CN109536615B

CN109536615B - 微卫星标记引物的开发方法及其应用

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Publication number: CN109536615B
Application number: CN201811239076.4A
Authority: CN
Inventors: 郭梁; 张殿昌; 郭华阳; 杨静文; 杨权; 张楠; 朱克诚; 刘宝锁; 林慧洁
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2018-10-23
Filing date: 2018-10-23
Publication date: 2020-09-18
Anticipated expiration: 2038-10-23
Also published as: CN109536615A

Abstract

本发明属于遗传育种技术领域，具体涉及微卫星标记引物的开发方法及其应用，其中微卫星标记引物的开发方法主要特点体现在其引物设计上，本发明利用重测序技术，在检测群体全基因组SNP、Indel和SSR变异规律的基础上，设计和筛选微卫星标记的引物，从而提高了微卫星标记引物的开发通量和效率。

Description

微卫星标记引物的开发方法及其应用

技术领域

本发明属于遗传育种技术领域，具体涉及基于群体重测序的微卫星标记引物的开发方法及其应用。

背景技术

群体与个体相对，是个体的集合。DNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是其如下核苷酸：腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列方式。重测序即是对已知基因组参考序列的物种进行不同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差异性分析。微卫星(Microsatellite)也称为短串联重复序列(STR)或简单重复序列(SSR)，是广泛分布在真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6bp(Base Pair，碱基对的简称)的核苷酸序列(称为基序)成首尾相连构成。

微卫星广泛分布于基因组中，多态性高，稳定性好，共显性遗传。研究发现，微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同，因而造成微卫星位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来，就能发现不同的微卫星在不同的种群甚至不同个体间的多态性，基于这一想法，人们开发了微卫星标记。目前，微卫星标记广泛应用于系谱鉴定、个体识别、基因连锁分析、遗传连锁图谱构建、遗传多样性检测等诸多领域。不同微卫星标记一般通过扩增微卫星位点的引物对体现。引物对是人工合成的两段寡核苷酸序列，一条引物与目的微卫星位点一端的DNA正向链互补，另一个引物与目的位点另一端的反反向链DNA互补，其功能是作为核苷酸聚合酶作用的起始点。已知一个微卫星位点的核苷酸序列，可根据这一序列合成扩增引物。

现有微卫星标记引物的开发主要步骤如下：

步骤一、合成微卫星引物

根据参考DNA或RNA序列，进行微卫星位点的检测，并根据检测结果合成微卫星引物。

步骤二、验证引物能否被扩增出来

对单个个体或者混合DNA进行扩增，然后，利用琼脂糖凝胶电泳检测引物是否成功扩增。

注意：这里的扩增是指单对引物PCR扩增(每对引物包括一正向和一反向引物)，与多重PCR即多重引物PCR扩增不同。

扩增通常指聚合酶链式反应，简称PCR，即Polymerase Chain Reaction。PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速复制。总体而言，PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。

步骤三、验证扩增产物的多态性

通过小规模扫描(6-10个)筛选多态的微卫星位点，筛选方法一般采用：聚丙烯酰胺凝胶电泳，记录每个微卫星位点的等位基因分布区间。

在多重PCR组合开发即开发能一起做多重PCR的微卫星标记引物组合时，还需要继续下面步骤四。

步骤四、多重PCR验证，即验证不同微卫星标记引物能否在一起做多重PCR。

随机组合微卫星位点，形成多重PCR组合，比较同组内不同微卫星位点等位基因分布区间，对引物分配荧光标记，要求采用同一荧光标记的不同微卫星位点等位基因的分布区间不能交叠。进行多重PCR扩增，并检测扩增效果。

上述扩增效果一般通过测序仪检测，即通过检测每个微卫星位点是否成功扩增、峰型是否整齐，判断该组微卫星组合是否可以用于多重PCR。

上述步骤二、三、四(步骤四还包括了分组操作)主要完成扩增后产物的检测，目前PCR产物检测方法主要有琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、荧光标记引物测序法等，每种方法各有优缺点，实际操作中，用户可根据需求选择单一或不同方法进行组合使用。

上述现有微卫星标记引物开发方法普遍存在效率低下且通量低的缺点。主要反应如下：

1)从上述步骤一可知，现有方法引物设计基于不包含多态信息的参考序列，但设计出的引物目标是应用于群体。而群体中广泛存在SNP和Indel变异，若这些变异发生于引物结合位置则会影响设计出引物的扩增效率，导致扩增稳定性很弱或不能扩增。

2)现有方法在引物设计阶段微卫星位点的多态性未知，尤其对多态性低的物种，导致即使进行了大量的扩增工作，最后得到的多态的微卫星位点比例还是很低。

总而言之，现有的微卫星标记引物的开发方法，在引物设计前并没有包含群体变异信息，具有太大的盲目性，导致引物合格率低，开发的多态的微卫星位点数量更是少。在经历大量盲目的扩增后，只能开发出少量的微卫星标记，导致现有微卫星标记开发方法存在明显的通量低，效率低下的问题。

不仅如此，低通量的微卫星标记引物的开发方法，也造就了多重PCR组合的开发效率低下问题。

由于现有微卫星标记引物开发方法通量低，开发的微卫星位点总量少，扩增条件中各微卫星位点扩增引物的退火温度不一，易导致扩增失败，从而致使多重PCR的开发效率低下。

另外，前面提到，微卫星是2-6碱基重复，其中两碱基重复的微卫星比率最高，占比通常达60％以上。但两碱基重复的微卫星分型时错误率较高。由于现有微卫星标记开发方法通量低，开发的微卫星位点总量少，一般都会保留两碱基重复的微卫星位点，也就导致现有多重PCR分型准确率低。与两碱基重复的微卫星在相比之下，3、4、5、6碱基重复的微卫星分型时错误率低，若开发出的微卫星位点充足，仅选择这部分位点则会提高多重PCR分型准确率。

发明内容

本发明提供了一种能提高效率和通量的微卫星标记引物的开发方法。

本发明还提供所述微卫星标记引物的开发方法开发出的微卫星标记引物在亲子鉴定方面的应用，以及在增殖放流、遗传多样性、种群遗传结构和遗传育种研究方面的应用。

一种微卫星标记引物的开发方法，包括如下步骤：

(1)重测序：选取待测物种，进行重测序；

(2)检测SNP和Indel变异：将步骤(1)获得的测序序列与该物种的参考基因组比对，获取其SNP和Indel变异；

(3)获取多态性高的微卫星位点：对参考基因组的重复基序进行检测，获得微卫星位点，对微卫星位点进行分型，筛选出多态性高的微卫星位点；

(4)设计微卫星位点的扩增引物并筛选：利用步骤(2)中的SNP和Indel变异信息和步骤(3)中获得的多态性高的微卫星位点信息，设计获得微卫星标记引物，并选取部分微卫星标记引物进行PCR验证。

步骤(1)中重测序推荐采用第二代测序技术进行双末端测序，测序深度推荐10X。

步骤(2)中推荐利用短序列比对软件将步骤(1)获得的测序序列与该物种的参考基因组比对。

步骤(3)中推荐利用重复基序检测软件对参考基因组的重复基序进行检测。

出于不同应用目的：步骤(3)中多态性高的微卫星位点是重复基序为3-6碱基的微卫星位点且等位基因数目在3-5个以上的微卫星位点。

或步骤(3)中多态性高的微卫星位点是重复基序为2-6碱基的微卫星位点且等位基因数目在3-5个以上的微卫星位点。

步骤(4)中利用步骤(2)中的SNP和Indel变异信息包括将参考基因组序列中SNP和Indel变异位点的碱基替换为“N”，从而在引物设计时自动避开该变异位置。

本发明还旨在保护所述的微卫星标记引物的开发方法开发出的微卫星标记引物在亲子鉴定方面的应用。

以及所述的微卫星标记引物的开发方法开发出的微卫星标记引物在增殖放流、遗传多样性、种群遗传结构和遗传育种研究方面的应用。

本发明微卫星标记引物的开发方法主要特点体现在其引物设计上，本发明针对现有微卫星标记引物的开发方法引物设计的缺点，利用重测序技术，在检测群体全基因组SNP、Indel和SSR变异规律的基础上，设计和筛选微卫星位点扩增引物，从而提高了微卫星标记引物开发通量和效率。另外，基于上述微卫星标记引物的开发方法开发出的大量的微卫星位点的基础上，由于可选择的微卫星位点数目丰富，可基于大量扩增条件一致的微卫星位点设计出成批的多重PCR组合，从而提高多重PCR的开发效率和开发的微卫星标记引物的质量。

相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

1)本发明微卫星标记引物的开发方法，利用群体重测序技术，通过比对重测序结果与参考基因组序列，事先获知了群体全基因组的SNP、Indel变异和微卫星位点多态性，然后在设计引物时，刻意避开变异位点和多态性差的微卫星位点，避免了引物设计的盲目性，使按照本发明方法设计引物在扩增后，不仅通量高，而且由于避免了盲目扩增，可大幅度提高总体试验效率。

2)本发明微卫星标记引物的开发方法由于具有高通量，开发的微卫星位点丰富，可支持排除重复基序为两碱基的微卫星位点，从而避免两碱基的微卫星位点分型时检测错误率高的问题，有利于提高开发的微卫星标记引物的质量。另外，由于本发明微卫星标记引物的开发方法能开发出丰富的微卫星位点可供进行多重PCR验证，有利于选择出扩增条件更为一致的微卫星位点形成多重PCR组合，从而有利于提高多重PCR的开发效率和开发的微卫星标记引物的质量。

3)本发明微卫星标记引物的开发方法，由于在引物设计时，本身针对的就是多态性高的位点，所以，在对扩增产物进行验证时，可省去验证扩增产物多态性步骤，有利于提高试验效率。

附图说明

图1为随机挑选的两组多重PCR组合G10、G20扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，以展示引物扩增效果；

图2为随机挑选的多重PCR组合G10在个体T1和T2中的多重扩增产物的验证峰图，以展示多重PCR组合G10的组合效果；

图3为随机挑选的多重PCR组合G20在个体T1和T2中的多重扩增产物的验证峰图，以展示多重PCR组合G20的组合效果。

具体实施方式

实施例一

一种卵形鲳鲹微卫星标记引物的开发方法，包括如下步骤：

1)获取卵形鲳鲹参考基因组序列(在ENA数据库中的识别号为PRJEB22654)，记为reference.fa。

2)群体重测序

收集代表性的卵形鲳鲹个体10尾，剪取鳍条保存于-80℃，提取基因组DNA，利用第二代测序技术进行双末端测序，文库大小为350bp，测序深度10X，该数据在NCBI数据库中的识别号为PRJNA484082。

3)检测SNP和Indel变异

将步骤2)获得的测序序列与该物种的参考基因组比对，获取其SNP和Indel变异，具体：

利用短序列比对软件将步骤2)获得的测序序列比对到步骤1)的参考基因组上，筛选准确比对到参考基因组上的序列，利用变异检测软件检测SNP和Indel变异。

利用的短序列比对软件为BWA-0.7.12，变异检测软件是SAMtools-1.8。

命令分别如下：

bwa mem-t 20 reference.fa sample.1.fq sample.2.fq|samtools view-b-f0x2-F 0x100-F 0x800|samtools sort--threads 20>sample.SNP.bam

samtools mpileup-C 50-uf reference.fa-b bam.list-q 20-Q 20-t DP,AD,ADF,ADR,SP,INFO/AD,INFO/ADF,INFO/ADR|bcftools call-cv->SNP.Indel.vcf

共检测到SNP 2189602个、Indel(InDel(insertion-deletion)插入缺失标记)811056个。

4)获取多态性高的微卫星位点

对参考基因组的重复基序进行检测，获得微卫星位点，对微卫星位点进行分型，筛选出多态性高的微卫星位点，具体：

4-1)从参考基因组序列上检测微卫星序列

利用重复基序检测软件对参考基因组的重复基序进行检测，鉴定微卫星序列，并将参考基因组序列上的这些位置替换为“N”，记为reference.1.fa。这里将重复基序替换为“N”，是为了让引物设计时，避开该位置。

重复基序检测软件为TRF409，命令如下：

trf reference.fa 2 7 7 80 10 50 500-f-d–m

共检测到重复序列位点288413个，微卫星位点为个127871个，两碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基位点分别为97230、11626、9540、4594和4881个。

4-2)利用群体重测序数据对微卫星位点进行分型

微卫星位点分型软件为lobSTR-4.0.6，命令如下：

/bin/allelotype--command classify--bam str--index-prefix/index/lobSTR_--strinfo/strinfo.tab--noise_model/share/lobSTR/models/illumina_v3.pcrfree--min-het-freq 0.2--min-border 5--min-bp-before-indel 7--maximal-end-match 15--min-read-end-match 5--max-matedist 1000--filter-clipped--noweb--out SSR

从而获取微卫星位点的整体基因型，其可反应群体微卫星位点的多态性。

4-3)筛选出多态性高的微卫星位点

筛选第4-2)步中获得的重复基序为3-6碱基的且等位基因数目在5个以上的微卫星位点，共573个。

5)设计微卫星位点的扩增引物并筛选

利用步骤3)中的SNP和Indel变异信息和步骤3)中获得的多态性高的微卫星位点信息，设计获得微卫星标记引物，并选取部分微卫星标记引物进行PCR验证，具体：

利用第3)步中获得的SNP和Indel变异信息，将参考基因组序列reference.1.fa中的变异位点的碱基替换为“N”，记为reference.2.fa，在reference.2.fa中提取步骤4-3)筛选出的微卫星位点前后各500bp的序列。利用primer3对步骤4-3)筛选出的微卫星位点批量设计引物，参数如下：

并利用电子PCR检测设计的引物是否可以扩增出单一条带，具体：利用电子PCR将设计的引物比对回参考基因组序列reference.fa，筛选出只比对到参考基因组序列单一位置的引物对522对。

检测软件为e-PCR，命令如下：

ePCR/famap-tn-b genome.famap reference.fa

ePCR/fahash-b genome.hash-w 12-f 3 genome.famap

ePCR/re-PCR-S genome.hash-o output.txt-n 3-g 3-d 80-470-r+input.txt

根据比对结果筛选比对到参考基因组单一位置的微卫星位点，也即筛选出只比对到参考基因组单一位置的引物对。

PCR验证

a)对微卫星位点进行分组

评估各微卫星位点引物对的兼容性，将可以兼容的微卫星位点分到同一组中，构成多重PCR组合。当然也可以随机分组，本实施例中先评估兼容性再分组，相当于对多重PCR扩增成功率有一个预判，有利于降低多重PCR开发的工作量，提高开发效率。引物兼容性评估软件为Multiplx-1.4，命令如下：

Multiplx/cmultiplx-primers primer.ff.txt-calcscores 12345-saveprimscores primer-scores.txt-saveprodscores product-scores.txt

Multiplx/cmultiplx-primers primer.ff.txt-loadprimscores primer-scores.txt-loadprodscores product-scores.txt-initialorder friends-stringencyhigh-calcgroups 1000 1000 -savegroups groups.txt。

将筛出的522个微卫星分成48个多重PCR组合，记为G1-G48，每个9到11个位点。然后在每组中，根据这些微卫星位点扩增引物在参考基因组上的位置和10个测序个体中的等位基因输出每个位点的分布范围，将每组微卫星位点组合按照每个位点的分布范围再次分组，使得每个小组可以利用同一种荧光进行标记，即每个小组的微卫星位点等位基因分布区间不交叠。

b)微卫星扩增引物验证

随机选取多重PCR组合G5、G6、G7、G10、G20、G22、G36和G42，在北京睿博兴科生物技术有限公司合成上述筛选出来的位点的引物，通过单对引物PCR扩增后，利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物多态性(当然也可通过ABI3730测序仪)。

所用DNA聚合酶为Premix Taq^TM Hot Start Version(TaKaRa,Cat.#R028A)，扩增程序为：98℃10s，57℃40s，72℃60s，30个循环；98℃10s，53℃40s，72℃60s，15个循环；最后72℃延伸10min。扩增条带单一明亮则认为扩增成功。图1为随机挑选的两组多重PCR组合G10、G20扩增后的电泳结果。图1中，上部为微卫星位点组合G10，下部为微卫星位点组合G20，左侧第一条泳道为DL2000Marker，中间9条泳道为G10位点或G20位点，最右侧泳道为空白对照。由图可见，G10和G20在中间9条泳道上每条均出现整齐明亮的片段。

上述8组多重PCR组合共包含74对引物，成功扩增67对，67对均具有高多态性，成功率为90％，而且开发出的微卫星位点重复基序为3个以上碱基，且等位基因数目在5个以上。

相比于现有微卫星标记开发方法，本发明不仅成功率(反映了开发效率)有较大幅度的提高，而且开发的微卫星位点多态性更好(现有普遍只要求包括两个以上等位基因)，而且重复基序全部为3个以上碱基(现有60％以上为2碱基重复)。

上述步骤b)微卫星扩增引物验证，包括：验证引物能否被扩增出来和验证扩增产物多态性的步骤，此处验证多态性主要用于证明通过本发明方法开发的微卫星位点引物，均满足多态性要求，因为本发明在引物设计时针对的本身就是多态性好的位点，在实际使用时，用户实则可省去验证多态性步骤。

c)多重PCR验证

随机选取9个个体T1、T2、T4、T5、T6、T7、T8、T9、T10(另取9尾卵形鲳鲹个体)对步骤b)中8组多重PCR组合(仅选择组合中扩增条带单一明亮的位点)进行验证。本实施例中，多重PCR扩增使用三引物体系(降低成本)，即每个位点由加荧光标记的通用引物、加通用引物的正向引物和反向引物构成，其中G10、G20引物选取如表一所示。各组引物采用相同浓度，比例统一为4:1:4。扩增效果验证通过ABI3730测序仪检测(可同时检测是否能扩出来以及多态性)，位点在预期范围内出现整齐规则的峰，如图2所示，则说明该位点合格，每组具有两个以上合格位点，说明该组合合格。

反应体系如下：

图2给出了T1和T2两个个体G10的检测结果。其中图2中由上而下，第一和第二幅图，是用TAMRA荧光标记引物，利用毛细管电泳对G10进行分型的结果展示图，第三、第四幅，是用ROX荧光标记引物，利用毛细管电泳对G10进行分型的结果展示图。具体上述9个个体G10检测数据汇总如表二所示。由表二得到的G10中的位点群体遗传学参数如表三所示，通过Ho和He判断获得的微卫星位点具有高多态性。

利用所选9个个体进行多重PCR组合G20验证的数据分别如图3和表四、五所示。图3给出了T1和T2两个测序个体G20的检测结果。其中图3中由上而下，第一和第二幅图，是用TAMRA荧光标记引物，利用毛细管电泳对G20进行分型的结果展示图，第三、第四幅，是用ROX荧光标记引物，利用毛细管电泳对G20进行分型的结果展示图。具体上述9个个体G20检测数据汇总如表四所示。由表四得到的G20中的位点群体遗传学参数如表五所示，通过Ho和He判断获得的微卫星位点具有高多态性。

由上可见，G10可以稳定扩增5个多态性高的位点(表二、表三和附图2)，G20可以稳定扩增7个多态性高的位点(表四、表五和附图3)。

总体的验证结果：G5、G6、G7、G10、G20、G22、G36和G42分别可以稳定扩增4、5、4、5、5、5、7和3个多态性高的位点。

从随机挑选的8组多重PCR组合G5、G6、G7、G10、G20、G22、G36和G42的验证结果我们可见，在采用相同浓度，即未进行引物浓度优化的情况下，每组均能成功开发出三个以上能一起做多重PCR且多态性高的位点，说明本发明多重PCR开发方法成功率可达100％，而且开发的每个位点均具有高多态性。

表一：G10和G20位点的引物信息

表二：多重PCR组合G10验证结果

表三：G10组合中的位点群体遗传学参数

N：个体数；Na：等位基因数；Ne：有效等位基因数；I：香农信息指数；Ho：观测杂合度；He：期望杂合度；uHe：无偏期望杂合度；F：固定指数

表四：多重PCR组合G20验证结果

表五：G20组合中的位点群体遗传学参数

需要说明的是，除了卵形鲳鲹之外，采用本发明中的微卫星标记引物的开发方法，也能开发出其它鱼类和物种的微卫星标记引物，如罗非鱼、大黄鱼等，此处卵形鲳鲹仅为列举并不作为对对象的限定。

另外，还需要指出的是，本发明微卫星标记引物的开发方法，在位点开发时，均排除了两碱基的重复序列，开发的微卫星标记引物，更为倾向于应用在亲子鉴定、增殖放流等领域，在应用于群里动态监测领域时，建议不排除两碱基的重复序列。此外，也可以应用在遗传多样性、种群遗传结构和遗传育种研究等方面。