JP2002253234A

JP2002253234A - 突然変異型ｄｎａポリメラーゼを使用する高温逆転写

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Publication number: JP2002253234A
Application number: JP2001118092A
Authority: JP
Inventors: Edward Soh Smith; ソースミスエドワード; Carita Maria Elfstrom; マリアエルフストロムカリタ; David Harrow Gelfand; ハロージェルファンドデビッド; Russell Gene Higuchi; ジーンヒグチラッセル; Thomas William Myers; ウィリアムマイアーズトーマス; Nancy Jeneane Schonbrunner; ジェアンヌショエンブルナーナンシー; Alice Ming Wang; ミンワンアリス
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-04-18
Filing date: 2001-04-17
Publication date: 2002-09-10
Anticipated expiration: 2021-04-17
Also published as: ZA200103103B; HK1044569B; CA2342277A1; AU781191B2; JP3844975B2; ATE339518T1; KR100798671B1; JP4468919B2; TR200101093A2; DK1152062T3; BR0101493A; ES2270915T3; EP1152062A2; AU3516501A; CN1344802A; CN1273611C; EP1152062A3; DE60122962T2; HK1044569A1; US20020012970A1

Abstract

(57)【要約】【課題】連結型逆転写／増幅反応に特に有効な改良型
逆転写方法。【解決手段】修飾耐熱性DNAポリメラーゼを、特にマ
グネシウムイオン緩衝液中で使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は分子生物学の分野
に、特にリボ核酸（RNA）配列の逆転写と増幅のための
方法に関連する。

【０００２】

【従来の技術】「逆転写酵素」はRNA依存性DNAポリメラ
ーゼとして特徴づけられる種類のポリメラーゼをいう。
既知の逆転写酵素はすべて、RNA鋳型からのDNA転写産物
の合成に際しプライマーを必要とする。従来、逆転写酵
素は主にmRNAのcDNAへの転写に使用されてきたが、cDNA
はその後ベクターに導入してクローン化し、いっそうの
操作に備えることができる。

【０００３】「DNAポリメラーゼ」はDNA依存性DNAポリ
メラーゼとして特徴づけられる種類のポリメラーゼをい
う。DNAポリメラーゼはその生体内機能から予想される
ように、RNA鋳型の使用を強く差別する。それにもかか
わらず、ある種のDNAポリメラーゼはRNAの生体外逆転写
能をもつことをいくつかの研究所がすでに立証している
（Karkas, 1973, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70: 3834
-3838; Gulati et al., 1974, Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 71: 1035-1039; Wittig and Wittig, 1978, Nuc. A
cids Res. 5:1165-1178）。Gulati他はE. coli Pol Iを
使用すればオリゴ(dT)10をプライマーとして用いてQβ
ウィルスRNAを転写しうることを発見した。Wittigおよ
びWittigはE. coli Pol Iを使用すれば、オリゴ(dA)で
あらかじめ酵素的に伸長させたtRNAを逆転写しうること
を立証した。しかし、Gulati他が示したように、酵素所
要量および少量のcDNA産物を考えるとE coli Pol の逆
転写酵素活性には実際的な価値があまりないようであ
る。

【０００４】耐熱性DNAポリメラーゼのテルムス・アク
アティクス（T. aquaticus）（Taq）DNAポリメラーゼは
二価金属イオンとしてMg⁺²を使用してcDNAを合成するが
効率は低いと報告されている（Jones and Foulkes, 198
9, Nuc. Acids. Res. 176:8387-8388）。TseおよびForg
et, 1990「Gene」88:293 -296およびShaffer他、1990、
「Anal. Biochem.」190-292-296はTaq DNAポリメラーゼ
とMg⁺²イオンを使用するRNA増幅法について記載してい
るが、この方法は非効率的で感受性も鈍い。

【０００５】RNA、DNA両核酸配列の増幅法は米国特許第
4,683,195号、4,683,202号および4,965,188号に記載さ
れているが、これらの各特許は参照により本書に組み込
まれる。好ましい方法はポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
法であり、これは一般に、各サイクルで増幅産物の変性
に使用する温度に耐えられるTaq DNAポリメラーゼなど
のような耐熱性DNAポリメラーゼを使用して行われる。P
CRは今日では技術上周知であり、学術文献にも広く記載
されている。たとえば、PCR Applications, 1999（Inni
s et al., eds., Academic Press, San Diego）; PCR S
trategies, 1995（Innis et al., eds., Academic Pres
s, San Diego）; PCR Protocols, 1990（Innis et al.,
eds., Aademic Press, San Diego）; PCR Technology,
1989（Erlich, ed., Stockton Press, New York）を参
照（いずれも参照により本書に組み込まれる）。PE Bio
systems（カリフォルニア州フォスターシティー）など
のような業者はPCR試薬を販売し、PCRプロトコールを刊
行している。増幅法の概説はAbramsonおよびMyers、199
3、「Current Opinion in Biotechnology」4:41-47に出
ており、これもまた参照により本書に組み込まれる。

【０００６】Taq DNAポリメラーゼとマグネシウムイオ
ン緩衝液を使用する逆転写はあまりに非効率的で実用的
ではないため、当初はRNA鋳型で開始するPCR増殖が、た
とえばモロニーマウス白血病ウィルス逆転写酵素（MoMu
LV RT）またはAMV-RTなどのような非耐熱性ウィルス逆
転写酵素を使用してターゲットRNAをまず逆転写し、次
いで得られたcDNAを、耐熱性DNAポリメラーゼを使用し
て増幅するという方法で行われた。

【０００７】耐熱性DNAポリメラーゼを使用する場合で
もDNA鋳型使用のプライマー伸長法で好まれるようにマ
グネシウム（Mg⁺²）緩衝液ではなくマンガン（Mn⁺²）緩
衝液中で反応させればRNA鋳型を効率的に逆転写させう
ることが判明するに至り、飛躍的な前進が図られた。耐
熱性DNAポリメラーゼを使用する効率的なMn⁺²活性化逆
転写法については米国特許第5,310,652号、5,322,770
号、5,407,800号、5,641,864号、5,561,058号および5,6
93,517号に記載されているが、これらの特許はすべて参
照により本書に組み込まれる。RNA鋳型からのcDNA合成
とDNA鋳型からのDNA合成のどちらもMn⁺²緩衝液中で行え
るため、Mn⁺²緩衝液を使用すれば単一酵素の連結型逆転
写／増幅反応が可能になる（Myers and Sigua, 1995, P
CR Strategies(前掲)所収、第5章をも参照）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段】本発明は、耐熱性DNAポリメラーゼを使用し
てRNA配列を逆転写する方法を提供する。本発明はさら
に、好ましくは単一の耐熱性DNAポリメラーゼを使用し
て連結型のワンチューブ反応でRNA配列を逆転写、増幅
する方法を提供する。本発明の方法では先行技術の高温
逆転写法に比して逆転写（RT）効率が向上する。

【０００９】好ましい実施態様において、本発明はマグ
ネシウム（Mg⁺²）緩衝液中でRNA配列を逆転写する方法
を、またさらにMg⁺²緩衝液中で単一の耐熱性DNAポリメ
ラーゼを使用して、好ましくは連結型のワンチューブ反
応で、RNA配列を逆転写、増幅する方法を提供する。Mg
⁺²緩衝液を使用して行われるこれらの方法では、耐熱性
DNAポリメラーゼのマンガン（Mn⁺²）活性化に依存する
在来法に比して忠実性が向上する。

【００１０】本発明の方法は、フルオレセイン系または
シアニン系の色素で標識したジデオキシヌクレオチド
（ddNTP）を取り込むDNAポリメラーゼの能力に影響を及
ぼすと従来説明されてきた決定的アミノ酸位置に点突然
変異を含む突然変異型熱活性（好ましくは耐熱性）DNA
ポリメラーゼを使用する。本発明は、これらの突然変異
型DNAポリメラーゼが特にMg⁺²緩衝液中で逆転写能の著
しい向上をも示すという意外な発見に由来している。

【００１１】本発明の方法に有用な突然変異型DNAポリ
メラーゼは欧州特許公開第0 902,035号、同時係属米国
出願第09/146,631号、およびPCT国際特許公開第WO 98/4
0496号に記載されており、これらの文献はいずれも参照
により本書に組み込まれる。これらの突然変異型DNAポ
リメラーゼはフルオレセイン系およびシアニン系色素で
標識したヌクレオチドを、デオキシヌクレオチド（dNT
P）や塩基類似体、たとえばジデオキシヌクレオチド（d
dNTP）を含めて、取り込む能力が高いと説明されてい
る。これらの突然変異型DNAポリメラーゼは本書では便
宜上、「フルオレセイン系色素取り込み型(Fluorescein
family Dye Incorporating)」DNAポリメラーゼ、略し
て「FDI」 DNAポリメラーゼという。FDI DNAポリメラー
ゼの最大の効用とされるものは、フルオレセインまたは
シアニン系色素で標識した色素ターミネーター（色素標
識ddNTP）を使用するDNA配列決定反応にある。野生型DN
Aポリメラーゼはヌクレオチド類似体を、また標識ヌク
レオチド類似体をなおさら、差別するため、色素ターミ
ネーター配列決定反応は一般に過剰な色素ターミネータ
ーを使用して行われた。FDI DNAポリメラーゼは標識色
素ターミネーターに対する差別を弱めることにより、色
素ターミネーター濃度を著しく下げて配列決定反応を行
えるようにする。

【００１２】本発明の方法に使用するDNAポリメラーゼ
中の突然変異させた決定的アミノ酸位置は、フルオレセ
インおよびシアニン系色素で標識したジデオキシヌクレ
オチドを取り込むDNAポリメラーゼの能力に影響を及ぼ
すのと同じアミノ酸であるが、欧州特許公開第0 902,03
5号および同時係属米国出願第09/146,631号では、天然
型に見られる保存配列モチーフ内の位置によって識別し
ている。その中の表1には多数のDNAポリメラーゼに見ら
れるこの配列モチーフの例が記されている。この配列モ
チーフと決定的アミノ酸は以下でも実質的に同じ方法で
識別する。

【００１３】天然型DNAポリメラーゼに見られるこの決
定的モチーフは、アミノ酸の標準1文字表記法を用いて
最も一般的に表すと次のようなアミノ酸配列を含む： LXXXXXXXXXE（配列番号1）配列中、位置2のXはSまたはA、位置3、4、6、7、8、9お
よび10のXは任意のアミノ酸、また位置5のXはLまたはI
である。

【００１４】もっと特殊な態様では、天然型DNAポリメ
ラーゼに見られる決定的モチーフは次のアミノ酸配列を
含む： LSXELXIPYEE（配列番号2）配列中、位置3のXはQまたはG、位置6のXはSまたはAであ
る。このモチーフを含むDNAポリメラーゼの例は好熱性
細菌テルムス（Thermus）属に由来するDNAポリメラーゼ
である。

【００１５】好ましい態様では、天然型DNAポリメラー
ゼに見られる決定的モチーフは次のアミノ酸配列を含
む： LSQELAIPYEE（配列番号3）このモチーフを含むDNAポリメラーゼの例は、テルムス
（Thermus）種アクアティクス（aquaticus）、テルモフ
ィルス（thermophilus）、ZO5およびカルドフィルス（c
aldophilus）に由来するDANポリメラーゼである。

【００１６】もう1つの好ましい態様では、天然型DNAポ
リメラーゼに見られる決定的モチーフは次のアミノ酸配
列を含む： LSXELSIPYEE（配列番号4）配列中、位置3のXはQまたはGである。このモチーフを含
むDNAポリメラーゼの例はテルムス（Thermus）種フラブ
ス（flavus）、sps17およびフィリホルミス（filiformi
s）に由来するDNAポリメラーゼである。

【００１７】もう1つのもっと特殊な態様では、天然型D
NAポリメラーゼに見られる決定的モチーフは次のアミノ
酸配列を含む： LSVRLGXPVKE（配列番号5）配列中、位置7のXはVまたはIである。このモチーフを含
むDNAポリメラーゼの例は超好熱性細菌テルモトガ（The
rmotoga）種マリティマ（maritima）とネオポリタナ（n
eopolitana）に由来するDANポリメラーゼである。

【００１８】もう１つのもっと特殊な態様では、天然型
DNAポリメラーゼに見られる決定的モチーフは次のアミ
ノ酸配列を含む： LSKRIGLSVSE（配列番号6）このモチーフを含むDNAポリメラーゼの例はテルモシフ
ォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）に由来す
るDNAポリメラーゼである。

【００１９】もう１つのもっと特殊な態様では、天然型
DNAポリメラーゼに見られる決定的モチーフは次のアミ
ノ酸配列を含む： LAQNLNIXRKE（配列番号7）配列中、位置8のXはSまたはTである。このモチーフを含
むDNAポリメラーゼの例はバシラス（Bacillus）種カル
ドテナクス（caldotenax）およびステアロテルモフィル
ス（stearothermophilus）に由来するDNAポリメラーゼ
である。

【００２０】以上特定した各決定的モチーフでは、位置
4のアミノ酸が決定的アミノ酸である。実施例で示すよ
うに、決定的アミノ酸の（実施例で使用した天然型DNA
ポリメラーゼ中に存在する）E、A、GまたはP以外の任意
のアミノ酸への突然変異はRT効率を向上させた。そこで
本発明の方法では、天然型DNAポリメラーゼが配列番号1
〜7よりなる群から選択される配列モチーフを含み、同
モチーフの位置4のアミノ酸がE、A、GまたはP以外の任
意のアミノ酸へと突然変異していることを特徴とする突
然変異型DNAポリメラーゼを使用する。好ましくは、決
定的アミノ酸はE、A、G、PまたはQ以外の任意のアミノ
酸へと、もっと好ましくはE、A、G、P、QまたはD以外の
任意のアミノ酸へと突然変異させる。

【００２１】本発明の一態様は、本書に記載する突然変
異型の熱活性または耐熱性DNAポリメラーゼを使用して
逆転写反応を行わせるステップを含むRNAの逆転写方法
に関連する。好ましくは、これらの方法は次のステップ
を含む： (a) RNAとハイブリダイズしそのターゲットRNAに対して
相補的なcDNA分子の合成を開始するための前記RNAに対
して十分に相補的であるプライマーと本書に記載する突
然変異型の熱活性または耐熱性DNAポリメラーゼとを含
む反応混合物を提供すること；および(b) 前記反応混合
物を適当な条件の下で処理して、1本鎖cDNAを提供する
こと。

【００２２】好ましい態様において、ステップ(a)の反
応は適当な緩衝液中で行われるようにし、緩衝液にはMg
⁺²が含まれるようにする。本発明のもう1つの態様は、
本書に記載する突然変異型の熱活性または耐熱性DNAポ
リメラーゼを使用して単一酵素による連結型逆転写／増
幅反応を行わせるステップを含むRNAの増幅方法に関連
する。好ましくは、これらの方法は次のステップを含
む： (a) RNAとハイブリダイズしそのターゲットRNAに対して
相補的なcDNA分子の合成を開始するための前記RNAに対
して十分に相補的である第1プライマー、前記cDNAへと
ハイブリダイズし延長産物の合成を開始するためのター
ゲットRNAに対して十分に相同的である第2プライマー、
および本書に記載する突然変異型の熱活性または耐熱性
DNAポリメラーゼを適当なMg⁺²緩衝液中に含んでなる反
応混合物を提供すること； (b) 前記反応混合物を適当な条件の下で処理して、1本
鎖cDNAを提供すること；および(c) ステップ(b)の反応
混合物を適当な条件の下で処理して、ステップ(b)のcDN
Aを増幅すること。

【００２３】好ましい態様において、この逆転写および
増幅は本書に記載する突然変異型の熱活性または耐熱性
DNAポリメラーゼを使用して、Mg⁺²を含む緩衝液中で、
単一酵素による連結型逆転写／増幅反応として行われる
ようにする。本発明の理解に資する意味で、以下に用語
の定義をしておく。「熱活性DNAポリメラーゼ」は本書
では高温の反応至適条件をもつDNAポリメラーゼをい
う。本発明に使用するこの熱活性酵素は60〜90℃の温度
範囲でプライマーの伸長を最大限に触媒する。

【００２４】「耐熱性DANポリメラーゼ」は熱に対して
安定的な、つまり2本鎖核酸の変性処理に必要な時間に
わたり高温にさらされても不可逆的な変性（失活）を起
こさないDNAポリメラーゼをいう。核酸の変性処理に必
要な加熱条件は技術上周知である。本書でいう耐熱性ポ
リメラーゼは、参照により本書に組み込まれる米国特許
第4,965,188号に記載されているポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）増幅などのような温度サイクル反応への使用に
適する。

【００２５】「高温逆転写反応」は本書では、少なくと
も40℃の、好ましくは40℃〜80℃の、さらに好ましくは
50℃〜70℃の温度で行われる逆転写反応をいう。「遺伝
子」は回収可能な生体活性ポリペプチドまたは前駆物質
の産生に必要な調節およびコード配列を含むDNA配列を
いう。「天然型」は天然源から単離される遺伝子または
遺伝子産物をいう。この用語はまた、分子生物学的手法
によって産生される組み換え型の天然タンパク質であっ
て、天然型と同じアミノ酸配列をもつものをいう。

【００２６】「突然変異型」は、核酸配列に変異のある
遺伝子またはアミノ酸配列に変異のある遺伝子産物であ
って、天然型または野生型の遺伝子または遺伝子産物と
比較した場合に機能的性質に変異が生じている可能性の
あるものをいう。その種の変異には点突然変異、欠失お
よび挿入が含まれる。アミノ酸配列の「点突然変異」は
本書では単一アミノ酸の置換または単一アミノ酸の欠失
のいずれかをいう。点突然変異は好ましくはコードDNA
中の適当なコドン変更によりアミノ酸配列に導入され
る。

【００２７】ある配列中の個別アミノ酸は本書ではANと
して表記する。その場合、Aは配列中のアミノ酸であ
り、Nは配列中の位置である。あるアミノ酸配列中の置
換型点突然変異は本書ではA₁NA₂として表記する。その
場合、A₁は突然変異前のタンパク質配列中のアミノ酸、
A₂は突然変異後のタンパク質配列中のアミノ酸、Nはア
ミノ酸配列中の位置である。アミノ酸表記には1文字記
号か3文字記号のいずれかを用いる（Lehninger, BioChe
mistry 2^nd ed., 1975, Worth Publishers, Inc.New Yo
rk, NY: pp. 73-75を参照。これは参照により本書に組
み込まれる）。たとえば、G46D突然変異はアミノ酸位置
46でグリシンがアスパラギン酸に変化したことを示す。
アミノ酸位置の番号付けは、突然変異を包含する領域の
由来源となっているタンパク質の完全長を土台にしてい
る。DNA配列中のヌクレオチドおよび点突然変異の表記
も同様である。

【００２８】「核酸」と「オリゴヌクレオチド」は検出
対象のプライマー、プローブ、およびオリゴマー断片を
いい、（2-デオキシ-D-リボースを含有する）ポリデオ
キシリボヌクレオチド、（D-リボースを含有する）ポリ
リボヌクレオチド、およびプリンまたはピリミジン塩基
もしくは修飾プリンまたはピリミジン塩基のNグリコシ
ドであるその他任意のタイプのポリヌクレオチドの総称
とする。「核酸」と「オリゴヌクレオチド」を長さで区
別する意図はなく、これらの用語は互換的に使用される
ことになろう。これらの用語は分子の一次構造を指すだ
けであり、したがって2本鎖および1本鎖RNAだけでな
く、2本鎖および1本鎖DNAをもいう。

【００２９】オリゴヌクレオチドは任意の適当な方法に
より調製することができる。この調製方法にはたとえ
ば、然るべき配列のクローニングと制限および直接化学
合成などが含まれ、直接化学合成にはNarang他、1979、
「Meth. Enzymol.」68:90-99のリン酸トリエステル法、
Brown他、1979、「Meth. Enzymol.」68:109-151のリン
酸ジエステル法、Beaucage他、1981、「Tetrahedron Le
tt.」22:1859-1862のジエチルホスホラミダイト法、お
よび米国特許第4,458,066号の固相担体法などがある
が、これらの各文献は参照により本書に組み込まれる。
シアノエチルホスホラミダイト化学を使用する自動合成
が好ましい。試薬と器具はたとえばPE Biosystems（App
lied Biosystems−カリフォルニア州フォスターシティ
ー）やPharmacia（ニュージャージー州ピスカタウェ
イ）などから市販されている。

【００３０】「プライマー」という用語は本書では、プ
ライマー伸長開始条件下に置いたときに合成起点として
機能しうるオリゴヌクレオチドをいい、天然、合成を問
わない。プライマーは好ましくは1本鎖オリゴデオキシ
リボヌクレオチドである。プライマーの適正な長さは意
図するプライマーの用途次第であるが、一般に15〜35ヌ
クレオチドの範囲である。短いプライマー分子では一般
に、鋳型と十分に安定的なハイブリッド複合体を形成す
るには温度を低くめにする必要がある。プライマーは正
確な鋳型配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリ
ダイズしてプライマーの伸長を起こすためには鋳型に対
して十分に相補的でなければならない。

【００３１】「プライマー対」は本書では、PCRなどの
ような増幅反応で所望のターゲット配列を増幅する機能
を果たすよう選択された第1および第2プライマーをい
う。たとえば、ターゲットRNAの増幅を目的とした連結
型逆転写／増幅反応に使用する場合、プライマー対は、
RNAとハイブリダイズしそのターゲットRNAに対して相補
的なcDNA分子の合成を開始するための前記RNAに対して
十分に相補的である第1プライマー、および前記cDNAと
ハイブリダイズし延長産物の合成を開始するためのター
ゲットRNAに対して十分に相同的である第2プライマーか
らなる。核酸配列増幅用のプライマー対の設計は技術上
周知である。

【００３２】プライマーは、もしも望むなら、分光光学
的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手
段による検出が可能な標識を組み込むことにより標識す
ることができる。たとえば、有用な標識は³²P、蛍光色
素、電子密度試薬、（ELISAアッセイで一般的に使用さ
れるような）酵素、ビオチン、または対応する抗血清ま
たはモノクローナル抗体が得られるハプテンおよびタン
パク質などである。

【００３３】「cDNA」は本書ではリボ核酸鎖（RNA）を
鋳型として使用して合成されるコピーDNA分子をいう。
このRNAはmRNA、tRNA、rRNAでも、またはウィルスRNAな
どのような他形態のRNAでもよい。cDNAは1本鎖でも2本
鎖でもよいし、またRNA/cDNAハイブリッドの場合のよう
に相補的RNA分子に水素結合したものでもよい。「逆転
写反応混合物」という用語はターゲットRNAの逆転写に
使用される種々の試薬を含んだ水溶液をいう。これらは
酵素、水性緩衝液、塩類、オリゴヌクレオチドプライマ
ー、ターゲット核酸およびヌクレオシド三リン酸を含
む。この混合物は文脈次第で完全または不完全逆転写反
応混合物のいずれかである。

【００３４】「増幅反応混合物」という用語はターゲッ
ト核酸の増幅に使用される種々の試薬を含んだ水溶液を
いう。これらは酵素、水性緩衝液、塩類、増幅用プライ
マー、ターゲット核酸、およびヌクレオシド三リン酸を
含む。この混合物は文脈次第で完全または不完全増幅反
応混合物のいずれかである。本発明の好ましい態様にお
いて、増幅反応はPCRであり、増幅反応混合物はPCR混合
物である。増幅反応混合物は本書では連結型逆転写／増
幅反応の場合のようなRNA増幅用の反応混合物を包含す
る。

【００３５】「緩衝液」は本書では、緩衝剤または緩衝
剤ミックス、および随意に二価陽イオンまたは一価陽イ
オンを含む溶液をいう。分子生物学と核酸化学の在来手
法は技術の熟練の範囲内に収まるものであり、文献に詳
しく記載されている。たとえば、Sambrook et al., 198
9, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold S
pring Harbor Laboratory, Cold SpringHarbor, New Yo
rk; Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait, ed., 198
4); Nuclei Acid Hybridization(B.D. Hames and S.J.
Higgins. eds., 1984); Basic Methods in Molecular B
iology(Elsevier, NY); Current Protocols in Molecul
arBiology(John Wiley and Sons, NY); およびMethods
in Enzymology(AcademicPress, Inc.)シリーズを参照。
これらの文献はすべて参照により本書に組み込まれる。
本書で触れる特許、特許出願および刊行物は前述、後述
を問わずすべて、参照により本書に組み込まれる。

【００３６】本発明の方法に使用される突然変異型DNA
ポリメラーゼは、欧州特許公開第0 902,035号、同時係
属米国出願第09/146,631号、およびPCT国際特許公開第W
O 98/40496号で特定された決定的アミノ酸位置での点突
然変異を含む。欧州特許公開第0 902,035号と同時係属
米国出願第09/146,631号は決定的アミノ酸を天然型DNA
ポリメラーゼ配列に見られる決定的保存配列モチーフ内
の位置によって識別している。PCT国際特許公開第WO 98
/40496号はTaq DNAポリメラーゼ中の決定的アミノ酸を
位置番号（E681）で、また他DNAポリメラーゼ中の決定
的アミノ酸をTaq DNAポリメラーゼに対するアミノ酸配
列相同性によって識別している。どちらの方法も同じ決
定的アミノ酸位置を特定している。本書では説明を明確
にする意味で、決定的アミノ酸を決定的保存配列モチー
フ内の位置によって表す。

【００３７】表1は本質的に欧州特許公開第0 902,035号
と同時係属米国出願第09/146,631号の表1の再掲である
が、多数の代表的DNAポリメラーゼ中に見られる決定的
モチーフを、全酵素配列内の決定的アミノ酸の位置と共
に示している（決定的アミノ酸は強調表示にしてあ
る）。複数の位置番号を示したのは、同じ種に由来する
DNAポリメラーゼについてアミノ酸配列に若干の差異が
文献で報告されている場合である。

【００３８】

【表１】

【００３９】欧州特許公開第0 902,035号、同時係属米
国出願第09/146,631号およびPCT国際特許公開第WO 98/4
0496号には決定的モチーフを含む熱活性DNAポリメラー
ゼをもつ多数の種が記載されている。本発明への使用に
好ましいDNAポリメラーゼはテルムス（Thermus）種に由
来する。本発明の方法に使用される突然変異型DNAポリ
メラーゼは、天然型DNAポリメラーゼが配列番号1〜7よ
りなる群から選択される配列モチーフを含み同モチーフ
の位置4のアミノ酸がE、A、GまたはP以外の任意のアミ
ノ酸へと突然変異していることを特徴とする熱活性の、
好ましくは耐熱性の突然変型DNAポリメラーゼである。
好ましくは、この決定的アミノ酸はE、A、G、PまたはQ
以外の任意のアミノ酸へと、さらに好ましくはE、A、
G、P、QまたはD以外の任意のアミノ酸へと突然変異して
いる。

【００４０】突然変異型DNAポリメラーゼは、ポリメラ
ーゼドメインに決定的モチーフを有する熱活性DNAポリ
メラーゼをもつ任意の種から得ることができる。決定的
モチーフは同酵素のポリメラーゼドメイン内の特定の機
能領域を特定し、またその機能にとって決定的である同
モチーフ内のアミノ酸を特定する。実施例では、テルム
ス・テルモフィルス（Thermus thermophilus）DNAポリ
メラーゼという広く使用されている耐熱性DNAポリメラ
ーゼのこの部位における可能な突然変異のそれぞれにつ
いて、Mg⁺²活性化逆転写効率への効果について説明す
る。この部位のアミノ酸変異が決定的保存モチーフを有
するほぼすべてのDNAポリメラーゼでフルオレセインま
たはシアニン系色素で標識したジデオキシヌクレオチド
（ddNTP）の取り込み効率に影響を及ぼすのとまったく
同じように、この部位のアミノ酸変異は決定的保存モチ
ーフを有するほぼすべてのDNAポリメラーゼのMg⁺²活性
化逆転写効率にも影響を及ぼすものと期待される。

【００４１】DNAポリメラーゼと機能的保存ドメインの
存在との構造的関連性は周知のとおりである（たとえ
ば、Ito and Braithwaite, 1991, Nucl. Acids Res. 19
(15):4045-4047; Blanco et al., 1991, Gene 100:27-3
8; Gutman and Minton, 1993,Nucl. Acids Res. 21(1
8): 4406-4407; Delarue et al., 1990, Protein Engin
eering 3(6):461-467を参照。各文献は参照により本書
に組み込まれる）。機能的保全ドメイン内の決定的アミ
ノ酸の突然変異は一般に、他のDNAポリメラーゼに導入
した場合には類似の作用を及ぼすものと期待される（た
とえば、Xu et al.,1997, J. Mol. Biol. 268:284-302;
米国特許第5,466,591; 5,795,762号; 5,939,292号; 5,
614,365号などを参照。各文献は参照により本書に組み
込まれる）。

【００４２】決定的モチーフを含む追加の熱活性または
耐熱性DNAポリメラーゼおよびその中の決定的アミノ酸
の位置は、アミノ酸配列の直接検査によりごく普通に特
定することができる。さらに、決定的モチーフおよびア
ミノ酸は、決定的モチーフを含むことが判明している別
のDANポリメラーゼ（たとえば表1に掲げたThermus種に
由来するDNAポリメラーゼ）との配列相同性によって特
定することができる。アミノ酸および核酸の配列アライ
ンメントプログラムは容易に入手できる。たとえば、
「GAP」、「BESTFIT」および「PILEUP」などのような広
く使用されている配列アラインメントプログラムはGene
tics Computer Group（ウィスコンシン州マジソン）か
ら出ている。一般に、デフォルトパラメーターを使用し
て配列アラインメントを行うと、表1に掲げたDNAポリメ
ラーゼの1つに見られる決定的アミノ酸と相同であるDNA
ポリメラーゼ配列中の決定的アミノ酸の特定が容易にな
る。

【００４３】新DNAポリメラーゼが得られると、配列番
号1によって文字通りには表されていない決定的モチー
フの変種を含む配列が発見されようが、それは既知の酵
素との配列相同性によって特定することができる。仮定
の例として、配列番号3の変種である（位置5のアミノ酸
がLまたはI以外であるという点だけが異なる）DNAポリ
メラーゼドメイン中にあるモチーフをもつ酵素は、いく
つかのThermus種酵素の決定的モチーフとの高相同性
（この例では11個のアミノ酸のうち10個）にかんがみて
決定的モチーフを有すると認識されよう。その種の酵素
は本発明への使用上、同等とみなされる。

【００４４】決定的アミノ酸は天然型酵素を基準にして
特定される。しかし、これは突然変異型酵素のアミノ酸
配列をそれ以外の点ではすべて天然型酵素と同じものに
限定するという意味ではない。本発明の方法に使用され
る突然変異型DNAポリメラーゼは、その存在が特定の用
途にとって好都合であるような追加の突然変異を含んで
もよい。たとえば5’→3’エキソヌクレアーゼ活性また
は3’→5’エキソヌクレアーゼ活性を除去する突然変異
とその用途は周知のとおりである。配列番号1〜7として
特定される決定的モチーフの位置3における追加の置換
突然変異（たとえばTth DNAポリメラーゼのQ682K、E683
K突然変異）は、特にMn⁺²活性化反応では、Mn⁺²濃度の
いっそうの低下を可能にする、または実用塩濃度の範囲
を広げるといった追加の利点をもたらすかもしれない。

【００４５】本発明の方法に使用する突然変異型DNAポ
リメラーゼは好ましくは、目的とする特定の突然変異型
タンパク質配列を発現するようにコード配列をあらかじ
め変更した組み換え発現ベクターから発現させる。発現
プラスミドのコード配列に点突然変異を導入する方法は
技術上周知であり、参照により本書に組み込まれる特許
および学術文献にも記載されている。詳細なプロコール
はたとえば、Sambrook他「Molecular Cloning: A Labor
atory Manual」Cold Spring Harbor、1989、2版、章15.
51『Oligonuleotide-mediated mutagenesis』およびAus
ebel他「Current Protocols in Molecular Biology (cu
rrent edition)」に記載されているが、両文献は参照に
より本書に組み込まれる。欧州特許公開第0 902,035
号、同時係属米国出願第09/146,631号およびPCT国際特
許公開第WO 98/40496号は然るべき発現ベクターの構
築、およびその結果として生じる突然変異型DNAポリメ
ラーゼの発現と精製について教示している。当業者は引
用文献に盛り込まれた指針に従い、また周知技術だけを
使用して、本発明の方法に使用するための多様な宿主系
突然変異型DNAポリメラーゼのうち任意のものを発現さ
せるのに適した突然変異型遺伝子を含む発現ベクターを
いくらでも調製することができよう。

【００４６】DNAポリメラーゼを本発明の高温逆転写方
法に使用するうえで肝心なのは、それが熱活性DNAポリ
メラーゼであるという点につきる。RNA鋳型からのcDNA
の調製は高温での繰り返し変性サイクルを伴わないた
め、その方法に有用な酵素が熱活性であるとか耐熱性で
あるとかいうのは非本質的である。実施例で説明する単
一酵素による連結型逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応増幅
（RT/PCR）法では、耐熱性DNAポリメラーゼを使用する
のが好ましい。というのは、その種のDNAポリメラーゼ
は繰り返し変性サイクルを含むRT条件とPCR条件の両方
にさらされるからである。

【００４７】本発明に基づく逆転写では、反応はRNA鋳
型、プライマーおよび熱活性または耐熱性の突然変異型
DNAポリメラーゼを含む混合物の中で行われる。この反
応混合物は一般に、4種類すべてのデオキシヌクレオチ
ド三リン酸（dNTP）、および二価陽イオンと一価陽イオ
ンを含む緩衝液を含有する。DNAポリメラーゼは二価陽
イオンを触媒活性用に必要とする。DNA鋳型を使用する
伸長反応では、好ましい二価陽イオンはMg⁺²であるが、
他の陽イオン、たとえばMn⁺²またはCo⁺²などもDNAポリ
メラーゼを活性化することができる。

【００４８】熱活性または耐熱性の突然変異型DNAポリ
メラーゼとDNA鋳型を使用する伸長反応とは対照的に、R
NA鋳型を使用する伸長反応すなわち逆転写は本質的に、
実用効率を達成するためにMn⁺²の使用を必要としてき
た。たとえば、Tth DNAポリメラーゼによるRNA増幅にMn
Cl₂またはMn(OAc)₂を使用するとMgCl₂と標準PCR条件を
使用する場合と比べて少なくとも10⁶倍も感受性が向上
する。

【００４９】Mn⁺²の使用は逆転写効率を高めるものの、
忠実性の低下も招き、誤って取り込まれるヌクレオチド
が増加するという結果になる。Mn⁺²の使用はDNA増幅の
忠実性をも低下させる。そのため、Mn⁺²使用の単一酵素
ワンチューブRNA増幅反応は反応のRNA、DNA両段階で忠
実性の低下に見舞われる。したがって、高忠実性のRNA
増幅が求められる場合には、反応を2段階に分けて行う
のが好ましい。これは、キレート剤、たとえばEDTAまた
は好ましくはEGTAを使用して逆転写反応混合物からMn⁺²
を効果的に除去してから適当なMg⁺²含有DNA増幅反応混
合物を加えて反応を完了させるという方法によって実現
される。

【００５０】本発明の方法への突然変異型DNAポリメラ
ーゼの使用は、使用される二価陽イオンに関係なく逆転
写反応にプラスとなる。Mn⁺²反応では、天然型よりも突
然変異型のDNAポリメラーゼを使用するほうがRNAの高温
逆転写および増幅効率が高まる。さらに、突然変異型DN
Aポリメラーゼを使用すると低Mn⁺²濃度での反応の実現
が可能になり、それによって忠実性に対するMn⁺²濃度の
有害な影響を少なくすることができる。

【００５１】特に意外なのは、突然変異型DNAポリメラ
ーゼがMg⁺²の使用による逆転写の効率を著しく高めるこ
とを可能にする点である。同酵素の好みの二価陽イオン
であるMg⁺²の使用は忠実性を著しく高める。そのため、
Mg⁺²反応では突然変異型DNAポリメラーゼを使用するとR
NAの高温、高忠実性逆転写および増幅が実用効率で実現
する。

【００５２】二価陽イオンはMgCl₂、Mg(OAc)₂、MgSO₄、
MnCl₂、Mn(OAc)₂またはMnSO₄などのような塩の形で供給
される。一般にMn⁺²を使用する反応では、実用陽イオン
濃度はトリスHCl緩衝液の場合で0.5〜7 mM MnCl₂の範
囲、好ましくは0.5〜2 mMであろうし、またビシン／KOA
c緩衝液またはトリシン／KOAc緩衝液の場合で0.5〜20mM
Mn(OAc)₂の範囲、好ましくは0.5〜5 mMであろう。一般
にMg⁺²を使用する反応では、二価陽イオンの実用濃度は
トリスHCl緩衝液の場合で0.5〜10 mM MgCl₂の範囲、ま
たビシン／KOAcまたはトリシン／KOAcの場合で0.5〜20
mM Mg(OAc)₂の範囲、好ましくは0.5〜5 mMであろう。こ
れらの濃度は通常の反応最適化を実現するための有用な
出発条件となる。特定の反応における最適二価イオン濃
度は特定の使用酵素だけでなく他の反応成分たとえばdN
TP濃度やプライマー配列および濃度などにも左右されよ
う。当業者には自明であろうが、一般に反応条件、特に
二価陽イオン濃度は通常の実験方法を使用して特定の反
応に合わせて経験的に最適化することができる。

【００５３】従来、混合二価陽イオン（たとえばMn⁺²と
Mg⁺²）緩衝液はRNA鋳型依存性DNA合成を活性化しうるも
のの、感受性と効率の低下を招くため好まれなかった。
混合二価陽イオン緩衝液は本発明の方法には有用である
と、また用途によっては好ましいかもしれないと、期待
される。混合陽イオンを使用すれば、たとえば高効率、
低忠実性Mn⁺²活性化反応と高忠実性Mg⁺²反応の兼ね合い
が図れるようになるかもしれない。

【００５４】耐熱性DNAポリメラーゼをMn⁺²緩衝液中で
使用する高温逆転法および連結型逆転写／増幅法は技術
上周知である。たとえば米国特許第5,310,652号、5,32
2,770号、5,407,800号、5,561,058号、5,641,864号およ
び5,693,517号を参照。これらの各特許は参照により本
書に組み込まれる。本発明の方法はこれらの先行技術の
変更であり、その変更は前述のように突然変異型DNAポ
リメラーゼの使用を伴う。好ましい態様において、反応
はDNAポリメラーゼの活性化を目的に使用される二価陽
イオンとしてMg⁺²を含む緩衝液中で行われる。

【００５５】本方法の1つの利点は、突然変異型DNAポリ
メラーゼの使用がRT伸長の高速化につながるように見
え、結果的にRT反応の所要時間が短縮されることにあ
る。好ましくは、逆転写反応で生成されるcDNAの量を最
大限度にするために、反応が約30分間行われるようにす
る。用途次第では、特にマンガン反応の場合には、1分
以下のRT時間でも満足な結果が得られよう。

【００５６】本方法の他の利点は、突然変異型DNAポリ
メラーゼを使用するとより低い酵素濃度でRT効率を高め
られ、さらにより広範囲の実用塩濃度を実現できること
にある。最適反応条件は、たとえば使用する特定酵素に
左右されようが、通常の方法で経験的に決定しうるもの
と見込まれる。本方法の実施に必要とされる他の態様、
たとえばターゲットRNAの選択、試料の調製、プライマ
ー設計、および（DNAポリメラーゼとDNAポリメラーゼの
活性化に使用される二価陽イオンを除く）試薬と反応条
件の選択などは技術上周知であり、たとえば前掲特許な
どに記載されている。同様に、逆転写を増幅反応と連結
する場合でも、DNAポリメラーゼとDNAポリメラーゼの活
性化に使用される二価陽イオンに関連しない増幅の諸態
様も技術上周知であり、たとえば前掲特許などに記載さ
れている。最後に、RNAの逆転写および増幅の用途も技
術上周知であり、たとえば前掲特許などに記載されてい
る。当業者は本方法を、RNAの逆転写および随意に増幅
が求められる任意の用途に応用することができよう。

【００５７】以下の実施例は説明のために示すだけであ
り、本発明をいかなる形でも限定する意図はない。

【００５８】

【実施例】実施例1 突然変異型DNAポリメラーゼの例「天然型」テルムス・テルモフィルス（Thermus thermo
philus）(Tth) DNAポリメラーゼから決定的アミノ酸の
可能な突然変異を網羅する一連の突然変異型DNAポリメ
ラーゼ19種を構築した。欧州特許公開第0 902,035号と
同時係属米国出願第09/146,631号に記載されているよう
に、Tth DNAポリメラーゼのアミノ酸配列は配列番号3と
して表される決定的配列モチーフを含む（このモチーフ
は、一般的モチーフ配列番号1のより狭い態様である配
列番号2の特定の態様である）。決定的アミノ酸は位置6
83にある（E683）。

【００５９】Tth DNAポリメラーゼの配列およびTth DNA
ポリメラーゼに対応する遺伝子を含むプラスミドは技術
上周知である（たとえば米国特許第5,618,711号および
5,789,224号を参照。両特許は参照により本書に組み込
まれる）。本実施例に使用される特定のプラスミドはあ
るTth DNAポリメラーゼをコードするが、そのポリメラ
ーゼは、参照により本書に組み込まれる米国特許第5,46
6,591号に記載されているような酵素の5’→3’エキソ
ヌクレアーゼ活性を除去するG46E点突然変異をも含む。
さらに前記プラスミドは、このコードされたアミノ酸配
列を変更することなく、コドン678、679、および680の
最初のヌクレオチドにまたがるClaI認識・切断部位を導
入するようなサイレントヌクレオチド置換を含む。5’
→3’エキソヌクレアーゼドメインにおける追加突然変
異の存在は、DNAポリメラーゼのMg⁺²緩衝液中でのRNA逆
転写能にはあまり影響しないと考えられる。というの
は、G46E突然変異をもつTth DNAポリメラーゼはここで
は天然型DNAポリメラーゼとみなされるからである。

【００６０】発現タンパク質中の点突然変異は、標準手
法を使用してコードDNA配列を突然変異させることによ
り導入した。要するに、コドン683を包含するコード鎖
の短い断片を所望の配列を包含する合成断片で置換し
た。長さ約65ヌクレオチドのこの短い断片は制限酵素Cl
aIおよびHindIIIでプラスミドを消化して切り出した。
合成2本鎖DNAインサートは、切り出した断片と同じアミ
ノ酸配列をコードするがコドン683に所望の突然変異を
含むように合成した。次いで、合成断片を消化済みプラ
スミドに接合して、突然変異コドンを含み、所望の点突
然変異をもつ完全長Tth DNAポリメラーゼをコードする
プラスミドを得た。

【００６１】実施例2 逆転写／増幅効率実施例1で述べた20種のDNAポリメラーゼ（天然型1種、
突然変異型19種）について、それぞれの逆転写／増幅反
応触媒能を比較した。大体、各DNAポリメラーゼを使用
して単一酵素による連結型逆転写／増幅反応を実施し
た。各反応に同じ初期ターゲットコピー数を使用し、反
応中に増幅産物の合成をモニターした。各DNAポリメラ
ーゼについて、反応効率の尺度となる任意（ただし一
定）量の増幅産物の生成に要するサイクル数を決定し
た。初期逆転写ステップは一般に逆転写／増幅反応の決
定的律速ステップであるため、総合的な反応効率の改善
は初期逆転写ステップの改善をも示唆する。

【００６２】反応時の増幅核酸の増加は、参照により本
書に組み込まれるHiguchi他、1992、「Bio/Technolog
y」10:413-417; Higuchi他、1993、「Bio/Technology」
11:1026-1030; HiguchiおよびWatson、「PCR Applicati
ons（前掲）」16章; 米国特許第5,994,056号; 欧州特許
公開第487,218号および第512,334号に記載されている方
法を使用してモニターした。これらの方法は本書では動
的PCRと呼ぶが、臭化エチジウム（EtBr）や他のDNA結合
色素が2本鎖DNAと結合したときに示す蛍光強度の増加に
よって反応中の2本鎖DNA量の変化を検出するものであ
る。ターゲット配列の合成に由来する2本鎖DNAの増加は
2本鎖DNAに結合した色素の量の増加とそれに付随する検
出可能な蛍光強度の増加という結果をもたらす。

【００６３】増幅は反応に臭化エチジウムを使用して行
った。あるいは、反応にSYBR（登録商標）Green I（Mol
ecular Probes社−オレゴン州ユージン）を使用して増
幅を行うこともできる。両色素は2本鎖DNAへのインター
カレーションまたは結合に伴いその蛍光強度を増加させ
る。反応は、増幅時に反応混合物の蛍光のモニタリング
を可能にする一体型サーマルサイクラー／蛍光検出装置
で行う。後述の機器に加えて、適当な任意の機器が使用
できることは明らかであろう。

【００６４】RNAターゲットと増幅プライマーターゲットRNAは、ヒトのグリセルアルデヒド-3-リン酸
デヒドロゲナーゼ（GAPDH）遺伝子をコードする発現プ
ラスミドを使用して合成した。GAPDH RNAのある領域
を、5’→3’方向に示した次のプライマーを使用して増
幅した。 P1(配列番号20) 5’-CGAGATCCCTCCAAAATCAA P2(配列番号21) 5’-CATGAGTCCTTCCACGATACCAA 初期ターゲット濃度は標準的な手段で測定した。本書で
述べる比較反応では、絶対コピー数は相対コピー数ほど
重要ではない。各反応で同じ初期コピー数を確保するた
めに、同じ初期RNAストックの希釈液の等分量を使用し
た。

【００６５】当業者はターゲットの選択が便宜的なもの
であることを認識しよう。実質的に同じプロトコールに
他のRNAターゲットと対応する増幅プライマーを使用す
ることもできよう。反応条件については通常の最適化が
期待されよう。増幅各RT-PCR増幅は総反応容量100 μlで行った。最終試薬
濃度は次のとおりであった。

【００６６】 DNAポリメラーゼ 10単位 GAPDH RNA 10⁶コピートリシン 50 mM、pH 8.15 KOAc 50 mM Mg(OAc)₂ 2 mM dATP、dGTP、dCTP 200 μM dUTP 400 μM 各プライマー 200 nM グリセロール 8 % DMSO 1 % 臭化エチジウム 1 μg/ml UNG^* 2単位^* 製造元Roche Molecular Systems、発売元Applied Bio
systems（カリフォルニア州フォスターシティー）臭化エチジウムの代わりにSYBR（登録商標）Green Iを
使用しても増幅産物の検出が可能になる。SYBR（登録商
標）Green I使用の増幅は（10,000Xとして販売されてい
る）SYBR（登録商標）Green IをDMSOで0.2Xに希釈して
行うことができる。

【００６７】臭化エチジウムを使用する反応は好ましく
は、適当な検出波長の選択を可能にするABI PRISM（登
録商標）7700 Sequence Detection System（Applied Bi
osystems）を使用して行う。SYBR（登録商標）Green I
を使用する反応は好ましくは、同じ熱サイクル条件でGe
neAmp（登録商標）5700 Sequence Detection System（A
pplied Biosystems）を使用して行う。GeneAmp（登録商
標）5700はSYBR（登録商標）Green Iと併用するよう設
計してあり、励起および検出波長はこの染料に合わせて
あらかじめ設定する。

【００６８】後述のアッセイは、本質的にGeneAmp（登
録商標）PCRシステム9600サーマルサイクラー（PE Bios
ystems−カリフォルニア州フォスターシティー）からな
る、蛍光検出システムを付加した改造型カスタム装置を
使用して行った。同装置の蛍光検出システムはGeneAmp
（登録商標）5700に採用されているものと類似するが、
臭化エチジウムと併用するよう設計してある。このカス
タム装置を使用して得られる結果は、好ましい装置の1
つを使用して得られる結果に匹敵するものと見込まれよ
う。

【００６９】増幅反応は次に示す特定の温度サイクルプ
ロフィールを使用して行った。検出増幅産物の累積を反応中の各サイクルで、反応蛍光強度
の増加を測定することにより測定した。各増幅サイクル
中に、色素の励起極大付近の波長光で各反応を励起さ
せ、色素の発光を発光極大付近で測定した。

【００７０】蛍光測定値は、蛍光測定値がサイクル間で
比較的一定しているように見受けられる反応初期の一サ
イクル中に得られた初期蛍光測定値で割って正規化し
た。初期蛍光測定値を求めるために選んだサイクル番号
は比較したすべての反応で同じにし、どの測定値も同じ
反応サイクルを基準にした増加を表すようにした。蛍光
が任意蛍光レベル（AFL）を超えるまでに実施した増幅
サイクルの数を実測蛍光値から計算した。AFLは基準蛍
光レベル近くに、ただし実測蛍光強度のランダム変動範
囲を超えるように選び、産物量が幾何級数的に増加する
増幅初期段階で反応速度を測定するようにした。この幾
何級数的増加段階では、特定の閾値に到達するのに要す
るサイクル数はもっぱら初期コピー数と反応効率に依存
する。各反応は同じ初期ターゲットコピー数を使用して
行われるので閾値に到達するまでのサイクル数が反応効
率の尺度となる。もっと後段のサイクルでは、増幅産物
の累積と試薬の消耗から最終的には反応プラトーに至
る。

【００７１】選択したAFLはどの反応でも1.12とした。P
CR増幅は離散型サイクルから成り、また蛍光測定はサイ
クル当たり1回実施されるため、実測蛍光強度は一般に
単一サイクル内でAFL未満からAFL超へと増加する。測定
値の精度を高めるために、AFL閾値に到達するまでの
「正確な」サイクル数（本書ではC_T値と呼ぶ）を、サイ
クル間の蛍光測定値を補間することによって計算した。

【００７２】結果天然型Tth DNAポリメラーゼ（E683）と各突然変異型DNA
ポリメラーゼ（位置683のアミノ酸(aa)によって識別）
を使用して得られたC_T値を次表に示す。各C_T値は2つの
反応で得られた平均値である。比較を容易にするため
に、天然型と突然変異型のC_T値の差（(C_T native)−(C_T
mutant)）も示している。突然変異型DNAポリメラーゼ
の使用によって効率が高まれば結果的に、この閾値に到
達するまでの所要サイクル数が少なくなる、すなわち低
C_T値となる。したがって、C_T値の差がプラスであれば効
率が高まったことになる。

【００７３】

【表２】

【００７４】以上の結果は、位置683のアミノ酸の、Al
a、GlyまたはPro以外の任意のアミノ酸への突然変異が
高効率のDNAポリメラーゼをもたらす結果となることを
示す。そのうち、AspおよびGln突然変異以外はみなC_T値
が少なくとも4サイクル少ないという結果になった。実施例3 逆転写効率実施例1で述べた特定DNAポリメラーゼについて、逆転写
反応触媒能を比較した。逆転写反応は各DNAポリメラー
ゼで、Mg⁺²かMn⁺²を使用して行った。次に、各反応から
得られたcDNAを天然型酵素とMg⁺²を使用して同一条件下
で増幅した。このプロトコールは、特に逆転写／増幅反
応の逆転写部分に対する酵素の効果の測定を可能にす
る。

【００７５】天然型酵素に加えて、アミノ酸位置683が
F、K、L、RおよびYへと突然変異したDNAポリメラーゼを
使用する反応も行った。これらの突然変異はそれぞれ実
施例2で、連結型逆転写／増幅反応の効率を著しく高め
ることが証明されている。逆転写各逆転写は総反応容量100 μlで行った。最終試薬濃度
は次のとおりであった。

【００７６】 DNAポリメラーゼ 5単位 GAPDH RNA 10⁶コピートリシン 50 mM、pH 8.15 KOAc 50 mM Mg(OAc)₂またはMn(OAc)₂ 2 mM dATP、dGTP、dCTP、dUTP 200 μM 各プライマー 200 nM グリセロール 8 % DMSO 1 % SYBR（登録商標）Green I 0.2 X UNG^* 1単位^* 製造元Roche Molecular Systems、発売元Applied Bio
systems（カリフォルニア州フォスターシティー）逆転写反応は次に示す特定の温度サイクルプロフィール
を使用して行った。

【００７７】逆転写時間および温度反応前保温インキュベーション 50℃、2分間逆転写 60℃、30分間保持 4℃ 増幅逆転写後、10 μlの反応産物を10 μl 2mM EGTAに加え
て、金属陽イオンをキレートして後続増幅反応から金属
陽イオンを効果的に除去するようにした。この混合物
を、天然型酵素とMg⁺²を含むPCR増幅混合物に加えた。
こうして、残存突然変異型DNAポリメラーゼを希釈し、
どのような影響も無視しうる程度と見込まれるようにし
た。PCR増幅は総反応容量100 μlで行い、試薬の最終濃
度は次のとおりとした。

【００７８】天然型DNAポリメラーゼ 5単位トリシン 50 mM、pH 8.15 KOAc 50 mM Mg(OAc)₂ 2 mM dATP、dGTP、dCTP、dUTP 200 μM 各プライマー 200 nM グリセロール 8 % DMSO 1 % SYBR（登録商標）Green I 0.2 X 増幅反応は次に示す特定の温度サイクルプロフィールを
使用して行った。

【００７９】結果逆転写用に天然型Tth DNAポリメラーゼ（E683）と各突
然変異型DNAポリメラーゼ（位置683のアミノ酸で識別）
を、また増幅用に一律に天然型Tth DNAポリメラーゼ
を、それぞれ使用して得られたC_T値を次表に示す。比較
を容易にするために、C_T値の差すなわち(C_T native)−
(C_T mutant)も示す。突然変異型DNAポリメラーゼの使用
によって効率が高まれば結果的に、この閾値に到達する
までの所要サイクル数が少なくなる、すなわち低C_T値と
なる。したがって、C_T値の差がプラスなら効率が高まっ
たことになる。

【００８０】

【表３】

【００８１】

【表４】

【００８２】これらの突然変異型DNAポリメラーゼはい
ずれも逆転写／増幅反応の効率を著しく高めた。各反応
のDNA増幅部分は等しく天然型酵素で行われたので、こ
れらの結果は各突然変異型DNAポリメラーゼが反応の逆
転写部分の効率を高めたことを示している。突然変異型
DNAポリメラーゼはいずれの陽イオンを使用する場合で
も著しい効率の改善をもたらした。

【００８３】こうした効率の改善はMg⁺²を使用すると特
に顕著であったし、突然変異型DNAポリメラーゼの使用
はMg⁺²活性化反応を実用的にすることを証明している。
従来報告されてきたとおり、天然型酵素の使用によるRN
A増幅では、Mg⁺²を使用した場合にはC_T値がほぼ10サイ
クルも多くなった（33.8−24.6）ことからも明らかなよ
うに、実用的な反応効率を実現するためには本質的にMn
⁺²の使用が必要になる。それに対して、たとえばE683Y
突然変異型を使用するとMg⁺²活性化反応の効率は天然型
酵素とMn⁺²を使用して実現される効率に等しくなった。

【００８４】実施例4 忠実性特定突然変異型DNAポリメラーゼと天然型酵素の忠実性
をいくつかの方法で比較した。Mg⁺²緩衝液で実施した連
結型逆転写／増幅反応の忠実性を、Mn⁺²緩衝液中で実施
した場合の忠実性と比較した。さらに、DNA増幅に使用
した場合のDNAポリメラーゼの忠実性も比較した。

【００８５】DNAポリメラーゼの忠実性は、DNAポリメラ
ーゼを使用して生成された増幅産物の融解温度（Tm）プ
ロフィールの測定によって比較することができる。ある
DNAポリメラーゼの忠実性は鎖合成時の誤った取り込み
数に反映される。低忠実性酵素の使用による増幅は得ら
れる増幅配列集団の異質性が強まる結果となろう。この
異質性を測定するには、増幅産物を変性処理して再アニ
ールさせ、得られる2本鎖DNA分子のTmを測定する。この
2本鎖は異質の配列集合からランダムに結合されるた
め、多数のミスマッチを含む。増幅産物集団内の配列異
質性が強ければ強いほど、2本鎖中の平均ミスマッチ数
は多くなる。これらのミスマッチは2本鎖DNA分子を不安
定にし、実測Tmを引き下げる結果となる。

【００８６】動的PCR反応の増幅産物に関する融解曲線
の決定は、増幅に使用されるサーマルサイクラー／蛍光
検出装置を使用して簡便に行うことができる。増幅後、
産物の変性温度を包囲するある温度範囲にわたって蛍光
と温度の関係を測定する。2本鎖および1本鎖分子の間の
移行は色素蛍光強度の変化に反映される。こうして融解
曲線が簡便に決定できる。あるいは、反応系の2本鎖DNA
量の尺度となる光学密度の温度変化に伴う変化をモニタ
ーするのが一般的である標準的な方法で測定を行うこと
もできる。

【００８７】天然型DNAポリメラーゼの忠実性を、E683K
突然変異とE683N突然変異をそれぞれ含む2つの突然変異
型DNAポリメラーゼの忠実性と比較した。連結型逆転写
／増幅反応は本質的に実施例2で述べたような、ただし
次の点が異なるMn⁺²緩衝液とMg⁺²緩衝液の両方でまった
く同じように実施した。Mn⁺²反応では、反応系に2 mMの
Mn(OAc)₂を使用した。すべての反応は25 UのDNAポリメ
ラーゼを使用して行った。

【００８８】増幅産物の2本鎖ターゲット配列のハイブ
リダイゼーション安定性プロフィール（融解曲線）を測
定するために、増幅後反応混合物の蛍光強度を、少なく
とも60℃〜80℃をカバーする温度範囲にわたってモニタ
ーした。予想どおり、蛍光測定値はS字状の融解曲線を
描く結果となった。TmはこのS字状融解曲線の変曲点の
温度と定義されるが、それはターゲットの半分が1本鎖
型となる温度に対応する。

【００８９】結果 Mg⁺²活性化反応とMn⁺²活性化反応の増幅産物に関する実
測Tm値は次表のとおりである。各測定値は複製反応の平
均である。温度の単位はすべて℃である。増幅産物のTm値 DNAポリメラーゼ Tm、Mg⁺² Tm、Mn⁺² 天然型 80 78 E683K 80 76 E683N 80 76 Mg⁺²を使用すると、天然型と突然変異型のDNAポリメラ
ーゼに忠実性の差はまったく観測されなかった。20種の
DNAポリメラーゼすべてを使用して実施した同様の反応
から、Mg⁺²活性化反応ではどの突然変異型DNAポリメラ
ーゼの忠実性も天然型DNAポリメラーゼの忠実性と同じ
であることが確認された。

【００９０】Mn⁺²緩衝液を使用して得られた結果をMg⁺²
緩衝液を使用して得られた結果と比較すると、Tm値の低
下からわかるようにすべてのDNAポリメラーゼの忠実性
が低下している。興味深いことに、Mn⁺²緩衝液を使用す
ると、少なくともこれらの反応条件の下では2つの突然
変異型DNAポリメラーゼが天然型酵素の場合よりも低い
忠実性を示した。

【００９１】忠実性はMn⁺²濃度の影響を受ける。突然変
異型酵素と天然型酵素の忠実性に対するMn⁺²濃度の影響
を比較するために、追加の実験をE683K突然変異を使用
してMn⁺²濃度0.5〜5 mMの範囲で実施した。その結果に
よれば（データは示していない）、どちらの酵素を使用
した反応でも予想どおり最低Mn⁺²濃度が最高の忠実性を
もたらした。突然変異型酵素の忠実性は天然型酵素のそ
れよりもMn⁺²濃度上昇の影響を強く受けた。しかし意外
にも、少なくともこれらの実験では、最低Mn⁺²濃度で最
高の効率を示したのも突然変異型酵素であった。したが
って、突然変異型酵素の使用はより低Mn⁺²濃度での反応
の実施を可能にし、もって忠実性に対するMn⁺²濃度の有
害な影響を最小限に抑える。

【００９２】さらに、Mn⁺²活性化反応とMg⁺²活性化反応
のどちらも本質的に前述の要領で実施したが、ただし反
応のDNA部分に限った忠実性への影響を観察しやすくす
る意味でDNA鋳型を使用した。いずれの場合にも、DNA増
幅産物のTm値はRNA増幅産物のTm値と見分けがつかなか
った。以上の結果は、前掲実施例の結果と総合すれば、
本発明の方法の優位性を証明する。先行技術の高温逆転
写および増幅方法は十分な反応効率を実現するためにMn
⁺²を使用して実施されたが、忠実性の低下に見舞われ
た。本発明はいくつかの選択肢を提供する。RNAの高温
逆転写および増幅にMn⁺²を使用するときは、突然変異型
酵素の使用により天然型酵素使用の場合よりも高い効率
が実現するし、より低Mn⁺²濃度での反応の実施が可能に
なり、もって忠実性に対するMn⁺²濃度の有害な影響を最
小限に抑えることができる。Mg⁺²を使用するときは、突
然変異型酵素の使用により高温、高忠実性のRNA逆転写
および増幅が実用効率で実現される。

【００９３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> HIGH TEMPERATURE REVERSE TRANSCRIPTION USING MUTANT DNA POLYMERAS ES <130> B015620 <150> US 60/198,336 <151> 2000-04-18 <160> 21 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> sequence motif <220> <221> VARIANT <222> (2)..(2) <223> X is S or A <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> X is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (4)..(4) <223> X is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> X is L or I <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> X is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> X is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> X is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (9)..(9) <223> X is any amino acid <220> <221> VARIANT <222> (10)..(10) <223> X is any amino acid <400> 1 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> sequence motif <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> X is Q or G <220> <221> VARIANT <222> (6)..(6) <223> X is S or A <400> 2 Leu Ser Xaa Glu Leu Xaa Ile Pro Tyr Glu Glu 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> sequence motif <400> 3 Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> sequence motif <220> <221> VARIANT <222> (3)..(3) <223> X is Q or G <400> 4 Leu Ser Xaa Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> sequence motif <220> <221> VARIANT <222> (7)..(7) <223> X is V or I <400> 5 Leu Ser Val Arg Leu Gly Xaa Pro Val Lys Glu 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> sequence motif <400> 6 Leu Ser Lys Arg Ile Gly Leu Ser Val Ser Glu 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> sequence motif <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> X is S or T <400> 7 Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Xaa Arg Lys Glu 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <400> 8 Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Thermus flavus <400> 9 Leu Ser Gly Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Thermus thermophilus <400> 10 Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Thermus sp. Z05 <400> 11 Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 1 5 10 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Thermus sp. sps17 <400> 12 Leu Ser Gln Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu 1 5 10 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Thermus caldophilus <400> 13 Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Thermus filiformis <400> 14 Leu Ser Gln Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu 1 5 10 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <400> 15 Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Thermotoga neapolitana <400> 16 Leu Ser Val Arg Leu Gly Ile Pro Val Lys Glu 1 5 10 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Thermosipho africanus <400> 17 Leu Ser Lys Arg Ile Gly Leu Ser Val Ser Glu 1 5 10 <210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus caldotenax <400> 18 Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu 1 5 10 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Bacillus stearothermophilus <400> 19 Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Thr Arg Lys Glu 1 5 10 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 20 cgagatccct ccaaaatcaa 20 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 21 catgagtcct tccacgatac caa 23

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１３年５月３０日（２００１．５．３
０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【請求項４】アミノ酸配列の位置4のアミノ酸が天然
型配列に比してE、A、G、P、QまたはD以外のアミノ酸へ
と突然変異している請求項１〜３のいずれかに記載の方
法。

【請求項５】 RNAを増幅するための方法であって、次
のステップを含む方法： (a) 請求項１記載の方法により前記RNAを逆転写して、
cDNAを提供すること、(b) 前記cDNAを増幅すること。

【請求項６】 DNAポリメラーゼがその天然型において
配列番号5、配列番号6および配列番号7よりなる群から
選択されるアミノ酸配列を含む請求項５記載の方法。

【請求項７】 DNAポリメラーゼがその天然型において
配列番号2のアミノ酸配列を含む請求項５記載の方法。

【請求項８】 DNAポリメラーゼがその天然型において
配列番号3および配列番号4よりなる群から選択されるア
ミノ酸配列を含む請求項７記載の方法。

【請求項９】ステップ(b)の増幅がポリメラーゼ連鎖
反応法を使用して行われる請求項５〜８のいずれかに記
載の方法。

【請求項１０】 RNAが単一酵素逆転写／増幅反応を使
用して増幅される請求項５〜９のいずれかに記載の方
法。

【請求項１１】突然変異型DNAポリメラーゼが耐熱性
である請求項５〜10のいずれかに記載の方法。

【請求項１２】アミノ酸配列の位置4のアミノ酸が天
然型配列に比してE、A、G、P、QまたはD以外のアミノ酸
へと突然変異している請求項５〜11のいずれかに記載の
方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者カリタマリアエルフストロムアメリカ合衆国，カリフォルニア 94131, サンフランシスコ，ダイアモンドハイツブールバード 5285，アパートメントナンバー 103 (72)発明者デビッドハロージェルファンドアメリカ合衆国，カリフォルニア 94611, オークランド，チェルトンドライブ 6208 (72)発明者ラッセルジーンヒグチアメリカ合衆国，カリフォルニア 94501, アラメダ，リバティアベニュ 3258 (72)発明者トーマスウィリアムマイアーズアメリカ合衆国，カリフォルニア 94501, アラメダ，フェルンサイドブールバード 2910 (72)発明者ナンシージェアンヌショエンブルナーアメリカ合衆国，カリフォルニア 94556, モラガ，ワンデルドライブ 14 (72)発明者アリスミンワンアメリカ合衆国，カリフォルニア 94549, ラファイエット，クァンディトロード 1246 Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA04 FA18 GA30 HA19

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 RNAを逆転写するための、次のステップ
を含む方法： (a) 前記RNA、プライマー、二価陽イオン、および突然
変異型熱活性DNAポリメラーゼを含む逆転写反応混合物
であって、前記の突然変異型DNAポリメラーゼが i) その天然型において前記DNAポリメラーゼが配列番
号1であるアミノ酸配列を含むこと、 ii) 前記アミノ酸配列の位置4のアミノ酸が前記天然型
配列に比してE、A、GまたはP以外のアミノ酸へと突然変
異していること、を特徴とする逆転写反応混合物を用意
すること；および(b) 前記反応混合物を、前記突然変
異型DNAポリメラーゼが前記プライマーの伸長産物の合
成を開始させるに足る温度で処理して、前記RNAに対し
て相補的であるcDNA分子を提供すること。
【請求項２】 DNAポリメラーゼがその天然型において
配列番号5、配列番号6および配列番号7よりなる群から
選択されるアミノ酸配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】 DNAポリメラーゼがその天然型において
配列番号2のアミノ酸配列を含む請求項１記載の方法。
【請求項４】 DNAポリメラーゼがその天然型において
配列番号3および配列番号4よりなる群から選択されるア
ミノ酸配列を含む請求項３記載の方法。
【請求項５】二価陽イオンがMg⁺²である請求項１〜４
のいずれかに記載の方法。
【請求項６】突然変異型DNAポリメラーゼが耐熱性で
ある請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】 DNAポリメラーゼがテルモス（Thermus）
種のDNAポリメラーゼの突然変異型である請求項1、3お
よび4のいずれかに記載の方法。
【請求項８】 DNAポリメラーゼがテルムス・テルモフ
ィルス（Thermus thermophilus）DNAポリメラーゼまた
はテルムス・アクアティクム（Thermus aquaticus）DNA
ポリメラーゼの突然変異型である請求項７記載の方法。
【請求項９】ステップ(b)の反応混合物の温度が40℃
〜80℃である請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】アミノ酸配列の位置4のアミノ酸が天
然型配列に比してE、A、G、P、QまたはD以外のアミノ酸
へと突然変異している請求項１〜９のいずれかに記載の
方法。
【請求項１１】 RNAを増幅するための方法であって、
次のステップを含む方法： (a) 請求項１記載の方法により前記RNAを逆転写して、
cDNAを提供すること、(b) 前記cDNAを増幅すること。
【請求項１２】 DNAポリメラーゼがその天然型におい
て配列番号5、配列番号6および配列番号7よりなる群か
ら選択されるアミノ酸配列を含む請求項11記載の方法。
【請求項１３】 DNAポリメラーゼがその天然型におい
て配列番号2のアミノ酸配列を含む請求項11記載の方
法。
【請求項１４】 DNAポリメラーゼがその天然型におい
て配列番号3および配列番号4よりなる群から選択される
アミノ酸配列を含む請求項13記載の方法。
【請求項１５】ステップ(b)の増幅がポリメラーゼ連
鎖反応法を使用して行われる請求項11〜14のいずれかに
記載の方法。
【請求項１６】 RNAが単一酵素逆転写／増幅反応を使
用して増幅される請求項11〜15のいずれかに記載の方
法。
【請求項１７】二価陽イオンがMg⁺²である請求項11〜
16のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】突然変異型DNAポリメラーゼが耐熱性
である請求項11〜17のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】 DNAポリメラーゼがテルムス（Thermu
s）種の一種のDNAポリメラーゼの突然変異型である請求
項11、13および14のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】 DNAポリメラーゼがテルムス・テルモ
フィルス（Thermus thermophilus）DNAポリメラーゼま
たはテルムス・アクアティクス（Thermus aquaticus）D
NAポリメラーゼの突然変異型である請求項19記載の方
法。
【請求項２１】ステップ(b)の反応混合物の温度が40
℃〜80℃である請求項11〜20のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】アミノ酸配列の位置4のアミノ酸が天
然型配列に比してE、A、G、P、QまたはD以外のアミノ酸
へと突然変異している請求項11〜21のいずれかに記載の
方法。