CN114574569A

CN114574569A - 一种基于末端转移酶的基因组测序试剂盒和测序方法

Info

Publication number: CN114574569A
Application number: CN202210316214.4A
Authority: CN
Inventors: 郭国骥; 韩晓平; 王雪怡; 王昕茹; 汪仁英
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2022-03-28
Filing date: 2022-03-28
Publication date: 2022-06-03
Anticipated expiration: 2042-03-28
Also published as: CN114574569B

Abstract

本发明公开了一种基于末端转移酶的基因组测序试剂盒和测序方法，属于基因测序技术领域。所述试剂盒包括带有磁珠分子标记序列的磁珠、带有转座酶细胞标记序列的转座酶以及末端转移酶。进一步本发明还公开了相应的测序方法。本发明基于末端转移酶和分子标记磁珠的单细胞基因组测序方法，实现上亿种分子标记来标记单个细胞并扩增可及性片段进行超高通量基因组可及性测序，具有重要的应用推广价值。

Description

一种基于末端转移酶的基因组测序试剂盒和测序方法

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，具体地，涉及一种基于末端转移酶的基因组测序试剂盒和测序方法。

背景技术

近年来，在基因组测序研究中学者发现表观遗传研究需要非编码基因组元件的性能分析。而开放染色质区域的全基因组图谱恰好可以完成这一部分的功能分析。目前，高通量转座酶可及性染色质测序分析(ATAC-seq)被认为是染色质可及性全基因组分析最容易获得和最具成本效益的策略。单细胞ATAC-seq(scATAC-seq)技术也已被开发用于研究含有异质细胞群的组织样本中细胞类型特异性染色质的可及性。

ATAC-seq预先将转座酶与细胞标签序列结合，再利用转座酶识别染色质无核小体聚集的开放区域，对其进行切割产生特定长度范围的片段并将细胞标签插入至待测DNA上，从而在单细胞水平上提供染色质可接近区域的信息，并揭示细胞基因转录活跃区域。但是单靠转座酶上的细胞标签往往无法达到超高通量单细胞水平，研究者为提高细胞标签的复杂性选择组合索引的方式来扩大测序通量。例如近段时间报道的sci-ATAC-seq(Cusanovich,D.A.et al.(2018)‘A Single-Cell Atlas of In Vivo MammalianChromatin Accessibility’,Cell,174(5),pp.1309-1324.e18.)与sci3-ATAC-seq(Domcke,S.et al.(2020)‘A human cell atlas of fetal chromatin accessibility’,Science,370(6518),p.eaba7612.)，分别提供了上万和几十万细胞通量的单细胞ATAC研究，但其通量、灵敏度、细胞间污染率仍未达到理想效果。且所有上述组合标记方法的标记步骤都需要依赖T4连接酶来完成寡核苷酸连接标记，有着较大的局限性。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一种，本发明旨在提供一种基于末端转移酶和结合分子标记微珠的超高通量单细胞基因组测序试剂盒和测序方法，以能够一次性获得上百万个单细胞的染色体开放区域基因组信息，并且有超高灵敏度和超低物种间转录组交叉污染率，为了达到该目的，本发明采用以下技术方案：

本发明第一方面提供一种基于末端转移酶的基因组测序试剂盒，包括包括带有磁珠分子标记序列的磁珠，所述磁珠分子标记序列依次包括用于作为PCR扩增时的引物结合区域的通用引物序列、用于标识DNA来源的磁珠细胞标签序列、用于标识结合DNA的标记分子标签序列和第一引物结合区序列；

带有转座酶细胞标记序列的转座酶，用于在切割基因组的同时将所述转座酶细胞标记序列连接在基因片段上，所述转座酶细胞标记序列依次包括用于作为PCR扩增时的引物结合区域的连接序列、用于标记DNA来源的转座酶细胞标签序列和转座酶包埋固定序列，其中转座酶包埋固定序列为双链，其与所述转座酶连接且其中一条链与所述转座酶细胞标签序列连接，

末端转移酶，用于对所述转座酶切割的缺口处DNA的3’末端合成第二引物结合区序列，所述第二引物结合区序列与所述第一引物结合区序列互补。

在本发明的一些实施方案中，所述转座酶细胞标签序列包括至少4个随机合成的碱基，例如6个、8个、10个。优选地，为6个，如此所述转座酶细胞标签序列可以达到4⁶＝4096种不同的序列。优选地，为了方便在96孔板中进行合成，所述转座酶细胞标签序列包括96种不同的序列。

进一步地，所述所述转座酶细胞标记序列是利用具有SEQ ID No.5所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID No.5所示核苷酸序列的引物制备得到的。

在本发明的一些实施方案中，所述磁珠细胞标签序列包括至少12个随机合成的碱基。在本发明的一些具体实施方案中，所述磁珠细胞标签序列可以整段随机合成，也可以分段随机合成，若分段合成，需要在一端设置接头序列以将不同的片段连接在一起。

在本发明的一些实施方案中，所述带有磁珠分子标记序列的磁珠是在磁珠上依次添加以下分段分子标记序列组合得到的：

第一分段分子标记序列，其依次包括通用引物序列、第一分段细胞标签序列和第一接头序列；

第二分段分子标记序列，其依次包括所述第一接头序列的互补序列、第二分段细胞标签序列和第二接头序列；

第三分段分子标记序列，其依次包括所述第二接头序列的互补序列、第三分段细胞标签序列、分子标签序列和第一引物结合区。

在本发明的一些实施方案中，所述第一分段细胞标签序列、第二分段细胞标签序列、第三分段细胞标签序列分别至少包括至少4个随机合成的序列，如此每种分段细胞标签序列可以达到4⁴＝256种不同的序列。优选地，为了方便在96孔板中进行合成，每种分段细胞标签序列包括96种不同的序列。

具体的合成方法如下：将等量的磁珠分别与96种所述第一细胞标签序列偶联，然后收集获得96种带修饰的磁珠，混合均匀后，再均分为96等分，与96种所述第二细胞标签序列混合后进行PCR序列延伸，然后再均分为96等分，与96种所述第三细胞标签序列混合后进行PCR序列延伸，然后变性解链获得具有96×96×96种单链寡核苷酸修饰的磁珠。

在本发明的一些实施方案中，所述分子标签序列包括至少4个随机合成的碱基。

优选地，所述通用引物序列5'端的核苷酸的C6位上使用胺基取代羟基，用于与表面羧基包被的磁珠偶联。

在本发明中，所述试剂盒还包括酶切反应液和/或细胞核制备液。

本发明第二方面提供一种利用本发明第一方面所述的基因组测序试剂盒进行测序的方法，包括以下步骤：

S1，获得待测序细胞的细胞核；

S2，利用所述带有转座酶细胞标记序列的转座酶切割基因组开放区域片段，

S3，利用表面活性剂处理细胞核使得转座酶发生蛋白结构变化，暴露缺口；

S4，利用末端转移酶对转座酶切割的缺口处DNA的3’末端合成第二引物结合区序列，所述第二引物结合区序列与所述第一引物结合区序列互补；

S5，将处理后的细胞核以及获得的所述带有磁珠分子标记序列的磁珠依次加入到琼脂糖微孔板中，使得所述带有磁珠分子标记序列的磁珠覆盖落入孔中的细胞核，裂解孵育使得所述第一引物结合区序列和所述第二引物结合区序列结合，获得磁珠-DNA复合物；

S6，收集所述磁珠-DNA复合物，合成第二链以获得完整带有标签序列的cDNA；

S7，利用PCR扩增可及性区域，构建测序文库，进行高通量测序。

在本发明的一些实施方案中，所述带有转座酶包埋固定序列的转座酶的合成方法如下，将转座酶包埋固定序列两条链按等比例混合，置于PCR仪中95℃2min并以0.1℃/sec降温速度降至25℃使其充分结合，获得转座酶引物工作液。现转座酶与转座酶引物工作液进行共孵育后用排枪加入到96孔板中于-20℃冰箱保存。

在本发明的一些实施方案中，所述细胞核利用细胞核制备液制备。优选地，所述细胞核制备液的组分如下：0.4％IGEPAL+2mM DTT+2×蛋白酶抑制剂+5％牛血清白蛋白，DPBS配制。

在本发明的一些实施方案中，所述第一引物结合区序列为多聚T序列。相应地，利用末端转移酶对转座酶切割的缺口处DNA的3’末端合成的第二引物结合区序列为多聚A序列。由此，第一引物结合区序列能够与第二引物结合区序列互补配对，获得磁珠-DNA复合物。

在本发明的一些实施方案中，在步骤S3和S4之间，进一步包括利用外切反应降解游离标签的步骤。

在本发明的一些实施方案中，在步骤S6中，在合成第二链之前，进一步包括利用外切反应降解未捕获目的片段的磁珠序列的步骤。

在本发明中，所述琼脂糖微孔板的制备方法如下：

(1)在硅片上刻蚀出微孔作为初始模具；

(2)在所述初始模具上浇注聚二甲基硅氧烷，成型后取下成为带有微柱的反向模具；

(3)在所述反向模具上浇注加热融化的琼脂糖，冷却成型后，取下即为琼脂糖微孔板。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

本发明的试剂盒和方法涉及一种结构以进行单拷贝标记，该方法规避了现有技术依赖两种结构引物结合Tn5转座酶的双拷贝标记的ATAC测序因随机插入自由组合而产生副产物的可能，本发明大大提高了测序灵敏度。

本发明的试剂盒和方法依赖末端转移酶在转座酶形成的基因开放片段缺口合成引物结合区域，其胞内合成效率远高于现有技术依赖胞内连接和胞内修复的ATAC测序。

本发明的试剂盒和方法通过转座酶上的多种不同的寡核苷酸细胞标签，结合微珠上的百万级分子标记，能够实现上亿种分子标记来标记单个细胞，达到超高通量。

附图说明

图1示出了蜂窝排列的琼脂糖微孔板图。

图2示出了分子标记磁珠制备流程图。

图3示出了本发明实施例3单细胞基因组测序的实验流程示意图。

图4示出了本发明实施例3中人鼠混合细胞基因组开放区域捕获片段read读数(UM)的物种间交叉污染率。

图5示出了本发明与其他已发表相关测序方法的人鼠混合细胞基因组开放区域捕获片段read读数(UM)的物种间交叉污染率对比。

图6示出本发明实施例3中人293T细胞和鼠3T3细胞基因组开放区域在转录起始位点(TSS)上下游富集程度(左：人类细胞数据；右：小鼠细胞数据)

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均按照《分子克隆实验指南》(第四版)(J.萨姆布鲁克、M.R.格林，2017)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。其他实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1微孔板和分子标记磁珠的制备

1.微孔板制备

根据测序规模设计微孔板，本实施例设计的微孔板的大小为1.8cm×1.8cm，并在硅片上蚀刻出微孔作为初始模具，微孔深度45μm、微孔直径32μm、孔间距32、36或40μm。接下来在硅片上浇注聚二甲基硅氧烷(PDMS)，成型后拿下PDMS成为板上有微柱的第二次模具，最终使用的的微孔板是浓度为5％的琼脂糖(用无酶水配制)，热融后浇注在PDMS微柱板上冷凝成型，此时的琼脂糖板揭下来后就是具有一定厚度的微孔板(图1)。保存时加上对细胞无害的DPBS混合液，加盖保存在4℃冰箱中，即做即用能保证微孔板良好的工作状态。

2.分子标记磁珠制备

微珠购自苏州知益微球科技有限公司(货号MagCOOH-20190725)。表面羧基包被，直径28μm。分子标记磁珠制备过程如图2所示。

(1)设计分子标记序列，将分子标记序列分成三段，相邻两段之间设置有用于将相邻两段通过PCR连接起来的接头序列，其中5’开始的第一段包括通用引物序列和部分细胞标签序列，最后一段含有部分细胞标签序列及整个分子标签序列、多聚T尾序列，除第一段外，其余序列均为相应序列的互补序列。

具体地包括：

第一分段分子标记序列，其依次包括通用引物序列、第一分段细胞标签序列(细胞标签序列1)和第一接头序列(接头序列1)；

第二分段分子标记序列，其依次包括所述第一接头序列的互补序列(接头序列1互补)、第二分段细胞标签序列(细胞标签序列2)和第二接头序列(接头序列2)；

第三分段分子标记序列，其依次包括所述第二接头序列的互补序列(接头序列2互补)、第三分段细胞标签序列(细胞标签序列3)、分子标签序列和第一引物结合区(多聚T尾)。

各段序列如表1所示：

表1磁珠分子标记序列

(2)分别合成上述所有序列，其中所有序列中属于细胞标签序列部分均设计96种序列，每种独立放置，第一段序列5’端的核苷酸的C6位上使用胺基取代羟基。

(3)将等量的磁珠分别与96种第一段序列偶联，然后收集获得96种带修饰的磁珠，混合均匀后，再均分为96等分，与96种第二段序列混合后进行PCR序列延伸，然后再均分为96等分，与96种第三段序列混合后进行PCR序列延伸，然后变性解链获得具有96×96×96种单链寡核苷酸修饰的磁珠。这种微珠结合的寡核苷酸链分子标记序列为：5’-TTTAGGGATAACAGGGTAATAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGTnnnnnnCGACTCACTACAGGGnnnnnnTCGGTGACACGATCGnnnnnnNNNNNNTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID No.4)；其中，n表示A/T/C/G中的任一种，6n序列为随机合成的细胞标签，且对应同一磁珠的三段序列中的6n序列不同，由于每个位点有A/T/C/G4种选择，所以6n的序列可以有4⁶种选择。N表示A/T/C/G中的任一种，这种6N序列为随机合成的分子标签。

实施例2带寡核苷酸细胞标签序列的转座酶的配制和保存

(1)96种转座酶包埋接头序列保存液配制1.4μM工作液浓度保存于-80度冰箱。其序列和配制方法如下：

Tn5 primerA：5'-[pho]CTGTCTCTTATACACATCT-3'(SEQ ID No.5)，[pho]代表磷酸化修饰。该序列为转座酶包埋识别固定序列。

Tn5 primerB：

5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTnnnnnnnnnnAGATGTGTATAAGAGACAG-3’(SEQ IDNo.6)，n表示A/T/C/G中的任一种，10n为随机合成的转座酶细胞标签(细胞标签1)，有96种组合。该序列包含连接序列、转座酶细胞标签序列(有96种组合)、包埋识别固定序列(与primer A互补)。

将2μL Tn5 primerA(100μM)，2μL Tn5 primerB(100μM)混合，置于PCR仪中95℃2min并以0.1℃/sec降温速度降至25℃获得Tn5引物工作液。

(2)将Tn5裸酶(诺维赞)与Tn5引物工作液进行共孵育后用排枪加入到96孔板中于-20℃冰箱保存。

实施例3人293T、鼠3T3混合细胞测试

(1)细胞核制备和固定：小鼠胚胎干细胞(ESC)3T3和人胚肾细胞(293T)各取1000万分别利用细胞核制备液(0.4％IGEPAL CA-630+2mM DTT+2×蛋白酶抑制剂(Roche，04693132001)+5％牛血清白蛋白(DPBS配制)制备细胞核；而又利用1％甲醛固定细胞核后以甘氨酸终止固定。

(2)Tn5酶切反应：取固定后细胞核：人293T细胞核与鼠3T3细胞核1：1重悬混合，加入到预先加有酶切体系(1×酶切反应液，0.01％洋地黄皂苷，0.5×带寡核苷酸序列的Tn5转座酶工作液)的96孔板中，55℃温箱中反应30min。(4×酶切反应液：132mM Tris-HCl(pH8.0)、264μM乙酸钾、40mM乙酸镁、64％N,N-二甲基甲酰胺)反应完成后加入40mM EDTA，于37℃终止反应。

(3)细胞核SDS处理：酶切反应完成后收集细胞核，RSB+0.05％SDS室温处理细胞。

(4)外切反应：收集SDS处理后细胞，加入外切酶体系(EXON I Buffer 1×，EXON I1×)于37-55℃进行外切反应。

(5)末端转移酶(TdT)聚合反应：收集细胞核加入末端转移酶聚合反应体系(1×TdT Buffer，2.5mM CoCl₂，50uM dATP，1％TdT；Roche，03333566001)37℃温箱反应30min，加入多聚A序列。反应结束后加入50μL 40mM EDTA混匀终止。

(6)微孔板：将细胞加入到实施例1制备的微孔板中，使大于80％的微孔中落有细胞。加入20万个分子标记磁珠，混匀，达到99％以上落孔率，使用DPBS溶液洗去多余的分子标记磁珠。加入150μL裂解液(1×Blue buffer(10×Blue buffer，Vazyme N104-01-AB)，1×PCR enhancer(Vazyme，P504-d1-AE)，5％PEG8000，10μM EDTA，1％SDS，1mg/mL蛋白酶K(20mg/mL，BBI B600169-0002))孵育30min，收集分子标记微珠-DNA复合物，清洗2次。

(7)外切反应：收集微珠加入外切酶体系(EXON I Buffer 1×，EXON I 1×)置于37℃温箱反应15min，反应后微珠在磁力架上清洗3次。

(8)二链反应：收集微珠加入二链合成反应体系(1×Blue buffer，1×PCREnhancer，5％PEG8000，1mM dNTP和2.5％Klenow聚合酶)室温反应10min，37℃温箱反应15min。

(9)测序文库扩增

用PCR体系A(2×Kapa，0.4μM ATAC-F引物和0.4uM ATAC-R引物)重悬微珠，进行可及性片段扩增反应：95℃预变性5min；98℃变性30sec，60℃退火60sec，72℃延伸60sec，循环2次；98℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸60sec，循环4次；72℃延伸3min。其中ATAC-F序列和ATAC-R序列分别可与Tn5转座酶上的连接序列和分子结合微珠上的通用引物部分结合以进行扩增并使得获得的片段带有i7接头。

反应结束，转移上清用以VAHTS DNA Clean Beads(诺维赞)纯化磁珠对获得体系进行纯化，富集目的片段后；加入PCR B体系(1×Kapa，0.4uM P5-ATAC，0.4uM i7-ATAC)，进行扩增反应：95℃预变性5min；98℃变性30sec，65℃退火60sec，72℃延伸60sec，循环2次；98℃变性30sec，65℃退火30sec，72℃延伸60sec，循环8次；72℃延伸3min。其中P5-ATAC序列：可与分子结合微珠上的通用引物部分结合；i7-ATAC序列可与另一端的i7接头结合以进行扩增，并且i7-ATAC序列中含有随机合成的index，用来区分上机样品。

反应完成后，加入两轮磁珠分选纯化200-500bp文库片段，分选纯化步骤如下：

(a)第一轮加入0.5×VAHTS DNA Clean Beads(诺唯赞)纯化磁珠，充分混匀，室温孵育后利用磁力架转移上清，丢弃磁珠。

(b)第二轮加入0.5×VAHTS DNA Clean Beads(诺唯赞)纯化磁珠，充分混匀，室温孵育后利用磁力架移除上清；用新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠两次。干燥磁珠加入灭菌超纯水洗脱、混匀，室温孵育；利用磁力架获取富集目的片段的上清，-20℃保存。使用Qubit3.0荧光剂测定文库浓度。

(10)环化测序文库

使用诺唯赞公司VAHTS Circularization Kit for MGI环化试剂盒，按照说明书方法进行操作，对最终获得的环化文库使用Qubit 3.0荧光剂测定文库浓度，可取1μL文库使用Agilent 2100Bioanalyzer进行长度分布检测。剩余文库送至浙江大学医学中心DNBSEQ-T7测序平台进行DNB的制作。

(11)上机测序以及数据分析

测序文库使用DNBSEQ-T7测序平台，PE100模式，返回原始fastq数据进行质控过滤、单细胞barcodes标记及固有序列(Tn5 barcodes+ME序列+polyA)裁剪后，将Read 2中大于20bp的序列比对到人(hg19)和小鼠(mm10)的参考基因组上。若一个细胞唯一比对到人或小鼠参考基因组的片段数不足90％，则被认为是交叉污染的细胞。图4显示物种间的污染率为0.34％，明显低于其他建库平台的污染率(图5)

通过将人和鼠的细胞的reads做转录起始位点(TSS)富集分析，如图6所示，说明检测到的片段在转录开放起始区域富集程度高(左图为人细胞的TSS富集分析；右图为鼠细胞的TSS富集分析)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大学

<120> 一种基于末端转移酶的基因组测序试剂盒及测序方法

<130> XYY202210306

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Tag1

<220>

<221> misc_feature

<222> (52)..(57)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 1

actaacaata agctcuautc gtcggcagcg tcagatgtgt ataagagaca gnnnnnncga 60

ctcactacag gg 72

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Tag2

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(21)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 2

cgatcgtgtc accgannnnn nccctgtagt gagtcg 36

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Tag3

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(39)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 3

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaannn nnnnnnnnnc gatcgtgtca ccga 54

<210> 4

<211> 131

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Bead Tag

<220>

<221> misc_feature

<222> (48)..(53)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (69)..(74)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (90)..(101)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

tttagggata acagggtaat aagcagtggt atcaacgcag agtacgtnnn nnncgactca 60

ctacagggnn nnnntcggtg acacgatcgn nnnnnnnnnn nttttttttt tttttttttt 120

tttttttttt t 131

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Tn5 PrimerA

<220>

<221> modified_base

<222> (1)..(1)

<223> phosphorylation

<400> 5

ctgtctctta tacacatct 19

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Tn5 primerB

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(33)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

aagcagtggt atcaacgcag agtnnnnnnn nnnagatgtg tataagagac ag 52

Claims

1.一种基于末端转移酶的基因组测序试剂盒，其特征在于，包括带有磁珠分子标记序列的磁珠，所述磁珠分子标记序列依次包括用于作为PCR扩增时的引物结合区域的通用引物序列、用于标识DNA来源的磁珠细胞标签序列、用于标识结合DNA的标记分子标签序列和第一引物结合区序列；

带有转座酶细胞标记序列的转座酶，用于在切割基因组的同时将所述转座酶细胞标记序列连接在基因片段上，所述转座酶细胞标记序列依次包括用于作为PCR扩增时的引物结合区域的连接序列、用于标记DNA来源的转座酶细胞标签序列和转座酶包埋固定序列，其中转座酶包埋固定序列为双链，其与所述转座酶连接且其中一条链与所述转座酶细胞标签序列连接；

2.根据权利要求1所述的基因组测序试剂盒，其特征在于，所述转座酶细胞标签序列包括至少4个随机合成的碱基。

3.根据权利要求1所述的基因组测序试剂盒，其特征在于，所述转座酶细胞标记序列是利用具有SEQ ID No.5所示核苷酸序列的引物和具有SEQ ID No.5所示核苷酸序列的引物制备得到的。

4.根据权利要求1所述的基因组测序试剂盒，其特征在于，所述第一引物结合区序列为多聚T序列，相应地，利用末端转移酶合成的所述第二引物结合区序列为多聚A序列。

5.根据权利要求1所述的基因组测序试剂盒，其特征在于，所述磁珠细胞标签序列包括至少12个随机合成的碱基。

6.根据权利要求1所述的基因组测序试剂盒，其特征在于，所述带有磁珠分子标记序列的磁珠是在磁珠上依次添加以下分段分子标记序列组合得到的：

第一分段分子标记序列，其依次包括所述通用引物序列、第一分段细胞标签序列和第一接头序列；

第三分段分子标记序列，其依次包括所述第二接头序列的互补序列、第三分段细胞标签序列、所述分子标签序列和所述第一引物结合区。

7.根据权利要求6所述的基因组测序试剂盒，其特征在于，所述第一分段分子标记、所述第二分段分子标记和所述第三分段分子标记分别具有SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQID No.3所示的核苷酸序列，由此得到的磁珠上带有的所述磁珠分子标记序列具有SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求1～7任一所述的基因组测序试剂盒，其特征在于，还包括酶切反应液和/或细胞核制备液。

9.一种利用权利要求1所述试剂盒进行基因组测序的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，获得待测序细胞的细胞核；

S2，利用所述带有转座酶细胞标记序列的转座酶切割基因组开放区域片段；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖微孔板的制备方法如下：

(1)在硅片上刻蚀出微孔作为初始模具；