CN117660604B - 用于ngs检测的ffpe参考品及其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医疗技术领域，具体公开了一种用于NGS检测的FFPE参考品及其制备方法及应用。一种用于NGS检测的FFPE参考品的制备方法，包括取细胞培养液，离心，然后加入细胞处理A液和细胞处理B液，得细胞凝渣，再以细胞凝渣制得细胞凝块并进行浸蜡等处理后，得FFPE参考品；细胞处理A液是牛血清蛋白、红藻胶、防腐剂、PBS缓冲液的混合液；细胞处理B液是中性福尔马林液、乙酸和乙醇的混合液。一种用于NGS检测的FFPE参考品的应用在于，将其应用于肿瘤NGS检测室内质控中。本申请的用于NGS检测的FFPE参考品不仅样本细胞来源可持续性，还具备核酸含量均一且核酸质量稳定的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医疗技术领域，尤其是涉及一种用于NGS检测的FFPE参考品及其制备方法及应用。
背景技术
二代基因测序（next generation sequencing, NGS）又称为高通量测序，能够同时对上百万的基因进行分析，相较于传统一代测序技术，该技术能同时检测多基因和未知基因，并且具有周期短和费用较低等优势，所以在临床中被广泛应用，尤其在靶向治疗、免疫治疗、用药指导及预后监测等肿瘤精准治疗方面提供较全面的指导信息。由于NGS的实验流程长和步骤复杂，实验过程中任何因素的变化均会影响检测结果的准确性，导致出现假阳性或假阴性结果，对患者的治疗造成不可挽回的后果；因此，在NGS实验当中，需要额外加入已知结果的标准参考品参与全流程实验，通过分析标准参考品的检测结果是否符合预期，从而确保实验流程的稳定性和可靠性，起到监控NGS实验流程的作用。
目前标准参考品的来源主要有两个途径：一个途径是使用临床组织样本，通过10%的中性福尔马林液固定和石蜡包埋（FFPF）的方法得到的组织蜡块，然后把组织蜡块切成蜡片，作为NGS实验的标准参考品。该途径的缺点是相同的临床组织样本数量有限，无法持续用于标准参考品的制备；如采用不同的临床组织样本，则无法保证标准参考品的一致性和稳定性，无法起到标准化的作用。
另一个途径是使用肿瘤细胞株培养的细胞液，通过离心收集、琼脂糖凝固、95%酒精固定等处理，然后用石蜡包埋制成细胞蜡块，再把蜡块中琼脂糖凝固的细胞切成蜡片，作为NGS实验的标准参考品，这样制备而成的标准参考品克服了临床组织样本数量有限且一致性和稳定性不足的缺陷，但是由于琼脂糖需在高温溶解的情况下才能使用，这给实验操作带来很大的不便；另外由于琼脂糖较黏稠，细胞在琼脂糖内部难以分布不均，而且琼脂糖的通透性不好，易导致其内部的细胞的固定、脱水不佳而出现核酸溶解等不良情况。因此，使用琼脂糖制作的细胞蜡块存在核酸含量不均匀且容易降解的情况，这样的细胞蜡块的核酸数量和质量难以达不到标准参考品的要求，有必要进一步改进使用肿瘤细胞株培养的细胞液建立标准参考品的制备方法。
发明内容
为了进一步改进使用肿瘤细胞株培养的细胞液建立标准参考品的制备方法，本申请提供一种用于NGS检测的FFPE参考品及其制备方法及应用。
第一方面，本申请提供的一种用于NGS检测的FFPE参考品的制备方法采用如下的技术方案：
一种用于NGS检测的FFPE参考品的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取细胞培养液，离心，得培养液沉渣；
步骤2：在培养液沉渣中加入清洗液溶解、混匀后离心，得液体沉渣；
步骤3：往液体沉渣中加入细胞处理A液，混匀，静置1~2min，再加入细胞处理B液溶解、混匀后离心，得细胞凝渣；
步骤4：将细胞凝渣轻压放入预制模具中，得细胞凝块；
步骤5：对细胞凝块进行固定、脱水、透明、浸蜡处理后，得FFPE参考品；
其中，细胞处理A液是牛血清蛋白、红藻胶、防腐剂、PBS缓冲液的混合液；
细胞处理B液是中性福尔马林液、乙酸和乙醇的混合液；
所述步骤3中的细胞处理A液和细胞处理B液的添加体积比为1：（15~30）。
上述技术方案中，本申请以细胞培养液为制作细胞蜡块的样本来源，不仅解决了样本来源的可持续性问题，还保证了样本细胞的质量一致性和稳定性，同时本申请通过细胞处理A液和细胞处理B液对细胞进行固定处理，通过牛血清蛋白和红藻胶的搭配使用，细胞快速附着并形成稳定的凝胶结构，从而达到精准固定细胞并避免细胞团聚的目的，解决了细胞在琼脂糖内难以分布均匀和通透性不好的问题，再配合后续的细胞处理B液的再次溶解、混匀和离心的操作，配合中性福尔马林液的固定作用，细胞在离心管底部形成一层均匀分散的细胞凝渣，保证了细胞的良好形态和内部组织结构，更好的保存了细胞内的核酸，显著提高了标准参考品的核酸含量和质量，便于后续步骤中细胞凝块的形成和固定、脱水等操作，这样制备而成的细胞蜡块细胞分散均匀且能够长时间保存，切出来的每张蜡片的形态也保持一致，所含细胞数量也基本一致，保证了用于质控的核酸量稳定。
本申请通过在步骤2中加入清洗液，能够很好的清洗培养液沉渣里面一些不需要的碎片或渣滓，从而提升沉渣的细胞量；本申请通过在步骤4中将细胞凝渣轻压放入预制模具中，保证了细胞凝块的规整度；本申请通过在步骤5中对细胞凝块进行固定、脱水、透明、浸蜡处理，能够把细胞内部的水分脱离出来，从而灭活或抑制细胞内部各种酶的活性，尤其是核酸酶的活性，以达到阻断核酸酶降解核酸的目的，为后期实验保持足够和完整的核酸。
优选的，所述PBS缓冲液是1wt%PBS缓冲液，细胞处理A液是牛血清蛋白、红藻胶、防腐剂、1wt%PBS缓冲液以（6~7）：（3~4）：（0.1~0.2）：90的质量比混合而成的。
上述技术方案中，本申请通过进一步优化细胞处理A液的成分用量，使得细胞处理A液的成分更适于细胞附着和凝胶结构的形成，从而进一步提高了细胞蜡块的核酸稳定性，保证了用于质控的核酸量稳定。
优选的，所述细胞处理B液由10wt%中性福尔马林液、乙酸、无水乙醇溶液以10：（4~6）：（80~90）的体积比混合而成。
优选的，所述10wt%中性福尔马林液是由甲醛（40%)100ml、纯净水900ml、磷酸氢二钠6.5g、磷酸二氢钠4.0g充分混合均匀配制而成的。
上述技术方案中，本申请通过进一步优化细胞处理B液的成分用量，使得细胞处理B液的成分更适于细胞的溶解和固定，从而进一步提高了细胞蜡块的核酸稳定性，保证了用于质控的核酸量稳定。
优选的，所述步骤1中细胞培养液的细胞浓度至大于1.0×106个/mL。
优选的，所述步骤1中培养的细胞是HCT116细胞，H1975细胞，H1650细胞，HCC4006细胞，SKMEL1细胞，HCC78细胞，293T细胞，A549细胞，AD293细胞中的一种或多种。
上述技术方案中，本申请通过优化培养细胞浓度，确保细胞数量充足，以满足制备标准参考品的需求。此外，本申请还可以根据实际需求，采用不同类型的细胞培养液混合，以获得具有特定性质的标准参考品。
优选的，所述步骤1-3中，离心的条件为在2800~3000r/min转速下离心时间5~8min。
上述技术方案中，本申请通过进一步优化离心的时间和速度，使得离心效果更好，更有利于后续步骤中细胞的收集和分离，同时更好的避免了细胞的破裂。
优选的，所述步骤2中，清洗液是由生理盐水、乙醇、乙酸、苯扎氯铵混合组成的溶液，其中以清洗液的质量百分比计，包括20%~85%无水乙醇，1%~10%乙酸，0.25~1%苯扎氯铵，余量为生理盐水；更优选的：30%无水乙醇，5%乙酸，0.5%苯扎氯铵，余量为生理盐水。
上述技术方案中，本申请通过进一步优化清洗液的成分，使得清洗效果更好，更有利于后续步骤中细胞的收集和分离。其中，生理盐水渗透压与细胞质内渗透压相近，有平衡渗透压作用；苯扎氯铵溶解细胞沉渣中粘液成分，乙醇能够进一步辅助苯扎氯铵溶解黏液成分，乙酸则能够破坏溶解红细胞。
优选的，所述步骤4中的预制模具为内管径为0.3~0.4cm的圆管状预制模具。
上述技术方案中，通过制备内管径为0.3~0.4cm的圆管状预制模具，能够进一步保证切出来的每张蜡片的形态一致，所含的细胞数量基本一致，保证了用于质控的核酸量稳定。
优选的，其特征在于，所述步骤5中采用全自动脱水机对细胞凝块进行固定、脱水、透明、浸蜡的处理，程序设计如下：
10％中性福尔马林溶液4h，37℃→75％酒精1.5h，37℃→85％酒精1.5h，37℃→95％酒精1.5h，37℃→95％酒精1.5h，37℃→无水酒精1h，37℃→无水酒精1h，37℃→二甲苯1h，37℃→二甲苯1h，37℃→石蜡1h，62℃→石蜡1h，62℃→石蜡1h，62℃。
上述技术方案中，本申请通过进一步优化固定、脱水、透明、浸蜡处理的条件，使得处理效果更好，更有利于后续步骤中细胞蜡块的制作和保存。其中，本申请通过中性福尔马林固定液使细胞内部的蛋白变性固定，进一步保持细胞形态；然后通过浸泡在浓度不同的梯度酒精内，把细胞内部的水分脱离出来，达到灭活或抑制细胞内部各种酶的活性，阻断核酸的降解目的，为后期实验保持足够和完整的核酸，接着本申请通过二甲苯进行透明作用，目的是把其脱水作用的酒精成分置换掉，同时调节后面石蜡的渗透作用，最后本申请通过进行石蜡浸泡，目的是让石蜡液渗透到细胞块内部，可对细胞块起到进一步的保护和支撑作用，防止后期切片过程中细胞结构或组织结构变形。
第二方面，本申请提供的一种用于NGS检测的FFPE参考品采用如下的技术方案：
一种用于NGS检测的FFPE参考品，采用第一方面所述的用于肿瘤NGS检测室内质控的FFPE参考品的制备方法制备而成。
上述技术方案中，本申请通过将用于肿瘤NGS检测室内质控的FFPE参考品的制备方法应用于NGS检测的FFPE参考品的制备中，可以制备出质量稳定、细胞分散均匀且能够长时间保存的FFPE参考品，从而为NGS检测提供稳定、可靠的室内质控标准品，提高NGS检测的准确性和可靠性。
第三方面，本申请提供的一种用于NGS检测的FFPE参考品的应用采用如下的技术方案：
一种用于NGS检测的FFPE参考品的应用，所述用于NGS检测的FFPE参考品用于肿瘤NGS检测室内质控。
上述技术方案中，本申请的用于NGS检测的FFPE参考品的制备方法简单易行，可用于大规模制备NGS检测的FFPE参考品，且制备得到的FFPE参考品稳定性好、一致性高，可用于肿瘤NGS检测室内质控，提高NGS检测结果的准确性。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
本申请使用细胞培养液为样本来源，解决了样本来源的可持续性问题，同时保证了样本细胞的质量一致性和稳定性；通过优化细胞处理A液和细胞处理B液的成分比例和添加质量比，使得细胞快速附着并形成稳定的凝胶结构，从而达到精准固定细胞并避免细胞团聚的目的；配合后续的固定、脱水等操作，保证了细胞的良好形态和内部组织结构，更好的保存了细胞内的核酸，显著提高了标准参考品的核酸含量和质量；使用该标准参考品进行质控应用时，能够准确反映NGS实验流程的稳定性和可靠性，提高实验结果的准确性。
附图说明
图1是实施例1的细胞蜡片的HE染色形态图。
图2是实施例2的细胞蜡片的HE染色形态图。
图3是实施例3的细胞蜡片的HE染色形态图。
图4是对比例1的细胞蜡片的HE染色形态图。
图5是对比例2的细胞蜡片的HE染色形态图。
图6是对比例3的细胞蜡片的HE染色形态图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
制备例1
一种细胞处理A液，由6g牛血清蛋白、4g红藻胶、0.1g防腐剂、90g 1wt%PBS缓冲液组成。
其中，防腐剂是PC950试剂。
其中，细胞处理A液的制备方法如下：将牛血清蛋白、防腐剂、1wt%PBS缓冲液混匀后，再加入红藻胶，搅拌均匀，得细胞处理A液。
制备例2
一种细胞处理A液，与制备例1不同的是，由7g牛血清蛋白、3g红藻胶、0.2g防腐剂、90g 1wt%PBS缓冲液组成。
制备例3
一种细胞处理A液，与制备例1不同的是，由6.5g牛血清蛋白、3.5g红藻胶、0.15g防腐剂、90g 1wt%PBS缓冲液组成。
制备例4
一种细胞处理B液，由10g 10wt%中性福尔马林液、4g乙酸、90g无水乙醇组成。
其中，10wt%中性福尔马林液是由甲醛（40%）100ml、纯净水900ml、磷酸氢二钠6.5g、磷酸二氢钠4.0g充分混合均匀配制而成的。
其中，细胞处理B液的制备方法如下：取配方量的10wt%中性福尔马林液、乙酸、无水乙醇混合均匀，得细胞处理B液。
制备例5
一种细胞处理B液，与制备例4不同的是，由10g 10wt%中性福尔马林液、6g乙酸、80g无水乙醇组成。
制备例6
一种细胞处理B液，与制备例4不同的是，由10g 10wt%中性福尔马林液、5g乙酸、85g无水乙醇组成。
制备例7
一种清洗液，包括生理盐水、乙醇、乙酸、苯扎氯铵。
其中，清洗液的配制方法如下：以清洗液的质量百分比计，取64.5%质量百分比的生理盐水、30%质量百分比的无水乙醇、5%质量百分比的乙酸和0.5%质量百分比的苯扎氯铵，混合均匀后，得清洗液。
对比制备例1
一种细胞处理A液，与制备例1不同的是，牛血清蛋白等量替换成红藻胶。
对比制备例2
一种细胞处理A液，与制备例1不同的是，红藻胶等量替换成牛血清蛋白。
实施例1
一种用于NGS检测的FFPE参考品的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：取5mL的HCT116细胞培养液（细胞浓度为1.0×107个/mL）和95mL的293T细胞培养液（细胞浓度为1.0×107个/mL）混匀，将混匀的细胞培养液倒入2管锥形离心管内，每管离心管倒入50ml，再放入台式高速离心机内，以2800r/min转速进行离心，离心时间为5min，离心结束后，取出离心管并弃上清液，只保留培养液沉渣。
步骤2：往含有培养液沉渣的离心管内加入清洗液，使每管离心管的总体积至15ml并混匀，使培养液沉渣溶解，把其中1管的培养液沉渣溶解液倒入另一管内，再次以2800r/min转速进行离心，离心时间为5min，离心结束后，弃上清液，只保留液体沉渣。
步骤3：往液体沉渣中加入细胞处理A液1mL，混匀，静置2min，再加入细胞处理B液15mL，溶解并混匀，再次以2800r/min转速进行离心，离心时间为5min，离心结束后，弃上清液，只保留细胞凝渣。
步骤4：把内管径0.3cm的塑料吸管剪成0.3cm高度的圆柱体状，用药匙从离心管内刮出细胞凝渣并轻压放入0.3cm高度圆柱体内进行铸型，成圆柱形的细胞凝块。
步骤5：使用全自动组织脱水机按如下程序设置对细胞凝块进行固定、脱水、透明、浸蜡处理，得到FFPE参考品。
程序设定如下：
10％中性福尔马林溶液4h，37℃→75％酒精1.5h，37℃→85％酒精1.5h，37℃→95％酒精1.5h，37℃→95％酒精1.5h，37℃→无水酒精1h，37℃→无水酒精1h，37℃→二甲苯1h，37℃→二甲苯1h，37℃→石蜡1h，62℃→石蜡1h，62℃→石蜡1h，62℃。
其中，细胞处理A液来自制备例1。
其中，细胞处理B液来自制备例4。
其中，清洗液来自制备例7。
实施例2
一种用于NGS检测的FFPE参考品的制备方法，与实施例1不同的是，包括以下步骤：
步骤1：取5mL的HCT116细胞培养液（细胞浓度为1.0×107个/mL）和95mL的293T细胞培养液（细胞浓度为1.0×107个/mL）混匀，将混匀的细胞培养液倒入2管锥形离心管内，每管离心管倒入50ml，再放入台式高速离心机内，以3000r/min转速进行离心，离心时间为5min，离心结束后，取出离心管并弃上清液，只保留培养液沉渣。
步骤2：往含有培养液沉渣的离心管内加入清洗液，使每管离心管的总体积至15ml并混匀，使培养液沉渣溶解，把其中1管的培养液沉渣溶解液倒入另一管内，再次以3000r/min转速进行离心，离心时间为8min，离心结束后，弃上清液，只保留液体沉渣。
步骤3：往液体沉渣中加入细胞处理A液1mL，混匀，静置1min，再加入细胞处理B液30mL，溶解并混匀，再次以3000r/min转速进行离心，离心时间为8min，离心结束后，弃上清液，只保留细胞凝渣。
步骤4：把内管径0.3cm的塑料吸管剪成0.3cm高度的圆柱体状，用药匙从离心管内刮出细胞凝渣并轻压放入0.3cm高度圆柱体内进行铸型，成圆柱形的细胞凝块。
步骤5：使用全自动组织脱水机按如下程序设置对细胞凝块进行固定、脱水、透明、浸蜡处理，得到FFPE参考品。
程序设定如下：
10％中性福尔马林溶液4h，37℃→75％酒精1.5h，37℃→85％酒精1.5h，37℃→95％酒精1.5h，37℃→95％酒精1.5h，37℃→无水酒精1h，37℃→无水酒精1h，37℃→二甲苯1h，37℃→二甲苯1h，37℃→石蜡1h，62℃→石蜡1h，62℃→石蜡1h，62℃。
其中，细胞处理A液来自制备例2。
其中，细胞处理B液来自制备例5。
实施例3
一种用于NGS检测的FFPE参考品的制备方法，与实施例1不同的是，包括以下步骤：
步骤1：取5mL的HCT116细胞培养液（细胞浓度为1.0×107个/mL）和95mL的293T细胞培养液（细胞浓度为1.0×107个/mL）混匀，将混匀的细胞培养液倒入2管锥形离心管内，每管离心管倒入50ml，再放入台式高速离心机内，以2900r/min转速进行离心，离心时间为7min，离心结束后，取出离心管并弃上清液，只保留培养液沉渣。
步骤2：往含有培养液沉渣的离心管内加入清洗液，使每管离心管的总体积至15ml并混匀，使培养液沉渣溶解，把其中1管的培养液沉渣溶解液倒入另一管内，再次以2900r/min转速进行离心，离心时间为7min，离心结束后，弃上清液，只保留液体沉渣。
步骤3：往液体沉渣中加入细胞处理A液1mL，混匀，静置2min，再加入细胞处理B液20mL，溶解并混匀，再次以2900r/min转速进行离心，离心时间为6min，离心结束后，弃上清液，只保留细胞凝渣。
步骤4：把内管径0.3cm的塑料吸管剪成0.3cm高度的圆柱体状，用药匙从离心管内刮出细胞凝渣并轻压放入0.3cm高度圆柱体内进行铸型，成圆柱形的细胞凝块。
步骤5：使用全自动组织脱水机按如下程序设置对细胞凝块进行固定、脱水、透明、浸蜡处理，得到FFPE参考品。
程序设定如下：
10％中性福尔马林溶液4h，37℃→75％酒精1.5h，37℃→85％酒精1.5h，37℃→95％酒精1.5h，37℃→95％酒精1.5h，37℃→无水酒精1h，37℃→无水酒精1h，37℃→二甲苯1h，37℃→二甲苯1h，37℃→石蜡1h，62℃→石蜡1h，62℃→石蜡1h，62℃。
其中，细胞处理A液来自制备例3。
其中，细胞处理B液来自制备例6。
对比例1
一种用于NGS检测的FFPE参考品的制备方法，与实施例1不同的是，细胞处理A液来自对比制备例1。
对比例2
一种用于NGS检测的FFPE参考品的制备方法，与实施例1不同的是，细胞处理A液来自对比制备例2。
对比例3
一种用于NGS检测的FFPE参考品的制备方法，与实施例1不同的是，细胞处理B液等量替换成无水乙醇溶液。
结果检测：
检测1：取上述各实施例及对比例的FFPE参考品，以4μm每片蜡片的厚度均切出120张蜡片，分别取切出的第1张蜡片、第40张蜡片、第80张蜡片和第100张蜡片做细胞蜡片的HE染色形态观察，取切出的第2张蜡片、第41张蜡片、第81张蜡片和第101张蜡片做DNA含量（ng）检测。
细胞蜡片的HE染色形态检测结果见图1-6。
切出的蜡片DNA含量（ng）见表1。
表1：
具体分析图1-6，可以看出，图1、图2、图3的细胞密集且分散均匀，细胞的边界清晰，证明图1-3的细胞保存效果完好。图4、图5的细胞稀疏且分散不均匀，有团聚，细胞含量较少且细胞形态有破坏痕迹。图6的细胞密集且分散较均匀，但是细胞形态有破坏痕迹。
具体分析表1，可以看出，实施例1-3的不同蜡片中DNA含量稳定且含量丰富，而对比例1-2的DNA含量不够稳定，不同蜡片提取出的DNA含量有一定的差别，且对比例1-2的DNA含量较少，而对比例3的DNA含量较为丰富但是含量不够稳定，不同蜡片提取出的DNA含量差别较大。
具体结合实施例1、对比例1-3分析，不难看出，实施例1的FFPE参考品在细胞形态、DNA含量稳定性方面具备一定优势，保证了用于质控的核酸量稳定，由此可见，细胞处理A液和细胞处理B液的配制对于FFPE参考品的制备具有关键作用，只有选择本申请特殊制备的细胞处理A液和细胞处理B液，并确保其在制备过程中的适当配比，才能够获得良好的细胞形态和稳定的DNA含量。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (5)
1.一种用于NGS检测的FFPE参考品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：取肿瘤细胞株的细胞培养液，离心，得培养液沉渣；
步骤2：在培养液沉渣中加入清洗液溶解、混匀后离心，得液体沉渣；
步骤3：往液体沉渣中加入细胞处理A液，混匀，静置1 ~ 2min，再加入细胞处理B液溶解、混匀后离心，得细胞凝渣；
步骤4：将细胞凝渣轻压放入预制模具中，得细胞凝块；
步骤5：对细胞凝块进行固定、脱水、透明、浸蜡处理后，得FFPE参考品；
其中，所述步骤2中的清洗液以质量百分比计，包括30%无水乙醇，5%乙酸，0.5%苯扎氯铵，余量为生理盐水；
所述细胞处理A液是牛血清蛋白、红藻胶、防腐剂、1wt%PBS缓冲液以（6~7）：（3~4）：（0.1~0.2）：90的质量比混合而成的，所述防腐剂是PC950试剂；
所述细胞处理B液由10wt%中性福尔马林液、乙酸、无水乙醇溶液以10：（4~6）：（80~90）的质量比混合而成；
所述步骤3中的细胞处理A液和细胞处理B液的添加体积比为1：（15~30）；
所述步骤1~3中，离心的条件为在2800~3000r/min转速下离心时间5~8min；
所述步骤5中采用全自动脱水机对细胞凝块进行固定、脱水、透明、浸蜡的处理，程序设计如下：
10％中性福尔马林溶液4h，37℃→75％酒精1.5h，37℃→85％酒精1.5h，37℃→95％酒精1.5h，37℃→95％酒精1.5h，37℃→无水酒精1h，37℃→无水酒精1h，37℃→二甲苯1h，37℃→二甲苯1h，37℃→石蜡1h，62℃→石蜡1h，62℃→石蜡1h，62℃。
2.根据权利要求1所述的用于NGS检测的FFPE参考品的制备方法，其特征在于，所述步骤1中细胞培养液的细胞浓度大于1.0×106个/mL。
3.根据权利要求1所述的用于NGS检测的FFPE参考品的制备方法，其特征在于，所述步骤1中培养的细胞是HCT116细胞、H1975细胞、H1650细胞、HCC4006细胞、SKMEL1细胞、HCC78细胞、293T细胞、A549细胞、AD293细胞中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的用于NGS检测的FFPE参考品的制备方法，其特征在于，所述步骤4中的预制模具为内管径为0.3~0.4cm的圆管状预制模具。
5.一种用于NGS检测的FFPE参考品，其特征在于，采用如权利要求1~4任一项所述的用于NGS检测的FFPE参考品的制备方法制备而成。
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