MX2011000566A - Genotipificacion no invasora de rhd fetal a partir de sangre completa materna. - Google Patents

Genotipificacion no invasora de rhd fetal a partir de sangre completa materna.

Info

Publication number
MX2011000566A
MX2011000566A MX2011000566A MX2011000566A MX2011000566A MX 2011000566 A MX2011000566 A MX 2011000566A MX 2011000566 A MX2011000566 A MX 2011000566A MX 2011000566 A MX2011000566 A MX 2011000566A MX 2011000566 A MX2011000566 A MX 2011000566A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
seq
exon
rhd
primers
gene
Prior art date
Application number
MX2011000566A
Other languages
English (en)
Inventor
Wen-Hua Fan
Roger Tim
Karena Kosco
Ram Bhatt
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of MX2011000566A publication Critical patent/MX2011000566A/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

La presente invención describe los métodos para determinar el genotipo de RHD de un sujeto. En particular, la invención proporciona un método no invasor para determinar el genotipo de RhD fetal a partir de una muestra biológica materna que contiene células fetales. La invención también proporciona nuevas sondas y cebadores útiles en los métodos descritos. Se describen también los kits y las mezclas que comprenden las nuevas sondas y cebadores.

Description

GENOTIPIFICACION NO INVASORA DE RhD FETAL A PARTIR DE SANGRE COMPLETA MATERNA Antecedentes de la Invención La prueba prenatal es comúnmente realizada para determinar una o más características genéticas del feto,; tales como el género, marcadores de trastornos o enfermedades genéticas, y anormalidades cromosómicas . Una prueba prenatal de este tipo es la determinación del estado del antígeno D de Rhesus fetal (RhD) . Esta prueba es particularmente importante para madres embarazadas quienes son RhD-negativas . Una madre RhD-negativa que posee un feto RhD-positivo puede desarrollar anticuerpos hacia el antígeno RhD expresado sobre la superficie de las células sanguíneas rojas (eritrocitos) fetales. Debido a que los anticuerpos son capaces de pasar hacia la circulación fetal vía la placenta, el feto RhD-positivo está en riesgo de una enfermedad o trastorno hemolítico del feto y del neonato (HDFN, por sus siglas en inglés) , en el cual los anticuerpos maternos anti-D atacan las células sanguíneas rojas fetales D-positivas, provocando lisis en ellas. El riesgo de HDFN es significativamente incrementado para embarazos subsiguientes en los cuales el feto es RhD-positivo. HDFN está caracterizado por anemia fetal con reticulocitosis en su forma más leve, y letalidad fetal en su forma más severa.
Ref. 217148 Es práctica prenatal estándar administrar un tratamiento profiláctico de inmunoglobulina anti-RhD para todas las madres embarazadas RhD-negativas aproximadamente a las 28 semanas de gestación, con un refuerzo opcional a las 34 semanas de gestación, para prevenir el desarrollo de anticuerpos maternos contra el RhD hacia los eritrocitos fetales en circulación que pueden expresar el antígeno superficial D. No obstante, hasta aproximadamente 38% de estas mujeres estarían llevando un feto RhD-negativo y pueden recibir el tratamiento profiláctico innecesariamente.
Los métodos actualmente disponibles para determinar el estado RhD fetal involucran típicamente procedimientos invasores para obtener células fetales para la prueba. Por ejemplo, la muestra de vello coriónico (CVS) o la amniocentesis puede ser realizada para clasificar el estado RhD o las anormalidades genéticas. Sin embargo, la mala portación espontánea, la infección, y la aloinmunización están asociadas con tales procedimientos invasores . De este modo, el desarrollo de un procedimiento no invasor para determinar el estado fetal de RhD es deseable para evitar complicaciones asociadas con pruebas de diagnóstico invasoras y la administración innecesaria de tratamientos profilácticos caros .
Breve Descripción de la Invención La presente invención está basada, en parte, en el desarrollo de métodos no invasores para aislar ADN fetal de muestras de sangre materna y el descubrimiento de que la detección de las regiones específicas de exones particulares del gen de RhD son predictivas del genotipo RhD . En consecuencia, la presente invención proporciona métodos no invasores para determinar el genotipo RhD de un sujeto, particularmente un sujeto fetal, a partir de una muestra biológica así como nuevas sondas y cebadores para el uso en los métodos de la invención.
En una modalidad, la invención proporciona polinucleótidos aislados útiles como cebadores para la amplificación del exón 4, exón 5, exón 7, y exón 10 del gen de RHD humano. En otra modalidad más, la invención proporciona polinucleótidos aislados, útiles como sondas para detectar el exón 4, exón 5, exón 7, ó exón 10 del gen de RHD. Los polinucleótidos aislados pueden ser sondas doblemente marcadas .
La presente invención abarca los métodos para determinar el Genotipo de RHD de un sujeto. En una modalidad, el método comprende la lisis de las células en una mezcla biológica para formar una mezcla de lisis, en donde la muestra biológica contiene una o más células provenientes del sujeto; la extracción del ácido nucleico a partir de la mezcla de lisis; y la detección de al menos un exón del gen de RHD en el ácido nucleico extraído, en donde la presencia o ausencia del exón indica el genotipo del RHD del sujeto. En otra modalidad más, el sujeto puede ser un feto. La muestra biológica puede ser una muestra biológica materna que contiene células fetales, tales como una muestra de sangre completa. En algunas modalidades, las células fetales pueden ser preferentemente lisadas sobre las células maternas.
En otra modalidad más, el método comprende la detección de al menos un exón del gen de RHD por amplificación de al menos un exón con uno o más grupos de cebadores, y la identificación de al menos un exón con una o más sondas marcadas. El exón puede ser el exón 4, exón 5, exón 7, ó el exón 10 del gen de RHD humano. En otra modalidad más, dos o más grupos de cebadores son utilizados para identificar al menos un exón, y dos o más sondas marcadas son utilizadas para identificar al menos un exón. En otra modalidad más, dos o más grupos de cebadores amplifican un exón simple del gen de RHD humano. En otra modalidad más, dos o más grupos de cebadores amplifican dos o más exones del gen de RHD humano.
En otra modalidad más de la invención, el método comprende extraer el ácido nucleico de una muestra biológica, en donde la muestra biológica contiene una o más células provenientes de un sujeto; y la detección de al menos tres exones del gen de RHD en el ácido nucleico extraído, en donde la presencia o ausencia de los exones indica el genotipo de RHD del sujeto. En una modalidad, cuatro exones del gen de RHD son detectados. Los exones que pueden ser detectados incluyen el exón 4, exón 5, exón 7, y exón 10 del gen de RHD humano. Los tres o más exones del gen de RHD pueden ser detectados mediante amplificación de los tres o más exones con tres o más grupos de cebadores, e identificando los tres o más exones con tres o más sondas marcadas. En algunas modalidades, el sujeto es un feto. En otras modalidades, la muestra biológica es una muestra biológica materna que contiene células fetales.
En algunas modalidades, el método comprende además confirmar la presencia del ADN fetal en el ácido nucleico extraído. . En una modalidad, la presencia del ADN fetal es confirmada por la detección de un cromosoma Y. En otra modalidad más, el cromosoma Y es detectado mediante la amplificación de un gen localizado sobre el cromosoma Y, con uno o más grupos de cebadores, en donde uno o más grupos de cebadores comprende un cebador delantero y un cebador inverso; e identificando el gen con una o más sondas marcadas. En otra modalidad más, el gen localizado sobre el cromosoma Y se selecciona del grupo que consiste de SRY, FCY, y DAZ. En otra modalidad más, la presencia del ADN fetal es confirmada por la detección de un alelo paternamente heredado .
La presente invención también proporciona un kit de genotipificación de RhD que comprende los nuevos cebadores y las sondas descritas en la presente. En una modalidad, el kit comprende al menos un grupo de cebadores, en donde al menos un grupo de cebadores comprende un cebador delantero y un cebador inverso; al menos una sonda marcada; y las instrucciones para utilizar al menos un grupo de cebadores y al menos una sonda para detectar un gen de RHD en una muestra biológica, en donde el cebador delantero y el cebador inverso se hibridan a un exón del gen de RHD humano. El exón puede ser el exón 4, exón 5, exón 7, ó exón 10 del gen de RHD humano. En otra modalidad más, el kit comprende dos o más grupos de cebadores y dos o más sondas marcadas . Los dos o más grupos de cebadores pueden hibridarse a un exón simple del gen de RHD humano o éstos pueden hibridarse a dos o más exones del gen de RHD humano. En otra modalidad, el kit comprende además un reactivo de lisis. El reactivo de lisis puede comprender S- (2-guanidino-4-tiazoil) -metil-isotiourea y opcionalmente vitamina E, un detergente, tal como tritón X-100, Tween-20, NP-40, y saponina.
La presente invención también contempla una mezcla de reactivos que comprende el ácido nucleico aislado y diversas combinaciones de las nuevas sondas y grupos de cebadores descritos en la presente. En una modalidad, lá mezcla de reactivos comprende el ácido nucleico aislado; tres o más grupos de cebadores para la amplificación de tres o más exones del gen de RHD, en donde cada grupo de cebadores comprende un cebador delantero y un cebador inverso; y tres o más sondas marcadas. En otra modalidad más, la mezcla de reactivos comprende ácido nucleico aislado; cuatro grupos de cebadores para la amplificación de cuatro exones de un gen de RHD; y cuatro sondas marcadas. Los grupos de cebadores y las sondas marcadas se hibridan preferentemente a tres o más exones seleccionados del exón 4, exón 5, exón 7, y exón 10 del gen de RHD humano.
Breve Descripción de las Figuras Figura 1. Esquema de los genes del antígeno Rh y las proteínas Rh codificadas correspondientes para los genotipos positivo y negativo de RhD. Representación de 10 exones de los genes de RhD (rojo) y RhCE (azul) en orientación opuesta, las cajas de Rh, y el gen de SMP1.
Figuras 2A y 2B. Amplificación por PCR del exón 4 del gen de RHD utilizando grupos de cebadores sobre el ADN aislado de muestras de sangre de madres RhD-negativas que llevan un feto RhD-positivo . La figura 2A es una muestra 14202 amplificada con eí grupo de cebadores 4.2 de RhD. La banda superior corresponde al amplicón esperado de 70 pares de bases (pb) (asterisco) . La figura 2B es una muestra 14202 amplificada con el grupo de cebadores 4.3 de RhD. La banda simple corresponde al amplicón esperado de 62 pb (asterisco) .
Figuras 3A a 3B. Amplificación por PCR del exón 5 del gen de RHD utilizando los grupos de cebadores sobre ADN aislado de muestras de sangre obtenidas de madres RhD-negativas que llevan un feto RhD-positivo. La figura 3A es una muestra 14180 amplificada con el grupo de cebadores 5 de RhD (últimas 2 bandas) . La banda superior corresponde al amplicón esperado de 83 pb (asterisco) . La figura 3B es una muestra 14180 amplificada con el grupo de cebadores 5.2 de RhD (últimas 2 bandas) . La banda superior corresponde al amplicón esperado 72 pb (asterisco) .
Figuras 4A a 4B. Amplificación por PCR del exón 7 del gen de RHD utilizando los grupos de cebadores sobre ADN aislado de muestras de sangre obtenidas a partir de madres RhD-negativas que llevan un feto RhD-positivo. La figura 4A es una muestra 14202 amplificada con el grupo de cebadores 7 de RhD (última 3 bandas) . Visibles sobre el gel de agarosa MS8 al 4.5% están dos bandas de tamaño casi igual de aproximadamente 53 y 58 pb. Los datos de secuenciamiento confirmaron la banda de 58 pb como el amplicón correcto (asterisco) . La figura 4B es una muestra 14202 amplificada con el grupo de cebadores 7.3 de RhD (últimas 2 bandas) . La banda simple corresponde al amplicón esperado de 61 pb (asterisco) .
Figura 5. Amplificación por PCR del exón 10 del gen de RHD utilizando grupos de cebadores sobre ADN aislado de muestras de sangre obtenidas a partir de madres RhD-negativas que llevan un feto RhD-positivo . La muestra 14180 fue amplificada con los grupos de cebadores de RhD para los exones 10 (últimas dos bandas) y 10.1 (primeras dos bandas; 10H) . La banda superior corresponde al amplicón correcto para el grupo de cebadores 10 (59 pb, últimas dos bandas) y el grupo de cebadores 10.1 (74 pb, primeras dos bandas) .
Descripción Detallada de la Invención Los antígenos del grupo sanguíneo Rhesus (Rh) son considerados como de la mayor importancia clínica debido a su alta inmunogenicidad. Los anticuerpos contra el antígeno Rh son responsables no solamente del trastorno hemolítico del neonato sino también de las reacciones de transfusión y la anemia hemolítica autoinmunitaria . Los fenotipos de Rh humano son controlados por dos genes de Rh estrechamente vinculados, localizados sobre cromosoma 1 (lp34. l-lp36) : RhD, el cual codifica para el antígeno D, y RhCE, el cual codifica para los antígenos Ce y Ee (Y. Colín et al. (1991) Blood,' Vol . 78: 2747) . Ambos genes, los cuales contienen 10 exones,, cada uno con aproximadamente 94% de homología secuencial, están en orientación opuesta sobre el cromosoma en configuración cola-a-cola, tal que la hebra de codificación del gen de RHD es la hebra de no codificación de RhCE, y viceversa (Figura 1; N. D. Avent et al. (2006) Expert Reviews en Mol. Med. , Vol. 8:1). Un gen de proteína membranal pequeña (SMP1) está localizado entre los dos genes de Rh.
RhD es también flanqueado por dos regiones de 9 kb de 98.6% de homología que son conocidos como las cajas Rhesus .
RhD y RhCE codifican para las proteínas de 417 aminoácidos. Las proteínas RhD y RhCE difieren por entre 31 y 35 aminoácidos. RhD codifica para los antígenos D mientras que RhCE codifica para cuatro alelos comunes responsables de la expresión de las dos series alélicas de antígenos, C/c y E/e. En individuos RhD-negativos , existe ya sea una supresión completa del gen de RHD o el gen es mutado o parcialmente suprimido, haciendo al gen no funcional, tal que no es expresado ningún antígeno RhD sobre las células sanguíneas rojas.
Aproximadamente quince por ciento de los Caucásicos son RhD-negativos y son usualmente homocigotos para una supresión de RHD. Sesenta y seis por ciento de los Negros Africanos RhD-negativos tienen un RhD intacto, pero el gen está inactivo debido a una mutación no en sentido en el exón 6, que convierte el codón para la tirosina 269 a un codón de terminación de la traducción. El gen de RHD intacto, conocido como pseudogen RhD ^???) , tiene múltiples mutaciones, incluyendo una duplicación de 37 pb en el límite del exón 3-exón 4, una mutación en mal sentido en el exón 5 y una mutación no en sentido en el exón 6 (B. K. Singleton, et al. (2000) Blood, Vol . 89: 2568). Este pseudogen inactivo no produce proteína D y tampoco antígenos D. Otro gen no funcional que es relativamente común entre los Africanos es RhD-CE-D. A pesar de la presencia de los exones de RhD, no son producidos antígenos RhD.
Como se discutió anteriormente, la certeza de que una madre RhD-negativa está llevando un feto RhD-negativo podría eliminar la profilaxis prenatal innecesaria de inmunoglobulina anti-Rh y las visitas al médico. Las pruebas clínicas estándares disponibles para la determinación del genotipo del RhD fetal involucran típicamente el uso de procedimientos invasores que están asociados con riesgos de perturbación del embarazo. Por lo tanto, existe una necesidad para el desarrollo de una prueba clínicamente no invasora para determinar el estado del RhD fetal.
La presente invención está basada, en parte, en el desarrollo de un nuevo método para aislar el ADN fetal de muestras biológicas maternas. Como se describe extensamente en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos co-pendiente No. 60/984,698, presentada el 1 de Noviembre del 2007, que se incorpora por referencia en la presente en su totalidad, el método comprende lisar selectivamente las células fetales sobre células maternas al exponer la muestra biológica a un reactivo de lisis particular por un periodo dé tiempo especificado. Tal método permite que el ADN fetal,, por ejemplo, ADN fetal de alta calidad sea extraído del lisado selectivo. El ADN fetal extraído puede ser utilizado para seleccionar diversos marcadores genéticos, tales como el genotipo de RHD.
La presente invención está también basada en el hallazgo de que la detección de uno o más exones específicos del gen de RHD es un predictor preciso del genotipo de RHD. En consecuencia, la presente invención proporciona un método para determinar el genotipo de RHD de un sujeto. En una modalidad, el método comprende lisar las células en una muestra biológica para formar una mezcla de lisis, en donde la muestra biológica contiene una o más células del sujeto; extraer el ácido nucleico de la mezcla de lisis,· y detectar al menos un exón del gen de RHD en el ácido nucleico extraído, en donde la presencia o ausencia del exón indica el genotipo de RHD del sujeto. En otra modalidad más, el sujeto es un feto. En otra modalidad más, la muestra biológica es una muestra biológica materna que contiene células fetales. Las muestras biológicas maternas ejemplares incluyen, pero no están limitadas a, sangre completa, plasma, suero, orina, moco cervical, fluido amniótico o muestras de vello coriónico. En una modalidad preferida, la muestra biológica materna es una muestra de sangre completa.
Cualquier reactivo de lisis adecuado puede ser utilizado para lisar las células en una muestra biológica, ejemplos de reactivos de lisis incluyen, pero no están limitados a, vitamina E, saponina, S- [ (2-guanidino-4- tiazoil ) metil] - isotiourea (GTMI) , o una sal de la misma, clorhidrato de guanidinio, isotiocianato de guanidinio; urea, ferricianuro de litio, ferricianuro y tiocianato de sodio, ferricianuro y tiocianato de potasio, cloruro de amonio, dietilenglicol , Zap-Oglobin y detergentes comúnmente utilizados tales como Tritones, Tween, y NP-40, DMSO etc., y cualquiera de las composiciones descritas en la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 60/984,698, presentada el 1 de Noviembre del 2007, la cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad.
En una modalidad de la invención, las células fetales son preferentemente lisadas sobre las células maternas en una muestra biológica materna. Las células fetales pueden ser preferentemente lisadas sobre las células maternas al poner en contacto la muestra biológica materna con un reactivo de lisis como se describe en la presente, por un periodo de tiempo. Sin desear estar comprometidos por alguna limitación técnica, se cree que las células fetales en la circulación materna están comprometidas y son de naturaleza apoptótica, por ejemplo, éstas pueden ser preferentemente lisadas a una concentración del reactivo de lisis que afecta mínimamente la lisis de las células maternas, o durante un periodo de tiempo más corto que el tiempo requerido para lisar las células maternas (si se utiliza la misma concentración del reactivo de lisis) .
Diversos factores asociados con una condición de lisis pueden ser variados para lisar preferentemente las célulás fetales. Los factores ejemplares que incluyen, pero no están limitados a, el periodo de tiempo de la reacción de lisis, la concentración del agente de lisis, la naturaleza del agente de lisis, el pH de la solución de lisis y la temperatura a la cual se lleva a cabo la reacción de lisis, pueden ser variados para lograr una lisis preferencial de las células fetales, pero no aquella de las células maternas. En otra modalidad más, el periodo de tiempo es de aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 30 minutos. En otra modalidad más, el reactivo de lisis comprende S- (2-guanidino-4-tiazoil) -metil- isotiourea (GTMI) o una sal del mismo. La concentración de GTMI puede ser de aproximadamente 0.1 mM hasta de aproximadamente 500 mM, más preferentemente de aproximadamente 0.5 mM hasta aproximadamente 25 mM, y lo más preferentemente de aproximadamente 20 mM. En otra modalidad más, el reactivo de lisis comprende GTMI, vitamina E, un detergente y opcionalmente saponina. En otra modalidad más, el reactivo de lisis comprende GT I, vitamina E, saponina, tritón X-100, DMSO, y un amortiguador de pH 7.2 a 7.4.
Como se describió anteriormente, diversos factores pueden ser variados para lograr la lisis preferencial de las células fetales sobre las células maternas en una muestra biológica materna. En una modalidad, la muestra biológica materna es puesta en contacto con aproximadamente 0.1 mM hasta aproximadamente 500 mM de solución de GTMI por aproximadamente 1-10 segundos en el extremo alto del intervalo de concentración, y hasta aproximadamente una hora en el extremo bajo del intervalo de concentración. En otra modalidad más, la muestra biológica materna es puesta en contacto con aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 25 mM de solución de GTMI por aproximadamente 5 minutos en el extremo superior del intervalo de concentración, y hasta aproximadamente 30 minutos en el extremo inferior del intervalo de concentración. En otra modalidad más, la muestra biológica es puesta en contacto con aproximadamente 1 mM hasta aproximadamente 5 mM de solución de GTMI por aproximadamente 10—30 minutos. Tales variaciones y manipulaciones están dentro del conocimiento de una persona experta en la materia.
El ácido nucleico puede ser extraído de la mezcla de lisis mediante cualquier medio conocido en la técnica. En una modalidad, el ácido nucleico es aislado mediante cualquier medio adecuado a partir de un sobrenadante obtenido mediante la centrifugación de la mezcla de lisis. El sobrenadante podría, opcionalmente, ser además tratado antes del aislamiento del ácido nucleico. Por ejemplo, el sobrenadante podría ser tratado con un reactivo, por ejemplo, proteinasa K que digiere las proteínas y ayuda a limpiar o purificar el ácido nucleico en la mezcla de lisis. Tal reactivo, si se utiliza, es desactivado, por ejemplo, mediante calentamiento de la muestra aproximadamente a 95 °C. El ácido nucleico puede ser además purificado mediante extracciones con, por ejemplo cloroformo y fenol, y precipitado en etanol . La pella de ácido nucleico puede ser luego suspendida en agua libre de nucleasa y utilizada para el análisis genético posterior. Alternativamente, el ácido nucleico proveniente del sobrenadante puede ser limpiado utilizando un kit comercialmente disponible, por ejemplo; el Kit de escalera de ADN apoptótico de Roche o el Minikit Sanguíneo de ADN QIAMP o el Kit 1 de ADN MagNA Puré LC de Roche .
En una modalidad de la invención, al menos un exón del gen de RHD es detectado para averiguar el genotipo de RHD del sujeto. Cualquiera de los diez exones pueden ser detectados para determinar el genotipo de RHD. Preferentemente, al menos uno del exón 4, exón 5, exón 7, o exón 10 es detectado. En algunas modalidades, son detectados al menos dos exones del gen de RHD. En otras modalidades, son detectados al menos tres exones del gen de RHD. La detección de todas las posibles combinaciones de cada uno de los exones preferidos son contempladas por los métodos de la invención. Por ejemplo, la detección de los exones 4 y 5 ; los exones 4 y 7; los exones 4 y 10; los exones 5 y 7 ; los exones 5 y 10; o los exones 7 y 10 pueden ser utilizados para predecir el genotipo de RHD de un sujeto. Similarmente, la detección de los exones 4, 5, y 7; los exones 4, 5, y 10; los exones 5, 7, y 10, o los exones 4, 7, y 10 puede ser utilizada para diagnosticar un genotipo de RHD de un sujeto. En otra modalidad más, los exones 4, 5, 7, y 10 son detectados para determinar el genotipo de RHD de un sujeto.
La detección de dos o más exones del gen de RHD incrementa la sensibilidad y la especificidad del ensayo. Como se mencionó previamente, las variantes del gen de RHD están presentes en la población, las cuales contienen algunos o todos los exones del gen de RHD, pero debido a las mutaciones en el gen no producen el antígeno D funcional . Los individuos que portan tales alelos son en consecuencia RhD-negativos . Al detectar dos o más exones o regiones específicas de los exones (tales como las regiones específicas psi) , pueden ser eliminados los falsos positivos debido a estas variantes RHD1? no funcionales. Por ejemplo, la detección del exón 7 podría identificar el gen de RHD y la variante RHD no funcional. Sin embargo, la detección de la región específica psi del exón 5 podría únicamente identificar el gen de RHD - . En algunas modalidades, tres o más exones del gen de RHD son detectadas para determinar un genotipo de RHD de un sujeto. En otras modalidades, cuatro exones del gen de RHD son detectados para determinar el genotipo de RHD de un sujeto.
Los exones del gen de RHD pueden ser detectados mediante cualquier método conocido en la técnica, para identificar la presencia de una secuencia específica de ácido nucleico. Los métodos adecuados incluyen, pero no están limitados a, Southern Blotting, Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) , hibridación de emparedado, y PCR en Tiempo Real (RT-PCR) . En una modalidad de la invención, la detección de al menos un exón del gen de RHD comprende la amplificación de al menos un exón con uno o más grupos de cebadores, e identificar al menos un exón con una o más sondas marcadas. Un "grupo de cebadores" como se utiliza en la presente, se refiere a un par de cebadores, un cebador delantero y un cebador inverso, que flanquean una secuencia nucleotídica o región genómica específica, y proporciona extremos 3'-hidroxilo libres para permitir que una polimerasa amplifique la secuencia específica de la región genómica. Una "sonda marcada" se refiere a un ácido nucleico de una sola hebra conjugado a un compuesto que i produce una señal detectable que es complementaria a una secuencia de ADN objetivo. En otra modalidad más de la invención, uno o más grupos de cebadores amplifican el exón 4 del gen de RHD humano. En otra modalidad, uno o más grupos de cebadores amplifican el exón 5 del gen de RHD humano. En otra modalidad más, uno o más grupos de cebadores amplifican el exón 7 del gen de RHD humano. En otra modalidad más, uno o más grupos de cebadores amplifican el exón 10 del gen de RHD humano. Dos o más grupos de cebadores pueden ser utilizados para amplificar regiones específicas de un exón simple. Por ejemplo, un primer grupo de cebadores pueden amplificar una primera región de un primer exón, mientras que un segundo grupo de cebadores pueden amplificar una segunda región del primer exón. La primera región y la segunda región de un exón pueden traslaparse. Alternativa p adicionalmente , dos o más grupos de cebadores pueden ser utilizados para amplificar dos diferentes exones. En algunas modalidades, dos o más grupos de cebadores amplifican dos o más exones del gen de RHD humano.
Como se discutió anteriormente, un grupo de cebadores puede ser diseñado para amplificar un exón específico del gen de RHD humano o una región particular de ese exón. En consecuencia, la presente invención también proporciona nuevos polinucleótidos aislados (por ejemplo, oligonucleótidos) para el uso como cebadores para amplificar regiones particulares de uno o más exones del gen de RHD humano. El polinucleótido aislado puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID No.: 1, SEQ ID No. : 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 16, SEQ ID No.: 17, SEQ ID No.: 19, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 22, y SEQ ID No.: 23, en donde el polinucleótido aislado contiene menos de cincuenta bases. En una modalidad, el polinucleótido aislado comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID o.: 1, SEQ ID No.: 2, SEQ ID No. : 4, SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No . : 11, SEQ ID No . : 13, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 17, SEQ ID No.: 19, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 22, y SEQ ID No.: 23, en donde el polinucleótido aislado contiene menos de cincuenta bases. Los polinucleótidos de los cebadores pueden contener una o más modificaciones químicas que incluyen, pero no están limitadas a, ácidos nucleicos trabados (LNA, por sus siglas en inglés) , peptidil-ácidos nucleicos (PNA, por sus siglas en inglés) , modificaciones de azúcar, tales como las modificaciones de 2'-0-alquilo (por ejemplo, 2 ' -O-metilo, 2 ' -O-metoxietilo) , 2'-fluoro y 4'-tio, modificaciones en la cadena principal, tales como uno o más enlaces fosforotioato, metilfosfonato, morfolino, o fosfonocarboxilato . En una modalidad, el polinucleótido aislado contiene aproximadamente 10 a aproximadamente 30 bases. En otra modalidad más, el polinucleótido aislado contiene aproximadamente 15 a aproximadamente 25 bases. Los grupos de cebadores preferidos para la amplificación del exón 4 del gen de RHD humano incluyen polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia indicada en la SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 4, o SEQ ID No.: 5. Los grupos de cebadores específicos para la amplificación del exón 5 del gen de RHD humano incluyen los polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia indicada en la SEQ ID No. : 7, SEQ ID No. : 8, SEQ ID No.: 10, o SEQ ID No.: 11. Los grupos de cebadores preferidos para la amplificación del exón 7 del gen de RHD humano incluyen los polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia indicada en la SEQ ID No. : 13, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 16, o SEQ ID No.: 17. Los grupos de cebadores preferidos para amplificar el exón 10 del gen de RHD humano incluyen los polinucleótidos aislados que comprenden una secuencia indicada en la SEQ ID No.: 19, SEQ ID No. : 20, SEQ ID No.: 22, o SEQ ID No.: 23. En otra modalidad más de la invención, el polinucleótido aislado se híbrida a un exón del gen · de RHD humano. En otra modalidad más, los cebadores de la invención amplifican específicamente un exón o región particular de un exón del gen de RHD, sin amplificar ninguna porción del gen de RHCE muy estrechamente relacionado, o cualquier otro gen en el genoma, por ejemplo, los cebadores son altamente sensibles y son capaces de amplificar cantidades muy pequeñas de ADN que contienen las secuencia del gen de RHD en un antecedente grande de ADN cromosómico contaminante .
En otra modalidad más de la invención, el polinucleótido cebador puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID No.: 76, SEQ ID No.: 77, SEQ ID No.: 79, SEQ ID No.: 80, SEQ ID No.: 83, SEQ ID No.: 84, SEQ ID No.: 86, SEQ ID No.: 87, SEQ ID No.: 89, SEQ ID No.: 90, SEQ ID No.: 92, SEQ ID No.: 93, SEQ ID No.: 95, SEQ ID No . : 96, SEQ ID No.: 98, SEQ ID No.: 99, SEQ ID No.: 100, SEQ ID No.: 101, SEQ ID No.: 102, SEQ ID No.: 103, SEQ ID No.: 104, SEQ ID No.: 105, SEQ ID No.: 107, SEQ ID No.: 109, SEQ ID No.: 110, SEQ ID No.: 112, SEQ ID No.: 113, SEQ ID No.: 114, SEQ ID No.: 115, SEQ ID No . : 116, SEQ ID No.: 117, SEQ ID No.: 118, SEQ ID No.: 119, SEQ ID No.: 121, y SEQ ID No.: 122, en donde el polinucleótido cebador contiene menos de cincuenta bases.
La presente invención también proporciona los polinucleótidos aislados (por ejemplo, oligonucleótidos ) para el uso como sondas para la detección de uno o más exones del gen de RHD . El polinucleótido aislado ' puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID No.: 3, SEQ ID No . : 6, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 15, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 21, y SEQ ID No.: 24, en donde el polinucleótido aislado contiene menos de cincuenta bases. En una modalidad, el polinucleótido aislado contiene aproximadamente 10 a aproximadamente 40 bases. En otra modalidad más, el polinucleótido aislado contiene aproximadamente 15 a aproximadamente 30 bases. Los polinucleótidos de sonda ejemplares para la detección del exón 4 del gen de RHD comprenden una secuencia indicada en la SEQ ID No.: 3 o SEQ ID No.: 6. Los polinucleótidos de sonda ejemplares para detectar el exón 5 del gen de RHD comprenden una secuencia indicada en la SEQ ID No. : 9 o la SEQ ID No . : 12. Los polinucleótidos de sonda ejemplares para detectar el exón 7 del gen de RHD comprenden una secuencia indicada en la SEQ ID No.: 15 o la SEQ ID No.: 18. Los polinucleótidos de sonda ejemplares para detectar el exón 10 del gen de RHD comprenden una secuencia indicada en la SEQ ID No.: 21 o la SEQ ID No. : 24.
En otra modalidad, el polinucleótido de sonda puede comprender una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID No.: 78, SEQ ID No.: 81, SEQ ID No.: 82, SEQ ID No.: 85, SEQ ID No.: 88, SEQ ID No.: 91, SEQ ID No.: 94, SEQ ID No.: 97, SEQ ID No.: 106, SEQ ID No.: 108, SEQ ID No.: 111, SEQ ID No.: 120, y SEQ ID No.: 123, en donde el polinucleótido de sonda contiene menos de cincuenta bases.
Preferentemente el polinucleótido de sonda, aislado, contiene al menos un marcador que produce una señal que puede ser detectada por uno o más métodos . Los marcadores adecuados incluyen, pero no están limitados a,, radiomarcadores, tales como 35S, 33P, y 32P, biotina, digoxigenina, fluorocromos , y enzimas, tales como fpsfatasa alcalina. Los marcadores adicionales así como los métodos de detección apropiados para los marcadores pueden ser averiguados por una persona de experiencia ordinaria en la técnica. En una modalidad, el marcador es enlazado al extremo 5' del polinucleótido aislado. En otra modalidad más, el marcador es enlazado al extremo 3' del polinucleótido aislado. En otra modalidad más, un primer marcador es enlazado al extremo 5' del polinucleótido aislado y un segundo marcador es enlazado al extremo 31 del polinucleótido aislado. El primer marcador y el segundo marcador pueden interactuar para generar una señal única o disminuir una señal generada por cualquier marcador. Por ejemplo, en el fenómeno conocido como transferencia de energía de resonancia de fluorescencia o FRET (por sus siglas en inglés) , la indicación de un primer marcador fluorescente produce una señal a la longitud de onda de emisión de un segundo marcador fluorescente localizado en estrecha proximidad al primer marcador presente, debido a una transferencia de energía. En una variación de este fenómeno, la señal de un primer marcador fluorescente puede ser apagada por un segundo marcador localizado en estrecha proximidad al primer marcador fluorescente. El uso de un primer marcador y un segundo marcador que interactúan de tales formas hacen posible la detección de conformaciones particulares de moléculas a las cuales son enlazados los marcadores. En una modalidad preferida de la invención, el polinucleótido de sonda aislado contiene una molécula reportera enlazada al extremo 5' del polinucleótido, y una molécula apagadora enlazada al extremo 3' del polinucleótido. Cualquier combinación reportero/apagado puede ser conjugada al polinucleótido aislado. Las moléculas reporteras adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, 6-carboxifluoresceína (6-FAM) , tetraclorofluoresceína (TET) , ROX, HEX, y JOE . Las moléculas apagadoras adecuadas incluyen, pero no están limitadas a tetrametilrodamina (TAMRA) , enlazador de muesca menor del tripéptido dihidrociclopirroloindol (MGB) , apagador de hoyo negro (BHQ) , y apagador no fluorescente del enlace a muesca menor (MGBNFQ) . Tales polinucleótidos doblemente marcados son particularmente útiles como sondas en combinación con los polinucleótidos del cebador de la invención, para la detección de uno o más exones del gen de RHD utilizando técnicas de PCR en tiempo real.
La presente invención abarca los métodos para determinar el genotipo de RHD de un feto, que comprende la lisis de las células en una muestra biológica materna que contiene células fetales, para formar una mezcla de lisis; la extracción del ácido nucleico a partir de la mezcla de lisis; y la detección de al menos de un exón del gen de RHD en el ácido nucleico extraído, en donde la presencia o la ausencia del exón indica el genotipo de RHD del feto. En una modalidad, el método comprende además la confirmación de la presencia del ADN fetal en el ácido nucleico extraído.
En algunas modalidades, la presencia del ADN fetal en el ácido nucleico extraído es confirmada por la detección de un cromosoma Y. Son conocidos varios métodos por aquellos expertos en la técnica para detectar un cromosoma Y en el ADN extraído de las muestras biológicas. En una modalidad, el cromosoma Y es detectado por amplificación de un gen localizado sobre el cromosoma Y con uno o más grupos de cebadores, en donde uno o más grupos de cebadores comprenden un cebador delantero y un cebador inverso; e identificar el gen con una o más sondas marcadas . Cualquiera de los genes localizados sobre el cromosoma Y humano pueden ser detectadas incluyendo AMELY (amelogenina, Y-cromosómica) , ANT3Y (translocador 3 del nucleótido de adehina sobre Y) , ASMTY (el cual significa acetilserotonina-metiltransferasa) , AZF1 (factor 1 de azoospermia) , AZF2 (factor 2 de azoospermia) , BPY2 (proteína básica sobre el cromosoma Y) , CSF2RY (receptor del factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos, subunidad alfa sobre el cromosoma Y) , DAZ (suprimido en azoospermia), IL3RAY (receptor de interleucina-3), PRKY (proteína-cinasa, Y-enlazada) , RBM1 (proteína del motivo de enlace al ARN, cromosoma Y, familia 1, miembro Al), RBM2 (proteína 2 del motivo de enlace al ARN) , RPS4Y (proteína S4 ribosomal, copia 1 Y-enlazada), RPS4Y2 (proteína S4 ribosomal, copia 2 Y-enlazada), SRY (región de determinación del sexo) , TSPY (proteína específica de los testículos) , UTY (gen de TPR ubicuamente transcrito, sobre el cromosoma Y) , ZFY (proteína de dedo de zinc) , y FCY. En una modalidad preferida, el gen es SRY, FCY, o DAZ . Los cebadores ejemplares para amplificar el gen SRY incluyen los polinucleótidos que comprenden la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 25 o la SEQ ID No.: 26. Los cebadores ejemplares para ámplificar el gel FCY incluyen los polinucleótidos que comprenden la secuencia indicada en la SEQ ID No. : 28 o la SEQ ID No.: 29. Los cebadores ejemplares para amplificar el gen DAZ incluyen los polinucleótidos que comprenden la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 31 o la SEQ ID No.: 32. Las sondas ejemplares para detectar el gen SRY incluyen los polinucleótidos que comprenden la SEQ ID No.: 27. Las sondas ejemplares para detectar el gen FCY incluyen los polinucleótidos que comprenden la SEQ ID No.: 30. Las sondas ejemplares para detectar el gen DAZ incluyen los polinucleótidos que comprenden la SEQ ID No.: 33.
La presente invención también proporciona los nuevos polinucleótidos (por ejemplo, oligonucleótidos) para el uso como cebadores y sondas ejemplares para la detección del gen DAZ sobre el cromosoma Y. En una modalidad, el polinucleótido aislado comprende una secuencia indicada en la SEQ ID No.: 31, SEQ ID No.: 32, o SEQ ID No.: 33, en donde el polinucleótido aislado contiene menos de cincuenta bases. En otra modalidad más, el polinucleótido aislado contiene aproximadamente 10 a aproximadamente 30 bases. En otra modalidad más, el polinucleótido aislado contiene aproximadamente 15 a aproximadamente 25 bases.
En otras modalidades, la presencia del ADN fetal en el ácido nucleico extraído es confirmada por la detección de un alelo paternamente heredado. La detección de un alelo paternamente heredado puede ser realizada por l determinación · por la presencia de uno o más marcadores polimórficos . En una modalidad, el ADN obtenido de las células maternas es seleccionado para uno o más marcadores polimórficos . Subsecuentemente, el ADN extraído, obtenido de la lisis selectiva de las muestras de sangre materna, es seleccionado para uno o más marcadores polimórficos no encontrados en los extractos de ADN materno. La presencia dé uno o más marcadores polimórficos en los extractos provenientes de la lisis seleccionada, es indicadora de un alelo paternamente heredado, y confirma la presencia del ADN fetal en el extracto. Diversos marcadores polimórficos pueden ser utilizados para determinar alelos paternamente heredados. Los cebadores y sondas pueden ser diseñados para detectar marcadores polimórficos apropiados en el ADN extraído. Un grupo ejemplar de marcadores polimórficos y cebadores y sondas para su detección, se describe en el Ej emplo 3.
La presente invención también abarca, los métodos para determinar el genotipo de RHD de un sujeto, mediante la detección de múltiples exones del gen de RHD en el ácido nucleico extraído proveniente de una muestra biológica obtenida del sujeto. En una modalidad, el método comprende extraer el ácido nucleico de una muestra biológica, en donde la muestra biológica contiene una o más células provenientes del sujeto; y detectar al menos tres exones del gen de RHD en el ácido nucleico extraído, en donde la presencia o ausencia de los exones indica el genotipo de RHD del sujeto. En otra modalidad más, son detectados cuatro exones del gen de RHD en el ácido nucleico extraído. En algunas modalidades, el sujeto es un feto. En otras modalidades, la muestra biológica es una muestra biológica materna que contiene células fetales.
La detección de cualquier combinación de los diez exones del gen de RHD puede ser utilizada para averiguar el genotipo de RHD de un sujeto. Preferentemente, es detectada una combinación del exón 4, exón 5, exón 7, y exón 10. En algunas modalidades, los cuatro del exón 4, el exón 5, el exón 7, y el exón 10 son detectados para determinar el genotipo de RHD de un sujeto. La detección de los tres o más exones del gen de RHD puede comprender la amplificación de los tres o más exones con tres o más grupos de cebadores, y la identificación de los tres o más exones con tres o más sondas marcadas o cualquier otro método descrito anteriormente. Los tres o más grupos de cebadores y tres o más sondas marcadas pueden ser cualquiera de los cebadores de la invención y las sondas descritas en la presente.
La presente invención también proporciona un kit de genotipificación de RhD que comprende los nuevos grupos de cebadores y nuevas sondas descritas en la presente. En una modalidad, el kit comprende al menos un grupo de cebadores, en donde al menos un grupo de cebadores comprende un cebador delantero y un cebador inverso; al menos una sonda marcada; y las instrucciones para el uso de al menos un grupo de cebadores y al menos una sonda para detectar un gen de RHD en una muestra biológica, en donde el cebador delantero y el cebador inverso se hibridan a un exón del gen de RHD humano.
En algunas modalidades, el kit comprende dos o más grupos de cebadores y dos o más sondas marcadas . En otras modalidades, dos o más grupos de cebadores se hibridan a un exón simple del gen de RHD humano. En otras modalidades adicionales, dos o más grupos de cebadores se hibridan a dos o más exones del gen de RHD humano. Preferentemente cada grupo de cebadores comprende un cebador delantero y un cebador inverso para la amplificación del exón del gen de RHD. En una modalidad, el exón es el exón 4, el exón 5, el exón 7, o el exón 10 del gen de RHD humano. En otras modalidades, los cebadores delanteros pueden incluir un polinucleótido que comprenden la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 1, SEQ 'ID NO.: 4, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 16, SEQ ID No.: 19 o la SEQ ID No.: 22. En otra modalidad más, los cebadores inversos pueden incluir un polinucleótido que comprenden la secuencia indicada en la SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 17, SEQ ID No.: 20 o la SEQ ID No.: 23. En otra modalidad más, las sondas marcadas pueden incluir un polinucleótido que comprende la secuencia indicada en la SEQ ID No. : 3, SEQ ID No. : 6, SEQ ID No.: 9, SEQ ID No . : 12, SEQ ID No.: 15, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No. : 21 o la SEQ ID No . : 24.
En otra modalidad, el kit comprende además un reactivo de lisis. El reactivo de lisis puede ser cualquiera de los reactivos de lisis para lisar células biológicas incluyendo aquellas descritas en la presente. En una modalidad preferida, el reactivo de lisis comprende S-(2-guanidino-4 -tiazoil ) -metil- isotiourea . En otra modalidad más, el reactivo de lisis comprende S- (2-guanidino-4-tiazoil) -metil-isotiourea, vitamina E, tritón X-100, y saponina. En otra modalidad más, el reactivo de lisis comprende S- (2-guanidino-4-tiazoil) -metil-isotiourea, vitamina E, saponina, DMSO, tritón X-100 y un amortiguador de pH 7.2 a 7.4. El kit puede comprender además las instrucciones para el uso del reactivo de lisis, para lisar las células en una muestra biológica y subsecuentemente preparar los extractos de ADN a partir del lisado. En otra modalidad más, las instrucciones pueden describir el uso del reactivo de lisis para lisar selectivamente células fetales en una muestra biológica materna.
La presente invención también contempla una mezcla de reactivos que comprenden el ácido nucleico aislado y diversas combinaciones de los nuevos cebadores y sondas descritas en la presente. En una modalidad, la mezcla de reactivos comprende el ácido nucleico aislado; tres o más grupos de cebadores para la amplificación de tres o más exones de un gen de RHD, en donde cada grupo de cebadores comprende un cebador delantero y un cebador inverso; y tres o más sondas marcadas. "Ácido nucleico aislado" se refiere al ácido nucleico extraído de una muestra biológica de un sujeto. El ácido nucleico aislado puede servir como una plantilla para la identificación de exones específicos del gen de RHD por los cebadores de la invención incluidos en la mezcla de reactivos. En una modalidad preferida, tres o más exones son seleccionados del grupo que consiste del exón 4, exón 5, exón 7, y exón 10 del gen de RHD humano. En otra modalidad más, la mezcla de reactivos comprende ácido nucleico aislado; cuatro grupos de cebadores para la amplificación de cuatro exones de un gen de RHD; y cuatro sondas marcadas. Los cuatro exones pueden ser el exón 4, el exón 5, el exón 7, y el exón 10 del gen de RHD humano.
Como se describe con detalle anteriormente, los nuevos cebadores y sondas de la invención amplifican específicamente exones o regiones particulares de exones particulares del gen de RHD. Cualquiera de los polinucleótidos de cebadores o polinucleótidos . de sondas anteriormente mencionados pueden ser incluidos en la mezcla de reactivos. En algunas modalidades, los cebadores delanteros de los tres o más grupos de cebadores son seleccionados del grupo que consiste de la SEQ ID No. : 1, SEQ ID No. : 4, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No . : 10, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No . : 16, SEQ ID No.: 19, y la SEQ ID No.: 22. En otras modalidades, los cebadores inversos de los tres o más grupos de cebadores son seleccionados del grupo que consiste de la SEQ ID No.: 2, SEQ ID No. : 5, SEQ ID No. : 8, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 17, SEQ ID No.: 20, y la SEQ ID No.: 23. En otras modalidades adicionales, las tres o más sondas marcadas se seleccionan del grupo que consiste de la SEQ ID No. : 3, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No . : 9, SEQ ID No . : 12, SEQ ID No . : 15, SEQ ID No. : 18, SEQ ID No. : 21, y la SEQ ID No. : 24.
Esta invención es además ilustrada por los siguientes Ejemplos adicionales que no deben ser considerados como limitantes. Los contenidos de todas las referencias, patentes, y solicitudes de patentes publicadas, citadas a todo lo largo de esta solicitud así como en las Figuras, se incorporan en la presente por referencia, en su totalidad.
EJEMPLOS Ejemplo 1. genotipl icación de RhD de las células fetales obtenidas de lisados de sangre materna Muestras de sangre (20 mi) de mujeres embarazadas (de 8 a 12 semanas de gestación) fueron tratadas con el reactivo de lisis (2 mi) por 10 a 20 minutos a temperatura ambiente con mezclado suave en un tubo tapado de 50 mi. El reactivo de lisis contenía S-( 2 -guanidinio-4 - tiazoil ) -met il - isotiourea (GTMI) 10 mM, vitamina E 10 mM, 1% de Tritón X-100, 0.5% de saponina, 2.5% de DMSO, NaCl 0.15 M y HEPES 0.05 M, pH 7.2. El tubo fue luego centrifugado a 2000 g por 10 minutos y el sobrenadante se transfirió a otro tubo de 50 mi. Este procedimiento da como resultado lisis preferencial de las células fetales apoptóticas sobre las células maternas presentes en la muestra de sangre materna. Ver la solicitud provisional co-pendiente de los Estados Unidos No. 60/984,698, presentada el 1 de Noviembre del 2007, la cual se incorpora por referencia en la presente en su totalidad.
Para disociar cualesquiera proteínas provenientes del ADN, el sobrenadante fue primeramente tratado con proteinasa K (10 mg/ml) a 55°C por 10 minutos, seguido por el tratamiento con el amortiguador de lisis (12 mi de isotiocianato de guanidinio 5 mM, 20% de Tritón X-100, en Tris-HCl 50 mM (pH 7.2) o 12 mi, el kit MagNA Puré, Roche Diagnostics) y partículas de vidrio magnéticas (MGPs) (3 mi, Kit MagNA Puré) . Después de un mezclado perfecto el tubo fue girado sobre una rueda giratoria a temperatura ambiente por 20 a 30 minutos. El tubo del sobrenadante fue colocado sobre un estante magnético por 2 minutos para congregar el ADN enlazado a las MGPs. Después de la congregación de las MGPs, el sobrenadante fue desechado y las MGPs fueron lavadas dos veces con Amortiguador de Lavado I, y dos veces con Amortiguador de Lavado II o hasta que los lavados se volvieron claros . Las MPGs fueron completamente secadas al aire por varias horas. El ADN fue eluído de las bandas con el amortiguador de elución (2 X 400 µ?) y la concentración fue determinada sobre un espectrofotómetro 1000 NanoDrop . El ADN eluído fue empleado para la amplificación por PCR para determinar el origen fetal o el estado de RhD fetal como se describe más adelante.
Para mejorar la especificidad, dos grupos de cebadores y de sondas para cada uno de los cuatro exones (4, 5, 7, y 10) del gen de RhD fueron desarrollados. La confirmación del estado de RhD fetal a partir del ADN extraído de sangre materna, se realizó mediante la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (RT-PCT) sobre ADN de tejido fetal similar. El ADN proveniente de los individuos RhD-posit ivos y- RhD-negat ivos conocidos, se utilizó como un control. Las secuencias de cebadores y sondas que fueron desarrolladas para cada exón del gen de RHD humano para el uso en métodos de PCR cuantitativo para evaluar los genotipos fetales, se listan enseguida: Cebador Delantero del Exón 4.2 de RhD AGACAAACTGGGTATCGTTGCTG (SEQ ID NO: 1) Cebador Inverso del Exón 4.2 de RhD GTGCCTGCCAAAGCCTCTAC (SEQ ID NO: 2) Sonda del Exón 4.2 de RhD (6FAM) - CTGATCTTTATCCTCCGTTCC- (BHQ) (SEQ ID NO: 3) Cebador Delantero del Exón 4.3 de RhD ACTACCACATGAACATGATGCACA (SEQ ID NO : 4) Cebador Inverso del Exón 4.3 de RhD GGCCACAGACAGCCCAAA (SEQ ID NO: 5) Sonda del Exón 4.3 de RhD ( 6FAM) - CTACGTGTTCGCAGCCT- (BHQ) (SEQ ID NO: 6) Cebador Delantero del Exón 5 de RhD CGCCCTCTTCTTGTGGATG (SEQ ID NO: 7) Cebador Inverso del Exón 5 de RhD GAACACGGCATTCTTCCTTTC (SEQ ID NO: 8) Sonda del Exón 5 de RhD ( 6FAM) - TCTGGCCAAGTTTCAACTCTGCTCGCT- (BHQ) (SEQ ID NO : 9) Cebador Delantero del Exón 5.2 de RhD TGTGGATGTTCTGGCCAAGTT (SEQ ID NO: 10) Cebador Inverso del Exón 5.2 de RhD TGAAC ACGGCATTCTTCCTTTC (SEQ ID NO: 11) Sonda del Exón 5.2 de RhD (6FAM) - AACTCTGCTCTGCTGAGAAGTCCAAT- (BHQ) (SEQ ID NO: 12) Sonda Delantera del Exón 7 de RhD GGATTCCCCACAGCTCCAT (SEQ ID NO: 13) Sonda Inversa del Exón 7 de RhD CTCCAAGCAGACCCAGCAA (SEQ ID NO: 14) Sonda del Exón 7 de RhD ( 6FAM) -ATGGGCTACAACTTC- (MGBNFQ) (SEQ ID NO: 15) Sonda Delantera del Exón 7.3 de RhD CCGGCTCCGACGGTATC (SEQ ID NO: 16) Sonda Inversa del Exón 7.3 de RhD TGGGTCTGCTTGGAGAGATCAT (SEQ ID NO: 17) Sonda del Exón 7.3 de RhD (6FAM) -ACCAGCAGCACAATG- (BHQ) ( SEQ ID NO: 18) Sonda Delantera del Exón 10 de RhD TGCCTGCATTTGTACGTGAGA (SEQ ID NO: 19) Sonda Inversa del Exón 10 de RhD CCTGCGCGAACATTGGA (SEQ ID NO: 20) Sonda del Exón 10 de RhD ( 6FAM) -ACGCTCATGACAGCAA- (BHQ) (SEQ ID NO: 21) Cebador Delantero del Exón 10.1 de RhD CCTCTCACTGTTGCCTGCATT (SEQ ID NO: 22) Cebador Inverso del Exón 10.1 de RhD AGTGCCTGCGCGAACATT (SEQ ID NO: 23) Sonda del Exón 10.1 de RhD ( 6FAM) -TACGTGAGAAACGCTCATGACAGCAAAGTCT- (BHQ) (SEQ ID NO: 24) Todas las reacciones de RT-PCR fueron realizadas por triplicado. Al menos dos de las tres reacciones fueron requeridas para dar como resultado productos de amplificación de PCR antes de la determinación de los genotipos de RhD fetal. La composición de la mezcla de reacción de PCR y el protocolo del ciclo se muestra enseguida. Todas las reacciones de RT-PCR fueron realizadas y analizadas utilizando el sistema de PCR en tiempo real 7900HT de ABI .
Composición de la mezcla de reacción de PCR: ADN = 7.5 Mezcla Maestra de PCR Universal Taqman = 12.5 µ? Cebador Delantero del Exón de RhD = 1.25 µ? (0.3 pmol/µ?) Cebador Inverso del Exón de RhD = 1.25 µ? (0.3 pmol/µ?) Sonda del Exón de RhD = 2.5 µ? (0.15 pmol/µ?) Volumen de Reacción Total de PCR = 25 µ? Ciclo de PCR; Activación de polimerasa a 95°C por 10 minutos Recocido a 60°C por 60 segundos Extensión a 60°C por 10 segundos Desnaturalización a 95°C por 15 segundos 45 Ciclos Los resultados de RT-PCR fueron tabúlados por valores de umbral de ciclo (Ct por sus siglas en Inglés) para cada reacción de PCR. Entre más alta es la cantidad de la plantilla de ADN inicial, más bajo es el valor de Ct . Valores de Ct bajos (< 30) fueron indicadores del estado materno de RhD positivo (en 1 a 3% de las muestras fue obtenida una señal positiva del ADN materno, debido a la presencia de variantes genéticas no funcionales del gen de RhD) . Valores de Ct altos (34 a 43) fueron diagnóstico del estado de RhD fetal positivo, y también confirmaron la presencia del ADN fetal en el lisado. Ninguna amplificación del ADN plantilla (extraído) fue interpretada como que el feto carece de antígeno D funcional (por ejemplo RhD negativo fetal) , que fue confirmado por la RT-PCR del ADN extraído de tejidos fetales similares. La tabla 1 lista los valores de Ct de la RT-PCR del ADN extraído de 16 muestras de sangre materna RhD-negat ivas . La tabla 2 resume los resultados.
Tabla 1: Valores de umbral de ciclo para exones de RHD amplificados a partir del ADN extraído de muestras de sangre materna RhD-negativa Tabla 2: Resumen de los Resultados. El estado de RhD fetal fue correctamente identificado en los 16 casos.
Tejido Fetal Concordante RhD-Positivo RhD-Negativo RhD-Positivo 13 0 * Sensibilidad: 100% (ningún falso negativo) * Especificidad: 100% (ningún falso negativo) Ejemplo 2. Validación de los grupos de cebadores del exón de RhD Ocasionalmente, altos valores de Ct mayores de 37 fueron encontrados cuando se realizó la amplificación por RT-PCR sobre sangre selectivamente lisada proveniente de una madre RhD-negativa . Para verificar que estos altos valores de Ct de los amplicones generados por los cebadores de RhD fueran de hecho representativos de los productos de PCR correspondientes a la presencia de cantidades pequeñas del ADN fetal RhD-posit ivo, el tamaño de producto de PCR fue examinado mediante electroforesis en gel y subsecuentemente secuenciado para verificar que había sido amplificado el locus correcto de RhD.
Muestras de sangre provenientes de madres RhD-negativas que llevan un feto RhD-positivo (muestras de 14180 ó 14202) fueron Usadas de acuerdo al método descrito en el ejemplo 1. Después de la lisis, el ADN fue aislado utilizando el equipo MagNa Puré de Roche. La PCR en tiempo real fue realizada sobre el sistema de RT-PCR 7900HT de ABI utilizando la Mezcla Maestra Universal Taqman (Applied Biosystems) con los grupos de cebadores de RhD 4.2, 4.3, 5,; 5.2, 7, 7.3, 10, y 10.1 descritos en el ejemplo 1. Para cada grupo de cebadores, se corrió un control sin plantilla de ADN (NTC) , el cual siempre dio como resultado un valor de Ct indeterminado, indicando ausencia de amplificación. Las reacciones de PCR de alto Ct (>37) y los NTCs fueron luego corridas ya sea sobre un gel de agarosa al 1.5% o un gel de agarosa MS-8 al 4.5%, contra una escalera de ADN conocida, como un marcador para evaluar el tamaño de los amplicones. El tamaño esperado del amplicón, de 58 a 83 pares de bases de longitud, fue observado para todos los productos de PCR resultantes de todos los cebadores de RhD.
Después de la extracción de las bandas esperadas del amplicón a partir del gel, los amplicones fueron secuenciados directamente utilizando ya sea los cebadores de PCR delanteros e inversos. El secuenciamiento fué realizado por Retroben en San Diego. Si los datos de secuenciamiento obtenidos fueron no concluyentes , el amplicón fue clonado dentro del vector pCR4-TOPO (Invitrogen) y secuenciado utilizando el cebador T3. Seis de los ocho amplicones pudieron ser secuenciados directamente, mientras que los restantes dos fueron secuenciados a partir del vector pCR4-TOPO. La secuencia obtenida para cada uno de los amplicones fue comparada a la secuencia publicada en la base de datos de la secuencia GenBank (NCBI) utilizando el algoritmo BLAST . Cada grupo de cebadores es discutido más adelante. La secuencia de ADN en LETRAS NEGRITAS representa la secuencia del amplicón obtenida experimentalmente . La secuencia del ADN en LETRAS ROJAS es la secuencia publicada en GenBank (indicada más adelante como Banco de Genes) . En todos los casos, la secuencia del amplicón por PCR fue una concordancia de 100% al locus Rh.
Grupos de cebadores 4.2 de Rh(D) (exón 4) La figura 2A presenta la muestra 14202 amplificada con el grupo de cebadores 4.2 (Ct 40.2) . Los tres productos de PCR observados fueron clonados separadamente dentro de pCR4-TOPO y secuenciados . La banda superior corresponde al amplicón correcto de 70 pares de bases, que fue identificado utilizando BLAST como el locus RhD : Secuenciamiento: grupo sanguíneo Rh de Homo sapiens, antígeno D (RHD) , mAR Sec . GTGCCTGCCAAAGCCTCTACCCGAGGGAACGGAGGATAAAGATCAGACAGCAACGATACCCAGTTTGTCT 70 Encontrada MI II I III IIII IIIIIMIII Mi III HMIi miM IMIMMII II I Sec . del G GCCTGCCAAAGCCTCTACCCGAGGGAACGGAGGATAAAGATCAGACAGCAACGATACCCAGTTTGTC 682 banco de genes Grupos de cebadores 4.3 de Rh(D) (exón 4) La figura 2B describe el gel electroforético de la muestra 14202 amplificada con el grupo de cebadores 4.3 de RhD (Ct 40.4) .
Secuenciamiento: grupo sanguíneo Rh de Homo sapiens, antígeno D (RHD) , mARN sec. Encontrada TGTTCGCAGCCTATTTTGGGCTGTCTGTGGCC 32 1111 i 11 ! I í 11111111111111111111 i I sec. del Banco de Genes TGT CGCAGCCTATTTTGGGCTGTCTGTGGCC 610 Grupos de cebadores 5 de Rh(D) (exón 5) La figura 3A muestra el gel electroforético de la muestra 14180 amplificada con el grupo de cebadores 5 de RhD (Ct 39.3) .
Secuenciamiento: grupo sanguíneo Rh de Homo sapiens, antígeno D (RHD) , mARN Seq. Encontrada AC C GC C GCTGAGAAGTCCAATCGAAAGGAAGAATGCC 41 IIIIMIIll!l!!M !llll!l MI!M ll!MI!l!!i Seq. del Banco de Genes ACTC GCTCTGCTGAGAAGTCCAATCGAAAGGAAGAA GCC Grupos de cebadores 5.2 de Rh(D) (exón 5) La figura 3B muestra la amplificación de la muestra 14180 con el grupo de cebadores 5.2 de RhD (últimas 2 bandas) (Ct 35) .
Secuenciamiento: grupo sanguíneo Rh de Homo sapiens, antígeno D (RHD) , mARN Sec. Encontrada GAGCAGAGTTGAAACTTGGCCAGAACATCCACA 33 I i 11111111 II 111111111111111111111 Sec. del Banco de GenesGAGCAGAGTTGAAACTTGGCCAGAACATCCACA 705 Grupos de cebadores 7 de Rh(D) (exón 7) La figura 4A muestra un gel electroforético de la muestra 14202 amplificada con el grupo de cebadores 7 de RhD (últimas 3 bandas) (Ct 37.3) . Dos amplicones de tamaño muy similar de aproximadamente 53 y 58 pares de bases son visibles sobre el gel de agarosa MS8 al 4.5%. Estos dos productos fueron clonados separadamente dentro del vector de clonación TA y fueron secuenciados múltiples clones. Todos los clones secuenciados revelaron el mismo amplicón correcto de 58 pares de bases, que fue identificado utilizando BLAST como el locus de RhD.
Secuenciamiento: grupo sanguíneo Rh de Homo sapiens, antígeno D (RHD) , mARN Sec. Encontrada TCTCCAAGCAGACCCAGCAAGCTCAAGT^ 53 sec. del banco | | | | | | | | | | | | | | | 11111 ¡ 1111111111111111111111111111111 e 98neS TCTCCAAGCAGACCCAGCAAGCTGAAGTTGTAGCCCATGATGGAGC GTGGGGAATCC 1020' Grupos de cebadores 7.3 de Rh(D) (exón 7) La figura 4B describe el análisis electroforático de la muestra 14202 amplificada con el grupo de cebadores 7.3 de RhD (últimas dos bandas) (Ct 38.2) . Existe un amplicón de aproximadamente 61 pares de bases que fue identificado utilizando BLAST como el locus de RhD: Secuenciamiento: grupo sanguíneo Rh de Homo sapiens, antígeno D (RHD) , mARN Sec. Encontrada CATTGTGCTGCTGGTGCTTGATACCGTCGGAGCCGG 36 Sec. de! banco de genes I I M I I I I M I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I CATTGTGCTGCTGGTGCTTGATACCGTCGGAGCCGG 1122 Grupos de cebadores 10 y 10.1 de Rh(D) La figura 5 presenta la muestra 14180 amplificada con los grupos de cebadores 10 de RhD (Ct 42.1, últimas dos bandas, 59 pares de bases) y 10.1 (10H; Ct 37.7, primeras dos bandas, 74 pares de bases) . Los amplicones de aproximadamente 74 pares de bases y 59 pares de bases para el grupo de cebadores 10.1 y 10, respectivamente, fueron identificados utilizando BLAST como el locus de Rhd: Grupo de cebadores 10 de RhD (.exón 10) : Secuenciamiento: grupo sanguíneo Rh de Homo sapiens, antígeno D (RHD) , mARN sec. Encontrada CATGACAGCAAAGTCTCCAATGTTCGCGCAGG 32 I E ] 11 [ i I M 11 i 1111 M 11 f 11 E 111 f f 11 Sec. del banco de genes ^ATGACAGCAAAGTCTCCAATGTTCGCGCAGG 1430 Grupo de cebadores 10H de RhD (exón 10) : Secuenciamiento: grupo sanguíneo Rh de Homo sapiens, antígeno D (RHD) , mAR Sec. Encontrada CGCTCATGACAGCAAAGTCTCCAATGTTCGCGCAGGCACT 40 Sec . del banco de genes M I I I I I I I I I I I I I I I I M U I I I I I I I l i l i I I I M U CGCTCATGACAGCAAAGTCTCCAATGTTCGCGCAGGCACT 143 Los resultados de estos experimentos resumidos en la tabla 3, confirman que todos los productos de PCR de alto Ct, hasta un valor de Ct de 42 . 1 , resultantes de la PCR en tiempo real realizada con los cebadores de RhD, son productos amplificados reales.
Tabla 3: resultados de validación de Ct para los grupos de cebadores de RhD Exón de RhD Tamaño del amplicón Muestra Ct Secuencia identificada Método 4.2 70 14202 40.2 locus RhD - 100% de concordancia clonación 4.3 62 14202 40.4 locus RhD - 100% de concordancia PCR 5 83 14180 39.3 locus RhD - 100% de concordancia PCR 5.2 73 14180 35 locus RhD - 100% de concordancia PCR 7 58 14202 37.3 locus RhD - 100% de concordancia clonación 7.3 61 14202 38.2 locus RhD - 100% de concordancia PCR 10 59 14180 42.1 locus RhD - 100% de concordancia PCR 10.1 74 14180 37.7 locus RhD - 100% de concordancia PCR Ejemplo 3: Determinación de la presencia del ADN fetal en muestras de sangre materna Muestras Masculinas RhD-Negativas Fetales El objetivo de los experimentos descritos en este ejemplo fue confirmar la presencia de ADN fetal en lisados preparados a partir de muestras de sangre materna. La positividad de RhD fetal proveniente de la sangre de madres RhD-negativas , fue considera diagnóstico en presencia de ADN fetal en las muestras maternas. En casos donde el estado de RhD fetal era negativo, el origen fetal del ADN fue establecido primeramente al determinar el género fetal por RT-PCR con cebadores y sondas diseñadas para amplificar los locus de SRY (región de determinación del sexo) y FCY sobre el cromosoma Y. Los cebadores de FCY y la sonda que fueron utilizados, fueron previamente descritos en la literatura (D. Bianchi, et al., (2001) Clin. Chem. , Vol . 47: 1867). El género fetal fue también determinado utilizando los nuevos cebadores y la sonda desarrollada para amplificar el gen DAZ (suprimido en azoospermia) sobre el cromosoma Y. El gen de la beta-globina utilizado como un gen de mantenimiento doméstico junto con el ADN masculino conocido, como un control positivo, y el ADN femenino como un control negativo. Los valores de Ct para las muestras positivas á SRY estuvieron en el intervalo de 32 a 7.5 mientras que las muestras positivas a FCY dieron valores de Ct entre 32 a 38. Los valores de Ct para las muestras positivas a DAZ estuvieron en el intervalo de 30 a 35, indicando que los cebadores y la sonda de DAZ fueron más sensibles que los cebadores/sonda de SRY y FCY. Los valores de beta-globina estuvieron en el intervalo de 24 a 32. Las secuencias de las sondas y los cebadores de los genes SRY, FCY, DAZ y beta-globina se listan enseguida: 5. 3 .
Cebador Delantero de SRY TGCACAGAGAGAAATACCCGAATTA (SEQ ID NO: 25) Cebador Inverso de SRY TGCAATTCTTCGGCAGCAT (SEQ ID NO: 26) Sonda de SRY (6FAM) -AAGTATCGACCTCGTCGGAAGGCGAA- (MGBNFQ) (SEQ ID NO: 27) Cebador Delantero de FCY TCCTGCTTATCCAAATTCACCAT (SEQ ID NO: 28) Cebador Inverso de FCY ACTTCCCTCTGACATTACCTGATAATTG (SEQ ID NO: 29) Sonda de FCY ( 6FAM) -AAGTCGCCACTGGATATCAGTTCCCTTGT- (TAMRA) (SEQ ID NO: 30) Cebador Delantero de DAZ 1.3 CGTATTCATTTTTTTCTGGAACCTTT (SEQ ID NO: 31) Cebador Inverso de DAZ 1.3 CTGAT ATCCAGTGGCGACTTGA (SEQ ID NO: 32) Sonda de DAZ ( 6FAM) -CAGGCATTTCCTGCTTATCCAAATTCACC- (BHQ- 1) (SEQ ID NO: 33) Cebador Delantero de Beta-Globina GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA (SEQ ID NO: 34) Cebador Inverso de Beta-Globina CCTTGATACCAACCTGCCCAG (SEQ ID NO: 35) Sonda de Beta-Globina (6FAM) -AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG- (TAMRA) (SEQ ID NO: 36) Muestras Femeninas RhD-Negativas Fetales Muestras que fueron RhD-negativas y también negativas para los genes del cromosoma Y, fueron analizadas mediante RT-PCR utilizando 16 grupos de marcadores polimórficos diseñados para amplificar alelos paternamente heredados por el feto (M. Alizadeh, et al, (2002), Blood, Vol . 99: 4618). Primeramente, estos marcadores bialélicos fueron probados sobre el ADN materno. Luego, fue probado el ADN fetal para aquellos marcadores que fueron negativos sobre el ADN materno. La presencia de un alelo en el ADN fetal y la ausencia del mismo alelo en el genoma materno fue indicadora del alelo paternamente heredado por el feto. Las secuencias de los cebadores y las sondas para la detección de estos marcadores se muestran enseguida: 5. 3' Cebador Delantero de SOI - GGTACCGGGTCTCCACATGA (SEQ ID NO: 37) Cebador Inverso de SOI - GGG AAAGTC ACTCACCCAAGG (SEQ ID NO: 38) Sonda de SOI (6FA ) -CTGGGCCAGAATCTTGGTCCTCACA- (BHQ) (SEQ ID NO: 39) Cebador Delantero de S02- GCTTCTCTGGTTGGAGTCACG (SEQ ID NO: 40) Cebador Inverso de S02- GCTTGCTGGCGGACCCT (SEQ ID NO: 41) Sonda de S02- (6FAM) -CTGCACCACCAAATCATCCCCGTG- (BHQ) (SEQ ID NO: 42) 5' 3' Cebador Delantero de S03- CTTTTGCTTTCTGTTTCTTAAGGGC (SEQ ID NO: 43) Cebador Inverso de S03- TCAATCTTTGGGCAGGTTGAA (SEQ ID NO: 44) Sonda de S03- (6FAM) -CATACGTGCACAGGGTCCCCGAGT- (BHQ) (SEQ ID NO: 45) Cebador Delantero de S04- CTGGTGCCCACAGTTACGCT (SEQ ID NO : 46) Cebador Inverso de S04- AAGGATGCGTGACTGCTATGG (SEQ ID NO: 47) Sonda de S04- ( 6FAM) -TCCTGGCAGTGTGGTCCCTTCAGAA- (BHQ) (SEQ ID NO: 48) Cebador Delantero de S05- AAAGTAGACACGGCCAGACTTAGG (SEQ ID NO: 49) Cebador Inverso de S05- CATCCCCACATACGGAAAAGA (SEQ ID NO: 50) Sonda de S05- ( 6FAM) -CCCTGGACACTGAAAACAGGCAATCCT- (BHQ) (SEQ ID NO: 51) Cebador Delantero de S06- CAGTCACCCCGTGAAGTCCT (SEQ ID NO: 52) ' Cebador Inverso S06- TTTCCCCCATCTGCCTATTG (SEQ ID NO: 53) Sonda S06- ( 6FAM) -CCCATCCATCTTCCCTACCAGACCAGG- (BHQ) (SEQ ID NO: 54) Cebador Delantero de S07- TGGTATTGGCTTTAAAAT ACTGGG (SEQ ID NO : 55) Cebador Inverso de S07- TGTACCCAAAACTCAGCTGCA (SEQ ID NO: 56) Sonda S07- (6FAM) -TCCTCACTTCTCCACCCCTAGTTAAACAG- (BHQ) (SEQ ID NO : 57) Cebador Delantero de S07b- GGTATTGGCTTTAAAATACTCAACC (SEQ ID NO: 58) Cebador Inverso de S07b- CAGCTGCAACAGTTATCAACGTT (SEQ ID NO: 59) Sonda de S07- ( 6FAM) -TCCTCACTTCTCCACCCCTAGTTAAACAG- (BHQ) (SEQ ID NO: 57) Cebador Delantero de S08- CTGGATGCCTCACTGATCCA (SEQ ID NO : 60) Cebador Inverso de S08- TGGGAAGGATGCATATGATCTG (SEQ ID NO: 61) Sonda de S08 - (6FAM) -CTCCCAACCCCCATTTCTGCCTG- (BHQ) (SEQ ID NO: 62) Cebador Delantero de S08b- GCTGGATGCCTCACTGATGTT (SEQ ID NO: 63) Cebador Inverso de SO8- TGGGAAGGATGCATATGATCTG (SEQ ID NO: 61) Sonda de S08- (6FAM) -CTCCCAACCCCCATTTCTGCCTG- (BHQ) (SEQ ID NO: 62) Cebador Delantero de S09a- GGGCACCCGTGTGAGTTTT (SEQ ID NO: 64) Cebador Inverso de S09a- TCAGCTTGTCTGCTTTCTGGAA (SEQ ID NO: 65) Sonda S09- ( 6FAM) -TGGAGGATTTCTCCCCTGCTTCAGACAG- (BHQ) (SEQ ID NO: 66) Cebador Delantero de S09a- GGGCACCCGTGTGAGTTTT (SEQ ID NO: 64) Cebadores Inversos de S09b- CAGCTTGTCTGCTTTCTGCTG (SEQ ID NO: 67) Sonda de S09- ( 6FAM) -TGGAGGATTTCTCCCCTGCTTCAGACAG- (BHQ) (SEQ ¦ ID NO: 66) 5' 3' Cebador Delantero SlOa- GCCACAAGAGACTCAG (SEQ ID NO: 68) Cebador Inverso de SlOa- TGGCTTCCTTGAGGTGGAAT (SEQ ID NO: 69) Sonda de S10- (6FAM) -CAGTGTCCCACTCAAGTACTCCTTTGGA- (BHQ) (SEQ ID NO: 70) Cebador Delantero de SlOb- TTAGAGCCACAAGAGACAACCAG (SEQ ID NO : 71) Cebador Inverso de SlOa- TGGCTTCCTTGAGGTGGAAT (SEQ ID NO: 69) Sonda de S10- (6FAM) -CAGTGTCCCACTCAAGTACTCCTTTGGA- (BHQ) (SEQ ID NO: 70) Cebador Delantero de Slla- TAGGATTC AACCCTGGAAGC (SEQ ID NO: 72) Cebador Inverso de Slla- CCAGCATGCACCTGACTAACA (SEQ ID NO : 73) Sonda de Sll-a (6FAM) -CAAGGCTTCCTCAATTCTCCACCCTTCC- (BHQ) (SEQ ID NO: 74) Cebador Delantero de SIIb- CCCTGGATCGCCGTGAA (SEQ ID NO: 75) Cebador Inverso de Slla- CCAGCATGCACCTGACTAACA (SEQ ID NO: 73) Sonda de Sil- (6FAM) -CAAGGCTTCCTCAATTCTCCACCCTTCC- (BHQ) (SEQ ID NO: 74) El secuenciamiento de los amplicones con el valor de Ct tan alto como de 43, ha mostrado más allá de la sombra de dudas, que estos amplicones de altos Ct son por supuesto productos de PCR reales (datos no mostrados) . Los resultados de estos experimentos demuestran que el ADN fetal puede ser¦ extraído por lisis selectiva de muestras de sangre materna, como se describe en el ejemplo 1, y que este ADN aislado puede ser utilizado para predecir de manera precisa el genotipo de RhD del feto.
Ejemplo 4. Nuevos cebadores y sondas para amplificar exones particulares del gen de RhD Este ejemplo describe las nuevas secuencias cebadoras y de sonda, adicionales, para amplificar y detectar exones particulares del gen de RhD humano. Estas secuencias de sonda y de cebadores se utilizan en métodos para determinar el genotipo de RhD en un sujeto, particularmente en métodos basados en RT-PCR. 5 3' Cebador Delantero del Exón 2.2 de RhD CCGTGATGGCGGCCA (SEQ ID NO: 76) Cebador Inverso del Exón 2.2 de RhD CAGCTGTGTCTCCGGAAACTC (SEQ ID NO: 77) Sonda del Exón 2.2 de RhD (NED) -CTTGGGCTTCCTCACCT- (MGBNFQ) (SEQ ID NO: 78) 5. _ 3.
Cebador Delantero del Intrón 4 de RhD ACAAGGAAACAAAGGCCAAGAG (SEQ ID NO: 79) Cebador Inverso del Intrón 4 de RhD AATTAAGCACTTCACAGAGCAGGTT (SEQ ID NO: 80) Sonda del Intrón 4 de RhD (6FA ) -TTGAAATCTGCATACCCCAGGCCTCCT-(MGBNFQ) (SEQ ID NO: 81) Cebador Delantero del Intrón 4 de RhD ACAAGGAAACAAAGGCCAAGAG (SEQ ID NO: 79) Cebador Inverso del Intrón 4 de RhD AATTAAGCACTTCACAGAGCAGGTT (SEQ ID NO: 80) Sonda del Intrón 4 de RhD ( 6FAM) -TTGAAATCTGCATACCCCAGGCCTCCT- (BHQ) (SEQ ID NO: 82) Cebador Delantero del Intrón 4.1 de RhCED AGGCTGAGGCAGGAGAATCTT (SEQ ID NO: 83) Cebador Inverso del Intrón 4.1 de RhCED GCAGTGGCGCGATCTTG (SEQ ID NO: 84) Sonda del Intrón 4.1 de RhCED (6FAM) -TGAATCCAGGTGGTGGAGGTTGCA- (MGBNFQ) (SEQ ID NO: 85) Cebador Delantero del Intrón 4.1 de RhD TGAGTAGTGTTTGCTAAATTCATACCTTT (SEQ ID NO: 86) Cebador Inverso del Intrón 4.1 de RhD ACCCC AGGCCTCCTGAAC (SEQ ID NO: 87) Sonda del Intrón 4.1 de RhD (6FAM) -TAAGCACTTCACAGAGCAG- (BHQ) (SEQ ID NO: 88) Cebador delantero del Exón 4.2 de RhD GCATGGCAGACAAACTGGGTAAT (SEQ ID NO: 89) Cebador Inverso del Exón 4.2 de Rhm CTGCCAAAGCCTCTACCGG (SEQ ID NO: 90) Sonda del Exón 4.2 de RhD1? (6FAM) -TTGCTGTCTGATCTTT- (BHQ) (SEQ ID NO: 91) Cebador Delantero del Exón 5.1 de ???? ATGTTCTGGCCAAGTTTCAAGAT (SEQ ID NO: 92) Cebador Inverso del Exón 5.1 de RHD¾f GCTACAGCATAGTAGGTGTTGAAGTC (SEQ ID NO : 93) Sonda del Exón 5.1 de RHD ? (6FAM) CTCTGCTGAGAAGTCCAATCGAAAGGAAGA- (BHQ) (SEQ ID NO: 94) Cebador Delantero del Exón 5.1 de RHD? ATGTTCTGGCCAAGTTTCAACGT (SEQ ID NO: 95) Cebador Inverso del Exón 5.1 de RHD1? GCTACAGCATAGTAGGTGTTGAACGC (SEQ ID NO : 96) Sonda del Exón 5.1 de RHD ? ( 6FAM) -CTCTGCTGAGAAGTCCAATCGAAAGGAAGA- (MGBNFQ) (SEQ ID NO: 91] Cebador Delantero del Exón 5.1 de RHD\(J GATGTTCTGGCCAAGTTTCAACTC (SEQ ID NO : 98) Cebador Inverso del Exón 5.1 de RHD? CTGCTAC AGC AT AGT AGGTGTTG AAC AC (SEQ ID NO : 99) Sonda del Exón 5.1 de RHDI|J (6FAM) - CTCTGCTGAGAAGTCCAATCGAAAGGAAGA- (BHQ) (SEQ ID NO: 94) 5. 3.
Cebador Delantero del Exón 5.1 de RHD ATGTTCTGGCCAAGTTTCAACAT (SEQ ID NO: 100) Cebador Inverso del. Exón 5 de ???? GCTACAGCATAGTAGGTGTTGAACTC (SEQ ID NO: 101) Sonda del Exón 5.1 de RHD (6FAM) - CTCTGCTGAGAAGTCCAATCGAAAGGAAGA- (BHQ) (SEQ ID NO: 94) Cebador Delantero del Exón 5.2 de RhD AATAAATCATAATGTGGATGTTCTGGCCAAGTT (SEQ ID NO : 102) Cebador Inverso del Exón 5.2 de RhD AATAAATCATAATGAACACGGCATTCTTCCTTTC (SEQ ID NO : 103) Sonda del Exón 5.2 de RhD (6FAM) -AACTCTGCTCTGCTGAGAAGTCCAAT- (BHQ) (SEQ ID NO: 12) Cebador Delantero del Exón 5.2 de RHD¾' GCGCCCTCTTCTTGTGGAAC (SEQ ID NO: 104) Cebador Inverso del Exón 5.2 de RHD¾f CATTCTTCCTTTCGATTGGACTTCT (SEQ ID NO: 105) Sonda del Exón 5.2 de RHDXP (6FAM) -TCTGGCCAAGTTTC- (BHQ) (SEQ ID NO: 106) Cebador Delantero del Exón 5.3 de RHD TGTGGATGTTCTGGCCAAGTT (SEQ ID NO: 10) Cebador Inverso del Exón 5.3 de RHD¾f TTGAACACGGCATTCTTCCTT (SEQ ID NO: 107) Sonda del Exón 5.3 de RHm (6FAM) - CAACTCTGCTCTGCTGAGAAGTCCAATCG- (BHQ) (SEQ ID NO: 108) Cebador Delantero del Exón 6.1 de RHD CACACGCTATTTCTTTGC AGACTT AT (SEQ ID NO: 109) Cebador Inverso del Exón 6.1 de RKOV GTTGTCTAGTTTCTTACCGGCAGGT (SEQ ID NO: 110) Sonda del Exón 6.1 de RHD? ( 6FAM)-TGTCACCTGATCCCTTCTCCGTGGC- (BHQ) (SEQ ID NO: 111) Cebador Delantero del Exón 6.1 de RHD ACGCTATTTCTTTGCAGACTTGG (SEQ ID NO: 112) Cebador Inverso del Exón 6.1 de RHD1? GTTGTCTAGTTTCTTACCGGCAGTT (SEQ ID NO : 113) Sonda del Exón 6.1 de ???? ( 6FAM)-TGTCACCTGATCCCTTCTCCGTGGC- (BHQ) (SEQ ID NO: 111) Cebador Delantero del Exón 6.1 de RHD ACGCT ATTTCTTTGC AGACTATG (SEQ ID NO: 114) Cebador Inverso del Exón 6.1 de ?.?? GTTGTCTAGTTTCTTACCGGCACCT (SEQ ID NO : 115) Sonda del Exón 6.1 de ??? ( 6FAM) -TGTCACCTGATCCCTTCTCCGTGGC- (BHQ) (SEQ ID NO: 111) Cebador Delantero del Exón 6.1 de RHD ACGCTATTTCTTTGCAGACTTTG (SEQ ID NO : 116) Cebador Inverso del Exón 6.1 de RHD'P GTTGTCTAGTTTCTTACCGGCAGCT (SEQ ID NO: 117) Sonda del Exón 6.1 de RHD¾> ( 6FAM) -TGTCACCTGATCCCTTCTCCGTGGC- (BHQ) (SEQ ID NO: 111) Cebador Delantero del Exón 7.2 de RhD CAGCTCCATCATGGGCTACAA (SEQ ID NO: 118) Cebador Inverso del Exón 7.2 de RhD GCACCAGCAGCACAATGTAGA (SEQ ID NO: 119) Sonda del Exón 7.2 de RhD (6FAM) -CTTGCTGGGTCTGCTTGGAGAG- (BHQ) (SEQ ID NO: 120) Cebador Delantero del Exón 10.3 de RhD GCAGTGCCGCAATCTCG (SEQ ID NO: 121) Cebador Inverso del Exón 10.3 de RhD CTGAGGCAGGAGAATTGCTTG (SEQ ID NO: 122) Sonda del Exón 10.3 de RhD 10.3 (6FA ) -AACCTCCGCCTCCCA- (MGBNFQ) (SEQ ID NO: 123) Se entiende que la invención descrita no está limitada a la metodología particular, a los protocolos y los materiales descritos, ya que éstos pueden variar. Se entiende también que la terminología aquí es para fines de describir las modalidades particulares únicamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención que estará limitada únicamente por las reivindicaciones anexas.
Aquellas personas expertas en la técnica reconocerán, o serán capaces de averiguar utilizando no más que experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención descrita en la presente. Tales equivalentes están destinados a ser abarcados por las siguientes reivindicaciones.
Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (80)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID No.: 1, SEQ ID No. : 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No . : 5, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No . : 13, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 17, SEQ ID No.: 19, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 22, y SEQ ID No. : 23, caracterizado porque contiene menos de cincuenta bases.
2. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido se híbrida a un exón del gen de RHD humano.
3. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de la SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No. : 9, SEQ ID No . : 12, SEQ ID No.: 15, SEQ ID No.: 18, SEQ ID No.: 21, y SEQ ID No.: 24, caracterizado porque contiene menos de cincuenta bases.
4. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque una molécula reportera es enlazada al extremo 5' del polinucleótido y una molécula apagadora es enlazada al extremo 3' del polinucleótido.
5. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polinucleótido detecta un exón del gen de RHD humano.
6. Un polinucleótido aislado que comprende una secuencia indicada la SEQ ID No.: 31, SEQ ID No.: 32, o SEQ ID No.: 33, caracterizado porque el polinucleótido aislado contiene menos de cincuenta bases.
7. El polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polinucleótido detecta un cromosoma Y humano.
8. Un kit de genotipificación de RhD caracterizado porque comprende : al menos un grupo de cebadores, en donde al menos un grupo de cebadores comprende un cebador delantero y un cebador inverso; al menos una sonda marcada; y las instrucciones para utilizar al menos un grupo de cebadores y al menos una sonda para detectar un gen de RHD en una muestra biológica, en donde- el cebador delantero y el cebador inverso se hibridan a un exón del gen de RHD humano.
9. El kit de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el exón es el exón 4, exón 5, exón 7, o exón 10 del gen de RHD humano.
10. El kit de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el exón es el exón 4.
11. El kit de conformidad con la reivindicación 10,, caracterizado porque el cebador delantero es la SEQ ID No.: 1 o SEQ ID No.: 4 y el cebador inverso es la SEQ ID No.: 2 o SEQ ID No. : 5.
12. El kit de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque al menos una sonda marcada es la SEQ ID No . : 3 o SEQ ID No . : 6.
13. El kit de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el exón es el exón 5.
14. El kit de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el cebador delantero es la SEQ ID No.: 7 o SEQ ID No.: 10 y el cebador inverso es la SEQ ID No.: 8 o SEQ ID No. : 11.
15. El kit de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque al menos una sonda marcada es la SEQ ID No. : 9 o SEQ ID No. : 12.
16. El kit de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el exón es el exón 7.
17. Él kit de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el cebador delantero es la SEQ ID No.: 13 o SEQ ID No.: 16 y el cebador inverso es la SEQ ID No.: 14 o SEQ ID No. : 17.
18. El kit de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque al menos una sonda marcada es la SEQ ID No. : 15 o SEQ ID No. : 18.
19. El kit de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el exón es el exón 10.
20. El kit de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el cebador delantero es la SEQ ID No.: 19 o SEQ ID No. : 22 y el cebador inverso es la SEQ ID No. : 20 O SEQ ID No. : 23.
21. El kit de conformidad con la reivindicación 19,( caracterizado porque al menos una sonda marcada es la SEQ ID No. : 21 o SEQ ID No. : 24.
22. El kit de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el kit comprende dos o más grupos de cebadores y dos o más sondas marcadas .
23. El kit de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque dos ^o más grupos de cebadores se hibridan a un exón simple del gen de RHD humano.
24. El kit de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque dos o más grupos de cebadores se hibridan a dos o más exones del gen de RHD humano.
25. El kit de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque además comprende un reactivo de lisis.
26. El kit de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el reactivo de lisis comprende S- (2-guanidino-4 -tiazoil ) -metil- isotiourea .
27. El kit de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el reactivo de lisis comprende S- (2-guanidino-4 -tiazoil) -metil-isotiourea, vitamina E, saponina, DMSO, tritón X-100 y un amortiguador de pH 7.2 a 7.4.
28. Un método para determinar el genotipo de RHD de un sujeto, caracterizado porque comprende: lisar las células en una muestra biológica para formar una mezcla de lisis, en donde la muestra biológica contiene una o más células del sujeto; extraer el ácido nucleico de la mezcla de lisis; y detectar al menos un exón del gen de RHD en el ácido nucleico extraído, en donde la presencia o ausencia del exón indica el genotipo de RHD del sujeto.
29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el sujeto es un feto.
30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la muestra biológica es una muestra biológica materna que contiene células fetales.
31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la muestra biológica materna es una muestra de sangre completa.
32. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque las células fetales son preferentemente lisadas sobre células maternas.
33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el paso de lisar las células comprende poner en contacto la muestra biológica materna con un reactivo de lisis por un periodo de tiempo, en donde el reactivo de lisis comprende S- (2-guanidino-4-tiazoil) -metil-isotiourea .
34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el reactivo de lisis comprende S- (2-guanidino-4 -tiazoil ) -metil - isotiourea , vitamina E, saponina, tritón X-100, D SO, y un amortiguador de pH 7.2 a 7.4.
35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el periodo de tiempo es de aproximadamente 10 minutes a aproximadamente 30 minutes.
36. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la detección de al menos un exón del gen de RHD comprende amplificar al menos un exón con uno o más grupos de cebadores e identificar al menos un exón con una o más sondas marcadas .
37. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque uno o más grupos de cebadores comprenden un cebador delantero y un cebador inverso.
38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque al menos un exón es el exón 4, exóri 5, exón 7 o exón 10 del gen de RHD humano.
39. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque al menos un exón es el exón 4.
40. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el cebador delantero es la SEQ ID No. : 1 o SEQ ID No. : 4 y el cebador inverso es la SEQ ID No.: 2 o SEQ ID No. : 5.
41. El método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque una o más sondas marcadas es la SEQ ID No. : 3 o SEQ ID No. : 6.
42. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque al menos un exón es el exón 5.
43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el cebador delantero es la SEQ ID No.: 7 o SEQ ID No . : 10 y el cebador inverso es la SEQ ID No. : 8 O SEQ ID No . : 11.
44. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque una o más sondas marcadas es la SEQ ID No. : 9 o SEQ ID No . : 12.
45. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque al menos un exón es el exón 7.
46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque el cebador delantero es la SEQ ID No.: 13 o SEQ ID No.: 16 y el cebador inverso es la SEQ ID No.: 14 O SEQ ID No . : 17.
47. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque una o más sondas marcadas es la SEQ ID No. : 15 O SEQ ID No. : 18.
48. El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque al menos un exón es el exón 10.
49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el cebador delantero es la SEQ ID No.:( 19 o SEQ ID No.: 22 y el cebador inverso es la SEQ ID No. : 20 o SEQ ID No. : 23.
50. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque una o más sondas marcadas es la SEQ ID No. : 21 o SEQ ID No . : 24.
51. El método de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque dos o más grupos de cebadores son utilizados para amplificar al menos un exón y dos o más sondas marcadas son utilizadas para identificar al menos un exón .
52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque dos o más grupos de cebadores amplifican un exón simple del gen de RHD humano.
53. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque dos o más grupos de cebadores amplifican dos o más exones del gen de RHD humano.
54. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque comprende confirmar la presencia dé ADN fetal en el ácido nucleico extraído.
55. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el paso de confirmación de la presencia de ADN fetal comprende detectar un cromosoma Y.
56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque el cromosoma Y es detectado por amplificación de un gen localizado sobre el cromosoma Y con uno o más grupos de cebadores, en donde uno o más grupos de cebadores comprende un cebador delantero y un cebador inverso; e identificar el gen con una o más sondas marcadas.
57. El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque el gen localizado sobre el cromosoma Y se selecciona del grupo que consiste de SRY, FCY, y DAZ .
58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque el gen es DAZ.
59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el cebador delantero es la SEQ ID No. : 31 y el cebador inverso es la SEQ ID No. : 32.
60. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque una o más sondas marcadas es la SEQ ID No. : 33.
61. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque el paso de confirmación de la presencia de ADN fetal comprende detectar un alelo paternalmente heredado.
62. Un método para determinar el genotipo de RHD de un sujeto caracterizado porque comprende: extraer ácido nucleico de una muestra biológica, en donde la muestra ' biológica contiene una o más células del sujeto; y detectar al menos tres exones del gen de RHD en el ácido nucleico extraído, en donde la presencia o ausencia de los exones indica el genotipo de RHD del sujeto.
63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la detección de al menos tres exones del gen de RHD comprende amplificar al menos tres exones con tres o más grupos de cebadores, e identificar al menos tres exones con tres o más sondas marcadas.
64. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque al menos tres exones se seleccionan del grupo que consiste del exón 4, exón 5, exón 7, y exón 10 del gen de RHD humano.
65. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque cuatro exones del gen de RHD son detectados en el ácido nucleico extraído.
66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque cuatro exones son el exón 4, exón 5, exón 7, y exón 10 del gen de RHD humano.
67. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque el sujeto es un feto.
68. El método de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la muestra biológica es una muestra biológica materna que contiene células fetales.
69. El método de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque además comprende la confirmación de la presencia de ADN fetal en el ácido nucleico extraído.
70. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el paso de confirmación de la presencia de ADN fetal comprende detectar un cromosoma Y.
71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el cromosoma Y es detectado por la amplificación de un gen localizado sobre el cromosoma Y con uno o más grupos de cebadores e identificar el gen con una o más sondas marcadas .
72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el gen localizado sobre el cromosoma Y se selecciona del grupo que consiste de SRY, FCY, y DA .
73. El método de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado porque el paso de confirmación de la presencia de ADN fetal comprende detectar un alelo paternalmente heredado.
74. Una . mezcla de reactivos, caracterizada porqué comprende ácido nucleico aislado; tres o más grupos de cebadores para la amplificación de tres o más exones de un gen de RHD, en donde cada grupo de cebadores comprende un cebador delantero y un cebador inverso; y tres o más sondas marcadas.
75. La mezcla de reactivos de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque tres o más exones se seleccionan del grupo que consiste del exón 4, exón 5, exón 7, y exón 10 del gen de RHD humano.
76. La mezcla de reactivos de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque los cebadores delanteros de tres o más grupos de cebadores se seleccionan del grupo que consiste de la SEQ ID No. : 1, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 10, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 16, SEQ ID No. : 19, y SEQ ID No.: 22.
77. La mezcla de reactivos de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque los cebadores inversos de tres o más grupos de cebadores se seleccionan del grupo que consiste de la SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 5, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 14, SEQ ID No.: 17, SEQ ID No. : 20, y SEQ ID No.: 23.
78. La mezcla de reactivos de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque tres o más sondas marcadas se seleccionan del grupo que consiste de la SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 6, SEQ ID No. : 9, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 15, SEQ ID No . : 18, SEQ ID No . : 21, y SEQ ID No . : 24.
79. La mezcla de reactivos de conformidad con la reivindicación 75, caracterizada porque la mezcla comprende ácido nucleico aislado; cuatro grupos de cebadores para la amplificación de cuatro exones de un gen de RHD; y cuatro sondas marcadas .
80. La mezcla de reactivos de conformidad con la reivindicación 79, caracterizada porque los cuatro exones son el exón 4, exón 5, exón 7, y exón 10 del gen de RHD humano.
MX2011000566A 2008-07-18 2009-07-17 Genotipificacion no invasora de rhd fetal a partir de sangre completa materna. MX2011000566A (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US8216908P 2008-07-18 2008-07-18
PCT/US2009/051061 WO2010009440A2 (en) 2008-07-18 2009-07-17 Non-invasive fetal rhd genotyping from maternal whole blood

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MX2011000566A true MX2011000566A (es) 2011-03-15

Family

ID=41551036

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2011000566A MX2011000566A (es) 2008-07-18 2009-07-17 Genotipificacion no invasora de rhd fetal a partir de sangre completa materna.

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20110262916A1 (es)
EP (1) EP2324063A4 (es)
JP (1) JP2011528554A (es)
CN (1) CN102282176A (es)
BR (1) BRPI0916617A2 (es)
CA (1) CA2731086A1 (es)
MX (1) MX2011000566A (es)
WO (1) WO2010009440A2 (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2576780C2 (ru) * 2014-04-25 2016-03-10 Общество с ограниченной ответственностью "Ген-технология" Набор с лиофилизированными праймерами для пцр-диагностики гена резус-фактора плода по крови беременной женщины
CN107075582A (zh) * 2014-09-29 2017-08-18 富士胶片株式会社 胎儿的染色体非整倍性的非侵入性判别方法及判别系统
EP3592860B1 (en) 2017-03-08 2021-11-03 Etablissement Français du Sang Rhd gene allele associated with a weak d phenotype and its uses
CN107254543B (zh) * 2017-08-09 2020-11-10 深圳市血液中心 用于检测RhD mRNA剪接体的PCR引物组合、试剂盒及实时荧光定量检测方法
CN115927646B (zh) * 2022-06-07 2024-04-02 银丰基因科技有限公司 一种检测人类家系及孕妇胎儿游离DNA的Rh血型基因型的引物探针组、试剂盒及其应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5723293A (en) * 1995-11-06 1998-03-03 The New York Blood Center, Inc. Diagnostic method and kit for determining Rh blood group genotype
EP0944829B1 (en) * 1996-12-11 2003-07-02 Amersham plc Selective lysis of cells
ES2283324T3 (es) * 1999-11-02 2007-11-01 Drk-Blutspendedienst Baden-Wurttemberg-Hessen Gemeinnutzige Gmbh Estructura molecular del locus rhd negativo.
EP1229128A1 (en) * 2001-01-31 2002-08-07 Boehringer Mannheim Gmbh New method for genotype determination
EP1524321B2 (en) * 2003-10-16 2014-07-23 Sequenom, Inc. Non-invasive detection of fetal genetic traits
US20070196820A1 (en) * 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
US20110143340A1 (en) * 2007-11-01 2011-06-16 Biocept, Inc. Non-invasive isolation of fetal nucleic acid

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0916617A2 (pt) 2019-09-24
EP2324063A2 (en) 2011-05-25
WO2010009440A2 (en) 2010-01-21
WO2010009440A3 (en) 2010-05-20
CA2731086A1 (en) 2010-01-21
JP2011528554A (ja) 2011-11-24
CN102282176A (zh) 2011-12-14
EP2324063A4 (en) 2012-01-18
US20110262916A1 (en) 2011-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5789605B2 (ja) 染色体異数性の検出方法
US9404150B2 (en) Methods and compositions for universal size-specific PCR
US20140193817A1 (en) Methods and kits useful for detecting an alteration in a locus copy number
EP1668154B1 (en) Methods useful for detecting an alteration in a locus copy number
US20080096766A1 (en) Methods and compositions for the amplification, detection and quantification of nucleic acid from a sample
JP2018533953A (ja) 胎児と妊娠女性との間において差次的にメチル化されるｄｎａ領域を用いる胎児染色体異数性の検出
JP2004502466A (ja) 診断方法
CN107475366B (zh) 一种用于检测疾病的组合物及其试剂盒和用途
CN106868106B (zh) 使用数字pcr的产前诊断方法
CN110484621B (zh) 一种肝癌早期预警的方法
MX2011000566A (es) Genotipificacion no invasora de rhd fetal a partir de sangre completa materna.
WO2007044780A2 (en) Methods and systems for screening for and diagnosing dna methylation associated abnormalities and sex chromosome aneuploidies
WO2003076614A1 (fr) Procede de collecte de donnees destinees a evaluer la sensibilite a une maladie parodontale
EP3368690B1 (en) A method for prenatal diagnosis using digital pcr.
JP7335871B2 (ja) 短い核酸の多重検出
KR20180019143A (ko) 디지털 pcr을 이용한 산전진단 방법
Juusola Messenger Rna Profiling: A Prototype Method For Body Fluidand Tissue Identification

Legal Events

Date Code Title Description
FA Abandonment or withdrawal