CN110491446B

CN110491446B - 一种快速的批量化SNP/Indel引物设计的方法及系统

Info

Publication number: CN110491446B
Application number: CN201910798281.2A
Authority: CN
Inventors: 田彩霞; 董亚晨; 刘露露
Original assignee: Shanghai Majorbio Bio Pharm Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Majorbio Bio Pharm Technology Co ltd
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2019-08-27
Publication date: 2023-04-07
Anticipated expiration: 2039-08-27
Also published as: CN110491446A

Abstract

本发明公开了一种快速的批量化SNP/Indel引物设计的方法及系统，包括：对变异检测获得的VCF文件进行标记过滤；根据标记过滤后所得的变异位点在参考基因组中的位置信息，提取引物设计的任务序列，并基于提取的任务序列结合设定的引物设计参数，生成选定的引物设计软件输入所需格式的输入文件；使用选定的引物设计软件，根据输入文件进行引物设计；对选定的引物设计软件完成引物设计后的输出文件，按照预设格式要求进行格式整理，生成最终所需的结果文件。本发明可解决基于有参考基因组的变异检测分析所获得的大量SNP和Indel标记的引物设计问题，实现大批量引物设计的一键化，流程速度快，结果归纳明晰，大幅度提升了分析效率。

Description

一种快速的批量化SNP/Indel引物设计的方法及系统

技术领域

本发明涉及引物设计技术领域，尤其涉及一种快速的批量化SNP/Indel引物设计的方法及系统。

背景技术

长期以来，动植物育种通常是基于表型性状进行选择。当表型性状较为简单时，表型选择是有效的。但对于一些表型难以准确鉴定的性状，仅基于表型性状进行选择是不准确的。因此，为了提供一套更有利于动植物育种的方法，各种DNA分子标记相继发展起来。与传统的分子标记相比，单核苷酸多态性(SNP)和小核苷酸片段插入或缺失(Indel)，因其具有分布广泛、多态性高、稳定性好、分析流程易自动化等特性，可应用于控制性状的功能基因的鉴定，有利于优良基因的进一步开发和利用，而被广泛应用于动植物群体遗传分析、分子辅助育种以及人类法医遗传学、医学诊断等领域。因此，关于SNP和INDEL的引物设计也是常规育种中必不可少的步骤。

目前，最经典、使用最广泛的引物设计软件是由加拿大的Premier公司开发的PrimerPremier，以及其他在线分析软件Primer-Blast，Primer3 Plus等。设计流程大都是需要获得任务序列，然后根据提供的任务序列以及选择好引物设计参数，从而获得引物设计结果。目前现有分析技术存在以下缺陷：

1.需要手动去获取任务序列；2.在获取任务序列的过程中容易引起位置信息误差；3.无法实现批量化设计引物需求；4.设计结果是碎片化的，做多个引物设计时费时费力。

发明内容

针对上述现有技术中存在的不足之处，本发明提供一种快速的批量化SNP/Indel引物设计的方法，拟解决基于有参考基因组的变异检测分析所获得的大量SNP和Indel标记的引物设计问题，实现大批量引物设计的一键化。

该快速的批量化SNP/Indel引物设计的方法包括：

对变异检测获得的VCF文件进行标记过滤；

根据标记过滤后所得的变异位点在参考基因组中的位置信息，提取引物设计的任务序列，并基于提取的任务序列结合设定的引物设计参数，生成选定的引物设计软件输入所需格式的输入文件；

使用所述选定的引物设计软件，根据所述输入文件进行引物设计；

对所述选定的引物设计软件完成引物设计后的输出文件，按照预设格式要求进行格式整理，生成最终所需的结果文件。

进一步地，所述对变异检测获得的VCF文件进行标记过滤，具体为：

将变异检测获得的VCF文件通过VCFtools软件的minDP参数进行标记过滤，筛选出符合预设质量要求的变异位点。

进一步地，所述根据标记过滤后所得的变异位点在参考基因组中的位置信息，提取引物设计的任务序列，并基于提取的任务序列结合设定的引物设计参数，生成选定的引物设计软件输入所需格式的输入文件，具体为：

基于筛选出的变异位点的染色体位置信息以及变异的碱基详情，提取到参考基因组中变异位点附近预设长度的序列作为引物设计的任务序列；

选择设定的引物设计参数，对提取出的任务序列的格式进行转化，生成选定的引物设计软件输入所需格式的输入文件。

可选地，所述选定的引物设计软件为primer3。

进一步地，所述引物设计参数遵循以下原则：

长度为15-30bp，其有效长度不大于38bp；GC含量在40％-60％之间，PCR扩增中的复性温度是较低Tm值引物的Tm值减去5-10℃，引物长度小于20bp时，其Tm恒等于4×(G+C)+2×(A+T)；产物长度在预设范围内，不小于100bp。

相应地，针对上述现有技术中存在的不足之处，本发明还提供一种快速的批量化SNP/Indel引物设计的系统，该系统包括：

信息获取模块，用于获取需要分析的数据信息，所述数据信息包括进行引物设计的VCF文件、参考基因组fasta文件，以及引物设计参数；

标记过滤模块，用于将变异检测获得的VCF文件通过VCFtools软件的minDP参数进行标记过滤，筛选出符合预设质量要求的变异位点；

任务序列提取脚本，用于根据变异位点在参考基因组中的位置信息，提取引物设计的任务序列；

任务序列格式转化脚本，用于结合选定的引物设计参数对提取出的任务序列的格式进行转化，生成选定的引物设计软件输入所需格式的输入文件；

引物设计模块，用于使用所述选定的引物设计软件，根据所述输入文件进行引物设计；

输出文件转化脚本，用于对所述选定的引物设计软件完成引物设计后的输出文件，按照预设格式要求进行格式整理，生成最终所需的结果文件。

可选地，所述引物设计参数为流程默认提供或用户自定义设置。

可选地，所述选定的引物设计软件为primer3。

进一步地，所述系统中所利用的工具包括一个Perl编写的主程序代码和两个Perl和shell编写的子程序代码。

可选地，所述系统中所使用的每个子程序脚本独立执行或嵌入到已有的数据分析流程中。

本发明具有如下有益效果：

本发明实现了大批量引物设计的一键化设计流程，不仅提供了关于SNP和Indel的自动化引物设计，同时还可以对引物设计的参数进行调整，解决了现有技术低效、低准确度的问题，同时在结果的展示也做了整理优化，解决了现有技术输出结果碎片化问题，具有流程速度快，结果归纳明晰的优点，可大幅度提升分析效率，旨在为更多科研工作提供便利。

附图说明

图1为本发明第一实施例提供的快速的批量化SNP/Indel引物设计的流程示意图；

图2为本发明第二实施例提供的快速的批量化SNP/Indel引物设计的流程示意图；

图3为输出结果表；

图4为引物设计结果表。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

第一实施例

本实施例提供一种快速的批量化SNP/Indel引物设计的方法，其流程如图1所示，包括以下过程：

1、标记过滤

对变异检测获得的VCF文件进行标记过滤；

具体地，本实施例实现标记过滤的方式为：将变异检测获得的VCF文件通过vcftools软件的minDP参数进行标记筛选，筛选出高质量的标记。当然也可以使用其他方式实现标记过滤，本实施例对此不作具体限定。

2、提取输入文件

基于变异位点的染色体位置信息以及变异的碱基详情，从而提取到参考基因组中变异位点附近的序列作为引物设计的输入序列，然后选择合适的引物设计参数，生成选定的引物设计软件输入所需格式的文件；

其中，选定的引物设计软件为primer3；当然也可以是其他现有的引物设计软件，本实施例对此不作具体限定；而引物设计参数则遵循以下原则：

1)长度一般为15-30bp，其有效长度[Ln＝2(G+C)+(A+T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74℃)，从而降低产物的特异性；

2)GC含量应在40％-60％之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5-10℃。

引物长度小于20bp时，其Tm恒等于4×(G+C)+2×(A+T)；

3)产物长度不能过小也不能过大，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊。

3、引物设计

使用选定的引物设计软件(primer3)进行引物设计。

4、输出结果文件

对于输出文件进行格式整理，生成最终所需的结果文件。

本实施例的方法实现了大批量引物设计的一键化设计流程，不仅提供了关于SNP和Indel的自动化引物设计，同时还可以对引物设计的参数进行调整，解决了现有技术低效、低准确度的问题，同时在结果的展示也做了整理优化，解决了现有技术输出结果碎片化问题，具有流程速度快，结果归纳明晰的优点，可大幅度提升分析效率，旨在为更多科研工作提供便利。

第二实施例

本实施例提供一种快速的批量化SNP/Indel引物设计的系统，其包括信息获取模块、标记过滤模块、任务序列提取脚本、任务序列格式转化脚本、引物设计模块，以及输出文件转化脚本；该系统实现快速的批量化SNP/Indel引物设计的流程如图2所示，包括：

1、利用信息获取模块获取用户输入的需要分析的具体信息，包括：a.进行引物设计的VCF文件，b.参考基因组fasta文件，c.引物设计参数；其中，引物设计参数可是流程默认提供，也可自定义设置；

2、利用标记过滤模块通过VCFtools做标记过滤，输出高质量变异位点；

3、利用自主研发的任务序列提取脚本，根据变异位点在参考基因组中的位置信息，提取引物设计的任务序列；

4、利用自主研发的任务序列格式转化脚本，转化任务序列格式，生成primer3格式的输入文件；

5、利用引物设计模块通过primer3软件进行引物设计；

6、利用自主研发的输出文件转化脚本，转化primer3的输出结果，得到引物设计结果表；如图3和图4所示，其中：

CHROM：序列编号；

POS：标记在参考基因组序列上的位置；

Total number：标记编号，从1开始累加；

Type：标记类型；

Ref：参考基因组的基因型；

Alt：突变基因型；

Marker size(bp)：标记片段长度；

Marker start(bp)：标记在参考基因组序列上的起始位置；

Marker end(bp)：标记在参考基因组序列上的终止位置；

FORWARD PRIMER1(5'-3')：正向引物序列；

Tm(℃)：退火温度；

GC(％)：引物的GC含量；

size：引物片段长度；

REVERSE PRIMER1(5'-3')：反向引物序列；

PRODUCT1 size(bp)：产物1的片段大小；

start(bp):产物片段在参考基因组序列上的起始位置；

end(bp)：产物片段在参考基因组序列上的终止位置。

进一步地，在实际应用中，本实施例所利用的工具包含1个Perl编写主程序代码和2个Perl和shell编写的子程序代码。每个子程序脚本既能够独立执行，也可以嵌入到已有的数据分析流程中，使用非常灵活。程序基于的Perl和shell语言，可以在Linux、MacOS等多种类unix系统平台下使用，能够在任意安装上述系统的服务器上进行使用。

在应用过程中，上述脚本会返回一系列详细的参数设置和对应的参数说明，指导数据分析人员正确使用这些方法。其中，参数分两种类型：必要参数和可选参数。必要参数要求由数据分析人员提供输入值，无默认值。可选参数的默认值有预设值，分析人员也可结合实际需求进行调整，具有灵活性。

本实施例的系统实现了大批量引物设计的一键化设计流程，不仅提供了关于SNP和Indel的自动化引物设计，同时还可以对引物设计的参数进行调整，解决了现有技术低效、低准确度的问题，同时在结果的展示也做了整理优化，解决了现有技术输出结果碎片化问题，具有流程速度快，结果归纳明晰的优点，可大幅度提升分析效率，旨在为更多科研工作提供便利。

此外，需要说明的是，本领域技术人员应明白，本实施例可提供为方法、装置、或计算机程序产品。因此，本实施例可采用硬件实施例、软件实施例、或结合软件和硬件方面的实施例的形式。而且，本发明实施例可采用在一个或多个其中包含有计算机可用程序代码的计算机可用存储介质(包括但不限于磁盘存储器、CD-ROM、光学存储器等)上实施的计算机程序产品的形式。

本发明实施例是参照根据本发明实施例的方法、终端设备(系统)、和计算机程序产品的流程图和/或方框图来描述的。应理解可由计算机程序指令实现本实施例流程图和/或方框图中的每一流程和/或方框、以及流程图和/或方框图中的流程和/或方框的结合。可提供这些计算机程序指令到通用计算机、专用计算机、嵌入式处理机或其他可编程数据处理终端设备的处理器以产生一个机器，使得通过计算机或其他可编程数据处理终端设备的处理器执行的指令产生用于实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能的装置。

这些计算机程序指令也可存储在能引导计算机或其他可编程数据处理终端设备以特定方式工作的计算机可读存储器中，使得存储在该计算机可读存储器中的指令产生包括指令装置的制造品，该指令装置实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能。这些计算机程序指令也可装载到计算机或其他可编程数据处理终端设备上，使得在计算机或其他可编程终端设备上执行一系列操作步骤以产生计算机实现的处理，从而在计算机或其他可编程终端设备上执行的指令提供用于实现在流程图一个流程或多个流程和/或方框图一个方框或多个方框中指定的功能的步骤。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的相同要素。

以上仅为本发明优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种快速的批量化SNP/Indel引物设计的方法，其特征在于，包括：

对变异检测获得的VCF文件进行标记过滤；

对所述选定的引物设计软件完成引物设计后的输出文件，按照预设格式要求进行格式整理，生成最终所需的结果文件；

所述对变异检测获得的VCF文件进行标记过滤，具体为：

将变异检测获得的VCF文件通过VCFtools软件的minDP参数进行标记过滤，筛选出符合预设质量要求的变异位点；

所述根据标记过滤后所得的变异位点在参考基因组中的位置信息，提取引物设计的任务序列，并基于提取的任务序列结合设定的引物设计参数，生成选定的引物设计软件输入所需格式的输入文件，具体为：

选择设定的引物设计参数，对提取出的任务序列的格式进行转化，生成选定的引物设计软件输入所需格式的输入文件；

所述选定的引物设计软件为primer3；

所述引物设计参数遵循以下原则：

长度为15-30bp，其有效长度不大于38bp；GC含量在40％-60％之间，PCR扩增中的复性温度是较低Tm值引物的Tm值减去5-10℃，引物长度小于20bp时，其Tm恒等于4×(G+C)+2×(A+T)；产物长度在预设范围内，不小于100bp；

所述最终所需的结果文件中的内容包括：

序列编号；

标记在参考基因组序列上的位置；

标记编号，从1开始累加；

标记类型；

参考基因组的基因型；

突变基因型；

标记片段长度；

标记在参考基因组序列上的起始位置；

标记在参考基因组序列上的终止位置；

正向引物序列；

退火温度；

引物的GC含量；

引物片段长度；

反向引物序列；

产物1的片段大小；

产物片段在参考基因组序列上的起始位置；

产物片段在参考基因组序列上的终止位置。

2.一种快速的批量化SNP/Indel引物设计的系统，其特征在于，包括：

输出文件转化脚本，用于对所述选定的引物设计软件完成引物设计后的输出文件，按照预设格式要求进行格式整理，生成最终所需的结果文件；

所述引物设计参数为流程默认提供或用户自定义设置；

所述选定的引物设计软件为primer3；

所述系统中所利用的工具包括一个Perl编写的主程序代码和两个Perl和shell编写的子程序代码；

所述系统中所使用的每个子程序脚本独立执行或嵌入到已有的数据分析流程中；

所述引物设计参数遵循以下原则：

所述最终所需的结果文件中的内容包括：

序列编号；

标记在参考基因组序列上的位置；

标记编号，从1开始累加；

标记类型；

参考基因组的基因型；

突变基因型；

标记片段长度；

标记在参考基因组序列上的起始位置；

标记在参考基因组序列上的终止位置；

正向引物序列；

退火温度；

引物的GC含量；

引物片段长度；

反向引物序列；

产物1的片段大小；

产物片段在参考基因组序列上的起始位置；

产物片段在参考基因组序列上的终止位置。