-503].
본 발명의 이러한 관점에 따른 방법은 좌위에서 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태(즉, 메틸화 패턴 및/또는 수준)를 결정함으로써 수행된다. 적어도 하나의 유전자의 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태는 좌위 복제 수에서의 변동을 나타내는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "소정의 메틸화 상태"는 증폭되지 않은, 바람직하게는 동일한 발달 상태에 있는 좌위로부터 얻어진 동일한 유전자의 메틸화 상태를 나타낸다.
따라서, 상술한 좌위에서의 적어도 하나의 유전자의 적어도 하나의 대립 유전자의 메틸화 상태에서의 변화(즉, 패턴 및/또는 증가한 수준)는 본 발명의 이러한 관점에 따른 좌위 복제 수에서의 변동을 나타낸다.
통상적으로, 인간 DNA의 메틸화는 시토신이 구아닌의 5'에 존재하는, 인접한 구아닌 및 시토신을 포함하는 디뉴클레오타이드 서열 (또한 CpG 디뉴클레오타이드 서열로 표시) 상에서 발생한다. CpG 디뉴클레오타이드 내에 있는 대부분의 시토신은 인간 게놈에서는 메틸화되어 있으나, 어떤 것은 CpG 섬으로 알려진, 특정 CpG 디뉴클레오타이드가 풍부한 게놈성 부위에서는 메틸화되지 않은 채로 있다 [참조 Antequera, F. et al., Cell 62: 503-514 (1990) ]. "CpG 섬"은 CpG 디뉴클레오타이드가 DNA 서열의 적어도 50%를 구성하는 CpG 디뉴클레오타이드가 풍부한 지역이 다.
그러므로 본 발명의 이러한 관점에 따른 메틸화 상태는 전형적으로, 바람직하게는 프로모터 부위에 있는 CpG 섬에서 결정된다. 하지만, 인간 게놈에서의 다른 서열도 CpA 및 CpT와 같이 DNA 메틸화되기 쉽다는 것이 이해될 것이다 [참조Ramsahoye (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 5237-5242; Salmon and Kaye (1970) Biochim. Biophys. Acta. 204: 340-351 ; Grafstrom (1985) Nucleic Acids Res. 13: 2827-2842 ; Nyce (1986) Nucleic Acids Res. 14: 4353-4367; Woodcock (1987) Biochem. Biophys. Res. Commun. 145: 888-894].
전술한 바와 같이, 좌위에서의 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태가 결정된다. 실시예 단원의 실시예 1-4는 염색체 X, 9 및 21의 증폭을 결정하는데 사용될 수 있는 유전자 목록을 제시하고 있다.
바람직하게는, 상기 적어도 하나의 유전자는 이의 발현 패턴에 따라 선택된다. 따라서, 좌위가 증폭되어 있지만 발현에서 변화를 보이지 않는, 즉 오로지 두 개의 유전자 복제물과 양립가능한 발현 패턴을 보여주는 유전자의 메틸화가 결정된다. 그러한 유전자들의 보기가 하기 표 1에 제시되어 있다.
[표 1]
유전자 명칭 염색체 위치
RASSF1-Ras 결합 (RalGDS/AF-6) 도메인 패밀리 1 3 3p21.3
짝지어진 박스 5; 짝지어진 박스 호메오(homeotic) 유전자 5 (B-세포 계열 특이성 활성체 단백질); B-세포 계열 특이성 활성체 단백질 9 9pl3
조직 인자 경로 저해체 2 7 7q22
ARHI, ras 유사체 I 1 lp31
FHIT 무른 히스티딘 세 개 유전자(fragile histidine triad gene); 비스(5'-아데노실)-트리포스파타베; 디뉴클레오시드 트리포스파타제; 디아데노신5',5"'-P1,P3-트리포스페이트 하이드롤라제; AP3A 하이드롤라제 3 3pl4.2
VHL 3 3p26-p25
OPCML 오피오이드-결합 세포 부착 분자 선구체; 오피오이드-결합 단백질/세포l 부착 분자-유사체; 오피에이프 결합-세포 부착 분자 11 11q25
CHFR 창머리 및 링 핑거 도메인을 가진 체크포인트 (checkpoint with forkhead and ring finger domains) 12 12q24.33
세마포린(semaphorin) 3B 3 3p21.3
MLH1 MutL 단백질 동족체 1 3 3p21.3
COX2 프로스타글란딘-엔도페록사이드 신타제 2 선구체; 프로스타글란딘 G/H 신타제 및 시클로옥시게나제 1 lq25.2-q25.3
MGMT 0-6-메틸구아닌-DNA 메틸트란스퍼라제 10 10q26
레티노 산 수용체 베타 3 3p24.1
PTEN 포스파타제 및 텐신 동종체; 다발성 진보 암 1에서 변이된 10 10q23.3
RASSFIA 3 3p21.3
APC 아드노마토시스 폴리포시스 콜리(adnomatosis polyposis coli) 5 5q21-q22
P15-CDKN2B 9 9p21
BLu 단백질 3
CDH1 캐드헤린(cadherin) 1, 타입 1, E-캐드헤린 (상피조직성) 16 16q22.1
TIMP-3 금속단백질효소-3의 조직 저해체 22 22ql2.3
GSN-젤솔린(gelsolin) 9 9q33
pl4-pl4ARF-시클린-의존성 키나제 저해체 2A 9 9p21
CDKN1C-시클린-의존성 키나제 저해체 1C 11 11p15.5
LOTl-다형상 선종 유전자-유사체 1 (pleiomorphic adenoma gene-like 1) 6 6q24-25
PIK3CG-포스포이노시티드-3-키나제, 촉매성, 감마 폴리펩타이드 7 7q22.2
TSLCl-이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 멤버 4 11 11q23.2
RB1-망막아종 1 13 13q14.2
Chfr-창머리와 링 핑거 도메인을 가진 체크포인트 12 12q24.33
HTERT-텔로머라제 역 전사효소 5 5p15.33
트랜스크립타제
MY018B-미오신 XVIIIB 22 22ql2.1
CASP8-카스파제-8 2 2q33-q34
hSNF5/INIl-SWI/SNF 관련, 매트릭스 연합, 액틴 의존성 조절자 (크로마틴, 서브패밀리 b, 멤버 1의); 수크로즈 비발효, 효모, 동족체-유사체 1; 인테그라제 인터액터 1; SWI/SNF 관련, 매트릭스 연합, 액틴 의존성 조절자 (하기의) 22 22q11.23
HICl-암에서 과메틸화된(hypermethylated in cancer) 17 17p13.3
유전자 발현을 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 이의 예를 보면, 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 혼성화 기반의 기술을 포함하는 RNA에 기초한 접근 (즉, 노던 블랏팅, PCR, RT-PCR, RNase 보호, 동소 (in-situ) 혼성화, 프라이머 연장, 마이크로어레이 분석 및 도트 블랏 분석) 또는 크로마토그래피, 전기영동, 특정 항체를 사용하여 수행되는, ELISA와 웨스턴 블랏 분석과 같은 면역검출 분석, 면역조직화학 등과 같은 단백질에 기초한 접근법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 좀 더 자세한 기술 문제는, http://www.protocol-online.org/에서 이용 가능한 실험실 참조 문헌 및 하기 실시예 단원에서 인용된 다른 참조문헌을 참조하라.
유전자 메틸화를 결정하기 위한 많은 접근 방법들이 당해 분야에 알려져 있고, 제한 효소 절단에 기초한 메틸화 검출 및 바이설페이트에 기초한 메틸화 검출을 포함한다. 수 개의 그러한 방법들이 하기와 후술하는 실시예 단원의 실시예 1에 요약되어 있다(메틸화를 검출하는데 유용한 더 상세한 기술적 문제들은 Ahrendt (1999) J. Natl. Cancer Inst. 91: 332-9; Belinsky (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 11891-96; Clark (1994) Nucleic Acids Res. 22: 2990-7; Herman (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821- 26; Xiong and Laird (1997) Nuc. Acids Res. 25: 2532-2534에 개시되어 있다].
제한 효소 절단 메틸화 검출 분석법
이 분석법은 메틸화된 DNA를 절단할 수 없는 특정 제한 효소의 능력에 근거한다. 일반적으로 사용되는 것들은 효소 짝으로서, 인식 모티프 CC를 포함하는 Hpa II-MPI 및 더 낮은 빈도의 인식 모티프 CCC를 가지는 MAI-MAI이다. 따라서, 예를 들어, Hpa II는 내부 시토신이 메틸화되어 있을 때, DNA를 절단할 수 없고, Hpa II-MPI는 신속한 메틸화 분석에 중요한 수단이 된다. 이러한 방법은 통상 서던 분석과 연계하여 수행된다. 결과를 해석하는데 어려움이 없는 수단을 사용하여 유전자 서열을 분석하였다. 따라서, CG 메틸화 둔감 효소들 (예를 들어, BamHI)에 대한 제한 위치가 측면에 구비된 목적 부위가 먼저 선택된다. HpaII에 대하여 5 내지 6개 이상의 위치를 포함하지 않는 서열이 선택된다. 서던 블랏 또는 PCR에 사용된 탐침자(들)는 이러한 부위 내에 존재하여야 하며 이를 온전히 또는 부분적으로 담당해야 한다. 이러한 방법은 불러(Buller) 및 그 동료에 의해 성공적으로 사용되었다(1999) 난소암 환자의 생식계열 DNA에서 비무작위적 X-염색체 불활성화 및 BRCA1 돌연변이 사이의 연합 (Association between nonrandom X-chromosome inactivation and BRCA1 mutation in germline DNA of patients with ovarian cancer) J. Natl. Cancer Inst. 91 (4): 339-46.
메틸화 민감성 효소 (예를 들어, HpaII)에 의한 절단은 때때로 부분적이기 때문에, McrBC 또는 오로지 메틸화된 CpG 자리만을 절단하는 다른 효소를 사용하여 상보적으로 분석하는 것이 [Yamada 등 Genome Research 14 247-266 2004] 다양한 메틸화 패턴들을 검출하는데 바람직하다.
바이설페이트에 기초한 메틸화 검출
게놈 시퀀싱 - 게놈 시퀀싱 기술 [Clark 등, (1994) 전기한 바와 같음]은 100개 세포 미만으로부터 분리된 DNA를 사용하여, 임의의 목적 서열의 양쪽 본 쇄 상의 모든 메틸화된 시토신을 검출할 수 있다. 이러한 방법에서, 소듐 바이설파이트를 사용하여, 5-메틸시토신이 비 반응성으로 남겨 지는 조건하의, 단일 본 쇄 DNA에서 시토신을 우라실 잔기로 전환한다. 전환된 DNA를 특이성 프라이머를 사용하여 증폭시키고 서열 분석한다. 상기 서열에 남아 있는 모든 시토신 잔기는 게놈에서 이전에 메틸화된 시토신을 나타낸다. 이러한 방법은 변성, 바이설파이트 전환 및 증폭의 효율을 최대화하는 명확한 과정을 이용하여 생식 세포 및 초기 발달 단계로부터 용이하게 이용 가능한, 적은 양의 게놈성 DNA로부터의 단일 유전자에 대하여 메틸화 지도를 작성할 수 있다.
메틸화-특이성 PCR ( MSP ) - 이것은 메틸화에 대해 민감하게 검출하기 위해 가장 널리 사용되는 분석법이다. 간략하게 말하면, 증폭 전에, DNA를 소듐 바이설파이트로 처리하여 모든 비메틸화 시토신들을 우라실 잔기들로 전환한다. 이러한 바이설파이트 반응으로 인해, 메틸화 정보는 서열에서의 차이로 효과적으로 전환된다. DNA가 모든 CpG들에서 메틸화된 것과 같은, DNA의 특정 메틸화 상태와 결합하는 프라이머를 사용하여 증폭된다. 만약 이러한 메틸화 상태가 DNA 샘플에 존재한다면, 생성된 PCR 산물은 겔 상에서 가시화될 수 있다. 하지만, 상기 특이성 프라이밍 방법은 프라이머 결합 위치에 있는 모든 CpG가 같이 메틸화되어 있어야 할 것을 요구한다는 것이다. 따라서, 공통으로 메틸화가 되어 있을 때, 증폭된 산물이 겔 상에서 관찰된다. 하나 이상의 CpG가 메틸화되어 있지 않은 경우, 생성물이 나타나지 않는다. 따라서, 이러한 방법은 메틸화가 부분적으로 되어 있는 것과 완전히 되어 있지 않은 것을 구분할 수 없다 [참조 미국 특허 번호 5,786,146; Herman 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9821-9826 (1996)]. 염색체 21의 증폭을 나타내는 메틸화를 검출하기 위한 프라이머의 예가 후술하는 실시예 단원의 실시예 2에 제시되어 있다.
실시간 형광 MSP ( MethyLight ) - 형광 탐색자를 이용하여 실시간 PCR MSP와 연계하여 사용하면, 높은 생산율을 보이는 균일한 반응을 실시할 수 있다. 탐색자가 어떤 CpG도 함유하지 않는다면, 상기 반응은 기본적으로 MSP의 정량적 형태이다. 그러나 상기 형광 탐색자가 하나 이상의 CpG를 함유하는 위치에 어닐되도록 고안되고, 그리고 이러한 세 번째 올리고뉴클레오타이드로 인하여 상기 분석법은 완전히 메틸화된 타겟 본쇄들에 대하여 특이성이 증가하게 된다. 증폭이 실시간으로 검출되기 때문에, 이차적 전기영동 단계가 필요 없다. 샘플에 대하여 후속 적 PCR 조작이 없는 관계로, 오염의 위험이 감소한다. 상기 메틸라이트(MethyLight) 탐색자는 타크만(Taqman) 탐색자 또는 라이트사이클러(LightCycler) 혼성화 탐색자 짝을 포함하지만 여기에 한정되지 않는 임의의 형태가 될 수 있고, 만약 다중 리포터 염료를 사용한다면, 수 개의 탐색자를 동시에 수행할 수 있다 [Eads (1999) Cancer Res. 59: 2302-2306; Eads (2000) Nucleic Acids Res. 28 : E32; Lo (1999) Cancer Res. 59: 3899-390]. 메틸라이트에 의한 정량적 분석법의 장점은 전립선암에서 글루타치온-S-트랜스터라제-Pl (GSTP1) 메틸화를 사용한 것에서 증명되었다 [Jeronimo (2001) J. Natl. Cancer Inst. 93: 1747-1752]. 이러한 방법을 사용하여, 양성 전립선 과생성물질 샘플, 전립선 내부상피(intraexpithelial) 신생물질 부위 및 국소 화 된 전립선암에서 메틸화를 나타내는 것이 가능하다.
바이설파이트 개질 DNA의 제한 효소 분석 - COBRA (Xiong 등, 1997, 전술한 바와 같음)로도 불리는 이러한 정량적 기술을 사용하여 게놈성 DNA의 적은 양으로 특정 유전자 좌위에서의 DNA 메틸화를 결정할 수 있다. 제한 효소 절단을 사용하여 소듐 바이설파이트로 처리된 DNA의 PCR 산물에서 메틸화-의존성 서열 차이를 밝힌다. 원조 DNA 샘플에서의 메틸화 수준은 절단 및 미절단 PCR 산물의 상대적 양에 의해 넓은 범위의 DNA 메틸화 수준에 대해 선형적인 정량적 형태로 표시된다. 이러한 기술은 미소절단(microdissected) 파라핀-내포 조직 샘플로부터 얻어진 DNA에 신뢰성 있게 적용될 수 있다. COBRA는 따라서 사용 용이성, 정량적 정확성 및 파라핀 분체와의 양립성의 강력한 특징들을 조화있게 구비하고 있다.
분화성 메틸화 혼성화 ( DMH ) - DMH는 고밀도, 마이크로어레이에 기초한 스크리닝 전략을 통합하여 메틸화된 CpG 디뉴클레오타이드 게놈성 단편물의 존재 상태 또는 부존재 상태를 검출한다 [참조 Schena 등, Science 270: 467- 470 (1995)]. 단일 부위에서 메틸화 자리의 수 (즉, >3)가 분석될 때에는 어레이-기반 기술을 사용한다. 먼저, 게놈성 라이브러리로부터 얻어진 CpG 디뉴클레오타이드 핵산 단편물을 생성하고, 증폭하고 고형 지지체 상에 고정시켜 CpG 디뉴클레오타이드가 풍부한 스크리닝 어레이를 만든다. DNA를 단편물로 절단하지만 메틸화된 CpG 섬들은 그대로 두는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 샘플로부터 DNA를 절단하여 암플리콘 (amplicon) 들을 생성한다. 이러한 암플리콘들을 사용하여 상기 스크리닝 어레이에 고정된, CpG 디뉴클레오타이드가 풍부한 단편물을 탐침하여 DNA 샘플의 CpG 디뉴클레오타이드 밀집 부위에서 메틸화 패턴을 확인한다. 한번에 하나의 유전자를 분석하는 것으로 제한되어 있는 서던 혼성화, 바이설파이트 DNA 시퀀싱 및 메틸화-특이성 PCR과 같은 다른 메틸화 분석 방법과는 달리, DMH는 게놈에서 다수의 메틸화-연관 유전자를 동시에 분석할 수 있도록 특별히 고안된 다수의 CpG 디뉴클레오타이드 밀집 게놈성 단편물들을 이용한다(상세한 점은 미국 특허 번호 6,605,432를 참조).
DNA 메틸화를 분석하기 위한 더욱 상세한 요건 및 추가 과정 (예를 들어, 질량 분광 분석)은 하기 문헌에서 참조 될 수 있다 [Tost J, Schatz P, Schuster M, Berlin K, Gut IG. MALDI 질량 분광 분석에 의한 CpG 메틸화의 분석 및 정밀 정량 (Analysis and accurate quantification of CpG methylation by MALDI mass spectrometry). Nucleic Acids Res. 2003 May 1 ; 31 (9): e50 ; Novik KL, NimmrichI, Genc B, Maier S, Piepenbrock C, Olek A, Beck S. Epigenomics : 메틸화 현상의 전 게놈적 연구 (genome-wide study of methylation phenomena). Curr Issues Mol Biol. 2002 Oct; 4 (4): 111-28. Review; Beck S, Olek A, Walter J. 게놈학에서부터 후성 게놈학까지: 생명의 고답적 견해 (From genomics to epigenomics: a loftier view of life). Nat Biotechnol. 1999 Dec; 17 (12): 1144; Fan (2002) Oncology Reports 9: 181-183; http://www.methods-online.net/methods/DNAmethylatio.html; Shi (2003) J. Cell Biochem. 88(1): 138-43; Adoryian (2002) Nucleic Acids Res. 30 (5): e21.].
유전자의 메틸화 상태를 검출하기 위해 수많은 상업적으로 이용가능한 키트를 사용할 수 있다는 것은 인식되어 있다. 예를 들어, EZ DNA 메틸화 키트 (Zymo Research로부터 이용가능, 미국 캘리포니아 92867, 오렌지카운티 625 W 카텔라 애비뉴 소재)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
통상적으로, 전술한 바이설페이트에 기반한 메틸화 검출 방법에 대한 올리고뉴클레오타이드는 선택되는 기술에 따라서 디자인된다.
본 명세서에서 사용되는바, 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 또는 이의 의태물 (mimetics)의 단일 본쇄 또는 이중 본쇄를 의미한다. 이러한 용어는 천연적으로 발생하는 염기, 당 및 뉴클레오시드 간의 공유 결합 (예를 들어, 백본)으로 구성되는 올리고뉴클레오타이드는 물론 각각 천연적으로 발생하는 부분과 유사하게 기능 하는 비천연적 발생 부분을 가지는 올리고뉴클레오타이드들을 포함한다 (참조, 미국 특허 번호: 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 및 5,625,050).
따라서, 예를 들어, 메틸화-특이적 PCR의 특이성에 영향을 주는 가장 첨예한 변수는 프라이머 디자인에 의해 결정된다. 바이설파이트에 의한 DNA의 개질은 본쇄 상보성을 파괴하기 때문에, 각 본쇄는 후속적 PCR 증폭에 대하여 주형으로서 사용될 수 있고, 다음으로, 각 본쇄의 메틸화가 결정될 수 있다. 하지만, 단일 본쇄를 증폭하는 것(예를 들어, 센스 본쇄)이 실제로 더 바람직할 수 있다. 프라이머를 디자인하여 80-250bp 크기의 부위를 증폭하는 데, 이러한 크기는 비 개질 된 DNA가 상기 프라이머들에 대한 주형으로서 작용하지 않는다는 것을 확고히 하기에 충분한 시토신을 원래의 본쇄에 포함한다. 이에 더하여, CpG 디뉴클레오타이드 내의 시토신의 수와 위치는 메틸화된 그리고 비메틸화된 주형에 대한 프라이머들의 특이성을 결정한다. 전형적으로, 1 내지 3개 CpG 부위가 각각의 프라이머에 포함되어 있고, 각 프라이머의 3' 지역에 밀집되어 있다. 이러한 것은 최적의 특이성을 제공하고 프라이밍 오류로 인한 양성 오류를 최소화시킨다. 동일한 열 순환 반응기(thermocycler)에서 주어진 유전자의 프라이머 각각 동시적으로 용이하게 분석하기 위해, 프라이머들의 길이를 거의 동일한 융해/어닐링 온도가 되게끔 조절한다.
더욱이, MSP는 특이적 프라이머 인식방식을 이용하여 메틸화된 대립 형질 유전자와 비메틸화 된 대립 형질 유전자 사이를 구별하기 때문에, 증폭하는 동안 엄격한 어닐링 조건이 유지된다. 본질적으로, 어닐링 온도는 어닐링 및 후속 적인 증폭 과정을 최대한 허용하는 것으로 선택된다. 바람직하게는, 프라이머들은 이론적 용해 온도보다 5 내지 8도 낮은 어닐링 온도로 디자인된다. 더 상세한 것은 Herman 및 Baylin (1998) 메틸화 특이성 PCR (Methylation Specific PCR in Current Protocols in Human Genetics). 참조.
본 발명의 교시에 따라서 고안된 올리고뉴클레오타이드들은, 효소 합성 또는 고상 합성과 같이, 당해 분야에 알려진 임의의 올리고뉴클레오타이드 합성 방법에 따라서 제조할 수 있다. 고상 합성을 수행하기 위한 장비 및 시약은 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems)으로부터 상업적으로 이용 가능하 다. 그러한 합성을 위한 임의의 다른 수단 또한 이용될 수 있다; 올리고뉴클레오타이드들의 실제 합성은 당해 분야에 숙련된 사람들의 능력 안에 있고, 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 등, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-E Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, New York (1988) 및 "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)에 상세히 기술된 바와 같은 확립된 방법론들을 통해, 고상 화학, 예를 들어, 시아노에틸 포스포라미다이트 (cyanoethyl phosphoramidite)를 이용한 후, 탈보호, 탈염, 및 예를 들어, 자동화된 트리틸-온 (trityl-on) 방법 또는 HPLC에 의한 정제에 의해 수행될 수 있다.
전술한 방법을 사용하여 좌위 복제 수에서의 변동 (전술한)과 연계된 병리적 현상을 검출할 수 있다.
그러한 병리 이상의 예는 삼염색체 1, 삼염색체 2, 삼염색체 3, 삼염색체 4, 삼염색체 5, 삼염색체 6, 삼염색체 7, 삼염색체 8, 삼염색체 9, 삼염색체 10, 삼염색체 11, 삼염색체 12, 삼염색체 13 (파타우 증후군), 삼염색체 14, 삼염색체 15, 삼염색체 16, 삼염색체 17, 삼염색체 18 (에드워드 증후군), 삼염색체 19, 삼염색체 20, 삼염색체 21 (다운 증후군), 삼염색체 22, 트리플로(triplo) X 증후군 (크라인펠터(Kleinfelter) 증후군), 트리플로 Y 증후군, 부분 삼염색체 6q, 삼염색체 9p, 삼염색체 llq, 삼염색체 14 모자이크, 삼염색체 22 모자이크를 포함하는 삼염 색체; 단염색체 1 및 단염색체 X (터너 (Turner) 증후군)과 같은 단염색체, 사염색체 18p과 같은 사염색체; 삼배수체성 (triploid) 증후군과 같은 삼배수체성 (희귀 질환에 대한 국가 조직 http://www.rarediseases.org/ 및 염색체성 모자이크 현상 http://www.medgen.ubc.ca/wrobinson/mosaic/contents.htm을 참조); 및 만성 골수성 백혈병과 같은 암을 포함하며 그러나, 이로 제한되지 않는다.
피험자에게서 좌위 복제 수의 변동을 확인하기 위해, DNA 샘플을 개별 피험자 (예를 들어, 포유동물)로부터 얻고 상술한 바와 같이 분석한다. 본 발명의 이러한 관점에 따라 바람직한 피험자는 임의의 발달 상태에 있는 인간 (즉, 이식 전 배아 피험체, 배아 피험체, 태아 피험체, 신생아 피험체, 및 출생된 피험체)이다.
일반적으로, 출생 후 조사를 하여 전통적인 염색체성 증후군을 제외하고, 다발성 선천성 기형 (MCA)을 가진 개인, 염색체성 이상을 지닌 개인의 부모 또는 형제자매, 균형성 또는 구조적 염색체 이상을 지닌 개인의 자녀, 두 번 이상의 유산 경험이 있는 커플, 불임 문제를 지닌 커플, 모호한 생식기를 가진 개인, 일차적 무월경의 여성, 정신 지체의 개인, 및 성징이 나타나지 않는 남성과 여성에 대해 유전자형을 확정 짓는다.
개별 피험체 (예를 들어, 신생아, 출생 후)의 생물학적 샘플로부터 DNA를 얻는다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 생물학적 샘플은 개인으로부터 분리된 조직 또는 액체를 지칭하는 것으로, 예를 들어, 혈장, 혈청, 척수, 임파액, 소변, 피부의 외부 부분, 호흡, 내장 및 비뇨 생식관, 눈물, 침, 젖, 혈액 세포, 종양, 기관, 및 생체 내 세포 배양 구성물을 포함하지만, 그러나 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 조직 생 검체, 혈액 또는 골수 샘플이 사용된다.
혈액은 바람직하게는, 소듐 헤파린 또는 EDTA-피복 튜브에 수집된다. 신생아는 최소 1 내지 2ml의 혈액이 요구되며, 아이 또는 성인은 최소 3 내지 5ml의 혈액이 요구된다. 백혈구 분석에는, 10% 미성숙 세포를 가지는 10.000 이상의 세포가 필요하다.
골수 (0.5 내지 2cc 골수)는 골수 이송 배지 또는 소듐 헤파린 튜브에 수집된다.
조직 생 검체 [표본 3mm, 예를 들어, 태반, 탯줄, 피부 (통상 모자이크 현상위 정도를 시험하는 데 사용)]를 멸균 생리 식염수에 또는 멸균 조직 배양 배지에 수집한다.
통상적으로, 말초 혈액으로부터 얻은 DNA를 사용한다. 정상적인 순환 임파구들은 배양 조건하에서 분열되지 않기 때문에, 임파구들을 얻고 외부 자극 인자 (예를 들어, 마이토젠)로 처리하여 세포 분열(유사분열)을 유도한다. 자극된 세포들을 45-96 시간 배양 후 임의의 시간에 수집할 수 있다.
일단 샘플이 얻어지면, 게놈성 DNA를 퀴아젠(Qiagen) (캘리포니아 91355, 발렌시아 스탠퍼드 28159 애비뉴 소재)로부터 이용가능한 QIAamp 혈액 키트를 사용하는 것과 같은 것으로 추출하고 상술한 바와 같이 분석한다.
염색체성 이상이 유산 및 출산 결함의 일차적 이유이기 때문에, 바람직하게는 전술한 방법론을 사용하여 미출생된 유아에서의 좌위 증폭을 확인한다. 임신부의 혈액으로부터 얻은 태아 DNA의 메틸화는 바이설파이트 개질을 사용하여 검출될 수 있으며, 이는 출산 전 스크리닝에 본 발명의 후성적(epigenetic) 표식자를 사용할 수 있게 한다는 것이 확립되는 것이다 [참조 Poon 등. (2002) Clin. Chem. 48: 35-41].
배아 (즉, 수정부터 발생 8주까지의 발생단계) 또는 태아 (즉, 발생 9주부터 출생까지의 발생 단계) 세포로부터 DNA를 수득하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 이의 예는 임신부 생검법, (예를 들어, 경부 샘플링, 양수 검사, 혈액 채취), 태아 생검법 (예를 들어, 간 생체검사) 및 융모 채취 (참조 발명의 배경 단원 및 미국 특허 번호 6,331,395)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
임신부 혈액으로부터 태아 DNA를 분리하여 사용하는 것이 본 발명의 이러한 관점에 따라서 바람직한데 이는 발생 단계의 아이에게 어떠한 위험도 부여하지 않는 비침습적 방법이기 때문이다 [참조 Lo (1998) Am. J. Hum. Genet. 62 (4) : 768- 75].
무세포(cell free) 태아 DNA를 임신부 혈액으로부터 수집하고 전술한 바와 같이 분석하였다 [참조 Bauer (2002) Am. J. Obstet. Gynecol. 186: 117-20; Bauer (2001) Ann. NY Acad. Sci. 945: 161-3; Pertl (2001) Obstet. Gynecol. 98 : 483-90; Samura (2000) Hum. Genet. 106: 45-9].
선택적으로, 태아 세포는, 고정된 항체가 태아 세포와 결합하고 태아세포를 포집하여 이를 밀집시키게 하는 항체 포집 기술을 사용하여 임신부 혈액으로부터 수집될 수 있다 [Mueller 등, "임신부의 말초 혈액으로부터 태아 융모 상피 세포의 분리 (Isolation of fetal trophoblasts cells from peripheral blood of pregnant women)", The Lancet 336: 197- 200 (1990); Ganshirt-Ahlert 등, "임신부 혈액으로부터의 강력한 출산 전 진단 수단으로서의 자성 세포 분류 및 전이 수용체 (Magnetic cell sorting and the transferring receptor as potential means of prenatal diagnosis from maternal blood)" Am. J. Obstet. Gynecol. 166: 1350-1355 (1992)].
태아 세포를 또한 항체 및 다른 특이성 결합 분체로 표지하여 유동 세포측정법 (flow cytometry)와 같은 세포 분류 과정을 용이하게 할 수 있다 [Herzenberg 등, "임신부 혈액 내의 태아 세포: 형광-활성 세포 분류에 의한 검출 및 집성 (Fetal cells in the blood of pregnant women: Detection and enrichment by fluorescence-activated cell sorting)", Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 76: 1453-1455 (1979); Bianchi 등, "임신부 혈액에서 유핵 적혈구로부터 태아 DNA의 분리 (Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood)" Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 87 : 3279-3283 (1990); Bruch 등, "유동 세포측정법을 사용하여 임신부 말초혈액으로부터 융모 상피세포-유사 세포 분류: 투과 전자 현미경 사용 및 태아 DNA 증폭을 포함하는 다중변수 연구 (Trophoblast-Like cells sorted from peripheral maternal blood using flow cytometry: a multiparametric study involving transmission electron microscopy and fetal DNA amplification)" Prenatal Diagnosis 11: 787-798 (1991). Price 등. "다중 변수 유동 세포 측정법으로 임신부 혈액으로부터 분리된 태아 세포를 이용한 출산 전 진단 (Prenatal diagnosis with fetal cells isolated from maternal blood by multiparameter flow cytometry)" Am. J. Obstet. Gynecol 165 : 1731-1737 (1991)].
PCR 기술은, 태아 DNA의 상대적인 양을 증가시키고 그럼으로써 분석할 수 있게 하기 위해, 통상적으로 연합하여 사용된다 [Bianchi 등, "임신부 혈액에서 유핵 적혈구로부터 태아 DNA의 분리 (Isolation of fetal DNA from nucleated erythrocytes in maternal blood)", Proc. Natl Acad. Sci (USA) 87: 3279-3283 (1990); Adkinson 등, "중합 효소 사슬 반응을 이용한 임신부 혈액으로부터의 태아세포 검출 증진 (Improved detection of fetal cells from maternal blood with polymerase chain reaction)", Am. J. Obstet. Gynecol. 170: 952-955 (1994); Takabayashi 등. "임신부 혈액으로부터 비침습적 태아 DNA 진단의 개발 Development of non-invasive fetal DNA diagnosis from maternal blood" Prenatal Diagnosis 15: 74-77 (1995)].
임신부 순환 물에서의 태아 세포를 이용하여 출산 전 진단을 하는 특정 개념은 미국 특허 번호 6,331,395호에 개시되어 있다.
예를 들어, 임신 8 내지 20주의 임신부로부터 혈액 (50ml)를 채취할 수 있다. 단핵 세포 (MNC) 분획을 파이콜-하이파퀴(Ficoll-hypaque) 상에서 원심분리로 분리하고, SCF 100ng/ml, IL-3 100ng/ml, 및 IL-6 100u/ml을 사용하여 10% FCS를 함유한 알파 배지에서 5x106/ml밀도로 7 일간 배양한다. 다음, 비흡착 세포들을 회수하고, 30% FCS, 1% BSA, 10-4M β-머캅토에탄올 및 페니실린과 스트렙토마이신은 물론 SCF 100ng/ml, IL-3 100ng/ml, 및 IL-6 100mu/ml을 함유한 알파 배지에 3x105/ml의 밀도로 다시 분배한다. 모든 배양은 5% C02 및 실내공기 또는 5% 산소의 분위기의 습한 조건의 배양기에서 실시하였다. 21일 후, 세포들을 회수하였다. 전술한 바와 같은 메틸화 분석을 위해, 표준방법을 사용하여 세포들을 원심분리하고 및 DNA를 추출하였다.
임신부 혈액으로부터 태아 세포를 집성하기 위한 키트는 아비바 바이오사이언시스 코오포레이션(AVIVA Biosciences Corporation)(캘리포니아주 샌디에고 소재, http://www.avivabio.com/Technology/fetal_cell_isolation.html)로부터 이용가능하다.
배아 또는 태아 DNA는 태아 사망 또는 유산 후에 얻을 수 있는 것으로 이해될 것이다. 이러한 경우, 효소적으로 분리한 조직 (외식편(explant))의 세포 및 조각을 사용하여 배아 또는 태아 조직으로부터 배양을 시작한다. 조직을 적절한 배양 조건에 놓으면, 세포는 표면에 붙게 되고 단층으로 성장한다.
상기 방법에 따라 염색체 정보는, 당해 분야에 공지된 (참조 미국 특허 번호 Nos. 5,906,919 및 5,580,724), 여러 가지 세포학적 (예를 들어, 김사(Giemsa) 염색) 및 혼성화-기반 기술 (예를 들어, FISH)를 사용하여, 더 유용한 것으로 된다.
전술한 바와 같이 좌위 증폭을 결정하는 시약은 진단 키트와 같이, 포장된 물품 또는 디스펜서 기구를 통해 제공될 수 있다. 이러한 포장된 물품, 예를 들어, 기포 포장과 같은 금속 또는 플라스틱 포일을 포함한다. 상기 포장 또는 디스펜서 방식은 진단 지침에 의해 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 전술한 바와 같이, 비정상적 메틸화를 초래하는 DNA 메틸화 이상 기작과 연계되어 있는 병리를 검출하는데 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이의 예는 프레디-윌리(Pradi-Willi), 안젤만(Angelman), 베크위스-위드만(Beckwith-Wiedemann), 레트(Rett) 및 ICF 증후군을 포함하지만, 그러나 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, ICF 증후군은 Dnmt3b라고 명칭 되는 DNA 메틸트 비정상적인 기능에 의해 유발된다. 유사하게도, mC (일명 MeCP2)를 인식하고 결합하는 단백질들 중 하나에서 정상적이지 못하면, 어린 여성에게 나타나는 정신 지체 현상인 레트 증후군이 유발된다.
여성의 염색체 X의 추가적인 복제물 상의 유전자들은 DNA 메틸화에 의해 억제되어 있기 때문에 [Goto (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (2): 362-78] 성별 결정 (예를 들어, 출산 전) 또한 본 발명의 관련 분야임이 이해될 것이다.
본 발명은 생존(활력)과 관계있는 유전자를 확인하는 것을 가능케 한다는 것이 이해될 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 관점에 따라서, 생존 양립성 유전자를 확인하는 방법이 제공된다.
상기 방법은, 전술한 바와 같이, 증폭된 염색체 서열 부위에서의 다수의 유전자의 메틸화 상태를 결정함으로써 수행된다.
후속적으로, 상기 복수 개의 유전자 중, 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태를 나타내는 유전자를 확인하고 그럼으로써 상기 생존 양립성 유전자를 확인한다.
그러한 방법은 유전자를 해설하고 신규한 치료 목표물을 확인하는데 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 추가적인 목적, 장점, 및 신규한 특징들은 제한적인 것으로 의도되지 않은 하기의 실시예를 고찰할 때, 당해 분야의 통상의 숙련자들에게는 명백한 것으로 될 것이다. 또한, 전술한 바와 같이 그리고 청구 범위에서 청구된 바와 같이, 본 발명의 다양한 구체예 및 관점들은 하기 실시예에서 실험적으로 뒷받침된다.
실시예
이제, 상술한 설명과 더불어, 본 발명을 비 제한적 방식으로 예시하는 하기 실시예를 언급하고자 한다.
일반적으로, 본 명세서에서 사용된 용어 및 본 발명에서 사용된 실험 과정은 분자적, 생화학적, 미생물학적 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 그러한 기술들은 문헌에 철두철미하게 설명되어 있다. 예를 들어, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook 등, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1-111 Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel 등, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson 등, "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren 등 (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 미국 특허 번호 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 및 5,272,057에 설정된 방법론; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellist, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-E Coligan J. E., ed. (1994); Stites 등. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)을 참조; 이용 가능한 면역분석법은 특허 및 과학적 문헌에 광범위하게 설명되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 및 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak 등, "Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory Course Manual"CSHL Press (1996) 참조, 이 모든 것은 본 명세서에 완전히 설정되어 있는 바와 같이, 참조문헌에 포함되어 있다. 다른 일반적인 참조 문헌들도 본 명세서를 통틀어 언급된다. 거기서의 절차들은 당해 분야에 공지되어 있고 독자들의 편리를 위해 제공되어 진다. 그곳에 포함된 모든 정보는 본 명세서에서 참조물로 포함된다.
재료 및 실험 과정
DNA 추출 - QIAamp 혈액 키트 (퀴아젠, 캘리포니아 91355, 발렌시아 스탠퍼드 28159 애비뉴 소재)을 사용하여 혈장 및 양수 샘플로부터 DNA를 추출한다. 칼럼당 혈장 또는 양수 800μl를 DNA 추출에 사용한다. 용출 완충액 50-110μl를 사용하여 DNA를 용출한다. 뉴클레온 (Nucleon) DNA 추출 키트 (Scotlabs Woburn, MA)를 제조자 지침에 따라 사용하여, DNA를 백혈구의 버피(buffy) 코트로부터 추출하였다.
DNA의 바이설파이트 처리 - DNA (최대 2μg)를 증류수 50μl에 희석시키고 2M NaOH 5.5μl를 첨가한다. 다음, 연어 정자 DNA 5μg을 상기 반응 혼합물에 첨가한다.
상기 용액을 50℃에서 10분간 배양하여 단일 본쇄의 DNA를 생성한다. 하이드로퀴논 [10mM 하이드로퀴논 (Sigma) 30μl, 하이드로퀴논 55mg을 물 50ml에 첨가하여 새로 제조]을 각 튜브에 첨가한다. 다음, 새로이 제조된 3M 소듐 바이설파이트 (Sigma S-8890, H20 5ml 당 소듐 바이설파이트 1.88mg을 첨가하고 NaOH로 pH를 5.0으로 조정하여 제조]를 상기 용액에 첨가한다. 상기 DNA 용액을 균일하게 확실히 혼합하도록 조처한다. 상기 DNA 용액에 미네랄 오일을 덮고 50℃에서 16시간 또는 70℃에서 1-2시간 처리한다. 더 길게 처리하면, 메틸화된 시토신이 티미딘으 로 전환되므로 허락되지 않는다. 일단 항온처리가 끝나면, 오일을 제거한다. DNA Wizard cleanup 프로메가(Promega) A7280 용액 1ml을 각 튜브에 첨가하고 상기 용액을 상기 키트의 미니프렙(miniprep) 칼럼에 적용한다. 진공처리하고 칼럼을 80% 이소프로판올 2ml로 세척한다. 온수 (예를 들어, 80℃) 50μl를 첨가하여, 상기 DNA를 표지 된 세척된 1.5ml 튜브로 용출한다. 상기 튜브를 1분간 원심분리 처리하고, 깨끗한 3M NaOH 5.5l를 각 튜브에 첨가한다. 상기 설포네이트 DNA 용액을 실온에서 5분간 항온 처리한다.
글리코겐 1μl를 담체 (뵈링게 인겔하임 게엠베하, 독일)로서 첨가하고, 10M NH4Ac 33μl, 및 3배 부피의 에탄올을 첨가한다. 적어도 1시간 내지 밤새 -20℃에서 처리하여 DNA 침전시키고 70% 에탄올로 세척한다. 건조된 펠렛을 물 20μl에 재현탁 시키고 -20℃에 보관하였다.
증폭 반응 - 설포네이트화 된 DNA 용액 1μl 알리쿼트를 1XGC 완충액 2 (타카라(TaKaRa), 일본국 교토 슈조 소재), dNTP 각 2.5mM, TaKaRa LA Taqe (타카라, 일본국 교토 슈조 소재) 5 U, 및 안티센스 프라이머 50pmol을 함유한 PCR 반응 혼합물 50l에 첨가한다. 반응 혼합물을 94℃에서 5분간 항온처리한다.
처리된 DNA의 센스 서열에 대한 상보 본쇄를 예비 가열 후, 하기와 같이 두 번의 사이클로 연장한다: 94℃에서 1분간, 60℃에서 3분간 및 72℃에서 3분간.
다음, 상기 센스 프라이머 50pmol을 첨가하고 혼합물을 94℃에서 가열시킨다.
상기 DNA들을 94℃에서 1분간, 60℃에서 1.5분간 및 72℃에서 2분간 가열하는 것으로 구성되는 주기를 8번 실시하여 증폭시킨다.
94℃에서 1 분간, 55℃에서 1.5분간 및 72℃에서 2분간으로 구성되는 주기를 30번 행하여 증폭을 심화시킨다.
결과로 나타나는 PCR 산물에서의 메틸화는 제한 효소 분석 또는 직접 시퀀싱으로 검출된다.
제한 효소에 의한 메틸화 위치의 검출 - 전술한 바와 같이, 메틸시토신을 티민으로 화학적으로 변경하는 것은 HpaII 및 HahI 제한 효소의 위치를 변경시키며 그래서 이러한 효소들이 그것들 각각의 부위에 있는 DNA를 절단할 수 없게 된다. 시토신 메틸화로 인하여, 메틸화에 민감한 효소들은 이러한 위치에서 절단하지 못하는 반면, 메틸화에 둔감한 MspI같은 다른 효소들은 일정한 제한 패턴을 낳는다. 바이설페이트로 처리된 DNA 상에서의 그러한 효소 용도는 특이성 제한 효소를 사용함으로써 메틸화 부위를 구별하게 한다 (더 자세한 것은 하기 실시예 3을 참조).
McrBC 를 사용한 메틸화 - McrBC는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터 얻는다. 상기 효소를 게놈성 DNA 5μg에 첨가하고 반응물을 제조자 지침에 따라 37℃에서 밤새 항온처리한다. 상기 효소를 65℃에서 20분간 항온처리하여 불활성화시킨다. 상기 절단된 DNA 50μg을 PCR 반응의 주형으로 사용한다. 프로모터 특이성 프라이머를 사용한다. 산물을 아가로즈 젤 상에서 분리하여 분석한다.
PCR 산물의 직접 시퀀싱 - 결과된 PCR 생성물을 상업적으로 이용 가능한 키 트 (예, Geneclean 등)을 사용하여 정제하고 상업적으로 이용 가능한 자동 시퀀서로 서열 분석한다.
대립 형질 특이성 올리고뉴클레오타이드 혼성화 - 이러한 분석법에서는, 관심의 유전자상에 있는 모든 후보 메틸화 위치를 포함하는 큰 분획 물을 증폭시킨다. 이러한 PCR 생성물은 플루오세인(flurocein) 또는 다른 형광표지(flurophore) (Cy3, Cy5)로 표지 된 하나의 뉴클레오타이드를 포함한다. 상기 생성물에 표지하는 제 2의 방법은 PCR 생성물에 내포되는 방사성 뉴클레오타이드 (32P, 33P, 35S, 3H 또는 14C)를 사용하는 것이다. 다음, PCR 생성물을 메틸화된 시토신 (즉, 티민) 대 시토신에 대하여 특이적인 올리고뉴클레오타이드와 혼성화시킨다. 올리고뉴클레오타이드에 대한 혼성화는 마이크로어레이 방법을 사용하여 유리 또는 니트로셀룰로즈 상에서 수행될 수 있다.
돌연변이 (또는 SNP) 검출용 상업적 키트 - 상업적으로 이용 가능한, "가미다진(Gamidagene)" 회사의 프론토(Pronto) 키트를 사용하여 메틸화 부위를 검출할 수 있다. 이러한 키트들은 고안된 특이성 탐침자와 연계하여, 돌연변이 및/또는 단일 뉴클레오타이드 다형성증 (SNP)을 검출하도록 고안되어 있고 관심 있는 메틸화 부위를 인식하도록 되어 있다. 유사하게, 뉴클레오타이드 서열에서의 변이를 인식할 수 있는 다른 방법 또한 사용할 수 있다. 예를 들어, 증폭 불응 변이 시스템(amplification refractory mutation system-ARMS)이 있다. 이러한 방법에서는 두 개의 상보적인 반응이 사용되는 데, 하나는 정상적인 대립 형질에 특이성인 프 라이머를 포함하고 나머지 것은 변이 대립 형질을 포함한다(둘 다 공통적인 제 2 프라이머를 가진다). PCR 프라이머는 여러 가지 DNA와 완벽하게 대응되기 때문에, 완벽하게 결합한 대립 형질 유전자형 결정을 바람직하게 증폭하여 확인한다. 전술한 바와 같이, 바이설파이트에 의해 티민으로 전환된 메틸 시토신은 이러한 방법으로 검출될 수 있다.
실시예 1
염색체 21의 유전자
하기 표 2는, 가디나 및 데이비슨 게놈 생물학(Gardiner and Davisson Genome Biology) 2000 1 (2): reviews 0002.1-0002.9에 설명되어 있는 바와 같이, 염색체 21의 122개 유전자의 할당된 기능을 제시하고 있다. 그 대부분은 완전하거나 또는 아마도 완전한 cDNA 서열을 가진다. 기능적 설명들이 직접적인 실험의 문헌적 보고서 또는 다른 단백질과의 유사성으로 추론한 것에 바탕을 두고 할당되었다. 오로지 부분적 구조 정보를 가지는 유전자들에 대한 설명은 그것에 있는 특이성 기능적 도메인에 기초하였고 (*)로 표시되어 있다(Gardiner K. http://genomebiologycom/2000/i/2/reviews/0002.1).
광범위하게 서술하기 위해 기능적 카테고리들이 선택되었다; 각 유전자들은 오로지 하나의 카테고리에서 나타난다.
[표 2]
기능적 카테고리 유전자 수 기능 설명
전사 인자, 조절자(regulator) 및 단속자(modulators) 17 GABPA, BACH 1, RUNX1, SIM2, ERG, ETS2 (전사 인자); ZNF294, ZNF295, Pred65,
*ZNF298, APECED (징크 핑거); KIAA0136 (루이신 지퍼); GCFC (GC-다발성 결합 단백질);
SON (DNA 결합 도메인); PKNOX1 (homeobox); HSF2BP (열충격 전사인자
결합 단백질); MRIP1 (에스트로젠에 의한 전사 활성의 단속자)
크로마틴 구조체 4 H2BFS (히스톤 2B), HMG14 (고 이동성 그룹), CHAF1B (크로마틴 조립 인자), PCNT
(페리센트린, 중심체(centrosome)의 중심 주변 (pericentriolar) 매트릭스의 일체형 성분)
단백질효소 및 단백질 효소 저해체 6 BACE (베타-부위 APP 절단 효소); TMPRSS2, TMPRSS3 (경막 세린 단백질효소);
ADAMTS1, ADAMTS5 (금속단백질효소) ; CSTB (단백질효소 저해체)
유비퀴틴 경로 4 USP25, USP16 (유비퀴틴 단백질효소); UBE2G2 (유비퀴틴 접합 효소); SMT3A (유비퀴틴-유사체)
인터페론류 및 면역 반을 인자 9 IFNAR1, IFNAR2, IL10RB, IFNGR2 (수용체/보조); MX1, MX2 (인터페론-유도된);
CCT8 (T-콤플렉스 서브유닛), TIAM1 (T-임파종 침입 및 전이 유도 단백질),
TCP10L (T-콤플렉스 단백질 10 유사체)
키나제류 8 ENK (엔테로키나제); MAKV, MNB, KID2 (세린/트레오닌); PHK (피리독살 키나제), PFKL
(포스포프럭토키나제); ANKRD3 (키나제 도메인을 가진 안키린(ankyrin)-유사체; PRKCBP2 (단백질 키나제 C
결합 단백질)
포스파타제류 2 SYNJ1 (폴리포스피노신노시티드 포스파타제); PDE9A (시클릭포스포디에스테라제)
RNA 가공 5 rA4 (SR 단백질), U2AF35 (스플라이싱 인자), RED 1 (에티다제), PCBP3 (폴리 (C)-결합 단백질);
*RBMll (RNA-결합 모티프)
부착 분자 4 NCAM2 (신경 세포), DSCAM; ITGB2 (임파구); c21 또는 f43 (상피에 단단히 접합하는
분자와 유사)
채널류 7 GRIK1 (글루타에미트 수용체, 칼슘 채널); KCNE1, KCNE2, KNCJ6, KCNJ15 (포타슘);
CLIC11 (클로라이드); TRPC7 (칼슘)
수용체류 5 CXADR (콕사키(Coxsackie)) 및 아데노바이러스); 클라우딘스 (Claudins) 8,14,17 (클라스드리디아(Claustridia)); Predl2 (만노즈)
전달체류 2 SLCSA3 (Na-미오이노시톨); ABCG1 (ATP-결합 카세트)
에너지 대사 4 ATP50 (ATP 신타제 올리고마이신 -민감성 부여 단백질); ATP5A (ATP아제-커플링 인자 6);
NDUFV3 (NADH-유비퀴논 옥소리덕타제 서브유닛 선구체); CRYZL1 (퀴논
옥시도리덕타제)
구조 4 CRYA (렌즈 단백질); COL18, COL6A1, COL6A2 (콜라겐류)
메틸 트란스퍼라제 3 DNMT3L (시토신 메틸 트란스퍼라베), HRMTIII (단백질 아르기닌 메틸 트란스퍼라제); Pred28
(AF139682) (N6-DNA 메틸트란스퍼라제)
SH3 도메인 3 ITSN, SH3BGR, UBASH3A
일 탄소 대사 4 GART (퓨린 생합성), CBS (시스타치오닌-β-산세타제), FTCD (포르미미노트란스퍼라제
시클로디아미나제), SLC19A1 (환원된 엽산염 운반자)
산소 대사 3 SOD1 (슈퍼옥사이드 디스뮤타제); CBR1, CBR3 (카르보닐 리덕타제)
기타 28 HLCS (홀로카르복실라제 신타제); LSS (라노스테롤 신세타제); B3GALT5 (갈락토실 트란스퍼라제);
*AGPAT3 (아실트란스퍼라제); STCH (미크로좀의 스트레스 단백질); ANA/BTG3 (세포 주기 제어);
MCM3 (DNA 복제 연관 인자); APP (알츠하이머의 아밀로이드 선구체); WDR4, WDR9
(WD 반복체 포함 단백질류); TFF1,2,3 (트레포일 단백질류); UMODL1 (uromodulin); Pred5
(리파제);*Pred3 (케라티노사이트 성장 인자); KIAA0653, *IgSF5 (Ig 도메인); TMEM1, *Pred44
(경막 도메인); TRPD (테트라트리코펩타이드 반복체 함유); S100b (Ca 결합); PWP
(주기성 트립토판 단백질); DSCR1 (프롤린 풍부); DSCR2 (루이신 풍부); WRB (트립토판 풍부
단백질); Pred22 (tRNA 신세타제); SCL37A1 (글리세롤 포스페이트 퍼미아제)
표 2 계속
실시예 2
삼염색체 21의 유전자 및 이의 메틸화 상태를 검출하는데 사용될 수 있는 프라이머
배경
신경 섬유 아밀로이드 단백질의 신경원 내적으로 신경섬유원 농축 (neurofibrillary tangles) 되고, 세포 외적으로는 반점(plaques)으로 그리고 혈관 내에 쌓여있는 것이 알츠하이머 질병 (AD) 및 나이 든 다운 증후군 환자들 두 경우에 대하여 특징적이다. 이러한 침적 물 내에 발견되는 주요 단백질은 작고, 불용성이고 매우 결집한 폴리펩타이드인, a4로서, 이는 이의 선구체, 즉 염색체 21 (21q21.2)에 국소화 되어 있는 아밀로이드 단백질 선구체의 이화작용 이상에 기인하는 것으로 추정된다.
실험 과정
APP (GenBank 수탁 번호 X127522)의 증폭을 검출하기 위해, APP 프로모터 부위의 메틸화를 바이설파이트 시퀀싱으로 결정한다.
[표 3]
프라이머 ID 올리고뉴클레오타이드 서열 (5'-3')/서열 번호: X127522에서의 위치 PCR 생성 크기 (bp)
APP-F tggttttagatttttttttttattg (1) 3449-3473 272
APP-R acctaccactaccaaaaaaactaac (2) 3696-3721
하기 표 4는 바람직한 PCR 조건을 제시하고 있다.
[표 4]
온도(℃) 시간 주기 횟수
95 10분
94 30초 35
62 30초
72 30초
72 10분
결과로 나타난 PCR 산물을 서열 분석하여 시토신이 티민으로 치환된 것을 확인한다. APP 프로모터 (프라이머APP-F 및APP-R을 사용, 도 lb)로부터 증폭된 PCR 산물이 도 la에 나타나 있다.
선택적으로, 상기 결과된 PCR 산물을 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이에 혼성화 시킬 수 있다.
하기 표 5 및 6은 전술한 바와 같이, 바이설파이트로 DNA를 처리한 후, 인간 염색체 21 상의 메틸화된 DNA 부분을 확인하는데 사용될 수 있는 특정 올리고뉴클레오타이드 형태를 제시하고 있다.
[표 5] - 아밀로이드 선구체 단백질 (APP) 유전자 ( GenBank 수탁 번호 X127522 ) 염색체 21
WT 탐색자 (5'-3')/ 서열 번호: 메틸화 탐색자 (5'-3')/ 서열 번호: 위치 (gi35230)
gagggggtgtgtggg/(5) gaggggcgtgtggg/(6) 3509-3523
gttaaggtgttgtat/(7) gttaaggcgttgtat/(8) 3535-3549
ttgtgggtgtggggt/(9) ttgtgggcgtggggt/(10) 3550-3563
tttttggtgtgagtg/(11) tttttggcgtgagtg/(12) 3573-3591
gagtgggtgtagttt/(13) gagtgggcgtagttt/(14) 3583-3597
tttggtggtgttgtta/(15) tttggtggcgttgtta/(16) 3598-3613
ggttgttgtgtttggg/(17) ggttgttgcgtttggg/(18) 3677-3692
tgttggttggggagt/(19) tgttggtcggggagt/(20) 3492-3506
ttttttttggtgtga/(21) tttttttcggtgtga/(22) 3570-3584
agttttttggtggtg/(23) agtttttcggtggtg/(24) 3592-3606
ggtgggttggattag/(25) ggtgggtcggattag/(26) 3639-3653
tggggagtggagggg/(27) gggggagoggagggg/(28) 3500-3514
tttttggcgtgagtg/(29) tttttggcgtgagtg/(30) 3572-3586
gggggtgtgtggggt/(31) gggggtgcgtggggt/(32) 3511-3525
tgtaggtggtgtta/(33) gtgtaggcggtgtta/(34) 3523-3537
tttggtgtgagtggg/(35) tttggtgcgagtggg/(36) 3574-3588
[표 6] - H2 - 칼포닌 유전자 ( GenBank 수탁 번호gi:4758017), 염색체 21
[ Kuromitsu J. 등, Mol Cell Biol . (1997) 17 (2): 707-12]
WT 탐색자 (5'-3')/ 서열 번호: 메틸화 탐색자 (5'-3')/ 서열번호 위치 (gi4758017)
aatttggtgttttta/(37) aatttggcgttttta/(38) 966501-966515
atatttgcgttttgg/(39) atatttgcgttttgg/(40) 966528-966542
tgtgttttgggttaa/(41) tgtgtttcgggttaa/(42) 966533-966547
ggtgtggtgtgtgga/(43) ggtgtggcgtgtgga/(44) 966559-966573
tgtggcgtgtggagt/(45) tgtggcgcgtggagt/(46) 966561-966575
tggagtttggtgtgt/(47) tggagttcggtgtgt/(48) 966570-966584
agtttggtgtgtttt/(49) agtttggcgtgtttt/(50) 966572-966586
aattttgcgttagtt/(51) aattttgcgttagtt/(52) 966588-966602
gttagtttggtggtt/(53) gttagttcggtggtt/(54) 966596-966610
실시예 3
삼염색체 X의 유전자 및 이의 메틸화 상태를 검출하는데 사용될 수 있는 프라이머
여성에 있어서, 이중의 X 염색체의 대부분 유전자 중 하나의 세트는 침묵하고 있다. 침묵은 전형적으로 그러한 유전자의 프로모터가 CpG 메틸화되어 발생하고 있다. 몇몇의 메틸화 분석 과정을 이용하여 남성, 여성, 및 클라인펠터 증후군에 걸린 피험체에서 안드로겐 수용체 (GenBank 수탁 번호 NM00044)의 메틸화 상태를 검출하였다.
실험 과정
세포 - 남성, 여성 및 클라인펠터 증후군에 걸린 배아를 12일 배양한 양막 세포를 코리엘 인스티튜트 엔제이 (Coriell Institute NJ)로부터 수득하였다. 클라인펠터 세포 Cat. No. GM03102. 정상 세포 Cat. Nos.
DNA 추출 - 세포를 2,500rpm에서 10분간 원심분리하였다. 세포 펠렛을 75mM NaCl 및 25mM EDTA을 포함하는 용해 완충액에 재현탁하고 잘 섞어 세포막을 용해하였다. 다음으로, 10% SDS 용액 (최종 부피의 1/10)을 상기 혼합물에 첨가하고 용액을 뒤집어서 혼합하였다. 용액을 프로테나제 K (10mg/ml, 최종 부피의 1/10) 존재하에서 밤새 55℃에서 항온처리하였다. 동 부피의 페놀: 클로로포름 (1:1)을 용액에 첨가하였고, 뒤집어서 잘 혼합하고 (5분), 및 15분간, 14,000 x g에서 원심분리하여 상 분리시켰다. 클로로포름을 상부 상에 첨가하고, 용액을 5분간 뒤집어서 잘 혼합하고, 14,000 x g에서 5분간 원심분리하여 상 분리시키고, 상부 상을 수집하고, 이에 3M 소듐 아세테이트 (최종 부피의 1/10)을 투입하고, 뒤집어서 잘 혼합하였다. 밤새, DNA를 에탄올 침전시키고 (70%), 이 후 농도 및 순도를 결정하였다.
제한 효소에 근거한 분석
DNA 분자 (즉, 바이설파이트-처리 또는 비처리) 0.5μg을 HpaII (30유닛, NEB 효소, New England Biolabs. Inc. Beverly MA 01915-5599 USA)로 절단하였다. 완전히 절단하기 위해, 8시간 항온처리 후, 새로이 효소를 다시 첨가하여 밤새 항온처리하였다.
절단 후, 상기 절단 혼합물로부터 얻은 DNA 2μl를, 하기 표 7에 제시된 프라이머를 하기 표 8과 9에서 제시된 조건하에서 사용하는 PCR 반응용 주형으로서 사용하였다.
[표 7]
프라이머 명칭 서열 (5'-3')/서열번호: NM000044에서의 위치 PCR 생성물 (bp)
AR-f TCCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGC/55 1183-1207 ~300*
AR-r GCTGTGAAGGTTGCTGTTCCTCAT/56 1447-1470
*PCR 생성물의 크기는 환자로부터 수득한 DNA에서의 CAG 반복체의 수에 의존한다.
[표 8]
반응 혼합물
완충액 10X 최종 부피(20μl)의 0.1
dNTPs 2mM 최종 부피(20μl)의 0.1
AR-f 10pmol/l 최종 부피(20μl)의 0.1
AR-r 10pmol/l 최종 부피(20μl)의 0.1
물 최종 부피(20μl)까지
효소* 1 유닛
DNA 최종 부피(20μl)의 0.1-0.15
*NEB 효소-Taq DNA 폴리머라제 Cat. No. M0267 New England Biokabs. Inc. Beverly MA 01915-5599 USA.
[표 9]
온도 시간 주기 횟수
94℃ 4분
94℃ 45초 35
59℃ 45초
72℃ 1분
72℃ 7분
약 300bp의 결과된 PCR 생성물을 2.5% 아가로즈 젤 상에서 분리하고 가시화시켰다.
메틸화 특이성 PCR ( MSP )
DNA를 전술한 실험 과정에서 설명한 바와 같이, 바이설파이트 처리하였다. 프라이머 및 PCR 조건은 표 10, 11 및 12에 제시되어 있다.
[표 10]
프라이머 명칭 서열 (5'-3')/서열 번호: NM000044에서의 위치 PCR 생성물 (bp)
AR-U tagaatttgttttagagtgtgtgt/57 1185-1208
AR-M tttgttttagagcgtgcg/58 1189-1207 ~225
AR-R aaaaccatcctcaccctact/59 1385-1404
[표 11]
비메틸화된 믹스 메틸화된 믹스
완충액 10X DS* 최종 부피의 0.1
dNTPs 2mM 최종 부피의 0.1 최종부피의 0.1
AR-U 10pmol/μl 최종 부피의 0.1
AR-M 10pmol/μl 최종 부피의 0.1
AR-U 10pmol/μ1 최종 부피의 0.1 최종 부피의 0.1
물 최종 부피까지 최종부피까지
효소* 1 유닛 1 유닛
DNA 최종부피의 0.1-0.15 최종 부피의 0.1-0.15
* 완충액 DS 10X-166mM 암모늄 설페이트, 670mM 트리즈마(Trizma); 67mM Mg 클로라이드; 100mM 머캅토에탄올; 1% DMSO; 암모늄 설페이트-Sigma A 4418; 트리즈마-Sigma T 5753; DMSO-트리즈마 D 8414; MgC12-Sigma M-1028; 머캅토에탄올-Sigma M 3148.
[표 12]
온도 시간 주기 횟수
94℃ 4분
94℃ 45초 35
59℃ 45초
72℃ 1분
72℃ 7분
이 단계 네스팅 PCR 반응으로 생성물을 확인하였고, 이의 프라이머가 하기 표 13에 기재되어 있고, PCR 반응이 하기 표 14-16에 제시되어 있다. 첫 번째 PCR의 DNA 주형을 바이설파이트 개질용으로 사용하였다 (~50ng). PCR 생성물을 두 번째 PCR 반응의 주형으로서 사용하였다(최종 부피의 1/20). 반응 생성물을 서열 분석하였다.
[표 13]
프라이머 명칭 서열(5'-3') NM000044에서의 위치 PCR 생성물 (bp)
AR-F-1 agatttagttaagtttaaggatggaagtg/60 1096-1124
AR-F-34 gggttgggaagggtttatttt/61 1131-1151 ~280*
AR-R-282 aaaaaccatcctcaccctactactac/62 1379-1404
*PCR 생성물의 크기는 환자로부터 얻은 DNA에서의 CAG 반복체의 수와 선형적으로 관련이 있다.
[표 14] - 단계 I
믹스 1
완충액 10X 최종 부피의 0.1
dNTPs 2mM 최종 부피의 0.1
AR-F-1 10pmol/μl 최종 부피의 0.1
AR-R-282 10pmol/μl
물 최종 부피까지
DNA 최종 부피의 0.1-0.15
효소* 1 유닛
*NEB 효소
바이설파이트 개질 DNA로부터 안드로겐 유도체의 엑손 1을 증폭하는 PCR 조건은 하기 표 15 및 16에 기재되어 있다.
[표 15]
온도 시간 주기 횟수
94℃ 4분
94℃ 45초 35
59℃ 45초
72℃ 1분
72℃ 7분
[표 16] - 단계 II
믹스 1
완충액 10X NEB 최종 부피의 0.1
dNTPs 2mM 최종 부피의 0.1
AR-F-34 10pmol/μl 최종 부피의 0.1
AR-R-282 10pmol/μl 최종 부피의 0.1
물 최종 부피까지
DNA (단계 I의 생성물) 최종 부피의 0.05
효소* 1 유닛
*NEB 효소
단계 II의 PCR 생성물을 2.5% 아가로즈 겔에서 분리하고 상업적으로 이용가능한 정제 키트 (GFX PCR cat. No, 27-9602-01 아머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscience)제조, 미국, 뉴저지 08855, 피스카타웨이 바이오사이언스 소재)를 이용하여 정제한 후, pGEM 플라스미드 (pGEM-T Easy Vector Vector System I Cat. No. A1360 또는 pGEM-T Vector Vector System I Cat. No. A3600 프로메가 코퍼레이션, 미국 윌밍턴 주, 매디슨 소재)로 클론 시켰다. 각 PCR 생성물의 5 내지 10개 클론을 서열 분석함으로써 정확한 서열 분석을 확증하였다. 서열분석은 ABI 서열분석기로 수행하였다.
결과
안드로겐 수용체의 엑손 1의 천연적인 서열이, HpaII 및 HhaI 제한 부위와 더불어 도 2a에 도시되어 있다. 바이설파이트 개질 후 얻어진 추정되는 서열이 도 2b에 도시되어 있다.
도 3 및 4는 남성, 여성 및 클라인펠터 증후군을 보이는 피험체에서의 안드로겐 수용체 메틸화 상태를, 제한 효소에 근거한 분석 및 메틸화 특이성 PCR (MSP)에 의해 결정한 결과를 도시하고 있다.
도 3에 도시된 바와 같이, XY (즉, 남성) 피험자로부터 수득한, HpaII 처리 DNA 샘플을 PCR 증폭한 결과 아무런 생성물도 얻지 못하였다. 그러나 XX 및 XXY 피험자로부터 수득한 HpaII 처리 DNA 샘플을 사용하여 동일한 반응을 시키면, 안드로겐 수용체 엑손 1의 엑손 1 생성물이 280bp의 크기로 뚜렷이 나타났다.
남성 및 클라인펠터 증후군을 지닌 피험체로부터 얻은 안드로겐 수용체의 엑손 1의 메틸화 상태를 MSP로 분석한 결과, 메틸화된 프라이머를 사용하게 되면, DNA증폭은 클라인펠터 증후군을 지닌 피험체 (즉, 46XXY)로부터 수득한 DNA에서만 일어난다는 것이 나타난다.
이와 더불어, 이러한 결과들은 클라인펠터 증후군을 지닌 피험체에서 안드로 겐 수용체의 DNA 메틸화 중재 유전자가 침묵하고 있다는 것을 지지하며 이것이 그러한 병리를 진단하는 도구로서 유용하다는 것을 나타내고 있다.
MSP는 부분적인 메틸화 (즉, 주어진 대립 형질에서 모든 메틸화 부위가 실제적으로 다 메틸화되지 않은 것)를 효과적으로 검출하지 않기 때문에, 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이를 사용하는 것이 유리할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
그러한 마이크로어레이에서 효과적으로 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드들이 하기 표 17에 기재되어 있다.
[표 17]
WT 탐색자(5'-3')/서열 번호: 메틸화 탐색자(5'-3')/서열 번호: 위치(M00044)
ggtttatttttggttgttgtt/63 ggtttattttcggttgttgtt/66 1142-1162
ggtttatttttggtcgttgtt/67
ggtttatttttggttgtcgtt/68
ggtttattttcggtcgttgtt/69
ggtttatttttggtcgtcgtt/70
ggtttattttcggttgtcgtt/71
ggtttattttcggtcgtcgtt/72
tatttttggttgttgtttaag/64 tattttcggttgttgtttaag/73 1146-1166
tatttttggtcggtgtttaag/74
tatttttggttgtcgtttaag/75
tattttcggtcgttgtttaag/76
tatttttggtcgtcgtttaag/77
tattttcggtgtcgtttaag/78
tattttcggtcgtcgtttaag/79
ttttggttgttgttaagattt/65 tttcggttgttgttaagattt/80 1150-1170
ttttggtcgttgttaagattt/81
ttttggttgtcgttaagattt/82
tttcggtcgttgttaagattt/83
ttttggtcgtcgttaagattt/84
tttcggttgtcgttaagattt/85
tttcggtcgtcgttaagattt/86
taagatttattgaggagtttt/89 taagatttatcgaggagtttt/88 1162-1182
tgttttagag tgtgtgtgaag/90 tgttttagag cgtgtgtgaag/91 1192-1212
tgttttagag tgtgcgtgaag/92
tgttttagag tgtgtgcgaag/93
tgttttagag cgtgcgtgaag/94
tgttttagag cgtgtgcgaag/95
tgttttagag tgtgcgcgaag/96
tgttttagag cgtgcgcgaag/97
ttagaggtgtgtgaagtgat/98 ttagagcgtgtgtgaagtgat/99 1196-1216
ttagagtgtgcgtgaagtgat/100
ttagagtgtgtgcgaagtgat/101
ttagagcgtgegtgaagtgat/102
ttagagcgtgtgcgaagtgat/103
ttagagtgtgcgcgaagtgat/104
ttagagcgtgcgcgaagtgat/105
agagtgtgtgtgaagtgattt/106 agagcgtgtgtgaagtgattt/107 1198-1218
agagtgtgcgtgaagtgattt/108
agagtgtgtgcgaagtgattt/109
agagcgtgcgtgaagtgattt/110
agagcgtgtgcgaagtgattt/111
agagtgtgcgcgaagtgattt/112
gagcgtgcgcgcaagtgattt/113
atttagaatttgggttttagg/114 atttagaattcgggttttagg/115
atttagaggttgtgagtgtag/116 atttagaggtcgcgagcgtag/117
atttagaggtcgtgagtgtag/118
atttagaggttgcgagtgtag/119
atttagaggttgtgagcgtag/120
atttagaggtcgcgagtgtag/121
atttagaggtcgtgagcgtag/122
atttagaggttgcgagcgtag/123
atttagaggtcgcgagcgtag/124
atttagaggttgtgagtgtag/125 Ttagaggtcgcgagcgtagta/126
Ttagaggtcgtgagtgtagta/127
Ttagaggttgcgagtgtagta/128
Ttagaggttgtgagcgtagta/129
Ttagaggtcgcgagtgtagta/130
Ttagaggtcgtgagcgtagta/131
Ttagaggttgcgagcgtagta/132
ttagaggtcgcgagcgtagta/133
aggttgtgagtgtagtatttt/134 Aggtcgcgagcgtagtatttt/135
Aggtcgtgagtgtagtatttt/136
Aggttgcgagtgtagtatttt/137
Aggttgtgagcgtagtatttt/138
Aggtcgcgagtgtagtatttt/139
Aggtcgtgagcgtagtatttt/140
Aggttgcgagcgtagtatttt/141
aggtcgcgagcgtagtatttt/142
tagtattttttggtgttagtt/143 tagtattttttggcgttagtt/144
tagtatttttcggtgttagtt/145
tagtatttttcggcgttagtt/146
tagtattttttggtgttagtttgt/147 tagtattttttggcgttagtttgt/148
tagtatttttcggtgttagtttgt/149
tagtatttttcggcgttagtttgt/150
실시예4
본 발명의 교시에 따라 확인된 염색체 21 상염색체성 삼염색체용 추정 표식자
전술한 바와 같이, 증폭된 염색체 또는 염색체 부위 상에 위치한 유전자들은 아마도 특이적 유전자의 침묵을 초래하는 상류 프로모터의 메틸화로 인하여 보통 과발현되지 않는다.
하기 표 18은 다운 증후군을 지닌 피험체로부터 수득한 양수 세포 대 정상적인 피험체로부터 수득한 양수 세포에서의 염색체 21 유전자 발현의 비율을 나타내고 있다. A X<1.5 비율은 유전자 침묵을 표시한다
(www.hgu.mrc.ac.uk/Research/Cellgen/Supplements/LUnigene/t2lall.htm).
[표 18]
유전자 명칭 수탁 번호 비율 위치 CpG섬 약자
아밀로이드 베타 (A4) 선구체 단백질 (프로테아제 넥신-III, 알츠하이머 질환) M28373 1.38 21q21.3 Y APP
ATP-결합 카세트, 서브패밀리 G (WHITE) 멤버 1 AF038175 1.23 21q22.3 Y ABCG1
자가면역 조절자(자가면역 다선성 내분비 부전증형(automimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dystrophy)) AJ009610 1.12 21q223 Y A1RE
BTB 및 CNC 상동성 1, 염기성 루이신 지퍼 전사 인자 1 AI830904 1.02 21q22.11 Y BACH1
BTG 패밀리, 멤버 3 BE896159 1.83 21q21.1-q21.2 Y BTG3
카르보닐 리덕타제 1 AP000688 1.28 21q22.13 CBR1
카르보닐 리덕타제 3 AB003151 1.06 21q22.2 Y CBR3
크로마틴 조립 인자 1, 서브유닛 B (p60) NM_00544121 0.97 q22.13 Y CHAF1B
염색체 21 전사 해독틀 (open reading frame) 18 AB004853 1.08 21q22.12 Y C21 또는 f18
염색체 21 전사 해독틀 (open reading frame) 18 AA984919 0.99 21q22.12 Y C21 또는 f18
염색체 21 전사 해독 (open reading frame) 2 AP001754 0.89 21q22.3 Y C21 또는 f2
콜라겐, 타입 VI, 알파 1 X99135 1.58 21q22.3 Y COL6A1
콜라겐, 타입 VI, 알파 2 AI635289 1.23 21q22.3 Y COL6A2
콜라겐, 타입 XVIII, 알파 I AF018081 1.17 21q22.3 Y COL18A1
콕사키 바이러스 및 아데노바이러스 수용체 AI557255 1.23 21q22.3 Y CXADR
시스타틴 B (스테핀 B) BF341232 1.94 21q22.3
염색체 21 (유일한) 2056 발현 서열 상의 DNA 세그먼트 AL137757 1.07 21q22.3 Y D21S2056E
다운 증후군 세포 부착 분자 AF217525 0.9 21q22.2 Y DSCAM
다운 증후군 임계 부위 유전자 1 U85267 0.82 21q22.12 Y DSCR1
다운 증후군 임계 부위 유전자 3 D87343 1.19 21q22.2 Y DSCR3
f-박스 및 WD-40 도메인 단백질 1B AA436684 0.9 21q22.11
글루타메이트 수용체, 이오노트로픽, 카이네이트 I NM_000830 0.96 21q21.3 Y GRIK1
HMT1 (hnRNP 메틸트란스퍼라제, S. 세제비지아에)-유사체 1 NM_001535 1.15 21q22.3 Y HRMT1L1
홀로카르복실라제 신세타제(비오틴- [프로프리오닐-코엔자임 A-카르복실라제 (ATP-가수분해)] 리가제) D87328 0.95 21q22.13 Y HLCS
인테그린, 베타 2 (항원 CD18 (p95), 임파구 기증-연합 항원 1: 대식세포 항원 1 (mac-1) 베타 서브유닛) X64072 0.83 21q22.3 Y ITGB2
인터페론 (알파, 베타 및 오메가) 수용체 1 AU137565 0.94 21q22.11 Y IFNAR1
인터페론 (알파, 베타 및 오메가) 수용체 2 L41943 1.28 21q22.11 Y IFNAR2
인터페론 감마 수용체 2 (인터페론 감마 전환자(transducer) 1) U05875 1.41 21q22.11 Y IFN
인터페론 감마 수용체 2 (인터페론 감마 전환자(transducer) 1) U05875 1.41 21q22.11 Y
인터루킨 10 수용체, 베타 Z17227 0.97 21q22.11 Y IL10RB
인터섹틴 1 (SH3 도메인 단백질) AI033970 0.95 21q22.11 Y
KIAA0653 단백질 A1421115 1.32
미니클로모좀 유지 결핍 (S. 세레비지아에) 3-연합 단백질 AB011144 1.14 21q22.3 Y MCM3AP
믹소바이러스 (인플루엔자) 내성 1, 쥐의 동족체 (인터페론- 유도성 단백질 p78) NM_002462 1.19 21q22.3 Y MX1
믹소바이러스 (인플루엔자) 내성 2, 쥐의 동족체 M30818 1.03 21q22.3 N MX2
신경 세포 부착 분자 2 U75330 1.07 21q21.1 N NCAM2
핵 수용체 상호작용 단백질 1 AF248484 1.3 21q11.2 N NRIP1
PBX/노티드(knotted) 1 호메오박스 1 Y13613 0.96 21q22.3 Y PKNOX1
페리센트린 AB007862 0.93 21q22.3 Y PCNT2
포스포프럭토키나제, 간 AL041002 1.29 21q22.3 Y PFKL
포스포리보실글리신아미드 포르밀트란스퍼라제, 포스포리보실글리신아마이드 신세타제, 포스포리보실아미노이미다졸 신세타제 AA436452 0.98 21q22.11
뇌하수체 종양-변형 1 상호작용 단백질 BE795643 1.58 21q22.3 Y PTTG1IP
칼륨 내부적 정류 채널 (potassium inwardly-rectifying channel), 서브패밀리 J, 멤버 15 U73191 1.42 21q22.13 N KCNJ15
프로테아제, 세린, 7 (엔테로키나제) U09860 0.87 21q21.1
PWP2 (주기성 트립토판 단백질, 효모) 동족체 AP001753 0.95 21q22.3 Y PWP2H
피리독살l (피리독신, 비타민 B6) 키나제 BE742236 1.5 21q22.3 Y PDXK
runt-연관 전사 인자 1 (급성 골수성 백혈병1; aml1 종양유전자) D43968 0.89 21q22.12 Y RUNX
S100 칼슘-결합 단백질, 베타 (신경) AV701741 1.21 21q22.3 Y S100B
SH3 도메인 결합 글루탐산-풍부 단백질 BE501723 0.96 21q22.2 N SH3BGR
단일 성격 (초파리) 동족체 2 U80456 1.32 21q22.13 Y SIM2
SMT3 (mif two 3의 억제자, 효모) 동족체 1 W55901 1.34 21q22.3 Y SMT3H1
SON DNA 결합 단백질 X63071 0.92 21q22.11 SON
슈퍼옥사이드 디스뮤타제 1, 가용성 (근위축성 측삭 경화증 1 (성인)) AI421041 1.04 21q22.11 Y SOD1
신나프토야닌 1 NM_003895 0.97 21q22.11 Y SYNJ1
테트라트리코폴리펩티드 반복체 도메인 3 D84294 1.23 21q22.13 N TTC3
일시적 수용체 잠재 채널 7 AB001535 0.97 21q22.3 Y TRPM2
경막 프로테아제, 세린 2 U75329 1.16 21q22.3 Y TMPRSS2
경막 단백질 1 U61500 0.95 21q22.3 Y TMEM1
트립토판 풍부 염기성 단백질 NM_004627 1.39 21q22.3 Y WRB
유비퀴틴-접합 효소 E2G 2 (효모 UBC7와 동족성) AL163300 0.99 21q22.3 Y
v-ets 조류 적아세포증 바이러스 E26 종양 유전자 동족체 2 AF017257 0.98 21q22.2 Y ETS-2
상기 표 18로부터, 염색체 21의 유전자가 삼염색체 상태로 다양하게 발현되고 있다는 것이 명백히 나타나고 있다; 특정 유전자들은 매우 과도하게 발현되고 (즉, 비율 X=1.5; 예를 들어, PDXK) 반면, 다른 것들은 낮게 발현되어 있다 (즉, 비율 X <1; 예를 들어, DSCAM). 이러한 다양성의 이유는 메틸화된 CpG 부위의 갯 수 일 수 있다. 따라서, 예를 들어, 1.2 비율은, 과도한 대립형질에서의 CpG 부위 모두가 메틸화되지않은 반면, 여전히 메틸화된 것들은 1.5배 과발현 (예를 들어, 세 개 대립 형질의 최대 과발현)을 방지한다 것을 제시하고 있다.
실시예 5
염색체 21 삼염색체에서 부분적으로 메틸화되는 염색체 21의 DSCAM 및 IFNARI 유전자
실시예 5a
DSCAM
다운 증후군 세포 부착 분자 (DSCAM) 유전자 (GenBank 수탁 번호: AF217525)을 선택하여 염색체 21 삼염색체에서의 부분적으로 침묵된 유전자 (예, X <1. 5)의 메틸화 패턴을 나타내었다.
DSCAM 엑손 1의 상류에 있는 CpG 섬의 메틸화는 DS 환자에서 이러한 유전자의 과발현을 저해할 것이라고 가정하였다. DSCAM 프로모터의 천연 서열이 도 4a에 도시되어 있다. 바이설파이트 처리 후 수득한 추정 서열이 도 4b에 도시되어 있다.
실험 과정
세포 - 건강한 및 DS 감염된 배아로부터 얻은 12일간 배양된 양막 세포를 코리엘 인스티튜트 엔제이(Coriell Instiute NJ)로부터 얻었다. DS 세포 Cat. No. GM02067. 정상세포 Cat. Nos.
DNA 추출 - 상기 실시예 3 참조.
서열분석에 기반한 DSCAM 메틸화 분석 - 하기 표 19 내지 21에 건강한 피험체 및 다운 증후군을 지닌 피험체로부터 얻은 조직 및 세포로부터 DSCAM 을 증폭하는데 사용된 프라이머 및 PCR 조건이 기재되어 있다.
하기 표 19에 기재된 프라이머 및 상기 표 14에 기재된 반응 혼합물 시약 및 농도를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다.
[표 19]
프라이머 명칭 프라이머 서열 (5'-3')/서열 번호: 위치 (AL163283)
DSCAM-fl-bis GTTATATGGATTTTTTTGTTAATTTTTTTT/87 333350-333379
DSCAM-rl-bis TCTCTACTACTACTTTAAAACTACAAAAC/151 333456-333481
DSCAM-nes-fl-bis GGTTTTAGTTATATGGATTTTTTTGTTAAT/152 333344-333373
[표 20] - 단계 1
온도 시간 주기 횟수
94℃ 4분
94℃ 45초 35
52℃ 45초
72℃ 1분`
72℃ 7분
*프라이머 DSCAM-nes-fl-bis 및 DSCAM-rl-bis를 사용하여 완충액 B-DS에서 반응을 수행하였다.
결과로 나타난 PCR 생성물은 142bp 크기였다.
PCR 생성물을 두 번째 PCR 반응의 주형으로서 사용하였다 (최종 부피의 1/20).
[표 21] - 단계 2
온도 시간 주기 횟수
94℃ 4분
94℃ 45초 35
53℃ 45초
72℃ 1분
72℃ 7분
프라이머 DSCAM-tl-bis 및 DSCAM-rl-bis을 사용하여 완충액 NEB에서 반응을 수행하였다.
결과된 PCR 생성물은 135bp 크기였다. PCR 반응 혼합물을 3% 아가로즈 겔 상에 적재하였고 상기 135bp 생성물을 상기 실시예 3에서 설명한 바와 같이 정제하였다. 전술한 바와 같이 서열 분석하여, 상기 생성물의 서열을 확인하였다.
결과
DS 배아 출처의 양막세포에서 DSCAM 메틸화 상태를 서열 분석한 결과 상기 클론들의 25%가 CpG 부위 상에서 메틸화를 겪는 것으로 나타났다. 이러한 결과들은 DSCAM가 오로지 부분적으로 메틸화된 것을 나타내며, DSCAM 메틸화를 검출하는데 올리고뉴클레오타이드 마이크로어레이를 사용하는 것이 바람직하다는 것을 제시하고 있다.
DSCAM 메틸화를 검출하는데 적합한 올리고뉴클레오타이드는 하기 표 22에 기재되어 있다.
[표 22]
WT탐색자(5'-3')/서열번호: 메틸화탐색자(5'-3')/서열번호: 염색체 (UCSC No.) 및 AL163283 클론에서의 위치
tttttgtttgtgagtcgggtg/246 tttttgtttgcgagttgggtg/153 41139457-41139477 333376-333396
ttttgtttgtgagtcgggtg/154
ttttgtttgtgagttgggcg/155
ttttgtttgcgagtcgggtg/156
ttttgtttgcgagttgggcg/157
ttttgtttgtgagtcgggcg/158
ttttgtttgcgagtcgggcg/159
gtttgtgagttgggtgagtga/160 gtttgcgagttgggtgagtga/161 41139462-41139482 333381-333401
gtttgtgagtcgggtgagtga/162
gtttgtgagttgggcgagtga/163
gtttgcgagtcgggtgagtga/164
gtttgcgagttgggcgagtga/165
gtttgtgagtcgggcgagtga/166
gtttgcgagtcgggcgagtga/167
gtgagttgggtgagtgaagttg/168 gcgagttgggtgagtgaagttg/169 41139475-41139495 333394-333414
gtgagtcgggtgagtgaagttg/170
gtgagttgggcgagtgaagttg/171
gtgagttgggtgagtgaagtcg/172
gtgagttgggcgagtgaagtcg/173
gtgagtcgggtgagtgaagtcg/174
gcgagttgggtgagtgaagtcg/175
gtgagtcgggcgagtgaagttg/176
gcgagttgggcgaqtgaagttg/177
gcgagtcgggcgagtgaagtcg/178
gcgagtcgggtgagtgaagttg/179
gcgagtcgggcgagtgaagttg/180
gcgagtcgggtgagtgaagtcg/181
gcgagttgggcgagtgaagtcg/182
gcgagtcgggcgagtgaagtcg/183
tgagtgaagttgagtgtggag/184 cgagtgaagttgagtgctggag/185 41139476-41139496 333395-333415
tgagtgaagtcgagtgtggag/186
tgagtgaagttgagcgtggag/187
tgagtgaagttgagtgcggag/188
cgagtgaagtcgagtgtggag/189
tgagtgaagttgagcgcggag/190
tgagtgaagtcgagtgcggag/191
cgagtgaagttgagcgtggag/192
tgagtgaagtcgagcgtggag/193
cgagtgaagttgagcgtggag/194
cgagtgaagtcgagcgtggag/195
tgagtgaagtcgagcgcggag/196
cgagtgaagttgagcgcggag/197
cgagtgaagtcgagtgcggag/198
cgagtgaagtcgagcgcggag/199
tgaagttgagtgtggaggtga/200 tgaagtcgagtgctggaggtga/201 41139480-41139500 333399-333419
tgaagttgagcgtggaggtga/202
tgaagttgagtgtggaggcga/203
tgaagttgagtgcggaggcga/204
tgaagttgagcgtggaggcga/205
tgaagtcgagtgtggaggcga/206
tgaagttgagcgcggaggtga/207
tgaagtcgagtgcggaggtga/208
tgaagtcgagcgtggaggtga/209
tgaagtcgagcgcggaggtga/210
tgaagtcgagcgtggaggcga/211
tgaagtcgagtgcggaggcga/212
tgaagttgagcgcggaggcga/213
tgaagtcgagcgcggaggcga/214
aagttgagtgtggaggtgagt/215 aagtcgagtgctggaggtgagt/216 41139481-41139501 333401-333421
aagttgagcgtggaggtgagt/217
aagttgagtgtggaggcgagt/218
aagttgagtgcggaggcgagt/219
aagttgagcgtggaggcgagt/220
aagtcgagtgtggaggcgagt/221
aagttgagcgcggaggtgagt/222
aagtcgagtgcggaggtgagt/223
aagtcgagcgtggaggtgagt/224
aagtcgagcgcggaggtgagt/225
aagtcgagcgtggaggcgagt/226
aagtcgagtgcggaggcgagt/227
aagttgagcgcggaggcgagt/228
aagtcgagcgcggaggcgagt/229
agtgtggaggtgagtagggat/230 gtgcggaggtgagtagggat/231 41139488-41139508 333407-333427
gcgtggaggtgagtagggat/232
gtgtggaggcgagtagggat/233
gtgcggaggcgagtagggat/234
gcgtggaggcgagtagggat/235
gcgcggaggtgagtagggat/236
gcgcggaggcgagtagggat/237
tgtttttggttgttggggtgt/238 tgtttttggtcgttggggtgt/239 41139517- 41139537 /333436-333456
tgtttttggttgttggggcgt/240
tgtttttggtcgttggggcgt/241
gttgttggggtgttttgtagt/242 gtcgttggggtgttttgtagt/243 41139525-41139545 333444-333464
gttgttggggcgttttgtagt/244
gtcgttggggcgttttgtagt/245
실시예 5b
IFNAR1
상기 표 18에서 나타난 바와 같이, 인터페론 (알파, 베타 및 오메가) 수용체 1 (IFNAR1, GenBank 수탁 번호: AU137565)은 염색체 21 삼염색체에서 부분적으로 침묵 되어 있는 것이 명백하다. IFNAR1의 메틸화 패턴을 실시예 5a에서 설명한 바와 같이 세포 및 조직에서 조사하였다. IFNAR1 프로모터의 천연 서열이 도 5a에 제시되어 있다. 바이설파이트 처리 후 수득한 추정 서열이 도 5b에 제시되어 있다.
실험 과정
세포 - 상기 참조.
DNA 추출 - 상기 실시예 3 참조.
서열 분석에 기초한 DSCAM 메틸화의 분석 - 하기 표 23 내지 25는 건강한 피험체 및 다운 증후군에 걸린 피험체로부터 수득한 조직과 세포로부터 IFNAR1을 증폭하는데 사용된 프라이머 및 PCR 조건들을 기재하고 있다.
하기 표 23에 기재된 프라이머 및 상기 표 14에 설명된 반응 혼합물 시약 및 농도를 사용하여 PCR 반응을 수행하였다.
[표 23]
프라이머 명칭 (AY654286)에서의 위치 서열(5'-3')/서열 번호:
IFNR-f4-bis 1327-1351 TTTTAGTTTTATTTGGTTTTTAGG'P/247
IFNR-r4-bis 1372-1396 AAAAAACCTTAACCTTCACAAAATC/248
IFNR-nes-f-bis 1533-1557 ATTGTTTAAGATTTTAGGGTTAGTA/249
[표 24] - 단계 1
온도 시간 주기 횟수
94℃ 4분
94℃ 45초 35
54℃ 45초
72℃ 1분
72℃ 7분
프라이머 IFNR-f4-bis 및 IFNR-r4-bis를 사용하여 완충액 B-DS에서 반응을 수행하였다.
결과된 PCR 생성물은 231bp 였다.
PCR 생성물을 두 번째 PCR 반응용 주형으로서 사용하였다 (최종 부피의 1/20).
[표 25] - 단계 2
온도 시간 주기 횟수
94℃ 4분
94℃ 45초 35
56℃ 45초
72℃ 1분
72℃ 7분
프라이머 IFNR-nes-t-bis 및 IFNR-r4-bis를 사용하여 완충액 NEB에서 반응을 수행하였다.
결과된 PCR 생성물은 186bp 크기였다.
PCR 반응 생성물을 2.5% 아가로즈 겔 상에서 분리하고 186bp 생성물을 상기 실시예 3에서 설명한 바와 같이 정제하였다. 전술한 바와 같이 서열 분석하여 생 성물의 서열을 확인하였다.
결과
IFNAR1의 메틸화가 DS 샘플에서 나타났다.
전술한 바로부터, DSCAM 및 IFNAR1 메틸화 상태는 염색체 21 삼염색체에 대한 유용한 진단 표식자로서 역할을 할 수 있다는 것이 인지될 수 있다. 이러한 결과들은 염색체 21 삼염색체에서 상부조절(upregulated)되지 않는 다른 유전자가 염색체 증폭에 대한 표식자로서 또한 역할을 할 수 있다는 것을 가리킨다.
실시예 6
염색체 13 상염색체성 삼염색체에 대한 추정 표식자
하기 표 26은 삼염색체 13 유전자형 피험체로부터 수득한 양수 세포 대 정상 피험자로부터 수득한 양수 세포에서의 염색체 13 유전자 발현 비율을 나타내고 있다(www.hgu.mrc.ac.uk/Research/Cellgen/Supplements/Unigene/t13all.htm.). 흥미롭게도, 대부분의 유전자가 침묵 된 (RNA가 정상 상태 (steady state) 수준에 있는) 염색체 21 삼염색체와는 달리, 유전자 발현의 이러한 프로파일은 염색체 13에서는 발생하지 않고, 이것은 염색체 21 증폭이 활발하다는 것을 설명하고 있는 것이다.
[표 26]
유전자 명칭 수탁 번호 비율 위치
ADP-리보실트란스퍼라제(NAD+;폴리(ADP-리보즈) 폴리머라제)-유사체 1 NM_006437 1.6 13q34
ATP아제, H+/K+ 교환, 베타 폴리펩타이드 NM_000705 1.11 13q34
카르복실펩티다제 B2 (혈장) NM_001872 0.92 13q14.13
CDC16 (세포 분열 주기 16, S. 세레비지아에, 동족체) NM_003903 1.08 13q34
회질 변성, 신경성 5 NM_006493 1.5 13q22.3
응집 인자 X AL521984 1.09 13q34
콜라겐, 타입 IV, 알파 1 XM_007094 0.43 13q34
컬린(cullin) 4A AI638597 1.58 13q34
시클린(cyclin) A1 NM_003914 1.06 13q13.3
시클린-의존성 키나제 8 BE467537 1.59 13q12
딕시훈트 (초파리) 동족체 NM_004392 1.69 13q21.33
DnaJ (Hsp40) 동족체, 서브패밀리 C, 멤버 3 AW772531 1.22 13q32.1
더블코르틴(doublecortin) 및 CaM 키나제-유사체 1 NM_004734 1.4 13q13.3
엔도셀린(endothelin) 수용체 타입 B BE837728 1 13q22.3
적출 수리 교차-상보 설치류 수리 결핍증 (excision repair cross-complementing rodent repair deficiency), 상보 (complementation) 그룹 5 (색소성 건피증, 상보 그룹 G (콕카인 증후군)) NM_000123 1.12 13q33.1
FERM, RhoGEF (ARHGEF) 및 플렉스트린(pleckstrin) 도메인 단백질 1 (콘드로사이트-유도) BF793662 1.19 13q32.2
섬유아 세포 성장 인자 9 (신경교-활성 인자) AI869879 0.98 13q12.11
fms-연관 티로신 키나제 1 (혈관 내피 성장 인자/혈관 투과성 인자(vascular permeability factor) 수용체) NM_002019 1.73 13q12.3
fms-연관 티로신 키나제 1 (혈관 내피 성장 인자/혈관 투과성 인자(vascular permeability factor) 수용체) NM_002019 1.73 13q12.3
fms-연관 티로신 키나제 3 NM_004119 1.3 13q12.2
창머리 박스 O1A (횡문근육종(rhabdomyosarcoma)) NM_002015 1.17 13q14.11
성장 지체(arrest)-특이성 6 NM_000820 0.76 13q34
인간 BRCA2 부위, mRNA 서열 CG011 U50536 0.67 13ql3.1
성장 I 패밀리, 멤버 1의 저해체 AF181850 0.99 13q34
인테그린, 베타-유사체 1 (EGF-유사 반복체 도메인들을 내포) NM_004791 0.68 13q33.1
카리요페린(karyopherin) 알파 3 (임포틴(importin) 알파 4) NM_002267 1.11 13q14.2
클로토(klotho) NM_004795 1.44 13q13.1
리가제 IV, DNA, ATP-의존성 NM_002312 1.3 13q33.3
리포마 HMGIC 융합 파트너 N67270 1.05 13q13.3
임파구 세포질 단백질 1 (L-프라스틴(plastin)) BF035921 0.98 13q14.13
미토콘드리아성 매개 펩티다제 AA524277 0.88 13q12.12
미토콘드리아성 번역 방출 인자 1 AI884353 0.99 13q14.11
미오튜불라린 연관 단백질 6 AW205652 1.63 13q12.13
조골세포 특이성 인자 2 (파스식클린(fasciclin) I-유사체) N71912 1.91 13q13.3
페록시레독신 (peroxiredoxin) 2 AL523978 1.11
프로피오닐 코엔자임 A 카르복실라제 알파 폴리펩타이드 NM_000282 1.22 13q32.3
단백질 포스파타제 1, 조절적 (저해체) 서브유닛 2 AI141349 1.57
퓨린성 (purinergic) 수용체 (패밀리 A 그룹 5) AI823889 1.25 13q14.2
복제 인자 C (활성체 1) 3 (38kD) AA907044 0.96 13q13.2
ret 핑거 단백질 2 AL526890 1.25 13q14.2
망막아종 1 (골육종 포함) NM000321 1.65 13ql4.2
시엘린 (sciellin) AK025320 0.95 13q22.3
세린/트레오닌 키나제 24 (Ste20, 효모 동족체) NM_003576 1.12
세린/트레오닌 키나제 24 (Ste20, 효모 동족체) Au146392 1.06 13q32.2
용질 운반체 패밀리 10 (소듐/담즙산 공동전달자 패밀리), 멤버 2 NM_000452 1.32 13q33.1
용질 운반체 패밀리 25 (미토콘드리아성 운반체; 오르니틴 전달자) 멤버 15 AI382550 0.87 13q14.11
용질 운반체 패밀리 7 (양이온성 아미노산 전달자, y+ 시스템), 멤버 1 X57303 1.09 13q12.3
샬레보-사구나이의 강직성 실조(spastic ataxia of Charlevoix-Saguenay) (sacsin) AB018273 0.97 13q12.12
스프라우티 (sprouty) (초파리) 동족체 2 NM_005842 1.54 13q31.1
전사 인자 Dp-l NM007111 1.23 13q34
경막 9 슈퍼패밀리 멤버 2 AU131084 0.97 13q32.3
트리펩티 펩티다제 II NM_003291 1.1 13q33.1
종양 괴사 인자(tumor necrosis factor) (리간드) 슈퍼패밀리, 멤버 11 AF053712 1.14 13q14.11
Zic 패밀리 멤버 2 (홀수-짝지어진 초파리 동족체) AF188733 1.9 13q32.3
징크 핑거 단백질 198 AL138688 1.45 13q12.11
실시예 7
삼염색체 9 의 유전자 및 이의 메틸화 상태를 검출하는 데 사용될 수 있는 프라이머
삼염색체 9는 희귀한 염색체성 질환이다. 이의 특성은 태아의 성장 지체, 출생시 심장 결함, 안면 기형 (예를 들어, 낮게 처져있거나 기형적 귀), 비정상적인 소두, 신장 및/또는 생식기 기형, 골격 기형 (예를 들어, 고정 및/또는 전위 된 관절), 및/또는 뇌의 기형을 포함한다.
염색체 9 상의 p16은 세포 주기 및 흑색종, 방광 및 폐암을 포함하는 많은 병리에서 중심적 역할을 담당하고 있다. 종양 억제 유전자인 p16의 발현이 방광, 결장 및 망막아종과 같은 다양한 암에서 억제되어 있다. p16 프로모터에서의 CpG 섬을 메틸화시키면, 특정의 경우, 이러한 유전자가 불활성화되는 것에 관여한다는 것이 밝혀졌다 [Sharpless (2003) Oncogene. 22 (20): 3092-8; Virmani (2003) Methods Mol Biol. 2003; 222: 97-115].
CpG WIZ® pl6 증폭 키트 (케미콘 인터내셔날 인코포레이티드(Chemicon International, Inc.))를 사용하여 p16 프로모터의 메틸화 상태를 메틸화-특이성 PCR (MSP)로 결정한다. 상기 키트는 바이설파이트 처리 후 서열이 가장 많이 분지 되어 있는 상기 프로모터의 부위로 과녁 되는 프라이머를 포함한다. PCR 변수들은 확인되어 있어서 상기 키트의 모든 프라이머 세트들은 동일한 조건하에서 증폭된다. pl6용 대조군 게놈성 DNA 샘플들(메틸화 및 비메틸화 된)이 또한 포함되어 있다.
실험 과정
CpGenome DNA 개질 키트 (인터젠(Intergen) 뉴욕주 뉴욕시)를 사용하여 바이설파이트 전환을 수행한다. DNA 1μg을 제조자 지침에 따라서 소듐 바이설파이트로 처리한다. 전환 후, 바이설파이트-처리DNA를 총 부피 25μl에 재현탁한다.
하기 표 27에 전술한 유전자의 메틸화 상태를 검출하는데 사용되는 방법들이 요약되어 있다.
[표 27]
방법 예 삼염색체
DNA 시퀀싱 *APP, AR. pl6, DSCAM BACH1 ETS2 INFAR1 21, X, 9
제한 효소 안드로겐 수용체 X
MSP 안드로겐 수용체 X
마이크로어레이 APP 21, X
변이 검출용 상업적 키트 p16 9
명확하게 하기 위해, 개별적인 구체예의 맥락에서 설명된, 본 발명의 특징들은 또한 단일 구체예로서 통합하여 제공될 수도 있음이 이해될 것이다. 역으로, 단순하게 하기 위해, 단일 구체예의 맥락에서 설명된 본 발명의 다양한 특징들은 또한 분리 적으로 또는 임의의 적절한 조합형태로 제공될 수 있다.
비록 본 발명이 특정 구체예와 연계되어 설명되었지만, 많은 대안, 변형 및 개질들이 당해 분야의 숙련자에게는 명백하다는 것이 자명하다. 따라서, 모근 그러한 대안, 변경, 개질들은 첨부된 청구 범위의 사상 및 범위 내에 속하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 언급된 모든 출판물, 특허 및 특허 출원서들은 각 개별 출판물, 특허 또는 특허 출원이 참조문헌으로서 포함되어 있다고 특별히 그리고 개별적으로 표명되어 있는 것과 같은 정도로 전체적으로 본 명세서상에 참조문헌으로서 포함되어 있다. 더하여, 본 출원서에서 나타난 임의의 참조 문헌의 인용 또는 확인은 그러한 참조 문헌이 본 발명에 선행기술로서 이용 가능하도록 허용된 것으로 해석되어서는 안 될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Trisogen Biotechnology Limited Partnership <120> METHODS AND KITS USEFUL FOR DETECTING AN ALTERATION IN A LOCUS COPY NUMBER <130> <160> 249 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 1 tggttttaga tttttttttt tattg 25 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 2 acctaccact accaaaaaaa ctaac 25 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 3 tattttttgg tgtta 15 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 4 tatttttcgg tgtta 15 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 5 gagggggtgt gtggg 15 <210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Single strand DNA oligonucleotide <400> 6 gagggggcgt gtggg 15 <210> 7 <211> 15 <212> DNA 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Claims (23)

  1. 좌위 복제 수에서 변동을 확인하는 방법에 있어서, 상기 좌위에서의 적어도 하나의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함하는 것으로서, 상기 적어도 하나의 유전자의 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태는 상기 좌위 복제 수에서의 변동을 나타내는 것인, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 좌위 복제 수에서의 변동은 이수성 및 배수성으로 구성되는 군으로부터 선택되는 염색체성 이상으로부터 결과되는, 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정짓는 단계는:
    (i) 제한 효소 절단 메틸화 검출;
    (ii) 바이설페이트-기반 메틸화 검출;
    (iii) 질량 분광분석;
    (iv) 서열 분석; 및/또는
    (v) 마이크로어레이 (microarray) 분석으로 수행되는, 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 좌위는 염색체 1, 염색체 2, 염색체 3, 염색체 4, 염색체 5, 염색체 6, 염색체 7, 염색체 8, 염색체 9, 염색체 10, 염색체 11, 염색 체 12, 염색체 13, 염색체 14, 염색체 15, 염색체 16, 염색체 17, 염색체 18, 염색체 19, 염색체 20, 염색체 21, 염색체 22, 염색체 X 및 염색체 Y로 구성되는 군으로부터 선택된 염색체상에 위치하는, 방법.
  5. 피험체에서 좌위 복제 수에서의 변동을 확인하는 방법에 있어서:
    (a) 상기 피험체의 염색체성 DNA를 수득하고; 및
    (b) 상기 염색체성 DNA의 좌위에서 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함하는 것으로서, 상기 적어도 하나의 유전자의 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태는 상기 좌위의 복제 수에서의 변동을 나타내며, 이로써 상기 피험체에서 좌위 복제 수에서의 변동을 확인하는, 방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계는:
    (i) 제한 효소 절단 메틸화 검출; 및
    (ii) 바이설페이트-기반 메틸화 검출;
    (iii) 서열 분석; 및/또는
    (iv) 마이크로어레이 분석에 의해 수행되는, 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 좌위는 염색체 1, 염색체 2, 염색체 3, 염색체 4, 염색체 5, 염색체 6, 염색체 7, 염색체 8, 염색체 9, 염색체 10, 염색체 11, 염색체 12, 염색체 13, 염색체 14, 염색체 15, 염색체 16, 염색체 17, 염색체 18, 염색체 19, 염색체 20, 염색체 21, 염색체 22, 염색체 X 및 염색체 Y로 구성되는 군으로부터 선택된 염색체상에 존재하는, 방법.
  8. 좌위 복제 수에서의 변동을 출산 전 확인하는 방법에 있어서:
    (a) 상기 좌위를 포함하는 태아 또는 배아성 염색체 DNA를 수득하고; 및
    (b) 상기 좌 위를 포함하는 상기 태아 또는 배아성 염색체 DNA에서의 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함하는 것으로서, 상기 적어도 하나의 유전자의 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태는 좌위 복제 수에서의 변동을 나타내며, 이로써 좌위 복제 수에서의 변동을 확인하는, 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 태아 또는 배아성 염색체 DNA를 수득하는 단계는:
    (i) 양수 검사;
    (ii) 태아 생검법;
    (iii) 융모 샘플링; 및/또는
    (iv) 모계 생검법에 의해 수행되는, 방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계는:
    (i) 제한 효소 절단 메틸화 검출;
    (ii) 바이설페이트-기반 메틸화 검출
    (iii) 질량 분광 분석;
    (iv) 서열 분석; 및/또는
    (v) 마이크로어레이 분석에 의해 수행되는, 방법.
  11. 다운 증후군을 출산 전 진단하는 방법에 있어서, 상기 방법은:
    (a) 태아 또는 배아 염색체 21을 수득하고; 및
    (b) 태아 또는 배아 염색체 21에서의 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계를 포함하는 것으로서, 상기 적어도 하나의 유전자는 선택되지만 다운 증후군에서 증폭되지 않으면서, 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태는 상기 태아 또는 배아 염색체 21의 증폭을 나타내며, 이로써, 다운 증후군을 출산 전에 진단하는, 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자는 APP 및 시스타치오닌-β-신타제(cystathionine-β-synthase)로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 태아 또는 배아 염색체 21을 수득하는 단계는:
    (i) 양수 검사;
    (ii) 태아 생검법;
    (iii) 융모 샘플링; 및/또는
    (iv) 모계 생검법에 의해 수행되는, 단계.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계는:
    (i) 제한 효소 절단 메틸화 검출;
    (ii) 바이설페이트-기반 메틸화 검출;
    (iii) 질량 분광 분석;
    (iv) 서열 분석; 및/또는
    (v) 마이크로어레이 분석에 의해 수행되는, 방법.
  15. (a) 증폭된 염색체성 서열 부위에서 복수의 유전자들의 메틸화 상태를 결정하고; 및
    (b) 상기 복수 개의 유전자 중 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태를 나타내는 유전자를 확인하고, 그럼으로써, 생존 양립성 유전자를 확인하는 단계를 포함하는, 생존 양립성 유전자를 확인하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 단계는:
    (i) 제한 효소 절단 메틸화 검출; 및
    (ii) 바이설페이트-기반 메틸화 검출;
    (iii) 질량 분광 분석;
    (iv) 서열 분석; 및/또는
    (v) 마이크로어레이 분석에 의해 수행되는, 방법.
  17. (a) 증폭된 염색체 서열 부위에서 복수 개의 유전자의 발현 수준을 결정하고; 및
    (b) 상기 복수 개의 유전자 중에서, 소정의 임계치 미만의 발현 수준을 나타내는 유전자를 확인하고, 이로써 생존 양립성 유전자를 확인하는 단계를 포함하는, 생존 양립성 유전자를 확인하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 복수 개의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계는 mRNA 수준에서 수행되는, 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 상기 복수 개의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계는 단백질 수준에서 수행되는, 방법.
  20. 포장물, 및 상기 포장물에 포함되어 있는 좌위 복제 수에서의 변동을 검출하기 위한 시약을 포함하는 제조 물품에 있어서, 을 제공하는바, 상기 시약은 좌위에서 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정할 수 있고, 상기 적어도 하나의 유전자의 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태는 좌위 복제 수에서 변동을 나타 내는 것인, 제조물품.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 좌위 복제 수에서의 상기 변동은 이수성 및 배수성으로 구성되는 군으로부터 선택되는 염색체성 이상의 결과로 초래되는, 제조 물품.
  22. 좌위 복제 수에서의 변동을 확인하기 위한 키트에 있어서, 상기 키트는 상기 좌위에서, APP 및 시스타치오닌-β-신타제로 구성되는 군으로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 메틸화 상태를 결정하는 시약을 포함하는 것으로서, 상기 적어도 하나의 유전자의 소정의 메틸화 상태와 상이한 메틸화 상태는 좌위 복제 수에서의 변동을 나타내는, 키트.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 좌위 복제 수에서의 변동은 이수성 및 배수성으로 구성되는 군으로부터 선택되는 염색체 이상의 결과로 초래되는, 키트.
KR1020067007622A 2003-09-22 2004-09-20 좌위 복제 수에서의 변동을 검출하기 위한 방법 및 이에유용한 키트 KR20060101470A (ko)

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