KR102332540B1

KR102332540B1 - 다운증후군 특이적인 후성학적 마커를 이용한 다운증후군 진단 방법

Info

Publication number: KR102332540B1
Application number: KR1020200081685A
Authority: KR
Inventors: 류현미; 임지혜
Original assignee: 의료법인 성광의료재단
Priority date: 2020-07-02
Filing date: 2020-07-02
Publication date: 2021-11-29
Also published as: US20230265512A1; WO2022005010A1; EP4177355A1; JP2023533247A

Abstract

태아로부터 분리된 생물학적 시료로부터 다운증후군 바이오마커의 메틸화 수준을 측정하는 단계로서, 상기 바이오마커는 21번 염색체에 존재하는 제1 바이오마커, 21번 염색체 외의 염색체에 존재하는 제2 바이오마커, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 단계; 상기 측정된 바이오마커의 메틸화 수준을 정상 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료의 상기 제1 및 제2 바이오마커의 메틸화 수준과 비교하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 비교하여 상기 태아의 다운증후군의 존재 또는 발병 위험을 결정하는 단계를 포함하는 다운증후군 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로써, 다운증후군을 높은 정확도로 조기 진단이 가능하므로, 다운증후군 진단 분야의 핵심 기술로 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

다운증후군 특이적인 후성학적 마커를 이용한 다운증후군 진단 방법 {Down syndrome diagnosis method using epigenetic marker specific for Down syndrome}

다운증후군 질환 특이적 후성학적 마커 및 이를 이용한 다운증후군 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 발명이다.

염색체의 구조 이상에 따른 돌연변이는 비정상적인 발달 및 배아의 사망을 초래한다. 그러나 가장 일반적인 염색체 이상으로 인해 나타나는 질병의 한 종류인 다운증후군(DS, down syndrome)의 경우 배아가 생존한다. 세계 보건기구(WHO)에 따르면 발달 장애의 가장 흔한 유전적 원인인 다운증후군의 발병률은 대략적으로 전 세계 1,100 명 중 1 ~ 100 명 사이다. 다운증후군은 정신 지체, 얼굴 구조상 특징, 열악한 근육 발달 및 짧은 키를 포함하는 80 가지 이상의 임상 특징을 나타내며 선천성 심장 질환, 당뇨병, 백혈병 및 기타 질병의 위험 증가와 관련이 있다.

종래에는 다운증후군을 진단하는 기술로서, 임신부 혈장에 존재하는 비세포성 DNA 조각인 cfDNA의 양적 차이를 분석하는 방법(NGS based NIPT)이 있고, 이 방법은 다운증후군에 대한 높은 검출 정확성을 나타내어 빠르게 임상에 적용되고 있으나, 고가의 기기와 검사 소모품이 요구되고, 분석 방법 또한 복잡하여 일반 검사실에서 적용하기 어렵고, 고가의 검사비용으로 인해 모든 임산부에 적용하기 어렵다는 한계점이 있다. 또한, SNP를 이용하는 방법 (PCR based NIPT)이 있으나, 이는 검사 정확성에 대한 명확한 근거가 없고, 각 기관에서 제시하는 특수 알고리즘을 사용해야 하므로 범용적 사용에 한계가 있다. 즉, 상기 언급한 염색체 이상 질병에 대하여 유전자 분석을 통해 미리 질병의 여부를 알아낼 수 있는 분석방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으나(한국 공개특허 10-2019-0003987), 아직은 미비한 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 기존 고가의 검사 기기 또는 특수 알고리즘을 활용할 필요 없이, 유전체의 메틸화 수준의 간단한 측정을 통해 다운증후군을 효과적으로 검사할 수 있는 본 발명을 완성하였다.

일 양상은 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 다운증후군 바이오마커의 메틸화 수준을 측정하는 단계로서, 상기 바이오마커는 21번 염색체에 존재하는 제1 바이오마커, 21번 염색체 외의 염색체에 존재하는 제2 바이오마커, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 단계; 상기 측정된 바이오마커의 메틸화 수준을 정상 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료의 상기 제1 및 제2 바이오마커의 메틸화 수준과 비교하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 비교하여 상기 개체의 다운증후군 존재 또는 발병 위험을 결정하는 단계를 포함하는 다운증후군 진단을 위한 정보를 제공하는 방법이다.

본 명세서 내 용어, “다운증후군”은 선천성 유전질환의 일종으로, 21번 염색체의 부분 혹은 전체가 정상보다 1개 더 많이 존재하여 나타나는 질병을 의미한다. 다운증후군은 신체적 발달의 지연을 일으키며 안면 기형과 지적 장애를 동반할 수 있다. 다운증후군을 가진 부모의 염색체는 대부분 정상이지만 임신 시 생식세포의 비분리 현상으로 인한 21번 염색체가 1개 더 존재할 수 있다. 발병 빈도는 20세 산모에게서 0.1%를 보이지만 45세 산모의 경우 4%로 급격히 증가하며, 산모의 연령에 따라 발병 빈도가 증가하는 양상을 보인다. 다운증후군은 산모가 임신 도중에 태아 산전 진단을 통하여 확인할 수 있으며 출산 후 직접적인 유전자 검사를 통해 판별 받을 수 있다.

본 명세서 내 용어, “진단”은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 다운증후군 질환의 발병 여부 또는 발병 가능성 여부를 확인하는 것을 포함하는 의미일 수 있다.

본 명세서 내 용어 "메틸화(methylation)"는 DNA의 사이토신(cytosine) 잔기의 5번째 탄소에 메틸기가 첨가되는 것을 의미할 수 있으며, DNA를 구성하는 염기에 메틸기가 부착되는 것을 의미할 수 있다. 바람직하게, 메틸화 여부는 특정 유전자의 특정 CpG 부위의 사이토신 잔기의 다섯 번째 탄소에서 일어나는 메틸화 여부를 의미한다. 메틸화가 일어난 경우 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 억제되며, 반대로, 비메틸화 또는 저메틸화가 일어나는 경우 특정 유전자의 발현이 증가하게 된다. 포유동물 세포의 게놈 DNA 에는 A, C, G 및 T에 더하여, 사이토신 링의 다섯 번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸사이토신(5-methylcytosine, 5-mC)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-메틸사이토신의 메틸화는 CpG라고 불리는 CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에서만 일어나고, CpG의 메틸화는 alu 또는 트랜스포존과 게놈의 반복 서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문에, CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후성 유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다.

본 명세서 내 용어, “메틸화 수준 측정”은 다운증후군을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 다운증후군 관련 유전자 바이오 마커의 메틸화 수준의 정도를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 상기 메틸화 수준 측정은 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것으로서, 당업계의　메틸화　수준을 측정하는 공지의 방법을 제한 없이 사용가능 하나, 메틸화 특이적인 PCR, 예를 들어 메틸화 특이적 PCR(methylation-specific polymerase chain reaction, MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 메틸화 특이적인 PNA를 이용하는 PCR, 또는 melting curve analysis 등을 통해 측정할 수 있다. 또는, DNA 칩, 파이로시퀀싱, 바이설파이트 시퀀싱, 및 메틸화 차세대 염기서열 시퀀싱(Methyl-Capture Sequencing, MC-Seq)과 같은 자동염기분석 등의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서 내 용어 “DMC”(차별적으로 메틸화된 CpG 위치, Differentially methylated CpG sites)란 발생 단계, 조직의 종류, 질환의 유무에 따라 상이한 DNA 메틸화 상태를 나타내는 CpG 위치를 의미할 수 있다. 상기 DMC가 반복적으로 존재하는 유전체 내 영역을 “DMR”(차별적으로 메틸화된 CpG 영역, Differentially methylated regions)이라 할 수 있다. 대부분의 DNA 메틸화는 CpG 위치에서 이루어지며, C는 사이토신을, G는 구아닌을 나타내며 p는 사이토신과 구아닌과의 사이에 있는 포스포다이에스테르 결합을 의미할 수 있다. 정상인의 체세포에서, 상기 하우스키핑 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬은 비메틸화되어 있으며, 임프린티드(imprinted) 유전자 및 비활성화 상태의 X 염색체 상의 유전자와 같이 발달과정 동안 발현되지 않는 유전자들은 메틸화되어 있다.

상기 메틸화 수준을 측정하는 제제는 유전자의 메틸화 존재 여부를 확인하기 위한 제제로서, 메틸화된 유전자의 양을 측정하기 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화-특이적 제한효소 (MSRE: Methylation-specific restriction enzyme), 상기 유전자의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 비메틸화된 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트 (bisulfite)일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트이다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화된 사이토신 잔기를 변형시켜 프로모터의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 상기 메틸화-특이적 제한효소는 그의 제한 부위의 메틸화 상태에 따라 핵산을 선택적으로 절단하는 효소를 의미하는 것이다. 제한 부위가 메틸화되지 않거나 또는 반메틸화된 경우에 특이적으로 절단하는 제한 효소의 경우, 제한 부위가 메틸화되면 절단은 일어나지 않거나 또는 상당히 감소된 효율 하에 일어날 것이다. 제한 부위가 메틸화된 경우 특이적으로 절단하는 제한 효소의 경우, 제한 부위가 메틸화되지 않으면 절단은 일어나지 않거나 또는 상당히 감소된 효율 하에 일어날 것이다.

상기 제1 바이오마커는 하기 표 1로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상일 수 있다.

No.	유전자	염색체 내 영역
1	CHODL	chr21-19617176-19617247
2		chr21-19617336-19617406
3		chr21-19617673-19617752
4	NCAM2	chr21-22370043-22370078
5	CYYR1	chr21-27944498-27944673
6	GRIK1	chr21-31311263-31311314
7	GRIK1	chr21-31311387-31311511
8	OLIG2	chr21-34391993-34392227
9		chr21-34392448-34392476
10		chr21-34392696-34392868
11		chr21-34395135-34395176
12		chr21-34395490-34395566
13		chr21-34395876-34395965
14		chr21-34396297-34396346
15		chr21-34396460-34396728
16		chr21-34397003-34397119
17		chr21-34399292-34399362
18		chr21-34399427-34399529
19		chr21-34399681-34399714
20		chr21-34399848-34399903
21		chr21-34400145-34400212
22		chr21-34400714-34400988
23		chr21-34401366-34401379
24		chr21-34401534-34401769
25	CLIC6	chr21-36042254-36042285
26	CLIC6	chr21-36042533-36042735
27	SIM2	chr21-38067964-38068044
28		chr21-38068418-38068806
29		chr21-38069018-38069190
30		chr21-38069475-38070680
31		chr21-38072494-38072506
32		chr21-38073032-38073075
33		chr21-38073463-38073528
34		chr21-38073992-38074050
35		chr21-38074152-38074184
36		chr21-38074992-38075172
37		chr21-38076769-38077111
38		chr21-38077206-38077398
39		chr21-38078262-38078458
40		chr21-38079128-38079359
41		chr21-38079924-38079962
42		chr21-38079988-38080178
43		chr21-38081200-38081254
44		chr21-38081394-38081455
45		chr21-38083112-38083128
46	HLCS	chr21-38352985-38353060
47	HLCS	chr21-38353193-38353257
48	MX2	chr21-42741677-42741853
49	MX1	chr21-42798695-42798848
50	TMPRSS2	chr21-42878480-42878569
51	SLC37A1,PDE9A	chr21-44011221-44011266
52	CBS	chr21-44473401-44473497
53	CRYAA	chr21-44588388-44588457
54	C21orf2,TRPM2	chr21-45769923-45770010
55	TSPEAR	chr21-46126022-46126188
56		chr21-46126891-46127100
57		chr21-46128800-46128978
58		chr21-46129159-46129689
59	LINC00162,SSR4P1	chr21-46439211-46439237
60	SLC19A1,LOC100129027	chr21-47062136-47062158
61	MCM3AP	chr21-47704178-47704210
62	YBEY	chr21-47717843-47717867
63	YBEY	chr21-47717931-47718023
64	PRMT2,NONE	chr21-48087183-48087258
65	ITSN1	chr21-35246628-35246690

본 명세서 내 용어 “CHODL” 유전자는 콘드로렉틴 (Chondrolectin) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 정확한 기능은 알려진 바 없고, 마우스에서 빠른 운동 뉴런의 마커인 것으로 밝혀진 바 있다.본 명세서 내 용어 “NCAM2” 유전자는 신경 세포 부착 분자 2 (Neural Cell Adhesion Molecule 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 프라이온 병과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “CYYR1” 유전자는 시토신 및 티로신-풍부 단백질 1 (CYYR1: Cysteine and tyrosine-rich protein 1)을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 기능은 구체적으로 알려진 바 없다.

본 명세서 내 용어 “GRIK1” 유전자는 글루타메이트 수용체, 이온성, 카이닌산 1 (GRIK1: Glutamate receptor, ionotropic, kainate 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 리간드-게이트 이온 채널로서 기능하는 많은 이온성 클루타메이트 수용체 (GluR) 서브유닛 중 하나를 코딩한다.

본 명세서 내 용어 “OLIG2” 유전자는 올리고덴드로사이트 전사 인자 (Oligodendrocyte transcription factor) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자의 발현은 주로 중추 신경계에 제한되고, 발달의 다른 단계에서 항-신경원 및 신경원성 인자 모두로 작용하고, 상기 유전자는 주로 뇌 종양과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “CLIC6” 유전자는 클로라이드 세포 내 채널 단백질 6 (Chloride intracellular channel protein 6)을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 도파민 수용체 D3와 상호작용하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “SIM2” 유전자는 일-편 동족체 2 (Single-minded homolog 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 얼굴과 머리의 구성뿐만 아니라 중추 신경계 정중선의 발달에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “HLCS” 유전자는 완전카르복시라아제 합성효소 (Holocarboxylase synthetase) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 달걀 노른자, 우유와 같은 식품에서 발견되는 비타민 B (비오틴)을 효과적으로 사용하는데 중요한 역할을 하고, 단백질, 지방 및 탄수화물의 생산 및 분해를 포함한 많은 중요한 세포 기능에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “MX2” 유전자는 인터페론-유도 GTP-결합 단백질 Mx2 (Interferon-induced GTP-binding protein Mx2)를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 인터페론-알파에 의해 상향-조절되나, 유사한 믹소바이러스 내성 단백질 1의 항바이러스 활성을 포함하지 않는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “MX1” 유전자는 인터페론-유도 GTP-결합 단백질 Mx1 (Interferon-induced GTP-binding protein Mx1)을 코딩하는 유전자를 의미한다. 마우스에서 인터페론-유도성 Mx 단백질은 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 특정 항바이러스 상태와 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “TMPRSS2” 유전자는 막관통 프로테아제, 세린 2 (Transmembrane protease, serine 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 세린 프로테아제는 많은 생리적 및 병리학적 과정에 관여하는 것으로 알려져 있고, 상기 유전자는 전립선 암 세포에서 안드로겐 호르몬에 의해 상향-조절되고, 안드로겐 비의존성 전립선 암 조직에서는 하향-조절되는 것으로 알려져 있다. 다만, 상기 유전자의 구체적인 생물학적 기능은 알려진 바 없다.

본 명세서 내 용어 “SLC37A1” 유전자는 글루코스-6-포스페이트 교환체 SLC37A1 (Glucose-6-phosphate exchanger SLC37A1) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 SLC37A4 단백질과 달리 혈당 항상성에는 관여하지 않는 것으로 보이나, 젖소의 우유에서 인산염 수준을 조절하고, 생산되는 우유의 양에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “PDE9A” 유전자는 고 친화성 cGMP-특이적 3',5'-고리형 포스포디에스테라제 9A (High affinity cGMP-specific 3',5'-cyclic phosphodiesterase 9A) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 cAMP 및 cGMP의 세포 내 농도를 조절함으로써 신호 전달에 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “CBS” 유전자는 시스타티오닌 베타-합성효소 (Cystathionine Beta-Synthase)를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자의 결함은 시스타티오닌 베타-합성효소 결핍증 (CBSD: cystathionine beta-synthase deficiency)을 유발하여, 호모시스틴요증 (homocystinuria)을 유발하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “CRYAA” 유전자는 알파-크리스탈린 A 사슬 (Alpha-crystallin A chain) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자의 결함은 상염색체 우성 선천성 백내장(autosomal dominant congenital cataract)을 유발하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “C21orf2” 유전자는 섬모 및 편모 연관 단백질 410 (CFAP410: Cilia And Flagella Associated Protein 410)을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 망막 영양실조 (Retinal Dystrophy) 및 척추골간단 이형성증 (Spondylometaphyseal Dysplasia)과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “TRPM2” 유전자는 일시적 수용체 전위 양이온성 채널, 서브패밀리 M, 멤버 2 (Transient receptor potential cation channel, subfamily M, member 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자의 생리학적 기능은 정확히 알려진 바 없으나, 인슐린 분비에 관여하는 것으로 보고된 바 있다.

본 명세서 내 용어 “TSPEAR” 유전자는 트롬보스폰딘 타입 라미닌 G 도메인 및 EAR 반복 (Thrombospondin Type Laminin G Domain And EAR Repeats) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 난청 (Deafness) 및 외배엽 이형성증 (Ectodermal Dysplasia)과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “LINC00162” 유전자는 P38 저해된 피부편평세포암종 연관 LincRNA (PICSAR: P38 Inhibited Cutaneous Squamous Cell Carcinoma Associated LincRNA) 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 기면증 (Narcolepsy) 및 배아 고환 암종 (Embryonal Testis Carcinoma)과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “SSR4P1” 유전자는 신호 서열 수용체 서브유닛 4 위유전자 1 (Signal Sequence Receptor Subunit 4 Pseudogene 1)를 의미한다. 상기 유전자의 기능에 대하여 정확히 알려진 바 없다.

본 명세서 내 용어 “SLC19A1” 유전자는 엽산 운반체 1 (Folate transporter 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 세포 내 엽산의 농도를 유지하는데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “LOC100129027” 유전자는 PCBP3 안티센스 RNA 1 (PCBP3-AS1: PCBP3 Antisense RNA 1) 유전자를 의미한다. 상기 유전자의 구체적인 생물학적 기능은 알려진 바 없다.

본 명세서 내 용어 “MCM3AP” 유전자는 80 kDa MCM3-연관 단백질 (80 kDa MCM3-associated protein)을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 MCM3 결합 단백질로서, 이는 인산화-의존적인 DNA-프리메이즈 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “YBEY” 유전자는 YbeY 메탈로엔도리보뉴클레아제 (YbeY Metalloendoribonuclease)를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 장간막 림프절염 (Mesenteric Lymphadenitis)과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “PRMT2” 유전자는 단백질 아르기긴 N-메틸트랜스퍼라제 2 (Protein arginine N-methyltransferase 2)를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 에스트로겐 수용체 알파와 상호작용하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “ITSN1” 유전자는 인터섹틴-1 (Intersectin-1) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 종두증 (Vaccinia) 및 조현병 (Schizophrenia 1)과 연관된 것으로 알려져 있다.

상기 제2 바이오마커는 하기 표 2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나일 수 있다.

No.	유전자	염색체 내 위치
1	MXRA8	chr1-1290330-1290333
2	MIB2	chr1-1564776-1564789
3	KIF26B	chr1-245851435-245851817
4	SP5	chr2-171573145-171573165
5	ZIC4	chr3-147113849-147113905
6	ENPEP, PITX2	chr4-111532737-111532757
7	SH3BP2	chr4-2800726-2800764
8	SEPP1, FLJ32255	chr5-42950062-42950139
9	SHROOM1	chr5-132158665-132158747
10		chr5-132158828-132158918
11		chr5-132158969-132158984
12	LINC00574, LOC154449	chr6-170338448-170338716
13	PRRT4	chr7-127991715-127991726
14	TMEM176B	chr7-150497697-150497702
15	MNX1	chr7-156796810-156796818
16	LOC101928483, EGFL7	chr9-139482774-139512407
17	NACC2, C9orf69	chr9-139001913-139001932
18	TLX1	chr10-102893888-102894961
19	FGF8	chr10-103535480-103535483
20	TACC2	chr10-123923354-123923385
21	CPXM2	chr10-125651146-125651165
22	NKX6-2	chr10-134598133-134598308
23	TLX1NB	chr10-102881237-102881254
24	IQSEC3	chr12-187057-187075
25	PCDH8	chr13-53422171-53422174
26	F7	chr13-113764089-113764501
27	SOX9	chr17-70117397-70117415
28	PNMAL2	chr19-46996868-46998096
29	THBD	chr20-23028442-23028524
30	MAPK8IP2	chr22-51042807-51042882
31	KLHDC7B	chr22-50986907-50987350
32	GPR143	chrX-9733732-9733845
33	IGHMBP2, MRGPRD	chr11-68709935-68710848

본 명세서 내 용어 “MXRA8” 유전자는 매트릭스 리모델링 관련 8 (Matrix remodeling associated 8) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질은 비근침윤성 방광암 진단용 바이오마커로 알려진 바 있다 (국내 공개특허공보 제10-2019-0089552호).본 명세서 내 용어 “MIB2” 유전자는 E3 유비퀴틴-단백질 리가아제 (MIB2: Mindbomb E3 ubiquitin-protein ligase 2)를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질 MIB2 는 액틴 단백질 (알파 1)과 상호작용하고, 흑색종 침윤을 억제하는 것으로 알려진 바 있다.

본 명세서 내 용어 “KIF26B” 유전자는 키네신 패밀리 멤버 26B (KIF26B: Kinesin Family Member 26B) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 미세소관을 따라 세포 소기관을 운반하는 세포 내 운동단백질로서, 신장 발달에 필수적이며 일부 유방암 및 대장암에서 상기 단백질의 증가된 수준이 관찰된 바 있다.

본 명세서 내 용어 “SP5” 유전자는 Sp5 전사 인자 (Sp5 Transcription Factor)를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 Wnt-매개 베타 카테닌 신호전달 및 표적 유전자 전사의 조절과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “ZIC4” 유전자는 Zic 패밀리 멤버 4 (ZIC4: Zic Family Member 4) 단백질, 구체적으로는 C2H2-타입 징크 핑거 단백질의 Zic 패밀리 멤버 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 X-연관내장이소장애 (X-linked visceral heterotaxy) 및 전전뇌증 타입 5 (holoprosencephaly type 5)와 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “ENPEP” 유전자는 글루타밀 아미노펩티다아제(Glutamyl Aminopeptidase)를 코딩하는 유전자를 의미한다. ENPEP는 융모암 (Choriocarcinoma) 및 임신융모질환 (Gestational Choriocarcinoma)과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “PITX2” 유전자는 페어드-라이크 호메오도메인 전사 인자 2 (Paired-like homeodomain transcription factor 2) 또는 뇌하수체 호메오박스 2 (pituitary homeobox 2)로도 알려진 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자의 돌연변이는 악센펠트-리이거 증후군 (Axenfeld-Rieger syndrome), 홍채앞방각발생장애 (iridogoniodysgenesis syndrome)와 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “SH3BP2” 유전자는 4번 염색체에 위치하는 유전자로부터 유래된 SH3 도메인 결합 단백질 2 (SH3BP2: SH3 domain-binding protein 2)를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 체루비즘 (cherubism)과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “SEPP1” 유전자는 셀레노단백질 P (Selenoprotein P)을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 셀레노단백질은 세포외 당단백질로서, 폴리펩티드당 9개의 Sec 잔기를 함유하는 점에서 흔하지 않고, 세포외 공간에서 항산화제로서 작용하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “FLJ32255” 유전자는 특성화되지 않은 (uncharacterized) LOC643977로서, IncRNA 클라스와 연관된 RNA 유전자이다.

본 명세서 내 용어 “SHROOM1” 유전자는 SHROOM1 family member 1, SHROOM1의 단백질을 코딩하는 유전자를 의미하며, 신경계와 다른 조직의 발달에 중요한 역할을 하며 세포 신장 동안 미세 소관 구조에 관여한다. 다운증후군의 증상 중 선천성 심장 결함 및 관절염에 관여한다.

본 명세서 내 용어 “LINC00574” 유전자는 긴 비암호화 RNA 574(Long Intergenic Non-Protein Coding RNA 574)로서, IncRNA 클라스와 연관된 RNA 유전자이다. LINC00574 유전자는 유방암과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “LOC154449” 유전자는 특성화되지 않은 (uncharacterized) LOC154449로서, IncRNA 클라스와 연관된 RNA 유전자이다.

본 명세서 내 용어 “PRRT4” 유전자는 프롤린 풍부 막관통 단백질 4 (PRRT4: Proline Rich Transmembrane Protein 4)를 코딩하는 유전자로서, 젤웨거 증후군 (Zellweger Syndrome)과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “TMEM176B” 유전자는 막관통 단백질 176B (TMEM176B: Transmembrane Protein 176B)를 코딩하는 유전자로서, 수지상 세포의 성숙 과정에 관여하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “MNX1” 유전자는 운동 뉴런 및 췌장 호메오박스 1 (MNX1: Motor neuron and pancreas homeobox 1) 단백질 또는 호메오박스 HB9 (HLXB9: Homeobox HB9)로도 알려진 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자의 돌연변이는 큐라리노 증후군 (Currarino syndrome)과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “LOC101928483” 유전자는 비번역 RNA (ncRNA: non-coding RNA)로서 NALT1 (NOTCH1 associated lncRNA in T cell acute lymphoblastic leukemia 1) 유전자로도 불린다.

본 명세서 내 용어 “EGFL7” 유전자는 EGF-유사 도메인-함유 단백질 7 (EGF-like domain-containing protein 7)을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자의 발현은 생리학적 조건에서 내피세포-특이적이나, 인간 암에서 종양 세포에 의해 비정상적으로 발현되는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “NACC2” 유전자는 NACC 패밀리 멤버 2 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 측벽 심근경색 (Lateral Myocardial Infarction) 및 간세포 심근염(Interstitial Myocarditis)과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “C9orf69” 유전자는 막관통 단백질 250 (Transmembrane 250)을 코딩하는 유전자를 의미하며, TMEM250로도 불리운다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 세포 주기에서 S기로의 진행을 촉진하여, 세포 증식에 중요한 역할을 할 수 있는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “TLX1” 유전자는 T 세포 백혈병 호메오박스 단백질 1 (TLX1: T-cell leukemia homeobox protein 1)을 코딩하는 유전자를 의미하며, HOX11로도 불리운다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 PPP1CC (Serine/threonine-protein phosphatase PP1-gamma catalytic subunit), PPP2CB (Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit beta isoform), 및 PPP2CA (Serine/threonine-protein phosphatase 2A catalytic subunit alpha isoform)와 상호작용하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “FGF8” 유전자는 섬유아세포 성장 인자 8 (FGF8: Fibroblast growth factor 8) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 유선 종양 세포의 안드로겐 및 앵커리지 독립적 성장을 지지하고, 이 유전자의 과발현은 종양 성장 및 혈관 형성을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “TACC2” 유전자는 변형된 산성 코일드-코일-함유 단백질 2 (TACC2: Transforming acidic coiled-coil-containing protein 2)을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 세포 주기에 걸쳐 중심체에 농축되는 단백질을 코딩하고, 상기 유전자는 종양 형성과 연관된 염색체 영역 내에 존재한다. 상기 유전자의 발현은 유방 종양의 진행에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “CPXM2” 유전자는 카복시펩티다아제 X, M14 패밀리 멤버 2 (CPXM2: Carboxypeptidase X, M14 family member 2) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다.

본 명세서 내 용어 “NKX6-2” 유전자는 NK6 호메오박스 2 (NKX6-2) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 강직성 운동실조증 (Spastic Ataxia), 및 상염색체 열성 질환 (Autosomal Recessive)과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “TLX1NB” 유전자는 TLX1 이웃 (TNX1 Neighbor) RNA 유전자로서, IncRNA 클라스에 속한다.

본 명세서 내 용어 “IQSEC3” 유전자는 IQ 모티프 및 Sec7 도메인 3으로 알려진 인간 유전자를 의미하며, KIAA1110으로도 불린다. 상기 유전자는 뇌에서, 특히 편도체 (amygdala)에서 높게 발현하여, 학습에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “PCDH8” 유전자는 프로토카데린-8 (PCDH8: Protocadherin-8) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 CNS-특이적인 방식으로 세포 부착에서 기능하는 것으로 여겨지는 내재성 막 단백질을 코딩한다.

본 명세서 내 용어 “F7” 유전자는 지혈에 필수적인 비타민 K-의존적인 인자인 응고인자 VII를 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 VII인자 결핍증 (Factor Vii Deficiency) 및 심근 경색과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “SOX9” 유전자는 전사인자 SOX-9 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자의 돌연변이는 골격 기형 증후군 (skeletal malformation syndrome) 및 굴지 이형성증 (campomelic dysplasia)과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “PNMAL2” 유전자는 PNMA 패밀리 멤버 8B (PNMA8B: PNMA Family Member 8B) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미하며, 상기 유전자의 중요한 이원체 (paralog)는 PNMA8A이다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 방종양성 항원-유사 단백질 8B (Paraneoplastic antigen-like protein 8B)를 의미한다.

본 명세서 내 용어 “THBD” 유전자는 트롬보모둘린 (Thrombomodulin) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 혈관의 내피세포에서 유래되는 단백질로서 다른 인자와 협동하여 혈관 내 혈전이 생기는 것을 방지하는 역할을 한다.

본 명세서 내 용어 “MAPK8IP2” 유전자는 C-jun-아미노-말단 키나아제-상호작용 단백질 2 (C-jun-amino-terminal kinase-interacting protein 2)를 코딩하는 유전자를 의미하며, IB2 (Islet-Brain-2)로도 불린다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 뇌에서 높게 발현되고, 펠란-맥더미드 증후군 (Phelan-McDermid syndrome)에서는 거의 항상 결실된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “KLHDC7B” 유전자는 켈치 도메인 함유 7B (Kelch Domain Containing 7B) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 클라미디아 폐렴 (Chlamydia Pneumonia)과 연관된 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “GPR143” 유전자는 G-단백질 공역 수용체 143 (G-protein coupled receptor 143) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자는 소안구증 (Microphthalmia)-연관 전사 인자에 의해 조절되는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “IGHMBP2” 유전자는 면역글로불린 헬리카제 μ-결합 단백질 2 (IGHMBP2: immunoglobulin helicase μ-binding protein 2), 또는 심장 전사 인자 1 (CATF1: cardiac transcription factor 1), 또는 DNA-결합 단백질 SMUBP-2로 알려진 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 유전자의 돌연변이는 말초 척추 근위축증 타입 1 (Distal spinal muscular atrophy type 1)을 유발하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서 내 용어 “MRGPRD” 유전자는 Mas-관련 G-단백질 결합 수용체 멤버 D (Mas-related G-protein coupled receptor member D) 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 대퇴부 암 (Femoral Cancer) 및 간 횡문근육종 (Liver Rhabdomyosarcoma)과 연관된 것으로 알려져 있다.

상기 태아의 제1 바이오마커의 메틸화 수준 또는 제2 바이오마커의 메틸화 수준을 정상 대조군의 메틸화 수준과 비교하여, 상기 태아의 다운증후군 존재 또는 발병 위험을 결정할 수 있다.

상기 제1 바이오마커 중 CHODL, NCAM2, CYYR1, GRIK1, OLIG2, CLIC6, SIM2, HLCS, MX2, MX1, TMPRSS2, SLC37A1, PDE9A, CBS, CRYAA, C21orf2, TRPM2, TSPEAR, LINC00162, SSR4P1, SLC19A1, LOC100129027, MCM3AP, YBEY, 및 PRMT2 유전자는 정상 태아를 임신한 모체의 혈액 또는 정상 태아의 태반에 비해 다운증후군 태아의 태반에서 과-메틸화된 것이고; ITSN1 유전자는 저-메틸화된 것일 수 있다.

상기 제2 바이오마커 중 MXRA8, MIB2, KIF26B, SP5, ZIC4, ENPEP, PITX2, SH3BP2, SEPP1, FLJ32255, SHROOM1, LINC00574, LOC154449, PRRT4, TMEM176B, MNX1, LOC101928483, EGFL7, NACC2, C9orf69, TLX1, FGF8, TACC2, CPXM2, NKX6-2, TLX1NB, IQSEC3, PCDH8, F7, SOX9, PNMAL2, THBD, MAPK8IP2, KLHDC7B, 및 GPR143 유전자는 정상 태아를 임신한 모체의 혈액 또는 정상 태아의 태반에 비해 다운증후군 태아의 태반에서 과-메틸화된 것이고; IGHMBP2, 및 MRGPRD 유전자는 저-메틸화된 것일 수 있다.

본 명세서 내 용어 “과-메틸화 (hyper-methylation)”는 메틸화 수준 측정 결과 대조군에 비하여 실험군의 메틸화 수준이 높게 나타나는 상태를 의미할 수 있다. 본 명세서 내 용어 “저-메틸화 (hypo-methylation)”는 메틸화 수준 측정 결과 대조군에 비하여 실험군의 메틸화 수준이 낮게 나타나는 상태를 의미할 수 있다.

상기 태아에서 측정된 제1 바이오마커의 메틸화 수준이 정상 태아를 임신한 모체의 혈액 또는 정상 태아 태반에서 측정된 메틸화 수준과 비교하여, 10 내지 30% 이상 저메틸화되거나 과메틸화된 경우, 상기 태아는 다운증후군의 존재 또는 발병 위험이 높은 것으로 결정할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 정상 태아 태반에서 측정된 제1 바이오마커의 메틸화 수준은 정상 모체 혈액에서 측정된 메틸화 수준과 비교하여, 10 내지 20% 이상 저메틸화되거나 과메틸화됨을 확인하여, 상기 제1 바이오마커는 조직(태반) 특이적인 마커임을 확인하였다. 또한, 일 구체예에 있어서, 다운증후군 태아 태반에서 측정된 제1 바이오마커의 메틸화 수준은 정상 태아 태반에서 측정된 메틸화 수준과 비교하여, 10 내지 20% 이상 저메틸화되거나 과메틸화됨을 확인하여, 상기 제1 바이오마커는 질환(다운증후군) 특이적인 마커임을 확인하였다.

상기 태아에서 측정된 제2 바이오마커의 메틸화 수준이 정상 태아를 임신한 모체의 혈액 또는 정상 태아 태반에서 측정된 메틸화 수준과 비교하여, 30 내지 50% 이상 저메틸화되거나 과메틸화된 경우, 상기 태아는 다운증후군의 존재 또는 발병 위험이 높은 것으로 결정할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 정상 태아 태반에서 측정된 제1 바이오마커의 메틸화 수준은 정상 모체 혈액에서 측정된 메틸화 수준과 비교하여, 10 내지 20% 이상 저메틸화되거나 과메틸화됨을 확인하여, 상기 제2 바이오마커는 조직(태반) 특이적인 마커임을 확인하였다. 또한, 일 구체예에 있어서, 다운증후군 태아 태반에서 측정된 제2 바이오마커의 메틸화 수준은 정상 태아 태반에서 측정된 메틸화 수준과 비교하여, 30 내지 50% 이상 저메틸화되거나 과메틸화됨을 확인하여, 상기 제1 바이오마커는 질환(다운증후군) 특이적인 마커임을 확인하였다.

본 명세서 내 용어 "생물학적 시료"는 태아의 체외로 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으며, 세포핵 내에 존재하지 않고 혈액 내에 유리된 DNA인 세포유리 DNA를 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 태반으로부터 유래된 것일 수 있다.

상기 용어 ”태반”은 태아와 모체 사이에서 태아의 성장과 생존에 필요한 물질교환을 매개하는 구조물로써, 태아를 밖에서 싸고 있는 장막의 일부가 모체의 자궁내막에 접착하여 형성된다. 상기 태반은 융모막을 포함할 수 있다. 상기 용어 “융모막”은 자궁 내에서 양수를 싸고 있는 막인 탈락막, 융모막, 양막 중 중간층에 해당한다. 융모막은 수정란에서 발생하여 난막의 일부를 구성하며 앞면에는 무수한 돌기인 융모막 융모가 밀생하여 자궁 내벽에 수정란을 침입시키는 역할을 한다. 예를 들어, 상기 생물학적 시료는 융모막 융모세포로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는 융모막 융모세포에서 유래된 모체 혈액 내 세포 유리 DNA를 의미할 수 있다.

일 양상에 따른 방법은 유전자 메틸화 수준의 간단한 측정을 통해 다운증후군을 효율적으로 진단할 수 있는 효과가 있다. 또한, 정상 대조군 (예를 들어, 정상 태아를 임신한 모체의 혈액 또는 정상 태아의 태반)에서 측정된 바이오마커의 메틸화 수준을 비교함으로써, 태아의 다운증후군 존재 또는 발병 위험을 진단할 수 있다.

도 1은 정상 모체 혈액 (NB), 정상 태아 태반 조직 (NT), 다운증후군 태아 태반 조직 (T21T)에 대한 염색체 21번의 메틸화 수준 분석을 통한 65종 바이오마커의 그룹 간 평균 메틸화 수준을 비교한 결과이다.
도 2는 정상 모체 혈액 (NB), 정상 태아 태반 조직 (NT), 다운증후군 태아 태반 조직 (T21T)에 대한 유전체의 메틸화 수준 분석을 통한 33종의 바이오마커의 그룹간 메틸화 수준을 비교한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 모체 혈액과 태반 조직에서의 DNA 분리

제일병원 임상 시험 심사위원회로부터 승인 하에 실시되었다(# CGH-IRB-2016-5). 2015 년 6 월부터 2017 년 5 월까지 제일병원 산부인과에서 산부인과 진료를 받은 단태 임신부를 대상으로 본 실험을 실시하였다. IRB의 승인을 받은 모든 환자로부터 서면 동의서가 작성되었다.

태반 조직은 융모막 융모 검사에 이용된 융모막 융모 세포로 임신 초기(임신 12 내지 13주)에 채취되었으며 분석될 때까지 액체 질소에 저장되었다. 각 태아의 임신 연령은 초음파 검사에 의해 결정되었다. 태아 융모막 융모 세포의 핵형을 결정하기 위해 GTG 밴딩 방법을 사용한 염색체 분석을 수행하였다. 모든 DS(down syndrome, 다운증후군)군의 태반 조직은 HSA21(47, XX, +21 또는 47, XY, +21)의 완전한 추가 사본(extra copy)이었으며, 모든 대조군(nomarl, N)군의 태반 조직은 정상 핵형(46, XX 또는 46, XY)을 나타냈다. 태아의 성별 비율은 실험군(다운증후군 태아군)과 대조군(정상 태아군)을 일치시켰다. 제조업자의 지시에 따라 QIAamp DNA 미니 키트(Qiagen, 카탈로그 번호 51304)를 사용하여 융모막 융모 세포로부터 각 샘플의 게놈 DNA를 추출하였다. 모체 혈액은 융모막 융모 검사 전 채혈 된 후 즉시 제조업자의 지시에 따라 QIAamp DNA 미니 키트(Qiagen, 카탈로그 번호 51304)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하고 분석될 때까지 초저온냉동고에 저장되었다.

하기 표 3에 나타난 바와 같이, 융모막 융모 세포의 채취에 있어서 모체 연령, 임신 연령, 반투명도 및 태아의 성별 비율과 관련하여 실험군과 대조군 간에 유의한 차이는 없었다(P> 0.05).

번호	핵형	재태기간(주)	태아성별	모체연령	목투명대(mm)
N1	46, XY	12+1	남	35	4.4
N2	46, XY	12+1	남	38	1.9
N3	46, XX	12+6	여	39	2.5
N4	46, XY	12+1	남	37	2.8
N5	46, XX	12+1	여	37	2.8
D1	47, XX, +21	12+4	여	35	3.9
D2	47, XY, +21	12+1	남	39	2.9
D3	47, XY, +21	12+3	남	39	4.6
D4	47, XX, +21	12+1	여	41	4.9
D5	47, XY, +21	13+1	남	33	9.1

실시예 2: MC-seq를 사용한 고효율 메틸롬 프로파일링(methylome profiling)

실시예 1에서 채취한 정상 모체 혈액, 정상 태아 태반 조직, 다운증후군 태아 태반 조직의 DNA 샘플을 기초로, MC-seq를 사용하여 다양한 CpG 부위에서 DNA 메틸화를 정량화하고 메틸롬 프로파일링을 실시하였다.

표준 DNA 메틸화 영역 포획 라이브러리는 3 μg 게놈 DNA를 갖는 페어드-엔드 시퀀싱 라이브러리(ver. B.3, 2015 년 6 월; Illumina)에 대한 SureSelect Methyl-Seq Target Enrichment 프로토콜 (Agilent)을 사용하여 생성되었다. SureSelect Human Methyl-Seq 프로브 세트 (Agilent, 카탈로그 번호 5190-4662)를 사용하였다. DNA의 정량 및 DNA 품질은 각각 PicoGreen 분석 키트 (Thermo Fisher Scientific, 카탈로그 번호 P7589) 및 Nanodrop 분광 광도계 (NanoDrop Technologies, 카탈로그 번호 ND-2000)로 측정하여 수행하였다. 3μg의 게놈은 초음파 분쇄장치 (AFA; Covaris, 카탈로그 번호 500219)을 사용하여 DNA 150-200 bp의 표적 크기로 단편화되었다. 간략하게, 8 개의 마이크로 튜브 스트립을 초음파기의 튜브 홀더에 로딩하고 다음 설정을 사용하여 DNA를 전단시켰다: 모드, 주파수 스위핑; 듀티 사이클, 10 %; 강도, 5; 버스트 당 사이클 수, 200; 지속 시간, 60 초 × 6 사이클; 온도, 4 ℃ ~ 7 ℃. 단편화 된 DNA가 수리되고, 'A'가 3'말단에 연결되고, SureSelect Methyl-Seq Methylated Adapter가 단편에 연결되었다. 결찰이 평가되면, 어댑터 결찰된 생성물을 PCR로 증폭시켰다.

이어서 메틸화 된 어댑터-결찰된 DNA와 같은 최종 정제된 생성물을 qPCR 정량화 프로토콜 가이드에 따라 정량화하고 TapeStation DNA 스크린 테이프 D1000 (Agilent, 카탈로그 번호 5067-5582)을 사용하여 검증하였다. DNA 메틸화 영역 캡처의 경우, 표준 SureSelect Methyl-Seq Target Enrichment 프로토콜 (Agilent)에 따라 350ng의 DNA 라이브러리를 하이브리드화 버퍼, 블로킹 믹스, RNase 블록 및 5μl의 SureSelect All DNA 메틸화 영역 캡처 라이브러리와 혼합했다. 캡처 베이트에 대한 혼성화는 PCR 기계를 사용하여 105 ℃에서 24 시간 동안 가열된 열 사이클러 리드 옵션을 사용하여 65 ℃에서 수행하였다. 표적 캡처된 DNA를 EZ DNA 메틸화-골드 키트(Zymo Research, 카탈로그 번호 D5005)를 사용하여 바이설파이트로 처리하고, 어댑터 첨가 단편을 풍부화하기 위한 8 개의 PCR 사이클 및 다중화 바코드를 추가하기 위한 6 개의 PCR 사이클을 수행하였다. 포획된 DNA를 증폭시켰다. 최종 정제된 생성물을 상기 언급된 qPCR 정량화 프로토콜 가이드를 사용하여 정량화하고 TapeStation DNA 스크린 테이프 D1000(Agilent, 카탈로그 번호 5067-582)을 사용하여 검증하였다. 시퀀싱은 HiSeq ™ 2500 플랫폼 (Illumina, 카탈로그 번호 SY-401-2501)을 사용하여 수행하였다.

실시예 3: 데이터 가공 및 메틸화 프로파일

실시예 2에서 메틸화된 최종 생성물에 대한 데이터 가공 및 메틸화 프로파일 분석을 실시하였다.

시퀀싱에서 생성된 페어드 엔드 데이터(paired end raw reads)의 품질을 FastQC 소프트웨어 (버전 0.11.5)를 사용하여 확인했다. 분석을 시작하기 전에 Trimmomatic (버전 0.32)을 사용하여 최종 데이터에서 기본 품질이 3 이하인 어댑터 시퀀스 및 염기를 제거했다. 또한 슬라이딩 윈도우 트림 방법을 사용하여 윈도우 크기 = 4, 평균 품질 = 15를 만족하지 않는 염기를 제거했다. 정리된 데이터를 생성하기 위해 최소 길이가 36 bp 인 데이터가 제거되었다. 세척된 판독물은 단방향 올리고 정렬 프로그램(SOAP)을 기반으로 하는 바이 설파이트 시퀀싱 MAPping 프로그램 (BSMAP; 버전 2.90 매개 변수 set-n 1 -r 0)을 사용하여 호모 사피엔스 게놈 (UCSC hg19)에 정렬되었으며, 이는 독특하게 데이터에 맵핑될 수 있었다. SAM 파일 형식의 매핑된 데이터는 SAMtools (버전 1.2)를 사용하여 정렬 및 인덱싱되었다. sambamba (버전 0.5.9)로 PCR 복제물을 제거했다. 메틸화 수준은 BSMAP 프로그램에서 methratio.py 특징으로 측정되었다. Agilent SureSelect 타겟 영역에 위치한 모든 단일 시토신의 10 CT 수보다 높은 메틸화 비율은 일반적인 메틸화가 완료된 것으로 볼 수 있다. 판독 쌍의 양 말단으로 덮인 영역의 경우, 메틸화를 호출하기 위해 단 하나의 판독만이 사용되었다. 결과 적용 범위 프로파일은 다음과 같이 요약되었다: # of C / 세 시퀀스 컨텍스트 각각에 대한 실질적인 CT 수 (CG, CHG 및 CHH).

메틸화 수준을 판독한 후, DMCs와 DMRs을 식별하기 위해 CpG의 각 염기에서의 메틸화 수준을 중간 스케일링 표준화로 표준화하였다. 5 개의 비교 쌍에 대해 두 그룹 간의 메틸화 차이의 유의성을 평가하기 위해 독립적인 T- 검정을 사용하였다. P 값은 Benjamini와 Hochberg FDR (False Discovery Rate) 방법을 사용 및 수정하여 여러 테스트에서 오탐지 결과를 제어했다. 주요 성분 분석은 이전 연구와 같이 질병 상태(정상 또는 DS)를 기반으로 하지만 태아의 성별에 근거하지 않은 샘플의 분리를 보여주었다. DMC는 |delta_mean|≥ 0.1, 독립적인 T- 검정 p- 값 <0.05 및 FDR <0.05와 관련된 각 영역을 필터링하여 결정되었다. DMR은 ≥ 3 DMC를 함유하는 임의의 길이의 연속 영역으로 정의되었다. 계층적 군집 분석은 또한 하나 이상의 비교 쌍을 만족하는 유의한 CpG에 대한 샘플의 메틸화 수준을 표시하기 위한 유사성의 척도로서 완전한 연결 및 유클리드 거리를 사용하여 수행되었다. 히트맵은 유사성 메트릭의 중심 절대 상관을 사용하여 중심 연결에 의해 자동으로 플로팅되었다. 차별적으로 메틸화된 결과의 모든 데이터 분석 및 시각화는 R 3.3.1 (www.r-project.org) 및 Statistical Package for Social Sciences 12.0 (SPSS Inc.)을 사용하여 수행되었다.

실시예 4: 다운증후군 태아의 태반에서 특이적인 후성학적 마커 발굴

실시예 1에서 수득된 정상 태아를 가진 모체의 혈액, 정상 태아의 태반, 다운증후군 태아의 태반 각각 5개의 샘플로부터, 실시예 2에 방법을 이용하여 유전체 메틸화 양상을 CpG site 수준에서 비교 분석하였다. 이 경우, 각 CpG site의 메틸화 수준 (%)은 0 내지 100으로 표현되며, 0은 비메틸화, 100은 완전한 메틸화를 의미한다. 비교 분석된 메틸화 수준의 차이에 따라 과메틸화되거나 저메틸화된 바이오마커를 발굴하였다.

4-1. 21번 염색체에서의 메틸화 수준 비교

다운증후군의 목적 염색체인 21번 염색체를 기준으로 동일한 형태의 후성학적 특성이 연속적으로 3개 이상 있는 부위로서 CHODL, NCAM2, CYYR1, GRIK1, OLIG2, CLIC6, SIM2, HLCS, MX2, MX1, TMPRSS2, SLC37A1, PDE9A, CBS, CRYAA, TRPM2, C21orf2, TSPEAR, LINC00162, SSR4P1, SLC19A1, LOC100129027, MCM3AP, YBEY, PRMT2, 및 ITSN1 유전자 영역을 선정하였다. 선정된 65개 유전자 영역의 구체적인 정보를 하기 표 4에 나타내었다.

유전자 기호	Region
유전자 기호	Functional part	bp	CG 개수	Seq.
CHODL	UTR5	72	6	chr21-19617176-19617247
	UTR5	71	13	chr21-19617336-19617406
	intronic	80	9	chr21-19617673-19617752
NCAM2	upstream	36	5	chr21-22370043-22370078
CYYR1	intronic	176	4	chr21-27944498-27944673
GRIK1	intronic	52	3	chr21-31311263-31311314
GRIK1	intronic	125	11	chr21-31311387-31311511
OLIG2	intergenic	235	14	chr21-34391993-34392227
		17	4	chr21-34392448-34392476
		173	7	chr21-34392696-34392868
		42	4	chr21-34395135-34395176
		75	5	chr21-34395490-34395566
		90	6	chr21-34395876-34395965
		50	3	chr21-34396297-34396346
		269	16	chr21-34396460-34396728
		117	9	chr21-34397003-34397119
	exonic	71	12	chr21-34399292-34399362
		103	12	chr21-34399427-34399529
		34	4	chr21-34399681-34399714
		56	8	chr21-34399848-34399903
	UTR3	68	10	chr21-34400145-34400212
		275	9	chr21-34400714-34400988
		14	3	chr21-34401366-34401379
	downstream	236	11	chr21-34401534-34401769
CLIC6	exonic	32	6	chr21-36042254-36042285
CLIC6	exonic	203	25	chr21-36042533-36042735
SIM2	intergenic	81	4	chr21-38067964-38068044
		389	29	chr21-38068418-38068806
		173	15	chr21-38069018-38069190
		1206	87	chr21-38069475-38070680
	intronic	13	3	chr21-38072494-38072506
		44	5	chr21-38073032-38073075
		66	8	chr21-38073463-38073528
		57	3	chr21-38073992-38074050
		31	3	chr21-38074152-38074184
		181	6	chr21-38074992-38075172
		343	30	chr21-38076769-38077111
		193	12	chr21-38077206-38077398
		197	8	chr21-38078262-38078458
		232	7	chr21-38079128-38079359
		39	4	chr21-38079924-38079962
		191	18	chr21-38079988-38080178
		55	7	chr21-38081200-38081254
		62	7	chr21-38081394-38081455
		17	4	chr21-38083112-38083128
HLCS	intronic	76	8	chr21-38352985-38353060
HLCS	UTR5	65	4	chr21-38353193-38353257
MX2	intronic	177	14	chr21-42741677-42741853
MX1	intronic	154	13	chr21-42798695-42798848
TMPRSS2	intronic	90	3	chr21-42878480-42878569
SLC37A1, PDE9A	intergenic	46	3	chr21-44011221-44011266
CBS	UTR3	97	4	chr21-44473401-44473497
CRYAA	upstream	137	13	chr21-44588388-44588457
C21orf2,TRPM2	intergenic	88	12	chr21-45769923-45770010
TSPEAR	intronic	167	8	chr21-46126022-46126188
		210	17	chr21-46126891-46127100
		179	10	chr21-46128800-46128978
		531	39	chr21-46129159-46129689
LINC00162, SSR4P1	intergenic	27	3	chr21-46439211-46439237
SLC19A1,LOC100129027	intergenic	23	3	chr21-47062136-47062158
MCM3AP	exonic	33	4	chr21-47704178-47704210
YBEY	downstream	25	4	chr21-47717843-47717867
YBEY	downstream	93	13	chr21-47717931-47718023
PRMT2, NONE	intergenic	76	11	chr21-48087183-48087258
ITSN1	intronic	63	4	chr21-35246628-35246690

정상 모체 혈액, 정상 태아 태반 및 다운증후군 태아 태반에서 상기 선정된 유전자 영역의 메틸화 정도 (메틸화 수준 (%)을 100으로 나눈 값)를 하기 표 5 및 도 1에 나타내었다.

후성학적 특성	Gene symbol	메틸화 정도
후성학적 특성	Gene symbol	정상 모체 혈액	정상 태아 태반	다운증후군 태아 태반
과메틸화 (Hyper)	CHODL	0.05	0.31	0.44
		0.04	0.26	0.37
		0.01	0.15	0.30
	NCAM2	0.02	0.23	0.34
	CYYR1	0.04	0.29	0.39
	GRIK1	0.14	0.29	0.46
	GRIK1	0.09	0.27	0.40
	OLIG2	0.02	0.18	0.34
		0.03	0.15	0.29
		0.03	0.28	0.43
		0.03	0.19	0.31
		0.02	0.12	0.25
		0.02	0.23	0.34
		0.04	0.18	0.31
		0.11	0.24	0.40
		0.10	0.23	0.38
		0.06	0.25	0.36
		0.06	0.19	0.32
		0.04	0.20	0.30
		0.03	0.13	0.27
		0.06	0.21	0.37
		0.06	0.28	0.40
		0.03	0.20	0.31
		0.04	0.24	0.34
	CLIC6	0.01	0.13	0.24
	CLIC6	0.02	0.16	0.33
	SIM2	0.12	0.22	0.34
		0.11	0.25	0.35
		0.08	0.19	0.29
		0.05	0.26	0.38
		0.04	0.30	0.40
		0.03	0.22	0.32
		0.04	0.22	0.33
		0.04	0.20	0.32
		0.04	0.19	0.30
		0.12	0.32	0.45
		0.04	0.23	0.39
		0.08	0.31	0.42
		0.11	0.34	0.44
		0.09	0.33	0.44
		0.09	0.31	0.45
		0.08	0.30	0.43
		0.04	0.25	0.37
		0.04	0.24	0.35
		0.06	0.29	0.39
	HLCS	0.04	0.57	0.71
	HLCS	0.03	0.50	0.66
	MX2	0.26	0.62	0.74
	MX1	0.05	0.30	0.45
	TMPRSS2	0.33	0.54	0.64
	SLC37A1,PDE9A	0.08	0.31	0.42
	CBS	0.21	0.67	0.77
	CRYAA	0.43	0.61	0.71
	C21orf2,TRPM2	0.15	0.41	0.54
	TSPEAR	0.12	0.60	0.73
		0.16	0.57	0.72
		0.09	0.46	0.62
		0.05	0.46	0.62
		LINC00162, SSR4P1	0.23	0.48	0.59
SLC19A1,LOC100129027		0.24	0.46	0.57
MCM3AP		0.16	0.44	0.55
YBEY		0.06	0.49	0.67
YBEY		0.11	0.48	0.64
PRMT2, NONE		0.01	0.34	0.44
저메틸화 (Hypo)	ITSN1	0.92	0.66	0.36

정상 태아 태반과 모체 혈액 세포 간의 메틸화 수준 차이, 및 다운증후군 태아 태반과 정상 태아 태반 간의 메틸화 수준 차이를 비교하였다.

그 결과, 표 5 및 도 1에 나타낸 바와 같이, CHODL, NCAM2, CYYR1, GRIK1, OLIG2, CLIC6, SIM2, HLCS, MX2, MX1, TMPRSS2, SLC37A1, PDE9A, CBS, CRYAA, TRPM2, C21orf2, TSPEAR, SSR4P1, LINC00162, MCM3AP, YBEY, 및 PRMT2 (NONE) 유전자 영역에서 태아 태반, 특히 다운증후군 태아의 태반에서 과메틸화됨을 확인하였다. 구체적으로, 상기 유전자들의 정상 태아 태반과 모체 혈액 세포 간의 메틸화 수준 차이는 10 내지 55로, 모체 혈액에 비해 태아 태반에서 과메틸화되어, 조직 (태반) 특이적인 바이오마커임을 확인하였다. 또한, 상기 유전자들의 다운증후군 태아 태반과 정상 태아 태반 간의 메틸화 수준 차이는 10 내지 20으로, 정상 태아에 비해 다운증후군 태아에서 과메틸화된 바이오마커로서 질환 (다운증후군) 특이적인 바이오마커임을 확인하였다. 다운증후군 태아 태반과 다른 두 그룹 (정상 태아 태반 및 모체 혈액) 간의 메틸화 수준 차이는 모두 통계적으로 유의하였다 (P < 0.05).

또한, ITSN1 유전자 영역은 다운증후군 태아의 태반에서 저메틸화됨을 확인하였다. 구체적으로, 모체 혈액 세포에서 ITSN1 유전자 영역의 메틸화 수준은 90 이상이고, 정상 태아 태반에서의 메틸화 수준은 65 이상으로 과메틸화된 반면에, 다운증후군 태아 태반에서의 메틸화 수준은 40 이하로 저메틸화됨을 확인하였다. 그룹 간의 메틸화 수준 차이는 25 이상이었다. 이 경우에도 다운증후군 태아 태반과 다른 두 그룹 (정상 태아 태반 및 모체 혈액) 간의 메틸화 수준 차이는 모두 통계적으로 유의하였다 (P < 0.05).

4-2. 21번 염색체를 제외한, 다른 염색체에서의 메틸화 수준 비교

동일한 형태의 후성학적 특성이 연속적으로 2개 이상 있는 부위로서 MXRA8, MIB2, KIF26B, SP5, ZIC4, ENPEP, PITX2, SH3BP2, SEPP1, FLJ32255, SHROOM1, LINC00574, LOC154449, PRRT4, TMEM176B, MNX1, LOC101928483, EGFL7, NACC2, C9orf69, TLX1, FGF8, TACC2, CPXM2, NKX6-2, TLX1NB, IQSEC3, PCDH8, F7, SOX9, PNMAL2, THBD, MAPK8IP2, KLHDC7B, GPR143, IGHMBP2, 및 MRGPRD 유전자 내 영역을 선정하였다. 선정된 33개 유전자 영역의 구체적인 정보를 하기 표 6에 나타내었다.

염색체	유전자 기호	Region
염색체	유전자 기호	Funtional part	bp	Seq.
1	MXRA8	exonic	4	chr1-1290330-1290333
1	MIB2	exonic	14	chr1-1564776-1564789
1	KIF26B	exonic	383	chr1-245851435-245851817
2	SP5	exonic	21	chr2-171573145-171573165
3	ZIC4	exonic	57	chr3-147113849-147113905
4	ENPEP,PITX2	intergenic	21	chr4-111532737-111532757
4	SH3BP2	intronic	39	chr4-2800726-2800764
5	SEPP1,FLJ32255	intergenic	78	chr5-42950062-42950139
5	SHROOM1	exonic	83	chr5-132158665-132158747
		intronic	91	chr5-132158828-132158918
		exonic	16	chr5-132158969-132158984
6	LINC00574, LOC154449	intergenic	269	chr6-170338448-170338716
7	PRRT4	exonic	12	chr7-127991715-127991726
7	TMEM176B	intronic	6	chr7-150497697-150497702
7	MNX1	downstream	9	chr7-156796810-156796818
9	LOC101928483,EGFL7	intergenic	29634	chr9-139482774-139512407
9	NACC2, C9orf69	intergenic	20	chr9-139001913-139001932
10	TLX1	intronic	1074	chr10-102893888-102894961
10	FGF8	intronic	4	chr10-103535480-103535483
10	TACC2	UTR5	32	chr10-123923354-123923385
10	CPXM2	exonic	20	chr10-125651146-125651165
10	NKX6-2	downstream	176	chr10-134598133-134598308
10	TLX1NB	intronic	18	chr10-102881237-102881254
12	IQSEC3	intronic	19	chr12-187057-187075
13	PCDH8	exonic	4	chr13-53422171-53422174
13	F7	intronic	413	chr13-113764089-113764501
17	SOX9	UTR5	19	chr17-70117397-70117415
19	PNMAL2	exonic	1237	chr19-46996868-46998096
20	THBD	exonic	83	chr20-23028442-23028524
22	MAPK8IP2	exonic	76	chr22-51042807-51042882
22	KLHDC7B	exonic	444	chr22-50986907-50987350
X	GPR143	exonic	114	chrX-9733732-9733845
11	IGHMBP2,MRGPRD	intergenic	914	chr11-68709935-68710848

정상 모체 혈액, 정상 태아 태반 및 다운증후군 태아 태반에서 상기 선정된 유전자 영역의 메틸화 정도 (메틸화 수준 (%)을 100으로 나눈 값) 를 하기 표 7 및 도 2에 나타내었다.

후성학적 특성	염색체	유전자	메틸화 정도
후성학적 특성	염색체	유전자	정상 모체 혈액	정상 태아 태반	다운증후군 태아 태반
과메틸화 (Hyper)	1	MXRA8	0.12	0.42	0.78
	1	MIB2	0.17	0.49	0.85
	1	KIF26B	0.16	0.37	0.79
	2	SP5	0.08	0.31	0.79
	3	ZIC4	0.00	0.29	0.68
	4	ENPEP,PITX2	0.03	0.45	0.74
	4	SH3BP2	0.02	0.33	0.71
	5	SEPP1,FLJ32255	0.01	0.33	0.70
	5	SHROOM1	0.08	0.40	0.77
			0.05	0.30	0.70
			0.07	0.34	0.73
	6	LINC00574, LOC154449	0.13	0.34	0.77
	7	PRRT4	0.09	0.19	0.67
	7	TMEM176B	0.03	0.29	0.73
	7	MNX1	0.00	0.12	0.61
	9	LOC101928483,EGFL7	0.21	0.31	0.80
	9	NACC2, C9orf69	0.00	0.39	0.70
	10	TLX1	0.02	0.36	0.72
	10	FGF8	0.03	0.22	0.70
	10	TACC2	0.02	0.26	0.66
	10	CPXM2	0.01	0.51	0.79
	10	NKX6-2	0.05	0.28	0.69
	10	TLX1NB	0.01	0.36	0.71
	12	IQSEC3	0.03	0.18	0.64
	13	PCDH8	0.10	0.31	0.77
	13	F7	0.06	0.24	0.68
	17	SOX9	0.03	0.25	0.64
	19	PNMAL2	0.03	0.42	0.78
	20	THBD	0.21	0.39	0.83
	22	MAPK8IP2	0.14	0.27	0.73
	22	KLHDC7B	0.03	0.55	0.84
	X	GPR143	0.13	0.33	0.73
저메틸화 (Hypo)	11	IGHMBP2, MRGPRD	0.81	0.78	0.14

그 결과, 표 7 및 도 2에 나타낸 바와 같이, MXRA8, MIB2, KIF26B, SP5, ZIC4, ENPEP, PITX2, SH3BP2, SEPP1, FLJ32255, SHROOM1, LINC00574, LOC154449, PRRT4, TMEM176B, MNX1, EGFL7, LOC101928483, NACC2, C9orf69, TLX1, FGF8, TACC2, CPXM2, NKX6-2, TLX1NB, IQSEC3, PCDH8, F7, SOX9, PNMAL2, THBD, MAPK8IP2, KLHDC7B, 및 GPR143 유전자 영역에서 태아 태반, 특히 다운증후군 태아의 태반에서 과메틸화됨을 확인하였다. 구체적으로, 상기 유전자들의 정상 태아 태반과 모체 혈액 세포 간의 메틸화 수준 차이는 10 내지 50으로, 모체 혈액에 비해 태아 태반에서 과메틸화되어, 조직 (태반) 특이적인 바이오마커임을 확인하였다. 또한, 상기 유전자들의 다운증후군 태아 태반과 정상 태아 태반 간의 메틸화 수준 차이는 25 내지 50으로, 정상 태아에 비해 다운증후군 태아에서 과메틸화된 바이오마커로서 질환 특이적임을 확인하였다. 다운증후군 태아 태반과 다른 두 그룹 (정상 태아 태반 및 모체 혈액) 간의 메틸화 수준 차이는 모두 통계적으로 유의하였다 (P < 0.05).

또한, IGHMBP2 및 MRGPRD 유전자 영역에서 다운증후군 태아의 태반에서 저메틸화됨을 확인하였다. 정상 태아 태반 및 모체 혈액 세포에서 IGHMBP2 및 MRGPRD 유전자 영역의 메틸화 수준은 75 이상으로 과메틸화된 반면에, 다운증후군 태아 태반에서의 메틸화 수준은 15 이하로 저메틸화되었음을 확인하였다. 이 경우에도 다운증후군 태아 태반과 다른 두 그룹 (정상 태아 태반 및 모체 혈액) 간의 메틸화 수준 차이는 모두 통계적으로 유의하였다 (P < 0.05).

상기 실시예 4의 결과를 종합하면, MXRA8, MIB2, KIF26B, SP5, ZIC4, ENPEP, PITX2, SH3BP2, SEPP1, FLJ32255, SHROOM1, LINC00574, LOC154449, PRRT4, TMEM176B, MNX1, LOC101928483, EGFL7, NACC2, C9orf69, TLX1, FGF8, TACC2, CPXM2, NKX6-2, TLX1NB, IQSEC3, PCDH8, F7, SOX9, PNMAL2, THBD, MAPK8IP2, KLHDC7B, GPR143, IGHMBP2, MRGPRD; 및 21번 염색체 내 CHODL, NCAM2, CYYR1, GRIK1, OLIG2, CLIC6, SIM2, HLCS, MX2, MX1, TMPRSS2, SLC37A1, PDE9A, CBS, CRYAA, C21orf2, TRPM2, TSPEAR, LINC00162, SSR4P1, SLC19A1, LOC100129027, MCM3AP, YBEY, PRMT2, ITSN1 유전자는 모체 및 정상 태아와 비교하여 다운증후군 태아에서 유의적인 후성학적 특징을 나타내는 바이오마커가 될 수 있음을 확인할 수 있다.

구체적으로, 21번 염색체에 존재하는 다운증후군 특이적 바이오마커의 DNA 메틸화 수준은 “정상 모체 혈액: 정상 태아 태반: 다운증후군 태아 태반 = 0 내지 10: 20: 40”으로, 질환에 따른 메틸화 수준의 차이는 약 20%이고, 21번 목적 염색체의 수적 증가를 반영하면 최종적으로 메틸화 수준의 차이는 약 30%임을 확인할 수 있다. 또한, 21번 염색체를 제외한 다른 염색체에 존재하는 다운증후군 특이적 바이오마커의 DNA 메틸화 수준은 “정상 모체 혈액: 정상 태아 태반: 다운증후군 태아 태반 = 0 내지 10: 30: 70”으로, 질환에 따른 메틸화 정도의 차이는 약 40%임을 확인할 수 있다.

즉, 상기 결과를 통해, 상기 바이오마커 유전자의 DNA 메틸화 수준 측정으로 다운증후군 태아를 진단할 수 있는, 모체 또는 정상 태아의 DNA 메틸화 수준과의 구체적인 비교 기준을 확인할 수 있다.

Claims

(a) 태아로부터 분리된 생물학적 시료로부터 다운증후군 바이오마커의 메틸화 수준을 측정하는 단계로서, 상기 바이오마커는 21번 염색체에 존재하는 하기 표 1로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 제1 바이오마커, 21번 염색체 외의 염색체에 존재하는 하기 표 2로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 제2 바이오마커, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 단계로서,
상기 바이오마커는 하기 표 1에 기재된 유전자 또는 하기 표 2에 기재된 유전자이고,
상기 바이오마커의 메틸화 수준은 하기 표 1의 염색체 내 영역의 염기서열의 메틸화 수준 또는 표 2의 염색체 내 위치의 염기서열의 메틸화 수준인 것인 단계;
[표 1]

[표 2]

(b) 상기 측정된 바이오마커의 메틸화 수준을 모체 혈액으로부터 분리된 생물학적 시료 및 정상 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료의 상기 제1 바이오마커, 제2 바이오마커, 또는 이들의 조합의 메틸화 수준과 비교하는 단계; 및
(c) 상기 메틸화 수준을 비교하여, 상기 태아로부터 분리된 생물학적 시료의 제1 바이오마커의 메틸화 수준과 상기 정상 대조군의 메틸화 수준의 차이가 10 내지 30% 이상인 경우, 또는 상기 태아로부터 분리된 생물학적 시료의 제2 바이오마커의 메틸화 수준과 상기 정상 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료의 메틸화 수준의 차이가 30 내지 50% 이상인 경우, 상기 태아의 다운증후군 존재 또는 발병 위험을 결정하는 단계를 포함하는 다운증후군 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
청구항 1에 있어서, 다운증후군의 목적 염색체인 21번 내 상기 제1 바이오마커 중 CHODL, NCAM2, CYYR1, GRIK1, OLIG2, CLIC6, SIM2, HLCS, MX2, MX1, TMPRSS2, SLC37A1, PDE9A, CBS, CRYAA, C21orf2, TRPM2, TSPEAR, LINC00162, SSR4P1, SLC19A1, LOC100129027, MCM3AP, YBEY, 및 PRMT2 유전자는 모체 혈액으로부터 분리된 생물학적 시료 및 정상 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에 비해 다운증후군 태아로부터 분리된 생물학적 시료에서 과-메틸화된 것이고; ITSN1 유전자는 저-메틸화된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 21번 염색체 이외의 염색체에 존재하는 상기 제2 바이오마커 중 MXRA8, MIB2, KIF26B, SP5, ZIC4, ENPEP, PITX2, SH3BP2, SEPP1, FLJ32255, SHROOM1, LINC00574, LOC154449, PRRT4, TMEM176B, MNX1, LOC101928483, EGFL7, NACC2, C9orf69, TLX1, FGF8, TACC2, CPXM2, NKX6-2, TLX1NB, IQSEC3, PCDH8, F7, SOX9, PNMAL2, THBD, MAPK8IP2, KLHDC7B, 및 GPR143 유전자는 모체 혈액으로부터 분리된 생물학적 시료 및 정상 대조군으로부터 분리된 생물학적 시료에 비해 다운증후군 태아로부터 분리된 생물학적 시료에서 과-메틸화된 것이고; IGHMBP2, 및 MRGPRD 유전자는 저-메틸화된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 메틸화 수준의 측정은 PCR, 메틸화 특이 PCR(methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이 PCR(real time methylation specific PCR), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 메틸화 특이적인 PNA를 이용하는 PCR, melting curve analysis, DNA 칩, 파이로시퀀싱, 바이설파이트 시퀀싱, 및 메틸화 차세대 염기서열 시퀀싱으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용하는 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 태아로부터 분리된 생물학적 시료는 태반으로부터 유래된 조직, 세포, 또는 세포유리 DNA를 포함하는 것이고, 상기 모체 혈액으로부터 분리된 생물학적 시료는 혈액 세포, 또는 세포유리 DNA를 포함하는 것인, 방법.