KR20220052937A - 폴리(a) 및 폴리(u) 중합효소를 사용한 폴리뉴클레오타이드의 주형-부재 효소적 합성 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 폴리(A) 및 폴리(U) 중합효소를 사용하여 3'-O-가역적으로 차단된 뉴클레오사이드 트리포스페이트로부터 소정의 서열의 폴리리보뉴클레오타이드의 주형 부재 효소적 합성을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

Description

폴리(A) 및 폴리(U) 중합효소를 사용한 폴리뉴클레오타이드의 주형-부재 효소적 합성
말단 데옥시뉴클레오타이드 전이효소 (TdT)와 같은 주형 부재 중합효소(template-free polymerase)를 사용하는 효소적 기반 방법으로 화학 기반 합성 방법을 보완하거나 대체하는데 관심이 모아지고 있는데, 이는 이러한 효소의 입증된 효율 및 경미한 비독성 반응 조건의 이점 때문이다 (예를 들어, Ybert 등의 국제 특허 공개 WO2015/159023; Hiatt 등의 미국 특허 5763594; 문헌[Jensen et al, Biochemistry, 57: 1821-1832 (2018)]; 등). 효소 기반 합성의 대부분의 접근법은 DNA 합성으로 제한되며 폴리뉴클레오타이드 산물에서 적절한 서열을 획득하기 위해 가역적으로 차단된 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 사용해야 한다. 불행하게도, 천연 TdT는 변형되지 않은 뉴클레오사이드 트리포스페이트와 비교하여 감소된 효율로 변형된 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 혼입시킨다. 따라서, 변형된 뉴클레오사이드 트리포스페이트가 DNA를 합성하기 위한 더 우수한 혼입 효율을 갖는 신규한 TdT 변이체를 개발하는데 많은 연구가 진행되었다 (예를 들어, Champion 등의 미국 특허 공개 US2019/0211315; Ybert 등의 국제 특허 공개 WO2017/216472 등).
상기의 관점에서, 가역적으로 차단된 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 혼입이 개선된 신규한 주형 부재 중합효소가 DNA 및 RNA를 합성하기 위해 이용가능하다면 주형 부재 효소적 기반 폴리뉴클레오타이드 합성 분야는 진보될 것이다.
본 발명은 폴리(A) 및 폴리(U) 중합효소 및 이의 변이체를 사용하여 폴리뉴클레오타이드의 주형 부재 효소적 합성을 위한 방법, 키트(kit) 및 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 폴리(A) 및 폴리(U) 중합효소를 사용하는 방법을 사용하여 소정의 서열의 RNA 산물을 합성한다. 다른 실시양태에서, 폴리(A) 및 폴리(U) 중합효소를 사용하는 방법을 사용하여 소정의 서열의 DNA 산물을 합성한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 합성하는 방법으로서, a) 유리(free) 3'-하이드록실을 갖는 3' 말단 뉴클레오타이드를 갖는 개시인자(initiator)를 제공하는 단계; 및 b) 폴리뉴클레오타이드가 형성될 때까지, (i) 연장 조건(elongation condition) 하에 유리 3'-하이드록실을 갖는 개시인자 또는 연장 단편(elongated fragment)을 3'-O-차단-뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 주형 부재 중합효소와 접촉시켜, 개시인자 또는 연장 단편을 3'-O-차단-뉴클레오사이드 트리포스페이트의 혼입에 의해 연장하여 3'-O-차단-연장 단편을 형성하는 단계, 및 (ii) 연장 단편을 탈차단(deblocking)시켜 유리 3'-하이드록실을 갖는 연장 단편을 형성하는 단계의 사이클을 반복하는 단계로서; 주형 부재 중합효소는 폴리(A) 중합효소 (PAP) 또는 폴리(U) 중합효소인 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 개시인자는 5' 말단에 의해 지지체에 부착될 수 있다. 추가의 실시양태에서, 지지체는 고체 지지체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 개시인자로부터 폴리뉴클레오타이드를 절단하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리-2'-데옥시리보뉴클레오타이드이고, 3'-O-차단-뉴클레오사이드 트리포스페이트는 3'-O-차단-2'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트이다. 추가의 실시양태에서, 3'-O-차단-2'-데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트는 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 또는 3'-O-아미노-2'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트이다. 추가의 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리리보뉴클레오타이드이고, 상기 3'-O-차단-뉴클레오사이드 트리포스페이트는 3'-O-차단-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트이다. 일부 실시양태에서, 3'-O-차단-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트는 3'-O-아지도메틸-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트이다. 추가의 실시양태에서, 3'-아지도메틸-O-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트는 3'-아지도메틸-O-아데노신 트리포스페이트, 3'-아지도메틸-O-구아노신 트리포스페이트, 및 3'-아지도메틸-O-시티딘 트리포스페이트, 3'-아지도메틸-O-우리딘 트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 폴리(A) 중합효소는 서열번호 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90 퍼센트 동일하고, 서열번호 1의 경우 위치 310, 서열번호 2의 경우 위치 318, 서열번호 3의 경우 위치 318, 서열번호 8의 경우 위치 316, 서열번호 9의 경우 위치 309, 서열번호 10의 경우 위치 316, 서열번호 11의 경우 위치 272, 서열번호 12의 경우 위치 316, 서열번호 13의 경우 위치 307, 서열번호 14의 경우 위치 313, 서열번호 15의 경우 위치 312, 서열번호 16의 경우 위치 317, 서열번호 17의 경우 위치 316, 서열번호 18의 경우 위치 316, 서열번호 19의 경우 위치 312, 서열번호 20의 경우 위치 310, 서열번호 21의 경우 위치 309, 서열번호 22의 경우 위치 317, 서열번호 23의 경우 위치 314, 서열번호 24의 경우 위치 307, 서열번호 25의 경우 위치 315, 서열번호 26의 경우 위치 316, 및 서열번호 27의 경우 위치 311에서의 메티오닌의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리(A) 중합효소 변이체이다. 특히, 상기 위치에서의 상기 메티오닌의 상기 치환은 F, Y, V, E 또는 T로부터 선택될 수 있다. 상기 서열번호 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27로부터 선택되는 상기 아미노산 서열은 또한 서열번호 1의 경우 위치 234, 서열번호 2의 경우 위치 240, 서열번호 3의 경우 위치 240, 서열번호 9의 경우 위치 232, 서열번호 10의 경우 위치 240, 서열번호 11의 경우 위치 196, 서열번호 12의 경우 위치 240, 서열번호 13의 경우 위치 229, 서열번호 14의 경우 위치 236, 서열번호 15의 경우 위치 236, 서열번호 16의 경우 위치 241, 서열번호 17의 경우 위치 233, 서열번호 18의 경우 위치 240, 서열번호 19의 경우 위치 240, 서열번호 20의 경우 위치 234, 서열번호 21의 경우 위치 233, 서열번호 22의 경우 위치 237, 서열번호 23의 경우 위치 238, 서열번호 24의 경우 위치 231, 서열번호 25의 경우 위치 239, 서열번호 26의 경우 위치 240, 및 서열번호 27의 경우 위치 235에서의 발린의 치환을 포함할 수 있다. 특히, 상기 위치에서의 상기 발린의 상기 치환은 알라닌 또는 글리신일 수 있다.
상기 조성물의 추가의 실시양태에서, 서열번호 2 또는 3에 적어도 90 퍼센트 동일한 아미노산 서열은 또한 서열번호 2 또는 3의 경우 위치 410에서의 알라닌의 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 위치 410에서의 알라닌의 치환은 발린이다.
일 양상에서, 본 발명은 소정의 서열을 갖는 폴리리보뉴클레오타이드를 합성하기 위한 방법 및 키트로서, a) 유리 3'-하이드록실을 갖는 3' 말단 뉴클레오타이드를 갖는 개시인자를 제공하는 단계; 및 b) (i) 연장 조건 하에 유리 3'-O-하이드록실을 갖는 개시인자 또는 연장 단편을 3'-O-차단 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 폴리(A) 중합효소와 접촉시켜, 개시인자 또는 연장 단편을 3'-O-차단 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 혼입에 의해 연장하여 3'-O-차단 연장 단편을 형성하는 단계, 및 (ii) 폴리뉴클레오타이드가 형성될 때까지 연장 단편을 탈차단하여 유리 3'-하이드록실을 갖는 연장 단편을 형성하는 단계를 반복하는 단계를 포함하는 방법 및 키트에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 또한 개시인자로부터 폴리뉴클레오타이드를 절단하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 3'-O-차단 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트는 3'-O-아지도메틸-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트이다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 소정의 서열을 갖는 폴리리보뉴클레오타이드의 주형 부재 합성을 수행하기 위한 키트에 관한 것이며, 상기 키트는 폴리(A) 중합효소, 고체 지지체에 부착된 개시인자, 및 3'-O-차단 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 단량체를 포함한다. 상기 3'-O-보호 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 단량체는 3'-O-아지도메틸-리보아데노신 트리포스페이트, 3'-O-아지도메틸-리보구아노신 트리포스페이트, 3'-O-아지도메틸-리보시티딘 트리포스페이트, 3'-O-아지도메틸-리보티미딘 트리포스페이트 및 3'-O-아미노-리보우리딘 트리포스페이트 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 상기 폴리(A) 중합효소는 서열번호 1에 적어도 90 퍼센트 동일하고, M310에서 치환되거나, 서열번호 3에 적어도 90 퍼센트 동일하고, M318에서 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리(A) 중합효소 변이체를 포함할 수 있고; 폴리(A) 중합효소 변이체는 (a) 주형의 부재 하에 리보핵산 단편을 합성할 수 있고, (b) 상기 3'-O-아지도메틸-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 리보핵산 단편에 혼입할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90 퍼센트 동일하고, 서열번호 1의 경우 위치 310, 서열번호 2의 경우 위치 318, 서열번호 3의 경우 위치 318, 서열번호 8의 경우 위치 316, 서열번호 9의 경우 위치 309, 서열번호 10의 경우 위치 316, 서열번호 11의 경우 위치 272, 서열번호 12의 경우 위치 316, 서열번호 13의 경우 위치 307, 서열번호 14의 경우 위치 313, 서열번호 15의 경우 위치 312, 서열번호 16의 경우 위치 317, 서열번호 17의 경우 위치 316, 서열번호 18의 경우 위치 316, 서열번호 19의 경우 위치 312, 서열번호 20의 경우 위치 310, 서열번호 21의 경우 위치 309, 서열번호 22의 경우 위치 317, 서열번호 23의 경우 위치 314, 서열번호 24의 경우 위치 307, 서열번호 25의 경우 위치 315, 서열번호 26의 경우 위치 316, 및 서열번호 27의 경우 위치 311에서의 메티오닌의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리(A) 중합효소 변이체에 관한 것이고, 상기 PAP 변이체는 (a) 주형의 부재 하에 리보핵산 단편을 합성할 수 있고, (b) 3'-O-아지도메틸-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 리보핵산 단편에 혼입할 수 있거나, 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 데옥시리보핵산 단편에 혼입할 수 있다. 특히, 상기 위치에서의 상기 메티오닌의 상기 치환은 F, Y, V, E 또는 T로부터 선택될 수 있다. 폴리(A) 중합효소 변이체는 또한 서열번호 1의 경우 위치 234, 서열번호 2의 경우 위치 240, 서열번호 3의 경우 위치 240, 서열번호 9의 경우 위치 232, 서열번호 10의 경우 위치 240, 서열번호 11의 경우 위치 196, 서열번호 12의 경우 위치 240, 서열번호 13의 경우 위치 229, 서열번호 14의 경우 위치 236, 서열번호 15의 경우 위치 236, 서열번호 16의 경우 위치 241, 서열번호 17의 경우 위치 233, 서열번호 18의 경우 위치 240, 서열번호 19의 경우 위치 240, 서열번호 20의 경우 위치 234, 서열번호 21의 경우 위치 233, 서열번호 22의 경우 위치 237, 서열번호 23의 경우 위치 238, 서열번호 24의 경우 위치 231, 서열번호 25의 경우 위치 239, 서열번호 26의 경우 위치 240, 및 서열번호 27의 경우 위치 235에서의 발린의 치환을 포함할 수 있다. 특히, 상기 위치에서의 발린의 상기 치환은 알라닌 또는 글리신일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 각각 서열번호 4, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 또는 47로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90 퍼센트 동일하고, 서열번호 4의 경우 위치 212, 서열번호 28의 경우 위치 189, 서열번호 29의 경우 위치 184, 서열번호 30의 경우 위치 227, 서열번호 31의 경우 위치 478, 서열번호 32의 경우 위치 192, 서열번호 33의 경우 위치 186, 서열번호 34의 경우 위치 243, 서열번호 35의 경우 위치 196, 서열번호 36의 경우 위치 253, 서열번호 37의 경우 위치 284, 서열번호 38의 경우 위치 182, 서열번호 39의 경우 위치 187, 서열번호 40의 경우 위치 203, 서열번호 41의 경우 위치 224, 서열번호 42의 경우 위치 204, 서열번호 43의 경우 위치 337, 서열번호 44의 경우 위치 296, 서열번호 45의 경우 위치 291, 서열번호 46의 경우 위치 218, 및 서열번호 47의 경우 위치 366에서의 티로신의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리(U) 중합효소 (PUP) 변이체에 관한 것이고, 상기 PUP 변이체는 (a) 주형의 부재 하에 리보핵산 단편을 합성할 수 있고, (b) 3'-O-아지도메틸-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 리보핵산 단편에 혼입할 수 있거나, 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 데옥시리보핵산 단편에 혼입할 수 있다. 특히, 상기 위치에서의 상기 티로신의 상기 치환은 알라닌 또는 글리신일 수 있다.
본 발명은 유리하게는 성장하는 RNA 단편으로 더 높은 비율의 리보뉴클레오타이드 혼입을 제공하는 주형 부재 중합효소 및 3'-O-변형 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 제공함으로써 효소적 폴리뉴클레오타이드 합성 분야에서 상기 문제를 극복한다.
도 1은 본 발명의 방법의 실시양태의 단계들을 도시한다.
도 2a 내지 도 2c는 본 발명의 방법에 따른 1 내지 5개의 리보뉴클레오타이드의 연장에 대한 데이터를 보여준다.
도 3ab는 M310F/Y/Q/A/V/E/T 돌연변이의 존재 하에 단일 3'-O-보호-rATP (3A) 및 rGTP (3B)를 사용한 폴리구아닐화를 사용한 연장에 대한 데이터를 보여준다.
도 4는 스키조사카로미세스 폼베 (schizosaccharomyces pombe) PUP에 의해 생성된 혼입 산물의 전기영동도이다. "No ext"는 표시된 열에 연장되지 않은 프라이머에 해당하는 밴드가 표시됨을 의미한다.
본 발명의 일반 원리는 특히 도면에 도시되고 상세하게 설명된 것과 같은 예를 통해 본 명세서에서 더욱 상세하게 개시된다. 그러나, 기재된 특정 실시양태로 본 발명을 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 본 발명은 다양한 변형 및 대안적인 형태를 수용할 수 있으며, 그 세부사항은 다수의 실시양태에 대해 제시되어 있다. 본 발명의 원리 및 범위에 속하는 모든 변형, 균등물 및 대안을 포괄하는 것으로 의되된다.
본 발명의 실시는 달리 지시되지 않는 한, 당해 분야의 기술 내에 있는 유기 화학, 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 세포 생물학 및 생화학에 대한 통상적인 기술 및 설명을 사용할 수 있다. 이러한 통상적인 기술은 다음에 제한되는 것은 아니나, 합성 펩타이드, 합성 폴리뉴클레오타이드, 단일 클론 항체의 제조 및 사용, 핵산 클로닝, 증폭, 시퀀싱 및 분석, 및 관련 기술을 포함할 수 있다. 이러한 통상의 기술에 대한 프로토콜은 제조업체의 산물 문헌 및 문헌[Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV); PCR Primer: A Laboratory Manual; and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Lutz and Bornscheuer, Editors, Protein Engineering Handbook (Wiley-VCH, 2009); Hermanson, Bioconjugate Techniques, Second Edition (Academic Press, 2008)] 등과 같은 표준 실험실 매뉴얼에서 찾을 수 있다.
본 발명은 동일한 합성에서 폴리(A) 중합효소 (PAP), 폴리(U) 중합효소 (PUP) 또는 PAP 및 PUP 둘 모두를 사용하여 폴리뉴클레오타이드, 폴리리보핵산 또는 폴리데옥시리보핵산을 합성하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, PAP 및/또는 PUP는 3'-O-가역적으로 보호된 rNTP 전구체를 사용하여 폴리리보핵산을 합성하는데 사용되며, 단일 PUP 또는 PAP 변이체는 모든 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 단량체를 연결하기 위해 사용될 수 있거나, 대안적인 실시양태에서, 상이한 PUP 및 PAP는 특정 RNA의 합성에서 상이한 종류의 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 단량체를 연결하기 위해 사용될 수 있다. 마찬가지로, 다른 실시양태에서, PAP 및/또는 PUP는 3'-O-가역적으로 보호된-dNTP 전구체를 사용하여 폴리데옥시리보핵산을 합성하는데 사용되며, 단일 PUP 또는 PAP는 모든 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (dNTP) 단량체를 연결하기 위해 사용되거나 다른 실시양태에서, 상이한 종류의 데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 단량체를 연결하기 위해 상이한 PUP 및 PAP 중합효소가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 합성 시 폴리뉴클레오타이드 사슬을 성장시키기 위해 3'-O-차단된-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 3'-O-차단된-2'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 연결 효능을 개선하기 위해 유전자 조작에 의해 변형된 PAP 및/또는 PUP 변이체를 사용한다.
RNA 합성을 위한 것이든 DNA 합성을 위한 것이든 본 발명의 방법은 도 1에 도시된 것과 같은 단계의 반복 사이클을 포함하며, RNA 합성을 위한 소정의 리보뉴클레오타이드 단량체 (또는 DNA 합성을 위한 2'-데옥시리보뉴클레오타이드 단량체)는 각 사이클에 첨가된다. 개시인자 폴리뉴클레오타이드 (100)는 예를 들어 유리 3'-하이드록실기 (103)를 갖는 고체 지지체 (102)에 부착되어 제공된다. RNA 합성의 경우 일반적으로 개시인자는 폴리리보뉴클레오타이드이고, DNA 합성의 경우 일반적으로 개시인자는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드이다. 개시인자 폴리뉴클레오타이드 (100) (또는 연장 개시인자 폴리뉴클레오타이드)의 3' 말단에 3'-O-보호-rNTP (또는 3'-O-보호 dNTP)의 효소적 혼입에 효과적인 조건 (104) 하에 개시인자 폴리뉴클레오타이드 (100) (또는 후속 사이클의 연장 개시인자 폴리뉴클레오타이드)에 3'-O-가역적으로 보호된-rNTP (또는 DNA 합성의 경우 3'-O-가역적으로 보호된-dNTP) 및 PAP 또는 PUP가 첨가된다. 이 반응은 3'-하이드록실이 보호되는 연장 개시인자 폴리뉴클레오타이드를 생성한다 (106). 연장 개시인자 폴리뉴클레오타이드가 보체 서열을 포함하는 경우, 3'-O-보호기가 제거되거나 탈보호되고, 적절한 서열이 원래 개시인자 폴리뉴클레오타이드로부터 절단된다. 이러한 절단은 다양한 단일 가닥 절단 기술 중 임의의 것을 사용하여, 예를 들어 원래 개시인자 폴리뉴클레오타이드 내의 소정의 위치에 절단 가능한 뉴클레오타이드를 삽입함으로써 수행될 수 있다. 예시적인 절단 가능한 뉴클레오타이드는 우라실 DNA 글리코실라제에 의해 절단되는 우라실 뉴클레오타이드일 수 있다. 추가로 매우 다양한 절단 가능한 연결 또는 절단 가능한 뉴클레오타이드가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 적절한 폴리뉴클레오타이드를 절단하면 절단된 가닥에 천연 유리 5'-하이드록실이 유지되지만; 대안적인 실시양태에서, 절단 단계는 예를 들어 포스파타제 처리로 후속 단계에서 제거될 수 있는 5'-포스페이트와 같은 모이어티가 유지될 수 있다. 절단 단계는 화학적, 열적, 효소적 또는 광화학적 방법에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단 가능한 뉴클레오타이드는 특정 글리코실라제 (예를 들어, 각각 우라실 데옥시글리코실라제 다음에 엔도뉴클레아제 VIII, 및 8-옥소구아닌 DNA 글리코실라제)에 의해 인식되는 데옥시우리딘 또는 8-옥소-데옥시구아노신과 같은 뉴클레오타이드 유사체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단은 개시인자에 데옥시이노신을 말단에서 두 번째 3' 뉴클레오타이드로 제공함으로써 달성될 수 있으며, 이는 개시인자의 3' 말단에서 엔도뉴클레아제 V에 의해 절단되어 방출된 폴리뉴클레오타이드 상에 5'-포스페이트를 유지시킬 수 있다. 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드를 절단하는 추가 방법은 참조로 포함되는 하기 참조문헌 미국 특허 제 5,739,386호, 제 5,700,642호 및 제 5,830,655호; 및 미국 특허 공개 제 2003/0186226호 및 제 2004/0106728호; 및 문헌[Urdea and Horn], 미국 특허 제 5367066호에 개시되어 있다.
연장 개시인자 폴리뉴클레오타이드가 보체 서열을 포함하지 않는 경우, 3'-O-보호기가 제거되어 유리 3'-하이드록실 (103)이 노출되고 연장 개시인자 폴리뉴클레오타이드가 리보뉴클레오타이드 첨가 및 탈보호의 또 다른 사이클에 적용된다.
일부 실시양태에서, 올리고리보뉴클레오타이드의 합성 방법은 (a) 유리 3'-하이드록실을 갖는 개시인자를 제공하는 단계; (b) 연장 조건 하에 3'-O-차단 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에 유리 3'-하이드록실을 갖는 개시인자 또는 연장 중간체 (즉, 연장 개시인자 폴리뉴클레오타이드)를 PAP와 반응시켜 3'-O-차단 연장 중간체를 생성하는 단계; (c) 연장 중간체를 탈차단하여 유리 3'-하이드록실을 갖는 연장 중간체를 생성하는 단계; 및 (d) 폴리리보뉴클레오타이드가 합성될 때까지 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 단계를 포함한다. ("연장 중간체"라는 용어는 또한 본 명세서에서 "연장 단편" 또는 "연장 개시인자 폴리뉴클레오타이드"로 지칭될 수 있음). 일부 실시양태에서, 상기 언급된 바와 같이, 개시인자는 예를 들어 그의 5' 말단에 의해 고체 지지체에 부착된 올리고뉴클레오타이드로서 제공된다. 상기 방법은 또한 반응, 또는 연장 단계 후뿐만 아니라, 탈차단 단계 후에 세척 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 반응 단계는 예를 들어 소정의 인큐베이션 기간 도는 반응 시간 후 세척에 의해 혼입되지 않은 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 제거하는 하위 단계를 포함할 수 있다. 이러한 소정의 인큐베이션 기간 또는 반응 시간은 수 초, 예를 들어 30초 내지 수 분, 예를 들어 30분일 수 있다.
일부 실시양태에서, 올리고리보뉴클레오타이드의 합성 방법은 (a) 유리 3'-하이드록실을 갖는 개시인자를 제공하는 단계; (b) 연장 조건 하에 3'-O-차단 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에 유리 3'-하이드록실을 갖는 개시인자 또는 연장 중간체 (즉, 연장 개시인자 폴리뉴클레오타이드)를 PAP 또는 PUP와 반응시켜 3'-O 차단 연장 중간체를 생성하는 단계; (c) 연장 중간체를 탈차단하여 유리 3'-하이드록실을 갖는 연장 중간체를 생성하는 단계; 및 (d) 폴리리보뉴클레오타이드가 합성될 때까지 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 단계를 포함한다. ("연장 중간체"라는 용어는 또한 본 명세서에서 "연장 단편" 또는 "연장 개시인자 폴리뉴클레오타이드"로 지칭될 수 있음). 일부 실시양태에서, 상기 언급된 바와 같이, 개시인자는 예를 들어, 그의 5' 말단에 의해 고체 지지체에 부착된 올리고뉴클레오타이드로서 제공된다. 상기 방법은 또한 반응, 또는 연장 단계 후뿐만 아니라, 탈차단 단계 후에 세척 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 반응 단계는 예를 들어 소정의 인큐베이션 기간 도는 반응 시간 후 세척에 의해 혼입되지 않은 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 제거하는 하위 단계를 포함할 수 있다. 이러한 소정의 인큐베이션 기간 또는 반응 시간은 수 초, 예를 들어 30초 내지 수 분, 예를 들어 30분일 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오타이드의 합성 방법은 (a) 유리 3'-하이드록실을 갖는 개시인자를 제공하는 단계; (b) 연장 조건 하에 3'-O-차단 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에 유리 3'-하이드록실을 갖는 개시인자 또는 연장 중간체 (즉, 연장 개시인자 폴리뉴클레오타이드)를 PAP 또는 PUP와 반응시켜 3'-O 차단 연장 중간체를 생성하는 단계; (c) 연장 중간체를 탈차단하여 유리 3'-하이드록실을 갖는 연장 중간체를 생성하는 단계; 및 (d) 폴리뉴클레오타이드가 합성될 때까지 단계 (b) 및 (c)를 반복하는 단계를 포함한다. ("연장 중간체"라는 용어는 또한 본 명세서에서 "연장 단편" 또는 "연장 개시인자 폴리뉴클레오타이드"로 지칭될 수 있음). 일부 실시양태에서, 상기 언급된 바와 같이, 개시인자는 예를 들어, 그의 5' 말단에 의해 고체 지지체에 부착된 올리고뉴클레오타이드로서 제공된다. 상기 방법은 또한 반응, 또는 연장 단계 후뿐만 아니라, 탈차단 단계 후에 세척 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 반응 단계는 예를 들어 소정의 인큐베이션 기간 도는 반응 시간 후 세척에 의해 혼입되지 않은 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 제거하는 하위 단계를 포함할 수 있다. 이러한 소정의 인큐베이션 기간 또는 반응 시간은 수 초, 예를 들어 30초 내지 수 분, 예를 들어 30분일 수 있다.
상기 방법은 또한 반응 또는 연장 단계 후 및 탈차단 단계 후에 캡핑 단계 (들)뿐만 아니라, 세척 단계를 포함할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 비연장 유리 3'-하이드록실이 캡핑된 가닥의 임의의 추가 연장을 방지하는 화합물과 반응하는 캡핑 단계가 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 화합물은 디데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트일 수 있다. 다른 실시양태에서, 유리 3'-하이드록실을 갖는 비연장 가닥은 3'-엑소리보뉴클레아제 활성 예를 들어, RNase R (Epicentre)로 처리함으로써 분해될 수 있다. 유사하게, 일부 실시양태에서, 탈차단되지 않은 가닥은 가닥을 제거하거나 추가 연장에 대해 불활성이 되도록 처리될 수 있다.
올리고리보뉴클레오타이드의 연속 합성을 포함하는 일부 실시양태에서, 캡핑 단계는 동일한 몰량의 다수의 올리고뉴클레오타이드의 생성을 방지할 수 있으므로 캡핑 단계가 바람직하지 않을 수 있다. 캡핑의 부재 하에 서열은 균일한 결실 분포 오류를 나타내지만 다수의 올리고리보뉴클레오타이드 각각은 동일한 몰량으로 존재할 것이다. 연장되지 않은 단편이 캡핑된 경우에는 그렇지 않다.
일부 실시양태에서, PAP 또는 PUP를 사용한 연장 또는 연장 단계를 위한 반응 조건은 다음을 포함할 수 있다: 반응 조건 1 (프라이머+AM-rATP): 250 uM AM-rATP, 0.1 uM ATTO488-(rA)5, 1 uM PAP, 1x ATP 완충액 (20 mM Tris-HCl, 0.6 mM MnCl2, 0.02 mM EDTA, 0.1% BSA, 10% 글리세롤, 100 mM 이미다졸, pH 7-8), 37 C, 30 min. 반응 조건 2 (프라이머+AM-rGTP): 250 uM rGTP, 0.1 uM ATTO488-(rA)5, 1 uM PAP, 1x GTP 완충액 (0.6 mM MnCl2, 0.1% BSA, 10 mM 이미다졸, pH 6), 37 C, 30 min. 상기에서 "AM-rNTP"는 3'-아지도메틸-O-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 지칭한다.
특정 적용에 따라, 탈차단 및/또는 절단 단계는 다양한 화학적 또는 물리적 조건, 예를 들어, 빛, 열, pH, 특정 화학 결합을 절단할 수 있는 효소와 같은 특정 시약의 존재를 포함할 수 있다. 3'-O-차단기 및 해당하는 탈차단 조건 선택에 대한 지침은 문헌[Wuts, Green's Protection Groups in Organic Chemistry, 5th Edition (Wiley 2014)]과 같은 참조문헌에서 찾을 수 있다. 일부 실시양태에서, 절단제 (때때로 탈차단 시약 또는 제제로도 지칭됨)는 예를 들어 디티오트레이톨 (DTT)과 같은 화학적 절단제이다. 대안적인 실시양태에서, 절단제는 3'-포스페이트 차단기를 절단할 수 있는 예를 들어 포스파타제와 같은 효소적 절단제일 수 있다. 탈차단제의 선택은 사용된 3'-뉴클레오타이드 차단기의 유형, 하나 또는 다중 차단기가 사용되는지, 개시인자가 생존 세포 또는 유기체 또는 간단한 처리가 필요한 고체 지지체에 부착되는지 등에 좌우됨을 당업자는 이해할 것이다. 예를 들어, 트리스(2-카복시에틸)포스핀 (TCEP)과 같은 포스핀을 사용하여 3'O-아지도메틸기를 절단할 수 있고, 팔라듐 착물을 사용하여 3'O-알릴기 및 3'-O-프로파길기를 절단할 수 있으며, 아질산나트륨을 사용하여 3'O-아미노기를 절단할 수 있다.
위에서 언급한 바와 같이, 일부 실시양태에서, 직교 탈차단 조건을 사용하여 제거될 수 있는 2개 이상의 차단기를 사용하는 것이 바람직하다. 하기 예시적인 차단기 쌍은 2개 이상의 서열이 동일한 반응 혼합물에서 합성되는 병렬 합성 실시양태에서 사용될 수 있다. 다른 차단기 쌍, 또는 둘 이상을 포함하는 기가 본 발명의 이러한 실시양태에서 사용하기 위해 이용가능할 수 있음이 이해된다.
Figure pct00001
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "개시인자" (또는 "개시 단편", "개시인자 핵산", "개시인자 올리고뉴클레오타이드" 등과 같은 균등한 용어)는 유리 3' 말단을 갖는 짧은 올리고뉴클레오타이드 서열을 지칭하며, PAP 또는 PUP와 같은 주형 부재 중합효소에 의해 추가로 연장될 수 있다. 일 실시양태에서, 개시 단편은 DNA 또는 RNA 개시 단편이다. 대안적인 실시양태에서, 개시 단편은 RNA 개시 단편이다. 일 실시양태에서, 개시 단편은 3 내지 100개의 뉴클레오타이드, 특히 3 내지 20개의 뉴클레오타이드를 보유한다. 일 실시양태에서, 개시 단편은 단일 가닥이다. 대안적인 실시양태에서, 개시 단편은 이중 가닥이다. 특정 실시양태에서, 5'-1차 아민으로 합성된 개시인자 올리고뉴클레오타이드는 제조업체의 프로토콜을 사용하여 자기 비드에 공유결합에 의해 연결될 수 있다. 마찬가지로, 3'-1차 아민으로 합성된 개시인자 올리고뉴클레오타이드는 제조업체의 프로토콜을 사용하여 자기 비드 또는 아가로스 비드에 공유결합에 의해 연결될 수 있다. 본 발명의 실시양태와 함께 사용하기 위한 다양한 다른 부착 화학물질은 당업계에 잘 알려져 있다 (문헌[Integrated DNA Technologies brochure, "Strategies for Attaching Oligonucleotides to Solid Supports," v.6 (2014); Hermanson, Bioconjugate Techniques, Second Edition (Academic Press, 2008)] 및 유사 참조문헌).
본 발명에 사용된 많은 3'-O-차단 rNTP는 상업적 판매업체 (예를 들어, Jena Bioscience, MyChemLabs 등)로부터 구입하거나, 예를 들어, 미국 특허 제 7057026호; 국제 특허 공개 WO2004/005667, WO91/06678; 문헌[Canard et al, Gene (상기 인용); Metzker et al, Nucleic Acids Research, 22: 4259-4267 (1994); Meng et al, J. Org. Chem., 14: 3248-3252 (3006)]; 미국 특허 공개 제 2005/037991호; 문헌[Zavgorodny et al, Tetrahedron Letters, 32 (51): 7593-7596 (1991)]의 공개된 기술을 사용하여 합성될 수 있다.
추가의 특정 실시양태에서, 3'-차단 뉴클레오타이드 트리포스페이트는 3'-O-프로파길, 3'-O-아지도메틸, 3'-O-NH2 또는 3'-O-알릴기에 의해 차단된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 3'-O-차단기는 3'-O-메틸, 3'-O-(2-니트로벤질), 3'-O-알릴, 3'-O-아민, 3'-O-아지도메틸, 3'-O-tert-부톡시 에톡시, 3'-O-(2-시아노에틸), 및 3'-O-프로파길을 포함한다.
폴리(A) 중합효소 및 유용한 변이체
3'-O-보호-rNTP의 더 높은 혼입 비율 (특정 보호기, 예컨대 3'-O-아지도메틸 포함), 더 큰 안정성 및 저장 수명, 열안정성, 용해도 등과 같은 개선된 특성을 위해 조작된 PAP 변이체를 포함하는 매우 다양한 PAP가 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있다. 특히, M310 (서열번호 1)에 돌연변이가 있는 효모 PAP, 또는 다양한 다른 종의 PAP와 같은 다른 PAP의 기능적으로 균등한 잔기는 야생형 PAP에 비해 3'-O-보호 rNTP의 개선된 혼입을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 효모 PAP 변이체는 M310에서의 치환을 제외하고 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이러한 치환은 M310F/Y/V/E/T로부터 선택된다. 특히, 치환 M310F/Y는 3'-O-아미노-rATP의 혼입을 가능하게 하고 치환 M310V/E/T는 3'-O-보호-rGTP의 혼입 비율을 개선한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 효모 PAP 변이체는 M310에서의 치환을 제외하고 서열번호 1의 적어도 90 퍼센트 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 PAP 변이체는 하기 표 1에 열거된 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PAP 변이체는 표 1에 나타낸 제2 위치에서 적어도 하나의 치환을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 PAP 변이체의 실시양태는 표 1에 나타낸 제1 위치에서 적어도 하나의 치환을 포함한다.
PAP 변이체: 치환 위치
서열번호 유기체 제1 위치 제2 위치
1 효모 V234 M310
2 마이셀리오프토라 (Myceliophthora) V240 M318
3 티엘라비아 (Thielavia) V240 M318
8 피로네마 (Pyronema) I237 M316
9 틸레티아 (Tilletia) V232 M309
10 클라트로스포라 (Clathrospora) V240 M316
11 드레크슬렐라 (Drechslerella) V196 M272
12 마그나포르티옵시스 (Magnaporthiopsis) V240 M316
13 크립토코쿠스 (Cryptococcus) V229 M307
14 골로비노마이세스 (Golovinomyces) V236 M313
15 호르타에아 (Hortaea) V236 M312
16 발사 (Valsa) V241 M317
17 왈레미아 (Wallemia) V233 M316
18 크실라리아 (Xylaria) V240 M316
19 카에토미움 (Chaetomium) V240 M312
20 라칸세아 (Lachancea) V234 M310
21 쉬조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) V233 M309
22 엑소피알라 (Exophiala) V237 M317
23 스케도스포리움 (Scedosporium) V238 M314
24 트리코데르마 (Trichoderma) V231 M307
25 아스퍼길루스 (Aspergillus) V239 M315
26 소디오마이세스 (Sodiomyces) V240 M316
27 네오호르타에아 (Neohortaea) V235 M311
일부 실시양태에서, 표 1에 나타낸 바와 같은 제1 위치에서의 치환은 A 또는 G이다 (따라서, 예를 들어, 서열번호 1의 경우, 치환은 V234A/G로 기재될 수 있음). 일부 실시양태에서, 표 1에 나타낸 바와 같은 제2 위치에서의 치환은 F, Y, V, E, 또는 T이다 (따라서, 예를 들어, 서열번호 1의 경우, 치환은 M310F/Y/V/E/T로 기재될 수 있음).
일부 실시양태에서, 본 발명의 PAP 변이체는 표 1의 치환 중 하나 이상 및 표시된 서열번호와 적어도 80 퍼센트 동일성의 동일성 퍼센트 값을 갖고; 일부 실시양태에서, 상기 동일성 퍼센트 값은 표시된 서열번호에 적어도 90 퍼센트 동일성이고; 일부 실시양태에서, 상기 동일성 퍼센트 값은 표시된 서열번호에 적어도 95퍼센트 동일성이고; 일부 실시양태에서, 상기 동일성 퍼센트 값은 적어도 97 퍼센트 동일성이고; 일부 실시양태에서, 상기 동일성 퍼센트 값은 적어도 98 퍼센트 동일성이고; 일부 실시양태에서, 상기 동일성 퍼센트 값은 적어도 99 퍼센트 동일성이다.
일부 실시양태에서, 합성되는 RNA 또는 DNA에서 2차 구조의 형성을 감소시키거나 제거하는 온도에서 본 방법이 실시될 수 있도록 열안정성 PAP가 사용된다. 일부 실시양태에서, 열안정성 PAP에 대해 가장 높은 혼입 비율이 발생하는 온도 범위는 40℃보다 더 높다. 일부 실시양태에서, 열안정성 PAP에 대해 가장 높은 혼입 비율이 발생하는 온도 범위는 50℃보다 더 높다. 일부 실시양태에서, 열안정성 PAP에 대해 가장 높은 혼입 비율이 발생하는 온도 범위는 40℃ 내지 85℃이다. 일부 실시양태에서, 열안정성 PAP에 대해 가장 높은 혼입 비율이 발생하는 온도 범위는 50℃ 내지 85℃이다.
폴리(U) 중합효소 및 유용한 변이체
PAP에서와 같이, 3'-O-보호-rNTP (3'-O-아지도메틸과 같은 특정 보호기 포함)의 더 높은 혼입 비율, 더 큰 안정성 및 저장 수명, 열안정성, 용해도 등과 같은 개선된 특성을 위해 조작된 PUP 변이체를 포함하는 매우 다양한 PUP가 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 PUP 변이체는 하기 표 2에 열거된 것들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 PUP 변이체는 표 2에 나타낸 제1 위치에서 적어도 하나의 치환을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 PAP 변이체의 실시양태는 표 2에 나타낸 제2 위치에서 적어도 하나의 치환을 포함한다.
PUP 변이체: 치환 위치
서열번호 유기체 제1 위치 제2 위치
4 S. 폼베 (S. pombe) Y212 H336
28 T. 브루세이 (T. brucei) Y189 L303
29 S. 폼베 Y184 H308
30 T. 보우디에리 (T. boudieri) Y227 H364
31 D. 스테노브로카 (D. stenobrocha) Y478 H613
32 피토모나스 (Phytomonas) Y192 L306
33 B. 살탄스 (B. saltans) Y186 L326
34 A. 데아네이 (A. deanei) Y243 L392
35 P. 락투카에데빌리스 (P. lactucaedebilis) Y196 H330
36 S. 쿨리시스 (S. culicis) Y253 L392
37 B. 메리스토스포루스 (B. meristosporus) Y284 H408
38 N. 칼리포니아에 (N. californiae) Y182 H310
39 퍼킨셀라 (Perkinsela) Y187 L394
40 S. 콤플리케이트 (S. complicate) Y203 H331
41 S. 오크라세움 (S. ochraceum) Y224 F349
42 G. 안드로사케우스 (G. androsaceus) Y204 Y332
43 T. 에쿠이페르둠 (T. equiperdum) Y337 L473
44 M. 코니카 (N. conica) Y296 H431
45 P. 무리나 (P. murina) Y291 H423
46 S. 자포니쿠스 (S. japonicus) Y218 H340
47 A. 니그리칸스 (A. nigricans) Y366 H509
일부 실시양태에서, 표 2에 나타낸 바와 같은 제1 위치에서의 치환은 A 또는 G이다 (따라서, 예를 들어, 서열번호 4의 경우, 치환은 Y212A/G로 기재될 수 있음). 일부 실시양태에서, 표 2에 나타낸 바와 같은 제2 위치에서의 치환은 F, Y, V, E, 또는 T이다 (따라서, 예를 들어, 서열번호 4의 경우, 치환은 H336F/Y/V/E/T로 기재될 수 있음).
일부 실시양태에서, 본 발명의 PUP 변이체는 표 2의 치환 중 하나 이상 및 표시된 서열번호에 적어도 80 퍼센트 동일성의 동일성 퍼센트 값을 갖고; 일부 실시양태에서, 상기 동일성 퍼센트 값은 표시된 서열번호에 적어도 90 퍼센트 동일성이고; 일부 실시양태에서, 상기 동일성 퍼센트 값은 표시된 서열번호에 적어도 95 퍼센트 동일성이고; 일부 실시양태에서, 상기 동일성 퍼센트 값은 적어도 97 퍼센트 동일성이고; 일부 실시양태에서, 상기 동일성 퍼센트 값은 적어도 98 퍼센트 동일성이고; 일부 실시양태에서, 상기 동일성 퍼센트 값은 적어도 99 퍼센트 동일성이다.
일부 실시양태에서, 합성되는 RNA 또는 DNA에서 2차 구조의 형성을 감소시키거나 제거하는 온도에서 본 방법이 실시될 수 있도록 열안정성 PUP가 사용된다. 일부 실시양태에서, 열안정성 PUP에 대해 가장 높은 혼입 비율이 발생하는 온도 범위는 40℃보다 더 높다. 일부 실시양태에서, 열안정성 PUP에 대해 가장 높은 혼입 비율이 발생하는 온도 범위는 50℃보다 더 높다. 일부 실시양태에서, 열안정성 PUP에 대해 가장 높은 혼입 비율이 발생하는 온도 범위는 40℃ 내지 85℃이다. 일부 실시양태에서, 열안정성 PUP에 대해 가장 높은 혼입 비율이 발생하는 온도 범위는 50℃ 내지 85℃이다.
PAP 및 PUP 변이체 생성
본 발명의 변이체는 공지된 참조 또는 야생형 PAP-코딩 또는 PUP-코딩 폴리뉴클레오타이드를 돌연변이시킨 다음, 이를 통상적인 분자 생물학 기술을 사용하여 이를 발현시킴으로써 생성된다. 예를 들어, 적절한 서열의 폴리펩타이드를 인코딩하는 적절한 유전자 또는 DNA 단편은 예를 들어, 문헌[Stemmer et al, Gene, 164: 49-53 (1995); Kodumal et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 101: 15573-15578 (2004)] 등에 기재된 프로토콜을 사용하여 통상적인 분자 생물학 기술을 사용하여 합성 단편으로부터 조립될 수 있거나, 이러한 유전자 또는 DNA 단편은 통상의 프로토콜을 사용하여 선택된 종의 세포로부터 직접 클로닝될 수 있다.
적절한 PAP 또는 PUP 변이체를 인코딩하는 단리된 유전자는 발현 벡터를 제공하기 위해 발현 벡터에 삽입될 수 있으며, 이는 이후 통상적인 프로토콜을 사용하여 변이체 PAP 또는 PUP 단백질을 생성 및 발현시키는데 사용될 수 있다. 정확한 서열을 가진 벡터는 E. 콜라이 생성자 균주에서 형질전환될 수 있다.
다음 절차는 PAP 변이체에 대해 설명되지만, 유사한 절차가 당업자에 의해 PUP 변이체에 적용될 수 있다. 형질전환된 균주를 통상적인 기술을 사용하여 PAP 단백질이 추출되는 펠렛으로 배양한다. 예를 들어, 미리 제조된 펠렛을 30 내지 37℃ 수조에서 해동시킨다. 완전히 해동되면, 펠렛을 50 mM tris-HCL (Sigma) pH 7.5, 150 mM NaCl (Sigma), 0.5 mM 머캅토에탄올 (Sigma), 5% 글리세롤 (Sigma), 20 mM 이미다졸 (Sigma) 및 프로테아제 칵테일 억제제 (Thermofisher) 100 mL용의 1개의 탭으로 구성된 용해 완충액에 재현탁한다. 조기 용해 및 응집체의 잔류를 방지하기 위해 신중한 재현탁을 수행한다. 재현탁된 세포를 전체 색상 균질성이 획득될 때까지 다수의사이클의 프렌치 프레스 (French press)를 통해 용해시킨다. 사용되는 일반적인 압력은 14,000 psi이다. 그런 다음 용해물을 10,000 rpm에서 1시간 내지 1시간 30분 동안 원심분리한다. 원심분리물을 0.2 μm 필터를 통과시켜 임의의 파편을 제거한 후, 컬럼 정제에 적용한다.
PAP 단백질을 1단계 친화도 절차로 원심분리물로부터 정제할 수 있다. 예를 들어, Ni-NTA 친화도 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 PAP 중합효소를 결합시킬 수 있다. 초기에 컬럼을 세척하고 15 컬럼 부피의 50 mM tris-HCL (Sigma) pH 7.5, 150 mM NaCl (Sigma) 및 20 mM 이미다졸 (Sigma)로 평형화한다. PAP 중합효소를 평형 후 컬럼에 결합시키고; 그런 다음, 예를 들어 50 mM tris-HCL (Sigma) pH 7.5, 500 mM NaCl (Sigma) 및 20 mM 이미다졸 (Sigma)로 구성된 세척 완충액을 15개의 컬럼 부피에 대해 컬럼에 적용할 수 있다. 이러한 세척 후, PAP 중합효소를 50 mM tris-HCL (Sigma) pH 7.5, 500 mM NaCl (Sigma) 및 0.5M 이미다졸 (Sigma)로 용리된다. 대상 PAP 중합효소의 최고 농도에 해당하는 분획을 수집하여 단일 샘플에 풀링 (pooling)하였다. 풀링된 분획을 투석 완충액 (20 mM Tris-HCl, pH 6.8, 200 mM Na Cl, 50 mM MgOAc, 100 mM [NH4]2SO4)에 대해 투석한다. 이후 투석물을 농축 필터 (Amicon Ultra-30, Merk Millipore)를 사용하여 농축시킨다. 농축된 효소를 소량으로 나누어 최종 50% 글리세롤을 첨가한 후-20℃에서 냉동하여 장기간 저장한다. 5 μL의 다양한 정제된 효소 분획을 SDSPAGE 겔에서 분석한다.
일부 실시양태에서, PAP 변이체를 공유 또는 비공유 결합; 아미노산 태그 (예를 들어, 폴리-아미노산 태그, 폴리-His 태그, 6His-태그 등); 화합물 (예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜); 단백질-단백질 결합 쌍 (예를 들어, 비오틴-아비딘); 친화도 결합; 포획 프로브; 또는 이의 조합을 포함하는 링커 모이어티에 작동 가능하게 연결시킬 수 있다. 링커 모이어티를 PAP 변이체 또는 그 일부로부터 분리시킬 수 있다. 본 발명의 PAP 변이체와 함께 사용하기 위한 예시적인 His-태그는 MASSHHHHHHSSGSENLYFQTGSSG-(서열번호 5))이다. 태그-링커 모이어티는 뉴클레오타이드 결합 활성 또는 PAP 변이체의 촉매 활성을 방해하지 않는다.
상기 공정 또는 균등한 공정은 활성 및/또는 보존을 위해 필요하거나 유용한 염, pH 완충액, 담체 화합물 등과 같은 다양한 시약과 혼합될 수 있는 단리된 PAP 또는 PUP 변이체를 생성한다.
뉴클레오타이드 혼입 활성 측정
본 발명의 변이체에 의한 뉴클레오타이드 혼입의 효율은 연장, 또는 연장, 분석에 의해 측정될 수 있고, 이는 문헌[Boule et al (하기 인용); Bentolila et al (하기 인용)]; 및 Hiatt 등의 미국 특허 제 5808045호에 기재되어 있으며, 상기 문헌 중 후자는 본 명세서에 참조로 포함된다. 간략하게, 이러한 분석의 한 형태에서, 유리 3'-하이드록실을 갖는 형광 표지된 올리고뉴클레오타이드를 가역적으로 차단된 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에 소정의 기간 동안 테스트될 PAP 변이체와 PAP 연장 조건 하에 반응시키고, 그 후 연장 반응을 중지하고 겔 전기영동으로 분리한 후 연장 산물과 연장되지 않은 개시인자 올리고뉴클레오타이드의 양을 정량화한다. 이러한 분석에 의해, PAP 변이체의 혼입 효율을 다른 변이체의 효율 또는 야생형 또는 참조 PAP 또는 다른 중합효소의 효율과 쉽게 비교할 수 있다. 일부 실시양태에서, PAP 변이체 효율의 척도는 균등한 분석에서 야생형 PAP를 사용한 연장 산물의 양에 대한 PAP 변이체를 사용한 연장 산물의 양의 비율 (백분율로 주어짐)일 수 있다. 시약을 물에서 시작하여 표 3의 순서로 튜브에 첨가한다.
연장 활성 분석 시약
시약 농도 부피
H2O - 12 μL
활성 완충액 10x 2 μL
rNTP 250 μM 2 μL
정제 효소 20 μM 2 μL
형광 프라이머 500 μM 2 μL
분석의 산물을 통상적인 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석할 수 있다. 예를 들어, 위 분석의 산물을 16 퍼센트 폴리아크릴아미드 변성 겔 (Bio-Rad)에서 분석할 수 있다. 분석 직전 유리판 내부에 폴리아크릴아미드를 붓고 중합시켜 겔을 제조한다. 유리판 내부의 겔을 전기영동 단계를 위해 TBE 완충액 (Sigma)이 채워진 개조된 탱크에 장착한다. 분석할 샘플을 겔 상부에 부가한다. 500 내지 2,000 V의 전압을 겔의 상부와 하부 사이에 실온에서 3 내지 6시간 동안 적용한다. 분리 후, 겔 형광을 예를 들어 Typhoon 스캐너 (GE Life Sciences)를 사용하여 스캔한다. 변형된 뉴클레오타이드의 혼입 백분율을 계산하기 위해 ImageJ 소프트웨어 (imagej.nih.gov/ij/) 또는 이의 균등물을 사용하여 겔 이미지를 분석한다.
키트
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 키트는 폴리(A) 중합효소 및 아데노신, 구아노신, 우리딘 및 시티딘 중 하나 이상의 3'-O-차단 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 포함한다. 다른 실시양태에서, 이러한 키트는 폴리(U) 중합효소를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 키트는 폴리(A) 중합효소 및 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 및 데옥시시티딘 중 하나 이상의 3'-O-차단-2'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 포함한다. 다른 실시양태에서, 이러한 키트는 폴리(U) 중합효소를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 키트는 5' 말단에 의해 지지체에 부착된 유리 3'-하이드록실을 갖는 개시인자를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 지지체는 고체 지지체이다. 이러한 고체 지지체는 자성 비드 또는 아가로스 비드와 같은 비드, 유리 슬라이드 또는 막과 같은 평면 고체를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 키트는 혼입된 3'-O-차단 뉴클레오타이드로부터 3' 차단기를 제거할 수 있는 탈차단제를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 서열번호 1의 효모 PAP와 같은 효모 PAP의 M310 돌연변이체, 또는 상이한 종의 PAP 내의 M310에 기능적으로 균등인 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 키트는 서열번호 1, 2 또는 3으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90 퍼센트 동일하고, 서열번호 1의 경우 위치 310에서의 메티오닌, 또는 서열번호 2 및 3의 경우 위치 318에서의 메티오닌의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 PAP 변이체를 포함할 수 있고, 본 변이체는 (a) 주형의 부재 하에 리보핵산 단편을 합성할 수 있고, (b) 3'-O-아지도메틸-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 리보핵산 단편에 혼입할 수 있거나, 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 데옥시리보핵산 단편에 혼입할 수 있다.
일부 실시양태에서, 전술한 키트의 PAP 변이체에서 서열번호 1의 위치 310에서의 메티오닌 또는 서열번호 2 또는 3의 위치 318에서의 메티오닌의 치환은 M310F/Y/V/E/T로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 전술한 키트의 PAP 변이체에는 서열번호 1의 경우 위치 234에서의 발린 및 서열번호 2 및 3의 경우 위치 240에서의 발린의 치환이 존재한다. 일부 실시양태에서, 상기 키트의 PAP 변이체에서 서열번호 1의 위치 234에서의 및 서열번호 2 및 3의 경우 위치 240에서의 발린의 치환은 알라닌이다. 일부 실시양태에서, 상기 키트의 PAP 변이체에서 서열번호 2 또는 3의 경우 위치 410에서의 알라닌의 치환이 존재한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 키트는 표 1의 서열번호 1 내지 3 및 8 내지 27로부터 선택되는 서열에 적어도 80 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 갖는 PAP 변이체를 포함할 수 있으며, 이는 표 1에 나타낸 바와 같은 선택된 서열의 제1 위치에서의 치환 또는 제2 위치에서의 치환 또는 두 위치 모두에서의 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 선택된 서열의 이러한 동일성 퍼센트는 적어도 90 퍼센트 동일성이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 키트는 표 2의 서열번호 4 및 28 내지 47로부터 선택되는 서열에 적어도 80 퍼센트 동일한 아미노산 서열을 갖는 PUP 변이체를 포함할 수 있으며, 이는 표 2에 나타낸 바와 같은 선택된 서열의 제1 위치에서의 치환 또는 제2 위치에서의 치환 또는 두 위치 모두에서의 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, 선택된 서열의 이러한 동일성 퍼센트는 적어도 90 퍼센트 동일성이다.
실시예 1
고체 지지체에 고정된 개시인자 폴리뉴클레오타이드에 대한 1 내지 5개의 리보뉴클레오타이드 첨가
PAP (Thermo)의 존재 하에 3'-O-아지도메틸-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 (AM-NTP)를 사용한 Cp-RNA 프라이머의 2 내지 3 사이클 연장. 실험 절차: 1) Cp-비드의 제조: 100 uL Cp-비드 (비드 상의 Cp 프라이머 농도 약 1 uM) + 1 uL 100 uM SynRDA_DNA-SynRDA_RNA; 실온에서 30분 동안 인큐베이션, 3x200 uL 결합 완충액 (BB), (200 mM caco, LiCl)으로 비드 세척, 25 uL BB에 비드 재현탁; 2) +1 첨가 반응: 250 uM 3'O-말단 뉴클레오타이드; 3.2 μM Cp-SynRDA_DNA-SynRDA_RNA; 1x PAP_효모 열 반응 완충액; 100 U/uL PAP_효모 (Thermo); 20 uL 최종 부피; Eppendorf 튜브; 30분, 37℃, 열혼합기, 1500 rpm, 3) +1 산물 세척: 3X 200 uL BB 4) TCEP 탈보호: 50 uL 200 uM TCEP, pH 7.0 (새로 개봉한 앰풀로부터 희석)에 비드 재현탁, 37C, 15 min, 열혼합기, 1500rpm; 5) 탈보호 +1 산물 세척: 3x 200 uL 결합 완충액, 6) +2/탈보호/+3 첨가: 1)-5) 참조, 8) 용리 + 겔: 20 uL B-블루 첨가, 교반, 용리, 겔 적용. 사용된 Cp-RNA 비드를 다음과 같은 방식으로 제조하였다: i) DNA 올리고 (TCATTTCACTCTCACA-NH2) (서열번호 6)에 의한 말단 카복실산 기를 표시하는 상용 Dynabead M-270 (Thermo Fisher에서 구매)의 공유 결합 기능화. 이 비드를 Cp 비드라고 한다. 그런 다음 Cp-비드를 서열 ATTO488-TGTGAGAGTGAAATGAGGrUrGrUrGrArGrArGrUr-GrArArArUrGrArGrG (SynRDA_DNA-SynRDA_RNA로 명명) (서열번호 7)의 DNA-RNA 혼성체 프라이머와 함께 인큐베이션하였다.
결과는 도 2a 내지 도 2c에 도시되어 있다. 이 데이터는 i) 3'-O-AM-rATP 및 3'-O-AM-rUTP를 사용하여 동일한 뉴클레오타이드로 첨가/탈보호의 적어도 5 사이클을 달성할 수 있음을 보여주고; ii) 2개의 다른 3'-O-AM-rNTP (A 및 U)를 사용하여 첨가/탈보호의 적어도 2 사이클을 달성할 수 있으며; iii) 3'-O-AM 보호 RNA의 적어도 95% 초과 탈보호가 달성될 수 있음을 보여준다.
실시예 2
AM-rATP 연장 및 리보구아닐화 활성에 대한 PAP M310 돌연변이의 영향
이 실험에서, RNA 프라이머의 AM-rATP 연장 (도 3a) 및 RNA 프라이머의 리보구아닐화 (도 3b)의 활성에 대한 PAP 위치 M310의 돌연변이의 효과를 조사하였다. RNA 프라이머의 AM-rATP 연장 (도 3a)을 연장 AM-rATP 완충액 (20 mM Tris-HCl, 0.6 mM MnCl2, 0.02 mM EDTA, 0.1% BSA, 10% 글리세롤, 100 mM 이미다졸, pH 7-8)에서 0.1 uM ATTO488-(rA)5 프라이머, 0.5 uM PAP 돌연변이체, 250 uM AM-rATP의 존재 하에 30분 동안 37C에서 총 반응 부피 20 uL로 수행하였다. RNA 프라이머의 리보구아닐화 (도 3b)를 rGTP 중합 완충액 (0.6 mM MnCl2, 0.1% BSA, 10 mM 이미다졸, pH 6.2)에서 0.1 uM ATTO488-(rA)5 프라이머, 0.5 uM PAP 돌연변이체, 250 uM AM-rATP의 존재 하에 30분 동안 37C에서 총 반응 부피 20 uL로 수행하였다.
실시예 3
AM-rNTP 혼입에 대한 티엘라비아 PAP 변이체의 효과
티엘라비아 PAP (서열번호 3)를 통상적인 기술을 사용하여 3개의 치환 (V240A, M318T 및 A410V)을 갖도록 조작한 후, 변형된 폴리펩타이드를 발현 및 정제하였다. AM-NTP를 혼입시키는 돌연변이된 PAP 및 야생형 티엘라비아 PAP의 능력을 다음 조건을 제외하고 실시예 2에 기재된 분석을 수행하여 비교하였다: 0.1 μM Atto488-(rA)7, 3.0 μM PAP, 250 μM AM-NTP. 반응 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
PAP 용융 온도
(도C)		 순도 +1
산물 (%)AM-ATP		 순도 +1
산물 (%)AM-UTP		 순도 +1
산물 (%)AM-GTP		 순도 +1
산물 (%)AM-CTP
텔라비아 변이체 46 100 100 97 95
텔라비아 야생형 48 100 100 23 31
데이터는 텔라비아 PAP 변이체가 AM-rGTP 및 AM-rCTP 단량체를 해당 야생형 PAP보다 훨씬 더 효율적으로 혼입시킨다는 것을 보여준다.
실시예 4
PUP에 의한 AM-NTP 혼입
이 실험에서, 스키조사카로미세스 폼베 PUP (서열번호 4)를 사용하여 AM-NTP를 실시예 3의 실험 프로토콜을 사용하여 개시인자에 혼입시켰다. 연장 산물을 겔 전기영동으로 분리하여 도 4에 나타낸 전기영동도를 획득하였다.
정의
아미노산은 다음 명명법에 따라 1문자 또는 3문자 코드로 표시된다: A: 알라닌 (Ala); C: 시스테인 (Cys); D: 아스파르트산 (Asp); E: 글루탐산 (Glu); F: 페닐알라닌 (Phe); G: 글리신 (Gly); H: 히스티딘 (His); I: 이소류신 (Ile); K: 리신 (Lys); L: 류신 (Leu); M: 메티오닌 (Met); N: 아스파라긴 (Asn); P: 프롤린 (Pro); Q: 글루타민 (Gln); R: 아르기닌 (Arg); S: 세린 (Ser); T: 트레오닌 (Thr); V: 발린 (Val); W: 트립토판 (Trp) 및 Y: 티로신 (Tyr).
치환된 잔기와 관련하여 "기능적으로 균등한"은 변이체 PAP의 치환된 잔기가 서열번호 1과 상동인 서열을 갖는 다른 PAP의 서열에서 잔기와 동일한 기능적 역할을 가짐을 의미한다. 기능적으로 균등한 잔기는 예를 들어, Mutalin 라인 정렬 소프트웨어 (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html; 1988, Nucl. Acids Res., 16 (22), 25 10881-10890)를 사용하여 서열 정렬을 사용하여 확인할 수 있다. 정렬 후, 기능적으로 균등한 잔기는 고려되는 다른 서열의 상동 위치에 있다. 서열 정렬 및 기능적으로 균등한 잔기의 확인은 종간을 포함하여 임의의 PAP와 이의 천연 변이체 사이에서 결정할 수 있다.
단백질과 관련하여 "단리된"은 자연 환경의 성분 또는 불균질한 반응 혼합물로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 화합물을 의미한다. 자연 환경 또는 반응 혼합물의 오염 성분은 단백질의 기능을 방해하고 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있는 물질이다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 단백질은 (1) Lowry 방법에 의해 측정된 단백질의 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과, (2) 스피닝 컵 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 획득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 (Coomassie blue) 또는 바람직하게는 실버 스테인 (silver stain)을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질성으로 정제된다. 재조합 방법에 의해 제조되는 경우, 본 발명의 단리된 단백질은 단백질의 자연 환경 중 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에 재조합 세포 내 원위치에 본 발명의 단백질을 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 단리된 단백질을 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조한다.
"키트"는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 물질 또는 시약을 전달하기 위한 임의의 전달 시스템을 지칭한다. 반응 분석과 관련하여, 이러한 전달 시스템에는 반응 시약 (예를 들어, 적절한 용기 중 PAP 효소, 보호된 rNTP 단량체 등) 및/또는 지원 물질 (예를 들어, 완충액, 분석 수행을 위한 서면 지침 등)의 한 위치에서 다른 위치로의 저장, 수송 또는 전달을 가능하게 하는 시스템 및/또는 화합물 (희석제, 계면활성제, 담체 등)이 포함된다. 예를 들어, 키트에는 관련 반응 시약 및/또는 지원 물질이 들어 있는 하나 이상의 용기 (예를 들어, 상자)가 포함된다. 이러한 내용물은 의도된 수신자에게 함께 또는 개별적으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 제1 용기는 효소를 포함할 수 있고, 제2 또는 그 이상의 용기는 rNTP 단량체, 완충액, 개시인자와의 고체 지지체 등을 포함할 수 있다.
상호 혼용되는 "돌연변이체" 또는 "변이체"는 서열번호 1로부터 유래되고 하나 이상의 위치에서 변형 또는 변이, 즉, 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하고, 주형 부재 중합효소 활성 및 하나 이상의 가역적으로 차단된 뉴클레오사이드 트리포스페이트 전구체를 혼입시키는 능력을 모두 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 변이체는 당업계에 잘 알려진 다양한 기술에 의해 획득될 수 있다. 특히, 야생형 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 변이시키기 위한 기술의 예는 다음에 제한되는 것은 아니나, 부위 지정 돌연변이유발, 무작위 돌연변이유발 및 합성 올리고뉴클레오타이드 작제를 포함한다. 돌연변이 유발 활성은 중합효소의 발명의 경우 또는 단백질 서열의 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환으로 구성된다. 다음 용어는 치환을 지정하는데 사용된다: L238A는 참조 또는 야생형 서열의 위치 238에 있는 아미노산 잔기 (류신, L)가 알라닌 (A)으로 변경된 것을 나타낸다. A132V/I/M은 모 서열의 위치 132에 있는 아미노산 잔기 (알라닌, A)가 발린 (V), 이소류신 (I) 또는 메티오닌 (M) 아미노산 중 하나로 치환된 것을 나타낸다. 치환은 보존적 또는 비보존적 치환일 수 있다. 보존적 치환의 예는 염기성 아미노산 (아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산 (글루탐산 및 아스파라긴산), 극성 아미노산 (글루타민, 아스파라긴 및 트레오닌), 소수성 아미노산 (메티오닌, 류신, 이소류신, 시스테인 및 발린), 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 소형 아미노산 (글리신, 알라닌 및 세린)의 그룹 내에서 이루어진다.
"폴리뉴클레오타이드" 또는 "올리고뉴클레오타이드"는 상호 혼용되며, 각각은 뉴클레오타이드 단량체 또는 이의 유사체의 선형 중합체를 의미한다. 폴리뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드를 구성하는 단량체는 왓슨-크릭 (Watson-Crick) 유형의 염기 쌍, 염기 적층, 후그스틴 (Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 유형의 염기 쌍 등과 같은 일반 패턴의 단량체-단량체 상호작용을 통해 천연 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 단량체 및 이의 뉴클레오사이드간 연결은 자연적으로 발생하거나 이의 유사체, 예를 들어 천연 또는 비천연 유사체일 수 있다. 비-천연 유사체는 PNA, 포스포로티오에이트 뉴클레오사이드간 연결, 형광단 또는 합텐 등과 같은 표지의 부착을 가능하게 하는 연결기를 포함하는 염기를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 사용이 중합효소에 의한 연장, 리가제에 의한 결찰 등과 같은 효소적 처리를 필요로 할 때마다, 당업자는 이러한 경우에 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드가 특정 위치 또는 일부 위치의 뉴클레오사이드간 연결, 당 모이어티 또는 염기의 특정 유사체를 포함하지 않을 것임을 이해할 것이다. 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 소수의 단량체 단위, 예를 들어 5 내지 40개, 일반적으로 "올리고뉴클레오타이드"로 지칭되는 경우 수천 개의 단량체 단위에서 크기가 다양하다. 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드가 "ATGCCTG"와 같은 일련의 문자 (대문자 또는 소문자)로 표시될 때마다 달리 지시되거나 문맥상 명백하지 않는 한 뉴클레오타이드가 왼쪽에서 오른쪽으로 5'→3' 순서이고 "A"는 데옥시아데노신을 지정하고, "C"는 데옥시시티딘을 지정하고, "G"는 데옥시구아노신을 지정하고, "T"는 티미딘을 지정하고, "I"는 데옥시이노신을 지정하고, "U"는 우리딘을 지정함이 이해될 것이다. 해당 리보뉴클레오타이드는 "rA", "rC", "rG" 및 "rT"로 지정될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 및 원자 번호 지정 규칙은 문헌[Strachan and Read, Human Molecular Genetics 2 (Wiley-Liss, New York, 1999)]에 개시된 것을 따를 것이다. 일반적으로 폴리뉴클레오타이드는 포스포디에스테르 연결에 의해 연결된 4개의 천연 뉴클레오사이드 (예를 들어, DNA의 경우 데옥시아데노신, 데옥시시티딘, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 RNA의 경우 리보스 대응물)를 포함하지만; 이는 또한 변형된 염기, 당 또는 뉴클레오사이드간 연결을 포함하여 비천연 뉴클레오타이드 유사체를 포함할 수 있다. 효소가 활성에 대한 특정 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 기질 요구사항, 예를 들어 단일 가닥 DNA, RNA/DNA 이중체 등을 갖는 경우, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 기질에 대한 적절한 조성의 선택은 특히 문헌[Sambrook et al, Molecular Cloning, Second Edition (Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1989)] 및 유사한 참조문헌과 같은 논문 내에 기재되어 있음이 당업자에게 명백하다. 유사하게, 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 형태 또는 이중 가닥 형태 (즉, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 및 이의 각각의 보체의 이중체)를 지칭할 수 있다. 어떤 형태인지 또는 두 형태 모두가 용어 사용의 맥락에서 의도되었는지는 당업자에게 명백할 것이다.
"프라이머"는 폴리뉴클레오타이드 주형으로 이중체를 형성할 때 핵산 합성의 개시점으로 작용하고 주형을 따라 이의 3' 말단으로부터 연장되어 연장 이중체가 형성될 수 있는 천연 또는 합성 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 연장은 일반적으로 DNA 또는 RNA 중합효소와 같은 핵산 중합효소로 수행된다. 연장 과정에서 첨가되는 뉴클레오타이드의 서열은 주형 폴리뉴클레오타이드의 서열에 의해 결정된다. 일반적으로 프라이머는 DNA 중합효소에 의해 연장된다. 프라이머는 일반적으로 14개 내지 40개 뉴클레오타이드 범위, 또는 18개 내지 36개 뉴클레오타이드 범위의 길이를 갖는다. 프라이머는 다양한 핵산 증폭 반응, 예를 들어 단일 프라이머를 사용하는 선형 증폭 반응 또는 둘 이상의 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응에 사용된다. 특정 적용을 위한 프라이머의 길이와 서열을 선택하기 위한 지침은 참조로 포함된 다음 참조문헌에 의해 입증된 바와 같이 당업자에게 잘 알려져 있다: 문헌[Dieffenbach, editor, PCR Primer: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor Press, New York, 2003)]).
"서열 동일성"은 2개의 폴리펩타이드 서열 또는 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열과 같은 2개의 서열 간의 일치 (예를 들어, 동일한 아미노산 잔기)의 수 (또는 분율, 일반적으로 백분율로 표시됨)를 지칭한다. 서열 동일성은 서열 갭을 최소화하면서 중첩 및 동일성이 최대화되도록 정렬될 때 서열을 비교함으로써 결정된다. 특히, 서열 동일성은 2개의 서열의 길이에 따라 다수의 수학적 전역 또는 국부 정렬 알고리즘 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다. 유사한 길이의 서열을 바람직하게 전체 길이에 걸쳐 서열을 최적으로 정렬하는 전역 정렬 알고리즘 (예를 들어, Needleman 및 Wunsch 알고리즘, 문헌[Needleman 및 Wunsch, 1970])을 사용하여 정렬하며, 실질적으로 다른 길이의 서열을 바람직하게는 국부 정렬 알고리즘 (예를 들어 Smith와 Waterman 알고리즘 (문헌[Smith and Waterman, 1981]) 또는 Altschul 알고리즘 (문헌[Altschul et al., 1997; Altschul et al., 2005])을 사용하여 정렬한다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 예를 들어 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ 또는 ttp://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/과 같은 인터넷 웹 사이트에서 이용 가능한 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계의 기술 범위 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 본 명세서의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성 % 값은 Needleman-Wunsch 알고리즘을 사용하여 두 서열의 최적 전역 정렬을 생성하는 이원 서열 정렬 프로그램 EMBOSS Needle을 사용하여 생성된 값을 지칭하고, 모든 검색 매개변수는 기본값으로 설정되어 있으며, 즉, 스코어링 매트릭스 = BLOSUM62, 갭 개방 = 10, 갭 연장 = 0.5, 엔드 갭 페널티 = 거짓, 엔드 갭 개방 = 10 및 엔드 갭 연장 = 0.5이다.
"치환"은 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 대체됨을 의미한다. 바람직하게는, 용어 "치환"은 천연 표준 20개 아미노산 잔기, 희귀 천연 아미노산 잔기 (예를 들어, 하이드록시프롤린, 하이드록실리신, 알로하이드록실리신, 6-N-메틸리신, N-에틸글리신, N-메틸글리신, N-에틸아스파라긴, 알로이소류신, N-메틸이소류신, N-메틸발린, 피로글루타민, 아미노부티르산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린) 및 종종 합성 제조된 비천연 아미노산 잔기 (예를 들어 사이클로헥실-알라닌))로부터 선택되는 또 다른 아미노산 잔기에 의한 아미노산 잔기의 대체를 지칭한다. 바람직하게는, 용어 "치환"은 천연 발생 표준 20개 아미노산 잔기로부터 선택되는 또 다른 아미노산 잔기에 의한 아미노산 잔기의 대체를 지칭한다. "+" 기호는 대체 조합을 나타낸다. 아미노산은 본 명세서에서 하기 명명법에 따른 1문자 또는 3문자 코드로 표시된다: A: 알라닌 (Ala); C: 시스테인 (Cys); D: 아스파르트산 (Asp); E: 글루탐산 (Glu); F: 페닐알라닌 (Phe); G: 글리신 (Gly); H: 히스티딘 (His); I: 이소류신 (Ile); K: 리신 (Lys); L: 류신 (Leu); M: 메티오닌 (Met); N: 아스파라긴 (Asn); P: 프롤린 (Pro); Q: 글루타민 (Gln); R: 아르기닌 (Arg); S: 세린 (Ser); T: 트레오닌 (Thr); V: 발린 (Val); W: 트립토판 (Trp) 및 Y: 티로신 (Tyr). 본 명세서에서는 치환을 나타내기 위해 다음의 용어를 사용한다: L238A는 모서열의 위치 238에 있는 아미노산 잔기 (류신, L)가 알라닌 (A)으로 변경된 것을 나타낸다. A132V/I/M은 모 서열의 위치 132에 있는 아미노산 잔기 (알라닌, A)가 발린 (V), 이소류신 (I) 또는 메티오닌 (M) 아미노산 중 하나로 치환된 것을 나타낸다. 치환은 보존적 또는 비보존적 치환일 수 있다. 보존적 치환의 예는 염기성 아미노산 (아르기닌, 리신 및 히스티딘), 산성 아미노산 (글루탐산 및 아스파라긴산), 극성 아미노산 (글루타민, 아스파라긴 및 트레오닌), 소수성 아미노산 (메티오닌, 류신, 이소류신, 시스테인 및 발린), 방향족 아미노산 (페닐알라닌, 트립토판 및 티로신), 소형 아미노산 (글리신, 알라닌 및 세린)의 그룹 내에서 이루어진다.
본 개시내용은 제시된 특정 형태의 범위로 제한되도록 의도되지 않고, 본 명세서에 기재된 변형의 대안, 수정 및 균등물을 포함하는 것으로 의도된다. 또한, 본 개시내용의 범위는 본 개시내용과 관련하여 당업자에게 명백해질 수 있는 다른 변형을 전체적으로 포함한다. 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한된다.
SEQUENCE LISTING <110> DNA SCRIPT <120> TEMPLATE-FREE ENZYMATIC SYNTHESIS OF POLYNUCLEOTIDES USING POLY(A) AND POLY(U) POLYMERASES <130> B3067PC00 <160> 47 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 552 <212> PRT <213> Yeast <400> 1 Met Ala Ser Gln Lys Val Phe Gly Ile Thr Gly Pro Val Ser Thr Val 1 5 10 15 Gly Ala Thr Ala Ala Glu Asn Lys Leu Asn Asp Ser Leu Ile Gln Glu 20 25 30 Leu Lys Lys Glu Gly Ser Phe Glu Thr Glu Gln Glu Thr Ala Asn Arg 35 40 45 Val Gln Val Leu Lys Ile Leu Gln Glu Leu Ala Gln Arg Phe Val Tyr 50 55 60 Glu Val Ser Lys Lys Lys Asn Met Ser Asp Gly Met Ala Arg Asp Ala 65 70 75 80 Gly Gly Lys Ile Phe Thr Tyr Gly Ser Tyr Arg Leu Gly Val His Gly 85 90 95 Pro Gly Ser Asp Ile Asp Thr Leu Val Val Val Pro Lys His Val Thr 100 105 110 Arg Glu Asp Phe Phe Thr Val Phe Asp Ser Leu Leu Arg Glu Arg Lys 115 120 125 Glu Leu Asp Glu Ile Ala Pro Val Pro Asp Ala Phe Val Pro Ile Ile 130 135 140 Lys Ile Lys Phe Ser Gly Ile Ser Ile Asp Leu Ile Cys Ala Arg Leu 145 150 155 160 Asp Gln Pro Gln Val 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His Leu Lys Trp Ser Gly Leu Val Glu Ser 370 375 380 Lys Val Arg Leu Leu Val Met Lys Leu Glu Val Leu Ala Gly Ile Lys 385 390 395 400 Ile Ala His Pro Phe Thr Lys Pro Phe Glu Ser Ser Tyr Cys Cys Pro 405 410 415 Thr Glu Asp Asp Tyr Glu Met Ile Gln Asp Lys Tyr Gly Ser His Lys 420 425 430 Thr Glu Thr Ala Leu Asn Ala Leu Lys Leu Val Thr Asp Glu Asn Lys 435 440 445 Glu Glu Glu Ser Ile Lys Asp Ala Pro Lys Ala Tyr Leu Ser Thr Met 450 455 460 Tyr Ile Gly Leu Asp Phe Asn Ile Glu Asn Lys Lys Glu Lys Val Asp 465 470 475 480 Ile His Ile Pro Cys Thr Glu Phe Val Asn Leu Cys Arg Ser Phe Asn 485 490 495 Glu Asp Tyr Gly Asp His Lys Val Phe Asn Leu Ala Leu Arg Phe Val 500 505 510 Lys Gly Tyr Asp Leu Pro Asp Glu Val Phe Asp Glu Asn Glu Lys Arg 515 520 525 Pro Ser Lys Lys Ser Lys Arg Lys Asn Leu Ser Ser Gly Glu Asn Leu 530 535 540 Tyr Phe Gln Gly Ser Ser Gly Ser 545 550 <210> 2 <211> 674 <212> PRT <213> Myceliophthora <400> 2 Met Ala Glu Arg Ile Tyr Gly Val Thr Pro Pro Ile Ser Thr Ala Leu 1 5 10 15 Pro Thr 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165 170 175 Leu Ala Asp Asn Asn Leu Leu Arg Gly Leu Ser Glu Asn Ala Val Arg 180 185 190 Ser Leu Asn Gly Thr Arg Val Thr Asp Glu Ile Leu His Leu Val Pro 195 200 205 Glu Pro Ala Thr Phe Lys Leu Ala Leu Arg Ala Ile Lys Leu Trp Ala 210 215 220 Gln Arg Lys Ala Ile Tyr Ala Asn Ile Met Gly Tyr Pro Gly Gly Val 225 230 235 240 Ala Trp Ala Met Leu Val Ala Arg Val Cys Gln Leu Tyr Pro Lys Ala 245 250 255 Thr Ser Ala Val Ile Val Asn Lys Phe Phe Asn Ile Met Leu Lys Trp 260 265 270 Pro Trp Pro Leu Pro Val Leu Leu Lys Asp Ile Glu Tyr Asn Gly Pro 275 280 285 Val Thr Arg Val Pro Val Trp Asn Pro Lys Leu Tyr Ala Ser Asp Arg 290 295 300 Asn His Lys Met Pro Ile Ile Thr Pro Ala Tyr Pro Ser Met Cys Ala 305 310 315 320 Thr His Asn Val Gly Arg Ser Ser Met Val Val Ile Gln Gln Glu Leu 325 330 335 Lys Lys Gly Ala Glu Val Thr Glu Glu Ile Met Leu Gly Arg Arg Pro 340 345 350 Trp Lys Asp Leu Phe Thr Lys His Thr Phe Phe Thr Ser Gly Phe Lys 355 360 365 Tyr Tyr Leu Thr Val Ile Ser Ser Ser Arg Thr Lys Lys Ala Gln Asn 370 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spinifera <400> 22 Met Ala Glu Lys Gln Trp Gly Met Thr Pro Pro Met Ser Thr Ala Leu 1 5 10 15 Pro Glu Pro Ile Asp Thr Glu Lys Thr Ala Asp Leu Ile Glu Glu Leu 20 25 30 Lys Lys Glu Asn Asn Tyr Glu Pro Leu Glu Ala Thr Gln Lys Arg Met 35 40 45 Ala Thr Leu Gly Leu Leu Asn Arg Val Thr Gln Glu Phe Val Arg Glu 50 55 60 Val Ser Arg Arg Arg Arg Met Pro Pro Ser Gln Ile Glu Gln Phe Gly 65 70 75 80 Gly Lys Ile Phe Pro Tyr Gly Ser Tyr Arg Leu Gly Val Phe Gly Pro 85 90 95 Gly Ser Asp Ile Asp Thr Leu Ala Val Ala Pro Arg His Val Thr Arg 100 105 110 Glu Asp Phe Phe Glu Tyr Phe Pro Thr Val Leu Lys Arg Met Thr Ala 115 120 125 Glu Gly Asp Ile Ser Ser Leu Thr Pro Val Pro Asp Ser Tyr Val Pro 130 135 140 Ile Ile Lys Leu Val Leu Asn Asp Ile Glu Ile Asp Leu Ile Phe Ala 145 150 155 160 Ser Ile Ala Ser Leu Gln Thr Ile Pro Lys Asn Leu Thr Leu Asn Asp 165 170 175 Asn Asn Leu Leu Thr Gly Leu Asp Gln Ala Thr Ile Arg Ala Val Thr 180 185 190 Gly Pro Arg Val Thr Asp Glu Ile Leu Ser Leu Val Pro Glu Gln Lys 195 200 205 Thr 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<213> Trichoderma citrinoviride <400> 24 Met Ala Glu Gln Asn Tyr Gly Val Thr Pro Pro Ile Ser Val Thr Leu 1 5 10 15 Pro Thr Glu Ala Glu Asn Arg Ala Ser Asp Ala Leu Leu Glu Glu Leu 20 25 30 Arg Arg Gln Lys Thr Phe Glu Ser Pro Ser Asp Thr Glu Lys Arg His 35 40 45 Glu Ile Cys Asn Glu Phe Val Arg Lys Val Ala Arg Glu Arg Glu Pro 50 55 60 Lys Asn Glu Ile Leu Ile Lys Asn Ala Arg Gly Lys Val Phe Thr Tyr 65 70 75 80 Gly Ser Phe Arg Leu Gly Val Phe Gly Pro Gly Ser Asp Ile Asp Thr 85 90 95 Leu Ile Val Ala Pro Lys Tyr Val Thr Arg Glu Asp Tyr Phe Asn Tyr 100 105 110 Phe Pro Asp Leu Leu Val Ser Met Ala Pro Pro Gly Ala Ile Thr Asp 115 120 125 Leu Thr Val Val Lys Asp Ala Phe Val Pro Ile Ile Lys Phe Glu Tyr 130 135 140 Ser Gly Ile Ser Ile Asp Leu Ile Phe Ser Arg Ile Ile Gln Lys Gln 145 150 155 160 Ile Ala Pro Asp Phe His Ser Leu Lys Asp Ser Ser Leu Leu Arg Gly 165 170 175 Leu Asp Glu Ala Glu Leu Arg Ser Leu Asn Gly Thr Arg Val Thr Asp 180 185 190 Glu Ile Leu Glu Leu Val Pro Glu Lys Ser Thr Phe Lys Leu 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Aspergillus thermomutatus <400> 25 Met Ser Ala Pro Pro Val Arg Gln Trp Gly Val Thr Pro Pro Ile Ser 1 5 10 15 Thr Ala Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu Ala Ala Asn Asp Asp Leu Ile 20 25 30 Ser Glu Leu Lys Ala Gln Asn Asn Phe Glu Ser Pro Ala Glu Thr Glu 35 40 45 Arg Arg Lys Gln Val Leu Gln Leu Ile Gln Arg Val Thr His Glu Phe 50 55 60 Val Lys Val Val Ser Arg Lys Lys Gly Leu Ser Pro Ala Ala Val Glu 65 70 75 80 Ala Ala Gly Gly Lys Ile Phe Thr Tyr Gly Ser Tyr Arg Leu Gly Val 85 90 95 Tyr Gly Pro Gly Ser Asp Ile Asp Thr Leu Val Val Gly Pro Lys His 100 105 110 Val Leu Ile Asp Asp Phe Phe Ser Asp Phe Pro Pro Val Leu Glu Lys 115 120 125 Met Ala Pro Pro Gly Ala Ile Glu Lys Met Thr Pro Val Pro Asp Ala 130 135 140 Phe Val Pro Ile Ile Lys Leu Glu Leu Ser Gly Ile Ser Ile Asp Leu 145 150 155 160 Ile Phe Ala Arg Leu Ile Val Ser Ser Val Pro Leu Asn Leu Asp Leu 165 170 175 Lys Asn Asn Asp Tyr Leu Arg Gly Leu Asp Glu Lys Glu Val Arg Ser 180 185 190 Leu Asn Gly Thr Arg Val Thr Asp Glu Ile Leu Glu Leu Val Pro Gln 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260 265 270 Met Ile Phe Ile Lys Trp Trp Ala Lys Arg Arg His Ile Asn Asn Pro 275 280 285 Tyr Arg Gly Thr Leu Ser Ser Tyr Gly Tyr Ala Leu Ile Val Leu His 290 295 300 Tyr Leu Ile Asn Val Val Lys Pro Pro Val Leu Pro Asn Leu Gln Thr 305 310 315 320 Phe Pro Val Pro Asp Ser Ala Pro Thr Asn Glu Ile Ile Phe Glu Gly 325 330 335 Asp Ser Asp Asp Thr Phe Glu Ile Trp Phe Tyr Lys Asp Ile Glu Lys 340 345 350 Leu Pro Lys Ser Asp Asn Ala Met Asp Ile Gly Glu Leu Leu Lys Gly 355 360 365 Phe Phe Glu Tyr Tyr Ala His Asn Phe Gln Trp Gly Arg Glu Val Val 370 375 380 Ser Ile Arg Thr Lys Gly Gly Leu Met Thr Lys Gln Glu Lys Gly Trp 385 390 395 400 Val Ala Ala Val Ile Lys Pro Gly Arg Thr Glu Asn Ser Glu Val Lys 405 410 415 Asn Arg Tyr Leu Phe Ala Val Glu Asp Pro Phe Glu Thr Glu His Asn 420 425 430 Val Ser Arg Thr Cys Asn Gly Pro Gly Val Asn Arg Ile Lys Asp Glu 435 440 445 Phe Lys Arg Ala Val Trp Leu Ile Arg Val Arg Asp Gly Gly Lys Thr 450 455 460 Leu Phe Gln Asn Leu Cys Met Glu Ala Pro Pro Glu Arg Val Trp Val 465 470 475 480 Arg Arg Glu Asp Arg Asp Arg Arg Gly Ile Glu Glu Ala Gly Gly His 485 490 495 Gly Ser Lys Asp His Gln Gly Ala Glu Gly Glu Ala Gly Asp Gly Val 500 505 510 Lys His Glu Ser Val Val Leu Ser Glu Asp Gly Arg Asn Ala Leu Glu 515 520 525 Ser Leu Val 530 <210> 45 <211> 474 <212> PRT <213> P. murina <400> 45 Met Asp Ser Val Lys Gly Phe Glu Gly Val Glu Ser Val Val Phe Gln 1 5 10 15 Lys Glu Met Lys Lys Leu Thr Lys Ile Ser Asp Phe Ser Gly Lys Asn 20 25 30 Tyr Gly Ser Gly Asn Glu Ile Glu Asp Leu Lys Lys Ser Leu Glu Lys 35 40 45 Met Met Leu Glu Ser Val Asn Ile Gln Glu Lys Gly Val Phe Leu Arg 50 55 60 Glu Lys Gly Ser Glu Gly Ser Tyr Glu Ala Asn Leu Asn Asp Lys Asp 65 70 75 80 Val Leu Lys Asn Asn Lys Lys Asp Ser Asn Phe Arg Asn Ile Lys Tyr 85 90 95 Tyr Glu Pro Lys Asp Tyr Gly Leu Tyr Val Asn Gly Lys Ala Val Trp 100 105 110 Arg Lys Asn Tyr Asp Glu Tyr Phe Val Leu Ser Thr Phe Ile Ser His 115 120 125 Thr Leu Lys His Ile Met Pro Thr Asn Glu Glu Ile Ser Gln Lys Glu 130 135 140 Arg Phe Arg Phe Phe Leu Ser Glu Ile Leu Asn Thr Cys Arg Pro Ser 145 150 155 160 Ala Lys Leu Val Leu Phe Gly Ser Val Ala Ser Gly Leu Ala Ile Val 165 170 175 Asn Ser Asp Met Asp Phe Cys Val Met Asp Asp Ser Leu Asp Leu His 180 185 190 Thr Asp Glu Phe Leu Lys Ile Phe Ser Glu Glu Ile Lys Lys Tyr Gly 195 200 205 Met Glu Thr Thr Leu Leu Phe Arg Thr Arg Val Ser Ile Ile Lys Val 210 215 220 Asn Ser Lys Gly Ser Phe Asn Phe Pro Gln Gly Ile Ser Cys Asp Ile 225 230 235 240 Gly Phe Asn Asn Lys Leu Ala Ile Tyr Asn Thr Lys Leu Leu Ala Thr 245 250 255 Tyr Ser Lys Cys Asp His Arg Val Arg Lys Ile Ile Leu Phe Val Lys 260 265 270 Tyr Trp Ala Lys Arg Arg Lys Ile Asn Asp Pro Tyr His Gly Thr Leu 275 280 285 Ser Ser Tyr Gly Tyr Val Leu Leu Ile Leu His Tyr Leu Ile Asn Ile 290 295 300 Val Pro Ile Pro Leu Leu Pro Asn Leu Gln Gln Met Lys Val Ala Ser 305 310 315 320 Trp Arg Ser Ile Pro Gln Ser Glu Ile Glu Cys Asp Gly Tyr Asn Val 325 330 335 Trp Phe Tyr Lys Asp Ile Asp Ile Ser Cys Ser Phe Ser Asn Asn Thr 340 345 350 Asp Ser Leu Gly Lys Leu Val Tyr Gly Phe Phe Tyr Tyr Tyr Ala Tyr 355 360 365 Gln Phe Asn Trp Lys Asp His Val Val Ser Ile Arg Thr Gln Thr Gly 370 375 380 Leu Leu Thr Lys Gln Glu Lys Gly Trp Thr Gln Ala Met Glu Arg Val 385 390 395 400 Phe Val Ser Asp Lys Ile Phe Lys Asp Arg Tyr Ile Leu Ala Ile Glu 405 410 415 Asp Pro Phe Glu Ile Thr His Asn Val Gly Arg Thr Val Asn Lys Gln 420 425 430 Ser Ser His Ile Ile Arg Gly Glu Phe Phe Arg Ala Ser Lys Leu Ser 435 440 445 Ser Ser Lys Leu Arg Lys Lys Ile Phe Asn Glu Leu Cys Glu Glu Arg 450 455 460 Ile Ile Ile Asn Asn Phe Ser Asn Val Ile 465 470 <210> 46 <211> 445 <212> PRT <213> S. japonicus <400> 46 Met Ser Gly Asn Gly Asn Gly His Phe Ile Pro Gly Val His Thr Val 1 5 10 15 Glu Glu Ile Glu Arg Gln Phe Val Asn Leu Ala Leu Gln Lys Arg Asn 20 25 30 Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Arg Glu Leu Asp Pro 35 40 45 Val Thr Cys Phe Leu Leu Ser Thr Tyr Asp Asp Val Arg Val Ser Asp 50 55 60 Asp Glu Leu Arg Glu Lys Asp Ala Ile Met Asn Leu Leu Lys His Val 65 70 75 80 Val His Ser Val Arg Pro Glu Ala Asp Ile Val Ala Phe Gly Ser Ile 85 90 95 Gln Ser Gly Leu Ala Leu Lys Asn Ser Asp Ile Asp Ala Cys Ile Leu 100 105 110 Leu Pro Asp Ile Gly Glu Glu Met Glu Glu Phe Ala Ser Glu Cys Phe 115 120 125 Glu Arg Phe Thr Ala Leu Gly Phe Glu Gly Lys Tyr Leu Arg Lys Ala 130 135 140 Arg Ile Pro Ile Ile Lys Leu Leu Ser Asp Thr Lys Asn Arg Tyr Tyr 145 150 155 160 Tyr Gly Phe Gln Cys Asp Ile Gly Phe Asn Asn Gln Leu Ala Ile Tyr 165 170 175 Asn Thr Ser Leu Leu His Gln Tyr Ser Leu Ile Asp Pro Arg Cys Lys 180 185 190 Gln Leu Ala Ile Leu Val Lys Tyr Trp Ala Lys Gln Lys Arg Ile Asn 195 200 205 Ser Pro Tyr Tyr Gly Thr Leu Ser Ser Tyr Gly Tyr Val Leu Met Val 210 215 220 Leu Phe Tyr Leu Ile His Val Val Arg Pro Ala Val Leu Pro Asn Leu 225 230 235 240 Gln Asp Ser Pro His Lys Gln Asp Leu Tyr Val Glu Gly Phe Asn Val 245 250 255 Gly Phe Val Arg Gly Thr Thr Val Ala Arg Arg Asn Thr Glu Ser Leu 260 265 270 Pro Gln Leu Leu Ala Gly Phe Tyr Gly Phe Phe Ala His Glu Phe Asn 275 280 285 Tyr Arg Glu Ser Val Ile Ser Ile Arg Gln Pro Gly Gly Leu Leu Lys 290 295 300 Lys Val Asp Lys Asp Trp Thr Leu Ala Lys Glu His Thr Gly Ser Ala 305 310 315 320 Asp Gln Val Ile Lys Asp Arg Tyr Val Leu Ala Ile Glu Asp Pro Phe 325 330 335 Glu Ile Thr His Asn Val Gly Arg Thr Val Ser Lys Ala Gly Leu Phe 340 345 350 Glu Ile Arg Gly Glu Phe Met Gln Ala Thr Arg Leu Leu Asn Ala Ala 355 360 365 Thr Leu His Ser Thr Ser Ala Ile Arg Lys Leu Arg Ala Ser Leu Phe 370 375 380 Lys Glu Arg Leu Glu Pro Lys Ser His Leu Lys Tyr Gln Lys Ala Leu 385 390 395 400 Arg Gln Lys Arg Met Gly Thr Glu Gly Lys Ala Ala Ala Glu Gly Lys 405 410 415 Thr Asn Asn Pro Thr Ala Ala Ser Gly Ser Asp Ser Ala Pro Ser Glu 420 425 430 Ser Ala Ser Arg Thr Ala Thr Val Glu Ser Arg Glu Pro 435 440 445 <210> 47 <211> 620 <212> PRT <213> A. nigricans <400> 47 Met Asn Pro Pro Gln Gln Thr Thr Gly Leu Glu Asp His Leu Arg Ser 1 5 10 15 Leu Ile Ile Asn Asn Gln Thr Pro Pro Asn His Ser Ile Ser Pro Ala 20 25 30 Ala Lys Ile Pro His Lys His His Pro Arg Thr Ser Thr Asp Ser Arg 35 40 45 Gly Phe Val Arg Ser Gln Thr Ile His Arg Pro Gly Pro Ala Ala Ser 50 55 60 Gln Pro Pro Ser Asn Gly Pro Asn Arg Arg Phe Pro Gly Glu Ala Gln 65 70 75 80 Arg Pro Asp His Arg Pro Pro His Leu Arg Gly Pro Ser Gln Asn Arg 85 90 95 Asn Tyr Trp His Gly Ala Pro Pro Pro Pro Arg Gln Val Val Pro Gln 100 105 110 Gly Leu Ser Pro Pro Ala Ala Thr Asn Leu His His Phe Pro Pro Leu 115 120 125 Gly Ala Lys Val Ala Pro Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Tyr His Ser 130 135 140 Val Pro Thr Ala Pro Cys His Arg Pro Glu Asn Gln Arg Pro Val Tyr 145 150 155 160 Gln Asn Asp Asn Arg Asp Ser Tyr His Tyr Lys Gln Arg Gly Leu Tyr 165 170 175 Asp Gly Tyr Leu Ala Glu Gln Trp Arg Glu Leu Asp Lys Met Ala Lys 180 185 190 Glu Val Leu Leu Thr Ala Thr Pro Val Asp Gly Glu Lys Glu Ala Lys 195 200 205 Glu Lys Phe Met Gln Asp Leu Glu Ala Val Cys Gln Lys Val Glu Pro 210 215 220 Thr Ala Lys Leu Ile Pro Phe Gly Ser Ile Val Thr Gly Phe Ala Thr 225 230 235 240 Arg Gly Ser Asp Ile Asp Cys Val Phe Thr Ser Asn Thr Asp Ser Ala 245 250 255 Leu Gln Asn Asp Lys Ile Thr Glu Pro Glu Thr Pro Phe Asp Arg His 260 265 270 Asp Glu Leu Val Thr Gln Leu Gln Glu Ser Gly Tyr Asn Ala Gln Leu 275 280 285 Leu Thr Arg Thr Arg Val Pro Ile Ile Lys Leu Val Arg Pro Ala Thr 290 295 300 Pro Asp Val Pro Asp Ser Val Ser Cys Asp Ile Gly Phe Asn Asn Phe 305 310 315 320 Leu Ala Ile His Asn Thr Arg Leu Leu Arg Thr Tyr Ala Ala Cys Asp 325 330 335 Glu Arg Leu Val Gln Met Val Leu Phe Ile Lys Trp Trp Ala Lys Arg 340 345 350 Arg His Ile Asn Ser Pro Tyr Arg Gly Thr Leu Ser Ser Tyr Gly Tyr 355 360 365 Ala Leu Leu Ile Val His Tyr Leu Ile Asn Ile Ala Gln Pro Pro Val 370 375 380 Leu Pro Asn Leu Gln Leu Phe His Pro Pro Ala Thr Gln Thr Ser Thr 385 390 395 400 Glu Leu Gln Tyr Glu His Asn Gly Asn Val Cys Asn Ile Trp Tyr Leu 405 410 415 Lys Asp Thr Ser Thr Leu Pro Arg Ser Ala Asn Lys Ala Ser Ile Gly 420 425 430 Glu Leu Leu Arg Gly Phe Phe Glu Tyr Tyr Ala Phe Thr Phe Arg Trp 435 440 445 Gln Asn Asp Val Val Ser Ile Arg Thr Ala Gly Gly Ile Leu Thr Lys 450 455 460 Met Glu Lys Asn Trp Cys Ala Ala Arg Ser Arg Pro Gly Gly Arg Glu 465 470 475 480 Glu Gly Gln Val Trp Glu Val Lys Asp Arg Val Asp Val Gln His Arg 485 490 495 Tyr Leu Leu Ala Ile Glu Asp Pro Phe Glu Thr Thr His Asn Val Ala 500 505 510 Arg Thr Cys Thr Phe Asn Gly Val Gly Arg Ile Lys Ser Glu Leu Lys 515 520 525 Arg Ala Met Tyr Leu Ile Lys Ser Arg Asp Pro Gly His His Arg Leu 530 535 540 Arg Thr Glu Leu Phe Glu Glu Ala Pro Pro Glu Arg Pro Phe Val Arg 545 550 555 560 Asn Gly Lys Glu Val Val Asp Lys Leu Glu Lys Val Glu Ile Val Glu 565 570 575 Glu Arg Ala Gly Val Ala Val Glu Ile Val Glu Glu Arg Ala Gly Val 580 585 590 Ala Val Glu Ile Val Glu Glu Arg Ala Gly Val Ala Leu Glu Val Val 595 600 605 Glu Glu Arg Ala Gly Ala Ala Val Glu Val Asp Val 610 615 620

Claims (22)

  1. 소정의 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 합성하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 유리(free) 3'-하이드록실을 갖는 3' 말단 뉴클레오타이드를 갖는 개시인자(initiator)를 제공하는 단계; 및
    b) 폴리뉴클레오타이드가 형성될 때까지, (i) 연장 조건(elongation condition) 하에 유리 3'-하이드록실을 갖는 개시인자 또는 연장 단편(elongated fragment)을 3'-O-차단-뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 주형 부재 중합효소(template-free polymerase)와 접촉시켜, 개시인자 또는 연장 단편을 3'-O-차단-뉴클레오사이드 트리포스페이트의 혼입에 의해 연장하여, 3'-O-차단-연장 단편을 형성하는 단계, 및 (ii) 연장 단편을 탈차단(deblocking)하여 유리 3'-하이드록실을 갖는 연장 단편을 형성하는 단계의 사이클을 반복하는 단계
    를 추가로 포함하고;
    주형 부재 중합효소는 폴리(A) 중합효소 (PAP) 또는 폴리(U) 중합효소인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 개시인자는 5' 말단에 의해 지지체에 부착되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 지지체는 고체 지지체인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 개시인자로부터 상기 폴리뉴클레오타이드를 절단하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 폴리-2'-데옥시리보뉴클레오타이드이고, 상기 3'-O-차단-뉴클레오사이드 트리포스페이트는 3'-O-차단-2'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 3'-O-차단-2'-데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트는 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 또는 3'-O-아미노-2'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트인, 방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 폴리리보뉴클레오타이드이고, 상기 3'-O-차단-뉴클레오사이드 트리포스페이트는 3'-O-차단-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리(A) 중합효소는 서열번호 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90 퍼센트 동일하고,
    서열번호 1의 경우 위치 310,
    서열번호 2의 경우 위치 318,
    서열번호 3의 경우 위치 318,
    서열번호 8의 경우 위치 316,
    서열번호 9의 경우 위치 309,
    서열번호 10의 경우 위치 316,
    서열번호 11의 경우 위치 272,
    서열번호 12의 경우 위치 316,
    서열번호 13의 경우 위치 307,
    서열번호 14의 경우 위치 313,
    서열번호 15의 경우 위치 312,
    서열번호 16의 경우 위치 317,
    서열번호 17의 경우 위치 316,
    서열번호 18의 경우 위치 316,
    서열번호 19의 경우 위치 312,
    서열번호 20의 경우 위치 310,
    서열번호 21의 경우 위치 309,
    서열번호 22의 경우 위치 317,
    서열번호 23의 경우 위치 314,
    서열번호 24의 경우 위치 307,
    서열번호 25의 경우 위치 315,
    서열번호 26의 경우 위치 316, 및
    서열번호 27의 경우 위치 311
    에서의 메티오닌의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리(A) 중합효소 변이체인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 위치에서의 상기 메티오닌의 상기 치환은 F, Y, V, E 또는 T로부터 선택되는, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 서열번호 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27로부터 선택되는 상기 아미노산 서열은 또한
    서열번호 1의 경우 위치 234,
    서열번호 2의 경우 위치 240,
    서열번호 3의 경우 위치 240,
    서열번호 9의 경우 위치 232,
    서열번호 10의 경우 위치 240,
    서열번호 11의 경우 위치 196,
    서열번호 12의 경우 위치 240,
    서열번호 13의 경우 위치 229,
    서열번호 14의 경우 위치 236,
    서열번호 15의 경우 위치 236,
    서열번호 16의 경우 위치 241,
    서열번호 17의 경우 위치 233,
    서열번호 18의 경우 위치 240,
    서열번호 19의 경우 위치 240,
    서열번호 20의 경우 위치 234,
    서열번호 21의 경우 위치 233,
    서열번호 22의 경우 위치 237,
    서열번호 23의 경우 위치 238,
    서열번호 24의 경우 위치 231,
    서열번호 25의 경우 위치 239,
    서열번호 26의 경우 위치 240, 및
    서열번호 27의 경우 위치 235
    에서의 발린의 치환을 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 위치에서의 상기 발린의 상기 치환은 알라닌 또는 글리신인, 방법.
  12. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3'-차단-O-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트는 3'-아지도메틸-O-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 3'-아지도메틸-O-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트는 3'-아지도메틸-O-아데노신 트리포스페이트, 3'-아지도메틸-O-구아노신 트리포스페이트, 및 3'-아지도메틸-O-시티딘 트리포스페이트 및 3'-아지도메틸-O-우리딘 트리포스페이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  14. 소정의 서열을 갖는 폴리리보뉴클레오타이드의 주형 부재 합성을 수행하기 위한 키트(kit)로서, 상기 키트는 폴리(A) 중합효소, 고체 지지체에 부착된 개시인자, 및 3'-O-차단 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 단량체를 포함하는, 키트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 3'-O-보호 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트 단량체는 3'-O-아지도메틸-리보아데노신 트리포스페이트, 3'-O-아지도메틸-리보구아노신 트리포스페이트, 3'-O-아지도메틸-리보시티딘 트리포스페이트, 3'-O-아지도메틸-리보티미딘 트리포스페이트 및 3'-O-아미노-리보우리딘 트리포스페이트 중 하나 이상을 포함하는, 키트.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 폴리(A) 중합효소는 서열번호 1에 적어도 90 퍼센트 동일하고, M310에서 치환되거나, 서열번호 3에 적어도 90 퍼센트 동일하고, M318에서 치환된 아미노산 서열을 갖는 폴리(A) 중합효소 변이체를 포함하고; 폴리(A) 중합효소 변이체는 (a) 주형의 부재 하에 리보핵산 단편을 합성할 수 있고, (b) 상기 3'-O-아지도메틸-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 리보핵산 단편에 혼입할 수 있는, 키트.
  17. 서열번호 1, 2, 3, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 27로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90 퍼센트 동일하고,
    서열번호 1의 경우 위치 310,
    서열번호 2의 경우 위치 318,
    서열번호 3의 경우 위치 318,
    서열번호 8의 경우 위치 316,
    서열번호 9의 경우 위치 309,
    서열번호 10의 경우 위치 316,
    서열번호 11의 경우 위치 272,
    서열번호 12의 경우 위치 316,
    서열번호 13의 경우 위치 307,
    서열번호 14의 경우 위치 313,
    서열번호 15의 경우 위치 312,
    서열번호 16의 경우 위치 317,
    서열번호 17의 경우 위치 316,
    서열번호 18의 경우 위치 316,
    서열번호 19의 경우 위치 312,
    서열번호 20의 경우 위치 310,
    서열번호 21의 경우 위치 309,
    서열번호 22의 경우 위치 317,
    서열번호 23의 경우 위치 314,
    서열번호 24의 경우 위치 307,
    서열번호 25의 경우 위치 315,
    서열번호 26의 경우 위치 316, 및
    서열번호 27의 경우 위치 311
    에서의 메티오닌의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리(A) 중합효소 변이체로서,
    상기 PAP 변이체는 (a) 주형의 부재 하에 리보핵산 단편을 합성할 수 있고, (b) 3'-O-아지도메틸-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 리보핵산 단편에 혼입할 수 있거나, 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 데옥시리보핵산 단편에 혼입할 수 있는, 폴리(A) 중합효소 (PAP) 변이체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 위치에서의 상기 메티오닌의 상기 치환은 F, Y, V, E 또는 T로부터 선택되는, PAP 변이체.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    서열번호 1의 경우 위치 234,
    서열번호 2의 경우 위치 240,
    서열번호 3의 경우 위치 240,
    서열번호 9의 경우 위치 232,
    서열번호 10의 경우 위치 240,
    서열번호 11의 경우 위치 196,
    서열번호 12의 경우 위치 240,
    서열번호 13의 경우 위치 229,
    서열번호 14의 경우 위치 236,
    서열번호 15의 경우 위치 236,
    서열번호 16의 경우 위치 241,
    서열번호 17의 경우 위치 233,
    서열번호 18의 경우 위치 240,
    서열번호 19의 경우 위치 240,
    서열번호 20의 경우 위치 234,
    서열번호 21의 경우 위치 233,
    서열번호 22의 경우 위치 237,
    서열번호 23의 경우 위치 238,
    서열번호 24의 경우 위치 231,
    서열번호 25의 경우 위치 239,
    서열번호 26의 경우 위치 240, 및
    서열번호 27의 경우 위치 235에서의 발린의 치환을 추가로 포함하는, PAP 변이체.
  20. 제19항에 있어서, 상기 위치에서의 발린의 상기 치환은 알라닌 또는 글리신인, PAP 변이체.
  21. 서열번호 4, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 또는 47로부터 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90 퍼센트 동일하고,
    서열번호 4의 경우 위치 212,
    서열번호 28의 경우 위치 189,
    서열번호 29의 경우 위치 184,
    서열번호 30의 경우 위치 227,
    서열번호 31의 경우 위치 478,
    서열번호 32의 경우 위치 192,
    서열번호 33의 경우 위치 186,
    서열번호 34의 경우 위치 243,
    서열번호 35의 경우 위치 196,
    서열번호 36의 경우 위치 253,
    서열번호 37의 경우 위치 284,
    서열번호 38의 경우 위치 182,
    서열번호 39의 경우 위치 187,
    서열번호 40의 경우 위치 203,
    서열번호 41의 경우 위치 224,
    서열번호 42의 경우 위치 204,
    서열번호 43의 경우 위치 337,
    서열번호 44의 경우 위치 296,
    서열번호 45의 경우 위치 291,
    서열번호 46의 경우 위치 218, 및
    서열번호 47의 경우 위치 366
    에서의 티로신의 치환을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리(U) 중합효소 (PUP) 변이체로서,
    상기 PUP 변이체는 (a) 주형의 부재 하에 리보핵산 단편을 합성할 수 있고, (b) 3'-O-아지도메틸-리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 리보핵산 단편에 혼입할 수 있거나, 3'-O-아지도메틸-2'-데옥시리보뉴클레오사이드 트리포스페이트를 데옥시리보핵산 단편에 혼입할 수 있는, 폴리(U) 중합효소 (PUP) 변이체.
  22. 제21항에 있어서, 상기 위치에서의 상기 티로신의 상기 치환은 알라닌 또는 글리신인, PUP 변이체.
KR1020227006177A 2019-07-30 2020-07-28 폴리(a) 및 폴리(u) 중합효소를 사용한 폴리뉴클레오타이드의 주형-부재 효소적 합성 KR20220052937A (ko)

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