CN108841919A - 一种嵌合式sda法制备探针 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种SDA法制备探针的方法，所述方法包括：1)合成双链寡核苷酸探针序列的两条链，依次包括第一扩增探针序列，第一固定序列，寡核苷酸序列，第二固定序列，第二扩增探针序列；第一扩增探针序列与第一固定序列相邻的碱基对为核糖核苷酸与对应位置的脱氧核糖核酸配对，第二扩增探针序列与第二固定序列相邻的碱基对为核糖核苷酸和脱氧核糖核酸配对；2)合成引物对：第一引物为第一扩增探针序列包括核糖核酸的单链，第二引物为第二扩增探针序列的包括核糖核酸的单链；3)用所述双链寡核苷酸探针序列和所述引物对在Klenow exo‑酶、RNaseH1和dNTP的作用下，进行链置换反应，获得探针。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体而言本发明涉及SDA方法制备探针。
背景技术
为了一次性获得大量感兴趣的未知突变信息的目标片段，通过设计一系列针对于目标区域内一定长度的寡核苷酸链，对这些寡核苷酸链进行相应的化学修饰，以便通过后续的方法来对这些携带有未知突变序进行识别与获取，最终实现对未知突变序列的富集，用于上机测序。
现有探针制备的方法包括：对原有的寡核苷酸链进行PCR扩增，通过割胶回收获取大量的寡核苷酸链，在体外转录试剂的作用下，大量寡核苷酸链带上了生物素标记物，最后对制备出来的RNA探针进行纯化。然而，上述方法在制备探针过程中，具有制备繁琐、割胶回收效率低和制备出的探针均一性差等缺点。
发明内容
为了制备出高产量、均一和质量高的探针用于捕获建库，本发明人提出了一种高效制备探针的方法，即通过恒温扩增的方法来制备探针。
因此，在第一方面，本发明提供了一种SDA法制备探针的方法，所述方法包括：
1)合成双链寡核苷酸探针序列的两条链，
所述双链寡核苷酸探针序列依次包括第一扩增探针序列a，第一固定序列b，寡核苷酸序列c，第二固定序列d，第二扩增探针序列e；
第一扩增探针序列a与第一固定序列b相邻的碱基对为核糖核苷酸和脱氧核糖核酸配对，第二扩增探针序列e与第二固定序列d相邻的碱基对为核糖核苷酸和脱氧核糖核酸配对；
合成引物对：第一引物为第一扩增探针序列a的包括核糖核酸的单链，第二引物为第二扩增探针序列e的包括核糖核酸的单链；
用所述双链寡核苷酸探针序列和所述引物对在Klenow exo-酶、RNaseH1和dNTP的作用下，进行链置换反应，获得探针。
在一个实施方案中，所述双链寡核苷酸探针序列的每条链分别带有一个核糖核酸，所述核糖核酸位于所述寡核苷酸序列c的5’端之前。
在一个实施方案中，所述第一固定序列b和所述第二固定序列d长度一般为20-30nt，优选15nt，用于标记不同GC％探针。
在一个实施方案中，所述寡核苷酸序列c为与目标DNA互补配对序列，长度一般为80-120nt，优选100nt。
在一个实施方案中，所述双链寡核苷酸探针序列的两条链为序列A和序列B：
序列A：SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.2+寡核苷酸序列+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.4，序列B为序列A的互补序列，
以第一扩增探针序列SEQ ID NO.1作为第一引物，形成不含SEQ ID NO.4的序列A，以第二扩增探针序列SEQ ID NO.4的互补序列作为第二引物，形成与不含SEQ ID NO.1的序列B序列；R代表核糖核苷酸中的任意一个碱基A、U、C、G，D代表与R配对的脱氧核糖核苷酸A、T、C或G。
在一个实施方案中，所述双链寡核苷酸探针序列的两条链为序列A和序列B：
序列A(5’至3’)：
ACGGTATTGACCTCGR(SEQ ID NO.1)TAATCAGATGCGTCG(SEQ ID NO.2)+寡核苷酸序列+GTAATAAGGGCGACC(SEQ ID NO.3)DGGATAACATGGCACT(SEQ ID NO.4)，
第一扩增探针序列ACGGTATTGACCTCGR(SEQ ID NO.1)用作第一引物，形成与TGCCATAACTGGAGCD(SEQ ID NO.1补)ATTAGTCTACGCAGC(SEQ ID NO.2补)+寡核苷酸序列+CATTATTCCCGCTGG(SEQ ID NO.3补)探针互补配对的ACGGTATTGACCTCGR(SEQ ID NO.1)TAATCAGATGCGTCG(SEQ ID NO.2)+寡核苷酸序列+GTAATAAGGGCGACC(SEQ ID NO.3)探针序列，第二扩增探针序列RCCTATTGTACCGTGA(SEQ ID NO.4补)为DGGATAACATGGCACT(SEQ IDNO.4)互补配对序列；
序列B(3’至5’)：
TGCCATAACTGGAGCD(SEQ ID NO.1补)ATTAGTCTACGCAGC(SEQ ID NO.2补)+寡核苷酸序列+CATTATTCCCGCTGG(SEQ ID NO.3补)RCCTATTGTACCGTGA(SEQ ID NO.4补)，
TGCCATAACTGGAGCD(SEQ ID NO.1补)序列为ACGGTATTGACCTCGR(SEQ ID NO.1)的互补序列，ATTAGTCTACGCAGC(SEQ ID NO.2补)为双链探针中另一条的第一固定序列，CATTATTCCCGCTGG(SEQ ID NO.3补)为双链探针中另一条的第二固定序列，第二扩增探针序列RCCTATTGTACCGTGA(SEQ ID NO.4补)用作第二引物，形成与TAATCAGATGCGTCG(SEQ IDNO.2)+寡核苷酸序列+GTAATAAGGGCGACC(SEQ ID NO.3)DGGATAACATGGCACT(SEQ ID NO.4)探针互补配对的
ATTAGTCTACGCAGC(SEQ ID NO.2补)+寡核苷酸序列+CATTATTCCCGCTGG(SEQ IDNO.3补)RCCTATTGTACCGTGA(SEQ ID NO.4补)探针序列；
R代表核糖核苷酸中的任意一个碱基A、U、C、G；TAATCAGATGCGTCG(SEQ ID NO.2)为探针第一固定序列，GTAATAAGGGCGACC(SEQ ID NO.3)为探针第二固定序列，D代表脱氧核糖核苷酸中的任意一个碱基A、T、C、G，与R互补配对组成核糖核苷酸和脱氧核糖核酸配对。
在第二方面，本发明提供了本发明第一方面中的双链寡核苷酸探针序列和引物对，
所述双链寡核苷酸探针序列依次包括第一扩增探针序列a，第一固定序列b，寡核苷酸序列c，第二固定序列d，第二扩增探针序列e；
第一扩增探针序列a与第一固定序列b相邻的碱基对为核糖核苷酸和脱氧核糖核酸配对，第二扩增探针序列e与第二固定序列d相邻的碱基对为脱氧核糖核苷酸和核糖核酸配对；
所述引物对：第一引物为第一扩增探针序列a的包括核糖核酸的单链，第二引物为第二扩增探针序列e的包括核糖核酸的单链。
在一个实施方案中，所述双链寡核苷酸探针序列的每条链分别带有一个核糖核酸，所述核糖核酸位于所述寡核苷酸序列前面。
在一个实施方案中，所述第一固定序列b和所述第二固定序列d长度一般为20-30nt，优选15nt，用于标记不同GC％探针。
在一个实施方案中，所述寡核苷酸序列c为与目标DNA互补配对序列，长度一般为80-120nt，优选100nt。
在一个实施方案中，所述双链寡核苷酸探针序列的两条链为序列A和序列B：
序列A：SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.2+寡核苷酸序列+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.4，序列B为序列A的互补序列，
以第一扩增探针序列SEQ ID NO.1作为第一引物，形成不含SEQ ID NO.4的序列A，以第二扩增探针序列SEQ ID NO.4的互补序列作为第二引物，形成与不含SEQ ID NO.1的序列B序列中的；R代表核糖核苷酸中的任意一个碱基A、U、C、G，D代表与R配对的脱氧核糖核苷酸A、T、C或G。
在一个实施方案中，所述双链寡核苷酸探针序列的两条链为序列A和序列B：
序列A(5’至3’)：
ACGGTATTGACCTCGR(SEQ ID NO.1)TAATCAGATGCGTCG(SEQ ID NO.2)+寡核苷酸序列+GTAATAAGGGCGACC(SEQ ID NO.3)DGGATAACATGGCACT(SEQ ID NO.4)，
序列B(3’至5’)：
TGCCATAACTGGAGCD(SEQ ID NO.1补)ATTAGTCTACGCAGC(SEQ ID NO.2补)+寡核苷酸序列+CATTATTCCCGCTGG(SEQ ID NO.3补)RCCTATTGTACCGTGA(SEQ ID NO.4补)。
本发明的方法具有操作简便快捷、制备出的探针产量高、易于保存和均一化等优点。本方法的优点具体体现为：
1.通过设计常规的限制性内切酶位点进行链置换反应，很难避免探针上带有酶切位点的碱基序列被切掉，这样很难保证制备出来探针的完整性，影响捕获效率。而本方法通过设计嵌合式DNA-R-DNA结构的双链探针序列与Klenow exo-酶、RNaseH1和dNTP共同起作用，进行链置换反应，保证了制备出结构完整的探针，然而探针结构的完整性是保证进行正常捕获的前提。
2.一般的SDA方法，是通过引入酶切位点的方法，进行链置换反应，酶切位点识别序列一般为固定的6-12个碱基，在人类基因组上出现极高的概率，这样根据人类参考基因组设计出来的探针上也会含有高比例的对应酶切位点，带来的后果是会破坏探针结构的完整性，因此现有方法在选择单链限制性内切酶方面会很受限，而我们的方法无需考虑酶切位点序列的特异性，方便了双链探针的设计。
附图说明
通过以下附图对本发明进行说明
图1是链置换反应过程示意图。
图2示出了SDA法制备探针用于建库和捕获结果。
图3示出原有制备探针方法的每根探针深度统计图。
图4示出SDA方法制备同一批次探针每根探针统计图。
具体实施方式
在本发明中，第一扩增探针序列a和第二扩增探针序列e为扩增探针序列，用于设计扩增引物。
在本发明中，第一固定序列b和第二固定序列d为固定序列，用于标记不同GC％探针。用于标记不同GC％探针，是指利用不同GC％含量的探针对序列进行区分。
在本发明中，涉及探针序列A的序列表示为5’至3’；涉及探针序列B的序列表示为3’至5’。“SEQ ID NO.x补”表示SEQ ID NO.x的互补序列，表示为3’至5’，例如“SEQ ID NO.2补”表示SEQ ID NO.2的互补序列，表示为3’至5’。
在本发明中，R代表核糖核苷酸中的任意一个碱基A、U、C、G；D代表脱氧核糖核苷酸中的任意一个碱基A、T、C、G。
在本发明中，Klenow exo-酶是指Klenow Fragment(3’-->5’exo)，来自DNA聚合酶的大(Klenow)片段。保持聚合酶活性，但无3’-->5’外切核酸酶、5’-->3’外切核酸酶活性。
实施例
一、SDA法制备探针过程：
1、合成大量双链带有5’端和3’端带有扩增探针和标记不同GC％探针的固定序列，在这两个固定序列之间嵌合了一个R碱基，R为核糖核苷酸中的任意一个碱基A、U、C、G，目的在于引入进行链置换反应的切口，以及与目标区域互补配对的寡聚核苷酸链，设计探针序列结构如下：
探针序列A(表示为5’至3’):
ACGGTATTGACCTCGRTAATCAGATGCGTCG+寡核苷酸序列(100bp)+GTAATAAGGGCGACCDGGATAACATGGCACT；
探针序列B(表示为3’至5’)：
TGCCATAACTGGAGCDATTAGTCTACGCAGC+寡核苷酸序列(100bp)+CATTATTCCCGCTGGRCCTATTGTACCGTGA
2、对双链寡聚核苷酸链进行定量，浓度为152ng/ul，稀释100倍，浓度为1.52ng/ul。
3、链置换反应：把定量过的双链探针序列、Klenow exo-酶、E.coliRNaseH1和dNTP进行混匀，在37℃时反应3个小时。
共计：50ul
链置换反应过程如图1所示，在Klenow exo-、E.coliRNaseH1和dNTP酶的作用下，发生链置换反应，Klenow exo-来自BioLabs的货号M0212S。具体反应机制如下：
(1)E.coliRNaseH1在双链探针：
序列A：ACGGTATTGACCTCGRTAATCAGATGCGTCG+寡核苷酸序列(100bp)+GTAATAAGGGCGACCDGGATAACATGGCACT；
序列B：TGCCATAACTGGAGCDATTAGTCTACGCAGC+寡核苷酸序列(100bp)+CATTATTCCCGCTGGRCCTATTGTACCGTGA的序列A上进行切割，切割位置为这条探针的ACGGTATTGACCTCGRTAATCAGATGCGTCG上的部分序列CGRTAA的RT之间形成一个切口，在Klenow exo-的作用下掀开TAATCAGATGCGTCG+寡核苷酸序列(100bp)+GTAATAAGGGCGACCDGGATAACATGGCACT这条探针序列，同理E.coliRNaseH1在序列B上进行切割，切割位置为这条探针的CATTATTCCCGCTGGRCCTATTGTACCGTGA上的部分序列GGRCC的RG之间形成一个切口，在Klenow exo-的作用下掀开TGCCATAACTGGAGCDATTAGTCTACGCAGC+寡核苷酸序列(100bp)+CATTATTCCCGCTGG这条探针序列。
(2)分别以ACGGTATTGACCTCGR和AGTGCCATGTTATCCR作为引物，扩增出2对相应的双链序列分别为：ACGGTATTGACCTCGRTAATCAGATGCGTCG+寡核苷酸序列(100bp)+GTAATAAGGGCGACC和TGCCATAACTGGAGCDATTAGTCTACGCAGC+寡核苷酸序列(100bp)+CATTATTCCCGCTGG；
TAATCAGATGCGTCG+寡核苷酸序列(100bp)+GTAATAAGGGCGACCDGGATAACATGGCACT和ATTAGTCTACGCAGC+寡核苷酸序列(100bp)+CATTATTCCCGCTGGRCCTATTGTACCGTGA。两组双链探针继续在Klenow exo-、E.coliRNaseH1和dNTP酶的作用下，周而复始地重复上述过程，合同大量的用于捕获测序的探针序列。
4、用2×磁珠进行纯化步骤3的链置换产物获得探针，洗脱体积为80ul。
二、对SDA法制备探针产量、效果和质量评估：
1.比较不同方法制备出探针产量
| Oligo pool投入量 | 探针总产量 | |
| PCR方法制备探针 | 10ng | 4000ng |
| SDA法制备探针 | 5ng | 3600ng |
上述结果说明：SDA方法制备探针，投入Oligo pool的量为PCR制备探针方法的一半，但是SDA方法制备的探针总量是PCR方法制备探针总量的2倍。原因在于PCR方法制备探针的过程繁琐，需要对PCR扩增后的寡核苷酸链通过割胶回收获取大量的寡核苷酸链，然后在体外转录试剂的作用下，大量的寡核苷酸链带上了生物素标记物，最后对制备出来的RNA探针进行进一步纯化。每一步繁琐的过程都会造成探针的损耗，而SDA方法制备探针只需要让探针进行大量扩增，进行一步产物纯化，最大程度地减少了探针制备过程中的损耗。
2.SDA法制备探针用于建库和捕获结果，见图2：
通过SDA方法建出的2个文库，在进行捕获之后，文库的主峰在270-320之间，符合上机测序文库片段大小的要求。说明SDA方法制备出的探针不但产量高而且可以有效地应用于杂交捕获实验中。
3.对SDA方法制备探针质量评估：
图3示出原有制备探针方法每根探针深度统计图；图4示出SDA方法制备同一批次探针每根探针统计图。
两图统计的是同批探针根据不同制备方法得到的每根探针深度，图3中全部探针在平均深度上下10％的占比为88％，图4中全部探针在平均深度上下10％的占比为99％，可以看出图4中制备出的探针对目标区域捕获的深度和均一性较高。通过统计每根探针的捕获DNA的深度来评估制备的探针是否可以正常工作，对每根探针的深度来画一个深度的离散图(flank深度图)这样可以直观的反映探针的工作情况；并且计算平均深度20％左右探针的占比来反映不同探针捕获DNA的均一性，占比越大表示制备的探针之间差异性越小，反映到捕获DNA的深度上为目标区域内的被测序列的基因组DNA之间的差异越小，提高后续对样本变异分析的准确度，为临床诊断提供更准确的参考。
序列表
<110> 艾吉泰康生物科技（北京）有限公司
<120> 一种嵌合式SDA法制备探针
<130> CF180229S
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 1
acggtattga cctcgr 16
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 2
taatcagatg cgtcg 15
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 3
gtaataaggg cgacc 15
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Synthetic sequence)
<400> 4
dggataacat ggcact 16
Claims (6)
1.一种SDA法制备探针的方法，所述方法包括：
1)合成双链寡核苷酸探针序列的两条链，
所述双链寡核苷酸探针序列依次包括第一扩增探针序列，第一固定序列，寡核苷酸序列，第二固定序列，第二扩增探针序列；
第一扩增探针序列与第一固定序列相邻的碱基对为核糖核苷酸和脱氧核糖核酸配对，第二扩增探针序列与第二固定序列相邻的碱基对为脱氧核糖核酸和核糖核苷酸配对；
2)合成引物对：第一引物为第一扩增探针序列的包括核糖核酸的单链，第二引物为第二扩增探针序列包括核糖核酸的单链；
3)用所述双链寡核苷酸探针序列和所述引物对在Klenow exo-酶、RNaseH1和dNTP的作用下，进行链置换反应，获得探针。
2.根据权利要求1的方法，所述双链寡核苷酸探针序列的每条链分别带有一个核糖核酸，所述核糖核酸位于所述寡核苷酸序列的5’端之前。
3.根据权利要求1的方法，所述第一固定序列b和所述第二固定序列d长度一般为20-30nt，优选15nt，用于标记不同GC％探针。
4.根据权利要求1的方法，所述寡核苷酸序列c为与目标DNA互补配对序列，长度一般为80-120nt，优选100nt。
5.根据权利要求1的方法，所述双链寡核苷酸探针序列的两条链为序列A和序列B：
序列A：SEQ ID NO.1+SEQ ID NO.2+寡核苷酸序列+SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.4，序列B为序列A的互补序列，
以第一扩增探针序列SEQ ID NO.1作为第一引物，形成不含SEQ ID NO.4的序列A，以第二扩增探针序列SEQ ID NO.4的互补序列作为第二引物，形成与不含SEQ ID NO.1的序列B序；R代表核糖核苷酸中的任意一个碱基A、U、C、G，D代表与R配对的脱氧核糖核苷酸A、T、C或G。
6.权利要求1中限定的双链寡核苷酸探针序列和引物对，
所述双链寡核苷酸探针序列依次包括第一扩增探针序列，第一固定序列，寡核苷酸序列，第二固定序列，第二扩增探针序列；
第一扩增探针序列与第一固定序列相邻的碱基对为核糖核苷酸和脱氧核糖核酸配对，第二扩增探针序列与第二固定序列相邻的碱基对为脱氧核糖核酸和核糖核酸配对；
所述引物对：第一引物为第一扩增探针序列的包括核糖核酸的单链，第二引物为第二扩增探针序列的包括核糖核酸的单链。
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| 蒋天伦: "链置换扩增术(SDA)及其进展", 《国外医学.临床生物化学与检验学分册》 * |
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| CN108841919B (zh) | 2021-07-06 |
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