CN113884365A - 用于蛋白质组质控的ffpe参考品、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于蛋白质组质控的FFPE参考品、其制备方法及应用，所述制备方法包括以下步骤：S1，对来自不同物种的细胞系进行细胞培养，不同细胞系包括人源细胞，收集细胞沉淀；S2，在保证2~5x106细胞量质量总和一致情况下，对所述不同物种的细胞沉淀进行不同比例的混合，之后进行福尔马林固定，并用琼脂糖凝胶包裹形成均匀细胞团块，最终制成为细胞蜡块；S3，提取所述混合细胞蜡块中的蛋白，该参考品可用于临床蛋白样本提取流程的质控；S4,对所述提取的蛋白质进行酶解然后质谱检测，以此作为FFPE样本的蛋白质组质谱检测的质控及实验室间质量评价的标准品。本发明所得FFPE参考品，能够通过不同的质谱检测方法来验证整个临床蛋白质组系统的稳定性。

Description

用于蛋白质组质控的FFPE参考品、其制备方法及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种用于蛋白质组质控的FFPE参考品、其制备方法及应用。
背景技术
近年来，随着质谱硬件以及软件相关技术的提升，蛋白质组检测领域发展极为迅速，越来越多的应用到了临床肿瘤标志物的发现以及蛋白质组的分子分型，以及潜在药物靶点的发现，推动了精准医疗的发展。以往临床蛋白质组应用更多的样本检测除了体液样本，更多的是手术切除的新鲜样本，或者保存一定期限的冻存组织或体液，然而临床样本更多是以福尔马林固定石蜡包埋的样本（Formalin fixed and paraffin embedded，FFPE样本）。目前蛋白质组提取的参考品多为单一或混合的细胞，其不能很好的模拟临床样本的情况，而组织FFPE样本缺乏均一性不能成为临床蛋白质组提取的标品进行大规模、多次的重复验证。市场上虽然有福尔马林固定石蜡包埋的基因检测标品，但其不能满足蛋白质组定性和定量评估的要求，不能作为临床蛋白质组质控的参考品。
发明内容
发明目的：为解决上述技术问题，本发明提供了用于蛋白质组质控的FFPE参考品、其制备方法及应用。
技术方案：一种用于蛋白质组质控的FFPE参考品的制备方法，包括以下步骤：
S1，对来自不同物种的细胞系进行细胞培养，不同细胞系包括人源细胞，收集细胞沉淀；
S2，在保证2~5x106细胞量质量总和一致情况下，对所述不同物种的细胞沉淀进行不同比例的混合，之后进行福尔马林固定，并用琼脂糖凝胶包裹形成均匀细胞团块，最终制成为细胞蜡块；
S3，提取所述混合细胞蜡块中的蛋白，该参考品可用于临床蛋白样本提取流程的质控；
S4，对所述提取的蛋白质进行酶解然后质谱检测，以此作为蛋白质组质谱检测的质控。
作为优选或具体的实施方案：
步骤S1中，所述人源细胞系选自肿瘤细胞系或者非肿瘤细胞系，优选为293T细胞系或者Hela细胞系；所述不同物种的细胞系，除了有人源物种的细胞系外，还至少包括其他一种物种来源的细胞，优选的为酵母Yeast来源的细胞系或者大肠杆菌E.coli来源的细胞系；
步骤S2中，不同配对样本间人源细胞系的蛋白比例优选为1：1~10；优选的1：1或1：2或1：4等；也可以是多个样本对应多个比例，优选的为1：2：4等。
例如两个物种混合：
Sample1：human-0% + E.coli-100%
Sample2：human-25% + E.coli-75%
Sample3：human-50% + E.coli-50%
Sample4：human-100% + E.coli-0%。
或者
Sample1：human-0% + Yeast-100%
Sample2：human-25% + Yeast-75%
Sample3：human-50% + Yeast-50%
Sample4：human-100% + Yeast-0%。
三种物种混合：
Sample1：human-30% + E.coli -30% + Yeast-40%
Sample2：human-60% + E.coli -30% + Yeast-10%。
或者
Sample1：human-40% + E.coli -30% + Yeast-30%
Sample2：human-10% + E.coli -30% + Yeast-60%。
或者
Sample1：human-30% + E.coli -40% + Yeast-30%
Sample2：human-60% + E.coli -10% + Yeast-30%。
或者
Sample1：human-40% + E.coli -30% + Yeast-30%
Sample2：human-10% + E.coli -60% + Yeast-30%。
或者
Sample1：human-30% + E.coli -40% + Yeast-30%
Sample2：human-30% + E.coli -10% + Yeast-60%。
或者
Sample1：human-30% + E.coli -30% + Yeast-40%
Sample2：human-30% + E.coli -60% + Yeast-10%。
或者
Sample1：human-15% + E.coli -20% + Yeast-65%
Sample2：human-30% + E.coli -5% + Yeast-65%。
或者
Sample1：human-20% + E.coli -15% + Yeast-65%
Sample2：human-5% + E.coli -30% + Yeast-65%。
或者
Sample1：human-15% + E.coli -65% + Yeast-20%
Sample2：human-30% + E.coli -65% + Yeast-5%。
或者
Sample1：human-20% + E.coli -65% + Yeast-15%
Sample2：human-5% + E.coli -65% + Yeast-30%。
或者
Sample1：human-65% + E.coli -20% + Yeast-15%
Sample2：human-65% + E.coli -5% + Yeast-30%。
或者
Sample1：human-65% + E.coli -15% + Yeast-20%
Sample2：human-65% + E.coli -30% + Yeast-5%。
步骤S3中，提取所述混合细胞蜡块中的蛋白，其方法包括以下步骤：
S31，有机溶剂进行脱蜡，结束后采用乙醇进行脱蜡后的复水；
S32，加入裂解液超声；
S33，水浴去交联，离心取上清；
S34，上清液加入有机溶剂，沉淀，然后复溶；
S35，BCA法进行蛋白浓度测定；
S36，蛋白跑胶质控。
更优选的，步骤S3中，提取所述混合细胞蜡块中的蛋白，其方法包括以下步骤：
S31，二甲苯或辛烷进行三次脱蜡，每次5~10min，依次100%、75%、50%的乙醇进行脱蜡后的复水，每次5~10min；
S32，4% SDS溶解在100mM的TrisHCl（pH=8.5）超声裂解；
S33，95度水浴去交联1小时，离心取上清；
S34，上清液加入丙酮，沉淀，过夜后尿素超声复溶；
S35，BCA法进行蛋白浓度测定；
S36，蛋白跑胶质控。
步骤S4中，对所述提取的蛋白质进行酶解然后质谱检测，其方法包括以下步骤：
S41，蛋白还原烷基化；
S42，蛋白酶解；
S43，肽段脱盐抽干及复溶后Nanodrop肽段定量；
S44，质谱检测；
S45，质谱检测结果的定性与定量结果的评估。
更优选的，步骤S4中，对所述提取的蛋白质进行酶解然后质谱检测，其方法包括以下步骤：
S41，采用DTT+IAM进行蛋白还原烷基化；
S42，采用溶液内酶解、FASP酶解或SP3酶解进行蛋白酶解；
S43，肽段脱盐抽干及复溶后Nanodrop肽段定量；
S44，质谱检测：DDA或DIA的检测方法；
S45，质谱检测结果的定性与定量结果的评估。
本发明还提供了采用上述制备方法所制成的用于蛋白质组质控的FFPE参考品。
本发明最后提供了所述的用于蛋白质组质控的FFPE参考品在制备蛋白质组质控试剂盒中的应用。
有益效果：随着临床蛋白质组的发展，针对其质量标准体系的控制受到广泛的关注。目前蛋白质组提取的参考品多为单一或混合的细胞，其不能很好的模拟临床样本的情况，而组织FFPE样本缺乏均一性不能成为临床蛋白质组提取的标品进行大规模、多次的重复验证。市场上虽然有福尔马林固定石蜡包埋的基因检测标品，但其不能满足蛋白质组定性和定量评估的要求，不能作为临床蛋白质组质控的参考品。目前非标蛋白质组定量的体系是建立于多物种样本已知不同比例的混合后，进行质谱定量方法的验证；结合目前蛋白质组非标定量质控体系以及临床FFPE样本微量性的特定，本发明将包含人源细胞系以及其他物种如常用的E.coli和Yeast细胞进行不同比例的混合且保证蛋白总量恒定情况下，进行标准方法的FFPE蛋白质组的制备提取，以便后期通过不同的质谱检测方法来验证整个临床蛋白质组系统的稳定性，包括微量FFPE样本的蛋白的收率，蛋白酶解后肽段的收率，以及蛋白质组定性和定量的稳定性和准确性检验等。
附图说明
图1：人源细胞FFPE蛋白提取质控胶图。
图2：实施例2中sample2、sample3、sample4的共鉴定蛋白的定量比例图。
图3：实施例3中sample1和sample2同物种共鉴定蛋白的定量比例。
具体实施方式
以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
选择单物种样本sample1：human-100%，每批次临床蛋白质组样本提取的过程中可以附带取1片石蜡组织样本进行进行单物种样本的蛋白提取，以此作为并行FFPE队列样本蛋白提取的质控标品：
1）将FFPE切片置于通风橱内二甲苯瓶缸中浸泡，保证组织充分浸泡于液面以下，每次5~10min后更换新缸，共进行三次脱蜡；之后依次置于100%、75%、50%的乙醇进行脱蜡后的复水，每次5~10min；
2）使用少量PBS浸泡FFPE组织表面约2分钟后去除使用洁净的刀片将组织刮取转移至1ml的EP管中，加入4% SDS溶解于100mM的TrisHCl（pH=8.5）裂解液后进行冰水浴超声裂解，超声功率25%，超声3秒暂停3秒，总超声时间6分钟；
3）超声后将液体低速离心至管底，并置于95度水浴中去交联1小时，之后14000g高速离心取上清；
4）加入-20度预冷的丙酮沉淀过夜后，离心去上清，沉淀使用8M的尿素（溶解于100mM的TrisHCl冰水浴超声复溶，超声功率25%，超声3秒暂停3秒，总超声时间3分钟；
5）BCA法进行蛋白浓度测定；
6）将FFPE提取蛋白浓缩至20ul以内体积并加入1xloading buffe置于95度水浴10分钟后上样，进行SDS-PAGE跑胶质控（见图1）。
实施例2
取FFPE标品盘，包含4组不同样本，其中两个样本sample1、sample4分别为纯的100%的E.coli和human细胞制备的FFPE标品，经过蛋白提取酶解后肽段可以直接混合为不同比例用于质谱定量检测方法的质控；sample2、sample3分别是不同比例混合的两个物种的细胞系，对于人源细胞蛋白质组等量检测的条件下可以组成理论的sample2：sample3：sample4=1：2：4的预设理论比例，可以同时质控FFPE蛋白提取至质谱定量检测的整个流程：
Sample1：human-0% + E.coli-100%
Sample2：human-25% + E.coli-75%
Sample3：human-50% + E.coli-50%
Sample4：human-100% + E.coli-0%。
1）脱蜡复水：将FFPE切片置于通风橱内二甲苯瓶缸中浸泡，保证组织充分浸泡于液面以下，每次5~10min后更换新缸，共进行三次脱蜡；之后依次置于100%、75%、50%的乙醇进行脱蜡后的复水，每次5~10min。
2）超声裂解：使用少量PBS浸泡FFPE组织表面约2分钟后去除使用洁净的刀片将组织刮取转移至1ml的EP管中，加入4% SDS溶解于100mM的TrisHCl（pH=8.5）裂解液后进行冰水浴超声裂解，超声功率25%，超声3秒暂停3秒，总超声时间6分钟。
3）去交联：超声后将液体低速离心至管底，并置于95度水浴中去交联1小时，之后14000g高速离心取上清。
4）丙酮沉淀与复溶：加入-20度预冷的丙酮沉淀过夜后，离心去上清，沉淀使用8M的尿素（溶解于100mM的TrisHCl冰水浴超声复溶，超声功率25%，超声3秒暂停3秒，总超声时间3分钟。
5）还原烷基化：加入总体积1/200的1M的DTT，56度水浴30分钟；水浴中取出后，恢复室温后加入总体积1/50的1M的IAA，避光保存30分钟；再次加入总体积1/200的1M的DTT，中和过量的IAA，避光保存15分钟。
6）FASP酶解：将还原烷基化后的蛋白液体转移至10KD的FASP管后，14000g离心15分钟后，用50mM的碳酸氢铵洗两遍；之后加入胰蛋白酶1ug胰蛋白酶（100ng/µL，共10ul），之后用封口膜包好，置于37度温箱消化4小时后，再次加入1ug胰蛋白酶消化过夜。取出消化后的肽段14000g离心15分钟，之后加入1%甲酸溶液100µL，再次离心直至膜上液体完全离心下来备用。
7）肽段脱盐与定量：使用自制的C18脱盐柱进行肽段脱盐后抽干及复溶后Nanodrop肽段定量，使用相同体积20ul loading buffer（0.1% FA质谱水）溶解，sample1、2、3、4肽段浓度接近约为0.5ug/ul左右。
8）分别取2ug约4ul的个样本肽段进行质谱上样检测，液相和质谱检测方法如下；
色谱分离梯度设置如下:
流动相A：100%色谱级水+0.2%甲酸
流动相B：80%色谱级乙腈+0.2%甲酸
色谱梯度:135分钟梯度，其中质谱采集时间为0~120分钟：
Figure 920788DEST_PATH_IMAGE001
。
液相使用纳升级色谱仪Easy-nLC和串联高分辨质谱仪Q-Exactive系列，色谱条件为：预柱外径360um，内径100um，填料是3um的C18，填料总长2cm；色谱柱长度25cm，外径360um，内径150um，一体化色谱柱柱尖开口3~5um，填料是1.9um粒径的C18反相填料；
质谱仪Q-Exactive HF（Thermo）设置如下:
一级质谱，扫描范围:350-1500m/z，分辨率:120000(@m/z 200)，AGC target:1e6，Maximum IT：40ms; 二级扫描，Isolation window: 400~1000 m/z 分为40个动态窗口，分辨率:30000(@m/z 200)，AGC target:5e4， Maximum IT:45ms，MS2 Activation Type:HCD，NCE:28; 二级扫描个数Top40。
9）质谱检测结果的定性与定量结果的评估：
使用maxquant对质谱采集的原始raw结果进行搜库检索，使用uniprot_human数据库对混合分别进行搜库检索，maxquant均使用默认搜库参数，选择LFQ定量的iBAQ方式进行最终的人源蛋白的不同比例的定量评估，蛋白定性与定量结果如下：sample1非人源物种之外，sample2、sample3、sample4分别鉴定到可定量人源蛋白数目为3620、4416、5113；三者共鉴定蛋白个数为3413，其共鉴定蛋白的定量比例如图2：图中左侧和右侧分别为Sample2和Sample3以及Sample2和Sample4共鉴定蛋白的定量比例，横坐标为Log2（Ratio），纵坐标为Log10(iBAQ)，其中两者的共鉴定蛋白的比例中位数分别约为2和4，与理论比例接近。
实施例3
取FFPE标品盘，包含2组三个不同样本，通过预设定量比例，Sample1、Sample2两个样本间人源蛋白蛋白质组定量比值为1：1，E.coli蛋白质组定量比值为1：2，酵母蛋白质组定量比值为4：1；取两个标准样本进行蛋白质组制备提取酶解后进行质谱检测，具体流程如下：
Sample1：human-65% + E.coli -15% + Yeast-20%
Sample2：human-65% + E.coli -30% + Yeast-5%。
1）脱蜡复水：将FFPE切片置于通风橱内二甲苯瓶缸中浸泡，保证组织充分浸泡于液面以下，每次5~10min后更换新缸，共进行三次脱蜡；之后依次置于100%、75%、50%的乙醇进行脱蜡后的复水，每次5~10min。
2）超声裂解：使用少量PBS浸泡FFPE组织表面约2分钟后去除使用洁净的刀片将组织刮取转移至1ml的EP管中，加入4% SDS溶解于100mM的TrisHCl（pH=8.5）裂解液后进行冰水浴超声裂解，超声功率25%，超声3秒暂停3秒，总超声时间6分钟。
3）去交联：超声后将液体低速离心至管底，并置于95度水浴中去交联1小时，之后14000g高速离心取上清。
4）丙酮沉淀与复溶：加入-20度预冷的丙酮沉淀过夜后，离心去上清，沉淀使用8M的尿素（溶解于100mM的TrisHCl冰水浴超声复溶，超声功率25%，超声3秒暂停3秒，总超声时间3分钟。
5）还原烷基化：加入总体积1/200的1M的DTT，56度水浴30分钟；水浴中取出后，恢复室温后加入总体积1/50的1M的IAA，避光保存30分钟；再次加入总体积1/200的1M的DTT，中和过量的IAA，避光保存15分钟。
6）FASP酶解：将还原烷基化后的蛋白液体转移至10KD的FASP管后，14000g离心15分钟后，用50mM的碳酸氢铵洗两遍；之后加入胰蛋白酶1ug胰蛋白酶（100ng/µL，共10ul），之后用封口膜包好，置于37度温箱消化4小时后，再次加入1ug胰蛋白酶消化过夜。取出消化后的肽段14000g离心15分钟，之后加入1%甲酸溶液100µL，再次离心直至膜上液体完全离心下来备用。
7）肽段脱盐与定量：使用自制的C18脱盐柱进行肽段脱盐后抽干及复溶后Nanodrop肽段定量，使用相同体积20ul loading buffer（0.1% FA质谱水）溶解，sample1、2、3、4肽段浓度接近约为0.5ug/ul左右。
8）分别取2ug约4ul的个样本肽段进行质谱上样检测，液相和质谱检测方法如下；
色谱分离梯度设置如下:
流动相A：100%色谱级水+0.2%甲酸
流动相B：80%色谱级乙腈+0.2%甲酸
色谱梯度:135分钟梯度，其中质谱采集时间为0~120m分钟：
Figure 241523DEST_PATH_IMAGE002
。
液相使用纳升级色谱仪Easy-nLC和串联高分辨质谱仪Q-Exactive系列，色谱条件为：预柱外径360um，内径100um，填料是3um的C18，填料总长2cm；色谱柱长度25cm，外径360um，内径150um，一体化色谱柱柱尖开口3~5um，填料是1.9um粒径的C18反相填料；
质谱仪Q-Exactive HF（Thermo）设置如下:
一级质谱，扫描范围:350-1500m/z，分辨率:120000(@m/z 200)，AGC target:1e6，Maximum IT：40ms; 二级扫描，Isolation window: 400~1000 m/z 分为40个动态窗口，分辨率：30000(@m/z 200)，AGC target:5e4，Maximum IT:45ms，MS2 Activation Type:HCD，NCE:28; 二级扫描个数Top40。
9）质谱检测结果的定性与定量结果的评估：
使用maxquant对质谱采集的原始raw结果进行搜库检索，分别使用uniprot_human、uniprot _E.coli、uniprot_S.cerevisiae数据库对混合样本进行搜库检索得到不同样本中各物种蛋白质组的定性与定量的结果，maxquant均使用默认搜库参数，选择LFQ定量的iBAQ方式进行不同物种的不同比例的定量评估，蛋白定性与定量结果如下：sample1和sample2分别鉴定到人源、E.coli 、Yeast蛋白数为4762/4685、1288/1602、2051/1730；sample1和sample2同物种共鉴定蛋白的定量比例如图3：图中左侧-中间-右侧分别为Sample1-vs-Sample2中相同物种蛋白质组共鉴定蛋白的定量比例，横坐标为Log2（Ratio），纵坐标为Log10(iBAQ)，与理论比例Ratio-human=1：1，Ratio-Ecoli=1：2，Ratio-Yeast=4：1，实际检测比例中位数与理论比例很接近。
实施例4
取FFPE标品盘，包含4组不同样本，其中两个样本sample1、sample4分别为纯的100%的human细胞和在13C重标培养基中培养的human细胞制备的FFPE标品，经过蛋白提取酶解后肽段可以直接混合为不同比例用于质谱定量检测方法的质控；sample2、sample3分别是不同比例混合的细胞系，对于人源细胞重标蛋白质组等量检测的条件下可以组成理论的sample2：sample3：sample4=1：2：4的预设理论比例，可以同时质控FFPE蛋白提取至质谱定量检测的整个流程：
Sample1：heavy-0% + light-100%
Sample2：heavy-25% +light-75%
Sample3：heavy-50% + light-50%
Sample4：heavy-100% + light-0%。
1）脱蜡复水：将FFPE切片置于通风橱内二甲苯瓶缸中浸泡，保证组织充分浸泡于液面以下，每次5~10min后更换新缸，共进行三次脱蜡；之后依次置于100%、75%、50%的乙醇进行脱蜡后的复水，每次5~10min。
2）超声裂解：使用少量PBS浸泡FFPE组织表面约2分钟后去除使用洁净的刀片将组织刮取转移至1ml的EP管中，加入4% SDS溶解于100mM的TrisHCl（pH=8.5）裂解液后进行冰水浴超声裂解，超声功率25%，超声3秒暂停3秒，总超声时间6分钟。
3）去交联：超声后将液体低速离心至管底，并置于95度水浴中去交联1小时，之后14000g高速离心取上清。
4）丙酮沉淀与复溶：加入-20度预冷的丙酮沉淀过夜后，离心去上清，沉淀使用8M的尿素（溶解于100mM的TrisHCl冰水浴超声复溶，超声功率25%，超声3秒暂停3秒，总超声时间3分钟。
5）还原烷基化：加入总体积1/200的1M的DTT，56度水浴30分钟；水浴中取出后，恢复室温后加入总体积1/50的1M的IAA，避光保存30分钟；再次加入总体积1/200的1M的DTT，中和过量的IAA，避光保存15分钟。
6）FASP酶解：将还原烷基化后的蛋白液体转移至10KD的FASP管后，14000g离心15分钟后，用50mM的碳酸氢铵洗两遍；之后加入胰蛋白酶1ug胰蛋白酶（100ng/µL，共10ul），之后用封口膜包好，置于37度温箱消化4小时后，再次加入1ug胰蛋白酶消化过夜。取出消化后的肽段14000g离心15分钟，之后加入1%甲酸溶液100µL，再次离心直至膜上液体完全离心下来备用。
7）肽段脱盐与定量：使用自制的C18脱盐柱进行肽段脱盐后抽干及复溶后Nanodrop肽段定量，使用相同体积20ul loading buffer（0.1% FA质谱水）溶解，sample1、2、3、4肽段浓度接近约为0.5ug/ul左右。
8）分别取2ug约4ul的个样本肽段进行质谱上样检测，液相和质谱检测方法如下；
色谱分离梯度设置如下:
流动相A：100%色谱级水+0.2%甲酸
流动相B：80%色谱级乙腈+0.2%甲酸
色谱梯度:135分钟梯度，其中质谱采集时间为0~120分钟：
Figure 552419DEST_PATH_IMAGE003
。
液相使用纳升级色谱仪Easy-nLC和串联高分辨质谱仪Q-Exactive系列，色谱条件为：预柱外径360um，内径100um，填料是3um的C18，填料总长2cm；色谱柱长度25cm，外径360um，内径150um，一体化色谱柱柱尖开口3~5um，填料是1.9um粒径的C18反相填料；
质谱仪Q-Exactive HF（Thermo）设置如下:
一级质谱，扫描范围:350-1500m/z，分辨率:120000(@m/z 200)，AGC target:1e6，Maximum IT：40ms; 二级扫描，Isolation window: 400~1000 m/z 分为40个动态窗口，分辨率:30000(@m/z 200)，AGC target:5e4， Maximum IT:45ms，MS2 Activation Type:HCD，NCE:28; 二级扫描个数Top40。
9）质谱检测结果的定性与定量结果的评估：
使用maxquant对质谱采集的原始raw结果进行搜库检索，使用uniprot_human数据库对混合样品分别进行搜库检索，肽段鉴定修改为13C重标设定，maxquant其他设置均使用默认搜库参数，选择LFQ定量的iBAQ方式进行最终的人源蛋白的不同比例的定量评估，蛋白定性与定量结果如下：sample2、sample3、sample4分别鉴定到可定量人源蛋白数目为3583、4326、5003；三者共鉴定蛋白个数为3458，Sample2和Sample3以及Sample2和Sample4共鉴定蛋白的定量比例中位数分别为2.13和4.22，与理论比例2和4接近。

Claims (9)

1.一种用于蛋白质组质控的FFPE参考品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1，对来自不同物种的细胞系进行细胞培养，不同细胞系包括人源细胞，收集细胞沉淀；
S2，在保证2~5x106细胞量质量总和一致情况下，对所述不同物种的细胞沉淀进行不同比例的混合，之后进行福尔马林固定，并用琼脂糖凝胶包裹形成均匀细胞团块，最终制成为细胞蜡块；
S3，提取所述混合细胞蜡块中的蛋白，该参考品可用于临床蛋白样本提取流程的质控；
S4，对所述提取的蛋白质进行酶解然后质谱检测，以此作为蛋白质组质谱检测的质控。
2.根据权利要求1所述的用于蛋白质组质控的FFPE参考品的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述人源细胞系选自肿瘤细胞系或非肿瘤细胞系；所述不同物种的细胞系，除了有人源物种的细胞系外，还至少包括其他一种物种来源的细胞。
3.根据权利要求1所述的用于蛋白质组质控的FFPE参考品的制备方法，其特征在于，步骤S2中，不同配对样本间人源细胞系的蛋白比例为1：1~10。
4.根据权利要求1所述的用于蛋白质组质控的FFPE参考品的制备方法，其特征在于，步骤S3中，提取所述混合细胞蜡块中的蛋白，其方法包括以下步骤：
S31，有机溶剂进行脱蜡，结束后采用不同比例乙醇进行脱蜡后的复水；
S32，加入裂解液超声；
S33，水浴去交联后离心取上清；
S34，上清液加入有机溶剂，沉淀，然后复溶；
S35，BCA法进行蛋白浓度测定；
S36，蛋白跑胶质控。
5.根据权利要求1所述的用于蛋白质组质控的FFPE参考品的制备方法，其特征在于，步骤S3中，提取所述混合细胞蜡块中的蛋白，其方法包括以下步骤：
S31，二甲苯或辛烷进行三次脱蜡，每次5~10min，依次100%、75%、50%的乙醇进行脱蜡后的复水，每次5~10min；
S32，4% SDS溶解在100mM的TrisHCl超声裂解；
S33，95度水浴去交联1小时，离心取上清；
S34，上清液加入丙酮，沉淀，过夜后尿素超声复溶；
S35，BCA法进行蛋白浓度测定；
S36，蛋白跑胶质控。
6.根据权利要求1所述的用于蛋白质组质控的FFPE参考品的制备方法，其特征在于，步骤S4中，对所述提取的蛋白质进行酶解然后质谱检测，其方法包括以下步骤：
S41，蛋白还原烷基化；
S42，蛋白酶解；
S43，肽段脱盐抽干及复溶后Nanodrop肽段定量；
S44，质谱检测；
S45，质谱检测结果的定性与定量结果的评估。
7.根据权利要求1所述的用于蛋白质组质控的FFPE参考品的制备方法，其特征在于，步骤S4中，对所述提取的蛋白质进行酶解然后质谱检测，其方法包括以下步骤：
S41，采用DTT+IAM进行蛋白还原烷基化；
S42，采用溶液内酶解、FASP酶解或SP3酶解进行蛋白酶解；
S43，肽段脱盐抽干及复溶后Nanodrop肽段定量；
S44，质谱检测：DDA或DIA的检测方法；
S45，质谱检测结果的定性与定量结果的评估。
8.一种用于蛋白质组质控的FFPE参考品，其特征在于，采用权利要求1-7任一项所述的制备方法制备而成。
9.权利要求8所述的用于蛋白质组质控的FFPE参考品在制备蛋白质组质控试剂盒中的应用。
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