KR20180019143A - 디지털 pcr을 이용한 산전진단 방법 - Google Patents

디지털 pcr을 이용한 산전진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 디지털 PCR을 이용한 산전진단 방법에 관한 것이다. 기존의 산전진단을 위한 양수 천자 방법은 침습적 검사로서, 주사기에 의한 양막의 세균감염, 주사기에 의한 상처 문제, 양수가 새는 문제 등의 위험성이 있었다. 따라서 최근에는 임부의 혈액으로부터 태아 DNA를 수득하여 태아의 유전자 이상을 진단하는 방법이 도입되고 있으나, 임부의 혈액에는 임부 DNA에 비하여 매우 소량의 태아 DNA가 포함될 뿐이므로 태아의 유전정보 분석은 정확도가 매우 저하되는 실정이다. 본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 임부의 혈액을 이용한 산전진단시 태아 DNA를 농축하여 태아 유전정보 분석의 정확성을 향상시킬 수 있는 방법이다. 본 발명의 산전진단방법은 임부와 태아 모두에게 안전하고 간편하며 정확성을 신뢰할 수 있으므로, 산전진단 분야에서 크게 활용될 것으로 기대된다.

Description

디지털 PCR을 이용한 산전진단 방법{A method for prenatal diagnosis using digital PCR}
본 발명은 디지털 PCR을 이용한 산전진단 방법에 관한 것이다.
결혼 인구의 고령화 및 출산 연령대의 고령화 등의 원인으로 태아의 유전성 질병 발생 확률이 최근 10년간 빠르게 증가하고 있다. 태아의 유전적 이상을 포함하는 질환을 임신 초기에 검출할 경우, 임부와 태아에게 고통을 줄이면서도 안전에 필요한 조속한 의학적 조치가 가능하기 때문에, 태아의 유전적 이상을 조기에 진단하는 것은 매우 중요하다. 태아에게 발생할 수 있는 유전적 이상으로서는 염색체 일부의 전좌, 결실, 중복, 삽입, 및 수적 이상(예를 들어 3염색체성) 등을 들 수 있으며, 이러한 염색체 이상이 있는 경우 태아의 신체 전반에 걸쳐 구조 이상과 기능 이상이 발생한다. 특히 유전자의 수적 이상은 임부의 나이가 많을수록 높은 빈도로 발생하는 것으로 알려져 있다.
통상적으로 태아의 유전적 이상을 진단하기 위해서 양수 천자 방법이 사용되고 있는데, 양수 검사는 침습적 검사로서, 주사기에 의한 양막의 세균감염, 주사기에 의한 상처 문제, 양수가 새는 문제 등의 위험성이 있으며, 심각한 경우 유산이 될 수도 있다. 따라서, 최근에는 임부의 혈액으로부터 태아 DNA를 수득하여 태아의 유전자 이상을 진단하는 방법이 도입되고 있으나, 임부의 혈액에는 임부 DNA에 비하여 매우 소량의 태아 DNA가 포함될 뿐이므로 태아의 유전정보 분석은 정확도가 매우 낮은 실정이다. 이와 관련하여 대한민국 등록특허공보 제10-1387582호에서는 모체의 혈액 내에 극히 소량으로 존재하는 세포 유리 태아 핵산을 표적으로 리얼타임 PCR을 수행하여 모체 내 세포 유리 태아 핵산을 검출할 수 있는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 리얼타임 PCR 방법은 비침습적 방법이지만, 한번에 여러 가지 종류의 검사를 하는데 한계가 있고 정확한 태아의 유전자 수 이상을 검출하기 위해서는 표준곡선의 사용이 필요하며 소모되는 시료의 양이 일정 수준 이상 필요하다는 단점이 있다.
따라서 본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 임부의 혈액을 이용한 산전진단시 태아 DNA를 농축하여 태아 유전정보 분석의 정확성을 향상시킬 수 있는 방법이다. 본 발명의 산전진단방법은 임부와 태아 모두에게 안전하고 간편하며 정확성을 신뢰할 수 있으므로, 산전진단 분야에서 크게 활용될 것으로 기대된다.
본 발명은 상기와 같은 종래의 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 디지털 PCR을 이용한 산전진단 방법에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구체예에서 “산전진단”이란, 출생 전에 선천이상을 진단하는 것으로서, 출생전진단 또는 자궁 내 진단이라고도 한다. 태아 또는 태아로부터의 탈락물질을 시료로 하여, 세포유전학, 생화학적 해석 그리고 영상을 이용한 방법으로 검사를 시행한다. 발생과 관련한 선천이상의 조기 발견 및 모성보호를 목적으로 삼는다. 기법으로는 침습적방법(양수천자, 융모채취, 태아채혈, 태아피부생검, 태아간생검)과 비침습적방법(초음파, 모체혈중태아세포채취 등)이 있다.
유전자 산전진단에 대한 적응은 부모 중 어느 한쪽 이상이 염색체이상 또는 중한 유전병 보인자, 이상아분만력, 고령임신, 초음파로서 중독태아 이상 인정을 확인하는 염색체이상, 단일유전자병, 선천성대사이상 등이 의심되는 경우에 실시한다. 핵형분석에 있어서는 안전성 면에서 양수천자를 해야 하는데, 임신 15~18주 사이에 채혈하는 것을 원칙으로 한다. DNA 진단으로는 융모채취도 시행하는데 임신 9~11주 사이에 경질 또는 경복적으로 채취한다. 태아 채혈은 임신 16주 이후에 제대로부터 경복적으로 채취한다. 세포 유전학적인 진단으로서는 하이브리다이제이션법(Fluorescence In Situ Hybridization, FISH) 또는 태아유래세포배양에 의한 핵형검사를 시행하며, 분자유전학적 진단으로는 서던흡입법(southern blotting), 중합효소 연쇄반응법(Polymerase Chain Reaction, PCR)에 의한 직접진단, 무한단편장다형(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP), PCR-RFLP법 등에 의한 간접진단을 시행하고 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “염색체 수 이상”이란, 이수성이라고도 하며, 세포, 개체 또는 계통에서 하나의 세포당 염색체 수가 기본수의 정수배가 되지 않고, 정수배에 대하여 1 내지 여러 개가 많거나 혹은 적은 상태인 것, 즉 불완전한 구성을 한 유전체를 포함한 상태를 의미하며, 이러한 상태에 있는 세포 또는 개체를 이수체라고 한다. 일반적으로 염색체 수가 기본수의 정수배보다 많은 경우를 고수성, 적은 경우를 저수성이라 한다. 특히 2배체의 경우 1쌍의 상동염색체 2개가 결손되어 있는 경우를 0염색체성, 한쪽은 결손되고 다른 한쪽만 존재하는 경우를 1염색체성, 1쌍의 상동염색체 외에 또 다른 1개의 여분 염색체가 존재하는 경우를 3염색체성이라 한다.
대표적인 성염색체 이수성은 XXY이며 정소기능부전이 주된 특징으로 나타나는 클라인펠터(Klinefelter)증후군이다. 또한 X염색체가 1개(XO)이며 난소가 발육되지 않는 터너(Turner)증후군, X염색체가 3개인 XXX 여성, XYY의 YY증후군(YY남성)이 있다. 대표적인 상염색체 이수성은 21번염색체가 3염색체성인 다운증후군, 18번염색체가 3염색체성으로 태생기의 발달장애를 일으키는 에드워드(Edward)증후군, 13번염색체가 3염색체성으로 고도의 기형을 수반하는 파타우(Patau)증후군 등이 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 고양이울음증후군은 특징적인 우는 소리를 내는 것으로 5번염색체 단완(短腕)의 부분결실이 원인이다.
본 발명의 일 구체예에서 “리얼타임 PCR(Real-time polymerase chain reaction, Real-time PCR)” 이란, 실시간 중합효소연쇄반응, 큐 PCR(quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)이라고도 한며, 목표 DNA분자의 증폭과 양을 동시에 측정하는 분자생물학 실험 기법이다. 일반적으로 사용되는 RT-PCR은 역전사 중합연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction)을 말하며, 실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)이 아니다. 그러나 모든 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자들이 이것을 명확하게 구분하여 명명하는 것은 아니다. 실시간 중합효소연쇄반응은 DNA 샘플에서 하나 또는 그 이상의 특정 서열을 위해 절대적인 유전자 복제 수 또는 상대적인 양을 검출할 수 있다.
실험의 진행은 일반적인 중합효소연쇄반응을 따른다. 중요한 특징은, 증폭된 DNA가 실시간으로 측정된다는 것이다. 이 점이 마지막에서 DNA가 관측이 되는 기본적인 중합효소연쇄반응과의 차이점이다. 두가지의 일반적인 방법이 실시간 중합효소연쇄반응에서 사용된다. (1) 아무 DNA 이중나선에 끼어들어갈 수 있는 불특정한 형광염색, (2) 올리고뉴클레오티드로 이루어진 서열-특이적 DNA탐침, 형광으로 보고자가 라벨되어있고, 상보적인 DNA목표에 결합한 뒤 검출된다. 종종, 실시간 중합효소연쇄반응은 세포 또는 조직의 mRNA와 코팅되지 않은 RNA(non-coding RNA)를 수량화하기 위해 역전사 중합연쇄반응과 결합되어 행하여진다.
본 발명의 일 구체예에서 “디지털 PCR(Digital polymerase chain reaction, Digital PCR)” 이란, 핵산을 탐지하고 정량하는 새로운 접근법으로서 기존 qPCR에 비해 정확한 정량 분석과 표적 핵산 분자의 고감도 탐지가 가능하다. 기존의 qPCR의 결과 분석 방식이 아날로그 방식인 점에 반해, 결과 신호가 "0" 또는 "1"의 값을 가져 분석 방식이 디지털 방식인 디지털 PCR 방법은 대용량 시료의 분석, 한번에 다양한 시료의 검사 그리고 다양한 검사 항목을 한번에 수행할 수 있는 장점이 있다. 디지털 PCR (digital PCR) 기술은 DNA 시료를 표준 곡선이 필요 없는 단일 분자 계수법을 적용하여 절대정량이 가능한 기술로서, 하나의 웰 당 하나의 액적(droplet)에 대한 PCR 반응으로 보다 정확한 절대 정량을 수행할 수 있는 장점이 있다(Gudrun Pohl and le-Ming Shih, Principle and applications of digital PCR, Expert Rev. Mol. Diagn. 4(1), 41-47 (2004) 참조).
디지털 PCR은 평균 0.5개 내지 1개의 카피수로 희석되도록 준비된 시료 유전자 주형, 증폭 프라이머 및 형광 프로브를 포함하는 각 액적을 하나의 웰에 분배하고 에멀젼 PCR을 수행한 후, 형광 신호가 나타나는 웰은 1개의 유전자 카피수의 시료가 분배되어 증폭 후 신호를 나타내는 것이므로 "1"의 값으로 카운트하고 형광 신호가 없는 웰은 0개의 카피수의 시료가 분배되어 증폭이 일어나지 않아 신호가 없는 것이므로 "0"으로 카운트함으로써 절대 정량을 할 수 있다.
디지털 PCR에서는 형광 신호가 나타나는 웰 당 유전자 카피수가 1개인 경우에만 데이터의 신뢰성이 보장된다. 즉, 디지털 PCR에서의 정량은 프아송 분포(poisson distribution)를 통해 웰 당 신호가 있거나 없는 경우 이를 디지털 값 1 또는 0으로 보고 포지티브(1의 값)와 네가티브(0의 값)의 비율을 계산하는데, 전체 포지티브와 네가티브 합에 대한 포지티브의 비율이 프아송 분포의 유전자 카피수 1개를 크게 벗어나는 경우에는 확률적으로 웰 당 유전자 카피수가 1개를 초과하는 것을 의미하는 것이므로 데이터의 신뢰성을 담보할 수 없게 된다. 이러한 이유로 디지털 PCR에서는 증폭 후 정량한 값이 프아송 분포를 만족시키지 않아 웰 당 유전자 카피수가 1개를 크게 초과하는 경우에는 유전자 시료를 희석하여 프아송 분포를 만족시키도록 하는 것이 중요하고 웰 당 유전자 카피수 1개에 근접한 경우에는 보정된 값으로 정량하는 것이 중요하다(예를 들어, Poisson 9 프로그램을 이용하여 보정가능).
그러나, 디지털 PCR 방법은 정량 분석의 용이성, 대용량 분석, 다량의 시료 처리 능력 등에도 불구하고 현재까지는 디지털 PCR의 데이터 신뢰성 확보를 위한 정량 분석의 보정 기술이 요구되고 있고, 웰 당 유전자 카피수를 1개로 맞추는데 기술적인 어려움이 존재하고 있다. 특히, 전술한 바와 같이 임부의 혈액 내지 혈장으로부터 태아 유래 유전자의 수에 대한 이상에 관한 유전자 분석을 수행하는데 있어서, 유전자 수 이상에 관한 표적유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍과 프로브를 이용하여 디지털 PCR을 수행할 때, 다량으로 존재하는 모체 유래 유전자의 배경 신호에 의해 임부의 혈액 내지 혈장 내에 소량으로 존재하는 태아 유래 표적유전자와 관련한 유전자의 수에 대한 이상이 검출되지 않거나 불명확한 신호로서 검출되는 문제점이 있게 된다. 이러한 문제점은 태아 유래 세포 유리 유전자를 이용한 유전자형 분석 기술과 디지털 PCR 기술의 접목을 어렵게 하는 장벽이 되고 있다.
따라서, 디지털 PCR 기술을 기반으로 임부의 혈액 내지는 혈장 내에 미량으로 존재하는 태아 유래 유전자를 이용하여 태아의 유전자 수 이상을 분석할 때, 태아 유래 유전자로부터 유래한 신호만의 분리가 어려운 문제와 모체 유래 유전자 배경 신호에 의한 문제를 해결하면서도 디지털 PCR 기술에서 요구되는 프아송 분포를 만족시켜 정량 결과를 신뢰할 수 있는 기술의 제공이 요구되고 있는 실정이다.
본 발명의 일 구체예에서 “대조군유전자”란, 표적유전자의 이상 유무를 결정하기 위하여 검사의 기준이 되는 정상 유전자를 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에 있어서, 대조군유전자란 임부의 혈액 내지 혈장 내의 모체 유래 유전자 세트나 태아 유래 유전자 세트 모두에 있어서 유전자 수 이상과 관련이 없는 것으로 알려진 유전자로서, 이에 한정하는 것은 아니나, 1번 염색체 또는 2번 염색체일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “표적유전자”란, 분석대상이 되는 시료 내의 유전자들 중 유전자형 분석에 유용한 변이가 존재하는 유전자로서, 예를 들어 유전자 감식이나 개체 식별에 사용되는 마커 유전자, 특정 질환의 진단에 사용되는 마커 유전자, 염색체 수 이상 내지는 유전자 수 이상을 나타내는 유전자, 유전학적으로 의미가 있는 돌연변이를 갖는 유전자, STR (short tandem repeat)을 갖는 유전자 및 단일염기다형성을 갖는 유전자 등을 의미한다. 예를 들어, 본 명세서에 있어서, 표적유전자란 태아의 유전자 수 이상의 검사 대상이 되는 유전자로서, 이에 한정하는 것은 아니나, 21번 염색체(다운증후군), 18번 염색체(에드워드 증후군), 또는 13번 염색체(파타우 증후군)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 “진단”이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 진단은 임부의 혈액으로부터 태아의 유전정보를 분석하여 염색체 수 이상 여부를 결정하는 것이나, 이제 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에서, (a) 임부의 혈액으로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 DNA를 크기별로 분류하여 1,000 bp 이하의 DNA를 수득하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 DNA로 디지털 PCR을 수행하되, 염색체 수 이상과 관련이 없는 염색체 상에 위치한 대조군유전자와 염색체 수 이상과 관련된 염색체 상에 위치한 표적유전자에 대해 디지털 PCR을 수행하는 단계; (d) 상기 대조군유전자의 디지털 PCR 정량값에 대한 상기 표적유전자의 디지털 PCR 정량값의 비율을 산출하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계에서 산출된 비율이 0.70 내지 1.14 이면 태아의 염색체 수 정상으로 결정하는 단계를 포함하는 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하고, 상기 (d) 단계에서 산출된 비율이 0.95 내지 1.10 이면 태아의 염색체 수 정상으로 결정하는 단계를 포함하는 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 (b) 단계의 DNA를 크기별로 분류하는 방법은 (a) DNA에 마그네틱 비드를 일차 혼합(비드 A)하고 결합되지 않은 DNA를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득된 DNA에 마그네틱 비드를 이차 혼합(비드 B)하고 비드에 결합된 DNA를 수득하는 단계를 포함하는, 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 비드 A와 비드 B의 첨가 비율은 0.75 내지 1.25 : 1인 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 비드 A와 비드 B의 첨가 비율은 0.75 내지 1.0 : 1인 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 구체예에서, (a) 임부의 혈액으로부터 DNA를 수득하는 단계; (b) 상기 DNA를 크기별로 분류하여 1,000 bp 이하의 DNA를 수득하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 DNA로 디지털 PCR을 수행하되, 염색체 수 이상과 관련이 없는 염색체 상에 위치한 대조군유전자와 염색체 수 이상과 관련된 염색체 상에 위치한 표적유전자에 대해 디지털 PCR을 수행하는 단계; (d) 상기 대조군유전자의 디지털 PCR 정량값에 대한 상기 표적유전자의 디지털 PCR 정량값의 비율을 산출하는 단계; 및 (e) 상기 (d) 단계에서 산출된 비율이 0.10 내지 0.69, 또는 1.15 내지 1.80 이면 태아의 염색체 수 이상으로 결정하는 단계를 포함하는 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하고, 상기 (d) 단계에서 산출된 비율이 0.45 내지 0.69, 또는 1.15 내지 1.31 이면 태아의 염색체 수 이상으로 결정하는 단계를 포함하는 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 (d) 단계에서 산출된 비율이 0.10 내지 0.69 이면, 태아의 염색체성을 1염색체성으로 결정하는 단계를 포함하는 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 1염색체성은 터너증후군인 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 (d) 단계에서 산출된 비율이 1.15 내지 1.80 이면, 태아의 염색체성을 3염색체성으로 결정하는 단계를 포함하는 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 3염색체성은 다운증후군, 에드워드증후군 또는 파타우증후군인 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 (b) 단계의 DNA를 크기별로 분류하는 방법은 (a) DNA에 마그네틱 비드를 일차 혼합(비드 A)하고 결합되지 않은 DNA를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득된 DNA에 마그네틱 비드를 이차 혼합(비드 B)하고 비드에 결합된 DNA를 수득하는 단계를 포함하는, 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 비드 A와 비드 B의 첨가 비율은 0.75 내지 1.25 : 1인 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 비드 A와 비드 B의 첨가 비율은 0.75 내지 1.0 : 1인 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한 상기 기술한 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 표적유전자는 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 갖는 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 표적유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서는 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍이 사용되고, 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 표적유전자 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브로는 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드가 사용되는 것을 특징으로 하는 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 서열번호 2의 염기서열을 갖는 표적유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서는 서열번호 10 및 11의 프라이머 쌍이 사용되고, 상기 서열번호 2의 염기서열을 갖는 표적유전자 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브로는 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드가 사용되는 것을 특징으로 하는 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 서열번호 3의 염기서열을 갖는 표적유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서는 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍이 사용되고, 상기 서열번호 3의 염기서열을 갖는 표적유전자 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브로는 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드가 사용되는 것을 특징으로 하는 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 서열번호 4의 염기서열을 갖는 표적유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서는 서열번호 16 및 17의 프라이머 쌍이 사용되고, 상기 서열번호 4의 염기서열을 갖는 표적유전자 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브로는 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드가 사용되는 것을 특징으로 하는, 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한 상기 기술한 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 대조군유전자는 서열번호 5와 6의 염기서열을 갖는 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 서열번호 5의 염기서열을 갖는 대조군유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서는 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍이 사용되고, 상기 서열번호 5의 염기서열을 갖는 대조군유전자 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브로는 서열번호 21의 올리고뉴클레오티드가 사용되는 것을 특징으로 하는 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공하며, 상기 서열번호 6의 염기서열을 갖는 대조군유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서는 서열번호 22 및 23의 프라이머 쌍이 사용되고, 상기 서열번호 6의 염기서열을 갖는 대조군유전자 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브로는 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드가 사용되는 것을 특징으로 하는 태아의 염색체 이수성 진단에 대한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
이하 상기 본 발명을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명의 디지털 PCR을 이용한 산전진단 방법은 비침습적 시료 채취 방법을 이용함으로써 임부와 태아에게 안전하고, 모체 유래 유전자 배경 신호로부터 소량의 태아 유래 유전자 신호를 누락 및 오류 없이 안정적으로 분리 가능하여 태아 유전정보의 정확성을 향상시키므로, 태아의 유전 질병을 조기에 진단하는데 활용도가 높을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, 21번, 1번, 및 2번 염색체 상의 표적유전자 또는 대조군유전자의 유전자위를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, 정상 및 다운증후군 세포에 대하여 디지털 PCR을 수행하고, 대조군유전자의 디지털 PCR 정량값에 대한 표적유전자의 정상화한 값을 산출한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, 정상 및 다운증후군 태아를 임신한 임부의 양수 시료에 대하여 디지털 PCR 수행하고, 대조군유전자의 디지털 PCR 정량값에 대한 표적유전자의 정상화한 값을 산출한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, 긴 길이의 DNA(LD)와 짧은 길이의 DNA(SD)가 1:1로 혼합된 DNA 시료에 대하여 DNA의 파쇄입도별 구분을 수행하고, DNA 시료 대비 첫번째 비드(비드 A)의 첨가 양에 따라 LD가 얼마나 제거되는가를 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, APP 유전자를 이용하여 임부의 혈액 시료로부터 태아 유래 DNA와 모체 유래 DNA 비율을 정량한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, 정상 gDNA와 다운증후군 gDNA를 다양한 비율로 혼합한 gDNA 시료에 대하여 디지털 PCR 수행하고, 정상 대비 다운증후군 유전자 양의 비율값을 산출한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, 정상 또는 다운증후군(T21) 태아를 임신한 임부의 혈장으로부터 cfDNA를 추출한 후, 상기 DNA를 파쇄입도별로 구분하여 디지털 PCR 수행하고, 대조군유전자의 디지털 PCR 정량값에 대한 표적유전자의 정상화한 값을 산출한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 대조군유전자 및 표적유전자의 선정과 프라이머 쌍 및 프로브의 설계
태아 유래 유전자에 대한 유전자 분석, 예를 들어 3염색체성(trisomy)과 같은 유전자 수 이상 여부 분석을 수행하기 위하여 21번 염색체(3염색체시 다운증후군 발생)를 표적 염색체로 하고, 1번 염색체 및 2번 염색체를 대조군 염색체로 설정하였다. 다음으로 유전자 검출을 위해, 21번 염색체 상의 4개 구역의 유전자를 표적유전자로 설정하고, 1번 염색체 상의 1개 구역의 유전자와 2번 염색체 상의 1개 구역의 유전자를 대조군유전자로 하여, 이를 토대로 각각의 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍과 증폭반응 결과물을 확인할 수 있는 형광표지 프로브를 설계하였다. 이들 프라이머 (주)바이오니아(대한민국 대전광역시 소재), 프로브는 Thermo Fisher Scientific(미국 소재)에 의뢰하여 합성하였다. 상기 21번, 1번, 및 2번 염색체 상의 설정된 부위를 도 1에 나타내고, 상기의 서열 및 프라이머 쌍과 프로브의 설계를 표 1과 2에 기재하였다.
서열번호 유전자 염색체 유전자위 염기서열
서열번호 1 표적유전자 1 21 36616417-36616581 CTGCAGTTCTTTGTGAACACTCTCATTTGTTGTATCTGTAGGCTGTCTCTCTCAGTGGTAAATGCCTTCGTGTGTTTGTAATGCTGATGGTTACTTGAGGTAAATAAGAATGTACCACTTGGCTCAGTGTGCATGATGTAAGCTTGTCTTTGTTGTATGTTGGCT
서열번호 2 표적유전자 2 21 36071971-36072131 TGACTATCACATGTCTTTGGTTGTAAACTGCTGTGATAGTTACCCTAAGTAATGGGACAGGAGATGAACCCACCCATTAAATAACACAGCAATTAAGCAGCCACTTTTAGAAAAATTTAAATGTGTGGCTTCGAGTTGGGTACTTGCATGTACAGCTTACT
서열번호 3 표적유전자 3 21 44773359-44773476 CCCAGGCTATGCTAGAAGGTATGCTTACAATTGGAAAAGTGTAGGCAGATAACATTAAATGGCAATAGCATGTGTAAACTAACTGCAAATGAGGAAAAGGACATTCTAAAGACAGGAT
서열번호 4 표적유전자 4 21 36465317-36465426 GGACCAGAGGTTTATTGGAGGTCTAAATATTTATGGAGAGCAATGATGGCTAATTTTAGAAACCATTAGGTTGCTATTTTTAAACGTGTGCTATAAGGATTTGCTAATTT
서열번호 5 대조군유전자 1 1 202879715-202879841 GAGGAAGCAACTAGAAAACAATGGAAGGGACTTCAGATGGTAAGGTTTCTGTTTAGTACTTATTTCAATTTTAGGCCTCCTGAATAGTAGAGGTGGTGACAGGAGGATACCTGAAACCTTGGTTATA
서열번호 6 대조군유전자 2 2 28398885-28398996 GGGAACATCCCAGGTTCAGTAAAAATACAGAGTATTTGCGTTAAACTGGACCTCAGTGGGGATGTGATGGGAGGTATGAGACAGATTGTGCCCTTATCCTTTTCTCTTCTTG
정방향 프라이머(5'→3') 역방향 프라이머(5'→3') 형광 프로브(5'→3')
서열번호 1 (서열번호 7)
CGTGTGTTTGTAATGCTGATGGT		 (서열번호 8)
CATCATGCACACTGAGCCAAGT		 (서열번호 9)
ACTTGAGGTAAATAAGAATGTAC
(5'-VIC, 3'-MGB_NFQ)
서열번호 2 (서열번호 10)
CCCTAAGTAATGGGACAGGAGATG		 (서열번호 11)
AAGTGGCTGCTTAATTGCTGTGT		 (서열번호 12)
ACCCACCCATTAAAT
(5'-VIC, 3'-MGB_NFQ)
서열번호 3 (서열번호 13)
TGCTAGAAGGTATGCTTACAATTGGA		 (서열번호 14)
TCATTTGCAGTTAGTTTACACATGCT		 (서열번호 15)
AAGTGTAGGCAGATAAC
(5'-VIC, 3'-MGB_NFQ)
서열번호 4 (서열번호 16)
GACCAGAGGTTTATTGGAGGTCTAAAT		 (서열번호 17)
CACGTTTAAAAATAGCAACCTAATGG		 (서열번호 18)
TTTATGGAGAGCAATGAT
(5'-VIC, 3'-MGB_NFQ)
서열번호 5 (서열번호 19)
CAACTAGAAAACAATGGAAGGGACTT		 (서열번호 20)
TCAGGAGGCCTAAAATTGAAATAAG		 (서열번호 21)
AGATGGTAAGGTTTCTGTTTAG
(5'-FAM, 3'-MGB_NFQ)
서열번호 6 (서열번호 22)
CATCCCAGGTTCAGTAAAAATACAGA		 (서열번호 23)
CTGTCTCATACCTCCCATCACATC		 (서열번호 24)
TATTTGCGTTAAACTGGACC
(5'-FAM, 3'-MGB_NFQ)
실시예 2. 정상 및 다운증후군 세포에 대한 디지털 PCR 수행
정상 또는 다운증후군(T21)의 gDNA에 대한 디지털 PCR 결과값을 산출하기 위해 Coriell사의 정상 또는 다운증후군(T21) gDNA를 구입하였다.
상기 gDNA를 주형으로 QX200 (Bio-Rad, 미국) 디지털 PCR 장비를 이용하여 PCR을 수행하였다. 디지털 PCR을 위한 샘플의 적정 농도 설정을 위하여, 실험시 gDNA 샘플은 1 내지 5000배의 범위에서 단계적으로 희석하였다. 디지털 PCR을 위한 마스터믹스는 총 반응액 20 ㎕ 기준으로 0.5 내지 1.0 μM의 프라이머, 0.1 내지 0.25 μM의 프로브 조건에서 샘플의 주입 농도를 2 내지 10 ng으로 맞추어 반응용액을 준비하고(하기 표 3 참조), 각 PCR 튜브에 분배하였다. 상기 용액이 담긴 PCR 튜브를 DG8 액적 발생기 카트리지(DG8 droplet generator catridges) 고정체에 장착한 후 20 ㎕ 의 샘플을 샘플 웰에, 70 ㎕의 액적 발생 오일을 오일 웰에 분주하였다. 그 후, 개스킷(Gasket)을 카트리지에 장착한 후 QX200 액적 발생기를 이용하여 액적 생성 반응을 진행하고, 생성된 액적을 96-웰 PCR 플레이트에 분주한 후 표 4의 온도조건에 맞추어 PCR을 진행하였다.
No. PCR 증폭 조성 부피 (㎕)
1 DNA 주형을 갖는 샘플 1
2 프라이머/프로브 세트 9
3 ddPCR Supermix for Probes 10
합계 20
No. 단계 온도 시간 사이클
1 전처리 95℃ 10분
2 변성 94℃ 30초 40 사이클
3 어닐링 60℃ 60초
4 유지(Hold) 98℃ 10분
상기의 반응이 완료된 웰을 QX200 액적 리더기(QX200 droplet reader)에 장착하여 각 프로브에 대한 카피수(copies/㎕) 값을 분석하고, 각 프로브에 대한 카피수(copies/㎕)값을 이용하여 각각의 대조군유전자(서열번호 5 또는 6)의 디지털 PCR 정량값에 대한 표적유전자(서열번호 1 내지 4)의 정상화한 값을 산출하였다. 그 결과를 도 2에 기재하였다.
실험 결과, 정상 체세포 시료(n=4)에 대한 산출비 값은 각각 1.1714, 1.0256, 1.0821, 및 1.0255로, 평균값은 1.08로 나타났으며, 다운증후군(T21) 체세포 시료(n=4)에 대한 산출비 값은 각각 2.1000, 1.4388, 1.3611, 및 1.1387로, 평균값은 1.51인 것으로 나타났다. 이로써, 다운증후군 시료의 산출비는 정상 시료 대비 약 1.5배의 값을 갖는 것을 알 수 있었다.
실시예 3. 정상 및 다운증후군 태아를 임신한 임부의 양수 시료에 대한 디지털 PCR 수행
정상 또는 다운증후군(T21) 태아를 임신한 임부의 양수 시료로부터 태아의 cfDNA를 수득하여, 이를 주형 샘플로 디지털 PCR을 수행하였다.
먼저, 독일 퀴아젠사 (QIAGEN)의 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (Qiagen Cat #55114)를 사용하여 세포로부터 gDNA를 추출하였다. gDNA 추출 과정은 제조사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 수행하였다. 구체적으로, 세포를 단백질 용해액(lysate buffer)로 용해하고, 단백질 성분을 제거하여 시료의 순도를 높이기 위하여, 50 ㎖ 원심분리 튜브에 100 ㎕의 프로테이나아제 K(proteinase K)를 첨가하였다. 그리고, 프로테이나아제 K가 첨가된 50 ㎖ 원심분리 튜브에 1.0 ㎍ 캐리어 RNA(carrier RNA)가 포함된 ACL 버퍼를 첨가한 후, 볼텍싱(vortexing)을 실시하여 세포 용해액과 ACL 버퍼를 혼합하였다. 상기 혼합액을 60℃에서 30분 동안 반응시킨 후, 3.6 ㎖의 ACB 버퍼(lysate buffer)를 상기 원심분리 튜브에 첨가하고 볼텍싱(vortexing)을 실시하여 ACB 버퍼 혼합물을 수득하고 나서 얼음에 5분간 반응시켰다.
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit의 컬럼 상에 존재하는 멤브레인의 흡착성을 좋게 함으로써 추출되는 gDNA의 수율을 높이기 위하여 진공 펌프 시스템(vacuum pump system)을 사용하였다. 진공 펌프 시스템을 이용하여 QIAamp 미니 컬럼(QIAamp Mini column)과 20 ㎖ 튜브 익스텐더(tube extender)를 장착하여 ACB 버퍼 혼합물을 QIAamp 미니 컬럼에 흘려 보낼 수 있도록 하였다. 진공 펌프 시스템을 작동시키고 ACB 버퍼 혼합물을 흘려보낸 후, 진공 펌프 시스템의 수치가 0이 되도록 조정하고 튜브 익스텐더를 제거하였다. 이러한 과정을 통하여 QIAamp 미니 컬럼의 멤브레인에 최대한 많은 양의 반응 물질이 결합되도록 한다. 그리고 나서, QIAamp 미니 컬럼에 결합된 반응 물질을 첫번째로 세척할 완충 용액인 ACW1 버퍼 600 ㎕를 진공 펌프 시스템을 작동시켜 QIAamp 미니 컬럼으로 흘려보낸 후, 진공 펌프 시스템의 수치가 0이 되도록 조정하고 튜브 익스텐더를 제거하였다. 이러한 과정을 통하여 QIAamp 미니 컬럼 멤브레인에 결합하고 있는 DNA를 세척하게 된다. 또한, 순도 높은 DNA를 수득하기 위하여 2차의 세척 작업이 수행된다. 두번째 세척 용액인 ACW2 버퍼 750 ㎕를 진공 펌프 시스템을 작동시켜 QIAamp 미니 컬럼으로 흘려보낸 후, 진공 펌프 시스템의 수치가 0이 되도록 조정하고 튜브 익스텐더를 제거하였다. 이러한 과정을 통하여 QIAamp 미니 컬럼 멤브레인에 결합하고 있는 DNA를 추가로 세척하게 되고, 순도 높은 DNA를 수득할 수 있다.
마지막 세척 용액인 에탄올 (96% 내지 100%) 750 ㎕를 진공 펌프 시스템을 작동시켜 QIAamp 미니 컬럼으로 흘려보낸 후, 진공 펌프 시스템의 수치가 0이 되도록 조정하고 튜브 익스텐더를 제거하였다. 그리고, 에탄올 성분을 최대한 말려 제거함으로써 추출된 DNA의 순도를 높인 후, QIAamp 미니 컬럼의 뚜껑을 닫고 20,000g 및 14,000 rpm 조건으로 3분 동안 원심분리를 하였다. QIAamp 미니 컬럼의 뚜껑을 열고 56℃에서 10분간 건조하였다. 그 후, QIAamp 미니 컬럼에 대해 AVE 버퍼 20 ㎕를 첨가하고 상온에서 3분 동안 반응시킨 후, QIAamp 미니 컬럼의 뚜껑을 닫고 20,000g 및 14,000 rpm 조건으로 1분 동안 원심분리를 하였다. 이로써, 정상 또는 다운증후군(T21) 체세포로부터 각각 대응하는 gDNA 샘플을 최종적으로 수득하였다.
시료로부터의 디지털 PCR은 실시예 2와 동일한 방법 및 조건으로 실시하였다. 그 결과를 도 3에 기재하였다.
실험 결과, 정상 태아를 임신한 임부의 양수 시료(n=4)에 대한 산출비 값은 각각 1.1991, 1.0574, 1.0006, 및 0.9560으로, 평균값은 1.05로 나타났으며, 다운증후군(T21) 태아를 임신한 임부의 양수 시료(n=4)에 대한 산출비 값은 각각 1.6584, 1.6954, 1.4886, 및 1.5062로, 평균값은 1.59인 것으로 나타났다. 이로써, 다운증후군 시료의 산출비는 정상 시료 대비 약 1.5배의 값을 갖으며, 이는 정상 또는 다운증후군 세포를 시료로 한 실험의 결과값과 비슷한 수치를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.
실시예 4. SPRIselsect 마그네틱 비드 비율에 따른 DNA의 파쇄입도별 구분 확인
태아 유래 DNA는 모체 유래 DNA보다 크기가 작으므로, 짧은 길이(bp)를 나타내는 태아 cfDNA의 정보 반영률을 높이기 위하여 cfDNA 추출 시 DNA 길이를 구분하여 추출하는 방법을 모색하였다. 서로 다른 크기의 DNA 제작을 위해 Thermo Fisher Scientific사의 Ion ShearTM Plus Reagents Kit (Cat #4471252)의 매뉴얼에 따라 gDNA를 2가지 조건(긴 길이, 짧은 길이; 5분, 15분)으로 파쇄하였다. gDNA의 파쇄입도별 구분은 독일 벡크만쿨터사 (Beckman Coulter)의 SPRIselsect Kit를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 이를 구체적으로 설명하면 하기와 같다.
먼저 gDNA가 포함된 시료와 마그네틱 비드(비드 A로 명명)를 혼합하여 긴 길이의 DNA(LD: long DNA)가 우선적으로 비드에 흡착하도록 하였다. 이 후, 자석을 이용하여 비드를 분리한 후, 비드에 흡착되지 않고 상등액에 남아있는 DNA를 새로운 튜브로 옮기고, 다시 한번 새로운 비드(비드 B로 명명)를 첨가하여 나머지 DNA(짧은 길이의 DNA, SD: short DNA)를 추출하였다. 각각의 튜브에서 비드 A와 비드 B로부터 흡착된 DNA를 추출하였다.
상기의 방법으로 LD와 SD가 1:1로 혼합된 DNA 시료를 대상으로 하여, DNA 시료 대비 비드 A의 첨가 양에 따라 LD가 얼마나 제거되는가를 분석하였다. 그 결과를 도 4에 기재하였다.
실험 결과, DNA 시료 대비 비드 A가 0.5배의 비율로 첨가되었을 경우에는 비드 A와 비드 B 모두 DNA의 크기 감별 효과가 없는 것으로 나타났다. 그러나 0.75배 비율인 경우에는 비드 A는 400bp 이상, 비드 B는 500bp 이하의 DNA를 흡착하고, 1.0배 비율인 경우에는 비드 A는 200bp 이상, 비드 B는 300bp 이하의 DNA를 흡착하며, 1.25배 비율인 경우에는 비드 A는 150bp 이상, 비드 B는 200bp 이하의 DNA를 흡착하여, 비드 A 첨가량이 증가할수록 제거되는 LD의 양 또한 증가하는 것을 알 수 있었다. 태아 cfDNA의 길이가 약 150bp 이하인 것을 고려할 때, 태아의 cfDNA를 농축하기 위한 가장 바람직한 범위의 DNA 시료 대비 비드 A의 첨가 비율은 0.75 내지 1.25이며, 더욱 바람직한 첨가 비율은 0.75 내지 1.0인 것으로 분석되었다.
실시예 5. 임부의 혈액 시료로부터 태아 유래 DNA와 모체 유래 DNA 비율 정량
임부의 혈액 내지 혈장 내의 태아 유래 DNA는 모체 유래 DNA보다 크기가 작은 것이 알려져 있다. 따라서, 특정 유전자와 관련하여 크기가 작은 태아 유래 DNA와 이보다 크기가 큰 모체 유래 DNA를 리얼타임 PCR로 증폭하면 특정 유전자와 관련하여 임부의 혈액 내지 혈장 내에 존재하는 태아 유래 DNA와 모체 유래 DNA를 정량할 수 있고, 이로부터 이들의 유전자 양의 비율을 구할 수 있다.
따라서, 본 실시예에서는 임부의 혈액 내지 혈장 샘플 내의 태아 유래 DNA와 모체 유래 DNA에 공통적으로 존재하는 특정 유전자로서 APP(Amyloid Precursor protein) 유전자 (GenBank accession No. NM_000484)와 β-액틴 유전자를 선정하였고, 상기 APP 유전자 및 β-액틴 유전자와 관련한 태아 유래 DNA와 모체 유래 DNA를 증폭할 수 있는 프라이머 쌍과, 증폭반응 결과물을 확인할 수 있는 형광표지가 된 프로브를 설계하였다(하기 표 5 참조).
표적
유전자		 앰플리콘 길이 정방향 프라이머 역방향 프라이머 형광 프로브
(5'→3') (5'→3') (5'-FAM, 3'-TAMRA)
APP 67 bp TCAGGTTGACGCCGCTGT
(서열번호 25)		 TTCGTAGCCGTTCTGCTGC
(서열번호 26)		 ACCCCAGAGGAGCGCCACCTG
(서열번호 28)
180 bp TCTATAAATGGACACCGATGGGTAGT
(서열번호 27)
β-액틴 83 bp TACAGGAAGTCCCTTGCCAT
(서열번호 29)		 CCTGTGTGGACTTGGGAGAG
(서열번호 30)		 CCCACTTCTCTCTAAGGAGAATGGCCC
(서열번호 32)
170 bp CACGAAGGCTCATCATTCAA
(서열번호 31)
67 bp AGAGCTACGAGCTGCCTGAC
(서열번호 33)		 CCATCTCTTGCTCGAAGTCC
(서열번호 34)		 TTCCGCTGCCCTGAGGCACT
(서열번호 36)
169 bp GGCAGGACTTAGCTTCCACA
(서열번호 35)
참고로, 상기 표 5에서는 리얼타임 PCR을 이용한 태아 유래 DNA와 모체 유래 DNA의 정량 비교를 통한 이들 유전자 양의 비율을 평가하기 위하여, 태아 유래 DNA의 크기가 모체 유래 DNA의 크기 보다 작은 점을 고려하여 프라이머 쌍을 설계하였다. 특히, 상기 표 5에 도시된 바와 같이, 모체 유래 유전자 양과 태아 유래 유전자 양을 정확히 평가하고 정량 평가시 분석 조건을 통일시키기 위하여, 태아 유래 DNA 및 모체 유래 DNA로부터의 짧은 앰플리콘과 모체 유래 DNA로부터의 긴 앰플리콘의 세트에 대한 검출 프로브와 정방향 프라이머는 공통으로 하고 역방향 프라이머만 다르도록 설계하였다. 그리고, 각 검출 프로브는 리얼 타임 PCR 증폭 반응결과물을 확인하고 이를 정량적으로 분석하기 위해 형광물질 및 소광물질로 이중 표지된다. 본 실시예에서는 각 검출 프로브의 5'말단에 형광물질인 FAM으로 표지하였고, 3'말단에는 소광물질인 TAMRA를 표지하였다.
상기 표 5에 도시된 바와 같이 APP 표적 유전자의 경우, 서열번호 25 및 26의 프라이머 쌍으로부터는 태아 유래 DNA 및 모체 유래 DNA로부터의 짧은 앰플리콘(길이 67bp)이 수득되고, 서열번호 25 및 27의 프라이머 쌍으로부터는 모체 유래 DNA로부터의 긴 앰플리콘(길이 180bp)이 수득된다.
본 실시예에서 실행한 짧은 길이의 DNA 농축법을 이용하여 정상 태아를 임신한 임산부의 cfDNA를 얻어내었고, LD에 대한 SD의 비율 측정을 위해 리얼 타임 PCR을 수행하였다. 본 실시예에서 리얼 타임 PCR은 7900HT Fast Real Time PCR System (Life Technologies, 미국)을 이용하여 수행하였다.
APP 유전자에 대한 각 프라이머 쌍 및 검출 프로브와, 전술한 바와 같이 준비된 DNA 주형과, 리얼타임 PCR 마스터 믹스(real-time PCR master mixture) 등의 리얼 타임 PCR 조성을 아래의 표 6와 같이 준비하고, 하기 표 7의 리얼 타임 PCR 증폭 조건 하에서 리얼 타임 PCR을 수행하였다. 한편, PCR 증폭 조성 중 PCR 증폭용 마스터 믹스는 예를 들어, PCR 버퍼, dNTP, DNA 폴리머라아제 등으로 이루어진 것으로서, 본 실시예에서는 리얼타임 PCR 마스터 믹스로 TaqMan　Universal Master Mix Ⅱ, no UNG (Life Technologies, Cat. 4440040)를 사용하였다. 리얼타임 PCR 증폭반응이 한번씩 반복될 때마다 FAM 파장에서 형광값을 측정하였으며, 반응 사이클에 대한 형광세기는 SDS 소프트웨어(SDS software)를 이용하여 분석하였다. 이중 APP 유전자에 대한 리얼타임 PCR 정량 결과를 각 샘플 별로 정리하고, 그 결과를 짧은 앰플리콘(길이 67bp)에 대한 결과와 긴 앰플리콘(길이 180bp)에 대한 결과로 나누어 도 5에 도시하였다.
No. PCR 증폭 조성 부피 (㎕)
1 DNA 주형을 갖는 샘플 1
2 프라이머 세트 (정방향 + 역방향)(10 ?M) 1
3 검출 프로브 (5 ?M) 0.5
4 증류수 2.5
5 TaqMan　Universal Master Mix II, no UNG 5
합계 10
No. 단계 온도 시간 사이클
1 사전변성 95℃ 10분
2 변성 95℃ 15초 50 사이클
3 어닐링 60℃ 60초
4 연장 72℃ 60초
실시예 6. 정상 및 다운증후군 gDNA 혼합 시료에 대한 디지털 PCR 수행
정상 gDNA와 다운증후군 gDNA를 다양한 비율로 혼합하여 혼합 gDNA를 제조하고, 이를 주형으로 표 2의 프라이머 및 프로브를 이용하여 디지털 PCR을 수행하고, 정상 대비 다운증후군 유전자 양의 비율값을 산출하였다. 그 결과를 도 6에 기재하였다.
실험결과, 다운증후군 gDNA의 혼합 비율이 낮을수록 정상 대비 다운증후군 유전자 양의 비율값이 1에 근접하여 나타나는 것으로 나타났다. 특히, 다운증후군 유전 정보의 반영율이 10% 미만으로 적을 경우에 비율값은 정상수치(1.1이내)와 가깝게 나타나는 것을 확인하였다. 통상적으로 임부의 혈액 내에 존재하는 cfDNA의 약 3 내지 13%만이 태아 유래의 cfDNA임을 고려할 때, 임부의 혈액에서 추출한 cfDNA를 그대로 이용하여 태아의 산전진단을 하는 것은 정확도가 매우 떨어지는 것임을 알 수 있었다.
실시예 7. 임부의 혈액으로부터 수득한 cfDNA의 파쇄입도별 구분 및 이에 대한 디지털 PCR 수행
정상 또는 다운증후군(T21) 태아를 임신한 임부의 혈장으로부터 다음과 같은 방법으로 cfDNA를 추출하였다.
먼저, Thermo Fisher Scientific사의 MagMAXTM Cell-Free DNA Isolation Kit (Cat #A29319)를 사용하여 혈장으로부터 cfDNA를 추출하였다. cfDNA 추출과정은 제조사의 매뉴얼에 따라 2 mL의 혈장을 대상으로 수행하였다.
추출된 cfDNA를 실시예 4의 방법으로 DNA를 파쇄입도별로 구분하고, 수득된 SD 구획의 시료를 주형으로 디지털 PCR을 수행하였다. 각 시료의 결과값으로부터 대조군유전자 대비 타겟유전자의 산출비를 구하였다. 그 결과를 도 7에 기재하였다.
실험 결과, 정상 시료(n=3에)의 산출비는 각각 1.04, 1.08, 및 0.98로 나타났으나, 다운증후군 시료(n=3)의 산출비는 각각 1.31, 및 1.15(2건 동일)인 것으로 나타났다. 이로써 상기의 DNA를 파쇄입도별로 구분하여 수득된 SD 구획으로 디지털 PCR을 수행하는 경우에, 대조군유전자 대비 타겟유전자의 산출비가 0.70 내지 1.14 이면 태아의 염색체 수 정상으로 판정할 수 있고, 더욱 바람직하게는 산출비가 0.95 내지 1.10 이면 태아의 염색체 수 정상으로 판정할 수 있으며, 산출비가 0.10 내지 0.69, 또는 1.15 내지 1.80 이면 태아의 염색체 수 이상으로 결정할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 산출비가 0.45 내지 0.69, 또는 1.15 내지 1.31 이면 태아의 염색체 수 이상으로 결정할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> BIOCORE <120> A method for prenatal diagnosis using digital PCR <130> DPB155593k01 <150> KR 15/0151313 <151> 2015-10-29 <160> 36 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 165 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ctgcagttct ttgtgaacac tctcatttgt tgtatctgta ggctgtctct ctcagtggta 60 aatgccttcg tgtgtttgta atgctgatgg ttacttgagg taaataagaa tgtaccactt 120 ggctcagtgt gcatgatgta agcttgtctt tgttgtatgt tggct 165 <210> 2 <211> 161 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tgactatcac atgtctttgg ttgtaaactg ctgtgatagt taccctaagt aatgggacag 60 gagatgaacc cacccattaa ataacacagc aattaagcag ccacttttag aaaaatttaa 120 atgtgtggct tcgagttggg tacttgcatg tacagcttac t 161 <210> 3 <211> 118 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cccaggctat gctagaaggt atgcttacaa ttggaaaagt gtaggcagat aacattaaat 60 ggcaatagca tgtgtaaact aactgcaaat gaggaaaagg acattctaaa gacaggat 118 <210> 4 <211> 110 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ggaccagagg tttattggag gtctaaatat ttatggagag caatgatggc taattttaga 60 aaccattagg ttgctatttt taaacgtgtg ctataaggat ttgctaattt 110 <210> 5 <211> 127 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gaggaagcaa ctagaaaaca atggaaggga cttcagatgg taaggtttct gtttagtact 60 tatttcaatt ttaggcctcc tgaatagtag aggtggtgac aggaggatac ctgaaacctt 120 ggttata 127 <210> 6 <211> 112 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gggaacatcc caggttcagt aaaaatacag agtatttgcg ttaaactgga cctcagtggg 60 gatgtgatgg gaggtatgag acagattgtg cccttatcct tttctcttct tg 112 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 cgtgtgtttg taatgctgat ggt 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 catcatgcac actgagccaa gt 22 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 9 acttgaggta aataagaatg tac 23 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 ccctaagtaa tgggacagga gatg 24 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 aagtggctgc ttaattgctg tgt 23 <210> 12 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 12 acccacccat taaat 15 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 tgctagaagg tatgcttaca attgga 26 <210> 14 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 tcatttgcag ttagtttaca catgct 26 <210> 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 15 aagtgtaggc agataac 17 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 gaccagaggt ttattggagg tctaaat 27 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 cacgtttaaa aatagcaacc taatgg 26 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 18 tttatggaga gcaatgat 18 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 caactagaaa acaatggaag ggactt 26 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 tcaggaggcc taaaattgaa ataag 25 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 21 agatggtaag gtttctgttt ag 22 <210> 22 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 catcccaggt tcagtaaaaa tacaga 26 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 ctgtctcata cctcccatca catc 24 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 24 tatttgcgtt aaactggacc 20 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 tcaggttgac gccgctgt 18 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 ttcgtagccg ttctgctgc 19 <210> 27 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 tctataaatg gacaccgatg ggtagt 26 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 28 accccagagg agcgccacct g 21 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 tacaggaagt cccttgccat 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 cctgtgtgga cttgggagag 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 cacgaaggct catcattcaa 20 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 32 cccacttctc tctaaggaga atggccc 27 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 agagctacga gctgcctgac 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 ccatctcttg ctcgaagtcc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 ggcaggactt agcttccaca 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 36 ttccgctgcc ctgaggcact 20

Claims (20)

  1. (a) 임부의 혈액으로부터 DNA를 수득하는 시료부;
    (b) 상기 DNA를 크기별로 분류하여 1,000 bp 이하의 DNA를 수득하는 분리부;
    (c) 상기 (b) 단계의 DNA로 PCR을 수행하되, 염색체 수 이상과 관련이 없는 염색체 상에 위치한 대조군유전자와 염색체 수 이상과 관련된 염색체 상에 위치한 표적유전자에 대해 PCR을 수행하는 증폭부;
    (d) 상기 대조군유전자의 PCR 정량값에 대한 상기 표적유전자의 PCR 정량값의 비율을 산출하는 비교부; 및
    (e) 상기 (d) 단계에서 산출된 비율이 0.70 내지 1.14 이면 태아의 염색체 수 정상으로 결정하는 판별부를 포함하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 산출된 비율이 0.95 내지 1.10 이면 태아의 염색체 수 정상으로 결정하는 판별부를 포함하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 DNA를 크기별로 분류하는 방법은
    (가) DNA에 마그네틱 비드를 일차 혼합(비드 A)하고 결합되지 않은 DNA를 수득하는 비드 A 혼합부; 및,
    (나) 상기 수득된 DNA에 마그네틱 비드를 이차 혼합(비드 B)하고 비드에 결합된 DNA를 수득하는 비드 B 혼합부를 포함하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 비드 A와 비드 B의 첨가 비율은 0.75 내지 1.25 : 1인, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  5. (a) 임부의 혈액으로부터 DNA를 수득하는 시료부;
    (b) 상기 DNA를 크기별로 분류하여 1,000 bp 이하의 DNA를 수득하는 분리부;
    (c) 상기 (b) 단계의 DNA로 PCR을 수행하되, 염색체 수 이상과 관련이 없는 염색체 상에 위치한 대조군유전자와 염색체 수 이상과 관련된 염색체 상에 위치한 표적유전자에 대해 PCR을 수행하는 증폭부;
    (d) 상기 대조군유전자의 PCR 정량값에 대한 상기 표적유전자의 PCR 정량값의 비율을 산출하는 비교부; 및
    (e) 상기 (d) 단계에서 산출된 비율이 0.10 내지 0.69, 또는 1.15 내지 1.80 이면 태아의 염색체 수 이상으로 결정하는 판별부를 포함하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 산출된 비율이 0.45 내지 0.69, 또는 1.15 내지 1.31 이면 태아의 염색체 수 이상으로 결정하는 판별부를 포함하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 산출된 비율이 0.10 내지 0.69 이면, 태아의 염색체성을 1염색체성으로 결정하는 판별부를 포함하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 1염색체성은 터너증후군인, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  9. 제 5항에 있어서,
    상기 (d) 단계에서 산출된 비율이 1.15 내지 1.80 이면, 태아의 염색체성을 3염색체성으로 결정하는 판별부를 포함하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 3염색체성은 다운증후군, 에드워드증후군 또는 파타우증후군인, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  11. 제 5 항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 DNA를 크기별로 분류하는 방법은
    (가) DNA에 마그네틱 비드를 일차 혼합(비드 A)하고 결합되지 않은 DNA를 수득하는 비드 A 혼합부; 및,
    (나) 상기 수득된 DNA에 마그네틱 비드를 이차 혼합(비드 B)하고 비드에 결합된 DNA를 수득하는 비드 B 혼합부를 포함하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 비드 A와 비드 B의 첨가 비율은 0.75 내지 1.25 : 1인, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 표적유전자는 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 갖는 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 표적유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서는 서열번호 7 및 8의 프라이머 쌍이 사용되고, 상기 서열번호 1의 염기서열을 갖는 표적유전자 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브로는 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드가 사용되는 것을 특징으로 하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 서열번호 2의 염기서열을 갖는 표적유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서는 서열번호 10 및 11의 프라이머 쌍이 사용되고, 상기 서열번호 2의 염기서열을 갖는 표적유전자 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브로는 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드가 사용되는 것을 특징으로 하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  16. 제 13항에 있어서,
    상기 서열번호 3의 염기서열을 갖는 표적유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서는 서열번호 13 및 14의 프라이머 쌍이 사용되고, 상기 서열번호 3의 염기서열을 갖는 표적유전자 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브로는 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드가 사용되는 것을 특징으로 하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  17. 제 13항에 있어서,
    상기 서열번호 4의 염기서열을 갖는 표적유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서는 서열번호 16 및 17의 프라이머 쌍이 사용되고, 상기 서열번호 4의 염기서열을 갖는 표적유전자 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브로는 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드가 사용되는 것을 특징으로 하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  18. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대조군유전자는 서열번호 5와 6의 염기서열을 갖는 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 서열번호 5의 염기서열을 갖는 대조군유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서는 서열번호 19 및 20의 프라이머 쌍이 사용되고, 상기 서열번호 5의 염기서열을 갖는 대조군유전자 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브로는 서열번호 21의 올리고뉴클레오티드가 사용되는 것을 특징으로 하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
  20. 제 18항에 있어서,
    상기 서열번호 6의 염기서열을 갖는 대조군유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서는 서열번호 22 및 23의 프라이머 쌍이 사용되고, 상기 서열번호 6의 염기서열을 갖는 대조군유전자 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브로는 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드가 사용되는 것을 특징으로 하는, 태아의 염색체 이수성 진단 장치.
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