ES2270915T3 - Trancripcion reversa a temperatura elevada utilizando polimerasas de dna mutantes. - Google Patents

Abstract

Un método para la transcripción reversa y la amplifi- cación de un RNA en una reacción acoplada de transcripción reversa y amplificación en un único tubo, con una sola en- zima, que comprende: (a) proporcionar una mezcla de reacción de transcrip- ción reversa que comprende dicho RNA, un cebador, Mg2+ y una polimerasa de DNA termoactiva mutante, en la que dicha po- limerasa de DNA mutante se caracteriza porque i) en su forma nativa, dicha polimerasa de DNA en su dominio polimerasa de DNA comprende una secuencia de aminoácidos que es la del ID de SEC Nº:1; ii) el aminoácido en la posición 2 de dicha se- cuencia de aminoácidos es S o A y el aminoácido en la posición 5 de dicha secuencia de aminoácidos es L o I; y iii) el aminoácido en la posición 4 de dicha se- cuencia de aminoácidos está mutado en relación con di- cha secuencia nativa a un aminoácido diferente de E, A, G o P; y (b) tratar dicha mezcla de reacción a una temperatura suficiente para que dicha polimerasa de DNA mutante inicie lasíntesis de un producto de extensión de dicho cebador para proporcionar una molécula de cDNA complementario a di- cho RNA, con un par de cebadores que comprende un primer cebador que es lo suficientemente complementario con el RNA para hibridar con éste e iniciar la síntesis de una molécu- la de cDNA complementario con el RNA, y un segundo cebador que es lo suficientemente homólogo con dicho RNA para hibridar con el cDNA e iniciar la síntesis de un producto de extensión, y (c) amplificar dicho cDNA.

Description

Transcripción reversa a temperatura elevada utilizando polimerasas de DNA mutantes.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención está relacionada con el campo de la molecular biología y, en particular, está relacionada con los métodos para la transcripción reversa y amplificación de secuencias de ácido ribonucleico (RNA).

Descripción de la materia relacionada

El término "transcriptasa reversa" describe una clase de polimerasas caracterizadas como polimerasas de DNA dependientes de RNA. Todas las transcriptasas reversas conocidas requieren un cebador para sintetizar un tránscrito de DNA a partir de un molde de RNA. Históricamente, la transcriptasa reversa se ha utilizado principalmente para transcribir el mRNA en cDNA, que entonces puede clonarse en un vector para su posterior manipulación.

El término "polimerasa de DNA" describe una clase de polimerasas caracterizadas como polimerasas de DNA dependientes de DNA. La polimerasa de DNA muestra una fuerte discriminación contra la utilización de un molde de RNA, como es de esperar por sus funciones in vivo. Sin embargo, varios laboratorios han demostrado que algunas polimerasas de DNA son capaces de realizar una transcripción reversa de RNA in vitro (Karkas, 1973, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 70:3834-3838; Gulati et al., 1974, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71:1035-1039; y Wittig y Wittig, 1978, Nuc. Acids Res. 5:1165-1178). Gulati et al. descubrieron que la Pol I de E. coli podía utilizarse para transcribir RNA viral de Q\beta utilizando oligo(dT) 10 como cebador. Wittig y Wittig han mostrado que la Pol I de E. coli puede utilizarse para la transcripción reversa de tRNA que se ha elongado enzimáticamente con oligo(dA). Sin embargo, como demostraron Gulati et al., la cantidad de enzima necesaria y el pequeño tamaño del producto de cDNA sugieren que la actividad transcriptasa reversa de la Pol I de E. coli tiene poco valor práctico.

Se ha descrito que lapolimerasade DNA de T. aquaticus (Taq), una polimerasa de DNA termoestable, sintetiza cDNA de forma ineficiente utilizando Mg^{+2} como ion metálico divalente (Jones y Foulkes, 1989, Nuc. Acids. Res. 176:8387-8388). Tse y Forget, 1990, Gene 88:293-296; y Shaffer et al., 1990, Anal. Biochem. 190:292-296, han descrito métodos para la amplificación de RNA utilizando la polimerasa de DNA Taq e ion Mg^{+2}. Sin embargo, los métodos son ineficientes y no son sensibles.

La amplificación de secuencias de ácido nucleico, tanto RNA como DNA, se describe en las patentes estadounidenses Nº 4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188. Un método preferido, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), normalmente se lleva a cabo utilizando una polimerasa de DNA termoestable, como la polimerasa de DNA Taq, que es capaz de soportar las temperaturas que se utilizan para desnaturalizar el producto amplificado en cada ciclo. Actualmente la PCR es bien conocida en la materia y se ha descrito extensivamente en la literatura científica. Véase, por ejemplo, PCR Applications, 1999, (Innis et al., eds., Academic Press, San Diego), PCR Strategies, 1995, (Innis et al., eds., Academic Press, San Diego); PCR Protocols, 1990, (Innis et al., eds., Academic Press, San Diego); y PCR Technology, 1989, (Erlich, ed., Stockton Press, New York). Proveedores comerciales como PE Biosystems (Foster City, CA) distribuyen reactivos de PCR y publican protocolos de PCR. En Abramson y Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47, se proporciona una revisión de los métodos de amplificación.

Como la transcripción reversa utilizando la polimerasa de DNA Taq en un tampón de ion magnesio era demasiado ineficiente para ser práctica, se llevó a cabo una amplificación de PCR inicial, a partir de un molde de RNA, mediante una primera transcripción reversa de la diana utilizando, por ejemplo, una transcriptasa reversa viral no termoestable como la transcriptasa reversa del virus de la leucemia murina de Molony (RT MoMuLV) o AMV-RT, y a continuación la amplificación del cDNA resultante utilizando una polimerasa de DNA termoestable.

Se consiguió un avance significativo con el descubrimiento de que una polimerasa de DNA termoestable podía utilizarse para la transcripción reversa eficiente de un molde de RNA llevando a cabo la reacción en un tampón con manganeso (Mn^{+2}), en lugar de con un tampón de magnesio (Mg^{+2}), como es preferible para la extensión de cebadores utilizando un molde de DNA. La transcripción reversa eficiente activada por Mn^{+2} utilizando una polimerasa de DNA termoestable se describe en las patentes estadounidenses Nº 5.310.652, 5.322.770, 5.407.800, 5.641.864, 5.561.058 y 5.693.517. Ya que tanto la síntesis de cDNA a partir de un molde de RNA como la síntesis de DNA a partir de un molde de DNA pueden realizarse en un tampón Mn^{+2}, la utilización de un tampón Mn+^{2} permite las reacciones acopladas de amplificación/transcripción reversa con una única enzima, (véase también Myers y Sigua, 1995, en PCR Strategies, supra, capítulo 5).

Resumen de la invención

La presente invención está relacionada con los métodos para la transcripción reversa y amplificación de secuencias de RNA, preferiblemente utilizando una única polimerasa de DNA termoestable en una reacción acoplada en un único tubo. Dichos métodos proporcionan una mejora de la eficiencia de la transcripción reversa ("RT") en relación a los métodos de transcripción reversa a elevada temperatura previamente descritos.

La invención proporciona métodos para la transcripción reversa y la amplificación de secuencias de RNA utilizando una única polimerasa de DNA termoestable en un tampón de ion magnesio (Mg^{+2}) en una reacción acoplada, en un solo tubo. Los métodos realizados utilizando un tampón con Mg^{+2} proporcionan una fidelidad mejorada sobre los métodos
previamente descritos que se basan en la activación de una polimerasa de DNA termoestable con manganeso (Mn^{+2}).

Los métodos de la presente invención utilizan una polimerasa de DNA mutante termoactiva, preferiblemente termoestable, que contiene una mutación puntual en una posición aminoacídica crítica previamente descrita que afecta a la capacidad de la polimerasa de DNA de incorporar didesoxinucleótidos (ddNTP) marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína o cianina. La presente invención resulta del descubrimiento sorprendente de que las polimerasas de DNA mutantes también muestran una capacidad significativamente mayor de realizar una transcripción reversa, concretamente en un tampón de Mg^{+2}.

Las polimerasas de DNA mutantes útiles en los métodos de la presente invención se describen en la publicación de patente europea Nº 0.902.035, la solicitud copendiente estadounidense Nº 09/146.631, y la publicación de patente internacional Nº PCT WO 98/40496. Estas polimerasas de DNA mutantes se han descrito que muestran una mayor capacidad para incorporar nucleótidos, lo que incluye desoxinucleótidos (dNTP) y análogos de base como los didesoxinucleótidos (ddNTP), marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína y cianina. Convenientemente, estas polimerasas de DNA mutantes se denominan aquí polimerasas de DNA "que incorporan colorantes de la familia de la fluoresceína", o polimerasas de DNA "ICF". La utilidad primaria descrita de las polimerasas de DNA ICF son las reacciones de secuenciación de DNA que utilizan terminadores coloreados (ddNTP marcados con un colorante) marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína o la cianina. Como la polimerasa de DNA salvaje discrimina los análogos de nucleótido, y más aun los análogos de nucleótido marcados, las reacciones de secuenciación con terminadores coloreados normalmente se llevan a cabo utilizando un exceso de terminadores coloreados. Al disminuir la discriminación de los terminadores marcados con colorantes, las polimerasas de DNA ICF permiten que las reacciones de secuenciación puedan realizarse con una concentración significativamente menor de terminadores coloreados.

La posición aminoacídica crítica que está mutada en las polimerasas de DNA utilizadas en los presentes métodos, que es el mismo aminoácido crítico que afecta a la capacidad de la polimerasa de DNA de incorporar didesoxinucleótidos marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína y la cianina, se identifica en la publicación de patente europea Nº 0.902.035 y la solicitud copendiente estadounidense Nº 09/146.631, según su localización en una secuencia motivo conservada presente en la forma nativa de la enzima. En la Tabla 1 se proporcionan ejemplos de la secuencia motivo en una serie de polimerasas de DNA. La secuencia motivo y el aminoácido crítico se identifican a continuación esencialmente de la misma forma.

Descrito de la forma más general, utilizando las abreviaturas estándar de una letra para los aminoácidos, este motivo crítico de la forma nativa de la polimerasa de DNA comprende la secuencia de aminoácidos

LXXXXXXXXXE

(ID de SEC Nº: 1),

en la que X en la posición 2 es S o A, las X en las posiciones 3, 4, 6, 7, 8, 9 y 10 son cualquier aminoácido, y la X en la posición 5 es L o I.

En una realización más específica, el motivo crítico en la forma nativa de la polimerasa de DNA comprende la secuencia de aminoácidos

LSXELXIPYEE

(ID de SEC Nº: 2),

en la que la X en la posición 3 es Q o G, y la X en la posición 6 es S o A. Las polimerasas de DNA del género Thermus son ejemplos de polimerasas de DNA que contienen este motivo.

En una realización preferida, el motivo crítico en la forma nativa de la polimerasa de DNA comprende la secuencia de aminoácidos

LSQELAIPYEE

(ID de SEC Nº: 3).

Las polimerasas de DNA de las especies Thermus aquaticus, themophilus, ZO5 y caldophilus son ejemplos de polimerasas de DNA que contienen este motivo.

En otra realización preferida, el motivo crítico en la forma nativa de la polimerasa de DNA comprende la secuencia de aminoácidos

LSXELSIPYEE

(ID de SEC Nº: 4),

en la que la X en la posición 3 es Q o G. Las polimerasas de DNA de las especies Thermus flavus, sps17 y filiformis son ejemplos de polimerasas de DNA que contienen este motivo.

En otra realización más específica, el motivo crítico en la forma nativa de la polimerasa de DNA comprende la secuencia de aminoácidos

\newpage

LSVRLGXPVKE

(ID de SEC Nº: 5);

en la que la X en la posición 7 es V o I. Las polimerasas de DNA de las especies Thermotoga marítima y neopolitana son ejemplos de polimerasas de DNA que contienen este motivo.

En otra realización más específica, el motivo crítico en la forma nativa de la polimerasa de DNA comprende la secuencia de aminoácidos

LSKRIGLSVSE

(ID de SEC Nº: 6).

Las polimerasas de DNA de Thermosipho africanus son un ejemplo de polimerasa de DNA que contiene este motivo.

En otra realización más específica, el motivo crítico en la forma nativa de la polimerasa de DNA comprende la secuencia de aminoácidos

LAQNLNIXRKE

(ID de SEC Nº: 7),

en la que la X en la posición 8 es S o T. Las polimerasas de DNA de las especies Bacillus caldotenax y stearothermophilus son ejemplos de polimerasas de DNA que contienen este motivo.

En cada uno de los motivos críticos identificadas anteriormente, elaminoácido crítico es el aminoácido en la posición 4.

Como se demuestra en los ejemplos, la mutación del aminoácido crítico a cualquier aminoácido diferente de E (presente en la polimerasa de DNA nativa utilizada en los ejemplos), A, G o P, proporciona una mejora de laeficiencia de la RT. Así, los métodos de la presente invención utilizan una polimerasa de DNA mutante, termoactiva, preferiblemente termoestable, que se caracteriza porque la forma nativa de la polimerasa de DNA comprende una secuencia motivo que se selecciona de entre el grupo que consiste en las ID de SEC Nº: 1-7, y el aminoácido en la posición 4 del motivo se muta a cualquier aminoácido diferente de E, A, G o P. Preferiblemente, el aminoácido crítico se muta a cualquier aminoácido diferente de E, A, G, P o Q, más preferiblemente a cualquier aminoácido diferente de E, A, G, E, Q o D.

La invención está relacionada con los métodos para la transcripción reversa y amplificación de un RNA en una reacción acoplada de transcripción reversa y amplificación con una única enzima en un solo tubo, que comprenden:

(a) proporcionar una mezcla de reacción de transcripción reversa que comprende dicho RNA, un cebador, Mg^{2+} y una polimerasa de DNA mutante termoactiva; en la que dicha polimerasa de DNA mutante se caracteriza porque

i)

dicha polimerasa de DNA en su forma nativa, en el dominio polimerasa de DNA comprende una secuencia de aminoácidos que es la del ID de SEC Nº: 1;

ii)

el aminoácido en la posición 2 de dicha secuencia de aminoácidos es S o A, y el aminoácido en la posición 5 de dicha secuencia de aminoácidos es L o I; y

iii)

comparado con dicha secuencia nativa, el aminoácido en la posición 4 de dicha secuencia de aminoácidos se muta a un aminoácido diferente de E, A, G o P; y

(b) someter dicha mezcla de reacción a una temperatura suficiente para que dicha polimerasa de DNA mutante inicie la síntesis de un producto de extensión de dicho cebador para proporcionar una molécula de cDNA complementario a dicho RNA, con un par de cebadores que comprenden un primer cebador que es lo suficientemente complementario al RNA para hibridar con éste e iniciar la síntesis de una molécula de cDNA complementario al RNA, y un segundo cebador que es lo suficientemente homólogo a dicho RNA para hibridar con el cDNA e iniciar la síntesis de un producto de extensión, y

(c) amplificar dicho cDNA.

Descripción detallada de la invención

Varios términos se definen a continuación para una mejor comprensión de la invención.

El término "polimerasa de DNA termoactiva", como se utiliza aquí, se refiere a una polimerasa de DNA que tiene un óptimo de temperatura de reacción elevado. La enzima termoactiva utilizada en la presente invención cataliza la extensión del cebador de forma óptima a una temperatura de entre 60 y 90ºC.

El término "polimerasa de DNA termoestable" se refiere a una polimerasa de DNA que es estable en calor, es decir, no queda desnaturalizada de forma irreversible (inactivada) cuando se somete a temperaturas elevadasdurante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de ácidos nucleicos de doble cadena. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización de un ácido nucleico son bien conocidas en la materia. Como se utiliza aquí, una polimerasa termoestable es adecuada para su utilización en una reacción de ciclado de temperatura como los métodos de amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") descritos en 4.965.188.

Una "reacción de transcripción reversa a elevada temperatura", como se utiliza aquí, se refiere a una reacción de transcripción reversa que se realiza a una temperatura de al menos 40ºC, preferiblemente entre 40ºC-80ºC y más preferiblemente entre 50ºC-70ºC.

El término "gen" se refiere a una secuencia de DNA que comprende las secuencias control y codificantes necesarias para la producción de un polipéptido o precursor bioactivo recuperable.

El término "nativa" se refiere a un gen o producto génico que se ha aislado de una fuente que aparece naturalmente. Este término también se refiere a una forma recombinante de la proteína nativa producida mediante técnicas de biología molecular que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la de la forma nativa.

El término "mutante" se refiere a un gen al que se le ha alterado la secuencia de ácido nucleico o un producto génico al que se le ha alterado la secuencia de aminoácidos, lo que resulta en un producto génico que puede tener propiedades funcionales alteradas si se compara con el gen o producto génico nativo o salvaje. Tales alteraciones incluyen mutaciones puntuales, deleciones e inserciones.

Como se utiliza aquí, una "mutación puntual" en una secuencia de aminoácidos se refiere a una única sustitución de aminoácidos o una única deleción de aminoácidos. Preferiblemente se introduce una mutación puntual en una secuencia de aminoácidos mediante un cambio de codón adecuado en el DNA codificante.

Los aminoácidos individuales en una secuencia se representan aquí como AN, en la que A es el aminoácido en la secuencia y N es la posición en la secuencia. Las mutaciones puntuales tipo sustitución en una secuencia de aminoácidos se representan aquí como A_{1}NA_{2}, en la que A_{1} es el aminoácido en la secuencia de proteína no mutada, A_{2} es el aminoácido en la secuencia de proteína mutada, y N es la posición en la secuencia de aminoácidos. Para denominar los aminoácidos se utilizan tanto los códigos de una letra como de tres letras (véase Lehninger, Biochemistry 2ª ed., 1975, Worth Publishers, Inc. New York, NY, Págs. 73-75). Por ejemplo, una mutación G46D representa un cambio de glicina a ácido aspártico en la posición aminoacídica 46. Las posiciones aminoacídicas se numeran en base a la secuencia completa de la proteína de la cual se deriva la región que incluye la mutación. Las representaciones de los nucleótidos y las mutaciones puntuales en las secuencias de DNA se indican de forma análoga.

Los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se refieren a los cebadores, sondas y fragmentos de oligómero a detectar, y pueden ser generales para los polidesoxiribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), los poliribonucleótidos (que contienen D-ribosa), y para cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N-glucósido de una base purínica o pirimidínica, o una base purínica o pirimidínica modificada. No se pretende hacer una distinción en longitud entre los términos "ácido nucleico" y "oligonucleótido", y estos términos se utilizarán de forma intercambiable. Estos términos se refieren sólo a la estructura primaria de la molécula. Por lo tanto, estos términos incluyen el DNA de cadena doble y sencilla, así como el RNA de cadena doble y sencilla.

Los oligonucleótidos pueden obtenerse mediante cualquier método adecuado, lo que incluye por ejemplo, la clonación y restricción de las secuencias apropiadas y la síntesis química directa mediante un método como el del fosfotriéster de Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99; el método del fosfodiéster de Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151; el método de la dietilfosforamidita de Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; y el método en soporte sólido de la patente estadounidense Nº 4.458.066. Es preferible la síntesis automatizada utilizando una química de cianoetilfosforamidita. Los reactivos e instrumentos están disponibles comercialmente a través de, por ejemplo, PE Biosystems (Applied Biosystems Foster City, CA) y Pharmacia (Piscataway, NJ).

El término "cebador", como se utiliza aquí, se refiere a un oligonucleótido, sea natural o sintético, que es capaz de actuar como un punto de iniciación de síntesis si se somete a unas condiciones en las que se inicie la extensión de cebadores. Un cebador es preferiblemente un oligodesoxiribonucleótido de cadena sencilla. La longitud apropiada de un cebador depende de la utilización que se pretende dar al cebador, pero normalmente oscila entre 15 y 35 nucleótidos. Las moléculas cortas de cebador generalmente requieren temperaturas más bajas para formar complejos híbridos lo suficientemente estables con el molde. No es necesario que un cebador contenga la secuencia exacta del molde pero debe ser lo suficientemente complementaria para que hibride con un molde y para que aparezca una elongación del cebador.

Un "par de cebadores", como se utiliza aquí, se refiere a un primer y segundo cebador seleccionados para funcionar en una reacción de amplificación, como una reacción en cadena de la polimerasa, para amplificar la secuencia diana deseada. Por ejemplo, para la utilización en una reacción acoplada de transcripción reversa/ amplificación para amplificar un RNA diana, un par de cebadores comprende un primer y segundo cebador, en los que el primer cebador es lo suficientemente complementario al RNA diana para hibridar con éste e iniciar la síntesis de una molécula de cDNA complementario al RNA diana, y dicho segundo cebador es lo suficientemente homólogo a dicho RNA diana para hibridar con el cDNA e iniciar la síntesis de un producto de extensión. El diseño de pares de cebadores para la amplificación de secuencias de ácido nucleico es bien conocida en la materia.

Un cebador puede marcarse, si se desea, mediante la incorporación de un marcaje detectable mediante métodos espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, o químicos. Por ejemplo, los marcajes útiles incluyen ^{32}P, colorantes fluorescentes, reactivos electrodensos, enzimas (como se utiliza generalmente en los ensayos ELISA), biotina, o haptenos y proteínas para los que haya disponibles antisueros o anticuerpos monoclonales.

Como se utiliza aquí, el término "cDNA" se refiere a una molécula de DNA copia sintetizada utilizando una cadena de ácido ribonucleico (RNA) como molde. El RNA puede ser mRNA, tRNA, rRNA, u otra forma de RNA, como RNA viral. El cDNA puede ser de cadena sencilla, de cadena doble o puede estar unido mediante puentes de hidrógeno a una molécula de RNA complementario, como en un híbrido RNA/cDNA.

El término "mezcla de reacción de transcripción reversa" se refiere a una solución acuosa que comprende los diferentes reactivos utilizados para la transcripción reversa de un RNA diana. Esta incluye los enzimas, tampones acuosos, sales, cebadores oligonucleótidos, ácido nucleico diana y nucleósidos trifosfato. En función del contexto, la mezcla puede ser una mezcla de reacción de transcripción reversa completa o incompleta.

El término "mezcla de reacción de amplificación" se refiere a una solución acuosa que comprende los diferentes reactivos utilizados para amplificar un ácido nucleico diana. Esta incluye los enzimas, tampones acuosos, sales, cebadores de amplificación, ácido nucleico diana y nucleósidos trifosfato. En función del contexto, la mezcla puede ser una mezcla de reacción de amplificación completa o incompleta. En la realización preferida de la invención, la reacción es una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la mezcla de reacción de amplificación es una mezcla de PCR. Como se utiliza aquí, una mezcla de reacción de amplificación incluye la mezcla de reacción utilizada para la amplificación de un RNA, como en una reacción acoplada de transcripción reversa/amplificación.

El término "tampón" como se utiliza aquí, se refiere a una solución que contiene un agente tamponante o una mezcla de agentes tamponantes y, opcionalmente, un catión divalente y un catión monovalente.

Las técnicas convencionales de biología molecular y química de ácidos nucleicos, que están al alcance del experto en la materia, se exponen extensivamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames y S. J. Higgins, ed., 1984); Basic Methods in Molecular Biology (Elsevier, NY); Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley e hijos, NY); y la serie Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).

Las polimerasas de DNA mutantes utilizadas en los métodos de la presente invención contienen una mutación puntual en una posición aminoacídica crítica identificada en la publicación de patente europea Nº 0.902.035, la solicitud estadounidense copendiente Nº 09/146.631 y la publicación de patente internacional Nº PCT WO 98/40496. La publicación de patente europea Nº 0.902.035 y la solicitud estadounidense copendiente Nº 09/146.631 identifican el aminoácido crítico en términos de su posición en una secuencia motivo crítica conservada que se encuentra en la secuencia de la polimerasa de DNA nativa. La publicación de patente internacional Nº PCT WO 98/40496 identifica el aminoácido crítico en la polimerasa de DNA Taq por su número de posición (E681), y en otras polimerasas de DNA mediante la homología con la polimerasa de DNA Taq de su secuencia de aminoácidos. Ambos métodos identifican la misma posición aminoacídica crítica. Para mayor claridad de la descripción, el aminoácido crítico se describe aquí en base a su posición en la secuencia motivo crítica conservada.

La Tabla 1, esencialmente reproducida de la Tabla 1 de la publicación de patente europea Nº 0.902.035 y la solicitud estadounidense copendiente Nº 09/146.631, proporciona los motivos críticos que se encuentran en una serie de polimerasas de DNA representativas (el aminoácido crítico está marcado) junto con la posición del aminoácido crítico en la secuencia completa de la enzima. En el caso de que se hayan descrito en la literatura secuencias de aminoácidos ligeramente diferentes para la polimerasa de DNA de una misma especie, se proporcionan los múltiples números de posición.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

Diferentes especies con una polimerasa de DNA termoactiva con el motivo crítico se describen en la publicación de patente europea Nº 0.902.035, la solicitud estadounidense copendiente Nº 09/146.631 y la publicación de patente internacional Nº PCT WO 98/40496. Las polimerasas de DNA preferidas para su utilización en la presente invención son las derivadas de una especie Thermus.

La polimerasa de DNA mutante utilizada en los métodos de la presente invención es una polimerasa de DNA mutante termoactiva, preferiblemente termoestable, que se caracteriza porque la forma nativa de la polimerasa de DNA comprende una secuencia motivo seleccionada de entre el grupo que consiste en los ID de SEC Nº: 1-7, y el aminoácido en la posición 4 del motivo se muta a cualquier aminoácido diferente de E, A, G o P. Preferiblemente, el aminoácido crítico se muta a cualquier aminoácido diferente de E, A, G, P o Q, más preferiblemente a cualquier aminoácido diferente de E, A, G, P, Q o D.

La polimerasa de DNA mutante puede ser derivada de cualquier especie con una polimerasa de DNA termoactiva con el motivo crítico en el dominio polimerasa. El motivo crítico identifica una región funcional concreta en el dominio polimerasa de la enzima, e identifica un aminoácido en el motivo que es crítico para la función. Los ejemplos describen los efectos sobre la eficiencia de la transcripción reversa activada por Mg^{+2} de cada mutación posible en este lugar en una polimerasa de DNA termoestable ampliamente utilizada, la polimerasa de DNA de Thermus thermophilus. Del mismo modo que los cambios de aminoácido en este lugar afectan a la eficiencia de incorporación de didesoxinucleótidos (ddNTP) marcados con colorantes de la familia de la fluoresceína o de la cianina en prácticamente todas las polimerasas de DNA con el motivo crítico conservado, es esperable que los cambios de aminoácido en este lugar afectarán la eficiencia de la transcripción reversa activada por Mg^{+2} de prácticamente todas las polimerasas de DNA con el motivo crítico conservado.

La relación estructural de las polimerasas de DNA y la presencia de dominios funcionales conservados es bien conocida (véase por ejemplo, Ito y Braithwaite, 1991, Nucl. Acids Res. 19(15):4045-4-47; Blanco et al. 1991, Gene 100:27-38; Gutman y Minton, 1993, Nucl. Acids. Res. 21(18):4406-4407; y Delarue et al., 1990, Protein Engineering 3(6):461-467).

Es esperable que las mutaciones de un aminoácido crítico en un dominio funcional conservado, en general, tengan efectos análogos al introducirlos en otras polimerasas de DNA (véase por ejemplo, Xu et al., 1997, J. Mol. Biol. 268:284-302; y las patentes estadounidenses Nº 5.466.591, 5.795.762, 5.939.292 y 5.614.365).

Otras polimerasas de DNA termoestables o termoactivas que contienen el motivo crítico, y la posición del aminoácido crítico de éste, pueden identificarse rutinariamente mediante la inspección directa de la secuencia de aminoácidos. De forma adicional, el motivo y aminoácido crítico pueden identificarse mediante la homología de secuencia con otras polimerasas de DNA que se sabe que contienen el motivo crítico, como las polimerasas de DNA de las especies
Thermus que selistan en la Tabla 1. Actualmente, están disponibles programas de alineamiento de secuencias de ácido nucleico y de aminoácidos. Por ejemplo, los programas de alineamiento de secuencias ampliamente utilizados, lo que incluye el "GAP", "BESTFIT" y "PILEUP", están disponibles en el Genetics Computer Group (Madison, Wisconsin). En general, realizar un alineamiento de secuencias utilizando los parámetros por defecto facilita la identificación del aminoácido crítico en una secuencia de la polimerasa de DNA homóloga al aminoácido crítico de una de las polimerasas de DNA que se listan en la Tabla 1.

Como se han obtenido nuevas secuencias de polimerasa de DNA, pueden descubrirse secuencias que contienen una variante del motivo crítico que no es literalmente la descrita en el ID de SEC Nº: 1, pero que es identificable mediante homología de secuencia con las enzimas conocidas. Como ejemplo hipotético, una enzima con un motivo en el dominio polimerasa de DNA que es una variante del ID de SEC Nº: 3, que difiere sólo en que el aminoácido en la posición 5 es diferente de L o I, se reconocería que tiene el motivo crítico en vista a la elevada homología (10 de 11 aminoácidos en este ejemplo) con el motivo crítico de varias enzimas de la especie Thermus. Tal enzima se considera equivalente para los propósitos de la presente invención.

El aminoácido crítico se identifica en referencia a la enzima nativa. Sin embargo, esto no pretende restringir la secuencia de aminoácidos de una enzima mutante en cualquier otro punto respecto a la enzima nativa. Las polimerasas de DNA mutantes utilizadas en los métodos de la presente invención pueden contener mutaciones adicionales cuya presencia pueda ser ventajosa para aplicaciones concretas. Por ejemplo, las mutaciones que eliminan la actividad exonucleasa de 5' a 3' o la actividad exonucleasa de 3' a 5' y sus aplicaciones son bien conocidas. Una mutación de sustitución adicional en la posición 3 de los motivos críticos identificados con los ID de SEC Nº: 1-7 (por ejemplo, un mutante Q682K y E683K de la polimerasa de DNA Tth) puede proporcionar beneficios adicionales, en particular en las reacciones activadas por Mn^{+2}, como el permitir una mayor reducción de la concentración de Mn^{+2} o un rango más amplio de las posibles concentraciones salinas.

Para su utilización en los métodos de la presente invención, las polimerasas de DNA mutantes preferiblemente se expresan a partir de vectores de expresión recombinantes en los que la secuencia codificante se ha modificado para expresar la secuencia de la proteína mutante concreta de interés. Los métodos para introducir mutaciones puntuales en una secuencia codificante en un plásmido de expresión son bien conocidos en la materia y se describen en la patente y la literatura científica. Protocolos detallados se proporcionan en, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, segunda edición, capítulo 15.51, "Oligonucleotide-mediated mutagenesis", y Ausebel et al., Current Protocols in Molecular Biology (edición actual). La publicación de patente europea Nº 0.902.035, la solicitud copendiente estadounidense Nº 09/146.631 y la publicación de patente internacional Nº PCT WO 98/40496 muestran la construcción de vectores de expresión apropiados, y la expresión y purificación de la polimerasa de DNA mutante resultante. Siguiendo las recomendaciones que se proporcionan en las citadas referencias, y utilizando sólo técnicas bien conocidas, un experto en la materia será capaz de obtener cualquier cantidad de vectores de expresión con un gen mutante, adecuados para la expresión de las polimerasas de DNA mutantes en cualquiera de los múltiples de sistemas huésped para su utilización en los métodos de la presente invención.

Para su utilización en los presentes métodos de transcripción reversa a elevada temperatura, es esencial que la polimerasa de DNA sea termoactiva. Como la preparación de cDNA a partir de un molde de RNA no involucra ciclos de desnaturalización repetida a temperaturas elevadas, no es esencial que las enzimas utilizadas en el método sean tanto termoestables como termoactivas. En los métodos de transcripción reversa y amplificación por reacción en cadena de la polimerasa combinadas (RT/PCR), con un único enzima, descritos en los ejemplos, es preferible la utilización de una polimerasa de DNA termoestable, ya que la polimerasa de DNA se somete tanto a las condiciones de RT como a las condiciones de PCR, lo que incluye ciclos de desnaturalización repetida.

Para la transcripción reversa, la reacción se realiza con una mezcla que contiene el molde de RNA, un cebador y una polimerasa de DNA mutante termoactiva o termoestable. La mezcla de reacción normalmente contiene los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTP) y un tampón que contiene un catión divalente y un catión monovalente. Las polimerasas de DNA requieren un catión divalente para su actividad catalítica. Para las reacciones de extensión que utilizan un molde de DNA, el catión divalente preferido es Mg^{+2}, aunque otros cationes como el Mn^{+2} o el Co^{+2} pueden activar las polimerasas de DNA.

Al contrario que las reacciones de extensión que utilizan una polimerasa de DNA termoactiva o termoestable y un molde de DNA, las reacciones de extensión que utilizan un molde de RNA, es decir la transcripción reversa, esencialmente requieren la utilización de Mn^{+2} para alcanzar una eficiencia útil. Por ejemplo, la utilización de MnCl_{2} o Mn(OAc)_{2} para la amplificación de RNA con la polimerasa de DNA Tth proporciona un aumento de la sensibilidad de al menos 10^{6} veces comparado con la utilización de MgCl_{2} y las condiciones de PCR estándar.

La utilización de Mn^{+2}, aunque aumenta la eficiencia de la transcripción reversa, también disminuye la fidelidad, lo que resulta en un mayor número de nucleótidos mal incorporados. La utilización de Mn^{+2} también disminuye la fidelidad en las amplificaciones de DNA. Por lo tanto, las reacciones de amplificación de RNA en un solo tubo y con una única enzima en las que se utiliza un tampón de Mn^{+2} se reduce la fidelidad de la reacción, tanto en la fase de RNA como en la de DNA. Por lo tanto, si se desea una mayor fidelidad de la amplificación de RNA, es preferible realizar la reacción en dos etapas. Esto se consigue al eliminar de forma efectiva los iones Mn^{+2} de la mezcla de transcripción reversa utilizando un quelante, como el EDTA o preferiblemente el EGTA, y entonces añadiendo una mezcla de amplificación de DNA que contenga Mg^{+2} para completar la reacción.

La utilización de polimerasas de DNA mutantes en el método descrito aquí proporciona beneficios en las reacciones de transcripción reversa independientemente del catión divalente utilizado. En las reacciones con Mn+^{2}, la utilización de una polimerasa de DNA mutante permite una transcripciónreversa a elevada temperatura y la amplificación de RNA con una mayor eficiencia que la que se alcanza utilizando la enzima nativa. Además, la utilización de la polimerasa de DNA mutante permite la realización de la reacción a una concentración de Mn^{+2} menor, minimizando así los efectos deletéreos de la concentración de Mn^{+2} sobre la fidelidad.

Es particularmente sorprendente el hecho de que las polimerasas de DNA mutantes permiten que la transcripción reversa pueda realizarse utilizando Mg^{+2} con una eficiencia significativamente aumentada. La utilización de Mg^{+2}, el catión divalente preferido de la enzima, proporciona una fidelidad significativamente mayor. Por lo tanto, en las reacciones con Mg^{+2}, la utilización de la polimerasa de DNA mutante permite la transcripción reversa y la amplificación de RNA a elevada temperatura y con elevada fidelidad, con una eficiencia útil.

El catión divalente se suministra en forma de sal, como MgCl_{2}, Mg(OAc)_{2}, MgSO_{4}, MnCl_{2}, Mn(OAc)_{2} o MnSO_{4}. En general, en las reacciones que utilizan Mn^{+2}, las concentraciones de catión que se pueden usar en un tampón Tris-HCl estarán en un rango de entre 0,5 y 7 mM de MnCl_{2}, preferiblemente entre 0,5 y 2 mM, y en un tampón bicina/KOAc o tampón tricina/KOAc estarán en un rango de entre 0,5 y 20 mM de Mn(OAc)_{2}, preferiblemente entre 0,5 y 5 mM. En general, en las reacciones que utilizan Mg^{+2}, las concentraciones de catión divalente que se pueden usar en un tampón Tris-HCl estarán en un rango de entre 0,5 y 10 mM de MgCl_{2}, y en un tampón bicina/KOAc o tricina/KOAC, estarán en un rango de entre 0,5 y 20 mM de Mg(OAc)_{2,} preferiblemente entre 0,5 y 5 mM. Estas concentraciones proporcionan las condiciones de inicio útiles para llevar a cabo una reacción de optimización rutinaria. La concentración óptima de ion divalente en una reacción concreta dependerá, no sólo de la enzima concreta utilizada, sino también del resto de componentes de la reacción, como por ejemplo la concentración de dNTP, y la secuencia y concentración de cebador. El experto entenderá que las condiciones de reacción en general, y la concentración de catión divalente en particular, pueden optimizarse empíricamente en cualquier reacción concreta utilizando los métodos experimentales rutinarios.

Aunque los tampones de mezcla de cationes divalentes (por ejemplo, Mn^{+2} y Mg^{+2}) son capaces de activar la síntesis de DNA dirigida por un molde de RNA, previamente estos no eran preferibles debido a la sensibilidad y eficiencia reducidas. Es esperable que los tampones de mezcla de cationes divalentes sean útiles en los métodos descritos aquí, y en algunas aplicaciones, pueden ser preferibles. de una mezcla de cationes puede permitir, por ejemplo, un equilibrio entre una reacción activada por Mn^{+2} de mayor eficiencia pero menor fidelidad y una reacción activada por Mg^{+2} de mayor fidelidad.

Los métodos de transcripción reversa a elevada temperatura y los métodos de transcripción reversa/amplificación combinadas utilizando una polimerasa de DNA termoestable en un tampón Mn^{+2} son bien conocidos e la materia. Véase por ejemplo, las patentes estadounidenses Nº 5.310.652, 5.322.770, 5.407.800, 5.561.058, 5.641.864 y 5.693.517. Los métodos de la presente invención representan una modificación de los métodos descritos previamente, en los que la modificación involucra la utilización de polimerasas de DNA mutantes, como las descritas anteriormente, y que la reacción se lleva a cabo en un tampón que contiene Mg^{+2} como catión divalente utilizado para activar la polimerasa de DNA.

Una ventaja de los presentes métodos es que la utilización de las polimerasas de DNA mutantes parece proporcionar tasas de extensión de la RT más rápidas y, en consecuencia, se necesita menos tiempo para la reacción de RT. Preferiblemente, y para maximizar la cantidad de cDNA producida en una reacción de transcripción reversa, la reacción se lleva a cabo en alrededor de 30 minutos. Dependiendo de la aplicación, en particular en las reacciones con manganeso, tiempos de RT tan cortos como un minuto o menos pueden proporcionar resultados aceptables.

Otras ventajas de los presentes métodos son que la utilización de las polimerasas de DNA mutantes puede proporcionar una eficiencia de RT mejorada a concentraciones de enzima menores, y además, que proporcionan un rango más amplio de concentraciones de sal que pueden utilizarse. Es esperable que las condiciones óptimas de reacción dependerán de, por ejemplo, la enzima concreta utilizada y pueden determinarse empíricamente de forma rutinaria.

Otros aspectos necesarios para llevar a cabo los presentes métodos, como la selección del RNA diana, la preparación de la muestra, el diseño del cebador y la elección de los reactivos y las condiciones de reacción diferentes de la polimerasa de DNA y el catión divalente utilizado para activar la polimerasa de DNA, son bien conocidos en la materia y se describen en, por ejemplo, las patentes anteriormente mencionadas como referencias. De forma similar, si la transcripción reversa se acopla con una reacción de amplificación, todos los aspectos de la amplificación no relacionados con la polimerasa de DNA y el catión divalente utilizado para activar la polimerasa de DNA son bien conocidos en la materia y se describen en, por ejemplo, las patentes anteriormente mencionadas como referencias. Por último, las aplicaciones de la transcripción reversa y la amplificación de RNA son bien conocidas en la materia y se describen en, por ejemplo, las patentes anteriormente mencionadas como referencias. Un experto en la materia será capaz de aplicar los presentes métodos en cualquier aplicación en la que se desee una transcripción reversa y, opcionalmente, una amplificación de RNA.

Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo a modo de ilustración y no debe considerarse que pretenden limitar la invención en modo alguno.

Ejemplo 1 Ejemplos de polimerasa de DNA mutante

Se obtuvieron una serie de 19 polimerasas de DNA mutantes a partir de la polimerasa de DNA "nativa" de Thermus thermophilus (Tth), que representan todas las mutaciones posibles del aminoácido crítico. Como se describe en la publicación de patente europea Nº 0.902.035 y la solicitud estadounidense copendiente Nº 09/146.631, la secuencia de aminoácidos de la polimerasa de DNA Tth contiene el motivo de secuencia crítico representado como ID de SEC Nº: 3 (que es una realización particular del ID de SEC Nº: 2, que es una realización reducida del motivo general, el ID de SEC Nº: 1). El aminoácido crítico está en la posición 683 (E683).

La secuencia de la polimerasa de DNA Tth y los plásmidos que contienen el gen de la polimerasa de DNA Tth son conocidos en la materia (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nº 5.618.711 y 5.789.224). El plásmido particular utilizado en el presente ejemplo también codifica una polimerasa de DNA Tth que contiene la mutación puntual G46E, lo que elimina la actividad exonucleasa de 5' a 3' de la enzima, como se describe en la patente estadounidense Nº 5.466.591. Además, el plásmido contiene sustituciones de nucleótido silentes que introducen un lugar de reconocimiento y corte ClaI, que incluye los codones 678, 679 y el primer nucleótido del 680, sin cambiar la secuencia de aminoácidos codificada. La presencia de la mutación adicional en el dominio exonucleasa de 5' a 3' se cree que no tiene un efecto apreciable en la capacidad de la polimerasa de DNA de realizar una transcripción reversa de RNA en un tampón con Mg^{+2}; la polimerasa de DNA Tth con la mutación G46E se considera aquí la polimerasa de DNA nativa.

Las mutaciones puntuales en las proteínas expresadas se introdujeron mediante la mutación de la secuencia de DNA codificante utilizando las técnicas estándar. Esencialmente, se reemplazó un fragmento corto de la secuencia codificante que incluye el codón 683 con un fragmento sintético que contiene la secuencia deseada. El fragmento corto, de 65 nucleótidos de longitud, se escindió mediante la digestión del plásmido con las enzimas de restricción ClaI y HindIII. Se sintetizó un inserto de DNA de doble cadena sintético que codificaba la misma secuencia de aminoácidos que el fragmento escindido, pero que contenía la mutación deseada en el codón 683. El fragmento sintético se ligó entonces con el plásmido digerido, dando lugar a un plásmido que contiene un codón mutado que codifica una polimerasa de DNA Tth completa con la mutación puntual deseada.

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 2 Eficiencia de la transcripción reversa/amplificación

Se comparó la capacidad de las 20 polimerasas de DNA descritas en el Ejemplo 1 (1 nativa y 19 mutantes) para catalizar reacciones de transcripción reversa/amplificación. Brevemente, las reacciones acopladas de transcripción reversa/amplificación, con una única enzima se llevaron a cabo con cada una de las polimerasas de DNA. Se utilizó el mismo número inicial de copias de la diana en cada reacción, y la síntesis de producto de amplificación se monitorizó durante la reacción. Se determinó el número de ciclos necesarios para generar una cantidad arbitraria pero fijada de producto amplificado, lo que proporciona una medida de la eficiencia de reacción de cada polimerasa de DNA. Como el paso de transcripción reversa inicial normalmente es el paso crítico limitante en una reacción de transcripción reversa/amplificación, una mejora global en la eficiencia de la reacción también sugiere una mejora del paso de transcripción reversa inicial.

El aumento de ácido nucleico amplificado durante la reacción se monitorizó utilizando los métodos descritos en Higuchi et al., 1992, Bio/Technology 10:413-417; Higuchi et al., 1993, Bio/Technology 11:1026-1030; Higuchi y Watson, en PCR Applications, supra, capítulo 16; la patente estadounidense Nº 5.994.056; y las publicaciones de patente europea Nº 487.218 y 512.334. Estos métodos, aquí denominados PCR cinética, se basan en el aumento de la fluorescencia que muestran el bromuro de etidio (EtBr) y otros colorantes de unión al DNA cuando se unen a DNA de doble cadena para detectar el cambio en la cantidad de DNA de doble cadena en una reacción. El aumento de DNA de doble cadena que resulta de la síntesis de las secuencias diana da lugar a un aumento de la cantidad de colorante unido al DNA de doble cadena y a un aumento concomitante detectable de la fluorescencia.

Las amplificaciones se llevaron a cabo con bromuro de etidio en la reacción. Alternativamente, las amplificaciones pueden realizarse utilizando SYBR® Green I (Molecular Probes, Eugene, OR) en la reacción. Ambos colorantes aumentan su fluorescencia tras intercalarse o unirse al DNA de doble cadena. Las reacciones se realizan en un sistema combinado de termociclador y detector de fluorescencia que permite la monitorización de la fluorescencia de la mezcla de reacción durante la amplificación. Quede claro que además del instrumental descrito a continuación, puede utilizarse cualquier instrumental adecuado.

RNA diana y cebadores de la amplificación

Se sintetizó un RNA diana utilizando un plásmido de expresión que codifica el gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) humana. Se amplificó una región del RNA de la GAPDH utilizando los siguientes cebadores, que se muestran en orientación de 5' a 3':

\newpage

P1 (ID de SEC Nº: 20)

5'-CGAGATCCCTCCAAAATCAA,

P2 (ID de SEC Nº: 21)

5'-CATGAGTCCTTCCACGATACCAA.

La concentración de diana inicial se calculó mediante los métodos estándar. En las reacciones de comparación descritas aquí, el número de copias absoluto no es tan importante como el número de copias relativo. Para asegurar que hay el mismo número de copias inicial en cada reacción, se utilizaron alícuotas de diluciones de la misma reserva de RNA inicial.

Un experto reconocerá que la selección de la diana es una cuestión de conveniencia. Podrían utilizarse otros RNA diana y sus correspondientes cebadores de amplificación en un protocolo esencialmente idéntico. Es esperable que sea necesaria una optimización rutinaria de las condiciones de reacción.

Amplificación

Cada amplificación de RT-PCR se realizó en un volumen total de reacción de 100 \mul. Las concentraciones finales de los reactivos fueron las siguientes:

10 unidades de polimerasa de DNA

10^{6} copias del RNA de GAPDH

Tricina 50 mM, pH 8,15

KOAc 50 mM

Mg(OAc)_{2} 2 mM

dATP, dGTP y dCTP 200 \muM

dUTP 400 \muM

cada uno de los cebadores 200 nM

glicerol al 8%

DMSO al 1%

1 \mug/ml de bromuro de etidio

2 unidades de UNG*

* Elaborada por Roche Molecular Systems y disponible comercialmente a través de Applied Biosystems, Foster City. CA.

De forma alternativa, puede utilizarse SYBR® Green I en lugar de bromuro de etidio para conseguir la detección del producto amplificado. Las amplificaciones que utilizan SYBR® Green I se realizan con SYBR® Green I 0,2 X (comercializado a 10.000 X) diluido en DMSO.

Las reacciones que utilizan bromuro de etidio preferiblemente se llevan a cabo utilizando un sistema de detección de secuencias ABI PRISM® 7700 (Applied Biosystems, Foster City, CA), que permite la selección de las longitudes de onda de detección adecuadas. Las reacciones que utilizan SYBR® Green I preferiblemente se llevan a cabo utilizando un sistema de detección de secuencias GeneAmp® 5700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) utilizando las mismas condiciones de termociclado. El sistema de detección de secuencias GeneAmp® 5700 está diseñado para su uso con SYBR® Green I y las longitudes de onda de excitación y detección están prefijadas para este colorante.

Los ensayos descritos a continuación se realizaron utilizando un instrumento personalizado que consiste esencialmente en un termociclador GeneAmp® PCR system 9600 (PE Biosystems, Foster City, CA) modificado mediante la adición de un sistema de detección de la fluorescencia similar al que se utiliza en el sistema de detección de secuencias GeneAmp® 5700, pero diseñado para su uso con bromuro de etidio. Los resultados obtenidos utilizando el instrumento personalizado se esperaría que fueran comparables a los resultados obtenidos utilizando uno de los instrumentos preferidos.

Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo utilizando el perfil de ciclado de temperatura específica que se muestra a continuación.

Tiempos y temperaturas de termociclado

Incubación pre-reacción:	50ºC durante 2 minutos
Transcripción reversa:	60ºC durante 30 minutos
	95ºC durante 1 minuto
55 ciclos: desnaturalización:	95ºC durante 15 segundos
\hskip1,4cm hibridación:	55ºC durante 30 segundos
\hskip1,4cm extensión:	72ºC durante 15 segundos
Extensión final y mantenimiento:	72ºC.

Detección

La acumulación de producto amplificado se evaluó en cada ciclo durante la reacción mediante la medición del aumento de la fluorescencia de la reacción. Durante cada ciclo de amplificación, cada una de las reacciones se excitó con luz a una longitud de onda cercana al máximo de excitación del colorante y se midió la emisión del colorante cerca de su máximo de emisión.

Las mediciones de la fluorescencia se normalizaron dividiendo por una medida de fluorescencia inicial obtenida durante un ciclo temprano en la reacción, mientras las medidas de la fluorescencia entre ciclos parecen ser relativamente constantes. El número de ciclo elegido para la medida de la fluorescencia inicial fue el mismo en todas las reacciones comparadas, de forma que todas las mediciones representan los aumentos relativos al mismo ciclo de reacción.

El número de ciclos de amplificación realizados hasta que la fluorescencia supera un nivel de fluorescencia arbitraria (NFA) se calculó a partir de los valores de fluorescencia observados. El NFA se eligió cercano al nivel basal del nivel de fluorescencia, pero por encima del rango de las fluctuaciones al azar de las medidas de fluorescencia, de forma que la cinética de reacción se midió durante la fase temprana de la amplificación, cuando la cantidad de producto aumenta geométricamente. Durante esta fase de crecimiento geométrico de la amplificación, el número de ciclos necesarios para alcanzar un valor umbral concreto depende únicamente del número inicial de copias y de la eficiencia de reacción. Como cada reacción se lleva a cabo utilizando el mismo número inicial de copias diana, el número de ciclos para alcanzar un valor umbral proporciona una medida de la eficiencia de la reacción. En los ciclos posteriores, la acumulación de producto amplificado y la finalización de reactivos finalmente da lugar a un efecto meseta de la reacción.

Se eligió un NFA de 1,12 para todas las reacciones. Como una amplificación de PCR consiste en ciclos discretos y las mediciones de fluorescencia se realizan una vez por ciclo, la medida de fluorescencia normalmente aumenta de inferior al NFA a superior al NFA en un único ciclo. Para mejorar la precisión de las mediciones, se calculó un número "exacto" de ciclos para llegar el nivel umbral del NFA, que se denomina aquí valor C_{T}, mediante la interpolación de las mediciones de fluorescencia entre ciclos.

Resultados

Los valores C_{T} obtenidos utilizando la polimerasa de DNA Tth nativa (E683) y cada una de las polimerasas de DNA mutantes (identificadas por el aminoácido en la posición 683) se muestran en la tabla a continuación. Cada valor C_{T} representa el valor promedio obtenido a partir de dos reacciones. Para facilitar la comparación, también se proporciona la diferencia entre los valores C_{T}, (C_{T} nativa) - (C_{T} mutante). Un aumento de la eficiencia al utilizar la polimerasa de DNA mutante resulta en que se alcanza el valor umbral en menos ciclos, es decir, en un valor C_{T} menor. Por lo tanto, una diferencia positiva entre los valores C_{T} indica un aumento en la eficiencia.

3

4

Los resultados indican que las mutaciones del aminoácido en la posición 683 a cualquier aminoácido excepto a Ala, Gly o Pro resultan en una polimerasa de DNA con eficiencia mejorada. De éstas, todos los mutantes excepto los de Asp y Gln resultaron en una mejora de al menos cuatro ciclos en el valor C_{T}.

Ejemplo 3 Eficiencia de la transcripción reversa

Se comparó la capacidad de catalizar reacciones de transcripción reversa de las polimerasas de DNA seleccionadas descritas en el Ejemplo 1. Las reacciones de transcripción reversa se llevaron a cabo con cada una de las polimerasas de DNA utilizando tanto Mg^{+2} como Mn^{+2}. El cDNA resultante de cada una de las reacciones se amplificaron entonces en condiciones idénticas utilizando la enzima nativay Mg^{+2}. Este protocolo permite la evaluación del efecto de la enzima específicamente en la fase de transcripción reversa de una reacción de transcripción reversa/amplificación.

Además de con la enzima nativa, las reacciones se llevaron a cabo utilizando polimerasas de DNA con mutaciones en la posición aminoacídica 683 a F, K, L, R e Y. Se ha demostrado en el Ejemplo 2 que cada una de estas mutaciones proporcionan aumentos significativos de la eficiencia en una reacción combinada de transcripción reversa/amplificación.

Transcripción reversa

Cada transcripción reversa se llevó a cabo en un volumen total de reacción de 100 \mul. Las concentraciones finales de los reactivos fueron las siguientes:

5 unidades de polimerasa de DNA

10^{6} copias del RNA de GAPDH

Tricina 50 mM, pH 8,15

KOAc 50 mM

Mg(OAc)_{2} o Mn(OAc)_{2} 2 mM

dATP, dGTP, dCTP y dUTP 200 \muM

cada uno de los cebadores 200 nM

glicerol al 8%

DMSO al 1%

SYBR® Green I 0,2 x

1 unidad de UNG*

* Elaborada por Roche Molecular Systems y disponible comercialmente a través de Applied Biosystems, Foster City. CA.

Las reacciones de transcripción reversa se llevaron a cabo utilizando el perfil de ciclado de temperatura específica que se muestra a continuación.

Tiempos y temperaturas de transcripción reversa

Incubación pre-reacción:	50ºC durante 2 minutos
Transcripción reversa:	60ºC durante 30 minutos
Mantenimiento:	4ºC.

Amplificación

Tras la transcripción reversa, se añadieron 10 \mul de los productos de reacción a 10 \mul de EGTA 2 mM para quelar el catión metálico, eliminándolo así de forma efectiva de la siguiente reacción de amplificación. La mezcla se añadió a una mezcla de amplificación de PCR que contenía la enzima nativa y Mg^{+2}. Por lo tanto, la polimerasa de DNA mutante residual se diluyó de forma que se espera que su efecto sea negligible. Las amplificaciones de PCR se llevaron a cabo en reacciones de 100 \mul con las siguientes concentraciones finales de los reactivos:

5 unidades de polimerasa de DNA nativa

Tricina 50 mM, pH 8,15

KOAc 50 mM

Mg(OAc)_{2} 2 mM

dATP, dGTP, dCTP y dUTP 200 \muM

cada uno de los cebadores 200 nM

glicerol al 8%

DMSO al 1%

SYBR® Green I 0,2 x

Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo utilizando el perfil de ciclado de temperatura específica que se muestra a continuación.

Tiempos y temperaturas de termociclado de amplificación

	95ºC durante 1 minuto
55 ciclos: desnaturalización:	95ºC durante 15 segundos
\hskip1,4cm hibridación:	55ºC durante 30 segundos
\hskip1,4cm extensión:	72ºC durante 15 segundos
Extensión final y mantenimiento:	72ºC.

Resultados

Los valores C_{T} obtenidos utilizando la polimerasa de DNA Tth nativa (E683) y cada una de las polimerasas de DNA mutantes (identificadas por el aminoácido en la posición 683) en la transcripción reversa, y la polimerasa de DNA Tth nativa en todas las amplificaciones se muestran en la tabla a continuación. Cada valor C_{T} representa el valor promedio obtenido a partir de dos reacciones. Para facilitar la comparación, también se proporciona la diferencia entre los valores C_{T}, (C_{T} nativa) - (C_{T} mutante). Un aumento de la eficiencia al utilizar la polimerasa de DNA mutante resulta en que se alcanza el valor umbral en menos ciclos, es decir, en un valor C_{T} menor. Por lo tanto, una diferencia positiva entre los valores C_{T} indica un aumento en la eficiencia.

6

Cada una de estas polimerasas de DNA mutantes proporcionaron una mejora significativa de la eficiencia en las reacciones de transcripción reversa/amplificación. Como la fase de amplificación de DNA en cada reacción se realizó de un modo idéntico con la enzima nativa, estos resultados demuestran que cada una de estas polimerasas de DNA mutantes proporcionan una mejora de la eficiencia en la fase de transcripción reversa de las reacciones. Las polimerasas de DNA mutantes proporcionaron una mejora significativa de la eficiencia utilizando cualquiera de los cationes.

La mejora fue particularmente marcada al utilizar Mg^{+2} y demuestra que la utilización de las polimerasas de DNA mutantes conduce a que las reacciones activadas por Mg^{+2} sean prácticas. De forma consistente con lo que se ha descrito previamente, en una amplificación de RNA que utiliza la enzima nativa es esencialmente necesaria la utilización de Mn^{+2} para conseguir una eficiencia de reacción útil, como se puede observar por el retraso de casi 10 ciclos (33,8-24,6) del Cr al utilizar Mg^{+2}. Por el contrario, utilizando el mutante E683Y, por ejemplo, la eficiencia de la reacción activada por Mg^{+2} fue la misma a la que se alcanza utilizando la enzima nativa y Mn^{+2}.

Ejemplo 4 Fidelidad

Las fidelidades de las polimerasas de DNA mutantes seleccionadas y la enzima nativa se compararon de varias formas. Las fidelidades en las reacciones acopladas de transcripción reversa/ amplificación realizadas en un tampón con Mg^{+2} se compararon con las fidelidades al realizarlas en un tampón con Mn^{+2}. De forma adicional, se compararon las fidelidades de las enzimas al utilizarlas en las amplificaciones de DNA.

Las fidelidades de las polimerasas de DNA pueden compararse analizando el perfil de temperatura de fusión (Tm) de los productos amplificados generados utilizando las enzimas. La fidelidad de una polimerasa de DNA se refleja en el número de incorporaciones erróneas que aparecen durante la síntesis de la cadena. Una amplificación que utiliza una enzima de fidelidad menor resultará en una mayor heterogeneidad de la población resultante de secuencias amplificadas. Para medir la heterogeneidad, los productos amplificados se desnaturalizan, se permite que hibriden de nuevo, y se mide la Tm de los dúplex resultantes. Como las cadenas se combinan al azar en los dúplex a partir de una población heterogénea de secuencias, en general los dúplex contienen una serie de emparejamientos incorrectos. Cuanto mayor es la heterogeneidad de las secuencias de la población de productos amplificados, mayor es el número promedio de emparejamientos incorrectos en los dúplex. Estos emparejamientos incorrectos desestabilizan los dúplex y resultan en una medida de Tm menor.

Se realizó una curva de fusión de los productos amplificados de una reacción de PCR cinética en la que se empleó convenientemente el instrumento termociclador/ detector de fluorescencia utilizado en la amplificación. Tras la amplificación, se midió la relación entre fluorescencia y temperatura a lo largo de un intervalo de temperatura que incluye la temperatura de desnaturalización del producto. La transición entre las moléculas de doble cadena y de cadena sencilla resulta en un cambio de fluorescencia del colorante. Así puede determinarse de forma conveniente una curva de fusión. Alternativamente, las mediciones pueden llevarse a cabo utilizando métodos estándar, que normalmente involucran la monitorización del cambio de la densidad óptica, una medida de la cantidad de DNA de doble cadena en la reacción, con un cambio en la temperatura.

La fidelidad de la polimerasa de DNA nativa se comparó con las fidelidades de dos de los mutantes, las polimerasas de DNA que contienen las mutaciones E683K y E683N, respectivamente. Las reacciones acopladas de transcripción reversa/amplificación se llevaron a cabo por duplicado tanto en tampones con Mn^{+2} como con Mg^{+2} esencialmente como se describe en el Ejemplo 2, pero con los siguientes cambios. Para las reacciones con Mn^{+2}, se utilizó Mn(OAc)_{2}
2 mM en la reacción. Todas las reacciones se llevaron a cabo utilizando 25 U de polimerasa de DNA.

Para medir el perfil de estabilidad de la hibridación (curva de fusión) de las secuencias diana amplificadas de doble cadena, la fluorescencia de la mezcla de reacción post-amplificación se monitorizó a lo largo de un intervalo de temperaturas que cubre al menos desde 60ºC a 80ºC. Como era esperable, las mediciones de fluorescencia resultaron en una curva de fusión sigmoidea. Una Tm se define como la temperatura del punto de inflexión en una curva de fusión sigmoidea, que corresponde a la temperatura a la que la mitad de la diana está en forma de cadena sencilla.

Resultados

Las medidas de los valores de Tm de los productos de amplificación de las reacciones activadas por Mg^{+2} y las reacciones activadas por Mn^{+2} se muestran en la tabla a continuación. Cada medición indica el promedio de replicados de las reacciones. Todas las temperaturas se dan en grados Celsius.

Valores de T_{m} de los productos de amplificación

Polimerasa de DNA	Tm, Mg^{+2}	Tm, Mn^{+2}
Nativa	80	78
E683K	80	76
E683N	80	76

Utilizando un tampón con Mg^{+2}, no se observó una diferencia entre la fidelidad de la polimerasa de DNA nativa y las mutantes. Reacciones similares llevadas a cabo utilizando las 20 polimerasas de DNA (datos no mostrados) confirmaron que la fidelidad de todas las polimerasas de DNA mutantes es idéntica a la fidelidad de la polimerasa de DNA nativa en reacciones activadas por Mg^{+2}.

Comparando los resultados obtenidos utilizando un tampón con Mn^{+2} con los obtenidos utilizando un tampón con Mg^{+2}, las fidelidades de todas las polimerasas de DNA se redujeron, como puede deducirse por la reducción de los valores de Tm obtenidos. De forma interesante, las dos polimerasas de DNA mutantes mostraron una fidelidad aun menor que la de la enzima nativa al utilizar un tampón con Mn^{+2}, al menos bajo estas condiciones de reacción.

La fidelidad se ve afectada por la concentración de Mn^{+2}. Para comparar el efecto de la concentración de Mn^{+2} en la fidelidad de las enzimas mutantes y nativa, se llevaron a cabo experimentos adicionales utilizando la mutación E683K y un rango de concentraciones de Mn^{+2} de entre 0,5 y 5 mM. Como era esperable, los resultados (datos no mostrados) demostraron que una concentración menor de Mn^{+2} da lugar a reacciones de mayor fidelidad con ambas enzimas. La fidelidad de una enzima mutante se ve más afectada por un aumento de la concentración de Mn^{+2} que la fidelidad de la enzima nativa. Sorprendentemente, sin embargo, al menos en estos experimentos, la enzima mutante también era más eficiente a la concentración más baja de Mn^{+2}. Así, la utilización de la enzima mutante permite realizar la reacción a una concentración de Mn^{+2} menor, minimizando así los efectos deletéreos de la concentración de Mn+^{2} sobre la fidelidad.

Además, tanto las reacciones activadas por Mn^{+2} como las activadas por Mg^{+2} también se llevaron a cabo esencialmente como se ha descrito anteriormente, pero utilizando moldes de DNA, lo que facilita la observación del efecto en la fidelidad sólo en la fase de DNA de la reacción. En todos los casos, el valor Tm del producto de la amplificación de DNA no era distinguible del valor Tm del producto de la amplificación de RNA.

Estos resultados, junto con todos los resultados de los ejemplos previos, demuestran las ventajas de los métodos de la presente invención. Los métodos de transcripción reversa y amplificación a elevada temperatura previamente descritos se han llevado a cabo utilizando Mn^{+2} para conseguir una eficiencia de reacción adecuada, pero sufren una reducción en la fidelidad. La presente descripción proporciona varias opciones. Utilizando Mn^{+2}, la utilización de la enzima mutante proporciona una transcripción reversa y amplificación de RNA a elevada temperatura con una mayor eficiencia que la que se alcanza utilizando la enzima nativa, y permite llevar a cabo la reacción a una concentración de Mn^{+2} menor, minimizando así el efecto deletéreo de la concentración de Mn+^{2} sobre la fidelidad. Utilizando Mg^{+2}, la utilización de la enzima mutante proporciona una transcripción reversa y amplificación de RNA a elevada temperatura y una elevada fidelidad con una eficiencia útil.

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

\hskip1cm Grenzacherstrasse 124

\hskip1cm 4070 Basilea

\hskip1cm SUIZA

\vskip0.400000\baselineskip

<120> TRANSCRIPCIÓN REVERSA A TEMPERATURA ELEVADA UTILIZANDO POLIMERASAS DE DNA MUTANTES

\vskip0.400000\baselineskip

<130> 5395

\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/198.336

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 18-04-2000

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<170> PatentIn versión 3.0

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia motivo

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)...(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es S o A

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es cualquier aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (4)...(4)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es cualquier aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)...(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es L o I

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)...(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es cualquier aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)...(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es cualquier aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)...(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es cualquier aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)...(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es cualquier aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)...(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es cualquier aminoácido

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia motivo

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es Q o G

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)...(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es S o A

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Xaa Glu Leu Xaa Ile Pro Tyr Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia motivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia motivo

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es Q o G

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Xaa Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia motivo

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)...(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es V o I

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Val Arg Leu Gly Xaa Pro Val Lys Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia motivo

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Lys Arg Ile Gly Leu Ser Val Ser Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia motivo

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)...(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> X es S o T

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Xaa Arg Lys Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thermus aquaticus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thermus flavus

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Gly Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thermus thermophilus

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thermus esp. ZO5

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thermus esp. sps17

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Gln Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thermus caldophilus

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thermus filiformis

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Gln Glu Leu Ser Ile Pro Tyr Glu Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thermotoga maritima

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Val Arg Leu Gly Val Pro Val Lys Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thermotoga neapolitana

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Val Arg Leu Gly Ile Pro Val Lys Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Thermosipho africanus

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ser Lys Arg Ile Gly Leu Ser Val Ser Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus caldotenax

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Ser Arg Lys Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus stearothermophilus

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Ala Gln Asn Leu Asn Ile Thr Arg Lys Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgagatccct ccaaaatcaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catgagtcct tccacgatac caa

\hfill

23

Claims (10)

1. Un método para la transcripción reversa y la amplificación de un RNA en una reacción acoplada de transcripción reversa y amplificación en un único tubo, con una sola enzima, que comprende:

(a) proporcionar una mezcla de reacción de transcripción reversa que comprende dicho RNA, un cebador, Mg^{2+} y una polimerasa de DNA termoactiva mutante, en la que dicha polimerasa de DNA mutante se caracteriza porque

i)

en su forma nativa, dicha polimerasa de DNA en su dominio polimerasa de DNA comprende una secuencia de aminoácidos que es la del ID de SEC Nº: 1;

ii)

el aminoácido en la posición 2 de dicha secuencia de aminoácidos es S o A y el aminoácido en la posición 5 de dicha secuencia de aminoácidos es L o I; y

iii)

el aminoácido en la posición 4 de dicha secuencia de aminoácidos está mutado en relación con dicha secuencia nativa a un aminoácido diferente de E, A, G o P; y

(b) tratar dicha mezcla de reacción a una temperatura suficiente para que dicha polimerasa de DNA mutante inicie la síntesis de un producto de extensión de dicho cebador para proporcionar una molécula de cDNA complementario a dicho RNA, con un par de cebadores que comprende un primer cebador que es lo suficientemente complementario con el RNA para hibridar con éste e iniciar la síntesis de una molécula de cDNA complementario con el RNA, y un segundo cebador que es lo suficientemente homólogo con dicho RNA para hibridar con el cDNA e iniciar la síntesis de un producto de extensión, y

(c) amplificar dicho cDNA.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicha polimerasa de DNA en su forma nativa comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de los ID de SEC Nº: 5, ID de SEC Nº: 6 e ID de SEC Nº: 7.

3. El método de la reivindicación 1, en el que dicha polimerasa de DNA en su forma nativa comprende la secuencia de aminoácidos del ID de SEC Nº: 2

4. El método de la reivindicación 3, en el que dicha polimerasa de DNA en su forma nativa comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo de los ID de SEC Nº: 3 e ID de SEC Nº: 4.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha polimerasa de DNA mutante es termoestable.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 4, en el que dicha polimerasa de DNA es una forma mutante de una polimerasa de DNA de una especie de Thermus.

7. El método de la reivindicación 6, en el que dicha polimerasa de DNA es una forma mutante de la polimerasa de DNA de Thermus thermophilus o la polimerasa de DNA de Thermus aquaticus.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha temperatura de dicha mezcla de reacción en el paso (b) está entre 40ºC y 80ºC.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho aminoácido en la posición 4 de dicha secuencia de aminoácidos está mutado en relación con dicha secuencia nativa a un aminoácido diferente de E, A, G, P, Q o D.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicha mezcla de reacción de transcripción reversa además comprende un tampón con una mezcla de cationes divalentes que comprende Mg^{2+} y Mn^{2+}.