CN107304448B - 一种基因组目标区域测序的杂交捕获方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基因组目标区域测序的杂交捕获方法，包括引物设计合成、文库构建和杂交捕获步骤，对杂交捕获进行了优化，操作简单，孵育时间适中，能够用于多种不同来源的DNA文库，有效降低捕获成本，提高捕获效率，缩短实验时间，适合基因组目标区域的测序。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种基因组目标区域测序的杂交捕获方法。
背景技术
在二代测序中，常需要对特定基因组目标区域测序。目标区域测序，比较常用的方法利用RNA探针捕获富集感兴趣的目标基因或基因组区域的DNA片段，以提高测序的深度、准确性和灵敏度。
由于DNA捕获探针被设计成能够与靶标区域相杂交互补的性质，使得目标片段的富集依赖于核苷酸的物理及化学性质，比如二级结构、退火温度、核苷酸浓度以及GC含量及盐浓度等。
基于杂交富集的原理，通常通过提高孵育的时间来提高特异性，通常的孵育时间在10-72小时，甚至更长。而长时间的孵育明显影响测序的进程。另外，较高的孵育温度以及长时间的孵育将会影响混合液中的盐离子浓度，尤其是当杂交反应的体积较小的时候。
虽然现在很多测序公司已经能够提供商品化的杂交富集方法及相应的试剂盒，但是其杂交方法多针对于本公司所生产的探针，其捕获探针通常不公开，且试剂溶液价格昂贵。每种试剂盒的操作条件均不相同，存在较大的差异，且文库的输入量有严格要求。
因而很有必要提供一种重复性高，操作时间短，高特异性，同时能够适用多种方法构建的基因组文库及捕获探针的杂交溶液及方法。
发明内容
本发明目的在于针对现有技术中杂交富集溶液昂贵、使用有局限，提供一种用于基因组目标区域测序的杂交捕获方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基因组目标区域测序的杂交捕获方法，包括如下步骤：
(一)探针设计合成
根据基因组目标区域，以已知基因组序列为参考，以瓦片阵列的方式设计生成探针群，探针长度为100～120bp，并过滤掉高度重复探针，在探针两段加入通用引物，并合成作为探针模板，以此模板体外转录制备参入生物素标记核苷酸的探针；
(二)文库构建
按照插入片段大小为200～300bp构建DNA文库，文库浓度不低于15ng/μl；
(三)杂交捕获
1)分别配置文库混合液、杂交混合液和捕获混合液；
2)PCR仪设定如下程序：95℃，5min；65℃，3min；65℃，2min；65℃，∞；
3)放入文库混合液，开始程序第一步：95℃5min；
4)到程序第二步65℃3min时，立即将杂交混合液放入；
5)到程序第三步65℃2min时，立即将捕获混合液放入；
6)到程序第四步后，在PCR仪上，将文库混合液、杂交混合液与捕获混合液混合；
7)65度杂交36个小时；
8)用磁珠捕获步骤7)的杂交产物；
其中，文库混合液含Human cot-1、通用寡核苷酸、步骤(二)构建的文库和文库对应的blocker序列；其中，杂交混合液由SSPE、EDTA、Denharts溶液及SDS混合制成；其中，捕获混合液为含步骤(一)所述探针和RNase抑制剂的溶液。
其中，步骤(二)构建文库进行的PCR循环数不超过9次，构建文库时包括采用Ampure磁珠对打断产物纯化的步骤。
优选地，所述文库混合液的配置方法如下：在1.5mLEP管中加入：Human cot-1 5μl、500μM Universal oligo 2μl、1-8种DNA文库每个文库200ng，各DNA文库对应的blocker200μM各1μl，盖上后，用注射器针头在盖上扎3-5个孔，65℃离心真空干燥至看不见明显液滴，12000rpm离心2min，打开盖，底部加入8μl水，盖上盖，用封口膜将盖子上的孔封住，涡旋，12000，2min，并转移到PCR管。
优选地，所述杂交混合液的配置方法如下：4*SSPE 20μl、pH 8.0、0.1M EDTA0.8μl、50×Denharts 8μl、0.1％SDS 8μl。
优选地，所述捕获混合液的配置方法如下：步骤(一)所述探针5μl、RNase抑制剂1μl。
优选地，所述步骤(三)第6)步为到程序第四步后，在PCR以上，移7μl文库混合液与13μl杂交混合液至捕获混合液，上下吹吸10次。
其中，所述的blocker可选自SEQ ID NO.1-96所示的序列。
在本发明的一个实施例中，所述步骤(三)第8)步所述捕获步骤如下：
1)洗涤缓冲液1提前半小时放置到室温，洗涤缓冲液2 65℃预热1h；
2)30μl Myone C1磁珠至新的1.5ml EP管，磁力架上3min，移去上清；
3)加入200μl结合缓冲液，移液器上下吹吸10次，将磁珠重悬，磁力架上3min，去上清；
4)重复3)两边，总共洗3次；
5)加入200μl结合缓冲液，移液器上下吹吸10次；
6)将杂交产物加入到重悬好的Myone C1磁珠中，颠倒混匀3-5下，室温30min；
7)磁力架上3min，去上清；
8)加入500μl洗涤缓冲液1，移液器上下吹吸10次，将磁珠重悬，室温15min，磁力架上3min，去上清；
9)加入500μl洗涤缓冲液2，移液器上下吹吸10次，将磁珠重悬，65度10min，磁力架上3min，去上清；
10)为确保液体去净：可用小离心机甩一下，放磁力架上，用10μl移液器将残留液体洗净；
11)加入25μl的水将磁珠重悬，下一步取15μl留10μl备份；
其中，所述洗涤缓冲液1的配置方法为：20×SSC 2.8mL、10％SDS 1mL、加水补至50mL；所述洗涤缓冲液2的配置方法为：20×SSC 3mL、10％SDS 0.1mL、加水补至100mL。
发明公开的改进的杂交方法，操作简单，孵育时间适中，能够用于多种不同来源的DNA文库，有效降低捕获成本，提高捕获效率，缩短实验时间，适合基因组目标区域的测序。
附图说明
图1杂交捕获示意图。
具体实施方式
下面结合附图，详细说明本发明的实施操作，但本发明请求保护的技术方案不受限于下述实施方式，在不改变其要点的情况下，可做各种改变进行实施。
其中实施例中使用的试剂，如果没有特别说明，在满足实验要求的情况下，均购自试剂公司。
实施例中涉及的试剂及材料：
实施例1试剂配制与存储
以下试剂配制所用水均为无核酸水，所用容器也需进行去核酸酶处理后才能使用。
1)Note#1
4*SSPE(ivitrogen，15591043)，分装于1.5ml管中，保存于4度。
2)Note#2
0.1M EDTA，pH 8.0(ivitrogen，15575020)，分装于1.5ml管中，保存于4度。
3)Note#3
50*denharts(invitrogen,750018)，分装于1.5ml管中，保存于-20度。
4)Note#4
0.1％SDS(invitrogen,15553027),稀释到1×，分装于1.5ml管中，保存于4度。
5)结合缓冲液(Binding buffer)：
组成：NaCl，Tris-HCl，EDTA，pH7.5
配制：
6)洗涤缓冲液1(Wash Buffer 1)：
组成：SSC,SDS
配制：
7)洗涤缓冲液2(Wash Buffer 2)：
组成：SSC,SDS
配制：
oligo准备
用PAGE纯化方式合成以下oligo，用水将oligo干粉溶解到存储浓度，然后存于-20℃。
*：与barcode序列反向互补，见下表1
表1：blocker序列
实施例2panel的设计与定制
1.目标区域列表的生成
a)根据实验的设计,选择想要测序的区域，以hg19为参考基因组，建立目标区域列表，含染色体编号及起始点位置；
b)目标区域调整：目标区域小于220bp的，向两端延伸到220bp。
2.评估目标区域(target region)的GC含量
对于GC含量高于70％或低于30％的区域，多设计1×到2×tiling的探针设计。
3.探针的生成
a)以瓦片阵列(tiling array)方式生成长度为110bp的探针群，即按照一定的重叠程度有规律地截取基因组的序列作为探针序列(如2×tiling设计，间隔长度为55bp；3×tiling设计，间隔长度为37bp)；
b)对于GC含量高于70％或低于30％的区域，多设计1×到2×tiling的探针设计；
c)探针到目标区域末端时直接跨出区域设计。
4.过滤高度重复区的探针
参考过滤条件：所有探针blast到基因组(没加接头)，过滤掉高重复(30％match，80％indentity)的探针，repeat>15滤掉。
5.通用引物序列加入
探针的两端加上下一步用于PCR的通用引物序列，探针结构如下：
GAAGCGAGGATCAACT(N110)CATTGCGTGAACCGA。
6.芯片定制
将探针列表交由探针合成公司合成(可选择公司如CustomArray、MYcroarray等)，返回的即为洗脱下来的探针溶液。
注意事项:
1)根据Panel的大小与检测目的的不同，选择不同的tiling的探针设计，以2×至4×为佳。
2)GC含量高于70％或低于30％的区域，即使多设计1×，实际实验结果也可能欠佳。
3)内含子区域或者其他非编码区，可能重复序列较高，或GC含量较低，这些区域捕获测序效果可能欠佳。
实施例3探针的制备
本实施例介绍探针的制备、存储。本章实验所需耗材需为无核酸耗材，全程戴手套、口罩，在超净台操作。
1.探针模板制备
1)先取5μl探针原液，用10mM Tris-HCl buffer稀释到3ng/μl,，4.2μl/管分装，取一管继续下面的步骤，其余冻存于-80度；
2)按以下体系及程序，平行做2管；
反应体系：
| KAPA HIFI library amplification Kit | 25μl |
| Rev(25μM) | 1μl |
| SP6promoter(25μM) | 1μl |
| Oligo pool(稀释后) | 1μl |
| 水 | 22μl |
反应程序：
3)qubit定量：取1μl PCR产物进行qubit定量，确定2管皆有PCR产物，继续下面步骤；
注：浓度大概在10-20ng/μl，但不同panel会有差异，可在此步骤做几次重复实验，统计平均数及偏差，作为一个质控点.
4)2管合并到一起，用QIAquick PCR clean Kit纯化，用50μl水(碱性)溶；
5)Qubit定量，总量约在500ng上下；
注：不同panel会有差异，纯化后浓度约在10ng/μl
6)分装:9μl/管,分成5管，可冻存于-80度，每次使用一管，避免反复冻融。
2.体外转录
1)将试剂盒Ambion SP6Megascript kit取出；
2)按以下体系准备反应体系，平行做两管；
| 探针模板 | 4.4μl |
| ATP | 2μl |
| CTP | 2μl |
| GTP | 2μl |
| UTP | 1.6μl |
| Biotin-16-UTP | 2μl |
| 10*Reaction Buffer | 2μl |
| Enzyme mix | 2μl |
| 水 | 2μl |
| Total | 20μl |
3)37度，6小时。
注：不能过夜，时间过长会反而导致得率降低。
3.纯化
1)试剂盒：MEGAclear kit(以下Elution Solution、Wash Solution、BindingSolution是MEGAclear kit试剂盒中的带的溶液)；
2)2管合并，加60μl Elution Solution将体系补齐到100微升，轻轻混匀；
3)加入350μl Binding Solution溶液，轻轻混匀；
4)再加入250μl无水乙醇，轻轻混匀；
5)将溶液加入离心柱中，静置1分钟；
6)将140μl Elution Solution溶液加入到一个1.5ml的EP管中，再将其放入到56度水浴锅中预热；
7)将离心管用12000*g离心1分钟，弃废液；
8)向离心柱中加入500μl Wash Solution，12000*g离心1分钟，弃废液；
9)再向离心柱中加入500μl Wash Solution，12000*g离心1分钟，弃废液；
10)12000*g离心2分钟(空甩)；
11)将离心柱放入一个新的离心管中，室温静置2分钟；
12)将70μl预热过的Elution Solution加入到离心柱的中央，静置2分钟，12000*g离心2分钟；
13)再将剩余的70微升预热过的Elution Solution加入到离心柱的中央，静置2分钟，12000*g离心2分钟。
4.定量与分装
Qubit定量(使用RNA定量试剂)，浓度在60ng/μl上下；
分装
500K panel：用Elution Solution(或者无RNase水配的10mM Tris-Hcl，pH8.0)稀释到30ng/μl，60μl/管分装；
4M panel：用Elution Solution(或者无RNase水配的10mM Tris-Hcl，pH8.0)稀释到60ng/μl，60μl/管分装；
3)分装探针冻存于-80度。
实施例4文库的构建
本方案需要300ng常规DNA文库，使用的文库构建试剂盒为NEXTflexTM Rapid DNA-Seq kit(BIOO，5144-02)。
1.重要参数
起始量：500ng；
插入片段：建议插入片段为200-300bp，可使用bioruptor或者cavaris打断，打断体系为50μl；
PCR循环数：文库构建PCR的循环数不超过9；
文库浓度：最终文库浓度不得小于15ng/μl。
2.实验步骤
文库构建步骤按试剂盒说明书进行，需要调整的步骤如下：
1)为控制成本，体系可减半进行；
2)为确保文库构建的顺利进行，去除可能存在的抑制剂对后续实验的影响，先用1.8×Ampure磁珠对打断产物进行纯化，纯化步骤参考试剂盒说明书；
3)接头连接后，无需片段选择，用0.8×Ampure磁珠纯化两次；
4)最终文库溶于25μl RSB中。
注：其余试剂盒构建的文库也可，但需保证PCR的循环数不超过9，且需注意barcode的对应关系。
3.文库质量检测
1)浓度检测：Qubit定量检测，浓度须大于15ng/μl；
2)插入片段：安捷伦2100检测插入片段，插入片段须在200-300bp左右；多次重复实验，确定打断区域没有问题后，可省略此步骤。
实施例5目标区域的杂交、捕获
1.杂交
1)配制library master mix
以5个DNA文库为例说明文库混合物的配置，Universal oligo为实施例1中的通用引物Uni-oligo，DNA文库按照200ng计算加入即加入体积xμl根据文库的浓度核算。
i.在1.5mlEP管中加入：
DNA文库(5个文库混样，每个文库200ng)xμl
ii.盖上后，用注射器针头(5ml注射器)在棺盖上扎3-5个孔；
iii.65度离心真空干燥至看不见明显液滴；
iv.12000rpm，2min；
v.小心开盖，底部加入8μl水，盖上盖，用封口膜将盖子上的孔封住；
vi.涡旋，12000,2min，并转移到PCR管，标记library master mix。
注意事项：
所使用的文库构建时PCR循环数不可大于9，否则可能会引起重复率高；
所使用的文库最好是同一性质的，使用同一个SOP获得，这样可保证数据量的均衡。
2)取一新的的PCR管，加入以下体系，并标记Noteridization master mix：Note#120μl、Note#2 0.8μl、Note#3 8μl、Note#4 8μl；共计36.8μl。
3)取一新的的PCR管，加入以下体系，并标记capture baits master mix：探针5μl、RNase抑制剂1μl；共计6μl。
4)PCR仪设定程序：95℃，5min；65℃，3min；65℃，2min；65℃，∞；
5)将library master mix放进PCR仪中，开始程序第一步：95度5min；
6)到程序第二步65度3min时，立即将Noteridization master mix放入；
7)到程序第三步65度2min时，立即将capture baits master mix放入；
8)到程序第四步后，在PCR以上，移7μl of Library Master Mix与13μlNoteridization Master Mix至Capture Baits Master Mix，上下吹吸10次；
9)65度杂交36个小时。
2.捕获
1)wash buffer1提前半小时放置到室温，wash buffer2 65度预热1h；
2)30μl Myone C1磁珠至新的1.5ml EP管，磁力架上3min，移去上清；
3)加入200μl binding buffer，移液器上下吹吸10次，将磁珠重悬，磁力架上3min，去上清；
4)重复3)两边，总共洗3次；
5)加入200μl binding buffer，移液器上下吹吸10次；
6)将杂交体系(2-9)加入到重悬好的Myone C1磁珠中，颠倒混匀3-5下，rotator(翻转器)室温30min；
7)磁力架上3min，去上清；
8)加入500μl wash buffer 1，移液器上下吹吸10次，将磁珠重悬，室温15min，磁力架上3min，去上清；
9)加入500μl wash buffer 2，移液器上下吹吸10次，将磁珠重悬，65度10min，磁力架上3min，去上清；
10)为确保液体去净：可用小离心机甩一下，放磁力架上，用10μl移液器将残留液体洗净；
11)加入25μl的水将磁珠重悬，下一步取15μl留10μl备份。
3.post-PCR
反应体系：
反应程序：98℃45s；98℃20s，65℃30s，72℃40s，共16个循环；72℃4min。
取上清，用2×Ampure beads(Beckman coulter，产品agencourt ampure xp，货号A63881.)纯化，25μl Elution buffer(agencourt ampure xp自带)洗脱，预计20-30ng/μl。
实施例6不同的混样个数进行测序的结果影响
按照实施例1-5，以人的血液提取的DNA制作DNA文库，针对了20个基因来设计(ACTC1,TPM1,ACTN2,LMNA,NEXN,TNNT2,DES,TTN,DSC2,DSG2,TTR,MYBPC3,CSRP3,MYH6,MYH7,TGFB3,MYL2,ABCC9,PKP2,MYL3)，8个血样，分别对应文库编号为1-8。构建文库的试剂盒为NEXTflexTM Rapid DNA-Seq kit(BIOO，5144-02)。相应地，barcodes选择了1-8，blocker选择了1-8，探针长度110bp。按照实施例5进行杂交富集，其中，混样的个数分别选择为4个、6个以及8个，分别对应文库1-4、1-6和1-8。并进一步对得到的溶液进行测序，测序的结果如下表表2所示。
表2混样个数对测序结果的影响
从表2的结果来看，采用本申请述及的杂交富集溶液及相应的杂交方法，在多个样本进行混样的情况下，测序结果表明同样能够得到较高的目标区域覆盖度。本发明将多个样混合，进行一次杂交捕获，目标区域覆盖率同样达到极高的覆盖度，不仅能解决探针等材料的使用成本，而且降低了操作次数，节约了时间。
实施例7与进口安捷伦试剂盒捕获数据进行比对
对特定的目标区域分别采用本申请述及的杂交富集溶液及相应的杂交方法进行杂交及测序，同时采用美国安捷伦试剂盒(sureselectXT Reagent kit货号G9611A)进行杂交捕获测序，以比较本发明的溶液及方法的性能。试验对象及方法同实施例6，test2-5分别对应的是DNA文库2-5。安捷伦试剂盒按照其说明操作，试验对象同为相同的血样DNA，编号2-4。测试结果如下表表3所示。
表3：与美国安捷伦试剂盒数据对比
从表3的结果来看，采用本申请的溶液及杂交方法，对目标区域序列的覆盖达到了100％，明显优于美国安捷伦试剂盒测定的结果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种基因组目标区域测序的杂交捕获方法，其特征在于，包括如下步骤：
(一)探针设计合成
根据基因组目标区域，以已知基因组序列为参考，以瓦片阵列的方式设计生成探针群，探针长度为100～120bp，并过滤掉高度重复探针，在探针两端加入通用引物，并合成作为探针模板，以此模板体外转录制备参入生物素标记核苷酸的探针；
(二)文库构建
按照插入片段大小为200～300bp构建DNA文库，文库浓度不低于15ng/μl；
(三)杂交捕获
1)分别配置文库混合液、杂交混合液和捕获混合液；
2)PCR仪设定如下程序：95℃，5min；65℃，3min；65℃，2min；65℃，∞；
3)放入文库混合液，开始程序第一步：95℃5min；
4)到程序第二步65℃3min时，立即将杂交混合液放入；
5)到程序第三步65℃2min时，立即将捕获混合液放入；
6)到程序第四步后，在PCR仪上，将文库混合液、杂交混合液与捕获混合液混合；
7)65℃杂交36个小时；
8)用磁珠捕获步骤7)的杂交产物；
其中，文库混合液含Human cot-1、通用寡核苷酸、步骤(二)构建的文库和文库对应的blocker序列
其中，杂交混合液由SSPE、EDTA、Denharts溶液及SDS混合制成；其中，捕获混合液为含步骤(一)所述探针和RNase抑制剂的溶液；其中，杂交混合液的的具体配置为：4*SSPE 20μl、pH 8.0、0.1M EDTA0.8μl、50×Denharts 8μl、0.1％SDS 8μl。
2.根据权利要求1所述的杂交捕获方法，其特征在于，其中步骤(二)构建文库进行的PCR循环数不超过9次。
3.根据权利要求1所述的杂交捕获方法，其特征在于，所述文库混合液的配置方法如下：在1.5mLEP管中加入：Human cot-1 5μl、500μM Universal oligo 2μl、1-8种DNA文库每个文库200ng，各DNA文库对应的blocker 200μM各1μl，盖上后，用注射器针头在盖上扎3-5个孔，65℃离心真空干燥至看不见明显液滴，12000rpm离心2min，打开盖，底部加入8μl水，盖上盖，用封口膜将盖子上的孔封住，涡旋，12000，2min，并转移到PCR管。
4.根据权利要求1所述的杂交捕获方法，其特征在于，所述捕获混合液的配置方法如下：步骤(一)所述探针5μl、RNase抑制剂1μl。
5.根据权利要求1所述的杂交捕获方法，其特征在于，所述步骤(三)第6)步为到程序第四步后，在PCR以上，移7μl文库混合液与13μl杂交混合液至捕获混合液，上下吹吸10次。
6.根据权利要求1所述的杂交捕获方法，其特征在于，所述的blocker选自SEQ IDNO.1-96所示的序列。
7.根据权利要求1所述的杂交捕获方法，其特征在于，其中步骤(二)构建文库时包括采用Ampure磁珠对打断产物纯化的步骤。
8.根据权利要求1所述的杂交捕获方法，其特征在于，所述步骤(三)第8)步所述捕获步骤如下：
1)洗涤缓冲液1提前半小时放置到室温，洗涤缓冲液2 65℃预热1h；
2)30μl Myone C1磁珠至新的1.5ml EP管，磁力架上3min，移去上清；
3)加入200μl结合缓冲液，移液器上下吹吸10次，将磁珠重悬，磁力架上3min，去上清；
4)重复3)两边，总共洗3次；
5)加入200μl结合缓冲液，移液器上下吹吸10次；
6)将杂交产物加入到重悬好的Myone C1磁珠中，颠倒混匀3-5下，室温30min；
7)磁力架上3min，去上清；
8)加入500μl洗涤缓冲液1，移液器上下吹吸10次，将磁珠重悬，室温15min，磁力架上3min，去上清；
9)加入500μl洗涤缓冲液2，移液器上下吹吸10次，将磁珠重悬，65度10min，磁力架上3min，去上清；
10)为确保液体去净：可用小离心机甩一下，放磁力架上，用10μl移液器将残留液体洗净；
11)加入25μl的水将磁珠重悬，下一步取15μl留10μl备份；
其中，所述洗涤缓冲液1的配置方法为：20×SSC 2.8mL、10％SDS 1mL、加水补至50mL；所述洗涤缓冲液2的配置方法为：20×SSC 3mL、10％SDS 0.1mL、加水补至100mL。
9.权利要求1-8任一权利要求所述的方法在基因组目标区域捕获测序中的应用。
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|---|---|---|---|---|
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667254A (zh) * | 2012-09-18 | 2014-03-26 | 邵阳 | 目标基因片段的富集和检测方法 |
| CN104178478A (zh) * | 2014-08-13 | 2014-12-03 | 邵华武 | 基因组dna测序文库液相杂交诱捕富集溶液及杂交方法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103667254A (zh) * | 2012-09-18 | 2014-03-26 | 邵阳 | 目标基因片段的富集和检测方法 |
| CN104178478A (zh) * | 2014-08-13 | 2014-12-03 | 邵华武 | 基因组dna测序文库液相杂交诱捕富集溶液及杂交方法 |
| CN104789687A (zh) * | 2015-05-08 | 2015-07-22 | 上海允英医疗科技有限公司 | 用于多基因捕获测序的探针制备方法 |
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