CN116622806A - 一种提高rna病毒检出率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种获得病毒RNA的方法，包括：去除第一核苷酸集合中的宿主rRNA，得到第二核苷酸集合；其中，所述第一核苷酸集合中包括宿主DNA、宿主rRNA和病原体RNA；所述第二核苷酸集合中包括病原体RNA；以及纯化所述第二核苷酸集合中的病原体RNA。本发明的技术方案流程简单，检测灵敏度高，RNA病原体的检测率高，对解决临床样本病毒载量低等问题，具有非常重要的参考意义。

Description

一种提高RNA病毒检出率的方法
技术领域
本发明涉及病原体检测方法，特别地涉及一种提高RNA病毒检出率的方法。
背景技术
RNA病毒在感染性疾病发生和发展中发挥了重大作用，样本中RNA病毒和有转录活性微生物的鉴定，对于辅助感染性疾病的诊断具有重要的临床意义。
传统临床微生物实验室鉴定病毒的方法主要有分离培养、免疫荧光检测和PCR分子检测等，局限性非常明显。病毒的宏转录组测序可以全面、无偏倚的检出样本中的RNA病毒，还能及时发现传统方法无法检出的新型病原体及其突变，为辅助临床决策提供更精准的参考。现有的高通量测序技术，相较于传统病毒鉴定方法，具有周期短、成本低、对操作人员的技术要求一般等优势，被越来越多的临床科室所接受。
RNA病毒宏转录组的研究领域，临床样本宿主核酸量极高，可达到106个/mL的水平，对RNA病毒的准确检测造成干扰。现有的去除宿主核酸的常规方法，是通过化学方法或者差异性裂解宿主细胞，再使用核酸酶消化宿主DNA。但是，RNA病毒在样本中以游离病原或者核酸的形式存在，病毒相对其他微生物其结构简单，易裂解而释放出核酸，释放出的核酸进一步会被宿主及其他微生物的核酸酶降解。现有技术中的宿主核酸去除方法在去除宿主核酸的同时也损失了RNA病毒，造成检测结果的假阴性；并且，对RNA病毒的测序结果往往显示出较高的人源比例，影响RNA病毒的检出率。因此，现有测序方法对临床样本中RNA病毒的检测，一般不会进行宿主核酸的去除。
发明内容
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种获得病毒RNA的方法，包括：去除第一核苷酸集合中的宿主rRNA，得到第二核苷酸集合；其中，所述第一核苷酸集合中包括宿主DNA、宿主rRNA和病原体RNA；所述第二核苷酸集合中包括病原体RNA；以及纯化所述第二核苷酸集合中的病原体RNA。
如上所述的的方法，进一步包括：去除第一核苷酸集合中的DNA，得到第一RNA集合；所述第一RNA集合中包括：宿主rRNA以及病原体RNA；富集样本总核苷酸中的所述第一RNA集合，得到经富集的第一RNA集合；去除所述经富集的第一RNA集合中的宿主rRNA，得到第二RNA集合，所述第二RNA集合中包括病原体RNA；以及纯化所述第二RNA集合中的病原体RNA。
如上所述的方法，其中，所述第二核苷酸集合中包括第二RNA集合。
如上2所述的方法，其中富集所述第一RNA集合的方法包括：使用第一磁珠富集所述第一RNA集合，所述第一磁珠的使用量为样本体积的1.6倍-2.0倍，优选为1.8倍。
如上所述的方法，进一步包括：在样本中加入rRNA探针，所述rRNA探针经配置以特异性地结合第一核苷酸集合或者第一RNA集合中的宿主rRNA而不结合病原体RNA；以及从样本中去除所述rRNA探针与所述宿主rRNA结合的复合物。
如上所述的方法，进一步包括：在样本中加入RNA酶，所述RNA酶消化与rRNA探针结合的宿主rRNA，而不消化病原体RNA。
如上所述的方法，纯化病原体RNA的方法包括：使用第二磁珠富集残余DNA和第二核苷酸集合或第二RNA集合中除病原体RNA以外的残余RNA；所述磁珠的使用量为样本体积的2.0倍-2.4倍，优选为2.2倍。
如上所述的方法，其中富集样本中的病原体RNA的方法包括：使用第三磁珠富集病原体RNA，所述第三磁珠的使用量为样本体积的2.0倍-2.4倍，优选为2.2倍。
如上所述的方法，所述样本为肺泡灌洗液、脑脊液、血液、尿液、粪便、呼吸道样本、胸水、腹水、心包液、呕吐物、脓肿组织。
如上所述的方法，所述病原体为以下RNA病毒中的一个或者多个：人正肺病毒、鼻病毒A、人偏肺病毒(hMPV)、GBV-C、人呼吸道病毒3、人副流感病毒2型、甲型流感病毒、甲型肝炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、艾滋病病毒、乙型脑炎病毒，乙型流感病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、轮状病毒、SARS病毒、MERS病毒、埃博拉病毒(Ebolavirus)、马尔堡病毒、噬菌体、新型冠状病毒(COVID-19)。
一种提高样本中RNA病毒检出率的方法，包括：提取样本核苷酸，得到第一核苷酸集合；其中所述第一核苷酸集合中包括：宿主DNA，宿主rRNA，以及病原体RNA；使用如权利要求1-10任一所述的获得病毒RNA的方法纯化病源体RNA；反转录病原体RNA，获得双链病原体cDNA；构建所述病原体cDNA文库；对所述cDNA文库测序。
如上所述的方法，进一步包括：纯化所述cDNA。
如上所述的方法，通过电泳法纯化所述cDNA，和/或加入第三磁珠纯化所述cDNA；所述第三磁珠的使用量为样本体积的2.0倍-2.4倍，优选为2.2倍。
如上所述的方法，所述cDNA文库中，双链病原体cDNA长度为300-700bp。
一种纯化样本总核苷酸中病毒RNA的试剂盒，包括：DNA酶，其经配置以去除第一核苷酸集合中的DNA，获得第一RNA集合；所述第一RNA集合中包括：宿主rRNA，以及病原体RNA；或者其经配置以去除第二核苷酸集合或者第二RNA集合中的DNA；rRNA探针，其经配置以结合第一核苷酸集合或者第一RNA集合中的宿主rRNA，而不结合病原体RNA；RNA酶，其经配置以去除与rRNA探针结合的宿主rRNA而不去除病原体RNA；RNA磁珠，其经配置以富集所述第一RNA集合和/或反向富集去除宿主rRNA后的病源体RNA；所述RNA磁珠包括：第一磁珠和/或第二磁珠。
一种提高样本中RNA病毒检出率的试剂盒，包括：DNA酶，其经配置以去除第一核苷酸集合中的DNA，获得第一RNA集合；所述第一RNA集合中包括：宿主rRNA，以及病原体RNA；或者其经配置以去除第二核苷酸集合或者第二RNA集合中的DNA；rRNA探针，其经配置以结合第一核苷酸集合或者第一RNA集合中的宿主rRNA，而不结合病原体RNA；RNA酶，其经配置以去除与rRNA探针结合的宿主rRNA而不去除病原体RNA；RNA磁珠，其经配置以富集所述第一RNA集合和/或反向富集去除宿主rRNA后的病源体RNA；所述RNA磁珠包括：第一磁珠和/或第二磁珠。
如上任一所述的获得病毒RNA的方法，或者如上所述的提高样本中RNA病毒检出率的方法在检测样本中RNA病原体方面的应用。
本发明与现有检测方法相比较，其优点在于：
适用但不限于人和动物脑脊液、血液、肺泡灌洗液、脓肿组织等样本宏转录组检测；
经过优化后的宿主核酸去除流程，无裂解宿主细胞的步骤，最大程度减少了RNA病毒的降解；特定体系的消化步骤，进一步减少了用于病原体鉴定的RNA中的宿主残留，测序结果中人源比例显著降低。提高了检测灵敏度，有利于RNA病毒的检出。
成功的将rRNA去除步骤与文库构建的流程衔接，获得了可用于上机测序的标准文库，并成功进行了已知病原体的鉴定；经过流程详细参数优化，构建了一套特定的包含人rRNA去除的文库制备流程；测序结果中样本的人源比例极显著降低、有效微生物读长数及病原体检出的读长数，显著提高。
本发明针采用反向富集法获得目标病原体的核酸，有效提高了RNA病毒宏转录组检测的灵敏度，对解决临床样本病毒载量低等问题，具有非常重要的参考意义。
附图说明
下面，将结合附图对本发明的优选实施方式进行进一步详细的说明，其中：
图1是根据本发明一个实施例的提高RNA病毒检出的优化后流程示意图；
图2是根据本发明一个实施例的去除样本DNA后测序结果中人源核苷酸比例；
图3是根据本发明一个实施例的去除样本DNA后测序结果中微生物核苷酸比例；
图4是根据本发明一个实施例的去除样本rRNA后测序结果中人源核苷酸比例；以及
图5是根据本发明一个实施例的去除样本rRNA后测序结果中人源核苷酸比例。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在以下的详细描述中，可以参看作为本申请一部分用来说明本申请的特定实施例的各个说明书附图。在附图中，相似的附图标记在不同图式中描述大体上类似的组件。本申请的各个特定实施例在以下进行了足够详细的描述，使得具备本领域相关知识和技术的普通技术人员能够实施本申请的技术方案。应当理解，还可以利用其它实施例或者对本申请的实施例进行结构、逻辑或者电性的改变。
本申请中所说的名词具有以下含义：
本文所述“rRNA”是指核糖体RNA，是细胞内含量最多的一类RNA，也是3类RNA(tRNA，mRNA，rRNA)中相对分子质量最大的一类RNA，rRNA占RNA总量的82％左右。在本申请中，rRNA为样本中病原体宿主的rRNA，其为宿主RNA的主要成分。在一些实施例中，rRNA、人源RNA、人RNA均为宿主RNA。
本文所述“样本”是指从可能被病原体感染的宿主体内获得的待检测的样本。其中包含宿主核苷酸，并可能包含病原体核苷酸。在一些实施例中，所述样本可以是肺泡灌洗液、脑脊液、血液、尿液、粪便、呼吸道样本、胸水、腹水、心包液、呕吐物、脓肿组织等。其中，呼吸道样本包括但不限于鼻拭子、咽拭子、痰液等。在一些实施例中，宿主可以为人、非人动物等。进一步地，非人可以为哺乳动物，如猫、狗、荷兰猪等宠物，也可以为小鼠、大鼠等，还可以为食蟹猴、黑猩猩等灵长类动物。
本文所述“病原体”是指可能感染宿主的病原体。在一些实施例中，病原体为RNA病原体。在一些实施例中，病原体包括但不限于：人正肺病毒、鼻病毒A、人偏肺病毒(hMPV)、GBV-C、人呼吸道病毒3、人副流感病毒2型、甲型流感病毒、甲型肝炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、艾滋病病毒、乙型脑炎病毒，乙型流感病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、轮状病毒、SARS病毒、MERS病毒、埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒、噬菌体、新型冠状病毒(COVID-19)等。
本文所述“参考品”是指样本中待检出的病原体，该病原体可以为被感染的阳性样本中的病原体，也可以为为进行试验而人为添加至阴性样本中的病原体。
本文所述“优化流程”、“优化后流程”在本申请中是指在检测样本中RNA病毒之前，提取样本的核苷酸后先去除其中的DNA和rRNA，然后再对剩余的RNA纯化、反转录以及测序等，以确定病原体种属等。与之对应的“对照流程”则在检测样本中RNA病毒之前，提取样本的核苷酸后，直接对核苷酸反转录、测序等，而不经过DNA和rRNA的去除。
本文所述“上机”、“下机”中的机指用于病原体RNA检测的仪器。在一些实施例中，该机是指测序仪。其中，在一些实施例中，上机是指将制备好的病原体cDNA文库进行测序和碱基读取。在一些实施例中，下机是指上机获得的测序和碱基读取结果生成的序列文件，该序列文件可用于生物信息学分析，以获取病原体检测结果。
本文所述“第一核苷酸集合”是指总的样本核苷酸。在本申请中，第一核苷酸集合为在样本中提取的核苷酸的集合。在一些实施例中，样本中包含宿主和病原体的核苷酸；第一核苷酸集合中包括但不限于宿主DNA、宿主rRNA、宿主tRNA、宿主mRNA、病原体RNA。
本文所述“第二核苷酸集合”是指在第一核苷酸集合的基础上，去除宿主rRNA，并且选择性的去除了宿主DNA后的核苷酸的集合。在一些实施例中，第二核苷酸集合中包括但不限于病原体RNA、宿主rRNA、宿主tRNA、宿主mRNA。在一些实施例中，第二核苷酸集合中还包括宿主DNA。
本文所述“第一RNA集合”是指在样本中提取的核苷酸中所包含的所有RNA，包括但不限于宿主rRNA、宿主tRNA、宿主mRNA、病原体RNA。在一些实施例中，第一RNA集合是指在第一核苷酸集合的基础上，通过实验去除其中的DNA后的剩余的RNA的集合。
本文所述“第二RNA集合”是指在第一RNA集合的基础上，进一步去除宿主rRNA后的RNA的集合。在一些实施例中，第二RNA集合中包括但不限于宿主rRNA、宿主tRNA、宿主mRNA、病原体RNA。在一些实施例中，第二核苷酸集合中包括第二RNA集合。
本文所述“磁珠”是指表面标记了某种官能团，能同核苷酸发生吸附反应的物质。在一些实施例中，磁珠使用量常用乘数“×”进行标识，或者使用倍数表示磁珠的体积，表示相对于原始样本体积而言使用多少倍体积的磁珠。在一些实施例中，如样本原始体积为100μl，1倍磁珠或者1×纯化时磁珠使用体积为1×100μl＝100μl。在一些实施例中，为实现本申请的病原体RNA的纯化或者病原体的检测，引入第一磁珠、第二磁珠和/或第三磁珠。
本文所述“第一磁珠”是指获取第一核苷酸集合后，对其进行DNA消除，并富集体系中剩余的第一RNA集合时所用磁珠。在一些实施例中，第一磁珠的使用量为样本体积的1.6倍-2.0倍，优选为1.8倍。也就是说，如果第一核苷酸集合所在样本的体积为50μl时，第一磁珠使用量为1.6×-2.0×或者1.6倍-2.0倍时，第一磁珠的使用体积为80-100μL。当第一磁珠使用量为1.8×或者1.8倍时，第一磁珠的使用体积即为90μl。
本文所述“第二磁珠”是指用于去除第二核苷酸集合或者第二RNA集合中，非病原体RNA的成分的磁珠。在一些实施例中，第二磁珠用于去除残余DNA和第二核苷酸集合或第二RNA集合中除病原体RNA以外的残余RNA。在一些实施例中，第二磁珠的使用量为样本体积的2.0×-2.4×或者2.0倍-2.4倍。优选为2.2×或者2.2倍。也就是说，如果第二核苷酸集合或者第二RNA集合所在样本的体积为50μl时，第二磁珠使用量为2.0×-2.4×或者2.0倍-2.4倍时，第二磁珠的使用体积为100-120μL。当第二磁珠使用量为2.2×或者2.2倍时，第二磁珠的使用体积即为110μl。
本文所述“第三磁珠”是指用于富集第二核苷酸集合或者第二RNA集合中的病原体RNA的磁珠。在一些实施例中，第三磁珠的使用量为样本体积的2.0×-2.4×或者2.0倍-2.4倍。优选为2.2×或者2.2倍。也就是说，如果第三核苷酸集合或者第二RNA集合所在样本的体积为50μl时，第三磁珠使用量为2.0×-2.4×或者2.0倍-2.4倍时，第三珠的使用体积为100-120μL。当第三磁珠使用量为2.2×或者2.2倍时，第三磁珠的使用体积即为110μl。本领域技术人员由本说明书所披露的内容，在没有背离本发明的精神下根据具体实例的不同进行分析路径的选择、调整和具体参数的调试都属于本发明的保护范围。
本文所述“种序列数”在本申请中是指在病原体检测中，尤其对病原体cDNA测序过程中，检测到该病原体的特异性序列读长，种序列数越多表示检测准确度越高。
本文所述“深度”在本申请中是指在病原体检测中，尤其对病原体cDNA测序过程中，比对到已知参考序列的碱基平均测序次数，如30倍的测序深度意味着每个碱基平均被测了30次。在本申请中，深度越高，检出物种的可信度越高。
本文所述“RPM(Micro)-ratio”中，RPM在本申请中是一种标化的序列数，表示每百万序列中比对到目标物种基因组的序列条数；RPM(Micro)-ratio在本申请中指检测病原体RPM/背景RPM。在本申请中，RPM(Micro)-ratio用来进行特异性物种的阈值判断，其值越高越好。
本文所述“覆盖范围”在本申请中是指在病原体检测中，尤其对病原体cDNA测序过程中，测序获得的序列占整个基因组的比例，其中，覆盖范围的值越高，表明病原体检测的结果越可信。
发明人发现，在临床样本中往往病毒的载量很低。使用宏转录组测序法检测RNA病毒的感染，会出现RNA病毒读长检测不到或者检测到的数量非常少的情况，因此，对RNA病毒及其核酸进行富集就很有必要。
富集目标核酸的常见方法为T重复寡核苷酸正向富集mRNA和去除核糖体RNA(rRNA)两种方法。目前市面上基于不同方法去除样本中人rRNA的试剂有很多，而应用于病原体检测的成品试剂则很少，其难点在于如何成功的将rRNA的去除步骤整合进文库制备的流程中，实现建库、测序并分析的检验流程。
RNA病毒宏转录组分析需进行RNA提取，要求RNA纯度高，需严格去除DNA污染。临床样本的人源极高。即使高通量测序湿实验经样本前处理、核酸提取及纯化后，仍会有不同程度宿主DNA的残留，影响RNA病毒的检测。
临床样本中rRNA的含量高，基因检测的实验流程一般不进行rRNA的去除，共同造成了RNA病毒的检出率低。将rRNA去除操作与测序文库制备等步骤衔接的实验流程，具有较高的技术要求。
临床样本的宏转录组数据分析时，常常99％以上的为宿主序列，获得的可分类微生物数据中还有大量的rRNA数据，使得可用于进行RNA病毒鉴定的数据就非常少，RNA病毒宏转录组测序的灵敏度很低。为了提高RNA病毒的检出率就需要提高测序量，导致测序成本的升高，不利于宏转录组的临床应用。
为提高RNA病毒的检出率，本申请提出了新的RNA病毒核苷酸纯化方法。在一些实施例中，RNA病毒核苷酸的纯化过程为：将提取的病原微生物的总核酸洗脱在含有DNA酶I的工作液中，并进行孵育以去除残留的宿主DNA，然后再对病毒RNA进行纯化回收。这样的处理方式使宿主的核酸在建库之前有了彻底的去除。在一些实施例中，本发明优化的核酸纯化流程能够彻底去除宿主的核酸，在湿实验步骤即对目标核酸进行了富集，与后续生物信息学分析的作用叠加，提高了RNA病毒的检出率。
进一步地，在一些实施例中，RNA病毒核苷酸的纯化过程为：对总RNA中人rRNA进行去除，并构建可用于测序的文库，该流程为去除RNA中的人rRNA，反向富集病毒核酸，使得有效RNA的比例显著提高，之后进行常规的双链cDNA合成，并基于转座酶法构建可用于测序的文库，经特定的生信分析流程后，成功检出目标病原体。结果显示，相比于未经优化的流程，显著提高了RNA病毒检出的读长数。
图1是根据本发明一个实施例的提高RNA病毒检出的优化后流程示意图。如图1所示，根据本发明的一个实施例，基于测序方法提高临床样本中RNA病毒检出率的方法，具体的步骤如下：
1.采集临床患者样本
临床患者的样本：新鲜样品或-80℃冻存样品。肺泡灌洗液、痰液等需要加液化剂，均一化样本后进行第二步处理或1小时之内-80℃冻存。
2.DNA酶消化，总RNA提取
总RNA的提取使用病原体DNA&RNA共提试剂盒。本实施例中采用赛默飞世尔科技(中国)有限公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒，直接提取样本中病原体的核酸。本申请不限定提取RNA的试剂盒。在一些实施例中，RNA洗脱体积≥15μL，优选35～50μL。
3.残留宿主DNA去除，RNA纯化：在本申请中，采用如下体系进行残留宿主的DNA去除：
混匀后，室温放置5～15分钟，纯化回收RNA。优选的DNA酶添加量在5～20U，可实现对应临床样本残留DNA的有效去除。在一些实施例中，更进一步的RNA的纯化，使用诺唯赞RNA磁珠回收纯化后的RNA，此回收方法仅为本申请的一个实施例，而不代表本申请的保护范围，本申请不对RNA纯化的方法进行限定。
4.宿主源rRNA去除
采用探针法去除人源rRNA，包括杂交捕获步骤和特异性核酸酶处理步骤，根据本申请的一个实施例，可采用诺唯赞公司的Ribo-off rRNA去除试剂盒，反向富集目标RNA。在一些实施例中，rRNA的去除还可通过CRISPR/Cas9系统，将rRNA剪切后，通过磁珠等方法富集病毒RNA。本申请不限定去除rRNA的方法。使用无核酶水将0.1-1ug RNA稀释至11uL。
1)RNA样品与探针杂交：
95℃，2min；95～22℃，0.1℃/sec；22℃5min；
2)加入RNase H消除DNA-rRNA杂合链的rRNA：
37℃，15～30min,4℃保存。
3)DNA酶I消化：加入DNA酶I消化DNA，此处DNA还包括剩余的cDNA链以及引物)：
反应程序：37℃，15～30min，4℃保存。
4)病原体RNA纯化
取上述反应得到的产物用110μL RNA Clean XP磁珠进行纯化，得到产物溶液。产物溶液中含有反向富集的目标RNA，方法包括：
5.一般反转录反应：将模板、逆转录buffer和随机引物加入到PCR管中混匀，50℃～68℃温浴3～8分钟后，冰上孵育1～3分钟。瞬时离心加入逆转录酶mix，混匀后在25～30℃下孵育10分钟，40-50℃孵育15～30分钟，80℃下孵育5秒～5分钟使反应失活，4℃冷却。
6.cDNA第二链的合成：逆转录合成的cDNA产物10μL～50μL，在冰上加入二链合成试剂，在16℃～37℃下孵育10分钟～30分钟，4℃～10℃冷却。
7.双链cDNA纯化：使用DNA Clean XP磁珠进行产物的纯化，用无核酸酶水15～30μL进行洗脱。
8.文库构建
使用转座子建库试剂盒(DNA Library Prep Kit for Illumina，诺唯赞)进行文库构建，按照说明书操作，纯化后的文库用生物分析仪进行验证，文库在300-700bp之间。
9.高通量测序和生物信息学分析
用贝瑞公司Nextseq CN500测序仪进行深度测序，测序方式为SE75，SE150，PE150等，优选SE75。
在一些实施例中，样本去宿主DNA步骤中，样本含有大量的宿主DNA和RNA，RNA病毒的丰度低，只占极少的一部分。本领域技术人员应当了解，由于宿主DNA和RNA的干扰，得到的测序数据中只有极小的一部分能够用于物种的鉴定。另外，提取的核酸浓度高，也影响后续DNA酶的投入量，更重要的在RNA中残留的DNA会影响rRNA的去除，耗费建库底物，甚至占用大量的测序数据量，最终影响RNA病毒的检出率。因此，在一些实施例中，发明人在核酸提取步骤即对宿主核酸去除，宿主核酸去除方法包括但不限于：1.宿主核酸游离+降解；2.宿主DNA直接消化；3.在提取病原体的总核酸过程中进行DNA消化；4.提取病原体的总核酸，在获得病原体DNA和/或RNA之后，进行宿主DNA消化。根据本申请的一个实施例，优选采用策略4。
在一些实施例中，在动物总RNA样本中去除rRNA的方法包括但不限于：
(1)Poly(A)调取法，真核生物中mRNA均具有Poly(A)尾巴结构，利用Poly(T)对真核生物的mRNA进行富集可以间接去除rRNA；
(2)利用带有链霉亲和素基团的磁珠结合rRNA-DNA探针(生物素基团标记)杂交产物，从而在总RNA中去除rRNA；
(3)利用RNase H酶特异性降解rRNA-DNA探针杂交双链中的rRNA。
其中方法(3)的探针对人/鼠两个物种的整个rRNA序列进行覆盖，可达到对rRNA理想的去除效果，性价比高。在本申请中，优选使用方法(3)对样本中的rRNA进行去除。
在一些实施例中，本申请逆转录的一链合成采用NEB公司一链合成模块，二链合成采用申请人自制的二链合成模块。本领域技术人员应当了解，已有多种市售试剂盒可实现RNA的逆转录。本申请不对逆转录中使用的试剂、逆转录方法限定。
在一些实施例中，本申请的文库构建方法包括：使用诺唯赞试剂盒DNA文库PrepKit V2 for Illumina进行片段化，并在片段化好的DNA片段两端加上特定的接头。
在本申请中，定量，质检，获得DNA文库的方法包括：在片段选择中先使用上述纯化产物的0.7倍体积的磁珠去除大片段，再用对于上述纯化产物的0.15倍体积的磁珠去除小片段，最终得到最适的文库片段长度，文库平均长度在325bp左右。
在本申请中，不限定测序方法。本申请的上机测序，对下机数据进行分析包括：数据经过去人源、去除低质量和复杂度低的序列后，用Kraken快速分类软件对序列病原体注释，并报出可能的致病病原体。
在一些情况下，临床RNA样本获取有限，可同步选用细胞培养的病毒质控品掺入阴性的临床样本中，进行实验流程的优化。
在本申请中，为实现本申请的实施例，涉及的仪器包括：天根全自动核酸提取仪、生物安全柜、震荡金属浴、PCR仪、磁力架、Qubit4.0等。
在本申请中，为实现本申请的实施例，涉及的试剂包括：核酸提取试剂盒、去宿主试剂、Ribo-off rRNA Depletion kit(Human/Mouse/Rat)、反转录和二链cDNA合成试剂、文库构建试剂、AMPure XP纯化磁珠、Qubit检测试剂、测序芯片等。
下文将通过一个具体的实施例对本申请方案进行进一步阐述。
实施例1：高效去除样本残留DNA的流程筛选：
通过对阴性临床样本中掺入RNA参考品：人正肺病毒、甲型流感病毒、人呼吸道病毒3等，浓度为250-2000拷贝/mL。再对该模拟样本进行宿主核酸去除，筛选出能较好的去除残留的宿主DNA的流程。
设置两种实验组合分别为：组合1吸附了核酸的提取磁珠，在含有DNase I的溶液中消化DNA；组合2提取完的病原体核酸，加入含有DNase I的溶液，然后使用RNA纯化磁珠回收。
组合1流程：取200～400μL样本，加入265～530μL病毒结合缓冲液，5～10μL蛋白酶K，彻底混匀后，金属浴56℃孵育10分钟，转入加有核酸提取试剂的深孔板，其中在洗涤步骤之后增加DNase I的消化，经80％乙醇漂洗，目标核酸洗脱在无核酶水中。
组合2流程：取200～400μL样本，加入265～530μL病毒结合缓冲液，5～10μL蛋白酶K，彻底混匀后，金属浴56℃孵育10分钟，转入加有核酸提取试剂的深孔板，目标核酸转入DNase I工作液，室温消化10～15分钟，加入RNA磁珠回收RNA.
实验结果如下：
表1：两个组合获得RNA中残留DNA的量
其中，阳性对照为qPCR体系中用于指示反应体系正常工作的参考标记。
表2：参考品检出的读长数
其中，上述样本1-3为肺泡灌洗液、4-6为脑脊液、7为阳性对照。在本实施例中，阳性对照用于指示反应体系的正常工作，本申请不对阳性对照中的病原体种类进行限定，可以指示检出参考品的反应体系正常即可。
qPCR定量纯化核酸中人管家基因β-actin的结果：组合2去除残留DNA更彻底。图2为根据本申请一个实施例的去除样本DNA后测序结果中人源核苷酸比例；图3为根据本申请一个实施例的去除样本DNA后测序结果中微生物核苷酸比例。测序方法分析样本中的人源核苷酸比例，组合2与组合1相比，人源核苷酸比例更少，降低20％左右；同时微生物核苷酸比例升高10％。表2显示组合2与组合1相比，对于参考品检出的读长数提高了2～10倍以上。
综上：针对RNA病毒，本发明优选组合2的方法，进行临床样本中残留DNA的去除，即提取的病原体总核酸中加入DNase I后，回收RNA，优选的DNase I的使用量为5～20U，可实现对应临床样本中DNA的有效去除。
实施例2：总RNA中rRNA去除对RNA病毒检出效率的影响
提取的病毒RNA中，除了目标核酸，还含有残留的宿主、其他病原的DNA及人源RNA(rRNA)，若不对这部分进行去除，其会随目标核酸反转录、参与建库流程、最终占用测序空间，影响RNA病毒的检出率；但同时，去除rRNA流程也会去除部分RNA病毒，影响RNA病毒的载量和检出，所以实际检测过程如何对获得的总RNA中人rRNA去除、以及去除程度等都会影响最终检测结果。
本实施例的目的是：根据实施例1中的核酸纯化流程(组合1)，使用阴性临床样本中掺入RNA病毒参考品，测试rRNA去除流程对提高病毒检出率的效果。模拟样本的制备以及掺入的参考品的拷贝数与实施例1相同。在一些实施例中，rRNA去除可使用诺唯赞公司的Ribo-off rRNA去除试剂盒。结果如下：
表3测序结果中rRNA比例对比
表4去除/不去rRNA流程对掺入参考品检出的读长数对比
其中，对照为不去除rRNA的样本。上述样本8-9为肺泡灌洗液，10-11为脑脊液。
结果显示，阴性样本掺入参考品分别做去除人rRNA处理和不去rRNA处理，之后都使用相同的流程进行反转录和建库，从测序结果看，不去rRNA样本参考品的检出读长数在个位数水平，而经过rRNA去除步骤，rRNA在测序结果中占比减少了2％～38％，RNA病毒的检出读长数提高了2～84倍。图4为根据本申请一个实施例的去除样本rRNA后测序结果中人源核苷酸比例；图5为根据本申请一个实施例的去除样本rRNA后测序结果中人源核苷酸比例。如图所示，去除样本中人rRNA后，人源核苷酸比例显著降低，同时微生物核苷酸比例显著提高。
综上，总RNA经去除rRNA后再进行反转录和建库，对于降低测序结果中rRNA的比例以及提高病原体的检出率上，效果显著。
实施例3：宿主rRNA去除试剂筛选
调研市场上rRNA去除效果较好的厂家，最终确定基于探针法的两个不同厂家的成品试剂盒，进行对比，由于其原理相同，因此使用模拟样本对其检测效果进行平行对比。实验流程为阴性的脑脊液和肺泡灌洗液中掺入RNA病毒的参考品，人副流感病毒2型、人正肺病毒和甲型流感病毒。结果如下表：
表5rRNA试剂厂家筛选
其中，试剂盒1与试剂盒2的主要区别在于：二者的反应原理不同，具体为：
试剂盒1的反应原理为：探针杂交+链霉亲和素磁珠法。即采用生物素标记的DNA探针与总RNA中高丰度的rRNA液相杂交，形成RNA-DNA探针复合物；然后采用链霉亲和素标记的磁珠，结合液相中的RNA-DNA探针复合物及多余探针；分离磁珠和液相，液相上清中剩余的RNA即为去除rRNA及多余探针后的目标RNA。
但该方法的缺点为样本起始量高，rRNA残留量较高，操作复杂，这些因素都会影响rRNA去除效率。
试剂盒2的反应原理为：探针杂交+RNA酶H消化法。即采用特异的DNA探针与总RNA中高丰度的rRNA液相杂交，形成RNA-DNA探针复合物；RNase H针对性的消化RNA-DNA探针复合物上的RNA单链，而未与探针杂交的rRNA不受影响；采用DNsse消化剩余的探针，纯化回收未被消化的rRNA等目标核酸。
与试剂盒1相比，该方法的优点为样本起始量低，rRNA残留量更低，操作相对简单，更适合于微量样本的rRNA去除，在RNA病原体核的检测中，其rRNA的去除效果优于试剂盒1。
综上：试剂盒2的rRNA去除试剂盒整体效果较好，宿主核苷酸比例降低显著，病原体检出读长明显增多。在一些实施例中，选择试剂盒2的rRNA去除试剂盒完成本申请的临床样本的检测。
实施例4：临床样本检测
经过实施例1、2、3的摸索，确定本发明的实验流程，以下结果仅为最优方案的结果展示，不能作为发明范围的限制。基于以上搭建的提高RNA病毒检出率的宏转录组实验流程，测试经测序验证为RNA病毒阳性的临床样本。实验流程具体如下：取200～400μL，实施上述组合2的去除残留宿主DNA的流程，之后使用实施例2的方法进行人rRNA去除处理，使用回收的RNA进行常规反转录以及文库构建、并测序分析，结果如下表：
表6两个流程病原体检出对比(其余肺泡灌洗液)
其中，对照流程为不进行样本中DNA和rRNA去除的流程。优化流程为既去除样本中DNA，也去除rRNA的流程。如表6结果显示，阳性样本经优化流程的检测，病毒检出的读长数提高1.2～29.3倍，性能大幅提升。
表7不同病原体的下机数据分析
表7为不同病原体的下机数据分析结果。如表7所示，使用本申请的优化流程纯化病原体RNA后，检出种序列数，深度，RPM(Micro)-ratio，覆盖范围等指标都较对照流程有所提高；其中，种序列数最多可提高到优化前的30倍。由此可知，使用优化流程纯化病原体RNA后，病原体的检出准确度和可信度均优于使用对照流程。本申请的优化流程更有助于微量RNA病原体的检出，可提高检测灵敏度。
上述实施例仅供说明本发明之用，而并非是对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此，所有等同的技术方案也应属于本发明公开的范畴。

Claims (17)

1.一种获得病毒RNA的方法，包括：
去除第一核苷酸集合中的宿主rRNA，得到第二核苷酸集合；其中，所述第一核苷酸集合中包括宿主DNA、宿主rRNA和病原体RNA；所述第二核苷酸集合中包括病原体RNA；以及
纯化所述第二核苷酸集合中的病原体RNA。
2.根据权利要求1所述的的方法，进一步包括：
去除第一核苷酸集合中的DNA，得到第一RNA集合；所述第一RNA集合中包括：宿主rRNA以及病原体RNA；
富集样本总核苷酸中的所述第一RNA集合，得到经富集的第一RNA集合；
去除所述经富集的第一RNA集合中的宿主rRNA，得到第二RNA集合，所述第二RNA集合中包括病原体RNA；以及
纯化所述第二RNA集合中的病原体RNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二核苷酸集合中包括第二RNA集合。
4.根据权利要求2所述的方法，其中富集所述第一RNA集合的方法包括：使用第一磁珠富集所述第一RNA集合，所述第一磁珠的使用量为样本体积的1.6倍-2.0倍，优选为1.8倍。
5.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括：
在样本中加入rRNA探针，所述rRNA探针经配置以特异性地结合第一核苷酸集合或者第一RNA集合中的宿主rRNA而不结合病原体RNA；以及
从样本中去除所述rRNA探针与所述宿主rRNA结合的复合物。
6.根据权利要求5所述的方法，进一步包括：在样本中加入RNA酶，所述RNA酶消化与rRNA探针结合的宿主rRNA，而不消化病原体RNA。
7.根据权利要求1或2所述的方法，纯化病原体RNA的方法包括：使用第二磁珠富集残余DNA和第二核苷酸集合或第二RNA集合中除病原体RNA以外的残余RNA；所述第二磁珠的使用量为样本体积的2.0倍-2.4倍，优选为2.2倍。
8.根据权利要求7所述的方法，其中富集样本中的病原体RNA的方法包括：使用第三磁珠富集病原体RNA，所述第三磁珠的使用量为样本体积的2.0倍-2.4倍，优选为2.2倍。
9.根据权利要求1所述的方法，所述样本为肺泡灌洗液、脑脊液、血液、尿液、粪便、呼吸道样本、胸水、腹水、心包液、呕吐物、脓肿组织。
10.根据权利要求1所述的方法，所述病原体为以下RNA病毒中的一个或者多个：人正肺病毒、鼻病毒A、人偏肺病毒(hMPV)、GBV-C、人呼吸道病毒3、人副流感病毒2型、甲型流感病毒、甲型肝炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、艾滋病病毒、乙型脑炎病毒，乙型流感病毒、鼻病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、登革热病毒、轮状病毒、SARS病毒、MERS病毒、埃博拉病毒(Ebola virus)、马尔堡病毒、噬菌体、新型冠状病毒(COVID-19)。
11.一种提高样本中RNA病毒检出率的方法，包括：
提取样本核苷酸，得到第一核苷酸集合；其中所述第一核苷酸集合中包括：宿主DNA，宿主rRNA，以及病原体RNA；
使用如权利要求1-10任一所述的获得病毒RNA的方法纯化病源体RNA；
反转录病原体RNA，获得双链病原体cDNA；
构建所述病原体cDNA文库；
对所述cDNA文库测序。
12.根据权利要求11所述的方法，进一步包括：纯化所述cDNA。
13.根据权利要求12所述的方法，通过电泳法纯化所述cDNA，和/或加入第三磁珠纯化所述cDNA；所述第三磁珠的使用量为样本体积的2.0倍-2.4倍，优选为2.2倍。
14.根据权利要求11所述的方法，所述cDNA文库中，双链病原体cDNA长度为300-700bp。
15.一种纯化样本总核苷酸中病毒RNA的试剂盒，包括：
DNA酶，其经配置以去除第一核苷酸集合中的DNA，获得第一RNA集合；所述第一RNA集合中包括：宿主rRNA，以及病原体RNA；或者其经配置以去除第二核苷酸集合或者第二RNA集合中的DNA；
rRNA探针，其经配置以结合第一核苷酸集合或者第一RNA集合中的宿主rRNA，而不结合病原体RNA；
RNA酶，其经配置以去除与rRNA探针结合的宿主rRNA而不去除病原体RNA；
RNA磁珠，其经配置以富集所述第一RNA集合和/或反向富集去除宿主rRNA后的病源体RNA；所述RNA磁珠包括：第一磁珠和/或第二磁珠。
16.一种提高样本中RNA病毒检出率的试剂盒，包括：
DNA酶，其经配置以去除第一核苷酸集合中的DNA，获得第一RNA集合；所述第一RNA集合中包括：宿主rRNA，以及病原体RNA；或者其经配置以去除第二核苷酸集合或者第二RNA集合中的DNA；
rRNA探针，其经配置以结合第一核苷酸集合或者第一RNA集合中的宿主rRNA，而不结合病原体RNA；
RNA酶，其经配置以去除与rRNA探针结合的宿主rRNA而不去除病原体RNA；
RNA磁珠，其经配置以富集所述第一RNA集合和/或反向富集去除宿主rRNA后的病源体RNA；所述RNA磁珠包括：第一磁珠和/或第二磁珠。
17.如权利要求1-10任一所述的获得病毒RNA的方法，或者如权利要求11-14所述的提高样本中RNA病毒检出率的方法在检测样本中RNA病原体方面的应用。
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