KR100884565B1

KR100884565B1 - 폐암 특이적 메틸화 마커 유전자를 이용한 폐암 진단용키트 및 칩

Info

Publication number: KR100884565B1
Application number: KR1020070031516A
Authority: KR
Inventors: 안성환; 윤치왕; 문영호; 오태정; 김명순; 김열홍
Original assignee: (주)지노믹트리
Priority date: 2006-05-11
Filing date: 2007-03-30
Publication date: 2009-02-19
Also published as: KR20070109811A

Abstract

본 발명은 폐암 특이적인 마커 유전자의 스크리닝 방법, 상기 스크리닝된 유전자를 이용한 폐암 진단용 키트 및 핵산 칩에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 폐암 형질전환 세포에서 프로모터 부위가 특이적으로 메틸화되는 폐암 특이적 마커 유전자의 스크리닝 방법, 상기 마커 유전자의 프로모터 메틸화를 확인할 수 있는 폐암 및 폐암 진행단계 진단용 키트 및 핵산 칩에 관한 것이다.

본 발명의 진단용 키트 및 진단용 핵산 칩을 이용하면, 폐암을 초기 형질전환 단계에서 진단할 수 있어, 조기진단이 가능하고, 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 폐암 및 폐암의 진행단계를 진단할 수 있다.

폐암, 메틸화, 메틸화 마커, 폐암진단, 조기진단

Description

폐암 특이적 메틸화 마커 유전자를 이용한 폐암 진단용 키트 및 칩{Diagnosis Kit and Chip for Lung Cancer Using Lung Cancer Specific Methylation Marker Gene}

도 1은 폐암마커 유전자를 선택하는 방법을 나타낸 개략도이다.

도 2는 마커 후보 유전자가 실제로 메틸화되었는지를 확인하기 위하여, 제한효소 절단 및 유전자 증폭에 의하여 메틸화를 확인하는 방법을 나타낸 개략도이다.

도 3은 디메틸화제를 처리한 후의 11개 폐암 마커의 재활성을 나타낸 것이다.

도 4는 폐암 세포주인 A549, NCI-H146 및 NCI-H358 세포에서 11개의 확인된 메틸화 유전자의 프로모터 메틸화 상태를 나타낸 것이다.

도 5는 정상인으로부터 채취한 정상 조직 및 종양조직에서의 11개 폐암마커의 메틸화 빈도를 나타낸 것이다.

도 6은 정상인으로부터 채취한 정상 조직 및 종양 부근 조직에서의 11개 폐암마커의 메틸화 빈도를 나타낸 것이다.

발명의 분야

발명의 배경

과거에는 폐암이 매우 드문 종양이었으나, 20세기에 들어서 흡연이 보편화되면서 급격히 늘기 시작하여, 서양에서는 남자와 여자 모두에서 가장 많이 발생하는 악성 종양이 되었고, 우리나라에서도 남자에서는 폐암 다음으로 많은 악성 종양이며, 여자에서도 놀랄 만큼 그 빈도가 증가하고 있는 추세이다. 이러한 폐암의 발생 빈도의 증가는 흡연, 대기오염 및 산업공해의 증가 등에 기인한다.

의학이 발달한 오늘날에도 암, 특히 대다수를 차지하는 고형암(solid tumor: 혈액암을 제외한 나머지 암)의 5년 생존율은 50% 미만이고, 전체 암환자의 약 3분의 2는 진행 단계에서 발견되며, 이들 대부분은 진단 후 2년 이내에 사망한다. 이와 같이 저조한 암의 치료 효과는 치료법의 문제만은 아니며, 실제 암을 조기에 진단할 수 있는 방법과 진행된 암을 정확히 진단하고, 치료 후 추적 조사하는 것이 용이하지 않기 때문이다.

최근, 암의 진단에 유전자검사가 적극적으로 시도되고 있다. 그 대표적 방법은 혈액에서 백혈병의 유전자 지표인 ABL:BCR(Abelson Murine Leukemia Viral Oncogene Homolog: Breakpoint cluster region) 융합 유전자의 유무를 PCR로 찾는 것이다. 또한, 암세포가 발현하는 유전자의 존재를 RT-PCR 및 블라팅으로 파악함으로써, 혈구세포 중에 함께 존재하는 암세포를 진단하는 방법도 시도되고 있다. 그러나, 상기 방법은 전립선암과 흑색종 등 일부 암에서만 적용이 가능하며, 위양성률(false positive rate)이 높고, 검사 및 판독 방법의 표준화가 어려우며, 그 유용성에도 한계가 있다 (Kopreski, M.S. et al ., Clin . Cancer Res., 5:1961, 1999; Miyashiro, I. et al ., Clin . Chem., 47:505, 2001). 또한, 최근 혈청(serum)이나 혈장(plasma)내 DNA를 사용하는 유전자 검사가 활발히 시도되고 있다. 상기 암에서 유리된 DNA를 가지고 암 유전자(oncogene)와 종양 억제 유전자의 돌연변이, 소실, 기능상실 등 암 특이적인 유전자 이상을 분석하면 암을 진단할 수 있다.

한편, 폐암 환자에서 객담이나 기관지 폐포 세척액(bronchoalveolar lavage) 내에 존재하는 암세포 및 암 유전자의 존재를 유전자 검사나 항체 검사로 찾는 방법이 시도되고 있다 (Palmisano, W.A. et al ., Cancer Res., 60:5954, 2000; Sueoka, E. et al ., Cancer Res., 59:1404, 1999). 그러나, 다수 유전자의 이상을 동반하고, 다양한 변이를 보이는 암을 정확하게 진단하기 위해서는 다수 유전자를 동시에, 그리고 정확하게 자동분석할 수 있는 방법이 요구되나, 아직 이러한 방법은 정립되어 있지 않다.

이에, 최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있는데, DNA 메칠화는 주로 특정 유전자의 프로모터 부위의 CpG 섬(CpG island)의 사이토신(cytosine)에서 일어나고, 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 차단되는 것으로, 종양억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화를 검색하는 것이 암 연구에 큰 도움이 되며, 이를 메틸화 특이 PCR(이하, MSP라고 함)이나 자동염기분석 등의 방법으로 검사하여 암의 진단과 스크리닝 등에 이용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다.

프로모터 CpG 섬의 메틸화가 발암을 직접 유발하는지, 또는 발암에 2차적인 변화인지에 대한 논란이 있으나, 여러 암에서 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene), DNA 수선 유전자(DNA repair gene), 세포 주기 조절 유전자 등이 과메칠화(hyper-methylation)되어 있어 이들 유전자의 발현이 차단되어 있다는 것이 확인되었으며, 특히 암 발생의 초기 단계에서 특정 유전자의 프로모터 부위에 과메칠화가 일어난다는 것은 주지의 사실이다. 따라서, 종양관련 유전자의 프로모터 메틸화가 암의 중요한 지표이며, 이는 암의 진단 및 조기진단, 발암 위험의 예측, 암의 예후 예측, 치료 후 추적조사, 항암요법에 대한 반응 예측 등 다방면으로 이용될 수 있다. 실제 혈액이나 객담, 침, 대변, 소변 등에서 종양 관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다 (Esteller, M. et al ., Cancer Res ., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedez, M. et al ., Cancer Res., 60:892, 2000; Ahlquist, D.A. et al ., Gastroenterol ., 119:1219, 2000).

현재, 폐암의 진단은 여러 가지 검사를 통해서만 가능하며, 폐암으로 의심되는 증상이 있을 경우, 흉부 촬영 검사, 현미경적 검사, 비디오경 검사, 생검, 전이여부 확인 검사 등을 통해 폐암인지 여부를 가려내어 그 진행 정도 등을 판단한다. 그러나, 상기 진단방법은 고가의 장비, 고비용, 검체 채취에 어려움이 있을 뿐 아니라, 폐암의 초기 진단에 부적합하다. 따라서, 폐암의 경우 종양의 크기가 3㎝ 이하인 제 1 병기의 5년 생존 가능성은 약 70%에 달한다는 것을 볼 때, 환자의 생존기간을 늘이려면 병변 범위가 작을 때 조기 진단하는 것이 가장 좋은 방법이므로, 기존의 각종 폐암 진단 방법보다 효율적인 진단 방법, 즉, 조기에 진단이 가능하고, 대용량으로 검체를 처리할 수 있으며, 민감도 및 특이도가 높은 새로운 진단에 사용할 폐암 특이적 바이오 마커의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

따라서, 본 발명자들은 대장암 특이적 발현감소 유전자 LAMA2(Laminin merosin alpha 2), FABP4(Fatty acid binding protein 4), GSTA2(Glutathione S-transferase A2), STMN2(Stathmin-like 2), NR4A2(Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2), DSCR1L1(Down syndrome critical region gene 1-like 1), A2M(Alpha-2-macroglobulin) 및 SEPP1(Selenoprotein P, plasma, 1)의 메틸화된 프로모터를 이용한 암 진단용 마이크로어레이 및 암 진단 키트에 대한 발명을 하여 출원한 바 있다 (대한민국 특허출원 10-2004-0076765).

이에, 본 발명자들은 폐암조직에서 특이적으로 메틸화되는 메틸화 관련 종양억제 유전자를 효과적으로 스크리닝하기 위하여 폐 조직 임상시료를 대상으로 형질전환 세포에서 유전자 발현 분석을 수행하였다. 이로부터 정상세포에 비하여 종양조직 세포에서 발현이 감소하는 유전자 목록을 작성하였다. 또한, 디메틸화제를 처리하지 않은 종양조직(형질전환)세포에 비하여 디메틸화제를 처리한 세포에서 더 많이 발현하는 유전자 목록을 작성하였다. 상기 두 개의 유전자 목록을 비교하여 공통되는 유전자 목록을 메틸화 관련 유전자 프로모터 마커로 선별하였다. 상기 스크리닝된 유전자 마커를 이용하여 암 및 초기 암 진행단계인 이형증으로 진단된 실제 임상시료를 이용하여 메틸화 정도를 측정하여, 이들 유전자 마커들이 폐암 및 암 세포로 형질전환이 진행중인 조직을 차별적으로 진단할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 폐암 형질전환 세포에서 프로모터 부위가 특이적으로 메틸화되는 폐암 마커 유전자의 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 프라이머 및 비메틸화 핵산을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 폐암 진단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폐암 특이적 마커 유전자의 CpG섬을 포함하는 단편과 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브를 포함하는 폐암 및 폐암 진행단계 진단용 핵산 칩을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 형질전환 세포 및 비형질전환 세포의 유전자 발현목록을 비교하여, 형질전환 세포에서 발현이 감소하는 유전자를 확인하는 단계; (b) 형질전환 세포를 디메틸화제로 처리하고, 상기 형질전환 세포의 유전자 발현목록과 디메틸화제를 처리하지 않은 형질전환 세포의 유전자 발현목록을 비교하여, 디메틸화제를 처리한 세포에서 더 많이 발현하는 유전자를 확인하는 단계; 및 (c) (a) 단계와 (b) 단계에서 공통되게 확인된 유전자를 메틸화 마커 유전자로 선정하는 단계를 포함하는 정상세포에서 폐암세포로의 세포 형질전환 여부를 확인할 수 있는 메틸화 마커 유전자의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 확인된 유전자의 서열을 검토하고, 프로모터 서열에 CpG 섬이 없는 유전자를 제외하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 디메틸화제는 5 아자 2'-데옥시씨디딘(DAC)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 암으로 형질전환된 세포에서 공통되게 확인된 유전자의 메틸화를 분석하여, 공통되게 확인된 유전자의 프로모터 부위가 메틸화된 것으로 확인된 유전자를 메틸화 마커 유전자로 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 확인된 유전자의 메틸화 분석은 (a) 증폭될 핵산 부위 내의 메틸화 부위를 포함하는 프라이머를 준비하는 단계; (b) 메틸화 특이 제한 엔도뉴클레아제로 형질전환 세포의 게놈을 처리하는 단계; 및 (c) 상기 프라이머와 상기 처리된 게놈 핵산을 접촉시켜 상기 핵산을 증폭시키되, 증폭산물이 생성되지 않는 경우, 상기 확인된 유전자를 메틸화되지 않은 것으로 간주하고, 증폭산물이 생성되는 경우, 상기 확인된 유전자를 메틸화된 것으로 선정하는 단계에 의해 수행 되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 형질전환 세포 게놈이 메틸화된 CpG 부위 및 비메틸화된 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레이즈의 이소키조머(isochizomer)를 처리한 게놈을 대조군으로 사용하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 증폭 산물의 생성은 프로브를 이용한 하이브리다이제이션에 의해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 프로브는 고체 기질 상에 고정화되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 증폭은 PCR, 리얼타임 PCR, 증폭 및 등온 효소를 이용한 선형증폭으로 구성된 군에서 선택되는 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 스크리닝된 마커 유전자의 증폭을 위한 프라이머 및 비메틸화 핵산을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 검체의 폐암 진단용 또는 폐암 진행 단계 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 비메틸화 핵산을 민감하게 절단하는 제제는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제는 MspI, HpaII, BssHII, BstUI 및 NotI으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, CDO1(NM_001801, cAMP 반응 요소 조절자, cAMP responsive element modulator); CREM(AB209533, cAMP 반응 요소 조절자, cAMP responsive element modulator); FABP4(CB999901, 지방산 결합 단백질 4, 지방세포, fatty acid binding protein 4, adipocyte); G0S2(CD511787, G0/G1 스위치 유전자, G0/G1 switch gene); HYAL1(NM_007312, 히알루노글루코사미니다아제 1, hyaluronoglucosaminidase 1); LPXN(BC034230, 루페신, leupaxin); NFKBIA(BM908726, B-세포 억제자에서 카파 라이트 폴리펩타이드 유전자의 핵 인자 인핸서, 알파, nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha); RRAD(BC057815, Ras-연관 당뇨병, Ras-related associated with diabetes); THBD(NM-000361, 트롬보모듈린, thrombomodulin); TNNC1(CF553054, 트로포닌 씨, troponin C, slow); 및 TOM1(AK097926, myb1의 타겟, target of myb1, chicken); 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 폐암 마커 유전자의 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 프라이머 및 비메틸화 핵산을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 폐암 및 폐암 진행단계 진단용 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, CDO1(NM_001801, cAMP 반응 요소 조절자, cAMP responsive element modulator); CREM(AB209533, cAMP 반응 요소 조절자, cAMP responsive element modulator); FABP4(CB999901, 지방산 결합 단백질 4, 지방세포, fatty acid binding protein 4, adipocyte); G0S2(CD511787, G0/G1 스위치 유전자, G0/G1 switch gene); HYAL1(NM_007312, 히알루노글루코사미니다아제 1, hyaluronoglucosaminidase 1); LPXN(BC034230, 루페신, leupaxin); NFKBIA(BM908726, B-세포 억제자에서 카파 라이트 폴리펩타이드 유전자의 핵 인자 인핸서, 알파, nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha); RRAD(BC057815, Ras-연관 당뇨병, Ras-related associated with diabetes); THBD(NM-000361, 트롬보모듈린, thrombomodulin); TNNC1(CF553054, 트로포닌 씨, troponin C, slow); 및 TOM1(AK097926, myb1의 타겟, target of myb1, chicken); 유전자 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택된 폐암 마커 유전자의 CpG섬을 포함하는 단편과 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브를 포함하는 폐암 및 폐암 진행단계 진단용 핵산 칩을 제공한다.

본 발명의 일 양태는 정상세포에서 폐암세포로의 세포 형질전환 여부를 확인할 수 있는 메틸화 마커 유전자의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 폐 조직에서 정상세포가 폐암세포로 형질전환되는 과정을 메틸화에 의해 조절하는 마커 유전자를 선별하였다. 메틸화 마커 유전자는 (1) 형질전환 세포 또는 세포주 및 비형질전환 세포 또는 세포주의 유전자 발현목록을 비교하고, 비형질전환 세포 또는 세포주에서 더 많이 발현되는 유전자의 목록을 분류하는 단계; (2) 형질전환 세포 또는 세포주를 메틸화 저해제로 처리하고, 처리되지 않은 형질전환 세포 또는 세포주와 비교하여, 메틸화 저해제를 처리한 형질전환 세포 또는 세포주에서 더 많이 발현되는 유전자의 목록을 분류하는 단계; 및 (3) (1) 및 (2) 단계에서 얻은 유전자 목록을 비교하여, 두 목록에 모두 존재하는 유전자를 비형질전환 상태에서 형질전환된 형태로 전환 중인 세포에서 메틸화에 의해 조절되는 마커 유전자 후보로 간주하는 단계로 구성되는 방법으로 선별하였다.

추가적인 확인 방법으로, 상기 유전자의 서열을 결정하여, CpG 서열이 존재 하는 지를 확인할 수 있고, 상기 유전자가 실질적으로 메틸화되어 있는지를 생화학적 분석을 수행하여 확인할 수 있다.

상기 선별방법으로는 폐암뿐만 아니라, 폐암으로 진행 중인 여러 이형증 단계에서 다양하게 메틸화되는 유전자를 찾아낼 수 있으며, 선별된 유전자는 폐암 스크리닝, 위험성 평가, 예측, 병명 확인, 병의 단계 진단 및 치료 타겟의 선정에도 사용될 수 있다.

폐암 및 여러 단계의 이상에서 메틸화되는 유전자를 확인하는 것은 정확하고 효과적으로 폐암을 조기 진단할 수 있게 하며, 다중 유전자를 사용한 메틸화 목록 확립 및 치료를 위한 새로운 타겟을 확인할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 메틸화 데이타는 다른 비-메틸화 연관 바이오마커 검출 방법과 연계하면 더욱 정확한 폐암 진단시스템을 확립할 수 있을 것이다.

본 발명의 상기 방법으로, 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산 바이오마커의 메틸화 단계를 결정하는 것을 포함하는 여러 단계 또는 기(期)의 폐암 진행을 진단할 수 있다. 폐암의 각 단계의 검체에서 분리된 핵산의 메틸화 단계를 폐 조직의 세포 증식성 이상을 갖지 않는 검체로부터 얻어진 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계와 비교하여, 검체의 폐암의 특정 단계를 확인할 수 있으며, 상기 메틸화 단계는 하이퍼메틸화일 수 있다.

본 발명의 일례로, 핵산은 유전자의 조절 부위에서 메틸화될 수 있다. 다른 예로, 메틸화는 유전자의 조절 부위의 외곽에서부터 시작되어 내부로 진행되기 때문에, 조절 부위의 외곽에서 메틸화를 검출하는 것으로 세포 형질전환에 관여하는 유전자를 조기 진단할 수 있다.

다른 예로, 본 발명에서는 다음 예 중의 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태를 키트 또는 핵산 칩을 이용하여 검출하는 것에 의하여, 검체에 존재하는 폐 조직의 세포 성장성 이상(이형증)을 진단할 수 있다: CDO1(시스테인 디옥시네이즈, 타입 I, cysteine dioxygenase, type I); CREM(cAMP 반응 요소 조절자, cAMP responsive element modulator); FABP4(지방산 결합 단백질 4, 지방세포, fatty acid binding protein 4, adipocyte); G0S2(G0/G1 스위치 유전자, G0/G1 switch gene); HYAL1(히알루노글루코사미니다아제 1, hyaluronoglucosaminidase 1); LPXN(루페신, leupaxin); NFKBIA(B-세포 억제자에서 카파 라이트 폴리펩타이드 유전자의 핵 인자 인핸서, 알파, nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha); RRAD(Ras-연관 당뇨병, Ras-related associated with diabetes); THBD(트롬보모듈린, thrombomodulin); TNNC1(트로포닌 씨, troponin C, slow); TOM1(myb1의 타겟, target of myb1, chicken); 유전자 및 이들의 조합.

본 발명의 진단용 키트 또는 핵산 칩을 이용하면 검체의 폐 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증 진행도)을 결정할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태를 결정하는 것을 포함하고, 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 폐 조직의 세포 성장성 이상 성향(이형증)이 없는 검체로부터 분리한 핵산의 메틸화 단계와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.

예로 들 수 있는 핵산은 CDO1(시스테인 디옥시네이즈, 타입 I, cysteine dioxygenase, type I); CREM(cAMP 반응 요소 조절자, cAMP responsive element modulator); FABP4(지방산 결합 단백질 4, 지방세포, fatty acid binding protein 4, adipocyte); G0S2(G0/G1 스위치 유전자, G0/G1 switch gene); HYAL1(히알루노글루코사미니다아제 1, hyaluronoglucosaminidase 1); LPXN(루페신, leupaxin); NFKBIA(B-세포 억제자에서 카파 라이트 폴리펩타이드 유전자의 핵 인자 인핸서, 알파, nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha); RRAD(Ras-연관 당뇨병, Ras-related associated with diabetes); THBD(트롬보모듈린, thrombomodulin); TNNC1(트로포닌 씨, troponin C, slow); TOM1(myb1의 타겟, target of myb1, chicken); 유전자 및 이의 조합.

본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 메틸화 유전자 마커를 이용하여 폐암 형성할 가능성이 있는 조직의 조기 진단이 가능하다. 암 조직에서 메틸화된다고 확인된 유전자가 임상적으로 또는 형태학적으로 정상으로 보이는 조직에서 메틸화되면, 상기 정상으로 보이는 조직은 암화가 진행되고 있는 것이다. 그러므로, 종상으로 보이는 조직에서의 폐암 특이적 유전자가 메틸화를 확인함으로, 폐암을 조기진단할 수 있다.

본 발명의 메틸화 마커 유전자를 이용하면, 검체에서 폐 조직의 세포 성장성 이상(이형증진행)을 검출할 수 있다. 상기 방법은 검체로부터 분리한 하나 이상의 핵산을 포함하는 시료를 하나 이상의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 하나 이상의 핵산에서 하나 이상의 부위의 메틸화 상태를 확인하는 것을 포함하고, 상기 핵산의 메틸화 상태는 폐 조직의 세포 성장성 이상(이형증 진행)을 가지지 않는 검체의 핵산에서의 동일한 부위의 메틸화 상태와 차이가 있는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 양태로, 상기 폐암 특이적 메틸화 마커 유전자로 확인된 유전자를 증폭하기 위한 타겟-특이적 프라이머 및 비메틸화 핵산을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 폐 이형성의 고도 이상(고위험군 이형증) 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 추가적인 양태로 상기 키트는, 안에 들어 있는 시료를 구획짓는 캐리어 수단 및 비메틸화 핵산을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 첫번째 용기와 바이오마커의 증폭을 위한 타겟-특이적 프라이머를 함유하는 두번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 마커 유전자를 스크리닝하는 다른 실시예로, (1) 형질전환 세포 및 비형질전환 세포의 유전자 발현목록을 비교하여, 형질전환 세포에서 발현이 감소하는 유전자를 확인하는 단계; (2) 형질전환 세포를 디메틸화제로 처리하고, 상기 형질전환 세포의 유전자 발현목록과 디메틸화제를 처리하지 않은 전환세포의 유전자 발현목록을 비교하여, 디메틸화제를 처리한 세포에서 더 많이 발현하는 유전자를 확인하는 단계; 및 (3) (1) 단계와 (2) 단계에서 공통되게 확인된 유전자를 메틸화 마커 유전자로 확인하는 단계를 포함하는 정상세포에서 폐암세포로의 형질전환 여부를 확인할 수 있는 메틸화 마커 유전자를 스크리닝하는 방법을 사용할 수 있다.

상기 방법은 추가적으로 상기 단계를 거쳐 스크리닝된 유전자의 서열을 확인하는 단계 및 상기 스크리닝된 유전자들 중에서 프로모터 및 엑손 1의 서열에 CpG 섬이 없는 유전자를 제외시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법에 있어서, 상기 비교는 직접 비교 또는 간접 비교에 의하여 수행될 수 있다. 상기 디메틸화제는 5 아자 3‘-디옥시시티딘(DAC, 5 aza 2'-deoxycytidine)일 수 있다. 상기 방업에서 메틸화 마커 유전자를 확인하는 방법은 형질전환된 세포에서 상기 공통되게 확인된 유전자의 메틸화를 분석하는 단계를 포함하고, 상기 공통되게 확인된 유전자의 프로모터 부위에 메틸화가 존재하는 것으로, 상기 유전자를 마커 유전자를 확정한다.

다른 양태로, 상기 방법에 따른 상기 공통되게 확인된 유전자의 메틸화의 분석은 (i) 증폭된 핵산 부위 내의 메틸화 부위를 포함하는 프라이머를 확인하는 단계, (ii) 메틸화 특이 제한 엔도뉴클레아제로 형질전환 세포의 게놈을 처리하는 단계, 및 (iii) 상기 프라이머와 상기 게놈 핵산을 접촉시켜 확인된 증폭이 성공하여 증폭산물이 생성된 것을 유전자가 메틸화된 것으로 확인하고, 증폭 산물이 생성되지 않은 것을 확인된 유전자가 메틸화되지 않은 것으로 확인하는 단계에 의해서 수행될 수 있다.

대조군으로써, 상기 형질전환 세포 게놈은 메틸화된 CpG 부위 및 비메틸화된 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레이즈의 이소키노머(isochizomer)로 처리할 수 있다.

본 발명은 다른 양태로, 상기 증폭된 핵산의 존재를 하이브리다이제이션에 의하여 검출하는 마커 유전자의 CpG섬을 포함하는 단편과 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브를 포함하는 폐암 및 폐암 진행단계 진단용 핵산 칩에 관한 것이다.

추가적으로, 상기 증폭은 PCR 또는 리얼타임 PCR, 등온 효소를 이용한 증폭 또는 선형 증폭에 의하여 수행될 수 있다. 프로모터 바깥쪽의 메틸화를 검출함으로써 세포 형질전환을 조기에 검출할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 본 발명의 키트 또는 핵산칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 형질전환된 폐암 세포를 확인할 수 있다.

본 발명의 다른 실시예로, 본 발명의 키트 또는 핵산칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 폐암의 또는 폐암의 진행 단계를 진단할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예로, 정상 표현형을 나타내는 샘플을 이용하여 본 발명의 키트 또는 핵산칩을 이용하여 마커 유전자의 메틸화를 검사하는 것에 의하여 폐암으로 진행될 수 있는 가능성을 진단할 수 있다. 상기 샘플은 고체 또는 액체 조직, 혈청 또는 플라즈마를 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예로, 폐암에서 특이적으로 메틸화되는 유전자의 메틸화 빈도를 검토하고, 폐암 진행 가능성을 가지는 조직의 메틸화 빈도를 정하는 것에 의하여, 조직의 폐암으로의 발전 가능성을 평가할 수 있다.

본 발명에서 "디메틸화 제제"는 핵산으로부터 메틸 그룹을 제거하거나, 메틸화가 일어나는 것을 억제하는 화학제제 또는 효소를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

상기 디메틸화 제제의 예로는 5-아자씨티딘(5-azacytidine), DAC(5 aza 2--deoxycytidine), 아라비노푸라노실-5-아자사이토신(arabinofuranosyl-5- azacytosine, 5-플루오로-2-데옥시사이티딘(5-fluoro-2'-deoxycytidine), 피리미돈(pyrimidone), 트리플로로메틸데옥시사이티딘(trifluoromethyldeoxycytidine), 슈도이소사이티딘(pseudoisocytidine), 디하이드로-5-아자사이티딘, AdoHcy와 같은 경쟁적 저해제로서, AdoMet/AdoHcy 아날로그, 시네펀진(sinefungin) 및 아날로그, SIBA(5'-데옥시-5'-S-이소부틸아데노신), MTA(5'-메틸티오-5'-데옥시아데노신), 에티오닌(ethionine) 아날로그와 같은 AdoMet의 수준에 영향을 미치는 약물, 메티오닌(methionine), L-cis-AMB, 사이클로류신(cycloleucine), 안티폴레이트(antifolates), 메토트레제이트(methotrexate), AdoHcy의 수준에 영향을 미치는 약물, dc-AdoMet 및 MTA와 같은 AdoHcy 하이드로레이즈(hydrolase) 저해제, 3-데자-아데노신(3-deaza-adenosine), 네플라노신 A(neplanocin A), 3-데자네플라노신(3-dezaneplanocin), 4'-티오아데노신, 3-데자-아리스테로마이신(3-deza-aristeromycin), 오르니틴 신세세이즈(ornithine synthetase) 저해제, DFMO(α-디플로로메틸오르니틴), 스퍼민(spermine) 및 스퍼미딘(spermidine) 신세세이즈의 제해제, MTA(S-메틸-5'-메틸티오아데노신), L-cis-AMB, AdoDATO, MGBG, 메틸티오아데노신 포스포릴레이즈 저해제, DFMTA(디플로로메틸티오아데노신), 메타닌(metanin), 스퍼민/스퍼미딘, 소듐 부티레이트, 프로카이나미드(procainamide), 히드랄라진(hydralazine), 디메틸술폭사이드, 자유라디칼 DNA 부가생성물, UV, 8-하이드록시 구아닌, N-메틸-N-니트로소우레아(N-methyl-N-nitrosourea), 노포비오신(novobiocine), 페놀바비탈(phenolbarnital), 벤조피렌(benzo[a]pyrene), 에틸메탄술포네이트, 에틸니트로소우레아(ethylnitrosourea), N-에틸-N'-니트로-N-니트로 소구아니딘, 9-아미노아크리딘(9-aminoacridine), 니트로젠 머스타드(nitrogen mustard), N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘, 디에칠니트로사민(diethylnitrosamine), 클로덴(chlordane), N-아세톡시-N-2-아세틸아미노플로렌(N-acetoxy-N-2-acethylaminofluorene), 아플라톡신 B1, 날리디직 산(nalidixic acid), N-2-플루오레닐아세타민(N-2-fluorenylacetamine), 3-메틸-4'-(디메틸아미노)아조벤젠, 1,3-비스(2-클로르에틸)-1-니트로소우레아, 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 6-멀캡토푸린, 4-니트로퀴놀린-1-옥사이드, N-니트로소디에틸아민, 헥사메틸렌비스아세타미드(hexamethylenebisacetamide), 레티오닉 산, cAMP와 레티오닉 산, 방향성 탄화수소 발암물질, 디부티릴(dibutyryl) cAMP 또는 메틸트랜스퍼라아제에 대한 안티센스 mRNA를 포함하고, 이에 한정되지는 않는다 (Zingg et al., Carcinogenesis, 18:869, 1997).

본 발명에서 사용된 "세포 형질전환"은 정상에서 비정상으로, 비-종양성에서 종양성으로, 미분화에서 분화로, 줄기세포에서 비-줄기세포로와 같이 세포의 특징이 한 형태에서 다른 형태로 바뀌는 것을 의미한다. 추가적으로, 상기 형질전환은 세포의 형태, 표현형, 생화학적 성질 등에 의하여 인식될 수 있다. 상기와 같은 세포의 형질전환에는 많은 예가 있나, 본 발명에서는 폐에서의 비정상 세포 및 암화 세포의 존재에 관한 것이고, 상기 조직의 형질전환에 대한 마커는 폐암세포로의 전환에 대한 마커이다.

본 발명에서, "직접 비교"라는 말은 한 종류의 서로 다르게 표지된 핵산과 다른 종류의 핵산의 대응 정도를 확인하기 위하여, 하나 이상의 소스(source)에서 분리된 서로 다르게 표지된 핵산 간에 프로브를 경쟁적으로 결합시키는 것을 말한다.

본 발명에서 암의 “조기 확인”전이되기 전에 암의 가능성을 발견하는 것으로, 바람직하게는 검체 조직 또는 세포에서 형태학적 변화가 관찰되기 전에 발견하는 것이다. 추가적으로, 세포 형질전환의 “조기 확인”은 세포가 형질전환되는 형태가 되기 전에 초기 단계에서 형질전환이 일어날 가능성 높은 것을 말한다.

본 발명에서 "하이퍼메틸화"는 CpG 섬의 메틸레화를 의미한다.

본 발명에서 "간접 비교"는 첫번째 소스와 두번째 소스에서 분리된 핵산에 각각 하이브리다이제이션되는 레퍼런스 프로브를 사용하여 첫번째 소스에서 분리된 핵산의 레벨과 두번째 소스에서 분리된 핵산에서 동일한 대립 유전자 레벨을 평가하고, 그 결과를 비교하여 레퍼런스 프로브와 직접적으로 경쟁 결합시키지 않고도, 샘플에 존재하는 핵산의 상대적 양을 결정하는 것이다.

본 발명에서, "샘플" 또는 "검체 샘플"은 수행되는 분석의 종류에 따라, 개개인, 체액, 세포주, 조직배양 등에서 얻어지는 모든 생물학적 샘플을 포함하는 폭넓은 범위의 샘플을 의미한다. 상기 나타낸 바와 같이, 생물학적 샘플은 정액, 림프, 체액, 혈청 플라즈마 등을 포함한다. 포유동물로부터 체액 및 조직 생검을 획득하는 방법은 통상적으로 널리 알려져 있다. 바람직한 소스는 폐의 생검(biopsy)이다.

본 발명에서 "종양 부근 조직" 또는 "짝지워진 종양 부근 조직"은 암 조직 부위의 부근에 존재하는 임상적 및 형태학적으로 정상 표현형을 나타내는 조직을 의미한다.

메틸화 조절 바이오마커의 스크리닝

본 발명에서는 세포 또는 조직이 형질전환되거나 세포의 형태가 다른 형태로 변화될 때에 메틸화되는 바이오마커 유전자를 스크리닝하였다. 여기서, "형질전환" 세포는 정상형태가 비정상형태로, 비-종양성이 종양성으로, 미분화형태가 분화형태로 바뀌는 등의 세포 또는 조직의 형태가 다른 형태로 변화되는 것을 의미한다 (도 1).

그러므로, 본 발명에서는 폐암세포로의 형질전환에서 메틸화 조절 마커 유전자를 체계적인 방법으로 확인하였다. 상기 방법의 일 양태로, (1) 형질전환된 폐암 세포 및 비형질전환 세포 또는 세포주의 유전자 발현목록을 비교하고, 비형질전환 세포 또는 세포주에서 더 많이 존재하는 유전자의 목록을 분류하는 단계; (2) 형질전환된 폐암세포 또는 세포주를 메틸화 저해제로 처리하고, 처리하지 않은 형질전환된 폐암세포 또는 세포주와 비교하여, 메틸화 저해제를 처리한 형질전환된 폐암세포 또는 세포주에서 더 많이 존재하는 유전자의 목록을 분류하는 단계; 및 (3) (1) 및 (2) 단계에서 얻은 유전자 목록을 비교하여, 두 목록에 모두 존재하는 유전자를 비형질전환 상태에서 형질전환된 폐암세포 형태로 전환 중인 세포의 게놈에서 메틸화에 의해 조절되는 마커 유전자로 간주하는 단계로 구성되는 방법을 들 수 있다.

상기에 덧붙여, 바이오마커 후보 목록을 추가로 조정하고, 상기 바이오마커 후보가 전환 조건에서 정말로 메틸화되는지를 확인하기 위하여, 핵산 메틸화 검출 어세이를 수행한다. 상기 어세이에는 DNA 단편에서의 메틸화를 검출할 수 있는 수많은 방법이 사용가능하다. 한정되지 않은 한 예로, 다음의 방법을 사용할 수 있다. 게놈 DNA를 메틸화 민감성 제한효소로 처리하고, 마커에 특이적인 유전자 서열을 가지는 프로브와 메틸화 부위를 접촉시킨다. 절단되지 않은 프로브가 결합된 부위가 검출되면, 프로브가 결합된 부위에서 메틸화가 일어났다는 것을 의미한다.

마이크로어레이 기술을 이용하여 본 발명을 실시하는 방법을 하기에 기술하였다.

(1) 형질전환 세포 발현 라이브러리 및 비 전환세포 발현 라이브러리를 바람직하게는 녹색을 띠는 Cy3 및 빨간색을 띠는 Cy5로 서로 다르게 형광표지한다. 상기 표지된 라이브러리를 알려진 유전자의 프로브 세트가 고정된 마이크로어레이에 경쟁적으로 결합시킨다. 비형질전환 세포에서 더 많이 발현된 유전자를 확인한다. 선택적으로, 간접 비교 방법을 수행한다.

(2) 형질전환 세포주를 디메틸화 제제로 처리하고, 발현 라이브러리를 형광표지로 표지한다. 또한, 디메틸화제를 처리하지 않은 전환 세포주로부터 상기와 다르게 표지된 발현 라이브러리를 얻는다. 상기 두 라이브러리를 알려진 유전자 프로브 세트가 고정된 마이크로어레이 기질에 경쟁적으로 결합시킨다. 디메틸화 제제로 처리된 형질전환 세포에서 더 많이 발현되는 유전자를 확인한다. 상기 유전자들은 디메틸화 조건에서 재활성화될 것이다. 선택적으로, 간접 비교방법을 수행한다.

(3) 상기 두가지 방법으로부터 확인된 유전자를 비교하고, 두 목록에 공통적 으로 존재하는 유전자를 선택한다.

또한, 형질전환 세포와 비형질전환 세포간 및 디메틸화제를 처리한 세포와 처리하지 않은 세포간의 유전자 발현 비교는 프로브 세트의 직접적인 경쟁결합에 의하여 수행될 수 있다. 선택적으로, 상기 비교는 간접 비교 일 수 있다. 예를 들면, 발현된 유전자를 알려진 표준비교 RNA의 프로브 세트와 각각 독립적으로 결합시킬 수 있다. 그러므로, 여러 세포로부터 발현되는 유전자의 상대적인 양을 간접적으로 비교할 수 있다. 상기 표준비교 RNA의 프로브 세트는 발현된 유전자의 완전한 세트를 포함하고 있기 때문에, 최적화되어 있다 (도 1).

(4) 유전자의 프로모터 부위 또는 엑손 1 부위의 핵산 서열에 CpG 섬이 존재하는지 확인한다. CpG 섬이 존재하지 않는 프로모터 또는 엑손 1을 가지는 유전자는 목록에서 삭제한다. 목록에 남아있는 유전자의 메틸화 수준을 측정하며, 이는 여러 가지 수단을 사용할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서는, 형질전환 세포의 게놈을 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제로 처리하고, 증폭되는 영역에 메틸화 부위가 위치하는 여러 프라이머를 사용하여 핵산 증폭을 수행하였다. 핵산 증폭 단계를 마쳤을 때, 성공적으로 증폭이 일어났다면, 이 유전자가 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제에 의하여 절단되지 않은 것이기 때문에, 메틸화가 일어난 것이다. 증폭산물이 없으면, 유전자가 메틸화 민감성 엔도뉴클레아제에 의하여 절단되었기 때문에, 메틸화가 일어나지 않은 것이다.

폐암에 대한 바이오마커

본 발명에서는 폐암 진단을 위한 바이오 마커를 제공한다.

폐암에 대한 바이오마커 -정상세포와의 비교를 위한 암세포의 용도

본 실시예에서, "정상" 세포는 비정상적 세포형태 또는 세포학적 성질의 변화를 나타내지 않은 세포를 의미한다. "종양"세포는 암 세포를 의미하고, "비종양" 세포는 병증 조직의 일부이지만, 종양 부위는 아니라고 판단되는 세포를 의미한다.

폐 종양세포의 유전자 발현목록은 마이크로 어레이의 경쟁적 하이브리다이제이션 형태로 비종양세포와 종양세포의 유전자 발현목록을 간접적으로 비교하였다. 공통된 레퍼런스 유전자 목록은 종양 부근 조직과 같은 비종양세포의 유전자 목록과 비교하였고, 또한, 공통된 레퍼런스 유전자 목록은 종양세포 유전자 목록과 비교하였다. 비종양세포와 비교하여, 종양 세포에서 억제되는 유전자를 종양억제 유전자로서 찾고 기록하였다.

선택적으로, 종양 세포로부터 얻어진 유전자 발현 목록은 종양 억제 유전자를 얻기 위하여, 마이크로어레이 하이브리다이제이션 형태에서 비종양 및/또는 정상 세포와 직접적으로 비교할 수 있다. 또한, 상기 직접 및 간접비교 방법은 모두 종약억제 유전자를 찾는데 사용될 수 있다.

이와는 별도로, 폐암 세포주 A549, NCI-H146 및 NCI-H358을 디메틸화제인 DAC으로 처리하고, 종양세포에서는 정상적으로 억제되는 유전자의 재활성(reactivation)을 분석하였다. 종양 억제 유전자 세트와 디메틸화 재활성 유전자 세트에서 중첩되는(겹치는) 유전자를 폐암 바이오마커 유전자 후보로 간주하였으 며, 48개의 중첩되는 유전자들을 찾았다. 상기 유전자들이 필수적인 CpG 섬을 가지고 있는 지를 in silico 분석을 통하여 확인하였다. CpG 섬을 가지고 있지 않은 15개의 유전자를 발견하고 목록에서 제외시켰다. 추가적으로, 33개의 남은 유전자가 종양 세포에서 분리되었을 때 실제로 메틸화되어 있는 지를 확인하기 위한 생화학적 테스트가 필요하다.

HpaII/MsPI 효소 절단/PCR(또는 효소 분해 후-PCR)과 같은 메틸화 민감성 효소/핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 분석으로 폐암세포주에서 메틸화되어 있지 않은 22개의 유전자를 제외시켰다. 후보유전자가 종양세포에서 정말로 메틸화되어 있는 지를 생화학적 방법으로 추가로 확인하기 위하여, 바이설파이트(bisulfite) 시퀀싱을 수행하였으며, 11개 유전자가 모두 메틸화되어 있는 것을 확인하였다.

상기 11개 유전자의 유전자 발현 목록을 제작하였다. 상기 11개 유전자의 발현 수준을 종양 및 종양 부근 비종양조직에서 측정하였다. 상기 유전자의 메틸화 정도 또한, 임상적 시료에서 HpaII/MsPI 효소 절단/PCR(또는 효소 분해 후-PCR)과 같은 메틸화 민감성 효소/핵산 서열 기반 증폭(NASBA) 분석을 이용하여 측정한 결과, 상기 확인된 유전자들은 정상세포에서는 메틸화되지 않았다. 그러나, 이들은 종양부근 비종양세포뿐만 아니라 종양세포에서도 메틸화되어 있었다. 도 5 및 도 6은 종양세포가 종양 부근 조직보다 더 빈번하게 메틸화된다는 것을 추가적으로 보여준다.

본 발명의 한 양태는 폐암과 다음에 기재된 11개 유전자의 프로모터 하이퍼메틸화 사이의 관련성의 발견에 기반을 둔 것이다: CDO1(시스테인 디옥시네이즈, 타입 I, cysteine dioxygenase, type I); CREM(cAMP 반응 요소 조절자, cAMP responsive element modulator); FABP4(지방산 결합 단백질 4, 지방세포, fatty acid binding protein 4, adipocyte); G0S2(G0/G1 스위치 유전자, G0/G1 switch gene); HYAL1(히알루노글루코사미니다아제 1, hyaluronoglucosaminidase 1); LPXN(루페신, leupaxin); NFKBIA(B-세포 억제자에서 카파 라이트 폴리펩타이드 유전자의 핵 인자 인핸서, 알파, nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha); RRAD(Ras-연관 당뇨병, Ras-related associated with diabetes); THBD(트롬보모듈린, thrombomodulin); TNNC1(트로포닌 씨, troponin C, slow); TOM1(myb1의 타겟, target of myb1, chicken); 유전자.

본 발명의 진단용 키트 및 핵산 칩의 다른 용도로, 검체에서 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계를 결정하여 검체의 폐 조직의 세포 성장성 이상을 조기진단할 수 있다. 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 폐 조직의 세포 성장성 이상을 가지고 있지 않은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다. 핵산은 CpG 섬과 같은 CpG-함유 핵산인 것이 바람직하다.

본 발명의 진단용 키트 및 핵산 칩의 다른 용도로, 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화를 결정하는 것을 포함하는 검체의 폐 조직의 세포 성장성 이상 소양을 진단할 수 있다. 상기 핵산은 CDO1(시스테인 디옥시네이즈, 타입 I, cysteine dioxygenase, type I); CREM(cAMP 반응 요소 조절자, cAMP responsive element modulator); FABP4(지방산 결합 단백질 4, 지방세포, fatty acid binding protein 4, adipocyte); G0S2(G0/G1 스위치 유전자, G0/G1 switch gene); HYAL1(히알루노글루코사미니다아제 1, hyaluronoglucosaminidase 1); LPXN(루페신, leupaxin); NFKBIA(B-세포 억제자에서 카파 라이트 폴리펩타이드 유전자의 핵 인자 인핸서, 알파, nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha); RRAD(Ras-연관 당뇨병, Ras-related associated with diabetes); THBD(트롬보모듈린, thrombomodulin); TNNC1(트로포닌 씨, troponin C, slow); TOM1(myb1의 타겟, target of myb1, chicken); 유전자 및 그의 조합을 코딩하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 하나 이상의 핵산의 메틸화 단계는 폐 조직의 세포 성장성 이상에 대한 소양을 가지고 있지 않은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 메틸화 상태와 비교하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 "소양"은 상기 세포성장성 이상에 걸리기 쉬운 성질을 의미한다. 소양을 가진 검체는 아직은 세포성장성 이상을 가지고 있지 않지만, 세포성장성 이상이 존재하거나 존재할 경향이 증가된 검체를 말한다.

본 발명의 다른 양태는 검체의 핵산을 포함하는 시료를 시료의 메틸화 상태를 결정할 수 있는 제제와 접촉시키고, 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화를 확인하는 것을 포함하는 검체의 폐 조직의 세포 성장성 이상을 진단하는 방법을 제공한다. 여기서, 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위의 메틸화는 세포 성장성 이상을 가지지 않는 검체의 동일한 핵산의 동일한 부위의 메틸화 단계와 다른 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 방법은 검체로부터 분리된 하나 이상의 핵산의 하나 이상의 부위 의 메틸화를 결정하는 단계를 포함한다. 여기서, "핵산" 또는 "핵산 서열"이란 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드를 의미하거나 이들의 단편, 단일가닥 또는 이중가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, 센스 또는 안티센스 가닥의 게놈 기원 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA, PNA(peptide nucleic acid) 또는 자연 기원 또는 합성 기원의 DNA 양 또는 RNA 양 물질을 말한다. 핵산이 RNA이면, 데옥시뉴클레오티드 A, G, C 및 T를 대신하여, 각각 리보뉴클레오티드 A, G, C 및 U로 대체된다는 것은 당해 분야 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명하다.

서로 다르게 메틸화된 CpG 섬의 존재를 검출할 수 있는 핵산이라면 어떤 것이 든 사용할 수 있다. 상기 CpG 섬은 핵산 서열에서 CpG가 풍부한 부위이다. 상기 핵산은 예를 들면, 하기 유전자를 코딩하는 서열을 포함한다(GenBank Acession Number를 표시하였다):

1. CDO1 (NT_0347); 시스테인 디옥시네이즈, 타입 I (Cysteine dioxygenase, type I)

앰플리콘 크기: 205bp

ctcaattttcgcaggctcctcacaattctctatttggaagaagtgtccctctccttcccttttcttttcctcctttactcagcgtcagtccccgcagccatctcctccgaccctttttgtctacgtcccagcgtcgcgaaccacagcggcggaggtggagcggggagaggcgttaggccgggcggctaaaacgcgccgttaaagt (서열번호 1)

CDO1-F: 5'-ctcaattttc gcaggctcct ca (서열번호 2)

CDO1-R: 5'-actttaacgg cgcgttttag cc (서열번호 3)

2. CREM (NT_0087); cAMP 반응 요소 조절자 (cAMP responsive element modulator

앰플리콘 크기: 245bp

accagctgtgactggctgtgaatatggaggaaaagggccactagtcaaggtatgtagatagcttttagaagtcagaagaagcacgcctgcagtcccagctactcaggaggctgaggccggaggatcgcttgagcctggggagatagaggttgcagagagccgagaccacgccactgcagcccagcctggacagaggtgagacgctcgcggaccttagcttggggttggcggcgttaggaagaaac (서열번호 4)

MTPN-F: 5'-accagctgtg actggctgtg aa (서열번호 5)

MTPN-R: 5'-gtttcttcct aacgccgcca ac (서열번호 6)

3. FABP4 (NT_0081); 지방산 결합 단백질 4, 지방세포 (Fatty acid binding protein 4, adipocyte)

앰플리콘 크기: 1,018 bp

ggatacacagtgtagcgatgcatcactctgaaatattttagtttctttttttcccctaaatctgggtatttcgtgggaatttgcagcacatgtgaacaacttctgtcattcttgcatgaggcaaagggaattgaaaaccacgattactttagaaaactagtttcacagattggtcactgtataaaagaaggatattggttttggtagcttgtgaccacacaccatttctgatctgaataaattcagaacttataatacagttcagaaattgaatgcagtttctcaatatgaggaaagtattttagaataaggcctatttttcaaaggatctgtggaaatcaatgctatgctctcatttaggagatggaaagagtgaggttaaattatcatttcgattaaatctacagtccagattactggtggatgaattgaatgtacttttttattcatataaaacatttgaaatcagaaatctggagtacttttaaatcccattatttattttgttttaatcgccaggtaattcctgagac aggagtgtcccgaagagcctttgcaattatgtaagaatctccgaggcagttcttatgttcctcaattcaaaagaaccacataactgcaatttaaataacaccccacacacacacaaaataaggtcgaagtttatctcaaaataatttcccctctctacactgggataaatatgtataggaataatagggggaaattcagtgcactgagcattaagctgtcaaaacaggaatgtttaaaatatcctgttagtggtttaaaaataatttgtactctaagtccagtgactatttgccagggagaaccaaagttgagaaatttctattaaaaacatgactcagagaaaaaaatgcagaggccggtaatgaaggaaatgattggatctcattcccaattggtcattcctaagatcacatgttctgagcatctttaaaaggaagttatctggactcaagagggtcacagcaccctcctgaaaactgcagc (서열번호 7)

MTSS1-F: 5'-ggatacacag tgtagcgatg ca (서열번호 8)

MTSS1-R: 5'-gctgcagttt tcaggagggt g (서열번호 9)

4. G0S2 (NT_0218); G0/G1 스위치 유전자 (G0/G1 switch gene)

앰플리콘 크기: 205 bp

gtcctggacaagggaagctgtgcacccgctgacaccagtaagaaggttgccgccatgtcagagatgtccgcggacacctccctgggctccgggtcctcccctgcgctcgcctggagtgggaccttcgcgtgcacactggccttcccacgcgccccgctgcgatggcacccgcgccgggccccctagctcacacagtcggagcgtg (서열번호 10)

PELI2-F: 5'-gtcctggaca agggaagctg tg (서열번호 11)

PELI2-R: 5'-cacgctccga ctgtgtgagc ta (서열번호 12)

5. HYAL1 (NT_0225); 히알루노글루코사미니다아제 1 (Hyaluronoglucosaminidase 1)

앰플리콘 크기: 215 bp

tgcagacggagtctctcaatggtgcccaggctggagtgcagtggcgtgatctcggctcgctacaacatccacctcccagcagcctgccttggcctcccaaagtgccgagattgcagcctctgcccggccgccaccccgtctgggaagtgaggagcgtctctgcctggccgcccatcgtctgggatgtgaggagcccctctgcctggctgcccagt (서열번호 13)

PLEKHF2-F: 5'-tgcagacgga gtctctcaat gg (서열번호 14)

PLEKHF2-R: 5'-actgggcagc caggcag (서열번호 15)

6. LPXN (NT_0339); 루페신 (Leupaxin)

앰플리콘 크기: 244 bp

acttggatgcggtgcctgacctagagggaggcgaaagggttgtgagcgtgacatgactggtgacctacaccgagaagctgaagggtctcttaagctctgcggccggaagccatctgcttctgcggtttatacaatagcaactttatcagaggttacttttctgcacgctagcgtatgacattaatttgtcttcctgattcatcaaagggaatttccgttgcagttggtgatgcagtgggcctct (서열번호 16)

RERG-F: 5'-acttggatgc ggtgcctgac (서열번호 17)

RERG-R: 5'-agaggcccac tgcatcacca (서열번호 18)

7. NFKBIA (NT_0264); B-세포 억제자에서 카파 라이트 폴리펩타이드 유전자의 핵 인자 인핸서, 알파 (Nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha)

앰플리콘 크기: 187 bp

aaagagggaccgcccatcaggtcggcgtccttgggatctcagcagccgacgaccccaattcaaatcgatcgtgggaaaccccagggaaagaaggctcacttgcagagggacaggattacagggtgcaggctgcagggaagtaccggggggagggggcctggtcggaaggactttccagccactcggc (서열번호 19)

THBD-F: 5'-aaagagggac cgcccatcag (서열번호 20)

THBD-R: 5'-gccgagtggc tggaaagtcc (서열번호 21)

8. RRAD (NT_0104); Ras-연관 당뇨병 (Ras-related associated with diabetes)

앰플리콘 크기: 206 bp

tcagtctcacggggccagaccgaattcttctccagagggcagttgctgcttttggctgattgggtttaccccgctgcctgcctccccatcacgtactccccccgcaacctcgctctctctctccttctcacacacaccctcagctccggacctcgcctaccggtcagcccctctattcccagacagctaccgctactcccctggcg (서열번호 22)

TP53INP1-F: 5'-tcagtctcac ggggccagac (서열번호 23)

TP53INP1-R: 5'-cgccagggga gtagcggtag (서열번호 24)

9. THBD (NT_0113); 트롬보모듈린 (Thrombomodulin)

앰플리콘 크기: 194 bp

cccccactccccattcaaagccctcttctctgaagtctccggttcccagagctcttgcaatccaggctttccttggaagtggctgtaacatgtatgaaaagaaagaaaggaggaccaagagatgaaagagggctgcacgcgtgggggc ccgagtggtgggcggggacagtcgtcttgttacaggggtgctggcc (서열번호 25)

MGC11324-F: 5'-cccccactcc ccattcaaag (서열번호 26)

MGC11324-R: 5'-ggccagcacc cctgtaacaa (서열번호 27)

10. TNNC1 (NT_0225); 트로포닌 씨 (Troponin C, slow)

앰플리콘 크기: 206 bp

atcttggccccgccttcttcctgcgccctcgccccgcccccgcgcgtgactgacaggggccactcagggcgcgcgtgcgaggtgctcgcttgcgtaatctacctgcgtggcgccgccggcggtaccctgcacagcctgctagaaactgagaccccgggtggtgacagctctgggcatcgcccctgggtcctcgggaagaggggaca (서열번호 28)

ZFHX1B-F: 5'-atcttggccc cgccttcttc (서열번호 29)

ZFHX1B-R: 5'-tgtcccctct tcccgaggac (서열번호 30)

11. TOM1 (NT_0115); myb1의 타겟 (Target of myb1, chicken)

앰플리콘 크기; 250 bp

tcttggagcggggagaccttgacatcaaacaggaagagtcttaccgggacaaggagacaacagcccagagaggctgtcacccagggtaggtgtgcagtcacagtgaggtcccaaggactaagggctatgaccctaagagtctcggcttctgtgtaactcacccaagtcacttccctggtctacgacccagtttcccaaatgtgtaaagggtcctttagacctcgccctaaaaggtcaggggcgtggctta (서열번호 31)

Forward; 5'-tcttggagcg gggagacctt (서열번호 32)

Reverse; 5'-taagccacgc ccctgacctt (서열번호 33)

상기에서 밑줄로 표시된 "ccgg"는 메틸화된 사이트를 의미하고, 또한, 메틸화 민감성 제한효소 HpaII가 인식하는 부위이다.

메틸화( methylaton )

본 발명에서의 정제되거나 정제되지 않은 형태의 어떠한 핵산도 사용될 수 있으며, 타겟부위(예를 들면, CpG-함유 핵산)를 함유하는 핵산서열을 함유하고 있거나 함유할 것으로 의심되는 어떠한 핵산도 사용될 수 있다. 차별적으로 메틸화될 수 있는 핵산 부위가 CpG 섬이고, 이는 다른 디뉴클레오티드 CpG 핵산 부위와 비교하여 높은 CpG밀도를 가지는 핵산 서열이다. 이중(doublet) CpG는 G*C 염기쌍의 비율로 예측하였을 때, 척추동물 DNA에서 단 20% 정도의 확률로 나타난다. 특정 부위에서, 이중 CpG의 밀도는 게놈의 다른 부위와 비교하여 10배나 더 높다. CpG 섬은 평균 G*C 비율이 약 60%로, 보통의 DNA의 G*C 비율은 평균 40%를 나타낸다. CpG 섬은 전형적으로 약 1~2 kb 길이를 가지고, 인간 게놈에는 약 45,000개의 CpG 섬이 존재한다.

여러 유전자에서, CpG 섬은 프로모터의 업스트림(upstream)에서 시작하여, 다운스트림의 전사 부위까지 확장된다. 프로모터에서 CpG 섬의 메틸화는 보통 유전자의 발현을 억제시킨다. CpG 섬은 또한 유전자 코딩 부위의 3' 부위뿐만 아니라, 유전자 코딩 부위의 5'부위를 둘러싸고 있을 수 있다. 그러므로, CpG 섬은 프로모터 부위를 포함하는 조절 부위의 코딩 서열 업스트림, 코딩 부위(예를 들어, 엑손영역), 코딩 부위의 다운스트림, 예를 들면, 인헨서 부위 및 인트론를 포함하는 여 러 부위에서 발견된다.

통상적으로, CpG-함유 핵산은 DNA이다. 그러나, 본 발명의 방법은 예를 들면, DNA 또는 DNA와 mRNA를 포함하는 RNA를 함유하는 시료를 적용할 수 있으며, 여기서 DNA 또는 RNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 또는 DNA-RNA 하이브리드를 함유한 시료인 것을 특징으로 할 수 있다.

핵산 혼합물 또한 사용할 수 있다. 검출될 특이적인 핵산 서열은 큰 분자의 분획일 수 있고, 처음부터 특이서열이 전체 핵산서열을 구성하는 분리된 분자형태로 존재할 수 있다. 상기 핵산서열은 순수한 형태로 존재하는 핵산일 필요는 없으며, 핵산은 전체 인간 DNA가 포함되어 있는 것과 같이 복잡한 혼합물 내의 적은 분획일 수도 있다. 시료에 포함된 핵산의 메틸화 정도를 측정하는 데 사용되거나, 메틸화된 CpG 섬을 검출하는 데 사용되는 시료에 포함된 핵산은 Sambrook 등(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY., 1989)에 기재된 여러가지 방법으로 추출될 수 있다.

핵산은 정보를 코드하거나 핵산의 전사를 조절하는 DNA 부위인 조절 부위를 포함할 수 있다. 조절 부위는 적어도 하나의 프로모터를 포함한다. "프로모터"는 전사를 지시하는데 필요한 최소한의 서열이고, 프로모터-의존성 유전자에서 세포 타입 특이적, 조직 특이적 또는 외부 시그널이나 제제에 의한 유도성을 조절할 수 있다. 프로모터는 유전자의 5' 또는 3' 부위에 위치한다. 프로모터 부위의 전체 또는 부분의 핵산 수는 CpG 섬 부위의 메틸화를 측정하는데 적용될 수 있다. 타겟 유전자 프로모터의 메틸화는 외곽에서부터 내부로 진행한다. 그러므로, 세포 전환의 초기 단계는 프로모터 부위의 외곽에서의 메틸화를 분석함으로써 검출할 수 있다.

검체로부터 분리된 핵산은 검체의 생물학적 시료에 의하여 얻어진다. 폐암이나 폐암의 진행단계를 진단하고 싶다면, 스크랩이나 생검으로 폐 조직에서 핵산을 분리하여야 한다. 이러한 시료는 당해분야에서 알려진 여러 의학적 과정에 의하여 얻어질 수 있다.

본 발명의 한 양태에서, 검체로부터 얻어진 샘플의 핵산의 메틸화 정도는 폐 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체의 동일한 핵산 부분과 비교하여 측정한다. 하이퍼메틸화는 하나 이상의 핵산에서 메틸화된 대립유전자가 존재하는 것을 말한다. 폐 조직의 세포 성장성 이상이 없는 검체는 동일한 핵산을 검사했을 때, 메틸화 대립유전자가 나타나지 않는다.

샘플( sample )

본 발명은 폐암의 조기확인에 대하여 기술하고 있으며, 폐암 특이적 유전자 메틸화를 이용하고 있다. 폐암 특이적 유전자의 메틸화는 종양 부위의 부근의 조직에서도 일어났다. 그러므로, 폐암의 조기확인 방법은 액체 또는 고체 조직을 포함하는 모든 샘플로 폐암-특이적 유전자의 메틸화의 유무를 확인할 수 있다. 상기 샘플은 혈청 또는 플라즈마를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

개별 유전자 및 패널

본 발명은 진단 또는 예측 마커로서 각 유전자를 개별적으로 사용하거나, 몇 몇 마커 유전자를 조합하여 패널 디스플레이 형태로 하여 사용할 수 있고, 몇몇의 마커 유전자는 전체적인 패턴 또는 메틸화된 유전자의 목록을 통하여 신뢰성 및 효율성을 향상시키는 것을 확인할 수 있다. 본 발명에서 확인된 유전자는 개별적으로 또는 본 실시예에서 언급된 유전자가 조합된 유전자 세트로 사용될 수 있다. 또는 유전자들은 함께 메틸화된 유전자의 수 및 그 중요도에 따라 순위를 메길 수 있고, 가중치를 둘 수 있으며, 암으로 발전할 가능성의 수준을 선정할 수 있다. 이러한 알고리즘은 본 발명에 속한다.

메틸화 검출 방법

차별적 메틸화의 검출-메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제

차별적 메틸화의 검출은 메틸화되지 않은 CpG 부위만을 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 핵산 샘플을 접촉시켜 비메틸화된 핵산을 절단하는 것으로 수행할 수 있다.

별도의 반응으로, 상기 샘플을 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머(isochizomer)와 접촉시켜, 메틸화된 핵산을 절단하였다.

특이적 프라이머를 핵산샘플에 첨가하고, 통상의 방법으로 핵산을 증폭시켰다. 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭산물이 존재하고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서 증폭산물이 존재하지 않으면, 분석된 핵산 부위 에 메틸화가 일어난 것이다. 그러나, 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 처리한 샘플에서 증폭 산물이 존재하지 않고, 메틸화 및 비메틸화 CpG 부위를 모두 절단하는 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머를 처리한 샘플에서도 증폭 산물이 존재하지 않는다는 것은 분석된 핵산부위에 메틸화가 일어나지 않은 것이다.

여기서, "메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제"는 인식부위에 CG를 포함하고, C가 메틸화되지 않았을 때와 비교하여 C가 메틸화되었을 때 활성을 가지는 제한효소이다 (예를 들면, SmaI). 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 비제한적 예로써, MspI, HpaII, BssHII, BstUI 및 NotI이 포함된다. 상기 효소들은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 다른 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레오티드로는 예를 들면, SacII 및 EagI를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제의 이소키소머는 메틸레이션 민감성 제한 엔도뉴클레아제와 동일한 인식 부위를 갖는 제한 엔도뉴클레아제이지만, 메틸화된 CGs와 비메틸화된 CGs를 모두 절단하며, 예를 들면, MspI를 들 수 있다.

본 발명의 프라이머는 증폭될 로커스의 각 가닥과 "대체적으로" 상보성을 가지도록 제작되고, 상기에서 설명한 바와 같이, 적당한 G 또는 C 뉴클레오티드를 포함한다. 이것은 중합반응을 수행하는 조건에서 프라이머가 대응하는 핵산 가닥과 하이브리다이제이션 되기에 충분한 상보성을 가지는 것을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 증폭 과정에 사용되며, 상기 증폭과정은 예를 들면, PCR과 같은, 타겟 로커스가 많은 반응 단계를 거치면서 기하급수적인 숫자로 증가하는 효소 연속 반응이다. 전형적으로, 한 프라이머(안티센스 프라이머)는 로커스의 네가티브(-) 가닥 에 대하여 상동성을 가지고, 나머지 하나의 프라이머(센스 프라이머)는 포지티브(+) 가닥에 대하여 상동성을 가진다. 변성된 핵산에 프라이머가 어닐링 되면, DNA 폴리머라아제 I(Klenow) 및 뉴클레오티드와 같은 효소 및 반응물들에 의하여 사슬이 신장되고, 그 결과, 타겟 로커스 서열을 함유하는 + 와 - 가닥이 새롭게 합성된다. 상기 새로이 합성된 타겟 로커스가 주형으로도 사용되어, 변성, 프라이머 어닐링 및 사슬 신장의 사이클이 반복되면 타겟 로커스 서열의 기하급수적인 합성이 진행된다. 상기 연속 반응의 산물은 반응에 사용된 특이 프라이머의 말단과 대응하는 말단을 가지는 독립적인 이중가닥 핵산이다.

상기 증폭 반응은 당해 분야에서 보편적으로 사용되고 있는 PCR인 것이 바람직하다. 그러나, 리얼타임 PCR 또는 등온 효소를 사용한 선형증폭과 같은 대체적인 방법도 사용할 수 있으며, 멀티플렉스 증폭 반응 역시 사용할 수 있다.

차별적 메틸화의 검출- 바이설파이트 시퀀싱 방법

메틸화 CpG를 함유한 핵산을 검출하는 다른 방법은 핵산을 함유한 시료를 비메틸화 시토신을 변형시키는 제제와 접촉시키는 단계 및 CpG-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 시료의 CpG-함유 핵산을 증폭시키는 단계를 포함한다. 여기서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 변형된 메틸화 및 비메틸화 핵산을 구별하여 메틸화 핵산을 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 증폭 단계는 선택적이고, 바람직하지만, 필수적인 것은 아니다. 상기 방법은 변형된(예를 들면, 화학적으로 변형된) 메틸화 및 비메틸화 DNA를 구별하는 PCR 반응에 의존하는 것이 다. 상기와 같은 방법은 미국특허 5,786,146에 개시되어 있으며, 상기 특허에는 메틸화 핵산의 검출을 위한 바이설파이트(bisulfite) 시퀀싱과 연관하여 기재되어 있다.

기질

타겟 핵산 부위가 증폭되면, 핵산 서열의 존재를 검출하기 위하여, 상기 핵산 증폭산물은 고체 지지체(기질)에 고정된 알려진 유전자 프로브와 하이브리다이제이션될 수 있다.

여기서, "기질"은 물질, 구조, 표면 또는 재료, 비생물학적이고, 합성되고, 무생물, 평면, 구형 또는 특이적 결합, 평편한 표면의 물질을 포함하는 혼합물 수단으로, 하이브리다이제이션 또는 효소 인식 부위 또는 대다수의 다른 인식 부위 또는 표면, 구조 또는 재료로 구성된 수 많은 다른 분자 종을 넘어서는 수 많은 다른 인식 부위를 포함할 수 있다. 상기 기질은 예를 들면, 반도체, (유기)합성 메탈, 합성 반도체, 인슐레이터 및 도판트; 금속, 합금, 원소, 화합물 및 미네랄; 합성되고, 분해되며, 에칭되고, 리소그라프되며, 프린트되고 마이크로패브리케이트된 슬라이드, 장치, 구조 및 표면; 산업적, 폴리머, 플라스틱, 멤브레인, 실리콘, 실리케이트, 유리, 금속 및 세라믹; 나무, 종이, 카드보드, 면, 울, 천, 직조 및 비직조 섬유, 재료 및 패브릭일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

몇몇 형태의 멤브레인은 당해분야에서 핵산 서열에 대하여 부착력을 가진다고 알려져 있다. 이러한 멤브레인의 특이적이고 비제한적인 예로 니트로셀룰로오스 또는 폴리비닐클로라이드, 디아조티즈드(diazotized) 페이퍼 및 GENESCREENTM, ZETAPROBETM(Biorad) 및 NYTRANTM 등의 상업적으로 사용되는 멤브레인과 같이 유전자 발현 검출용 멤브레인을 들 수 있다. 비드, 글래스, 웨이퍼 및 금속 기질도 포함된다. 이러한 목적물에 핵산을 부착시키는 방법은 당해분야에서 잘 알려져 있다. 이와 다르게, 액체 상에서도 스크리닝을 수행할 수 있다.

하이브리다이제이션 조건

핵산 하이브리다이제이션 반응에서, 엄격한 특정 수준을 달성하기 위하여 사용되는 조건은 하이브리다이즈되는 핵산의 성질에 따라 다양하다. 예를 들면, 하이브리다이제이션되는 핵산 부위의 길이, 상동성 정도, 뉴클레오티드 서열 조성(예를 들면, GC / AT 조성비) 및 핵산 타입(예를 들면, RNA, DNA)등이 하이브리다이제이션 조건을 선택하는데 고려된다. 추가적인 고려조건은 핵산이 예를 들면, 필터 등에, 고정화되어 있는지의 여부이다.

매우 엄격하게 진행되는 조건의 예를 들면 다음과 같다: 실온의 2X SSC/0.1% SDS(하이브리다이제이션 조건); 실온의 0.2XSSC/0.1% SDS(엄격성이 낮은 조건); 42℃에서의 0.2XSSC/0.1%SDS(보통의 엄격성을 가지는 조건); 68℃에서 0.1X SSC(높은 엄격성을 가지는 조건). 세척과정은 이들 중 한가지 조건을 사용하여 수행할 수 있고, 예를 들면, 높은 엄격성을 가지는 조건, 또는 상기 조건을 각각 사용할 수 있으며, 상기 기재된 순서대로 각각 10~15분씩, 상기 기재된 조건을 전부 또는 일부 반복하여 수행할 수 있다. 그러나, 상기에 기술한 바와 같이, 최적 조건은 포함된 특별한 하이브리다이제이션 반응에 따라 다양하며, 실험을 통하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 중요한 프로브의 하이브리다이제이션에는 높은 엄격성을 가지는 조건이 사용된다.

표지( Label )

중요한 프로브는 검출할 수 있도록 표지되며, 예를 들면, 방사선 동위원소, 형광 화합물, 바이오발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이트 또는 효소로 표지될 수 있다. 상기와 같은 프로브를 적당하게 표지하는 것은 당해 분야에서 널리 알려진 기술이며, 통상적인 방법을 통하여 수행할 수 있다.

키트( Kit )

본 발명의 일 양태에 의하면, 검체의 세포 성장성 이상을 검출하는 데 유용한 키트를 제공하고 있다. 본 발명의 키트는 샘플을 담는 구획된 캐리어 수단, 비메틸화 시토신을 민감하게 절단하는 제제를 함유하는 첫번째 용기, CpG 함유 핵산을 증폭하기 위한 프라이머를 함유하는 두번째 용기 및 절단된 또는 절단되지 않은 핵산의 존재를 검출하는 수단이 함유된 세번째 용기를 포함하는 하나 이상의 용기를 포함한다. 본 발명에 따라 사용되는 프라이머는 서열번호 1~33에 기재된 서열, 기능적 조합 및 그 단편을 포함한다. 기능적 조합 또는 단편은 게놈상에서 메틸화가 일어났는지의 여부를 검출하는 프라이머로서 사용된다.

캐리어 수단은 병, 튜브와 같은 하나 이상의 용기를 함유하기에 적합하고, 각 용기는 본 발명의 방법에 사용되는 독립적 구성요소들을 함유한다. 본 발명의 명세서에서, 당해 분야의 통상의 지식을 가진 자는 용기 중의 필요한 제제를 손쉽게 분배할 수 있다. 예를 들면, 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 함유하는 용기를 하나의 용기로 구성할 수 있다. 하나 이상의 용기는 중요 핵산 로커스와 상동성을 가지는 프라이머를 포함할 수 있다. 또한, 하나 이상의 용기는 메틸화 민감성 제한효소의 이소키소머를 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. 폐암에서 억제되는 유전자의 확인

폐암에서 억제되는 유전자를 확인하기 위하여, 마이크로어레이 하이브리다이제이션을 수행하였다. 마이크로어레이 하이브리다이제이션은 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다 (Schena et al., Science, 270:467, 1995). 폐암 환자로부터 쌍을 이루도록 종양 부근 조직 및 종양 조직을 분리하고, 이로부터 전체 RNA를 분리하였다. 상기 짝지워진 종양 부근 조직 및 종양 조직의 유전자 발현 수준의 상대적 차이를 간접적으로 비교하기 위하여, 표준비교 RNA(간접 비교)를 제작하였다. 표준비교 RNA를 제작하기 위하여, 폐암세포주 A549(한국세포주은행(KCLB) 10185), 위암세포주 AGS(KCLB 21739), 신장암 세포주 Caki-2(KCLB 30047), 결장암 세포주 HCT116(KCLB 10247), 자궁경부암 세포주 Hela(KCLB 10002), 혈액암 세포주 HK-60(KCLB 10240), HT1080(KCLB 10121), 유방암 세포주 MDA-MB2(KCLB 30026), 간암 세포주 SK-hep1(KCLB 30052) 및 T세포 유래 세포주 Molt-4(KCLB 21582), 뇌암 세포주 U-87MG(KCLB 30014)의 11개 인간 암세포주로부터 전체 RNA를 분리하였다. 세포주 및 폐 조직의 전체 RNA는 Tri Reagent(Sigma, USA)를 사용하여 분리하였다. 표준비교 RNA를 제작하기 위하여, 11개 세포주로부터 분리한 전체 RNA를 동량으로 혼합하였다. 상기 표준비교 RNA는 내부 대조군으로 사용하였다. 상기 짝을 이룬 종양부근 조직 및 종양 조직의 상대적 유전자 발현 레벨을 비교하기 위하여, 비종양 및 종양 조직으로부터 분리한 RNA와 표준비교 RNA를 간접적으로 비교하였다. 전체 RNA 100μg을 Cy3-dUTP 또는 Cy5-dUTP로 표지하였다. 상기 표준비교 RNA는 Cy3로 표지하였고, 폐 조직으로부터 분리한 RNA는 Cy5으로 표지하였다. 상기 Cy3- 및 Cy5-로 표지한 두 cDNA는 PCR 정제키트(Qiagen, 독일)를 사용하여 정제하였다. 정제된 cDNA를 혼합하고, Microcon YM-30(Millipore Corp., USA)을 이용하여 최종부피가 27μl가 되도록 농축하였다.

하이브리다이제이션 반응액 전체 80μl은 다음을 포함한다: 27μl의 표지된 cDNA 타겟, 20μl의 20X SSC, 8μl의 1% SDS, 24μl의 포름아마이드(Sigma, USA) 및 20μg의 인간 Cot1 DNA(Invitrogen Corp., USA). 상기 하이브리다이제이션 반응액을 100℃에서 2분간 가열하고, 즉시 인간 22K 올리고뉴클레오티드(GenomicTree, Inc., 한국) 마이크로어레이에 하이브리다이즈시켰다. 상기 하이브리다이제이션은 습도조절된 HybChamber X(GenomicTree, Inc., 한국)에서 42℃에서 12~16시간 동안 수행하였다. 하이브리다이제이션이 끝난 후, 마이크로어레이 슬라이드는 Axon 4000B(Axon Instrument Inc., USA)를 이용하여 판독하였다. 시그날과 배경 형광 강도는 GenePix Pro 4.0 소프웨어(Axon Instrument Inc., USA)를 사용하여 타겟 부위 내부의 모든 픽셀의 강도를 평균하는 것에 의하여 각 프로브에 대하여 측정하였다. 명백한 비정상성을 보이는 스팟은 분석에서 제외하였다. 모든 데이타는 GeneSpring 7.2(Agilent, USA)을 이용하여, 정상화, 통계학적 분석 및 클러스트 분석을 수행하였다.

비종양 및 종양 조직의 유전자 발현 수준의 상대적인 차이를 결정하기 위하여, 간접비교를 위한 통계학적 분석(ANOVA, p<0.05)을 수행하였다. 상기 통계학적 분석 결과로부터, 짝지워진 종양 부근 조직과 비교하여 종양 조직에서, 1047개의 유전자 전체가 하향조절(down regulated)된 것을 확인하였다 (도 1).

실시예 2. 메틸화 조절 유전자 발현의 확인

상기 실시예 1에서 확인된 유전자의 발현이 프로모터 메틸화에 의하여 조절되는 지를 확인하기 위하여, 폐암 세포주 A549(KCLB 10185), NCI-H146(KCLB 30173) 및 NCI-H358(KCLB 25807)에 디메틸화제, 5-아자-2-데옥시사이티딘(DAC, Sigma, USA)을 200nM 농도로 3일간 처리하였다. 처리하지 않은 세포주와 처리한 세포주를 Tri reagent로 처리하여 전체 RNA를 분리하였다. DAC 처리에 의한 유전자 발현변화 를 결정하기 위하여, 비처리 세포주 및 처리 세포주간의 전사수준을 직접적으로 비교하였다. 그 결과, DAC를 처리하지 않은 대조군과 비교하여, DAC를 처리하였을 때, 발현이 상승한 767개의 유전자를 확인하였다. 실시예 1에서 획득한 1047개 종양 억제 유전자 목록과 767개의 디메틸화에 의하여 재발현된 유전자를 비교한 결과, 48개의 공통된 유전자를 찾아내었다 (도 1).

실시예 3. 확인된 유전자의 메틸화 구조

(1) 프로모터 부위 CpG 섬의 인실리코(in silico) 분석

상기 48개 유전자의 프로모터 부위에서 CpG 섬의 존재를 찾기 위하여, MethPrimer(http://itsa.ucsf.edu/~urolab/methprimer/index1.html)을 이용하였다. 상기 48개 유전자 중 15개의 유전자가 CpG 섬을 가지고 있지 않았으며, 상기 15개의 유전자를 공통 유전자 목록에서 제외시켰다.

(2) 메틸화의 생화학적 분석

남은 33개 유전자의 메틸화 상태를 생화학적으로 확인하기 위하여, 제한효소 HpaII(메틸화-민감성) 및 MspI(메틸화-비민감성)을 처리한 후, PCR을 수행하여 각 프로모터의 메틸화 상태를 검출하였다 (도 2).

상기 두 효소는 동일하게 5'-CCGG-3' 서열을 인식한다. HpaII는 내부 시토신 잔기가 메틸화되어 있으면, 활성을 나타내지 않는데 반하여, MspI은 내부 시토신 잔기의 메틸화에 의하여 활성이 영향을 받지 않는다. CpG 부위의 시토신 잔기가 메 틸화되어 있지 않으면, 두 종류의 효소가 모두 타겟 서열을 절단할 수 있다. 특정 유전자의 메틸화 상태를 결정하기 위하여, 프로모터 부위의 CpG 섬에 하나 이상의 HpaII 사이트를 가지는 PCR 타겟을 선택하였다. A549(KCLB 10185), NCI-H146(KCLB 30173) 및 NCI-H358(KCLB 25807)로부터 분리된 게놈 DNA 100ng을 각각 5U의 HpaII 및 10U의 MspI으로 처리하고, Quiagen PCR 정제 키트로 정제하였다. 중요 부위를 증폭하기 위하여 특이적 프라이머를 사용하였다. 상기 정제된 게놈 DNA 5ng을 유전자-특이적 프라이머 세트를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. 상기 PCR 반응은 94℃에서 1분, 66℃에서 1분, 72℃에서 1분 처리하는 것을 한 사이클로하여 30사이클을 수행하였고, 최종적으로 72℃에서 10분간 신장시켰다. 각 증폭 산물은 에티듐브로마이드를 함유한 2% 아가로오즈 겔에서 전개시켰다. HpaII처리 산물의 밴드 밀도가 MspII처리 산물보다 1.5배 보다 더 크면, 상기 타겟 부위는 메틸화된 것으로 간주하고, HpaII처리 산물의 밴드 밀도가 1.5배보다 적으면 비메틸화된 것으로 간주하였다. 그 결과, 33개 유전자 중 22개의 유전자가 메틸화되지 않았으며, 종양조직에서 하향 조절되고(down requlated), 디메틸화 조건에서 상향조절되며(up regulated), 프로모터에 CpG 섬을 함유하고, 암세포주에서 실질적으로 메틸화되어 있는 조건을 만족하는 11개의 후보 유전자만이 남게 되었다 (도 3).

(3) 메틸화된 프로모터의 바이설파이트 시퀀싱

상기 11개 유전자의 메틸화 상태를 추가적으로 확인하기 위하여, 각각의 프로모터의 바이설파이트 시퀀싱을 수행하였다. DNA를 바이설파이트로 처리하면, 비 메틸화된 시토신은 우라실로 변형되고, 메틸화된 시토신은 변화없이 남게 된다. 상기 바이설파이트 변형은 Sato 등의 방법으로 수행하였다 (Sato et al., Cancer Research, 63:3735, 2003). 폐암 세포주 A549, NCI-H146 및 NCI-H358의 게놈 DNA 1㎍을 MSP(Methylation-Specific PCR) 바이설파이트 변형 키트(In2Gen, Inc., 한국)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. 상기 바이설파이트 처리된 A549, NCI-H146 및 NCI-H358 게놈 DNA를 PCR로 증폭한 후, PCR 산물의 서열을 분석하였다. 그 결과, 상기 유전자 모두가 메틸화되어 있는 것을 확인하였다.

실시예 4. 디메틸화제 처리에 의한 11개 확인된 유전자의 재활성화

도 4는 확인된 11개 유전자의 재활성화를 나타낸 것이다. 도 4에 나타난 바와 같이, 디메틸화 제제(DAC)를 처리한 폐암 세포에서 처리하지 않은 폐암세포와 비교하여 유전자 발현이 재활성화 된 것을 확인할 수 있다.

실시예 5. 임상샘플에서의 프로모터 메틸화 어세이

본 발명에서 선택된 11개의 유전자의 메틸화된 프로모터의 임상적 적용성을 확인하기 위하여, 환자가 아닌 사람의 정상조직, 종양 부근 조직 및 초기 폐암조직 임상 샘플을 이용하여, 메틸화 어세이를 수행하였다. 메틸화 어세이는 제한효소/PCR 방법을 사용하여, 상기 실시예들에 기재된 방법으로 수행하였다.

도 5 및 도 6은 초기 폐암에 대한 메틸화 분석의 결화를 나타낸 것으로, 정상인 샘플(Biochain)로부터 획득한 정상 조직에서는 어떠한 유전자도 메틸화가 일 어나지 않았다. 그러나, 폐암 조직뿐만 아니라 이에 짝지워진 종양 부근 조직의 모든 유전자에서 메틸화가 일어났다. 예상한 대로, 암 샘플에서는 모든 유전자가 메틸화되었지만, 정상 세포에서는 메틸화되어 있지 않았다. 게다가, 도 5 및 도 6에 나타난 바와 같이, 11개 확인된 유전자가 짝지워진 종양 부근 조직에서 메틸화되어 있었기 때문에, 11개의 확인된 유전자는 폐암의 조기확인에도 유용하다는 것을 확인할 수 있었다.

종양 조직에서의 마커의 메틸화 빈도는 마커가 메틸화된 종양조직 샘플의 수를 종양 조직 및 이에 짝지워진 종양 부근 조직 샘플을 포함하는 전체 샘플의 수로 나누어서 구하였으며, 짝지워진 종양부근 조직의 마커의 메틸화 빈도는 짝지워진 종양 부근 조직 샘플의 메틸화된 마커의 수를 전체 샘플 수로 나누어서 구하였으며, 백분율로 나타내었다.

본 발명은 폐암 특이적인 마커 유전자의 스크리닝 방법, 상기 스크리닝된 폐암 특이적 마커 유전자의 CpG 섬의 메틸화를 진단할 수 있는 폐암 및 폐암 진행단계 진단용 키트 및 폐암 및 폐암 진행단계 진단용 핵산 칩을 제공하는 효과가 있다. 본 발명의 진단용 키트 및 진단용 핵산 칩을 이용하면, 폐암을 초기 형질전환 단계에서 진단할 수 있어, 조기진단이 가능하고, 통상적인 방법보다 정확하고 빠르게 폐암 및 폐암의 진행단계를 진단할 수 있다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 이들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> genomictree <120> DIAGNOSIS KIT AND CHIP FOR LUNG CANCER USING LUNG CANCER SPECIFIC METHYLATION MARKER GENE <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 205 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctcaattttc gcaggctcct cacaattctc tatttggaag aagtgtccct ctccttccct 60 tttcttttcc tcctttactc agcgtcagtc cccgcagcca tctcctccga ccctttttgt 120 ctacgtccca gcgtcgcgaa ccacagcggc ggaggtggag cggggagagg cgttaggccg 180 ggcggctaaa acgcgccgtt aaagt 205 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctcaattttc gcaggctcct ca 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 actttaacgg cgcgttttag cc 22 <210> 4 <211> 245 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 accagctgtg actggctgtg aatatggagg aaaagggcca ctagtcaagg tatgtagata 60 gcttttagaa gtcagaagaa gcacgcctgc agtcccagct actcaggagg ctgaggccgg 120 aggatcgctt gagcctgggg agatagaggt tgcagagagc cgagaccacg ccactgcagc 180 ccagcctgga cagaggtgag acgctcgcgg accttagctt ggggttggcg gcgttaggaa 240 gaaac 245 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Claims

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다음으로 구성된 군에서 선택되는 폐암 마커 유전자 프로모터의 CpG 섬을 포함하는 단편을 증폭하기 위한 프라이머 및 메틸화 민감성 제한 엔도뉴클레아제를 함유하는 폐암 또는 폐암 진행단계 진단용 키트:

(1) CDO1 (NM_001801) - cAMP 반응 요소 조절자 (cAMP responsive element modulator);

(2) CREM (AB209533) - cAMP 반응 요소 조절자 (cAMP responsive element modulator);

(3) FABP4 (CB999901) - 지방산 결합 단백질 4, 지방세포 (fatty acid binding protein 4, adipocyte);

(4) G0S2 (CD511787) - G0/G1 스위치 유전자 (G0/G1 switch gene);

(5) HYAL1 (NM_007312) - 히알루노글루코사미니다아제 1 (hyaluronoglucosaminidase 1);

(6) LPXN (BC034230) - 루페신 (leupaxin);

(7) NFKBIA (BM908726) - B-세포 억제자에서 카파 라이트 폴리펩타이드 유전자의 핵 인자 인핸서, 알파 (nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor, alpha);

(8) RRAD (BC057815) - Ras-연관 당뇨병 (Ras-related associated with diabetes);

(9) THBD (NM-000361) - 트롬보모듈린 (thrombomodulin);

(10) TNNC1 (CF553054) - 트로포닌 씨 (troponin C, slow); 및

(11) TOM1 (AK097926) - myb1의 타겟 (target of myb1, chicken).
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