KR100944037B1 - 시스테인 디옥시게나제， 타입 ⅰ의 유전자를 함유하는재조합벡터를 포함하는 폐암 치료제 - Google Patents
시스테인 디옥시게나제， 타입 ⅰ의 유전자를 함유하는재조합벡터를 포함하는 폐암 치료제 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 시스테인 디옥시게나제, 타입 I(cystein dioxygenase, type I, CDO1)을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 이용한 폐암 치료제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 폐암세포에서 프로모터 부위가 특이적으로 메틸화되어 있어 유전자의 발현이 현저히 저하되어 있는 시스테인 디옥시게나제, 타입 I을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 폐암세포에 도입함으로써 폐암세포의 증식을 억제하는 폐암 치료제에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 상기 시스테인 디옥시게나제, 타입 I을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 폐암세포에 처리하면 폐암세포의 증식을 억제하여, 폐암 치료에 유용하다.
시스테인 디옥시게나제 타입 I 유전자, 메틸화, 폐암
Description
본 발명은 시스테인 디옥시게나제, 타입 I(cystein dioxygenase, type I, CDO1)을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 이용한 폐암 치료제에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 폐암세포에서 프로모터 부위가 특이적으로 메틸화되어 있어 유전자의 발현이 현저히 저하되어 있는 시스테인 디옥시게나제, 타입 I을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 폐암세포에 도입함으로써 폐암세포의 증식을 억제하는 폐암 치료제에 관한 것이다.
정상적인 세포는 암 유전자(oncogene), 암 억제 유전자(tumor suppressor gene) 및 세포사멸 조절 유전자(apoptosis regulating gene)들이 상호 보완적으로 조절되어 조화롭게 생장·유지되나, 여러 가지 원인에 의하여 세포가 비정상적으로 증식 및 생장을 거듭함으로써 암이 발생하는 것으로 알려져 있으며, 이의 근본 원 인은 세포 내 유전자들의 이상에 의해 유발된다. 이러한 유전적인 이상은 크게 유전적 변이와 후생유전학적 변이가 있다.
CpG 섬은 특정 유전자의 프로모터 부위를 포함하는 조절 부위의 코딩 서열 업스트림, 코딩 부위(예를 들어, 엑손 영역), 코딩 부위의 다운스트림(예를 들면, 인헨서 부위 및 인트론)을 포함하는 여러 부위에서 발견된다. 후생유전학적 변이 중 하나인 DNA 메틸화는 주로 특정 유전자의 프로모터 부위에서의 CpG 섬의 시토신(cytosine)에서 일어나며, 유전자 발현을 조절하는 프로모터에서 CpG 섬의 메틸화는 대상 유전자의 발현을 억제시킨다. 특히, 여러 암에서 암 억제 유전자, DNA 회복 유전자(DNA repair gene), 세포 주기 조절 유전자 등이 하이퍼메틸화(hyper-methylation)되어 있어, 이들 유전자의 발현이 차단되어 있음이 확인되었으며, 암 유전자의 경우는 hypo-methylation으로 인하여 유전자의 발현이 유도되는 것으로 밝혀졌다. 특히, 암 발생의 초기 단계에서 hyper-methylation 및 hypo-methylation이 발견된다. 따라서, 암세포에서 특정 유전자의 프로모터 부위에서의 CpG 섬의 메틸화는 유전자의 발현을 저해하거나 차단하여 궁극적으로 세포 내에서의 활성을 억제 내지 불활성화하기 때문에, 통상적으로 암세포에서 메틸화되어 있는 유전자는 암 억제 유전자일 가능성이 매우 높다고 볼 수 있다 (Baylin et al ., Adv . Cancer Res., 72:141, 1998; Jones and Laird, Nat . Genet., 21: 163, 1999).
인간의 사망 원인 중 가장 높은 비율을 차지하고 있는 암의 치료를 위하여 광범위한 연구가 진행되고 있으며, 현재까지 알려진 암 치료 방법으로는 수술, 방사선요법, 항암 화학요법, 면역요법 및 유전자 치료법 등이 있다. 이러한 항암 치 료 연구 과정에서 암세포 및 암 조직 내의 세포에 선택적으로 암 치료를 위한 유전자를 도입·발현시키는 새로운 치료방법에 대한 필요성이 대두되어 왔다.
최근 유전자 치료법은 새로운 표적 유전자의 발굴과 이를 효율적으로 표적세포에 도입하여 장기간 발현을 유도하고, 임상치료에 이용 시 유전자 전달 효율을 향상시키려는 방법에 대한 연구가 진행되고 있다.
종래에는 유전자 또는 그 단백질을 암 치료에 사용하는 유전자 치료법으로, 사이토카인을 유도하여 면역 반응을 증가시키고, 혈관 생성을 억제하는 특정 염기서열을 포함하는 p43 단백질을 유효성분으로 함유하는 종양 억제제를 이용한 방법(한국 공개특허 제2001-0112108호), 암세포를 사멸시키는 물질인 마이코락톤을 함유하는 항암제, 레티노블라스토마 단백질의 발현을 저하시키는 안티센스 Rb 뉴클레오타이드 및 마이코락톤과 상기 안티센스 Rb 뉴클레오타이드를 함유하는 항암제(한국 공개특허 제2002-0040521호) 등에 대해 알려져 있었다. 또한, 임포틴 α유전자 및 재조합 p53 유전자를 발현하는 재조합벡터를 포함하는 항암 조성물을 이용하여 암을 억제하는 방법(한국 등록특허 제10-0760320호) 및 전립선암 치료 및 진단에 사용되는 전립선-특이 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자를 포함하는 조성물(미국특허 제6,329,505호) 등에 대하여 알려져 있었다.
이외에도 유전자 또는 그 단백질을 암 치료에 사용하는 경우는 많으며, 이에 대한 연구가 지속으로 진행되고 있다. 현재 인체 게놈 프로젝트와 병행되어 암환자에 결핍된 유전자나 암 유발 유전자 및 항암 효과를 갖는 유전자 등을 찾기 위한 연구가 진행 중이며, 특히 더욱 효과적으로 암의 유전자 치료에 응용될 수 있는 신 규 암 억제 유전자의 발굴에 대한 필요성이 매우 절실한 실정이다.
본 발명자들은 암 조직 세포에서 유전자 발현이 억제되는 원인이 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬에서의 DNA 메틸화에 의한 것임을 밝혀 특허 출원한 바 있다 (한국 공개특허출원 제10-2007-0109811호).
이에, 본 발명자들은 유전자를 이용한 폐암 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 폐암세포주에서는 시스테인 디옥시게나제, 타입 I(cystein dioxygenase, type I, CDO1) 을 코딩하는 유전자의 프로모터 부위가 특이적으로 메틸화되어 있어 유전자의 발현이 억제되어 있음을 발견하고, CDO1 유전자를 함유하는 발현벡터를 폐암세포에 도입하여 과발현시킬 경우 폐암세포의 증식을 억제하는 효과를 나타낸다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 주된 목적은 시스테인 디옥시게나제, 타입 I(cystein dioxygenase, type I, CDO1)을 코딩하는 유전자 또는 그 단백질을 이용한 폐암 치료제를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시스테인 디옥시게나제, 타입 I을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 포함하는 폐암 치료제를 제공한다.
본 발명은 또한, 시스테인 디옥시게나제, 타입 I 단백질을 유효성분으로 함유하는 폐암 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 CDO1 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 시스테인 디옥시게나제, 타입 I 단백질은 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 시스테인 디옥시게나제, 타입 I을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 포함하는 폐암 치료제 및 시스테인 디옥시게나제, 타입 I 단백질을 함유하는 폐암 치료용 약학 조성물을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 암 억제 유전자인 CDO1 유전자를 함유하는 재조합벡터를 폐 암세포에 도입할 경우, 폐암세포의 증식을 억제하므로 폐암 치료에 유용하게 이용할 수 있다.
본 발명에서는 폐암세포에서 유전자 발현을 조절하는 프로모터가 특이적으로 메틸화되어 있는 유전자 중, 시스테인 디옥시게나제, 타입 I(CDO1)을 코딩하는 유전자 또는 그 단백질을 폐암 치료에 이용할 수 있는지 확인하였다.
시스테인 디옥시게나제, 타입 I 단백질은 피루베이트(pyruvate)와 설퍼레이트(sulfurate) 화합물과 관련된 몇 가지 중요한 대사 과정을 개시하고, 세포 내 시스테인 농도를 조절하며, 세포 내 자유 시스테인(free cysteine)의 농도를 유지하는데 중요한 역할을 한다.
본 발명은 일 관점에서, 시스테인 디옥시게나제, 타입 I을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 포함하는 폐암 치료제에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에서는 폐암에서 CDO1 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 마이크로어레이 하이브리다이제이션을 수행하였다. 즉, 폐암 환자의 종양 부근 정상 조직과 종양 조직으로부터 각각 분리한 전체 RNA에서의 CDO1 유전자 발현 정도를 간접 비교 방법으로 측정하였다.
본 발명에서 "간접 비교"는 첫번째 소스와 두번째 소스에서 분리된 핵산에 각각 하이브리다이제이션되는 레퍼런스 프로브를 사용하여 첫번째 소스에서 분리된 핵산의 레벨과 두번째 소스에서 분리된 핵산에서 동일한 대립 유전자 레벨을 평가 하고, 그 결과를 비교하여 레퍼런스 프로브와 직접적으로 경쟁 결합시키지 않고도, 샘플에 존재하는 핵산의 상대적 양을 결정하는 것이다. 그 결과, 종양 조직에서는 유전자의 발현이 하향조절되었고, CDO1 유전자도 하향조절되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 유전자의 발현이 프로모터의 메틸화에 의해 조절되는지 확인하기 위하여 디메틸화제인 DAC를 처리한 결과, DAC를 처리한 경우 유전자의 발현이 증가되었는바, 이는 유전자 발현이 프로모터의 메틸화에 의한 것임을 알 수 있었다.
본 발명의 다른 실시예에서는 CDO1 유전자 프로모터가 폐암세포주에서 메틸화되었는지 여부를 파이로시퀀싱으로 확인하였다. 그 결과, CDO1 유전자의 프로모터가 정상세포에서는 메틸화되어 있지 않으나, 폐암세포에서 메틸화되어 있다는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 목적 유전자를 전달하는 기술로는 크게 바이러스를 수송체를 사용하는 방법(viral vector-based transfer method), 합성 인지질이나 합성 양이온성 고분자 등을 사용하는 비바이러스성 방법(non-viral delivery method) 및 세포막에 일시적인 전기 자극을 가하여 유전자를 도입하는 전기 투과법(electroporation) 등의 물리적 방법이 있는바, 상기 전달 기술 중 바이러스 수송체를 사용하는 방법은 치료 유전자로 대체된 유전자를 지니는 일부 또는 전체의 복제 능력이 결손된 벡터로서 유전인자의 전달이 효율적으로 이루어질 수 있기 때문에 유전자 치료를 위해 선호하는 방법이다.
바이러스 수송체 또는 바이러스 벡터로 사용되는 바이러스로는 RNA 바이러스 벡터(레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등)와 DNA 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 등)가 있으며, 이 외에도 단순포진 바이러스 벡터(herpes simplex viral vector), 알파 바이러스 벡터(alpha viral vector) 등이 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 CDO1 유전자를 전달하기 위하여, CDO1 유전자를 pcDNATM4/His 벡터에 삽입하여 CDO1 유전자를 발현시킬 수 있는 CDO1 유전자 발현 벡터(pCDO1)를 제작하였다. 상기 CDO1 유전자는 인간 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 합성 방법에 따라 합성할 수 있다. 상기 pCDO1 발현 벡터 0.1~2㎍/105 cells과 리포좀 1~20㎍/105 cells을 폐암세포에 도입하여 배양한 후, 세포 증식 여부를 확인하였다. 상기 제작된 재조합벡터는 통상적인 방법으로 암세포에 도입할 수 있고, 고효율로 발현되어 폐암세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있다. 본 발명에서는 603bp의 호모 사피엔스(Homo sapiens) 유래의 cDNA 염기서열 중 CDO1 유전자(GenBank NM_001801, 서열번호 1) 및 시스테인 디옥시게나제, 타입 I 단백질(GenBank NP_001792.2, 서열번호 2)을 사용하였다.
그 결과, 폐암세포 증식이 억제되었다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기 CDO1 유전자를 함유하는 재조합벡터를 폐암세포에 도입할 경우 폐암 치료에 효과적이라는 것을 알 수 있었다.
본 발명에서는 pcDNA4TM/His 벡터를 사용하였으나, 이에 제한되지 않고 발현 목적에 따라 다양한 발현 벡터를 이용할 수 있으며, 발현 벡터의 외래 유전자 삽입 부위에 삽입되는 유전자의 크기, 염기서열 등도 공지의 기술에 의해 다양하게 변화시킬 수 있다.
특히, 본 발명에서는 발현 벡터로서 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 등의 바이러스 벡터를 사용한 구체적인 실시예는 없으나, 공지의 유전자 전달체인 바이러스 벡터를 이용하여 유전자를 전달함으로써 in vivo 상에서 대장암 치료제로 이용할 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
또한, 본 발명에서는 시스테인 디옥시게나제, 타입 I 단백질이 폐암세포의 증식을 억제하는 구체적인 실시예는 없으나, CDO1 유전자가 과발현될 경우 폐암세포의 증식을 억제하므로, CDO1 유전자를 함유하는 재조합벡터가 도입된 형질전환체를 배양하여 수득된 시스테인 디옥시게나제, 타입 I 단백질을 폐암세포에 처리할 경우에도 폐암세포의 증식을 억제하는 효과를 나타낼 것이라는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 시스테인 디옥시게나제, 타입 I 단백질을 유효성분으로 함유하는 폐암 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 이미 사용되고 있는 항히스타민제, 소염진통제, 항암제 및 항생제 등의 약제와 함께 제제화하거나 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정 제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트 윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물을 함유하는 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 그의 염은 다양한 기능성 식품 및 건강보조식품의 제조시 식품의 주성분 또는 첨가제 및 보조제로 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1: 폐암 조직 및
폐암세포주에서의
시스테인
디옥시게나제
, 타입 I을 코딩하는 유전자의 발현 측정
폐암 조직 또는 폐암세포에서 시스테인 디옥시게나제, 타입 I(CDO1)을 코딩하는 유전자의 발현을 확인하기 위하여, 마이크로어레이 하이브리다이제이션을 수행하였다. 마이크로어레이 하이브리다이제이션은 표준 프로토콜을 이용하여 수행하였다 (Schena et al., Science, 270:467, 1995).
폐암 환자(고려대학교 병원 호흡기내과)로부터 쌍을 이루도록 종양 부근 정상 조직(8 샘플) 및 종양 조직(8 샘플)을 분리하고, 이로부터 전체 RNA를 분리하였다. 상기 짝지워진 종양 부근 정상 조직과 종양 조직의 유전자 발현 수준의 상대적 차이를 간접적으로 비교하기 위하여, 표준 비교 RNA(간접 비교)를 제작하였다.
즉, 표준비교 RNA를 제작하기 위하여, 폐암세포주 A549(한국세포주은행(KCLB) 10185), 위암 세포주 AGS(KCLB 21739), 신장암 세포주 Caki-2(KCLB 30047), 결장암 세포주HCT116(KCLB 10247), 자궁경부암 세포주 Hela(KCLB 10002), 혈액암 세포주 HK-60(KCLB 10240), HT1080(KCLB 10121), 유방암 세포주 MDA-MB231(KCLB 30026), 간암 세포주 SK-hep1(KCLB 30052), T 세포 유래 세포주 Molt-4(KCLB 21582) 및 뇌암 세포주 U-87MG(KCLB 30014)로부터 전체 RNA를 Tri Reagent(Sigma, USA)를 사용하여 분리하였다. 표준 비교 RNA를 제작하기 위하여, 상기 11개 세포주로부터 분리한 전체 RNA를 동량으로 혼합하였고, 이를 내부 대조군으로 사용하였다.
상기 짝을 이룬 종양 부근 정상 조직 및 종양 조직의 상대적 유전자 발현 정 도를 비교하기 위하여, 비종양 및 종양 조직으로부터 분리한 RNA와 표준 비교 RNA를 간접적으로 비교하였다. 이를 위하여, 전체 RNA 100㎍을 Cy3-dUTP 또는 Cy5-dUTP로 표지하였고, 상기 표준 비교 RNA는 Cy3로 표지하였으며, 위 조직으로부터 분리한 RNA는 Cy5으로 표지하였다. 상기 Cy3- 및 Cy5-로 표지한 두 cDNA는 PCR 정제 키트(Qiagen, 독일)를 사용하여 정제하였다. 상기 정제된 cDNA를 혼합하고, Microcon YM-30(Millipore Co., USA)을 이용하여 최종 부피가 27㎕가 되도록 농축하였다.
하이브리다이제이션 반응액(표지된 cDNA 타겟 27㎕, 20X SSC 20㎕, 1% SDS 8㎕, 포름아마이드(Sigma, USA) 24㎕ 및 인간 Cot1 DNA(Invitrogen, USA) 20㎍) 80㎕를 100℃에서 2분간 가열하고, 즉시 인간 35K 올리고뉴클레오티드(GenomicTree, Inc., 한국) 마이크로어레이에 습도 조절된 HybChamber X(GenomicTree, Inc., 한국)에서 42℃, 12~16시간 동안 하이브리다이제이션시켰다. 상기 하이브리다이제이션된 마이크로어레이 슬라이드를 Axon 4000B(Axon Instrument Inc., USA)를 이용하여 판독하였다. 신호와 배경 형광 강도는 GenePix Pro 4.0 소프트웨어(Axon Instrument Inc., USA)를 사용하여 타겟 부위 내부의 모든 픽셀의 강도를 평균하여 각 프로브에 대해 측정하였다. 명백한 비정상성을 보이는 스팟은 분석에서 제외하였다. 모든 데이타는 GeneSpring 7.2(Agilent, USA)을 이용하여 정상화, 통계학적 분석 및 클러스트 분석을 수행하였다.
또한, 비종양 및 종양 조직의 유전자 발현 수준의 상대적인 차이를 결정하기 위하여, 간접 비교를 위한 통계학적 분석(ANOVA, p<0.05)을 수행하였다. 그 결과, 짝지워진 종양 부근 정상 조직과 비교하여 종양 조직에서 818개의 유전자 전체가 하향조절(down regulated)되는 것을 확인하였고, CDO1 유전자도 하향조절되는 것을 확인하였다 (표 1).
| 폐암 조직에서의 하향 발현 정도 | 폐암세포주에서의 재발현 수준 | ||||
| Fold change | p-value | A549 | NCI-H146 | NCI-H358 | |
| CD01 | 0.6 | < 0.01 | 1.2 | 2.9 | 2.2 |
상기 유전자의 발현이 유전자 프로모터의 메틸화에 의하여 조절되는지 확인하기 위하여, 폐암세포주인 A549(KCLB 10185), NCI-H146(KCLB 30173) 및 NCI-H358(KCLB 25807)에 디메틸화제인 5-아자-2-데옥시사이티딘(DAC, Sigma, USA) 200nM을 3일간 처리하였다. 상기 DAC를 처리한 세포주와 처리하지 않은 세포주에 Tri reagent를 처리하여 전체 RNA를 분리하였다.
DAC 처리에 의한 유전자 발현 변화를 확인하기 위하여, 비처리 세포주 및 처리 세포주간의 전사 수준을 직접적으로 비교하였다. 상기 폐암세포주를 각각 10% FBS, 페니실린 100units/㎖ 및 스트렙토마이신 100㎍/㎖를 함유하는 RPMI 배양 배지(GIBCO/BRL, Grand Island, NY)에서 37℃, 5% CO2 농도 조건하에서 배양한 후, DAC를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 DAC 처리군의 유전자 발현을 측정하였다 (표 1).
그 결과, DAC를 처리한 경우 총 767개의 발현 증가 유전자를 확인할 수 있었고, 이중 CDO1 유전자도 포함되어 있는 것을 확인하였다.
실시예 2: 폐암세포주에서 시스테인 디옥시게나제, 타입 I을 코딩하는 유전자의 메틸화 측정
상기 실시예 1에서 확인된 CDO1 유전자의 폐암세포주에서의 재발현이 디메틸화에 의한 것인지 확인하기 위하여, 폐암세포주 및 정상 세포주에서 메틸화 정도를 측정하였다.
이를 위하여 바이설파이트(bisulfite) 처리를 이용하여 메틸화되지 않은 시토신을 우라실로 변형시키기 위하여 정상세포주인 NHBE(Cambrex, CC2541) 및 폐암세포주인 A549(KCLB 10185), NCI-H146(KCLB 30173), NCI-H358(KCLB 25807), HCC 1195(KCLB 71195)에서 전체 gDNA를 정제하여, 그 중 gDNA 200ng을 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리한 후, 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 파이로시퀀싱에 사용하였다.
CDO1 유전자의 파이로시퀀싱을 수행하기 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 PSQ assay design 프로그램(Biotage, USA)를 이용하여 수행하였다. CDO1 유전자의 메틸화 측정을 위한 PCR 및 시퀀싱 프라이머는 하기 표 2와 같다.
| 프라이머 | 염기서열 (5' → 3') | positiona | 서열번호 | 증폭 산물의 크기 |
| forward | GGGAGGATGAATTTTATAGATTTG | +35 | 3 | 94bp |
| reverse | CACCCCCAAACCCCTAAC | +128 | 4 | |
| sequencing | AATTTGATTTGTGTGTGTA | +59 | 5 |
a 전사 개시점(+1)으로부터의 위치: 뉴클레오티드
표 2에 기재된 프라이머로 증폭되는 바이설파이트 처리 후의 염기서열과 시퀀싱 프라이머 및 메틸화 측정을 위한 분석 염기서열은 하기 서열번호 6과 같다. 밑줄로 표시된 염기서열은 CpG 부위의 메틸화 측정을 위하여 분석한 염기서열이고, "y(C 또는 T)"로 표시된 부위는 CpG 부위의 시토신을 나타낸 것이다.
서열번호 6: 5'-gggagg atgaatttta tagatttgaa tttgatttgt gtgtgtatyg ygtttttagy gatttyggat ttattgygtt gttaggggtt tgggggtg-3'
상기 바이설파이트로 전환시킨 gDNA 20ng을 PCR로 증폭하였다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환된 DNA 20ng, 10X PCR buffer 5㎕(Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5units(Enzynomics, Korea), 2.5mM dNTP 4㎕(Solgent, Korea), PCR 프라이머 2㎕ of 10pmole/㎕)을 95℃에서 5 분간 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 반응시킨 다음, 72℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로즈 젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.
상기 증폭된 PCR 산물을 대상으로 PyroGold 시약(Biotage, USA)을 이용하여 PSQ96MA 시스템(Biotage, USA)으로 파이로시퀀싱을 수행하였다. 파이로시퀀싱 후, 메틸화 정도는 메틸화 지수를 계산함으로써 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다. CDO1 유전자의 경우, 4개의 CpG 부위의 메틸화 정도를 측정하였다.
그 결과, CDO1 유전자의 프로모터 부위는 정상세포인 NHBE와 폐암세포주 중 NCI-H146에서는 메틸화가 되어 있지 않고(5% 미만), 나머지 3개의 폐암세포주(A549, NCI-H358, HCC 1195)에서는 80% 이상의 높은 메틸화 지수를 나타내었다 (도 1).
실시예 3: 폐암 조직에서 시스테인 디옥시게나제, 타입 I을 코딩하는 유전자의 메틸화 측정
CDO1 유전자의 폐암 조직에서의 발현 저하가 메틸화에 의한 것인지를 확인하기 위하여, 파이로시퀀싱 방법으로 메틸화 정도를 정량 분석하였다.
39명의 폐암 환자로부터 수술 조직(부산대학교병원 호흡기내과)을 확보하고, 이로부터 종양 조직 및 이와 쌍을 이루는 정상 조직에서의 CDO1 유전자의 메틸화 정도를 측정하였다. 종양 조직 및 정상 조직으로부터 각각 지노믹 DNA를 QIAamp DNA Mini kit(QIAGEN, USA)를 사용하여 분리한 후, 상기 분리된 gDNA 200ng에 EZ DNA methylation-Gold kit(Zymo Research, USA)를 이용하여 바이설파이트를 처리하였다. 상기 바이설파이트가 처리된 DNA를 멸균 증류수 20㎕로 용출시켜 파이로시퀀싱에 사용하였다.
상기의 바이설파이트로 전환시킨 gDNA 20ng을 PCR로 증폭시켰다. PCR 반응 용액(바이설파이트로 전환시킨 DNA 20ng, 10X PCR buffer 5㎕(Enzynomics, Korea), Taq polymerase 5units(Enzynomics, Korea), 2.5mM dNTP 4㎕(Solgent, Korea), PCR 프라이머 2㎕ of 10pmole/㎕)을 95℃에서 5분간 처리한 후, 95℃에서 40초, 60℃에서 45초, 72℃에서 40초로 총 45회 반응시킨 다음, 72℃에서 5분 조건으로 PCR을 수행하였다. 상기 PCR 산물의 증폭 여부는 2.0% 아가로즈 젤을 사용한 전기영동으로 확인하였다.
상기 증폭된 PCR 산물을 PyroGold 시약(Biotage, USA)을 이용하여 PSQ96MA 시스템(Biotage, USA)을 이용하여 파이로시퀀싱을 수행하였다. 파이로시퀀싱 후, 메틸화 정도는 메틸화 지수(methylation index)로 측정하였다. 메틸화 지수는 각 CpG 부위에서 시토신이 결합하는 평균율을 구하여 계산하였다.
그 결과, CDO1 유전자의 경우 정상 조직에서는 거의 모든 시료에서 유의한 메틸화가 전혀 관찰되지 않았으나, 폐암 종양 조직에서는 거의 모든 시료에서 유의한 수준의 메틸화가 검출되었다 (도 2의 A).
CDO1 유전자를 이용하여 폐암 여부를 진단할 수 있는지 확인하기 위하여, ROC(Receiver operating characteristic) 커브 분석을 수행하였다. 그 결과, 정상과 암을 구분지을 수 있는 메틸화 지수의 cut-off은 > 11.12%이며, 폐암 진단에 대한 민감도는 79.5%, 특이도는 92.3%로 매우 우수한 것으로 나타났다 (도 2의 B). 정상 조직과 폐암 조직에서의 메틸화 지수 cut-off(> 11.12%) 이상인 시료의 빈도를 표 3에 나타내었다.
| 바이오 마커 | 메틸화가 검출된 시료의 수/전체 시료수 (%)a | p값b | |
| 폐 정상 조직 | 폐암 종양 조직 | ||
| CDO1 | 3/39 (7.7) | 31/39 (79.5) | < 0.0001 |
a 전체 시료 중 CDO1이 cut-off 이상 메틸화된 시료의 빈도
b 카이스퀘어 테스트 결과 얻은 p 값
CDO1 유전자의 메틸화 지수가 상기 cut-off 보다 높은 경우를 메틸화 양성으로 판정하였고, 이하인 경우는 음성으로 판정하였다. 표 3에서와 같이, ROC 커브 분석 결과 얻은 cut-off를 기준으로 하였을 경우, 정상 조직에서는 92.3%의 시료에서 메틸화 음성을 나타내었고, 폐암 조직에서는 79.5%의 메틸화 양성 빈도를 나타내었다. 이는 CDO1 유전자가 정상 조직에 비하여 폐암 조직에서 매우 높은 빈도로 메틸화되어 있음을 보여주며, 폐암 조직에서 CDO1 유전자의 발현 저하가 프로모터 메틸화에 의한 것임을 알 수 있다.
실시예 4: 시스테인 디옥시게나제, 타입 I을 코딩하는 유전자의 발현벡터 제작
CDO1 유전자를 인간 세포 안에서 발현시키기 위한 발현 벡터를 제조하기 위하여, 21C Human Gene Bank(생명공학연구원)로부터 CDO1 유전자를 포함하고 있는 1,578bp의 cDNA 클론(hMU002664)을 분양받았다. 상기 1,578bp의 염기서열은 pBluescriptR 벡터 내의 KpnI 및 EcoRI 제한효소 절단을 통하여 확보하고, 이를 다시 pcDNA4TM/His 발현벡터(Invitrogen)의 KpnI 및 EcoRI 부위에 클로닝하여 CDO1 유전자 발현 벡터(pCDO1)를 제작하였다 (도 3).
실시예 5: 시스테인 디옥시게나제, 타입 I을 코딩하는 유전자의 폐암세포로의 도입 및 암세포 증식 억제 여부 측정
폐암세포주 내에서 시스테인 디옥시게나제, 타입 I(CDO1)을 코딩하는 유전자의 과발현에 따른 암세포의 증식 억제 효과를 확인하기 위하여 세포 증식 실험을 수행하였다.
세포 증식 실험을 수행하기 위하여, 폐암세포주 NCI-H358을 96 웰 플레이트에 3×103의 농도로 접종하고, 10% FBS(Sigma, USA), 페니실린(100units/㎖, WelGENE, Korea) 및 스트렙토마이신(100units/㎖, WelGENE, Korea)이 첨가된 RPMI 1640 배지(Sigma, USA)에 37℃, CO2(5%) 배양기(Forma Scientific Inc.)에서 24시간 동안 배양하였다.
상기 배양된 폐암세포에 실시예 4에서 제작한 pCDO1 발현 벡터를 Fugene HD transfection 시약(Roche Applied Science)을 사용하여 트랜스펙션시켰다. 대조군으로는 CDO1 유전자가 포함되지 않은 pcDNA4TM/His를 트랜스펙션시켰다. 상기 형질전환체를 48시간 동안 배양한 후, WST-1 시약(Roche Applied Science)을 웰당 10㎕씩 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간 동안 추가로 배양하였다. 상기 배양액을 현미경 하에서 관찰하고, ELISA reader(BIO-RAD, Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer)를 이용하여 440㎚에서의 흡광도를 측정하여 세포 증식 상태를 현미경하에서 관찰하였다.
그 결과, CDO1 유전자를 함유하는 pCDO1 발현 벡터가 도입된 폐암세포에서는 현저하게 세포 증식이 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4의 A).
또한, ELISA를 이용하여 사멸된 세포량을 측정한 결과, 대조군 벡터를 도입시킨 세포에 비하여 pCDO1 발현 벡터를 도입시킨 폐암세포에서의 증식이 42% 정도 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4의 B). 이는 CDO1 유전자 또는 그 단백질이 폐암세포의 증식을 효과적으로 억제할 수 있으며, 폐암 치료제로서 사용할 수 있다는 것을 의미한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 폐암세포주 및 정상 세포주에서의 메틸화 정도를 측정한 것이다.
도 2는 시스테인 디옥시게나제, 타입 I(CDO1)을 코딩하는 유전자의 프로모터 부위의 메틸화 여부를 측정한 것이다 (A: 폐암 조직 및 정상 조직에서 파이로시퀀싱 방법을 이용하여 CDO1 유전자 프로모터 부위의 메틸화 여부를 측정한 것; B: CDO1 유전자를 폐암 진단에 이용할 수 있는지 확인하기 위하여 ROC 커브 분석을 수행한 것).
도 3은 CDO1 유전자 발현 벡터(pCDO1)의 모식도를 나타낸 것이다.
도 4는 폐암세포주에서 CDO1 유전자가 세포 증식에 미치는 영향을 측정한 것이다 (A: pCDO1이 도입된 NCI-H358 폐암세포주의 증식 여부를 현미경으로 관찰한 것; B: ELISA를 이용하여 사멸된 세포량을 측정한 것).
<110> Genomictree
<120> THERAPEUTIC AGENT OF LUNG CANCER COMPRISING RECOMBINANT VECTOR
CONTAINING A GENE ENCODING CDO1
<160> 6
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 603
<212> DNA
<213> CDO1
<400> 1
atggaacaga ccgaagtgct gaagccacgg accctggctg atctgatccg catcctgcac 60
cagctctttg ccggcgatga ggtcaatgta gaggaggtgc aggccatcat ggaagcctac 120
gagagcgacc ccaccgagtg ggcaatgtac gccaagttcg accagtacag gtatacccga 180
aatcttgtgg atcaaggaaa tggaaaattt aatctgatga ttctctgttg gggtgaagga 240
catggcagca gtattcatga tcataccaac tcccactgct ttctgaagat gctacaggga 300
aatctaaagg agacattatt tgcctggcct gacaaaaaat ccaatgagat ggtcaagaag 360
tctgaaagag tcttgaggga aaaccagtgt gcctacatca atgattccgt tggcttacat 420
cgagtagaga acatcagcca tacggaacct gctgtgagcc ttcacttgta cagtccacct 480
tttgatacat gccatgcctt tgatcaaaga acaggacata aaaacaaagt cacaatgaca 540
ttccatagta aatttggaat cagaactcca aatgcaactt cgggctcgct ggagaacaac 600
taa 603
<210> 2
<211> 200
<212> PRT
<213> CDO1
<400> 2
Met Glu Gln Thr Glu Val Leu Lys Pro Arg Thr Leu Ala Asp Leu Ile
1 5 10 15
Arg Ile Leu His Gln Leu Phe Ala Gly Asp Glu Val Asn Val Glu Glu
20 25 30
Val Gln Ala Ile Met Glu Ala Tyr Glu Ser Asp Pro Thr Glu Trp Ala
35 40 45
Met Tyr Ala Lys Phe Asp Gln Tyr Arg Tyr Thr Arg Asn Leu Val Asp
50 55 60
Gln Gly Asn Gly Lys Phe Asn Leu Met Ile Leu Cys Trp Gly Glu Gly
65 70 75 80
His Gly Ser Ser Ile His Asp His Thr Asn Ser His Cys Phe Leu Lys
85 90 95
Met Leu Gln Gly Asn Leu Lys Glu Thr Leu Phe Ala Trp Pro Asp Lys
100 105 110
Lys Ser Asn Glu Met Val Lys Lys Ser Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn
115 120 125
Gln Cys Ala Tyr Ile Asn Asp Ser Ile Gly Leu His Arg Val Glu Asn
130 135 140
Ile Ser His Thr Glu Pro Ala Val Ser Leu His Leu Tyr Ser Pro Pro
145 150 155 160
Phe Asp Thr Cys His Ala Phe Asp Gln Arg Thr Gly His Lys Asn Lys
165 170 175
Val Thr Met Thr Phe His Ser Lys Phe Gly Ile Arg Thr Pro Asn Ala
180 185 190
Thr Ser Gly Ser Leu Glu Asn Asn
195 200
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
gggaggatga attttataga tttg 24
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
cacccccaaa cccctaac 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sequencing primer
<400> 5
aatttgattt gtgtgtgta 19
<210> 6
<211> 94
<212> DNA
<213> sequence for measuring methylation of CpG island
<400> 6
gggaggatga attttataga tttgaatttg atttgtgtgt gtatygygtt tttagygatt 60
tyggatttat tgygttgtta ggggtttggg ggtg 94
Claims (4)
- 시스테인 디옥시게나제, 타입 I(cystein dioxygenase, type I, CDO1)을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터를 포함하는 폐암 치료제.
- 제1항에 있어서, 상기 시스테인 디옥시게나제, 타입 I을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 폐암 치료제.
- 시스테인 디옥시게나제, 타입 I 단백질을 유효성분으로 함유하는 폐암 치료용 약학 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 시스테인 디옥시게나제, 타입 I 단백질은 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020070132263A KR100944037B1 (ko) | 2007-12-17 | 2007-12-17 | 시스테인 디옥시게나제， 타입 ⅰ의 유전자를 함유하는재조합벡터를 포함하는 폐암 치료제 |
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