JP5013869B2

JP5013869B2 - 遺伝子座コピー数の変化を検出するのに有用な方法およびキット

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Publication number: JP5013869B2
Application number: JP2006527568A
Authority: JP
Inventors: デビッドハレー，
Original assignee: トリソゲンバイオテクノロジーリミテッドパートナーシップ
Priority date: 2003-09-22
Filing date: 2004-09-20
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2024-09-20
Also published as: JP2007505641A; ATE415495T1; CN1882700A; CA2540141C; WO2005028674A3; AU2004274724A1; AU2004274724B2; ZA200602319B; WO2005028674A2; AU2004274724A2; EP1668154A2; CA2540141A1; EP2186914A3; EP1668154B1; DE602004018009D1; KR20060101470A; EP2186914A2

Description

本発明は、トリソミーなどの染色体異常を生じさせる遺伝子座コピー数異常（例えば、増幅）を検出するのに有用な方法およびキットに関連する。

遺伝的成分が環境的要因よりも優位である疾患状態は遺伝病と呼ばれており、典型的には下記の３つのカテゴリーの１つに分類にされる：（ｉ）１つ以上の染色体の非存在、過剰または異常な配置によって特徴づけられる障害；（ｉｉ）１つだけの変異遺伝子によって主に引き起こされ、常染色体優性型、常染色体劣性型またはＸ連鎖型にさらに分類されるメンデル型障害または単純に遺伝する障害；および（ｉｉｉ）多数の遺伝子および環境的要因の相互作用によって引き起こされる多因子性障害。

異数性症は、流産児の中では５０％を超えて見出される非常に一般的な染色体異常である［ＭｃＣｏｎｎｅｌｌＨＤ、ＣａｒｒＤＨ、ヒトの自然流産の細胞遺伝学研究における近年の進歩、ＯｂｓｔｅｔＧｙｎｅｃｏｌ．、１９７５（５月）、４５（５）：５４７〜５２］。トリソミーは胎児または胚の状態では致死的であり、その一方で、常染色体トリソミーは、出生後も胎児の生存を可能にするトリソミーである。

ダウン症候群は、２１トリソミーとしても知られており、出生前に診断することができる非常に一般的な遺伝病の１つである。ダウン症候群は、この障害を伴って生まれた子供における精神遅延ならびに多くの身体的および生理学的な異常の原因である。多くの子供が、先天性心臓欠陥および胃腸の異常（これらは手術によって是正することができる）を伴って生まれる。身体的特徴には、後部が平らな頭、ならびに、傾斜した眼、くぼんだ鼻梁、小さい手足、出生時における頸の後部における過度な皮膚、低下した筋緊張、および、手の掌におけるサルのようなしわが含まれる［Ｄｏｗｎｓｙｎｄｒｏｍｅ（１９９４）、ＮａｔｉｏｎａｌＤｏｗｎＳｙｎｄｒｏｍｅＣｏｎｇｒｅｓｓ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ：ＮＤＳＣ］。

ダウン症候群の罹患率は米国では１００００人の生出産あたり９．２例である。ダウン症候群発生についての原因は依然としてほとんど理解されていないが、母体の高齢が１つの要因として働くことが広く明らかにされている。従って、２１トリソミーを有する胎児を妊娠している危険性は、３５歳を超える母親については指数的に増大する。出産する母親の母体年齢が米国では高くなっているため、子供がダウン症候群と子宮内で診断されることについて危険性のある母親の罹患率が以前よりもはるかに大きくなっている。従って、３５歳を超える潜在的にすべての母親はダウン症候群について高リスクであると見なされ、そのような母親には、検査することが勧められることが望ましい。

ダウン症候群について出生前スクリーニングするための現在の方法は多様であり、これらには、血液血清スクリーニング、超音波検査、浸襲的検査、遺伝学的カウンセリングおよび染色体研究が含まれる。多くの研究が、特に妊娠第一期においてダウン症候群の出生前診断を改善するために行われているが、今日まで、どの検査も、ダウン症候群を診断することにおいて１００％正確であることが立証されていない。

下記には、ダウン症候群の出生前スクリーニングおよび出生前診断のための現在の方法がまとめられる。

非浸襲的検査
胎児の超音波画像化。この検査は妊娠の第１２週〜第１８週の間で行われる。この検査では、後頸部半透明性（すなわち、後頸部の増大した肥厚または腫脹）、長骨の短化、および、第１足指と第２足指との間のサンダルギャップが探される。だが、胎児のトリソミー状態を検出するための超音波検査法の感度は、染色体異常のタイプ、超音波検査時の妊娠週齢、照会理由、陽性の超音波検査知見についての判断基準、および超音波検査法の質により変化することが理解される。推測として、１つ以上の超音波検査知見が、２１トリソミー（ダウン症候群）を有する胎児の５０％〜７０％において特定され得る。従って、超音波検査マーカーの存在または非存在により、胎児のダウン症候群の危険性を実質的に修正することができ、超音波検査マーカーの存在または非存在が遺伝学的音波検査図の基礎である。母体の生化学的マーカーおよび超音波検査マーカーは大部分が独立しているので、組み合わせた危険性推測は、いずれか単独よりも大きい検出率をもたらす。

母体の血清スクリーニング。母体の血清スクリーニングはまた、血清α−フェトタンパク質（ＡＦＰ、低濃度であることにより、ダウン症候群が示される）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＧＣ、高濃度であることにより、ダウン症候群が示される）、および非共役型エストリオ−ル（ｕＥ３、低濃度であることにより、ダウン症候群が示される）を見る三重マーカー試験をはじめとする多重マーカースクリーニング検査として知られている。四番目のマーカーとして、近年、インヒビンＡが加えられており、高濃度であることにより、ダウン症候群の診断が示される［Ｗａｌｄ、ＷａｔｔおよびＨａｃｋｓｈａｗ（１９９９）、ＴｈｅＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ、第３４１巻、第７号、４６１〜４６９］。インヒビンＡを加えた三重マーカー検査は現在では、四重マーカー検査になっている。これらのマーカーは、母胎年齢パラメーターと一緒になって、約７０％の検出率および約５％の偽陽性率を伴ってダウン症候群を診断するために使用することができる。これらのマーカーは、妊娠第二期においてダウン症候群を診断するために使用することができ、一方、ＡＦＰ検査および超音波は妊娠第一期において使用される。

この四重検査は、今では、後頸部半透明性超音波検査法、および、妊娠に関連した血清タンパク質−Ａ（ＰＡＰＰ−Ａ）についての検査と一緒に使用されている。この方法は、５％の偽陽性率を伴うが、検出率を８５％に増大させることができ、それにより、現在利用できる、ダウン症候群のための最も信頼できる非浸襲的な検出検査を提供している［Ｗａｌｄ、Ｋｅｎｎａｒｄ、ＨａｃｋｓｈａｗおよびＭｃＧｕｉｒｅ（１９９８）、ＨｅａｌｔｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔ、第２巻、第１号、１〜１２４］。しかしながら、現在利用できる血清マーカーは統計学的結果を提供しており、そのような統計学的結果は不明確であり、また、多くの場合、解釈することが困難であることに留意にしなければならない。

浸襲的検査
羊水穿刺。羊水穿刺は、胎児の異常を妊娠第二期において検出するのに羊水が吸引される浸襲的手法である。この検査は、ダウン症候群などの遺伝的異常の子供を有することについて危険性がより大きい母体年齢が高くなった女性について勧められる。羊水穿刺のための照会には、異常に低濃度または異常に高濃度のＡＦＰが含まれ得る。羊水穿刺は通常の場合には妊娠第二期において行われるが、妊娠第１１週という早期において行うことができる。羊水のサンプルが妊娠の約１６週間で採取される。わずかに２０％の羊膜細胞が検査のために適するだけであるので、サンプルは、中期分析のための十分な分裂細胞を得るために培養する必要がある。従って、結果は１週間後〜３週間後に得ることができ、このことは母体の不安の増大をもたらし得るし、また、妊娠第二期〜第三期の中絶の検討をもたらし得る。核型決定により、ダウン症候群以外の染色体障害が検出される。しかしながら、妊婦２００人においておよそ１人が羊水穿刺のために流産する。

絨毛生検（ｃｖｓ）。絨毛生検では、胎盤を形成し、胎児によって形成され、従って、胎児の細胞を含有する絨毛膜のサンプルを採取することを伴う。この検査は妊娠第一期の終期（すなわち、１０週間〜１２週間）で行うことができる。この手法は経子宮頸的または経腹膜的に行われる。両方の方法は同等に安全かつ有効である。この手法は迅速であり（結果を２４時間以内に得ることができ）、また、痛みを伴うことがほとんどない。サンプル（すなわち、未培養サンプル）は、その後、特に染色体異常に注目して、顕微鏡下で分析される。ＣＶＳの利点は、妊娠第一期における早期検査であり、また、低下した母体細胞汚染の危険性である。欠点は、流産の危険性の増大と費用である。母体の血清マーカーに注目することはさらに重要である。だが、ＡＦＰが注目される頃には、そのときは遅すぎて、ＣＶＳを行うことができない。陽性の結果から、ダウン症候群などの遺伝病が６０％〜７０％の割合で検出される。ＣＶＳの１％が、直接的ＣＶＳまたは培養ＣＶＳから得られる結果が胎児の結果とは異なる限定された胎盤モザイク現象を示していることが理解される。培養ＣＶＳは、胎盤のより近いところに位置する直接的ＣＶＳよりも、胎児系統に近い関係の細胞から成長させられる。流産の危険性が羊水穿刺の場合よりも高い。その上、ＣＶＳ時に手足を切断する危険性が比較的高い。

未培養羊膜細胞の分裂中期蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）。羊水のスライド標本を、蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して分析することができる。この検査は、培養されていない中期細胞に対して行われ、多数の染色体異常を検出することができる。結果が２４時間以内に得られる。第２１染色体の重要な領域に由来するプローブが、ダウン症候群を診断するために使用される。別のプローブが、倍数性を調べるために使用される。プローブの位置により、２つのシグナルが重なり得るので、いくつかの転座の場合には、偽陰性の結果がもたらされることがある。

定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）診断。この手法は、ダウン症候群における不分離の研究において有用であることが立証されている。典型的には、第２１染色体内における（ＧＴ）ｎ反復およびＡｌｕ配列の多型が使用される［Ｐｅｔｅｒｓｅｎ（１９９１）、ＡｍＪＨｕｍＧｅｎｅｔ、４８：６５〜７１；Ｃｅｌｉ（１９９４）；Ｍｅｓｓａｒｉ（１９９６）、ＨｕｍＧｅｎｅｔ、９７：１５０〜１５５］。従って、例えば、子宮頸管内の管洗浄によって妊娠の７週間〜９週間の間で得られる経子宮頸細胞（ＴＣＣ）サンプルに由来する胎児ＤＮＡを使用することができる。栄養芽層の回収がＹ染色体特異的なＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅および父系特異的なマイクロサテライト対立遺伝子の検出のために十分である。この方法は胎児の性別を正確に予測することができる。２１トリソミーの胎児が、スーパーオキシドディスムターゼ−１（ＳＯＤ１）の蛍光ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および定量的ＰＣＲ分析を使用してＴＣＣにおいて診断された。その後、定量的蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、Ｘ染色体およびＹ染色体に由来するＤＮＡ配列の検出と一緒に２１トリソミーおよび１８トリソミーの同時診断のために実証された。羊水、胎児の血液または組織から抽出されたＤＮＡサンプルが、第２１染色体および第１８染色体のそれぞれにおける２つの遺伝子座について特異的な多型の小さいタンデム反復（ＳＴＲ）を検出するのに、定量的蛍光ＰＣＲによって増幅された。増幅生成物の定量的分析は２１トリソミーおよび１８トリソミーの診断を可能にし、一方で、性別判定が、Ｘ染色体およびＹ染色体に由来するＤＮＡ配列のＰＣＲ増幅を使用して同時に行われた。２組のＳＴＲマーカーを第２１染色体トリソミーの検出のために使用することにより、選択された染色体異常の迅速な出生前診断のための定量的蛍光多重ＰＣＲの有用性が確認された［Ｐｅｒｔｌ、ＯｂｓｔｅｔＧｙｎｅｃｏｌ．（２００１）Ｓｅｐ、９８（３）：４８３〜９０］。

別の研究では、ＤＮＡが、残りの羊水から抽出され、第２１染色体に存在する３つの小さいタンデム反復マーカーを用いて、蛍光に基づくＰＣＲ反応で増幅された。反応生成物が、２コピーまたは３コピーの第２１染色体の存在を特定するために、ＤＮＡシーケンサーで分析された。この方法を使用して、合計で９９．６％の有益な結果が３つのマーカーにより達成された（Ｖｅｒｍａ、１９９８）。蛍光性のＰＣＲ生成物による染色体定量分析が非多型の標的遺伝子に対してもまた行われた。ＤＳＣＲ１（ダウン症候群重要領域１）、ＤＣＣ（直腸結腸ガンでは欠失する）およびＲＢ１（網膜芽細胞腫１）の一部分の、Ｒａｈｉｌ他（２００２）により設定された同時増幅は、第２１染色体、第１８染色体および第１３染色体について異倍数性の分子的検出をそれぞれ可能にした。定量的分析が、４００の羊水の盲検的予測研究において行われた。連続したその後の核型分析がすべてのサンプルに対して行われ、分子的結果は、偽陽性または偽陰性の結果を伴うことなく、細胞遺伝学データと一致していた。従って、胎児ＤＮＡに対するＰＣＲを使用する染色体定量による異倍数性の診断は有効かつ信頼できる方法である。しかしながら、母体ＤＮＡが染色体定量を妨げることがあるので、これらの方法は、胎児ＤＮＡの純度に対して非常に敏感である。

単一細胞における異倍数性の検出。この方法は着床前遺伝子診断で使用される。ＤＮＡが、溶解された単一細胞から得られ、縮重オリゴヌクレオチドプライマーによるＰＣＲ（ＤＯＰ−ＰＣＲ）を使用して増幅される。生成物が、ニックトランスレーションを使用して標識され、正常な参照ゲノムＤＮＡと一緒にハイブリダイゼーションに供される。比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）の蛍光比プロフィルが、０．７５および１．２５のカットオフ閾値を用いて異倍数性を明らかにするために使用される。第１３染色体、第１８染色体または第２１染色体についてトリソミーであることが知られている単一細胞が、この技術を使用して分析された［Ｖｏｕｌｌａｉｒｅ他（１９９９）；Ｔａｂｅｔ（２００１）；Ｒｉｇｏｌａ他（２００１）］。

フィンガープリントシステムは、着床前遺伝子診断を行う別の方法である。大きいヘテロ接合性、既知の対立遺伝子サイズ範囲、および、最小限のＰＣＲスタッター人工物を有するテトラヌクレオチドのマイクロサテライトマーカーが、Ｘ染色体、第１３染色体、第１８染色体および第２１染色体について選択され、多重蛍光（ＦＬ）ＰＣＲ形式において最適化される［Ｋａｔｚ他（２００２）、ＨｕｍＲｅｐｒｏｄ．、１７（３）：７５２〜９］。しかしながら、胎児細胞の純粋な一部分を母親の血清から単離するために、未だ利用することができない技術的手法が要求されるので、これらの方法は体外受精について限定される。

母体循環における胎児細胞。この技術の大きな利点は、この技術が非浸襲的であり、従って、手法自体が妊娠に対する危険性を全く有しないということである。胎児ＤＮＡが５週間で検出されているので、潜在的には、ＣＶＳよりも早期に行うことができる。

ほんのわずかな胎児細胞（栄養芽層、リンパ球および有核赤血球）が母体循環に見出されるだけであり、従って、これらの細胞について選択し、かつ濃縮する必要がある。濃縮技術には、フロー／磁気分取および二重密度遠心分離が含まれる。１０００万個の母体細胞についておよそ１個〜２個の胎児細胞が存在し、その胎児細胞の５０％は核型決定のためには適していない。特に、リンパ球はこの技術における使用には適していない。これは、そのような細胞は数年の持続期間にわたって母体循環に留まっており、従って、結果が以前の妊娠によって影響され得るからである。この方法は、従来の核型決定と比較して、１つの染色体を調べるだけである。

ａ）ＦＩＳＨを、３つのシグナルを伴う細胞の割合を得るために可能な限り多くの細胞においてシグナル／細胞の数を観察するために使用することができる。プローブのハイブリダイゼーション効率は、認められるシグナルの数に劇的な影響を与え（それにより、結果を歪曲し）得る。

ｂ）プライマーによるｉｎｓｉｔｕ標識化（ＰＲＩＮＳ）は、相補的なゲノム部位に対する、特異的な未標識ＤＮＡプライマーのｉｎｓｉｔｕアニーリング、および、標識されたヌクレオチドを取り込むＰＣＲによるその後の伸長に基づいている。

ダウン症候群を診断する他の方法には、１０週間で採取され、培養および核型決定を必要とする体腔液、ならびに子宮腔洗浄／経子宮頸細胞サンプリングが含まれる。後者は羊水穿刺またはＣＶＳよりも浸襲的ではない。後者は７週間〜９週間で行われ、胎盤から離れた細胞を集めることを伴い、従って、直接的ＣＶＳと類似する。しかしながら、この方法は母親を汚染および感染にさらす。

このように、一般には染色体異常（すなわち、トリソミー）の出生前診断、具体的にはダウン症候群の出生前診断は複雑であり、未解決の技術的技能を要求し、完全に効果的ではなく、また、流産を生じさせることがある。ダウン症候群のための出生前検査は確定的でないという事実のために、健康な胎児の妊娠を中断させる危険性が高い。

従って、上記の制限を有しない、染色体異常をもたらす遺伝子座増幅を検出する方法が必要であることが広く認められており、また、そのような方法を有することは非常に好都合である。

本発明の１つの態様によれば、遺伝子座コピー数の変化を特定する方法が提供され、この場合、この方法は、遺伝子座内における少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を明らかにすることを含み、この方法では、この少なくとも１つの遺伝子の所定のメチル化状態とは異なるメチル化状態により、遺伝子座コピー数の変化が示される。

下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、遺伝子座コピー数の変化は、異倍数性および多倍数性からなる群から選択される染色体異常に由来する。

本発明の別の態様によれば、対象における遺伝子座コピー数の変化を特定する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）対象の染色体ＤＮＡを得ること、および（ｂ）染色体ＤＮＡのこの遺伝子座における少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を明らかにすることを含み、この方法では、この少なくとも１つの遺伝子の所定のメチル化状態とは異なるメチル化状態により、遺伝子座のコピー数の変化が示され、それにより、対象における遺伝子座コピー数の変化が特定される。

本発明のさらに別の態様によれば、遺伝子座コピー数の変化を出生前に特定する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）この遺伝子座を含む胎児または胚の染色体ＤＮＡを得ること、および（ｂ）この遺伝子座を含む胎児または胚の染色体ＤＮＡにおける少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を明らかにすることを含み、この方法では、この少なくとも１つの遺伝子の所定のメチル化状態とは異なるメチル化状態により、遺伝子座コピー数の変化が示され、それにより、遺伝子座コピー数の変化が出生前に特定される。

記載された実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、胎児または胚の染色体ＤＮＡを得ることは、（ｉ）羊水穿刺；（ｉｉ）胎児生検；（ｉｉｉ）絨毛生検；および／または母体生検によって行われる。

記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を明らかにすることは、（ｉ）制限酵素消化によるメチル化検出；（ｉｉ）重硫酸塩に基づくメチル化検出；（ｉｉｉ）質量分析法による分析；（ｉｖ）配列分析；および／または（ｖ）マイクロアレイ分析によって行われる。

本発明のさらに別の態様によれば、ダウン症候群を出生前に診断する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）胎児または胚の第２１染色体を得ること；および（ｂ）胎児または胚の第２１染色体における少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を明らかにすることを含み、この方法では、ダウン症候群において増幅されていない少なくとも１つの遺伝子が選択され、一方、所定のメチル化状態とは異なるメチル化状態により、胎児または胚の第２１染色体の増幅が示され、それにより、ダウン症候群が出生前に診断される。

記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの遺伝子は、ＡＰＰおよびシスタチオニン−β−シンターゼからなる群から選択される。

本発明のさらなる態様によれば、「生存と両立し得る」遺伝子を特定する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）増幅された染色体配列領域における多数の遺伝子のメチル化状態を明らかにすること；および（ｂ）この多数の遺伝子のうち、所定のメチル化状態とは異なるメチル化状態を示す遺伝子を特定し、それにより、「生存と両立し得る」遺伝子を特定することを含む。

本発明のさらにさらなる態様によれば、「生存と両立し得る」遺伝子を特定する方法が提供され、この場合、この方法は、（ａ）増幅された染色体配列領域における多数の遺伝子の発現レベルを明らかにすること；および（ｂ）この多数の遺伝子のうち所定の閾値よりも低い発現レベルを示す遺伝子を特定し、それにより、「生存と両立し得る」遺伝子を特定することを含む。

記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、多数の遺伝子の発現レベルを明らかにすることがｍＲＮＡレベルで行われる。

記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、多数の遺伝子の発現レベルを明らかにすることがタンパク質レベルで行われる。

本発明のなおさらなる態様によれば、包装材と、包装材に含有されている、遺伝子座コピー数の変化を検出するのに特定された試薬とを含む製造物が提供され、この場合、試薬は、遺伝子座における少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を明らかにすることができ、一方、この少なくとも１つの遺伝子の所定のメチル化状態とは異なるメチル化状態により、遺伝子座コピー数の変化が示される。

本発明のさらなる態様によれば、遺伝子座コピー数の変化を特定するためのキットが提供され、この場合、キットは、ＡＰＰおよびシスタチオニン−β−シンターゼからなる群から選択される、この遺伝子座における少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を明らかにするための試薬を含み、このキットでは、この少なくとも１つの遺伝子の所定のメチル化状態とは異なるメチル化状態により、遺伝子座コピー数の変化が示される。

記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、遺伝子座コピー数の変化は、異倍数性および多倍数性からなる群から選択される染色体異常に由来する。

本発明は、遺伝子座増幅を特定するための方法およびキットを提供することによって、現在知られている形態の欠点を対処することに成功している。

本明細書で使用される技術用語と科学用語はすべて、特に断らない限り、本発明の属する技術分野の当業者が共通して理解しているのと同じ意味を持っている。本明細書に記載されているのと類似の又は均等の方法と材料は本発明を実施又は試験するのに使用できるが、適切な方法と材料は以下に述べる。争いが生じた場合、定義を含めて本特許明細書が基準である。さらに、本明細書の材料、方法及び実施例は例示することだけを目的とし本発明を限定するものではない。

図面の説明
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１ａは、ヒトＡＰＰ領域のプロモーター領域から第１エキソンに及ぶＡＰＰプロモーターの増幅された生成物のヌクレオチド配列である。＋１は転写開始部位を示す。プライマー１のために使用された配列（配列番号１）およびプライマー２のために使用された配列（配列番号２）には二重下線が付される。長さが９ｂｐのＧＣリッチなエレメントの６コピーには下線が付される。Ｃの上のドットは、増幅されたプロモーター領域（−２５１〜＋２２）におけるＣｐＧダブレットでのシトシンを示す。図１ｂは、図１ａに示されるＤＮＡ配列のメチル化状態を検出するのに使用されたプライマーのヌクレオチド配列である。プライマー１（ａ〜ｂ）はスルホン化後またはスルホン化前のプライマー１の配列（配列番号１、ＡＰＰ−Ｆ）をそれぞれ表す。プライマー２（ｃ〜ｅ）はスルホン化後（ｃ）のプライマー２の配列（配列番号２、ＡＰＰ−Ｒ）をそのアンチセンス配向（ｄ）で表すか、または、スルホン化前（ｅ）のその配列を表す。
図２はアンドロゲン受容体エキソン１の生来的な配列のヌクレオチド配列（図２ａ）および重亜硫酸塩修飾された配列のヌクレオチド配列（図２ｂ）である。図２ａ−＃はフォワードプライマーの位置を示し、＃＃はリバースプライマーの位置を示し、^＊はＨｐａＩＩ部位を示し、^＊＊はＨｈａＩ部位を示す。図２ｂ−緑色の強調はＣｐＧアイランドを示し、ピンク色の下線はＣｐＧ部位を示し、（＃）はＡＲ−Ｆ−１（配列番号６０）の位置を示し、（^＊）はＡＲ−Ｆ−３４プライマー（配列番号６１）の位置を示し、（^＊＊）はＡＲ−Ｒ−２８２プライマー（配列番号６２）の位置を示す。
図３は男性、女性およびクラインフェルター症候群罹患の被験体におけるアンドロゲン受容体のメチル化状態の、制限酵素に基づく分析の生成物を可視化するアガロースゲルの写真である。レーン１−ＤＮＡマーカー；レーン２−陰性コントロール；レーン３−ＸＸ非切断；レーン４−ＸＹ非切断；レーン５−ＸＹ非切断；レーン６−Ｘトリソミー非切断；レーン７−ＸＸ切断；レーン８−ＸＹ切断；レーン９−ＸＹ切断；レーン１０−Ｘトリソミー切断。
図４は生来的なＤＳＣＡＭプロモーターのヌクレオチド配列（図４ａ）および重亜硫酸塩修飾されたＤＳＣＡＭプロモーターのヌクレオチド配列（図４ｂ）である。（＃）はフォワードプライマーの位置を示し、（＄）はリバースプライマーの位置を示す。緑色の強調はＣｐＧアイランドを示す。
図５は生来的なＩＦＮＡＲ１プロモーターのヌクレオチド配列（図５ａ）および重亜硫酸塩修飾されたＩＦＮＡＲ１プロモーターのヌクレオチド配列（図５ｂ）である。緑色の強調はＣｐＧアイランドを示す。（^＊）はＩＦＮＲ−ｆ４−ｂｉｓ（配列番号２４７）の位置を示し、（^＊＊）はＩＦＮＲ−ｎｅｓ−ｆ−ｂｉｓ（配列番号２４９）の位置を示し、（^＊＊＊）はＩＦＮＲ−ｒ４−ｂｉｓ（配列番号２４８）の位置を示す。

本発明は、染色体異常を生じさせる遺伝子座コピー数異常を特定するのに使用されることができる方法およびキットの発明である。特に、本発明はトリソミーなどの遺伝子座増幅を出生前に検出するのに使用されることができる。

本発明の原理および操作は、図面および添付された説明を参照してより良く理解することができる。

本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は、他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施することができ、または様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現および用語は説明のためであり、従って限定として見なされるべきではないことを理解しなければならない。

遺伝病は、異倍数性、正倍数性および多倍数性などの染色体数の変化によって最も頻繁に引き起こされる病理学的状態である。染色体数またはその一部におけるそのような変化は、通常、胚または胎児にとって致死性である。２１トリソミー（ダウン症候群）、１８トリソミー（エドワーズ症候群）、１３トリソミー（パトー症候群）および性染色体が唯一の生きて生まれる常染色体トリソミーである。２１トリソミーとは対照的に、１３トリソミーおよび１８トリソミーの障害は、より重篤な臨床的症状発現を有する傾向があり、また、罹患した新生児がその最初の５年間を生き延びることはほんの希である。多数の異常がトリソミー障害の胎児には存在しているが、特定のトリソミーについて典型的な異常は１つだけではない。むしろ、特異的な診断を示唆する特徴的な一群の臨床的知見が存在する。その上、これらの患者の一部はトリソミー細胞株についてモザイク状であり得るので、様々な表現型が可能である。

今日まで、どのトリソミー障害についても特異的な処置、治療または治療薬はない。これらの理由から、一般には染色体異常の早期出生前診断、具体的にはトリソミーの早期出生前診断が非常に求められている。

トリソミーの出生前診断を行うための現在利用可能な方法には、超音波検査、および、羊膜細胞または絨毛膜細胞の細胞遺伝学的分析が含まれる。超音波検査は高い偽陽性率によって制限される一方で、浸襲性検査は完全に有効ではなく、高い技術的技能を要求し、また、流産をもたらす場合がある。あるいは、母体血清中の循環している胎児ＤＮＡの診断的使用は、現在、母親ではなく、胎児に見出される遺伝子または変異に限定される。

下記の実施例の節においてさらに記載されるように、染色体異常についての新しい診断様式を探し求めているとき、本発明者らは、常染色体のトリソミーまたはモノソミーが、その過剰発現が生存と両立しない遺伝子のサイレンシングのために出生後の生存を可能にしていることを発見した。

ＤＮＡメチル化は、遺伝子発現が原核生物および真核生物の両方でサイレンシングされる可逆的機能である。このレベルの遺伝子発現制御が、特にプロモーター配列領域においてメチル基をシトシンのピリミジン環の５番目の炭素位置に付加することができるメチルトランスフェラーゼの能力によって達成される［Ａｄａｍｓ（１９９５）、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、１７（２）：１３９〜４５］。真核生物細胞におけるメチル化された配列は、通常、不活性である［ＧｏｌｄおよびＰｅｄｅｒｓｅｎ（１９９４）］。

異常なＤＮＡメチル化がガンにおける広範囲に及ぶ現象であり、また、ガン発生時に生じる最も初期の変化の１つであり得ることが明確に明らかにされている［Ｓｔｉｒｚａｋｅｒ（１９９７）、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、５７（１１）：２２２９〜３７］。ＤＮＡメチル化はまた、遺伝子刷り込み、胚発達、Ｘ染色体サイレンシングおよび細胞周期調節において中心的な役割を果たすことが示されている［Ｃｏｓｔｅｌｌｏ（２００１）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．、３８（５）：２８５〜３０３］。遺伝子メチル化の正常なパターンを明らかにすることができないことが、レット症候群（精神遅延の主要な形態）、プラーダー・ヴィリ症候群、アンゲルマン症候群、ＩＣＦ症候群およびベックウィズ・ヴィーデマン症候群をはじめとする数多くの遺伝病についての原因である。

ＤＮＡメチル化が遺伝子サイレンシングにおいて果たす中心的な役割を考慮すると、同じ機構が、その過剰発現が致死的である（すなわち、生存と両立しない）遺伝子のサイレンシングを生じさせるために用いられることが非常に考えられる。このことは、遺伝子座増幅を検出するのに、遺伝子メチル化状態の決定が使用され得ることを示唆している。

実際、ダウン症候群の臨床的表現型（すなわち、精神遅延、先天性の心臓疾患およびその他）に関係している第２１染色体上の様々な遺伝子がＤＳ患者ではトリソミーレベルで発現しているが、ダウン症候群患者における第２１染色体からの遺伝子の全体的な遺伝子発現には、マイクロアレイ分析によって明らかにされるように、著しい違いがない［ＧｒｏｓｓＳＪ、ＦｅｒｒｅｉｒａＪＣ、ＭｏｒｒｏｗＢ、ＤａｒＰ、ＦｕｎｋｅＢ、ＫｈａｂｅｌｅＤ、ＭｅｒｋａｔｚＩ、２１トリソミーの胎盤の遺伝子発現プロフィル：出生前診断の非浸襲的技術を設計するための潜在的方法、ＡｍＪＯｂｓｔｅｔＧｙｎｅｃｏｌ．、２００２（８月）、１８７（２）：４５７〜６２］。

これらの知見は、ＤＮＡメチル化が、第２１染色体の余分なコピー体における生命に関わる遺伝子のサイレンシングをもたらすように作用することを示唆している。この仮定は、ダウン症候群患者における第２１染色体のｈ２−カルポニン遺伝子が第２１染色体の３つのコピー体のうちの１つにおけるメチル化のために過剰発現していないことを示したＫｕｒａｍｉｔｓｕおよび共同研究者らによってさらに立証されている［Ｋｕｒｏｍｉｔｓｕ（１９９７）、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、２：７０７〜１２］。

遺伝子座コピー数の変化と、メチル化状態との間でのこの新しく特定された連関は、実行することが簡便であり、費用効果的であり、かつ、個体に対する最小限の危険性をもたらすか、または、個体に対する危険性を全くもたらさない分子生物学的技術を使用して染色体異常を効果的に検出することを初めて可能にしている。

従って、本発明の１つの態様によれば、遺伝子座コピー数の変化を特定する方法が提供される。

本明細書中で使用される用語「遺伝子座」は、染色体上の遺伝子の場所または存在位置を示す。本発明のこの態様によるこの方法では、第１染色体〜第２２染色体、Ｘ染色体およびＹ染色体に存在する遺伝子座の増大（以降、遺伝子座増幅）または喪失を検出することができる。

本明細書中で使用される表現「遺伝子座増幅」は遺伝子座コピー数の増加を示す。本発明のこの態様による遺伝子座増幅および遺伝子座欠損は、染色体構造における変化（例えば、重複化、反転、転座、欠失、挿入）から、かつ／あるいは、染色体数またはその一部（これはまた染色体マーカーとも呼ばれる）における増加または減少（＞２ｎ）から生じ得る。染色体数の変化は、完全な１組の染色体ではなく、１つ以上の染色体の増大または喪失を伴う異倍数性である場合がある（例えば、トリソミーおよびテトラソミー）。あるいは、遺伝子座増幅は、完全な３組以上の染色体が存在する多数倍性から生じる場合がある。

身体の特定の細胞タイプにのみ存在する染色体数の変化（すなわち、モザイク現象）もまた本発明のこの態様に従って検出され得ることが理解される［ＭｏｄｉＤ、ＢｅｒｄｅＰ、ＢｈａｒｔｉｙａＤ、ダウン症候群：染色体モザイク現象の研究、ＲｅｐｒｏｄＢｉｏｍｅｄＯｎｌｉｎｅ、２００３（Ｊｕｎ）、６（４）：４９９〜５０３］。

本発明のこの態様によるこの方法は、遺伝子座における少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態（すなわち、メチル化のパターンおよび／またはレベル）を明らかにすることによって行われる。そのような少なくとも１つの遺伝子の所定のメチル化状態とは異なるメチル化状態により、遺伝子座コピー数の変化が示される。

本明細書中で使用される「メチル化の所定の状態」は、好ましくは同じ発達状態の、増幅されていない遺伝子座から得られる同一遺伝子のメチル化状態を示す。

従って、上記遺伝子座における少なくとも１つの遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子のメチル化状態の変化により、本発明のこの態様に従って、遺伝子座コピー数の変化が示される。

典型的には、ヒトＤＮＡのメチル化は、隣接するグアニンおよびシトシンを含み、シトシンがグアニンの５’側に存在するジヌクレオチド配列（これはまたＣｐＧジヌクレオチド配列とも呼ばれる）において生じる。ＣｐＧジヌクレオチド内のほとんどのシトシンがヒトゲノムではメチル化されており、しかしながら、一部は、ＣｐＧジヌクレオチドが多い特定のゲノム領域（これはＣｐＧアイランドとして知られている）ではメチル化されないままである［Ａｎｔｅｑｕｅｒａ，Ｆ．他、Ｃｅｌｌ、６２：５０３〜５１４（１９９４）を参照のこと］。「ＣｐＧアイランド」は、ＣｐＧジヌクレオチドがＤＮＡ配列の少なくとも５０％を構成するＣｐＧジヌクレオチドリッチ領域である。

従って、本発明のこの態様によるメチル化状態は、典型的には、好ましくはプロモーター領域におけるＣｐＧアイランドにおいて明らかにされる。だが、ヒトゲノムにおける他の配列もＤＮＡメチル化を受けやすいことが理解される（例えば、ＣｐＡおよびＣｐＴなど）［Ｒａｍｓａｈｏｙｅ（２０００）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：５２３７〜５２４２；ＳａｌｍｏｎおよびＫａｙｅ（１９７０）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、２０４：３４０〜３５１；Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ（１９８５）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１３：２８２７〜２８４２；Ｎｙｃｅ（１９８６）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１４：４３５３〜４３６７；Ｗｏｏｄｃｏｃｋ（１９８７）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１４５：８８８〜８９４を参照のこと］。

本明細書中上記で述べられたように、遺伝子座内における少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態が明らかにされる。実施例の節の実施例１〜実施例４には、Ｘ染色体、第９染色体および第２１染色体の増幅を明らかにするために使用することができる数多くの遺伝子が列挙される。

好ましくは、そのような少なくとも１つの遺伝子はその発現パターンに従って選択される。従って、その遺伝子座が増幅されるが、発現における変化を示さない、すなわち、２つだけの遺伝子コピー体と矛盾しない発現パターンを示す遺伝子のメチル化が明らかにされる。そのような遺伝子の例が下記の表１に列挙される。

遺伝子発現を明らかにする様々な方法がこの分野では広く知られている。例には、オリゴヌクレオチドを使用するハイブリダイゼーションに基づく技術をはじめとするＲＮＡに基づく方法（例えば、ノーザンブロッティング、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、プライマー伸長、マイクロアレイ分析およびドットブロット分析）、または、特異的な抗体を使用して行うことができるタンパク質に基づく方法（例えば、クロマトグラフィー、電気泳動、免疫検出アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析など）、免疫組織化学およびその他など）が含まれるが、これらに限定されない。さらなる技術的詳細については、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｏｃｏｌ−ｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／において入手可能な実験室参考図書、および、下記の実施例の節において引用される他の参考文献を参照のこと。

遺伝子メチル化を明らかにするための数多くの方法がこの分野では広く知られており、そのような方法には、制限酵素消化に基づくメチル化検出、および、重硫酸塩に基づくメチル化検出が含まれる。いくつかのそのような方法が、下記において、また、下記の実施例の節の実施例１においてまとめられている（メチル化を検出するのに有用な技術に関するさらなる詳細が、Ａｈｒｅｎｄｔ（１９９９）、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．、９１：３３２〜９；Ｂｅｌｉｎｓｋｙ（１９９８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１１８９１〜９６；Ｃｌａｒｋ（１９９４）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２２：２９９０〜７；Ｈｅｒｍａｎ（１９９６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：９８２１〜２６；ＸｉｏｎｇおよびＬａｉｒｄ（１９９７）、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２５：２５３２〜２５３４に開示される）。

制限酵素消化メチル化検出アッセイ
このアッセイは、一部の酵素はメチル化ＤＮＡを切断することができないことに基づいている。ＣＣＧＧの認識モチーフを含むＨｐａＩＩ−ＭｓｐＩの酵素対、および、ＣＣＣＧＧＧのより低い頻度の認識モチーフを有するＳｍａＩ−ＸｍａＩの酵素対が典型的には使用される。従って、例えば、ＨｐａＩＩは、内部のシトシンがメチル化されているときにはＤＮＡを切断することができず、このことがＨｐａＩＩ−ＭｓｐＩを迅速なメチル化分析のための有益なツールにしている。この方法は、通常、サザンブロット分析と一緒に行われる。解釈することが困難な結果を与えない対策が、遺伝子配列を分析するために取られる。従って、ＣＧメチル化非感受性酵素（例えば、ＢａｍＨＩ）に対する制限部位が隣接する目的とする領域が最初に選択される。そのような配列は、ＨｐａＩＩに対する部位が５個〜６個よりも多く含まれないように選択される。サザンブロットまたはＰＣＲのために使用されるプローブはこの領域内に存在しなければならず、また、この領域を完全または部分的に覆わなければならない。この方法は、Ｂｕｌｌｅｒおよび共同研究者ら（１９９９）（卵巣ガン患者の生殖系列ＤＮＡにおける非ランダムなＸ染色体不活性化とＢＲＣＡ１変異との関連、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．、９１（４）：３３９〜４６）によって用いられ、成功している。

メチル化感受性酵素（例えば、ＨｐａＩＩ）による消化は多くの場合には部分的であるので、メチル化されたＣｐＧ部位のみを切断するＭｃｒＢＣまたは他の酵素を用いた補完的分析が、様々なメチル化パターンを検出するのに好ましい［Ｙａｍａｄａ他、ＧｅｎｏｍｅＲｅｓｅａｒｃｈ、１４：２４７〜２６６、２００４］。

重硫酸塩に基づくメチル化検出
ゲノム配列決定。ゲノム配列決定技術［Ｃｌａｒｋ他（１９９４）、上掲］は、１００個未満の細胞から単離されたＤＮＡを使用して、任意の標的配列の両方の鎖におけるすべてのメチル化シトシンを検出することができる。この方法では、重亜硫酸ナトリウムが、５−メチルシトシンが未反応のままである条件のもとで、一本鎖ＤＮＡにおいてシトシン残基をウラシル残基に変換するために使用される。変換されたＤＮＡが特異的なプライマーにより増幅され、配列決定される。配列に残留するシトシン残基のすべてが、ゲノムにおける以前にメチル化されたシトシンを表す。この方法では、生殖細胞および初期の発生段階から容易に得ることができる少量のゲノムＤＮＡに由来する１つだけの遺伝子のメチル化マッピングを可能にするために、変性、重亜硫酸塩変換および増幅の効率を最大にする規定された手順が利用される。

メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）。これは、メチル化の高感度検出のための最も広く使用されているアッセイである。簡単に記載すると、増幅の前に、ＤＮＡが、すべての非メチル化シトシンをウラシル変換するために重亜硫酸ナトリウムで処理される。重亜硫酸塩との反応により、メチル化情報が配列の違いに効果的に変換される。ＤＮＡが、ＤＮＡの１つの特定のメチル化状態（例えば、ＤＮＡがすべてのＣｐＧでメチル化されている状態など）と一致するプライマーを使用して増幅される。このメチル化状態がＤＮＡサンプルに存在するならば、生じたＰＣＲ生成物をゲル上で可視化することができる。

だが、方法特異的なプライマー伸長は、プライマー結合部位内のすべてのＣｐＧが同時にメチル化されることを要求することが理解される。従って、同時メチル化が存在するとき、増幅生成物がゲル上で認められる。ＣｐＧの１つ以上がメチル化されていないときには、生成物が認められない。従って、この方法は、メチル化の部分的なレベルと、メチル化の完全な非存在とを区別することができない［米国特許第５７８６１４６号；Ｈｅｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３：９８２１〜９８２６（１９９６）を参照のこと］。第２１染色体の増幅を示すメチル化を検出するための例示的なプライマーが下記の実施例の節の実施例２に示される。

リアルタイム蛍光ＭＳＰ（ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ）。蛍光プローブをＭＳＰと一緒に用いるリアルタイムＰＣＲの使用は、処理能が大きい均一反応を可能にする。プローブがＣｐＧを含まないならば、反応は本質的にはＭＳＰの定量的な形態である。しかしながら、蛍光プローブは、典型的には、１つ以上のＣｐＧを含有する部位にアニーリングするように設計され、また、この第３のオリゴヌクレオチドにより、完全にメチル化された標的鎖についてのアッセイの特異性が増大する。増幅の検出がリアルタイムで行われるので、二次的な電気泳動工程は必要でない。サンプルのＰＣＲ後の操作がないので、汚染の危険性が低下している。ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔプローブは、Ｔａｑｍａｎプローブ対またはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒハイブリダイゼーションプローブ対（これらに限定されない）をはじめとする任意の形式が可能であり、また、多数のレポーター色素が使用されるならば、数個のプローブを同時に行うことができる［Ｅａｄｓ（１９９９）、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、５９：２３０２〜２３０６；Ｅａｄｓ（２０００）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２８：Ｅ３２；Ｌｏ（１９９９）、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、５９：３８９９〜３９０］。ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔによる定量的分析の利点が、前立腺ガンにおけるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−Ｐ１（ＧＳＴＰ１）のメチル化を用いて明らかにされた［Ｊｅｒｏｎｉｍｏ（２００１）、Ｊ．Ｎａｔｌ．ＣａｎｃｅｒＩｎｓｔ．、９３：１７４７〜１７５２］。この方法を使用したとき、良性の前立腺肥大サンプル、前立腺の上皮内新生物領域、および局在化した前立腺腺ガンにおいてメチル化を示すことが可能であった。

重亜硫酸塩修飾されたＤＮＡの制限分析。ＣＯＢＲＡ（Ｘｉｏｎｇ他、１９９７、上掲）とも呼ばれるこの定量的技術は、少量のゲノムＤＮＡにおいて特定の遺伝子の遺伝子座におけるＤＮＡメチル化レベルを明らかにするために使用することができる。制限酵素消化が、重亜硫酸ナトリウムで処理されたＤＮＡのＰＣＲ生成物におけるメチル化に依存した配列の違いを解明するために使用される。元のＤＮＡサンプルのメチル化レベルが、広範囲のＤＮＡメチル化レベルの全域で直線的に定量的な様式で、消化されたＰＣＲ生成物および消化されていないＰＣＲ生成物の相対的な量によって表される。この技術は、顕微解剖されたパラフィン包埋組織サンプルから得られるＤＮＡに対して信頼性よく適用することができる。従って、ＣＯＢＲＡは、使用が容易なこと、定量的正確性、およびパラフィン切片との適合性の強力な特徴を併せ持つ。

示差的メチル化ハイブリダイゼーション（ＤＭＨ）。ＤＭＨは、メチル化されたＣｐＧジヌクレオチドのゲノムフラグメントの存在または非存在を検出するのに、高密度のマイクロアレイに基づくスクリーニング法を統合したものである［Ｓｃｈｅｎａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：４６７〜４７０（１９９５）を参照のこと］。アレイに基づく技術が、１つだけの領域における数多く（例えば、＞３）のメチル化部位が分析されるときに使用される。最初に、ゲノムライブラリー由来のＣｐＧジヌクレオチド核酸フラグメントを作製し、増幅し、固体支持体に固定して、ＣｐＧジヌクレオチドが多いスクリーニング用アレイを作製する。アンプリコンが、ＤＮＡをフラグメントに消化するが、メチル化されたＣｐＧアイランドを無傷のままに残す制限エンドヌクレアーゼを用いてサンプル由来のＤＮＡを消化することによって作製される。このようなアンプリコンが、スクリーニング用アレイに固定されたＣｐＧジヌクレオチドリッチフラグメントをプローブして、ＤＮＡサンプルのＣｐＧジヌクレオチドリッチ領域におけるメチル化パターンを特定するために使用される。一度に１つの遺伝子を分析することに限定される他のメチル化分析方法（例えば、サザンハイブリダイゼーション、重亜硫酸塩ＤＮＡ配列決定、およびメチル化特異的ＰＣＲなど）とは異なり、ＤＭＨでは、ゲノムにおける多数のメチル化関連遺伝子の同時分析を可能にするために特に設計された、ＣｐＧジヌクレオチドが多い数多くのゲノムフラグメントが利用される（さらなる詳細については米国特許第６６０５４３２号を参照のこと）。

ＤＮＡメチル化を分析するためのさらなる詳細およびさらなる手法（例えば、質量分析法による分析）が下記において得られる：ＴｏｓｔＪ、ＳｃｈａｔｚＰ、ＳｃｈｕｓｔｅｒＭ、ＢｅｒｌｉｎＫ、ＧｕｔＩＧ、ＭＡＬＤＩ質量分析法によるＣｐＧメチル化の分析および正確な定量、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２００３（５月１日）、３１（９）：ｅ５０；ＮｏｖｉｋＫＬ、ＮｉｍｍｒｉｃｈＩ、ＧｅｎｃＢ、ＭａｉｅｒＳ、ＰｉｅｐｅｎｂｒｏｃｋＣ、ＯｌｅｋＡ、ＢｅｃｋＳ、エピゲノミクス：メチル化現象の全ゲノム研究、ＣｕｒｒＩｓｓｕｅｓＭｏｌＢｉｏｌ．、２００２（１０月）、４（４）：１１１〜２８。総説：ＢｅｃｋＳ、ＯｌｅｋＡ、ＷａｌｔｅｒＪ、ゲノミクスからエピゲノミクスへ：生命のより高尚な見解、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９９（１２月）、１７（１２）：１１４４；Ｆａｎ（２００２）、ＯｎｃｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｓ、９：１８１〜１８３；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｔｈｏｄｓ−ｏｎｌｉｎｅ．ｎｅｔ／ｍｅｔｈｏｄｓ／ＤＮＡｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ；Ｓｈｉ（２００３）、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｃｈｅｍ．、８８（１）：１３８〜４３；Ａｄｏｒｙｉａｎ（２００２）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、３０（５）：ｅ２１。

数多くの市販のキットが、遺伝子のメチル化状態を検出するのに使用され得ることが理解される。例には、ＥＺＤＮＡメチル化キット^ＴＭ（これはＺｙｍｏＲｅｓｅａｒｃｈ（６２５ＷＫａｔｅｌｌａＡｖｅ、Ｏｒａｎｇｅ、ＣＡ９２８６７、米国）から入手することができる）が含まれるが、これに限定されない。

典型的には、本明細書中上記に記載された、重硫酸塩に基づくメチル化検出方法のためのオリゴヌクレオチドが、選択された技術に従って設計される。

本明細書中で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはそれらの模倣体の一本鎖または二本鎖のオリゴマーまたはポリマーを示す。この用語は、天然に存在する塩基、糖、および共有結合のヌクレオチド間連結（例えば、骨格）から構成されるオリゴヌクレオチド、ならびに、それぞれの天然に存在する部分と類似した機能を有する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチド（例えば、米国特許第４４６９８６３号、同第４４７６３０１号、同第５０２３２４３号、同第５１７７１９６号、同第５１８８８９７号、同第５２６４４２３号、同第５２７６０１９号、同第５２７８３０２号、同第５２８６７１７号、同第５３２１１３１号、同第５３９９６７６号、同第５４０５９３９号、同第５４５３４９６号、同第５４５５２３３号、同第５４６６６７７号、同第５４７６９２５号、同第５５１９１２６号、同第５５３６８２１号、同第５５４１３０６号、同第５５５０１１１号、同第５５６３２５３号、同第５５７１７９９号、同第５５８７３６１号および同第５６２５０５０号に開示されるオリゴヌクレオチド）を包含する。

従って、例えば、メチル化特異的ＰＣＲの特異性に影響を及ぼす最も重要なパラメーターがプライマー設計によって決定される。重亜硫酸塩によるＤＮＡの修飾は鎖の相補性を破壊するので、どちらの鎖もその後のＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして役立たせることができ、その後、それぞれの鎖のメチル化パターンを明らかにすることができる。だが、一本鎖（例えば、センス鎖）を増幅することが実際には好ましいことが理解される。様々なプライマーが、修飾されていないＤＮＡがプライマーのためのテンプレートとして役立たないことを確実にするために元の鎖に十分なシトシンを取り込む長さが８０ｂｐ〜２５０ｂｐである領域を増幅するために設計される。加えて、ＣｐＧジヌクレオチド内におけるシトシンの数および位置により、メチル化テンプレートおよび非メチル化テンプレートについてのプライマーの特異性が決定される。典型的には、１個〜３個のＣｐＧ部位が各プライマーに含まれ、各プライマーの３’領域に集中する。これにより、最適な特異性がもたらされ、かつ、誤ったプライマー伸長に起因する偽陽性が最小限に抑えられる。同じサーモサイクラーにおける所与遺伝子のプライマーのそれぞれの同時分析を容易にするために、プライマーの長さは、ほぼ等しい融解温度／アニーリング温度を与えるように調節される。

その上、ＭＳＰでは、特異的なプライマー認識が、メチル化された対立遺伝子と、メチル化されていない対立遺伝子とを区別するために利用されるので、厳しいアニーリング条件が増幅期間中において維持される。本質的には、アニーリング温度が、アニーリングおよびその後の増幅を可能にするために最大限に選択される。好ましくは、計算された融解温度よりも５度〜８度低いアニーリング温度を有するプライマーが設計される。さらなる詳細については、ＨｅｒｍａｎおよびＢａｙｌｉｎ（１９９８）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ）を参照のこと。

本発明の教示に従って設計されるオリゴヌクレオチドを、この分野で知られている任意のオリゴヌクレオチド合成法（例えば、酵素的合成または固相合成など）に従って作製することができる。固相合成を実行するための装置および試薬が、例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｐｓｙｓｔｅｍｓから市販されている。そのような合成のための任意の他の手段もまた用いることができる：オリゴヌクレオチドの実際の合成は十分に当業者の能力の範囲内であり、固相化学を利用して、例えば、シアノエチルホスホルアミダイト、その後の脱保護、脱塩、および、例えば、自動化されたトリチル−オン法またはＨＰＬＣによる精製を利用して、例えば、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）；「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」、第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ」（ＪｏｈｎＷｉｌｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９８８）、および、「ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編、１９８４）に詳しく記載されるような確立された方法論によって達成することができる。

本明細書中上記の方法論は、（上記の）遺伝子座コピー数の変化に関連する様々な病理を検出するのに使用することができる。

そのような病理の例には、様々なトリソミー、これには、１トリソミー、２トリソミー、３トリソミー、４トリソミー、５トリソミー、６トリソミー、７トリソミー、８トリソミー、９トリソミー、１０トリソミー、１１トリソミー、１２トリソミー、１３トリソミー（パトー症候群）、１４トリソミー、１５トリソミー、１６トリソミー、１７トリソミー、１８トリソミー（エドワーズ症候群）、１９トリソミー、２０トリソミー、２１トリソミー（ダウン症候群）、２２トリソミー、超女性症候群（クラインフェルター症候群）、三重Ｙ症候群、部分的な６ｑトリソミー、９ｐトリソミー、１１ｑトリソミー、モザイク状１４トリソミー、モザイク状２２トリソミーが含まれる；モノソミー、例えば、１モノソミーおよびＸモノソミー（ターナー症候群）など、テトラソミー、例えば、１８ｐテトラソミーなど；三倍体性、例えば、三倍数性症候群（希な疾患についての全国組織（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒａｒｅｄｉｓｅａｓｅｓ．ｏｒｇ／）および染色体モザイク現象（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｄｇｅｎ．ｕｂｃ．ｃａ／ｗｒｏｂｉｎｓｏｎ／ｍｏｓａｉｃ／ｃｏｎｔｅｎｔｓ．ｈｔｍｌ）を参照のこと）など；および、ガン、例えば、慢性骨髄性白血病などが含まれるが、これらに限定されない。

被験体における遺伝子座コピー数の変化を特定するために、ＤＮＡサンプルが個体被験体（すなわち、哺乳動物）から得られ、本明細書中上記に記載されたように分析される。本発明のこの態様による好ましい被験体は任意の発達段階のヒトである（例えば、着床前胚の被験体、胚の被験体、胎児の被験体、新生児の被験体、および出生後の被験体）。

出生後検査が、典型的には、古典的な染色体症候群を除外するために行われ、また、多重的な先天性異常（ＭＣＡ）を有する個体、染色体異常を有する個体の両親または兄弟姉妹、平衡した染色体異常または構造的染色体異常を有する個体の子供、２回以上の流産の病歴を有する夫婦、不妊問題を有する夫婦、生殖器形成不全の個体、原発性無月経の女性、精神遅延者、および、思春期不全の男女を核型決定して行われる。

ＤＮＡが、個体被験体（すなわち、出生前、出生後の被験体）の生物学的サンプルから得られる。本明細書中で使用される場合、生物学的サンプルの表現は、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、尿、ならびに、皮膚、気道、腸管および泌尿生殖管の外側切片、涙液、唾液、乳汁、血液細胞、腫瘍、器官（これらに限定されない）をはじめとする個体から単離される組織または体液のサンプルを示し、また、インビボ細胞培養構成成分のサンプルをも示す。好ましくは、組織生検物、血液または骨髄サンプルが使用される。

血液が、好ましくは、ヘパリンナトリウムまたはＥＤＴＡで被覆された試験管に集められる。新生児は少なくとも１ｍｌ〜２ｍｌの血液が必要であり、子供または成人は少なくとも３ｍｌ〜５ｍｌの血液が必要である。白血球分析のためには、細胞は、１０％の未成熟な細胞を伴う１００００個以上でなければならない。

骨髄（０．５ｃｃ〜２ｃｃの骨髄）が骨髄輸送培地またはヘパリンナトリウム試験管に集められる。

組織生検物［３ｍｍの標本、例えば、胎盤、臍帯、皮膚（これは典型的には、モザイク現象の程度を試験するために使用される）］が無菌の生理学的食塩水または無菌の組織培養培地に集められる。

典型的には、末梢血由来のＤＮＡが使用される。正常な循環しているリンパ球は培養条件下では分裂しないので、リンパ球が得られ、細胞分裂（すなわち、有糸分裂）を誘導するために外部刺激因子（すなわち、分裂促進因子）にさらされる。刺激された細胞は、４５時間〜９６時間のインキュベーションの後の任意の時間で集めることができる。

サンプルが得られると、ゲノムＤＮＡが、好ましくは、例えば、Ｑｉａｇｅｎ（２８１５９ＡｖｅｎｕｅＳｔａｎｆｏｒｄ、Ｖａｌｅｃｉａ、ＣＡ９１３５５）から入手可能なＱＩＡａｍｐ血液キットを使用することなどによって抽出され、上記で記載されたように分析される。

染色体異常は流産および先天的欠損症の主要な原因であるので、上記の方法論は、好ましくは、出産前の子供における遺伝子座増幅を特定するために使用される。母親の血液から得られた胎児ＤＮＡのメチル化が、出生前スクリーニングにおける本発明のエピジェネティクマーカーの使用を可能する重亜硫酸塩修飾を使用して検出され得ることが十分に明らかにされている［Ｐｏｏｎ他（２０００）、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、４８：３５〜４１を参照のこと］。

ＤＮＡを胚（すなわち、受胎から発達の８週間までの発達中の乳児）または胎児（すなわち、発達の９週間から出産までの発達中の乳児）の細胞から得る様々な方法がこの分野で広く知られている。例には、母体生検（例えば、子宮頸サンプリング、羊水穿刺サンプリング、血液サンプリング）、胎児生検（例えば、肝生検）および絨毛生検が含まれるが、これらに限定されない（背景の節および米国特許第６３３１３９５号を参照のこと）。

母体血液からの胎児ＤＮＡの単離は、発達中の乳児に危険性を何らもたらさない非浸襲的手法であるので、本発明のこの態様に従って使用されることが好ましい［Ｌｏ（１９９８）、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、６２（４）：７６８〜７５を参照のこと］。

細胞を含まない胎児ＤＮＡを母体の循環から集め、上記に記載されるように分析することができる［Ｂａｕｅｒ（２００２）、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、１８６：１１７〜２０；Ｂａｕｅｒ（２００１）、Ａｎｎ．ＮＹＡｃａｄ．Ｓｃｉ．、９４５：１６１〜３；Ｐｅｒｔｌ（２００１）、Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、９８：４８３〜９０；Ｓａｍｕｒａ（２０００）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、１０６：４５〜９を参照のこと］、

あるいは、胎児細胞を、固定化された抗体が胎児細胞に結合し、その濃縮を容易にするために胎児細胞を捕獲する抗体捕獲技術を使用して母体血液から濃縮することができる［Ｍｕｅｌｌｅｒ他、「妊婦の末梢血からの胎児栄養膜細胞の単離」、ＴｈｅＬａｎｃｅｔ、３３６：１９７〜２００（１９９０）；Ｇａｎｓｈｉｒｔ−Ａｈｌｅｒｔ他、「母体血液からの出生前診断の潜在的手段としての磁気細胞分取および移送受容体」、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、１６６：１３５０〜１３５５（１９９２）］。

胎児細胞はまた、フローサイトメトリーなどの細胞分取手法を容易にするために、抗体および他の特異的な結合性成分により標識することができる［Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ他、「妊婦の血液における胎児細胞：蛍光活性化細胞分取による検出および濃縮」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、７６：１４５３〜１４５５（１９７９）；Ｂｉａｎｃｈｉ他、「母体血液中の有核赤血球からの胎児ＤＮＡの単離」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８７：３２７９〜３２８３（１９９０）；Ｂｒｕｃｈ他、「フローサイトメトリーを使用して末梢の母体血液から分取された栄養膜様細胞：透過電子顕微鏡および胎児ＤＮＡ増幅を伴うマルチパラメーター研究」、ＰｒｅｎａｔａｌＤｉａｇｎｏｓｉｓ、１１：７８７〜７９８（１９９１）；Ｐｒｉｃｅ他、「マルチパラメーターフローサイトメトリーによって母体血液から単離された胎児細胞を用いた出生前診断」、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、１６５：１７３１〜１７３７（１９９１）］。

ＰＣＲ技術が、典型的には、胎児ＤＮＡの相対量を増大させ、従って、分析を可能にするために一緒に使用される［Ｂｉａｎｃｈｉ他、「母体血液中の有核赤血球からの胎児ＤＮＡの単離」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、８７：３２７９〜３２８３（１９９０）；Ａｄｋｉｎｓｏｎ他、「ポリメラーゼ連鎖反応による母体血液由来の胎児細胞の改善された検出」、Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．、１７０：９５２〜９５５（１９９４）；Ｔａｋａｂａｙａｓｈｉ他、「母体血液からの非浸襲的胎児ＤＮＡ診断の開発」、ＰｒｅｎａｔａｌＤｉａｇｎｏｓｉｓ、１５：７４〜７７（１９９５）］。

母体循環における胎児細胞を使用する出生前診断の具体的な形態が米国特許第６３３１３９５号に開示される。

例えば、血液（５０ｍｌ）を妊娠８週間〜２０週間の妊婦から得ることができる。単核細胞（ＭＮＣ）画分がＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅでの遠心分離によって単離され、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−６（１００ｕ／ｍｌ）を使用して、１０％ＦＣＳを含むアルファ培地において５・１０^６／ｍｌで７日間培養される。その後、非接着細胞が回収され、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−３（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−６（１００ｍｕ／ｍｌ）だけでなく、３０％ＦＣＳ、１％ＢＳＡ、１０^−４Ｍβ−メルカプトエタノール、ならびにペニシリンおよびストレプトマイシンを含むアルファ培地において３・１０^５／ｍｌで再置床される。すべてのインキュベーションが、５％ＣＯ_２、および、大気または５％酸素のいずれかとともに加湿インキュベーターにおいて行われる。２１日後、細胞が回収される。上記に記載されるようなメチル化分析のために、細胞が遠心分離され、ＤＮＡが、標準的な方法を使用して抽出される。

胎児細胞を母体血液から濃縮するためのキットを、ＡＶＩＶＡＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｖｉｖａｂｉｏ．ｃｏｍ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｆｅｔａｌ＿ｃｅｌｌ＿ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）から入手することができる。

胚または胎児のＤＮＡはまた胎児死亡または流産の後でも得ることができることが理解される。この場合、培養が、酵素的に解離させた細胞および組織片（外植片）を使用して胚または胎児の組織から開始される。組織が適切な培養条件に置かれたとき、細胞は表面に接着し、単層物として成長する。

本発明の方法論を使用して得られる染色体情報は、この分野で広く知られている数多くの細胞学的技術（例えば、ギムザ染色）およびハイブリダイゼーションに基づく技術（例えば、ＦＩＳＨ）を使用して、妥当性をさらに確認することができる（例えば、米国特許第５９０６９１９号および同第５５８０７２４号を参照のこと）。

上記に記載されるような遺伝子座増幅を明らかにするための試薬は、パックまたはディスペンサーデバイスで、例えば、診断キットなどで提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイル（例えば、ブリスターパックなど）を含むことができる。パックまたはディスペンサーデバイスには、診断のための説明書が伴い得る。

本発明はまた、上記で記載されたように、異常なメチル化をもたらす異常なＤＮＡメチル化機構に関連する様々な病理を検出するのに使用され得ることが理解される。例には、プラーダー・ヴィリ症候群、アンゲルマン症候群、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、レット症候群およびＩＣＦ症候群が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＩＣＦ症候群は、Ｄｎｍｔ３ｂと呼ばれるＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素の異常な機能によって引き起こされる。同様に、ｍＣ（これはＭｅＣＰ２と呼ばれる）を認識し、これに結合するタンパク質の１つにおける異常は、レット症候群（若年の女性を冒す精神遅延の一形態）を引き起こす。

女性のＸ染色体のもう一方のコピー体における遺伝子はＤＮＡメチル化によって抑制される［Ｇｏｔｏ（１９９８）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、６２（２）：３６２〜７８］ので、性別決定（例えば、出生前の性別決定）もまた、本発明によって意図されることがさらに理解される。

本発明は、生存と両立し得る遺伝子（生命に関わる遺伝子）の特定を可能にすることがさらに理解される。

従って、本発明の別の態様によれば、「生存と両立し得る」遺伝子を特定する方法が提供される。

この方法は、上記で記載されたように、増幅された染色体配列領域における多数の遺伝子のメチル化状態を明らかにすることによって行われる。

その後、多数の遺伝子のうち、所定のメチル化状態とは異なるメチル化状態を示す遺伝子が特定され、それにより、「生存と両立し得る」遺伝子が特定される。

そのような方法は、遺伝子に注釈を付けるために、また、新規な治療標的を特定するために効果的に用いることができる。

本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。

上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。

本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡｌａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編１９９４年「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ」ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ」ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ」ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎＢｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＳｅｒｉｅｓ」１〜４巻、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編「ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＨａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編「ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「ＢａｓｉｃａｎｄＣｌｉｎｉｃａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「ＳｅｌｅｃｔｅｄＭｅｔｈｏｄｓｉｎＣｅｌｌｕｌａｒＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓＳ．Ｊ．編「ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓＳ．Ｊ．編「ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｎｄＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「ＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓａｎｄＥｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬＰｒｅｓｓ１９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著「ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ；「ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅＴｏＭｅｔｈｏｄｓＡｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「ＳｔｒａｔｅｇｉｅｓｆｏｒＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬＰｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。

材料および実験手法
ＤＮＡ抽出。ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ血液キット（Ｑｉａｇｅｎ、２８１５９ＡｖｅｎｕｅＳｔａｎｆｏｒｄ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、９１３５５）を使用して血漿サンプルおよび羊水サンプルから抽出する。８００μｌの血漿または羊水を１個のカラムについてＤＮＡ抽出のために使用する。ＤＮＡを、５０μｌ〜１１０μｌの溶出緩衝液を使用して溶出する。ＮｕｃｌｅｏｎＤＮＡ抽出キット（ＳｃｏｔｌａｂｓＷｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を製造者の説明書に従って使用して白血球の軟膜からＤＮＡを抽出する。

ＤＮＡの重亜硫酸塩処理。ＤＮＡ（２μｇまで）を５０μｌの蒸留水に希釈し、これに５．５μｌの２ＭＮａＯＨを加える。その後、５μｇのサケ精子ＤＮＡを反応混合物に加える。

溶液を５０℃で１０分間インキュベーションし、それにより一本鎖ＤＮＡを生じさせる。ハイドロキノン［１０ｍＭハイドロキノン（Ｓｉｇｍａ）の３０μｌ、５５ｍｇのハイドロキノンを５０ｍｌの水に加えることによって新たに調製されたもの］を各チューブに加える。その後、５２０μｌの新たに調製された３Ｍ重亜硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓ−８８９０；１．８８ｇｍの重亜硫酸ナトリウムを５ｍｌのＨ_２Ｏあたり加え、ｐＨをＮａＯＨで５．０に調節することによって調製されたもの）を溶液に加える。ＤＮＡ溶液が均一に混合されることを確実にするための手段が取られる。ＤＮＡ溶液をミネラルオイルで覆い、５０℃で１６時間または７０℃で１時間〜２時間インキュベーションする。より長いインキュベーション期間は、メチル化シトシンがチミジンに変換することを回避するために避けられる。インキュベーションが終了したら、オイルを除く。１ｍｌのＤＮＡＷｉｚａｒｄクリーンアップ（ＰｒｏｍｅｇａＡ７２８０）溶液を各チューブに加え、溶液をキット内のミニプレップカラムに加える。真空を適用し、カラムを２ｍｌの８０％イソプロパノールで洗浄する。ＤＮＡを、５０μｌの温水（すなわち、８０℃）を加えることによって清浄な標識された１．５ｍｌチューブに溶出する。チューブを１分間遠心分離し、５．５μｌの３ＭＮａＯＨを各チューブに加える。スルホン化ＤＮＡの溶液を室温で５分間インキュベーションする。

１μｌのグリコーゲンをキャリアとして加え（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＩｎｇｅｌｈｅｉｍＧｍｂＨ、ドイツ）、３３μｌの１０ＭＮＨ_４Ａｃおよび３体積のエタノールを加える。ＤＮＡを、少なくとも１時間から一晩、−２０℃で沈殿させ、７０％エタノールで洗浄する。乾燥したペレットを２０μｌの水に再懸濁し、−２０℃で貯蔵する。

増幅反応。１μｌ量のスルホン化ＤＮＡ溶液を、１ＸＧＣ緩衝液２（ＴａＫａＲａＳｈｕｚｏ、Ｋｙｏｔｏ、日本）、各２．５ｍＭのｄＮＴＰ、５ＵのＴａＫａＲａＬＡＴａｑｅ（ＴａＫａＲａＳｈｕｚｏ、Ｋｙｏｔｏ、日本）、および５０ｐｍｏｌのアンチセンスプライマーを含有する５０μｌのＰＣＲ反応混合物に加える。反応混合物を９４℃の温度で５分間インキュベーションする。

予備加熱の後、重亜硫酸塩処理されたＤＮＡのセンス配列の相補鎖を下記のように２サイクルについて伸長させる：９４℃で１分間、６０℃で３分間および７２℃で３分間。

その後、５０ｐｍｏｌのセンスプライマーを加え、混合物を９４℃に加熱する。

ＤＮＡを、９４℃で１分間、６０℃で１．５分間および７２℃で２分間の８サイクルについて増幅する。

９４℃で１分間、５５℃で１．５分間および７２℃で２分間の３０サイクルによるさらなる増幅を行う。

得られたＰＣＲ生成物におけるメチル化を制限酵素分析または直接的な配列決定によって検出する。

制限酵素によるメチル化部位の検出。上記に記載されるようなチミンへのメチルシトシンの化学的修飾はＨｐａＩＩおよびＨａｈＩの制限酵素部位を変化させ、その結果、これらの酵素がＤＮＡをそれらのそれぞれの部位で消化することができないようにする。シトシンのメチル化により、メチル化感受性酵素はこれらの部位で消化することができなくなり、一方、他の酵素（例えば、メチル化に寛容であるＭｓｐＩなど）は一定の制限パターンをもたらす。重硫酸塩で処理されたＤＮＡに対するそのような酵素の使用により、特定の制限酵素を使用してメチル化部位を区別することができる（下記の実施例３におけるさらなる詳細を参照のこと）。

ＭｃｒＢＣによるメチル化。ＭｃｒＢＣはＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓから得られる。この酵素を５μｇのゲノムＤＮＡに加え、反応液を、製造者の説明書に従って３７℃で一晩インキュベーションする。酵素を６５℃での２０分間のインキュベーションによって不活性化する。５０μｇの消化されたＤＮＡをＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用する。プロモーター特異的なプライマーを使用する。生成物をアガロースゲル分離によって分析する。

ＰＣＲ生成物の直接的な配列決定。得られたＰＣＲ生成物を、市販のキット（例えば、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎなど）を使用して精製し、市販の自動シーケンサーによって配列決定する。

対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション。このアッセイでは、目的とする遺伝子におけるすべての候補メチル化部位を含有する大きいフラグメントが増幅される。ＰＣＲ生成物は、フルオレセインまたは他の蛍光体（Ｃｙ３、Ｃｙ５）による１つのヌクレオチド標識を含有する。生成物を標識するための第２の方法は、ＰＣＲ生成物に取り込む放射性ヌクレオチド（^３２Ｐ、^３３Ｐ、^３５Ｓ、^３Ｈまたは^１４Ｃ）による方法である。ＰＣＲ生成物を、その後、シトシンに対してメチル化シトシン（すなわち、チミン）についての特異的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションさせる。そのようなオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションは、マイクロアレイ法を使用してガラス上またはニトロセルロース上で行うことができる。

変異（またはＳＮＰ）を検出するための市販のキット。メチル化部位の検出を「Ｇａｍｉｄａｇｅｎｅ」社の市販されているいくつかの「Ｐｒｏｎｔｏ」キットによって行うことができる。これらのキットは、目的とするメチル化部位を認識するために設計および構成された特異的なプローブと併せて変異および／または単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出するのに設計されている。同様に、ヌクレオチド配列における変異を認識することができる他の方法もまた使用することができる。例えば、増幅不応性変異システム（ＡＲＭＳ）。この方法では、２つの補完的反応が使用される。一方が、正常な対立遺伝子について特異的なプライマーを含有し、もう一方が変異対立遺伝子を含有する（両方とも、共通する第２のプライマーを有する）。このＰＣＲプライマーは変化ＤＮＡと完全に一致するので、核型決定している完全に一致した対立遺伝子の優先的な増幅が確認される。上記で記載されたように、重亜硫酸塩によってチミンに変換されるメチルシトシンがこの方法によって検出可能である。

実施例１
第２１染色体の遺伝子
下記の表２には、ＧａｒｄｉｎｅｒおよびＤａｖｉｓｓｏｎ（ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙ、２０００、１（２）：再検討０００２．１〜０００２．９）によって注記されるような第２１染色体の１２２個の遺伝子の帰属された機能が示される。その大部分は完全なｃＤＮＡ配列または推定上の完全なｃＤＮＡ配列を有する。機能的注記は、直接的な実験の文献報告に基づいて、または、他のタンパク質に対する類似性からの推定に基づいて帰属された。部分的な構造情報のみを有する遺伝子の注記は、それにおける特定の機能的ドメインに基づいており、（^＊）によって示される（ＧａｒｄｉｎｅｒＫ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅｂｉｏｌｏｇｙ．ｃｏｍ／２０００／１／２／ｒｅｖｉｅｗｓ／０００２．１）。

様々な機能的カテゴリーが、広範囲に記述するために選ばれた。各遺伝子が１つだけのカテゴリーに現れる。

実施例２
２１トリソミーの遺伝子、およびそのメチル化状態を検出するのに使用することができるプライマー
背景
原線維アミロイドタンパク質がニューロン内に神経原線維錯綜として、細胞外にプラークとして、また血管内に沈着することは、アルツハイマー病（ＡＤ）患者および加齢したダウン症候群患者の両方の特徴である。これらの沈着物の中に見出される主要なタンパク質は、その前駆体（第２１染色体（２１ｑ２１．２）に突き止められているアミロイドタンパク質前駆体）の異常な異化に由来すると考えられる不溶性かつ非常に凝集している小さいポリペプチドａ４である。

実験手法
ＡＰＰ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｘ１２７５２２）の増幅を検出するのに、ＡＰＰプロモーター領域のメチル化を重亜硫酸塩配列決定によって明らかにする。

下記の表４は好ましいＰＣＲ条件を示す。

得られたＰＣＲ生成物を配列決定し、それによりチミンへのシトシン置換を特定する。ＡＰＰプロモーターからの増幅されたＰＣＲ生成物（ＡＰＰ−ＦおよびＡＰＰ−Ｒのプライマーを使用する；図１ｂ）を図１ａに示す。

あるいは、得られたＰＣＲ生成物をオリゴヌクレオチドマイクロアレイにハイブリダイゼーションさせることができる。

下記の表５および表６には、上記で記載されたように、重亜硫酸塩によるＤＮＡ処理の後で、ヒトの第２１染色体におけるメチル化されたＤＮＡ部分を特定するために使用することができるいくつかのオリゴヌクレオチド形態が示される。

実施例３
Ｘトリソミーの遺伝子、およびそのメチル化状態を検出するのに使用することができるプライマー
女性において、重複しているＸ染色体のほとんどの遺伝子の１組はサイレンシングを受けている。サイレンシングは、典型的には、そのような遺伝子のプロモーターのＣｐＧメチル化によって生じている。いくつかのメチル化分析手法を、男性、女性およびクラインフェルター症候群罹患の被験体におけるアンドロゲン受容体（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００４４）のメチル化状態を検出するのに用いた。

実験手法
細胞。男性、女性およびクラインフェルター症候群罹患の胚の１２日間培養された羊膜細胞をＣｏｒｉｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＪ）から得た。クラインフェルター細胞、カタログ番号：ＧＭＯ３１０２。正常細胞、カタログ番号。

ＤＮＡ抽出。細胞を２５００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを、７５ｍＭのＮａＣｌおよび２５ｍＭのＥＤＴＡを含む溶解緩衝液に再懸濁し、十分にボルテックス処理して、形質膜を崩壊させた。その後、１０％ＳＤＳ溶液（最終体積の１／１０）を混合物に加え、溶液を反転によって混合した。溶液を、プロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍｌ、最終体積の１／１０）の存在下、５５℃で一晩インキュベーションした。等体積のフェノール：クロロホルム（１：１）を溶液に加え、反転によって（５分間）十分に混合し、１４０００ｘｇで１５分間遠心分離して相分離させた。クロロホルムを上部相に加え、溶液を、５分間、反転によって十分に混合し、１４０００ｘｇで５分間遠心分離して相分離させ、上部相を集め、これに３Ｍ酢酸ナトリウム（最終体積の１／１０）を加え、反転によって十分に混合した。ＤＮＡを一晩のエタノール沈殿（７０％）に供し、その後、濃度および純度を測定した。

制限酵素に基づく分析
０．５μｇのＤＮＡ分子（すなわち、重亜硫酸塩処理物または重亜硫酸塩非処理物）をＨｐａＩＩ（３０ユニット、ＮＥＢ酵素、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、０１９１５−５５９９、米国）により消化した。完全な消化を確実にするために、インキュベーションを、新しい酵素を８時間のインキュベーションの後でさらに加えることを含めて一晩行わせた。

消化後、消化混合物からの２μｌのＤＮＡを、下記の表７に示されるプライマーを使用し、かつ、下記の表８〜表９に記載される条件のもとでのＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。

約３００ｂｐの得られたＰＣＲ生成物を２．５％アガロースゲルで分離し、可視化した。

メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）
ＤＮＡを、本明細書中上記の実験手法において記載されたように重亜硫酸塩処理した。

プライマーおよびＰＣＲ条件を、表１０、表１１および表１２にそれぞれ示す。

生成物の同一性を２段階のネスティングＰＣＲ反応によって確認した。そのプライマーを下記の表１３に示し、ＰＣＲ条件を下記の表１４〜表１６に示す。最初のＰＣＲのＤＮＡテンプレートを重亜硫酸塩修飾のために使用した（約５０ｎｇ）。ＰＣＲ生成物を２回目のＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した（最終体積の１／２０）。反応生成物を配列決定した。

重亜硫酸塩修飾されたＤＮＡからアンドロゲン受容体の第１エキソンを増幅するためのＰＣＲ条件を下記の表１５および表１６に示す。

工程ＩＩのＰＣＲ生成物を２．５％アガロースゲルにおいて分離し、市販の精製キット（ＧＦＸＰＣＲカタログ番号２７−９６０２−０１、ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＰｉｓｃａｔａｗａｙＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＪ、０８８５５、米国）によって精製し、その後、ｐＧＥＭプラスミド（ｐＧＥＭ−ＴＥａｓｙＶｅｃｔｏｒベクターシステムＩ（カタログ番号Ａ１３６０）またはｐＧＥＭ−ＴＶｅｃｔｏｒベクターシステムＩ（カタログ番号Ａ３６００）、ＰｒｏｍｅｇａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、米国）にサブクローン化した。正確な配列決定を、各ＰＣＲ生成物の５個〜１０個のクローンを配列決定することによって確認した。配列決定をＡＢＩシーケンサー装置によって行った。

結果
ＨｐａＩＩおよびＨｈａＩの制限部位とともにアンドロゲン受容体の第１エキソンの生来的な配列を図２ａに示す。重亜硫酸塩修飾の後で得られる推定される配列を図２ｂに示す。

図３および図４は、制限酵素に基づく分析およびメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）によって明らかにされたときの、男性、女性およびクラインフェルター症候群罹患の被験体におけるアンドロゲン受容体のメチル化状態の結果を示す。

図３に示されるように、ＸＹ（すなわち、男性）被験体から得られたＨｐａＩＩ処理ＤＮＡサンプルのＰＣＲ増幅は生成物をもたらさなかった。しかしながら、ＸＸ被験体およびＸＸＹ被験体から得られたＨｐａＩＩ処理ＤＮＡサンプルを使用した同じ反応は２８０ｂｐの明らかなバンド（アンドロゲン受容体エキソン１の第１エキソンの生成物）をもたらした。

男性およびクラインフェルター症候群罹患の被験体に由来するアンドロゲン受容体の第１エキソンのメチル化状態のＭＳＰ分析は、メチル化されたプライマーを使用するＤＮＡ増幅が、クラインフェルター症候群罹患の被験体（すなわち、４６ＸＸＹ）から得られたＤＮＡでのみ生じたことを示していた。

まとめると、これらの結果は、クラインフェルター症候群罹患の被験体におけるアンドロゲン受容体のＤＮＡメチル化媒介による遺伝子サイレンシングを明瞭に裏付けており、また、本発明をこの病理のための有益な診断ツールであるとして示唆している。

ＭＳＰは部分的なメチル化（すなわち、所与の対立遺伝子における必ずしもすべてのメチル化部位が実際にはメチル化されていない）を効率的に検出しないので、オリゴヌクレオチドマイクロアレイの使用が好都合であり得ることが理解される。

そのようなマイクロアレイにおいて効率的に使用することができるオリゴヌクレオチドを下記の表１７に示す。

実施例４
本発明の教示に従って特定された第２１染色体の常染色体トリソミーのための推定されるマーカー
本明細書中上記で述べられたように、増幅された染色体または染色体領域に存在する遺伝子は、おそらくは、特異的な遺伝子サイレンシングをもたらす上流のプロモーター領域のメチル化のために、通常の場合には過剰発現していない。

下記の表１８には、正常な被験体から得られた羊膜細胞に対する、ダウン症候群罹患の被験体から得られた羊膜細胞における第２１染色体の遺伝子発現の比率が示される。Ｘ＜１．５の比率は遺伝子サイレンシングを示す（ｗｗｗ．ｈｇｕ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｃｅｌｌｇｅｎ／Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ／Ｕｎｉｇｅｎｅ／ｔ２１ａｌｌ．ｈｔｍｌ）。

上記の表１８から、トリソミー状態において、第２１染色体の遺伝子の発現における変動性が存在することが明らかである；いくつかの遺伝子は非常に過剰発現しており（すなわち、Ｘ＝１．５の比率；例えば、ＰＤＸＫ）、一方、他の遺伝子は過小発現している（すなわち、Ｘ＜１の比率；例えば、ＤＳＣＡＭ）。この変動性に対する理由は、メチル化されているＣｐＧ部位の数が考えられる。従って、例えば、１．２の比率は、過剰な対立遺伝子における必ずしもすべてのＣｐＧ部位がメチル化を受けておらず、一方、依然としてメチル化されているＣｐＧ部位は１．５倍の過剰発現（すなわち、３つの対立遺伝子の最大の過剰発現）を妨げていることを示唆する。

実施例５
第２１染色体のＤＳＣＡＭ遺伝子およびＩＦＮＡＲ１遺伝子は第２１染色体トリソミーでは部分的にメチル化されている
（実施例５ａ）
ＤＳＣＡＭ
ダウン症候群細胞接着分子（ＤＳＣＡＭ）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ２１７５２５）を、第２１染色体トリソミーにおける部分的にサイレンシングされた遺伝子（すなわち、Ｘ＜１．５）のメチル化パターンを示すために選んだ。

ＤＳＣＡＭの第１エキソンの上流側のＣｐＧアイランドのメチル化がＤＳ患者におけるこの遺伝子の過剰発現を阻害しているかもしれないという仮説が立てられた。ＤＳＣＡＭプロモーターの生来的な配列が図４ａに示される。重亜硫酸塩処理の後で得られた推定される配列が図４ｂに示される。

実験手順
細胞。健康な胚およびＤＳ罹患の胚に由来する１２日間培養された羊膜細胞をＣｏｒｉｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＪ）から得た。ＤＳ細胞、カタログ番号ＧＭＯ２０６７。正常細胞、カタログ番号。ＤＮＡ抽出。上記の実施例３を参照のこと。

ＤＳＣＡＭメチル化の配列決定に基づく分析。下記の表１９〜表２１には、健康な被験体およびダウン症候群罹患の被験体に由来する組織および細胞からＤＳＣＡＭを増幅するために使用されたプライマーおよびＰＣＲ条件が示される。

ＰＣＲ反応を、下記の表１９に示されるプライマーと、上記の表１４に記載される反応混合物試薬および濃度とを使用して行った。

得られたＰＣＲ生成物は１４２ｂｐであった。

ＰＣＲ生成物を２回目のＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した（最終体積の１／２０）。

得られたＰＣＲ生成物は１３５ｂｐであった。ＰＣＲ反応混合物を３％アガロースゲルに負荷し、１３５ｂｐの生成物を、上記の実施例３に記載されるように精製した。生成物の配列同一性を、これもまた本明細書中上記に記載されるように配列決定によって確認した。

結果
ＤＳの胚に由来する羊膜細胞におけるＤＳＣＡＭのメチル化状態の配列分析は、２例において、クローンの２５％がＣｐＧ部位におけるメチル化を呈することを示した。これらの結果はＤＳＣＡＭのほんの部分的なメチル化を示しており、このことから、ＤＳＣＡＭのメチル化を検出するためのオリゴヌクレオチドマイクロアレイの使用が好ましいことが示唆される。ＤＳＣＡＭのメチル化を検出するのに好適なオリゴヌクレオチドが下記の表２２に示される。

（実施例５ｂ）
ＩＦＮＡＲ１
上記の表１８から、インターフェロン（α、βおよびω）受容体１（ＩＦＮＡＲ１、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＵ１３７５６５）が第２１染色体トリソミーでは部分的にサイレンシングされていることは明らかである。ＩＦＮＡＲ１のメチル化パターンを、実施例５ａに記載されるように細胞および組織において調べた。ＩＦＮＡＲ１プロモーターの生来的な配列が図５ａに示される。重亜硫酸塩処理の後で得られた推定される配列が図５ｂに示される。

実験手順
細胞。上記参照。

ＤＮＡ抽出。上記の実施例３を参照のこと。

ＤＳＣＡＭメチル化の配列決定に基づく分析。下記の表２３〜表２５には、健康な被験体およびダウン症候群罹患の被験体に由来する組織および細胞からＩＦＮＡＲ１を増幅するために使用されたプライマーおよびＰＣＲ条件が示される。

ＰＣＲ反応を、下記の表２３に示されるプライマーと、上記の表１４に記載される反応混合物試薬および濃度とを使用して行った。

得られたＰＣＲ生成物は２３１ｂｐであった。

得られたＰＣＲ生成物は１８６ｐであった。

ＰＣＲ反応生成物を２．５％アガロースゲルで分離し、１８６ｂｐの生成物を、上記の実施例３に記載されるように精製した。生成物の配列同一性を、これもまた本明細書中上記に記載されるように配列決定によって確認した。

結果
ＩＦＮＡＲ１対立遺伝子のメチル化がＤＳサンプルにおいて認められた。

上記から、ＤＳＣＡＭおよびＩＦＮＡＲ１のメチル化状態は第２１染色体トリソミーのための有益な診断マーカーとして役立ち得ることが考えられる。これらの結果はまた、第２１染色体トリソミーにおいてアップレギュレーションされていない他の遺伝子もまた染色体増幅のためのマーカーとして役立ち得ることを示している。

実施例６
第１３染色体の常染色体トリソミーのための推定されるマーカー
下記の表２６には、正常な被験体から得られた羊膜細胞に対する、１３トリソミーの遺伝子型決定された被験体から得られた羊膜細胞における第１３染色体の遺伝子発現が示される（ｗｗｗ．ｈｇｕ．ｍｒｃ，ａｃ．ｕｋ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｃｅｌｌｇｅｎ／Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ／Ｕｎｉｇｅｎｅ／ｔ１３ａｌｌ．ｔｈｍｌ）。興味深いことに、ほとんどの遺伝子がサイレンシングを受けている（ＲＮＡはむしろ定常レベルである）第２１染色体トリソミーとは対照的に、第２１染色体の増幅の生存性を説明する遺伝子発現のこのプロフィルが第１３染色体には存在しない。

実施例７
９トリソミーの遺伝子、およびそのメチル化状態を検出するのに使用することができるプライマー
９トリソミーは希な染色体障害である。特徴的な特徴には、胎児の遅れた成長、出生時に存在する心臓欠陥、顔の異常（例えば、低い位置および／または奇形の耳）、異常に小さい頭、腎臓および／または生殖器の異常、骨格異常（例えば、動かない関節および／または脱臼した関節）、ならびに／あるいは、脳の奇形が含まれる。

第９染色体上のｐ１６が、細胞周期および多くの病変（メラノーマ、膀胱ガンおよび肺ガンを含む）における中心的な役割を果たしている。ｐ１６（腫瘍抑制因子遺伝子）の発現が様々なガン（例えば、膀胱ガン、結腸ガンおよび網膜芽細胞腫など）では抑制されている。ｐ１６プロモーターにおけるＣｐＧアイランドのメチル化が特定の場合においてこの遺伝子の不活性化の原因であることが示されている［Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ（２００３）、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２２（２０）：３０９２〜８；Ｖｉｒｍａｎｉ（２００３）、ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌＢｉｏｌ．、２００３、２２２：９７〜１１５］。

ＣｐＧＷＩＺ（登録商標）ｐ１６増幅キット（ＣｈｅｍｉｃｏｎＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）によってｐ１６プロモーターのメチル化状態を明らかにするために使用する。このキットは、配列が重亜硫酸塩処理の後で最も異なる、プロモーターの様々な領域に標的化されるプライマーを含有する。ＰＣＲパラメーターは、キット内のすべてのプライマー組が同じ条件のもとで増幅するように特定されている。ｐ１６についてのコントロールのゲノムＤＮＡサンプル（メチル化体および非メチル化体）もまた含まれる。

実験手順
重亜硫酸塩による変換を、ＣｐＧｅｎｏｍｅＤＮＡ修飾キット（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ）を使用して行う。１μｇのＤＮＡを製造者の推奨法に従って重亜硫酸ナトリウムで処理する。変換後、重亜硫酸塩処理ＤＮＡを２５μｌの総体積で再懸濁する。

下記の表２７には、上記遺伝子のメチル化状態を検出するのに使用される方法がまとめられている。

明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。

本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更及び変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更及び変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許及び特許願はすべて、個々の刊行物、特許及び特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。

図１ａは、ヒトＡＰＰ領域のプロモーター領域から第１エキソンに及ぶＡＰＰプロモーターの増幅された生成物のヌクレオチド配列である。図１ｂは、図１ａに示されるＤＮＡ配列のメチル化状態を検出するのに使用されたプライマーのヌクレオチド配列である。アンドロゲン受容体エキソン１の生来的な配列のヌクレオチド配列（図２ａ）および重亜硫酸塩修飾された配列のヌクレオチド配列（図２ｂ）である男性、女性およびクラインフェルター症候群罹患の被験体におけるアンドロゲン受容体のメチル化状態の、制限酵素に基づく分析の生成物を可視化するアガロースゲルの写真である。生来的なＤＳＣＡＭプロモーターのヌクレオチド配列（図４ａ）および重亜硫酸塩修飾されたＤＳＣＡＭプロモーターのヌクレオチド配列（図４ｂ）である。生来的なＩＦＮＡＲ１プロモーターのヌクレオチド配列（図５ａ）および重亜硫酸塩修飾されたＩＦＮＡＲ１プロモーターのヌクレオチド配列（図５ｂ）である。

配列番号１〜２４９は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。

Claims

遺伝子座増幅を出生前に特定する方法であって、前記方法は、遺伝子座を含む出生前の染色体ＤＮＡ中の前記遺伝子座における少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を明らかにすることを含み、前記少なくとも１つの遺伝子は、２倍体の状態の発現パターンを有するように選択され、２倍体の状態における前記少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態と比較した前記遺伝子座における前記少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態の増加により、出生前の対象における遺伝子座増幅が示される方法。
ダウン症候群を出生前に検出する方法であって、前記方法は、出生前の第２１染色体における少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を明らかにすることを含み、前記少なくとも１つの遺伝子は、２倍体の状態の発現パターンを有するように選択され、２倍体の状態における前記少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態と比較した前記少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態の増加により、前記少なくとも１つの遺伝子の増幅が示され、それにより、ダウン症候群が出生前に検出される方法。
前記少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を明らかにすることは、（ｉ）制限酵素消化によるメチル化検出；（ｉｉ）重硫酸塩に基づくメチル化検出；（ｉｉｉ）質量分析法による分析；（ｉｖ）配列分析；および／または（ｖ）マイクロアレイ分析によって行われる請求項１または２に記載の方法。
遺伝子座は、第１染色体、第２染色体、第３染色体、第４染色体、第５染色体、第６染色体、第７染色体、第８染色体、第９染色体、第１０染色体、第１１染色体、第１２染色体、第１３染色体、第１４染色体、第１５染色体、第１６染色体、第１７染色体、第１８染色体、第１９染色体、第２０染色体、第２１染色体、第２２染色体、Ｘ染色体、及びＹ染色体からなる群から選択される染色体上に位置する請求項１に記載の方法。
出生前の染色体ＤＮＡは、（ｉ）羊水穿刺；（ｉｉ）胎児生検；（ｉｉｉ）絨毛生検；（ｉｖ）母体生検；（ｖ）血液サンプル採取；（ｖｉ）子宮頸サンプル採取；および／または（ｖｉｉ）尿サンプル採取によって得られる請求項１または２に記載の方法。