CN118056911A - 一种检测探针的捕获效率的方法 - Google Patents
一种检测探针的捕获效率的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118056911A CN118056911A CN202211443676.9A CN202211443676A CN118056911A CN 118056911 A CN118056911 A CN 118056911A CN 202211443676 A CN202211443676 A CN 202211443676A CN 118056911 A CN118056911 A CN 118056911A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- library
- dna
- capturing
- sample
- capture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 63
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims abstract description 27
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 23
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 17
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 36
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 28
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 14
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 11
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 3
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- -1 DNA Chemical class 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 238000007630 basic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000018528 secretion by tissue Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001926 trapping method Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本公开内容涉及一种检测探针的捕获效率的方法,所述方法包括以下步骤:1)使用来源于生物样品的DNA构建文库;2)用探针及磁珠捕获文库,且随后不进行扩增;3)将捕获后的文库从结合的磁珠上分离下来;和4)通过定量PCR对捕获前后的文库进行定量,从而得出捕获效率。本公开内容还涉及一种用于检测探针的捕获效率的试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于高通量基因测序领域,具体而言,本发明涉及一种检测二代测序(NGS)中探针的捕获效率的方法以及试剂盒。
背景技术
高通量测序技术又称下一代测序技术(NGS),可以一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。NGS技术以超高的测序通量、规模和速度革新了生物科学的发展,使科学家得以前所未有的方式进行广泛而深入的生物学系统和应用研究。NGS技术用于确定全基因组或目标区域DNA的核苷酸排列顺序。相比于全基因组测序,靶向区域测序仅测定基因组上临床治疗指导相关或感兴趣的区域,更加高效经济,因而在肿瘤用药指导,筛查等应用领域得以普及。
聚合酶链式反应(即PCR)是一种广泛运用于分子遗传和诊断的技术,可以分析样品中低浓度的DNA序列。
探针捕获建库法是指制备带有化学标记的DNA或RNA寡聚体与目标DNA片段进行特异性氢键结合并将结合区域富集的一种建库方法。目标序列捕获是根据目标基因组序列,设计与之完全互补的探针。然后将样本DNA片段化,加上用于测序的接头后与探针杂交,洗脱去除未杂交上的DNA,回收目标DNA片段,再经过PCR扩增后进行DNA测序。磁捕法是基于生物素和链霉亲和素的特异结合以及碱基互补原理,将生物素标记的特异寡核苷酸探针与目标序列杂交,再利用生物素与链霉亲和素特异结合,将探针结合至包被链霉亲和素的磁珠上,并利用磁力架收集,经低盐缓冲液洗涤,去除蛋白质、非靶核苷酸等杂质,最终得到纯化的特异性核酸分子。磁捕法中采用的液相杂交的优势在于杂交效率更高,易于操作,时间短,便于自动化操作。
对于探针捕获法的二代测序(NGS)而言,杂交前后的模板捕获效率是很重要的一个指标。但是这个指标目前没有合适的实验方法来直接测量。现有指标是通过NGS建库后的中靶率(on target rate)来评估探针捕获目标分子的特异性,但是这个指标无法评估杂交前后分子回收率,而分子回收率是杂交捕获试剂盒比较重要的一个性能方面。因此,需要建立一种方法来评估杂交体系的捕获效率,进而优化杂交体系性能。
发明内容
本申请建立了一种直接测量杂交前后捕获效率(Capture efficiency)的方法。该方法的建立能够很好的衡量杂交体系中探针对模板的杂交捕获效率,从而评估杂交体系的性能,以便于对杂交体系进行优化。
相对于现有技术的间接或定性检测比如中靶率(on target rate),本申请首创性地直接定量测量二代测序中探针杂交前后的捕获效率,这将极大有助于杂交方法的比较以及优化。
在此基础上,本发明提供了一种检测探针的捕获效率的方法;用于检测探针的捕获效率的试剂盒;以及定量PCR反应体系在制备用于所述方法的试剂盒中的用途。
在第一方面,提供了一种检测探针的捕获效率的方法,所述方法包括以下步骤:
1)使用来源于生物样品的DNA构建文库;
2)用探针和磁珠捕获文库,且随后不进行扩增;
3)将捕获后的文库从结合的磁珠上分离下来;和
4)通过定量PCR对捕获前后的文库进行定量,从而得出捕获效率。
在一些实施方案中,所述DNA为超声打断DNA、酶切打断DNA或cfDNA。
在一些实施方案中,所述生物样品为体液样品或组织样品。
在一些实施方案中,所述生物样品为石蜡包埋样品,优选FFPE样品。
在一些实施方案中,所述磁珠为M270磁珠。
在一些实施方案中,步骤3)包括:将捕获后尚未扩增的文库置于92-98 ℃加热3-10 min ,优选95℃加热5min;加热完成后立即置于冰上;然后使用磁力架在冰上分离磁珠,获取上清液作为分离的捕获后的文库。
在一些实施方案中,所述步骤4)包括:对于标准品绘制反映DNA浓度与Ct值关系的标准曲线;然后基于生物样品在捕获前后的Ct值确定DNA浓度或捕获产量,并依据panel大小和基因组大小,计算捕获效率。
在一些实施方案中,如下计算捕获效率:捕获效率=(捕获总量/投入量)/((panel大小/人类基因组大小)/中靶率),其中投入量是指步骤1)所构建的DNA文库的量,捕获总量为步骤3)捕获后从结合的磁珠上分离下来的文库的量。
在一些实施方案中,所述定量PCR的反应体系包含:
Taq聚合酶;
缓冲液;
引物和探针的混合液;
不含核酸酶的水;和
DNA模板。
在第二方面,提供了一种用于检测探针的捕获效率的试剂盒,所述试剂盒包含定量PCR反应体系和使用说明,其中所述定量PCR反应体系包含:
Taq聚合酶;
缓冲液;
引物和探针的混合液;
不含核酸酶的水;和
DNA模板。
在第三方面,提供了一种定量PCR反应体系在制备试剂盒中的用途,所述试剂盒用于第一方面所述的方法中,所述反应体系包含:
Taq聚合酶;
缓冲液;
引物和探针的混合液;
不含核酸酶的水;和
DNA模板。
下列描述和实施例详细阐述了本发明的实施方案。要理解的是,本发明不限于本文所述的具体实施方案并因此可改动。本领域技术人员将认识的是,存在本发明的许多变动和修改,所述变动和修改均包含在其范围之内。
附图说明
图1A (P5端)和图1B (P7端)为通过qPCR对梯度稀释的标准品进行扩增所得到的扩增曲线(一般方法的建立),其中曲线A、B、C、D、E和F分别代表10-4、10-5、10-6、10-7、10-8的浓度和NTC(无模板对照)。
图2A (P5端)和图2B (P7端)为图1A和图1B对应的标准曲线(一般方法的建立)。
图3A (P5端)和图3B (P7端)为对捕获后文库进行去磁珠处理前后,qPCR体系扩增效果的图示,其中曲线A、B和C分别代表NTC(无模板对照)、处理前和处理后的qPCR结果。
图4A (P5端)和图4B (P7端)为在实际使用中,通过qPCR反应扩增标准品所得的扩增曲线,其中曲线A、B、C、D、E和F分别代表10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8的浓度。
图5A (P5端)和图5B (P7端)为图4A和图4B对应的标准曲线。
具体实施方式
本文所用的术语仅以描述具体的实施方案为目的而不意图限制本发明。除非上下文另有明确指示,否则本文所用的单数形式“一”、“一个”和“所述”也意图包括复数形式。此外,开放式的表述“包括”和“包含”解释为还可以含有没有述及的结构组成部分或方法步骤,但需要注意的是,该开放式的表述也涵盖仅由所述的组分和方法步骤组成的情形(即涵盖了封闭式表述“由……组成”的情形)。
如全文所用,范围用作描述该范围内的每个数值和所有数值的简写形式。范围内的任何数值例如整数值、以增量10递增的值(当范围的端值为10的倍数时)或以十分之一递增的值(当范围的端值为小数点后一位时)都可选做该范围的终点。例如,范围150 bp-5 kb用作描述该范围内的所有数值,例如150 bp、160 bp、170 bp、180 bp、190 bp、200 bp、210bp、220 bp……4950 bp、4960 bp、4970 bp、4980 bp、4990 bp和5000 bp (以10 bp递增的值),并且包括所有子范围,例如200-4000 bp、300-3000 bp、400-2000 bp、500-1000 bp、600-1500 bp等。
本说明书中提及的所有科学技术术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义,在冲突的情况下以本说明书中的定义为准。
本文所述的术语“高通量测序”又可以称为下一代测序技术(Next GenerationSequencing, NGS)、大规模平行测序(Massively Parallel Sequencing,MPS),是指采用“边合成边测序”的原理、对于几十万到几百万DNA分子同时进行平行的测序反应,然后通过生物信息学分析所得到的原始图像数据或电化学信号、最终得到待测样品的核酸序列或拷贝数等信息的测序技术。高通量测序的基本程序是将待测DNA随机打断成小片段,经末端修复、连接接头序列、PCR等步骤进行文库构建,最后使用Illumina,Ion Torrent等测序仪进行测序。
本文所述的术语“生物样品”意指包含核酸或多肽的生物组织或体液的样品。此类样品通常来自人类,但包括从非人灵长类或啮齿类(例如小鼠和大鼠)分离的组织。生物样品还可以包括组织分泌物,诸如活检和尸检样品、为组织学目的而获取的冷冻切片、脑脊髓液、血液、血浆、血清、痰、粪便、泪液、粘液、毛发、皮肤等。生物样品还包括外植体和/或来源于患者组织的原代和/或转化的细胞培养物。“生物样品”也指来自动物的一个细胞或细胞群或一定量的组织或体液。最常见的是,生物样品已从动物移除,但术语“生物样品”还可以指在体内分析的细胞或组织,即,不从动物移除。通常,“生物样品”将含有来自动物的细胞,但该术语还可以指可用于测量多核苷酸或多肽的表达水平的非细胞生物材料,诸如血液的非细胞成分、血清、唾液、脑脊髓液或尿液。许多类型的生物样品可用于本发明,包括但不限于组织活检或血液样品。
可用于本发明的DNA可来源于各种来源,例如直接抽提自生物样品或由RNA反转录制备。从样品中抽提核酸例如DNA的方法是本领域众所周知的,例如可用苯酚和氯仿进行DNA抽提,或者使用市售DNA抽提试剂进行提取。
在一些实施方案中,所述DNA为抽提的DNA。DNA的抽提可采用本领域已知的任何方法进行,例如采用Qiagen试剂或Promega试剂。
在一些实施方案中,所述生物样品为体液样品或组织样品,优选所述样品选自活组织检查样品、肿瘤组织样品、细胞培养物、经固化处理的样品(如石蜡包埋样品例如FFPE样品)、全血、血浆、血清、唾液、脑髓液、汗液、痰、肺泡灌洗液、尿液、粪便、分泌液、乳汁和腹膜液等等。
在一些实施方案中,所述生物样品为石蜡包埋样品例如FFPE样品。
本文所述的中靶率(on-target rate)是NGS的参数(%),用来表示测序数据中有多少能够比对到目标区域上。在基因组上有许多与靶序列有同源性的部分,在实际工作中,这些并不属于目标的部分在杂交过程中也会被捕获下来。这种探针捕获到非目标区域片段的情况称为脱靶(off target)。脱靶的数据是无效的,不能用于后续分析。同等情况下,中靶率越高,由于脱靶产生的浪费越少,说明捕获探针越好,因而可用于评估探针质量。但中靶率并不能完全反映捕获过程中的捕获效率,且必须通过测序获得,耗费时间且成本高,不利于快速评估探针。
本发明的方法中所提及的“捕获效率”如下得到:对于标准品绘制反映DNA浓度与Ct值关系的标准曲线;然后基于生物样品在捕获前后的Ct值确定DNA浓度或捕获产量,并依据panel大小和基因组大小等信息,从而得出捕获效率。该方法可以直接得出捕获前后模板量的变化情况,从而评估出探针的捕获效率;且定量PCR快速、灵敏、成本低廉。因此,该方法的建立能够很好的衡量杂交体系中探针对模板的杂交捕获效率,从而评估杂交体系的性能,以便于对杂交体系进行优化。
在一些实施方案中,提供了一种检测探针的捕获效率的方法,所述方法包括以下步骤:
1)使用来源于生物样品的DNA例如cfDNA构建文库;
2)用探针和磁珠捕获文库,且随后不进行扩增;
3)将捕获后的文库从结合的磁珠上分离下来;和
4)对于标准品绘制反映DNA浓度与Ct值关系的标准曲线;然后基于生物样品在捕获前后的Ct值确定DNA浓度或捕获产量,并依据panel大小和基因组大小,计算捕获效率。
在一些实施方案中,步骤3)包括:将捕获后尚未扩增的文库置于92-98 ℃加热3-10 min ,优选95℃加热5min;加热完成后立即置于冰上;然后使用磁力架在冰上分离磁珠,获取上清液作为分离的捕获后的文库。
在一些实施方案中,所述定量PCR的反应体系包含:Taq聚合酶;缓冲液;引物和探针的混合液例如20x ddPCR Quantification Assay;不含核酸酶的水;和DNA模板。
在一些实施方案中,捕获效率可如下计算:捕获效率=(捕获总量/投入量)/((panel大小/人类基因组大小)/中靶率),其中投入量是指所构建的DNA文库的量,捕获总量是指捕获后从结合的磁珠上分离下来的文库的量。
虽然上文已描述了本发明的各种实施方案,但是应理解的是,其仅以实例的方式提供,而并非限制。对公开的实施方案的许多改变可依照本文的公开内容来进行,而不会背离本发明的精神或范围。因此,本发明的广度和范围不应受到任何上述的实施方案所限制。
本文提及的所有文献都通过引用结合到本文中。本申请引用的所有出版物和专利文件都为所有目的而通过引用结合,引用程度如同单独地指出各个出版物或专利文件一样。
实施例
实施例1:一般方法的建立
标准品的构建:使用梯度稀释的文库,建立标准品,用于后续的标准曲线绘制。采用10ng cfDNA构建文库,按Qubit测定浓度取200ng构建好的文库,稀释后总体积为20uL,即文库浓度10ng/uL,记为10-1。后续按照10倍稀释(10ul样本加90ul IDTE)至10-8。
标准品的验证:使用ddPCR™ Library Quantification Kit for IlluminaTruSeq对梯度稀释的标准品进行拷贝数确认。ddPCR反应体系如下表1所示。
表1
按照反应总数配制反应混合液并分装至八连管中,分别加入10-6、10-7、10-8三个浓度梯度的样本,每个梯度做三个重复(参见下表2)。
表2
标准曲线的绘制:使用此梯度稀释的标准品(10-4-10-8)作为模板,进行qPCR扩增并绘制标准曲线。使用的qPCR体系如下表3所示。
表3
试剂 | 体积(ul) |
缓冲液:10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, pH8.3@25℃ | 7.2 |
热启动Taq聚合酶 | 1.2 |
20x ddPCR Quantification Assay | 1 |
不含核酸酶的水 | 9.6 |
DNA模板 | 1 |
注:酶和缓冲液均可以使用市售的热启动Taq聚合酶(具有5’-3’聚合酶活性及外切酶活性)和对应的缓冲液进行替换。
反应程序如下表4所示。
表4
注:热盖设置105℃,体积设置20uL,荧光通道FAM和HEX(或VIC)。
通过qPCR反应,可以得到图1A (P5)和图1B (P7)的梯度扩增图。以各通道的Ct值(x轴)和稀释倍数(y轴),绘制对应通道的标准曲线,如图2A (P5标准曲线)和图2B (P7标准曲线)所示。在本发明中,P5和P7是同一个文库两端的接头,目前的测定针对两个接头各设计一组引物探针,在得出最终的捕获效率时,将两端的结果取平均值。
以上两个标准曲线均展现出良好的线性关系,且斜率较为一致,证明P5和P7的引物扩增效率接近,且这批标准品可以较好的对文库进行定量。
磁珠与文库分离方法的建立:使用10ng cfDNA构建文库。构建完成的文库使用标准流程进行捕获,捕获后的文库不进行最终的扩增步骤。将捕获后的文库从结合的M270磁珠上分离下来,分离方法为:取5ul捕获后尚未扩增的文库置于95℃加热5min,结束后立即置于冰上。使用磁力架在冰上分离磁珠,取上清进行后续实验。对于处理前后的文库情况,使用qPCR进行验证,使用的qPCR体系如下表5所示。
表5
试剂 | 体积(ul) |
缓冲液:10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2, pH8.3@25℃ | 7.2 |
热启动Taq聚合酶 | 1.2 |
20x ddPCR Quantification Assay (ddPCR™ Library Quantification Kit for Illumina TruSeq) | 1 |
不含核酸酶的水 | 9.6 |
DNA模板 | 1 |
注:酶和缓冲液均可以使用市售的热启动Taq聚合酶(具有5’-3’聚合酶活性及外切酶活性)和对应的缓冲液进行替换。
反应程序如下表6所示。
表6
注:热盖设置105℃,体积设置20uL,荧光通道FAM和HEX(或VIC)。
qPCR结果如图3A-B所示。从结果来看,分离磁珠前后,Ct值没有发生明显变化,但终点荧光值明显提高,便于后续检测。
实施例2:应用实例
文库的构建和定量:获取cfDNA样本,采用xGen Prism DNA Library Prep Kit,平行建立4个cfDNA文库,每个使用10ng cfDNA。用Qubit测定浓度,如下表7所示。
表7
DNA文库样本名称 | DNA文库浓度(ng/ul) |
Lib-1 | 90.6 |
Lib-2 | 91.6 |
Lib-3 | 98.8 |
Lib-4 | 104 |
文库捕获及磁珠分离:每个文库各取500ng,混合成为文库pool,进行捕获。捕获采用IDT xGen Hybridization and Wash Kit,文库杂交捕获后洗涤,但不进行最后的扩增步骤。取5ul此时的文库置于95℃加热5min,结束后立即置于冰上。使用磁力架在冰上分离M270磁珠,取上清用于后续的qPCR定量。
按照上述比例,配制qPCR体系,分别扩增标准品及捕获后文库样品,标准品扩增曲线及标准曲线分别如图4和图5所示,其中图4A为P5扩增曲线,图4B为P7扩增曲线;图5A为P5标准曲线,图5B为P7标准曲线。
样本的扩增结果如下表8所概述,其中目标基因组合(panel)大小为300Kb,中靶率为70%左右。
表8
靶标 | 荧光 | 淬灭 | Ct | 等效稀释倍数(对数) | 捕获后浓度(ng/ul) | 捕获总量(ng) | 捕获效率 |
P5 | VIC | NFQ-MGB | 15.48 | -3.87 | 0.0135 | 0.270 | 94.5% |
P7 | FAM | NFQ-MGB | 15.56 | -3.87 | 0.0134 | 0.268 | 93.8% |
从而可以利用扩增的Ct值确定捕获产量,进而得出捕获效率。捕获效率计算方式为:对于P5靶标组,将Ct值代入到标准曲线图中的拟合公式里,算出等效稀释倍数。由于标曲梯度稀释的时候的起始浓度为100ng/ul,即捕获后浓度=100*10^(-3.87)=0.0135ng/ul。捕获总量=捕获后浓度*20ul=0.270ng,捕获效率=(捕获总量/投入量)/((panel大小/人类基因组大小)/中靶率)=(0.270/2000)/((300kb/3G)/70%)=94.5%。类似地,可以计算P7靶标组的捕获效率为93.8%。
如以上实施例所证明的,本申请成功建立了一种直接测量杂交前后捕获效率的方法。该方法的建立能够很好的衡量杂交体系中探针对模板的杂交捕获效率,从而评估杂交体系的性能,以便于对杂交体系进行优化。因此,本发明方法的可以作为评估杂交效率的指标来评估杂交体系的性能,进而优化或改进杂交体系。
虽然上文已描述了本发明的各种实施方案,但是应理解的是,其仅以实例的方式提供,而并非限制。在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种检测探针的捕获效率的方法,所述方法包括以下步骤:
1)使用来源于生物样品的DNA构建文库;
2)用探针和磁珠捕获文库,且随后不进行扩增;
3)将捕获后的文库从结合的磁珠上分离下来;和
4)通过定量PCR对捕获前后的文库进行定量,从而得出捕获效率。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述DNA为超声打断DNA、酶切打断DNA或cfDNA。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述生物样品为体液样品或组织样品。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述生物样品为石蜡包埋样品,优选FFPE样品。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述磁珠为M270磁珠。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中步骤3)包括:将捕获后尚未扩增的文库置于92-98℃加热3-10min;加热完成后立即置于冰上;然后使用磁力架在冰上分离磁珠,获取上清液作为分离的捕获后的文库。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其中步骤4)包括:对于标准品绘制反映DNA浓度与Ct值关系的标准曲线;然后基于生物样品在捕获前后的Ct值确定DNA浓度或捕获产量,并依据panel大小和基因组大小,计算捕获效率。
8.根据权利要求7所述的方法,其中如下计算捕获效率:捕获效率=(捕获总量/投入量)/((panel大小/人类基因组大小)/中靶率),其中投入量是指步骤1)所构建的DNA文库的量,捕获总量为步骤3)捕获后从结合的磁珠上分离下来的文库的量。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述定量PCR的反应体系包含:
Taq聚合酶;
缓冲液;
引物和探针的混合液;
不含核酸酶的水;和
DNA模板。
10.一种用于检测探针的捕获效率的试剂盒,所述试剂盒包含定量PCR反应体系和使用说明,其中所述定量PCR反应体系包含:
Taq聚合酶;
缓冲液;
引物和探针的混合液;
不含核酸酶的水;和
DNA模板。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211443676.9A CN118056911A (zh) | 2022-11-18 | 2022-11-18 | 一种检测探针的捕获效率的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202211443676.9A CN118056911A (zh) | 2022-11-18 | 2022-11-18 | 一种检测探针的捕获效率的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN118056911A true CN118056911A (zh) | 2024-05-21 |
Family
ID=91068521
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202211443676.9A Pending CN118056911A (zh) | 2022-11-18 | 2022-11-18 | 一种检测探针的捕获效率的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN118056911A (zh) |
-
2022
- 2022-11-18 CN CN202211443676.9A patent/CN118056911A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN113166797B (zh) | 基于核酸酶的rna耗尽 | |
WO2020233094A1 (zh) | 一种ngs建库分子接头及其制备方法和用途 | |
WO2018184495A1 (zh) | 一步法构建扩增子文库的方法 | |
JP2018520706A (ja) | 試料採取からngsライブラリ調製までの自動化 | |
CN115109842A (zh) | 用于准确的平行定量核酸的高灵敏度方法 | |
CN109295500B (zh) | 一种单细胞甲基化测序技术及其应用 | |
CN112662771B (zh) | 一种肿瘤融合基因的靶向捕获探针及其应用 | |
CN109280696B (zh) | Snp检测技术拆分混合样本的方法 | |
CN114015749A (zh) | 一种基于高通量测序的线粒体基因组测序文库的构建方法及扩增引物 | |
CN112592981B (zh) | 用于dna档案建库的引物组、试剂盒和方法 | |
CN111748628B (zh) | 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒 | |
CN114875118B (zh) | 确定细胞谱系的方法、试剂盒和装置 | |
CN118056911A (zh) | 一种检测探针的捕获效率的方法 | |
CN116065240A (zh) | 一种高通量构建rna测序文库的方法及试剂盒 | |
EP3325697B1 (en) | Optimized clinical sample sequencing | |
CN111172260A (zh) | 检测人尿液或血液样本中的线粒体基因组的方法及试剂盒 | |
CN108841919A (zh) | 一种嵌合式sda法制备探针 | |
CN114807310A (zh) | 一种基于多重pcr靶向高通量测序检测肺癌多基因突变的引物对、试剂盒及方法 | |
CN116622806A (zh) | 一种提高rna病毒检出率的方法 | |
Al-Turkmani et al. | Molecular assessment of human diseases in the clinical laboratory | |
WO2024028505A1 (en) | Methods of preparing normalised nucleic acid samples, kits and devices for use in the method | |
CN118291584A (zh) | 基于核酸酶的rna耗尽 | |
CN117625763A (zh) | 准确地平行定量变体核酸的高灵敏度方法 | |
WO2024077152A1 (en) | Probes for depleting abundant small noncoding rna | |
CN115109835A (zh) | 一种细胞外rna文库的构建方法及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |