JP2021536255A - Ｒｎａライブラリーの構築のための方法及びキット - Google Patents

Ｒｎａライブラリーの構築のための方法及びキット Download PDF

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Abstract

ＲＮＡライブラリー構築方法及びその特化されたキットを提供する。ＲＮＡライブラリーを調製するための方法は、以下のステップ：ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；３’末端に尾部を付加するステップ；５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップを含む。本発明は、ポリＡ尾部付加及び５’末端ライゲーションを組み合わせている。システムのＲＮＡ含量は、ポリＡ尾部付加によって急速に増加し、それにより、続く精製による損失を避けることができる。【選択図】なし

Description

本出願は、ＲＮＡライブラリーの構築のための方法及びキットに関する。
ＮＩＰＴ（非侵襲的出生前検査）を含む、非侵襲的検査は、非常に古典的な技術であるだけでなく、新興分野でもある。血漿又は血清酵素検査及びＮＩＰＴは、身体的健康又は妊娠を予測するために、それぞれタンパク質及びＤＮＡのレベルで血漿／血清を解析する。しかしながら、血漿／血清ＲＮＡの適用はまだ始まったばかりであり、これは主に、ＲＮＡが不安定であり、血漿／血清ＲＮＡがほとんど小さな断片であり、その濃度が非常に低く、したがって、そのような低品質及び低濃度のＲＮＡのライブラリーの構築のための非常に優れた戦略がないためである。ＲＮＡライブラリーの構築の現在の技術は、長鎖ＲＮＡ又は短鎖ＲＮＡのみに向けられ、長鎖ＲＮＡ及び短鎖ＲＮＡ同時のライブラリーの構築のための好適な技術はなく、そのため、長鎖ＲＮＡと短鎖ＲＮＡの両方の同時研究は、それらの別々のライブラリーの構築を必要とする。
ＲＮａｓｅＨ法は、長鎖ＲＮＡのライブラリーの構築のための古典的な方法である。基本ステップは：ｒＲＮＡと逆相補性であるＤＮＡオリゴを試料とアニールするステップ、ＲＮａｓｅＨによってｒＲＮＡを除去するステップ、次いでＤＮａｓｅによってＤＮＡオリゴを除去するステップ；逆転写（一本鎖ｃＤＮＡ合成）、二本鎖合成；ギャップ充填、ｄＡの付加、アダプターライゲーション、ＰＣＲを含む。以下の問題がある；プロセスが、実行するのに非常に扱いにくく、遅く、困難であること；ＲＮＡの最初の量が高い必要があること；ＲＮＡの長い断片のみが検出できること。
Ｓｍａｌｌ ＲＮＡのライブラリー構築は、以下の基本ステップ：３’アダプターをライゲートするステップ、次いで５’アダプターをライゲートするステップ、逆転写、ＰＣＲを含む。以下の問題がある：操作が困難であり、遅く、コストがかかること；ＲＮＡの最初の量が、高い必要があること；ＲＮＡの短い断片のみが検出できること；ライブラリーの構築中に深刻なバイアスが誘導されること。
本発明は、ＲＮＡライブラリー構築方法及びその特化されたキットを提供する。
本発明は、ＲＮＡライブラリーを調製するための第１の方法（方法１）であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
３’末端に尾部（ｔａｉｌｉｎｇ、テーリング）を付加するステップ
５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法を提供する。
方法１は、好ましくは以下のステップ：
（１）ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
（４）ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
（５）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
断片化は、加熱処理によって実行される。断片化の目的は、４００ｎｔ以下のＲＮＡ断片を得ることである。ＲＩＮ＞８の場合、加熱処理は、９４℃、１０分のパラメーターを有する。５≦ＲＩＮ≦８の場合、加熱処理は、９０℃、５分のパラメーターを有する。３≦ＲＩＮ≦５の場合、加熱処理は、８０℃、５分のパラメーターを有する。ＲＩＮ＜３の場合、加熱処理は、６５℃、５分のパラメーターを有する。
３’末端に尾部を付加するステップは、以下の様式：５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変し、次いで尾部を付加することによって実行される。「５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変する」ステップは、以下の方法：Ｔ４ ＰＮＫによって処理することによって実行される。
尾部を付加するステップは、ポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部を付加するステップを指す。
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップは、以下の方法：ＲＮａｓｅＨ消化及びＤＮａｓｅ消化を連続して実施することによって実行される。
ＲＮＡを抽出するステップは、ＣｆＲＮＡを抽出するステップ又は全ＲＮＡを抽出するステップを指す。
ＲＮＡを抽出するステップで使用される試料は、限定はされないが、血漿、組織又は細胞を含む。
本発明は、ＲＮＡライブラリーを調製するための方法（方法２）であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法も保護しようとする。
方法２は、好ましくは以下のステップ：
（１）ＲＮＡを抽出するステップ；
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
（４）ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
（５）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
尾部を付加するステップは、ポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部を付加するステップを指す。
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップは、以下の方法：ＲＮａｓｅＨ消化及びＤＮａｓｅ消化を連続して実施することによって実行される。
ＲＮＡを抽出するステップは、ＣｆＲＮＡを抽出するステップ又は全ＲＮＡを抽出するステップを指す。
ＲＮＡを抽出するステップで使用される試料は、限定はされないが、血漿、組織又は細胞を含む。
本発明は、ＲＮＡライブラリーを調製するための方法（方法３）であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法も提供する。
方法３は、好ましくは以下のステップ：
（１）ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
（４）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
断片化は、加熱処理によって実行される。断片化の目的は、４００ｎｔ以下のＲＮＡ断片を得ることである。ＲＩＮ＞８の場合、加熱処理は、９４℃、１０分のパラメーターを有する。５≦ＲＩＮ≦８の場合、加熱処理は、９０℃、５分のパラメーターを有する。３≦ＲＩＮ≦５の場合、加熱処理は、８０℃、５分のパラメーターを有する。ＲＩＮ＜３の場合、加熱処理は、６５℃、５分のパラメーターを有する。
３’末端に尾部を付加するステップは、以下の様式：５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変し、次いで尾部を尾部することによって実行される。「５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変する」ステップは、以下の方法：Ｔ４ ＰＮＫによって処理することによって実行される。
尾部を付加するステップは、ポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部を付加するステップを指す。
標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップは、限定はされないが、チップ捕捉、複合ＰＣＲ、又は縮重ＰＣＲを含む方法によって実行される。
ＲＮＡを抽出するステップは、ＣｆＲＮＡを抽出するステップ又は全ＲＮＡを抽出するステップを指す。
ＲＮＡを抽出するステップで使用される試料は、限定はされないが、血漿、組織又は細胞を含む。
本発明は、ＲＮＡライブラリーを調製するための方法（方法４）であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法も保護しようとする。
方法４は、好ましくは以下のステップ：
（１）ＲＮＡを抽出するステップ；
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
（４）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
尾部を付加するステップは、ポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部を付加するステップを指す。
標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップは、限定はされないが、チップ捕捉、複合ＰＣＲ、又は縮重ＰＣＲを含む方法によって実行される。
ＲＮＡを抽出するステップは、ＣｆＲＮＡを抽出するステップ又は全ＲＮＡを抽出するステップを指す。
ＲＮＡを抽出するステップで使用される試料は、限定はされないが、血漿、組織又は細胞を含む。
前述のハイブリッドのいずれか１つは、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドである。
前述のＲＮＡのいずれか１つは、ヒトＲＮＡである。
上記のように除去されると予想されるＲＮＡは、ｒＲＮＡ及びＹ ＲＮＡである。前述のＤＮＡプローブ混合物のいずれか１つは、配列表の配列番号５〜配列番号２０８に連続して示されるように、２０４種類のプローブから構成される。
上記のように除去されると予想されるＲＮＡは、ｒＲＮＡである。前述のＤＮＡプローブ混合物のいずれか１つは、配列表の配列番号５〜配列番号１９９に連続して示されるように、１９５種類のプローブから構成される。
前述のアダプターのいずれか１つは、配列表の配列番号１に示される。
前述の逆転写のいずれか１つは、配列表の配列番号２に示されるように逆転写プライマーを使用する。
前述のＰＣＲのいずれか１つは、２つのプライマーを使用し、１つは配列表の配列番号３に示され、もう一方は配列表の配列番号４に示される。
本発明は、構成要素Ａ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット１）も保護しようとする。
本発明は、構成要素Ａ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット２）も保護しようとする。
本発明は、構成要素Ａ、構成要素Ｈ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット３）も保護しようとする。
本発明は、構成要素Ａ、構成要素Ｈ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット４）も保護しようとする。
本発明は、構成要素Ｉ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット５）も保護しようとする。
本発明は、構成要素Ｉ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット６）も保護しようとする。
構成要素Ａは、ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付加するための試薬又は試薬の組合せである。
構成要素Ｂは、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートするための試薬又は試薬の組合せである。
構成要素Ｃは、ＤＮＡプローブ混合物である。ＤＮＡプローブ混合物は、除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される。
構成要素Ｄは、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せである。
構成要素Ｅは、逆転写のための試薬又は試薬の組合せである。
構成要素Ｆは、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである。
構成要素Ｇは、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブとハイブリダイズするための試薬又は試薬の組合せである。
構成要素Ｈは、５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変するための試薬又は試薬の組合せである。
構成要素Ｉは、ＲＮＡ分子の３’末端を尾部付加及び改変するための試薬又は試薬の組合せである。
前述のキットのいずれか１つは、構成要素Ｊをさらに含む；構成要素Ｊは、ＲＮＡを抽出するための試薬又は試薬の組合せである。
構成要素Ａは、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰである。構成要素Ａは、ＲＮａｓｅＨ緩衝液、ＡＴＰ、ＲＮａｓｅ阻害剤及びポリＡポリメラーゼである。
構成要素Ｂは、アダプター及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ１である。
構成要素Ｄは、ＲＮａｓｅＨ及びＤＮａｓｅである。構成要素Ｄは、ＲＮａｓｅＨ、Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩである。構成要素Ｄは、ＲＮａｓｅＨ、Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ、ＣａＣｌ２及びＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液である。
構成要素Ｅは、逆転写プライマー及びＨｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴである。構成要素Ｅは、逆転写プライマー、ｄＮＴＰ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ＨｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ緩衝液及びＨｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴである。
構成要素Ｆは、増幅プライマー対である。構成要素Ｆは、増幅プライマー対及びＨｉＦｉ ＰＣＲ Ｍｉｘである。
構成要素Ｇは、アダプター、ＤＮＡプローブ混合物及びＴ４ ＲＮＡリガーゼ１である。構成要素Ｇは、アダプター、ＤＮＡプローブ混合物、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液、ＡＴＰ、ＰＥＧ８０００、ＲＮａｓｅ阻害剤、アルカリホスファターゼ及びＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液である。
構成要素Ｈは、Ｔ４ ＰＮＫである。
構成要素Ｉは、ポリＡポリメラーゼ、ＡＴＰ及びＴ４ＰＮＫである。構成要素Ｉは、ＲＮａｓｅ Ｈ緩衝液、ＡＴＰ、ＲＮａｓｅ阻害剤、Ｔ４ ＰＮＫ及びポリＡポリメラーゼである。
尾部を付加するステップは、ポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部を付加するステップを指す。
ＲＮＡを抽出するステップは、ＣｆＲＮＡを抽出するステップ又は全ＲＮＡを抽出するステップを指す。
ＲＮＡを抽出するステップで使用される試料は、限定はされないが、血漿、組織又は細胞を含む。
前述のハイブリッドのいずれか１つは、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドである。
前述のＲＮＡのいずれか１つは、ヒトＲＮＡである。
上記のように除去されると予想されるＲＮＡは、ｒＲＮＡ及びＹ ＲＮＡである。前述のＤＮＡプローブ混合物のいずれか１つは、配列表の配列番号５〜配列番号２０８に連続して示されるように、２０４種類のプローブから構成される。
上記のように除去されると予想されるＲＮＡは、ｒＲＮＡである。前述のＤＮＡプローブ混合物のいずれか１つは、配列表の配列番号５〜配列番号１９９に連続して示されるように、１９５種類のプローブから構成される。
前述のアダプターのいずれか１つは、配列表の配列番号１に示される。
前述の逆転写プライマーのいずれか１つは、配列表の配列番号２に示される。
前述の増幅プライマー対のいずれか１つについては、１つは配列表の配列番号３に示され、もう一方は配列表の配列番号４に示される。
本発明は、シークエンシングの前述の方法のいずれか１つの使用も保護しようとする。シークエンシングはハイスループットシークエンシングである。
本発明は、シークエンシングの前述のキットのいずれか１つの使用も保護しようとする。シークエンシングはハイスループットシークエンシングである。
本発明は、ポリＡ尾部付加及び５’末端ライゲーションを組み合わせている。システムのＲＮＡ含量は、ポリＡ尾部付加によって急速に増加し、それにより、続く精製による損失を避けることができる。特定の配列を除去することは都合がよい。断片化及び改変（Ｔ４ ＰＮＫ処理）により、全ての型のＲＮＡが同様の化学的状態に入り、同時にライブラリーへと構築され得る。
図１は、本発明によって提供される方法の概略的なフローチャートを示す図である。
以下の実施例は、本発明のより良い理解を容易にするが、本発明を限定はしない。以下の実施例の実験方法は、他に特定しない限り、従来の方法である。以下の実施例で使用する試験材料は、他に特定しない限り、従来の生化学試薬店から全て購入される。以下の実施例の定量的検査は全て、３回の反復実験を設定し、結果は平均される。
１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液、ＲＮａｓｅＨ：ＮＥＢ Ｍ０２９７Ｌ。ＲＮａｓｅ阻害剤：Ｔｈｅｒｍｏ ＥＯ０３８２。Ｔ４ ＰＮＫ：ＮＥＢ Ｍ０２０１。ポリＡポリメラーゼ：ＮＥＢ Ｍ０２７６。１０×Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ緩衝液、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１：ＮＥＢ Ｍ０２０４。実施例で使用したアルカリホスファターゼは、ＦａｓｔＡＰアルカリホスファターゼであった：Ｔｈｅｒｍｏ ＥＦ０６５１。Ｔｕｒｂｏ ＤＮａｓｅ：Ｔｈｅｒｍｏ ＡＭ２２３８。ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ：ＮＥＢ Ｍ０３０３。ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ：Ｖａｚｙｍｅ Ｎ４１１。ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ：Ｖａｚｙｍｅ Ｎ４１２。ＨｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＴ、５×ＨｉＳｃｒｉｐｔ ＩＩ緩衝液：Ｖａｚｙｍｅ Ｒ２０１。２×ＨｉＦｉ ＰＣＲ Ｍｉｘ：ＫＡＰＡ ＫＫ２６０２。Ｑｕｂｉｔ ＨＳ：Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ３２８５４。
小さなＲＮＡ断片は、１８ｎｔ〜３００ｎｔのサイズを有するＲＮＡ分子を指す（１８ｎｔと３００ｎｔを含む）。一般的な小さなＲＮＡ断片は、限定はされないが、マイクロＲＮＡ、短鎖非コードＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）を含む。
大きなＲＮＡ断片は、３００ｎｔよりも大きなサイズを有するＲＮＡ分子を指す。一般的な大きなＲＮＡ断片は、限定はされないが、ｍＲＮＡ及びＬｎｃＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）を含む。
配列表の配列番号５〜配列番号２０８では、ＲはＡ又はＧを表す。
実施例１：試料としてＣｆＲＮＡを使用してＲＮＡライブラリー（小さなＲＮＡ断片の情報を含有する）を構築する
Ｉ．ＲＮＡ抽出
ＣｆＲＮＡを、３００μＬの血漿から抽出した（ＲＮＡの量は約１２ｎｇであった）。
ＩＩ．ＲＮＡライブラリー構築
１．ポリＡ付加。
ステップＩで得たＣｆＲＮＡを取り、１４．５μＬの容積に達するまでＤＥＰＣ Ｈ２Ｏを添加し、次いで２μＬの１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液を添加し、次いで氷上に置き、次いで表１に記載の試薬を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで２μＬの４０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を添加して反応を停止させた。
Figure 2021536255
２．ｒＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション及びアダプターのライゲーション
ステップ１の完了後、システムに１μＬのＤｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ Ｍｉｘ及び０．５μＬの２０μＭ アダプターを添加し、反応させ（反応条件：９５℃で５分、次いで０．１℃／秒の速さで２２℃に冷却、次いで２２℃で５分間維持）、次いで氷上に置き、次いで表２に記載の試薬を添加し、２５℃で１時間反応させ、次いで２μＬの１Ｕ／μＬ アルカリホスファターゼ及び１３μＬのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）を添加し、次いで３７℃で１０分間反応させた。
アダプター（配列表の配列番号１）：
5'-GAACGACAUGGCUACGAUCCGACUUNNNN-3'
アダプターでは、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＵを表す。アダプターの５’末端と３’末端の両方がヒドロキシル基を有する。
Figure 2021536255
Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ Ｍｉｘはプローブ混合溶液であった（プローブ混合物は、配列表の配列番号５〜配列番号２０８に連続して示されるように、２０４種類のプローブから構成された；Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ Ｍｉｘでは、各プローブの濃度は０．５μＭであった）。プライマー混合物の各プローブは、除去されると予想されるＲＮＡ（ｒＲＮＡ及びＹ ＲＮＡ）と逆相補性であり、アニールしてＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成する。
３．除去されると予想されるＤＮＡ及びＲＮＡの除去
（１）ステップ２の完了後、システムに１μＬの５Ｕ／μＬ ＲＮａｓｅＨ及び４μＬのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで表３に記載の試薬を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置いた。
Figure 2021536255
（２）ステップ（１）の完了後、システムに精製のため７０μＬのＲＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ（１×）を添加し、精製産物を１５μＬのＤＥＰＣ水で回収し、１２．５μＬの上澄み液を新しいヌクレアーゼフリー遠心チューブに注意深くピペットした。
４．逆転写及びＰＣＲ
（１）ステップ３（２）の遠心チューブを取り、１μＬの５μＭ Ａｄ１５３Ｒ−２５ｄＴ−ＶＮを添加し、６５℃で５分間反応させ、次いで氷上に２分間置き、次いで表４に記載の試薬を添加し、次いで逆転写にかけ（逆転写プログラム：５０℃、４０分）、次いで２５μＬの３ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を添加し、十分に混合し、８５℃で１５分間反応させた。
Figure 2021536255
Ａｄ１５３Ｒ−２５ｄＴ−ＶＮ（配列表の配列番号２）：
5'-GACCGCTTGGCCTCCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'
Ａｄ１５３Ｒ−２５ｄＴ−ＶＮでは、ＶはＡ、Ｇ又はＣを表し、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。
（２）ステップ（１）の完了後、２１μＬの産物を取り、表５に記載の試薬を添加し、次いでＰＣＲ増幅にかけ（ＰＣＲ増幅反応プログラム：９４℃で３分；９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒、２０サイクル；７２℃で５分；１６℃で保存）。
Figure 2021536255
Ａｄ１５３−ＲＴ−Ｂａｒｃｏｄｅ−Ｎ（配列表の配列番号３）：
5'-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3'
Ａｄ１５３−ＲＴ−Ｂａｒｃｏｄｅ−Ｎでは、文字枠でマークした１０個の「Ｎ」は、試料バーコードであり、各試料はユニークな試料バーコードを有した。
Ｐｉ−Ａｄ１５３Ｆ−ＦＬ（配列表の配列番号４）：
5'-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3'
（３）ステップ（２）の完了後、システムに精製のため９０μＬのＤＮＡ Ｃｌｅａｎ Ｂｅａｄｓ（１．８×）を添加し、精製産物を２０μＬの１×ＴＥ溶液で回収し、それがライブラリー溶液であった。
５．ライブラリーの品質管理
ライブラリー溶液の定量は、Ｑｕｂｉｔ ＨＳで実行し、ライブラリー濃度は２ｎｇ／μＬより高いべきである。
ＩＩＩ．ハイスループットシークエンシング
複数試料のライブラリー溶液を混合し、次いでハイスループットシークエンシングにかけた。
使用した装置は、ＢＧＩ−ＳＥＱ５００ＲＳであった。
パラメーター設定は：ＳＥ３５；４プール１；他の設定はＢＧＩ−ＳＥＱ５００ＲＳ標準プロトコールであった。
低品質のリードは除去された；リードの５’末端の４塩基及び３’末端の複数の「Ａ」（最初の塩基がＡではなくなるまで）は除去された；少なくとも１５個の連続する「Ａ」を含有するリードは除去された；１７塩基を超えないリードは除去された；ｒＲＮＡアライメント及び除去が実施された；
マイクロＲＮＡ及びｐｉＲＮＡアライメントを実施し、総リード数と比較した各遺伝子のリード数を計算した。
実施例２：効果の比較
血漿試料は３０人のヒト血漿試料であった。
ＲＮＡライブラリーは、実施例１に記載の方法に従って構築し、平均ゲノムアライメント率は５８．７２％であり、平均トランスクリプトームアライメント率は３９．５９％であった。
ライブラリーは、ＲＮａｓｅＨ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖａｚｙｍｅ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／１１ｂｆ８７１ｄ−ｃ６６ｃ−４０ｃｃ−ａｄｂｅ−３１７ａ７８ａｆ２１７０．ｐｄｆ）に従って構築し、平均ゲノムアライメント率は６２．４４％であり、平均トランスクリプトームアライメント率は２６．９９％であった（ここでアライメント率は、ミトコンドリアｒＲＮＡによる人工物であり、実際のアライメント率は約３％であった）。
ライブラリーは、Ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖａｚｙｍｅ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／３２ａｂ９ｂ８９−８０７９−４９６１−ｂ５７１−ｄａｆ９６４ｃ０２ａ４６．ｐｄｆ）に従って構築し、平均ゲノムアライメント率は４．３８％であり、平均トランスクリプトームアライメント率は１．７７％であった。
ライブラリーは、ＳＭＡＲＴｅｒ（ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）Ｓｔｒａｎｄｅｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ−Ｓｅｑ Ｋｉｔ−Ｐｉｃｏ Ｉｎｐｕｔ Ｍａｍｍａｌｉａｎ）に従って構築し、平均ゲノムアライメント率は３５．１０％であり、平均トランスクリプトームアライメント率は３７．２３％であった。
実施例３：試料としてＣｆＲＮＡを使用して、ＲＮＡライブラリーを構築する（大きなＲＮＡ断片の情報と小さなＲＮＡ断片の情報の両方を含有する）
Ｉ．ＲＮＡ抽出
ＣｆＲＮＡを３００μＬの血漿から抽出した（ＲＮＡの量は約１２ｎｇであった）。
ＩＩ．ＲＮＡライブラリー構築
１．断片化、改変、及びポリＡ付加。
断片化は加熱処理によって実行した。
改変の目的は、断片化によって得られたＲＮＡ断片に、５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を形成させることであった。
ステップＩで得られたＣｆＲＮＡを取り、１４．５μＬの容積に達するまでＤＥＰＣ Ｈ２Ｏを添加し、次いで２μＬの１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液を添加し、加熱処理にかけ（ＲＩＮ＞８の場合、加熱処理は、９４℃、１０分のパラメーターを有した。５≦ＲＩＮ≦８の場合、加熱処理は、９０℃、５分のパラメーターを有した。３≦ＲＩＮ≦５の場合、加熱処理は、８０℃、５分のパラメーターを有した。ＲＩＮ＜３の場合、加熱処理は、６５℃、５分のパラメーターを有した）、次いで氷上に置き、次いで表６に記載の試薬を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで２μＬの４０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を添加して反応を停止させた。
Figure 2021536255
ステップ２〜５は、実施例１のステップＩＩのステップ２〜５と同じであった。
３．ハイスループットシークエンシング
実施例１のステップＩＩＩと同じ。
実施例４．試料として全ＲＮＡを使用してＲＮＡライブラリーを構築する
Ｉ．ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡは、組織又は細胞から抽出した。
ＩＩ．ＲＮＡライブラリー構築
１．断片化、改変、及びポリＡ付加。
断片化は加熱処理によって実行した。
改変の目的は、断片化によって得られたＲＮＡ断片に、５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を形成させることであった。
ステップＩで得られた全ＲＮＡ（約１２ｎｇ）を取り、１４．５μＬの容積に達するまでＤＥＰＣ Ｈ２Ｏを添加し、次いで２μＬの１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液を添加し、加熱処理にかけ（ＲＩＮ＞８の場合、加熱処理は、９４℃、１０分のパラメーターを有した。５≦ＲＩＮ≦８の場合、加熱処理は、９０℃、５分のパラメーターを有した。３≦ＲＩＮ≦５の場合、加熱処理は、８０℃、５分のパラメーターを有した。ＲＩＮ＜３の場合、加熱処理は、６５℃、５分のパラメーターを有した）、次いで氷上に置き、次いで表６に記載の試薬を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで２μＬの４０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を添加して反応を停止させた。
２．ｒＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション及びアダプターのライゲーション。
ステップ１の完了後、システムに１μＬのＤｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ Ｍｉｘ及び０．５μＬの２０μＭ アダプターを添加し、反応させ（反応条件：９５℃で５分、次いで０．１℃／秒の速さで２２℃に冷却、次いで２２℃で５分間維持）、次いで氷上に置き、次いで表２に記載の試薬を添加し、２５℃で１時間反応させ、次いで２μＬの１Ｕ／μＬ アルカリホスファターゼ及び１３μＬのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）を添加し、次いで３７℃で１０分間反応させた。
アダプター（配列表の配列番号１）：
5'-GAACGACAUGGCUACGAUCCGACUUNNNN-3'
アダプターでは、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＵを表す。アダプターの５’末端と３’末端の両方がヒドロキシル基を有する。
Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ Ｍｉｘはプローブ混合溶液であった（プローブ混合物は、配列表の配列番号５〜配列番号１９９に連続して示されるように、１９５種類のプローブから構成された；Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅ Ｓｅｔ Ｍｉｘでは、各プローブの濃度は０．５μＭであった）。プライマー混合物の各プローブは、除去されると予想されるＲＮＡ（ｒＲＮＡ）と逆相補性であり、アニールしてＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成した。
ステップ３〜５は、実施例１のステップＩＩのステップ３〜５と同じであった。
ＩＩＩ．ハイスループットシークエンシング
複数試料のライブラリー溶液を混合し、次いでハイスループットシークエンシングにかけた。
使用した装置は、ＢＧＩ−ＳＥＱ５００ＲＳであった。
パラメーター設定は：ＳＥ５０；４プール１；他の設定はＢＧＩ−ＳＥＱ５００ＲＳ標準プロトコールであった。
低品質のリードは除去された；リードの５’末端の４塩基及び３’末端の複数の「Ａ」（最初の塩基がＡではなくなるまで）は除去された；少なくとも１５個の連続する「Ａ」を含有するリードは除去された；１７塩基を超えないリードは除去された；ｒＲＮＡアライメント及び除去が実施された；
マイクロＲＮＡ及びｐｉＲＮＡアライメントを実施し、総リード数と比較した各遺伝子のリード数を計算した。
ＲＮＡ−ＲｅｆＳｅｑアライメントを実施し、短鎖非コードＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びＬｏｎｇ Ｎｏｎｃｏｒｄｉｎｇのアライメントを別々に実施し、ＲＰＫＭを計算した。
実施例５：試料として全ＲＮＡを使用して、ＲＮＡライブラリーを構築する
Ｉ．ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡを、組織又は細胞から抽出した。
ＩＩ．ＲＮＡライブラリー構築
１．ポリＡ付加。
ステップＩで得た全ＲＮＡ（約１２ｎｇ）を取り、１４．５μＬの容積に達するまでＤＥＰＣ Ｈ２Ｏを添加し、次いで２μＬの１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液を添加し、次いで氷上に置き、次いで表１に記載の試薬を添加し、３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで２μＬの４０ｍＭ ＥＤＴＡ水溶液を添加して反応を停止させた。
２．ｒＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション及びアダプターのライゲーション
実施例４のステップＩＩのステップ２と同じ。
ステップ３〜５は、実施例１のステップＩＩのステップ３〜５と同じであった。
ＩＩＩ．ハイスループットシークエンシング
実施例４のステップＩＩＩと同じ
実施例６：効果の比較
試料は、胎盤組織試料及びヒト不死化白血球（ＥＢウイルス法による）試料であった。
ＲＮＡライブラリーは、実施例４に記載の方法に従って構築し、胎盤組織試料のゲノムアライメント率は６６．３２％であり、マイクロＲＮＡアライメント率は０．３２％であり、ｍＲＮＡ＋ｌｎｃＲＮＡアライメント率は２７．７６％であった。
ＲＮＡライブラリーは、実施例５に記載の方法に従って構築し、胎盤組織試料のゲノムアライメント率は７９．１８％であり、マイクロＲＮＡアライメント率は２１．５４％であり、ｍＲＮＡ＋ｌｎｃＲＮＡアライメント率は９．５０％であった。
ＲＮＡライブラリーは、実施例４に記載の方法に従って構築し、ヒト不死化白血球試料のゲノムアライメント率は７３．０７％であり、マイクロＲＮＡアライメント率は０．２２％であり、ｍＲＮＡ＋ｌｎｃＲＮＡアライメント率は２８．５２％であった。
ＲＮＡライブラリーは、実施例５に記載の方法に従って構築し、ヒト不死化白血球試料のゲノムアライメント率は８６．８５％であり、マイクロＲＮＡアライメント率は２．４１％であり、ｍＲＮＡ＋ｌｎｃＲＮＡアライメント率は２０．４０％であった。
本発明は、以下の利点を有する：ライブラリー構築が高効率と高感度である；プロセスは簡略化され、大幅に加速される；非常に低コストであり、１つの反応材料は３０元以下である；操作が簡単である；カスタマイズが容易であり、モジュールは異なるニーズに合うように調整され得る；高品質のシークエンシングをもたらす；長鎖ＲＮＡ断片及び短鎖ＲＮＡ断片を同時に検出することができる。

Claims (17)

  1. ＲＮＡライブラリーを調製するための方法であって、以下のステップ：
    ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
    ３’末端に尾部を付加するステップ；
    ５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、前記ＤＮＡプローブ混合物が、除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
    ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
    逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
    を含む方法。
  2. 前記断片化が、加熱処理によって実行される、請求項１に記載の方法。
  3. ３’末端に尾部を付加する前記ステップが、以下の様式：５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変し、次いで尾部を付加することによって実行される、請求項１に記載の方法。
  4. 「５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変する」前記ステップが、以下の方法：Ｔ４ ＰＮＫによって処理することによって実行される、請求項３に記載の方法。
  5. ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去する前記ステップが、以下の方法：ＲＮａｓｅＨ消化及びＤＮａｓｅ消化を連続して実施することによって実行される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ＲＮＡライブラリーを調製するための方法であって、以下のステップ：
    ＲＮＡを抽出するステップ；
    ３’末端に尾部を付加するステップ；
    ５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、前記ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
    ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
    逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
    を含む方法。
  7. ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去する前記ステップが、以下の方法：ＲＮａｓｅＨ消化及びＤＮａｓｅ消化を連続して実施することによって実行される、請求項６に記載の方法。
  8. ＲＮＡライブラリーを調製するための方法であって、以下のステップ：
    ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
    ３’末端に尾部を付加するステップ；
    ５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
    逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
    を含む方法。
  9. ＲＮＡライブラリーを調製するための方法であって、以下のステップ：
    ＲＮＡを抽出するステップ；
    ３’末端に尾部を付加するステップ；
    ５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
    逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
    を含む方法。
  10. ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ａ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、
    構成要素Ａが、ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付加するための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｂが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートするための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｃが、除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成されるＤＮＡプローブ混合物であり；
    構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
  11. ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ａ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、
    構成要素Ａが、ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付加するための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｇが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブとハイブリダイズするための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
  12. ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ａ、構成要素Ｈ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、
    構成要素Ａが、ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付加するための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｈが、５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変するための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｂが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートするための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｃが、除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成されるＤＮＡプローブ混合物であり；
    構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
  13. ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ａ、構成要素Ｈ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、
    構成要素Ａが、ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付加するための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｈが、５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変するための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｇが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブとハイブリダイズするための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
  14. ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ｉ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、
    構成要素Ｉが、ＲＮＡ分子の３’末端を尾部付加及び改変するための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｂが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートするための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｃが、除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成されるＤＮＡプローブ混合物であり；
    構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
  15. ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ｉ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、
    構成要素Ｉが、ＲＮＡ分子の３’末端を尾部付加及び改変するための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｇが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブとハイブリダイズするための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
    構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
  16. シークエンシングにおける、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法の使用。
  17. シークエンシングにおける、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のキットの使用。
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