CN1929828A

CN1929828A - 一种cb1受体拮抗剂在制备有益于肝疾治疗的组合物中的应用

Info

Publication number: CN1929828A
Application number: CNA2005800075168A
Authority: CN
Inventors: 索菲·洛特斯塔恩; 阿里亚纳·马拉特; 帕斯卡莱·格勒纳尔; 鲍里斯·朱利安; 让娜·德兰·范·涅
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sanofi Aventis France
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Sanofi Aventis France
Priority date: 2004-03-09
Filing date: 2005-03-08
Publication date: 2007-03-14
Also published as: EP2305220A2; US20080214449A1; KR20070026415A; ZA200607159B; TW200534851A; TWI337540B; RU2402328C2; CA2557976A1; EP1574211A1; JP2007527893A; US20120329833A1; HK1094674A1; WO2005084652A2; SI1725223T1; AU2005218937A1; US8604060B2; WO2005084652A3; EP1725223A2; RU2006134707A; TNSN06272A1

Abstract

一种CB1受体拮抗剂在制备治疗肝脏疾病的组合物中的应用，优选是N－哌啶－5－(4－对氯苯基)－1－(2，4－二氯苯基)－4－甲基吡唑－3－甲酰胺的应用。

Description

一种CB1受体拮抗剂在制备有益于肝疾治疗的组合物中的应用

技术领域

本发明涉及CB1受体拮抗剂在制备有益于肝病治疗的组合物的一种新用途。

背景技术

肝纤维化是慢性肝损害的常见反应，最终导致肝硬化及其并发症，门静脉高压，肝衰竭和肝细胞癌。纤维化的进程是合成肌纤维组分和基质降解抑制剂的肝成肌纤维细胞的加强增殖和积聚的结果(见Fredman，.S.L.，生物化学杂志(J Biol Chem)2000年卷275，2247-50页)。

桑科植物大麻(Cannabis Sativa)包括六十多种化学成分，其最主要的有效成分是(-)Δ⁹-四氢大麻酚(THC)。内源性的天然大麻素也得到了鉴定：花生四烯酸乙醇胺(anandamide)和2-花生四烯酸甘油(2-arachidonyl glycerol)，它们是花生四烯酸的衍生酯(Piomelli，D等，当代药物科学(Trends Pharmacol Sci)2000年卷21，218-24页)。大麻素和两个G蛋白偶联受体CB1和CB2结合，CB1和CB2同样结合THC(见Pertwee，R.G.，当代医学化学(Curr MedChem)1999年卷6，635-64页)。因此CB1是两个已知大麻素细胞受体之一。众所周知，作为G蛋白偶联跨膜受体的该受体在脑和血管中表达(Pertwee，R.G.，当代医学化学(Curr Med Chem)1999年卷6，635-64页)而不在肝细胞内表达(见Guzman，M和& Sanchez，C.，生命科学(Life Sci)1999年卷65，657-64页)。CB1介导大麻的精神作用效应。与此不同的是CB2受体主要在免疫系统表达并缺乏精神作用效应(见Friedman，S.L.，生物化学杂志(J Biol Chem)2000年卷275，2247-50页)。除精神效应以外，大麻素还显示出镇痛、止吐以及增进食欲的中枢效应(见Harrold，J.A.和Williams，G.英国营养学杂志(Br J Nutr)2003年卷90，729-34页)。此外，大麻素还引起抗炎和血管舒张特性(见Kumar，R.N.，Chambers，W.A.和Pertwee.麻醉学(Anaesthesia)2001年卷56，1059-68页)。几个研究也指出，由于大麻素诱导包括神经胶质瘤和皮肤癌在内不同类型的的实验性肿瘤退化的能力，其可能是潜在的抗肿瘤剂。这些抗肿瘤效应主要归因于它们的抗增殖和细胞凋亡特性(Bifulco，M.等，美国实验生物学学会联盟杂志(Faseb J)2001年卷29，29页；Casanova，M.L.等，临床调查杂志(J Clin Invest)2003年卷111，43-50页；Sanchez，C.等，肿瘤研究(Cancer Res)2001年卷61，5784-9页)。

只有很少的资料涉及大麻素对肝的作用。CB1和CB2受体不在肝细胞内表达(Guzman，M.和Sanchez，C.生命科学(Life Sci)1999年卷65，657-64页)。但是分离于肝动脉的内皮细胞内有CB1受体的存在，并且在肝硬化时其表达增强(Batkai，S.等自然医学(Nat Med)2001年卷7，827-32页)。

CB1受体的两种同源异构体已经被分离到：长同源异构体(序列1(SEQ ID NO：1))和在NH2端截短的相当于一个剪接变异体的短同源异构体(序列2(SEQ ID NO：2))，两者的区别在于对其配体的亲和性不同(Shire等，生物化学杂志(J Biol Chem)，1995年；Rinaldi-Carmona等，药理学和实验治疗学(J Pharmacol Exp Ther)1996年)。在CB1受体基因的编码区存在5处单个的核苷酸多态性。在其中，只有3处导致了CB1受体的单个氨基酸的变化(即：在序列1中，在200位氨基酸残基处，苯丙氨酸取代了亮氨酸，216位异亮氨酸取代了缬氨酸，246位缬氨酸取代了丙氨酸，序列2的变化也在相对应的位置)。有一个CB1受体的7区共有序列，其在脊椎动物中高度保守但却不出现在其他大麻素受体中。(见Attwood，T.K.和Findlay，J.B.C在“蛋白质工程”(Protein Eng)1994年卷7(2)195-203页；Attwood，T.K.和Findlay，J.B.C.，在“7次跨膜”(7TM)1993年卷2，G.Vriend和B.Bywater编辑；Birnbaumer，L.在“药理学和毒物学年度综述”(Ann.Rev Pha rmacol Toxicol)1990年卷30，675-705页，Casey，P.J.和Gilman，A.G在“生物化学杂志”(J.Biol.Chem.)1988年卷263(6)2577-2580页；5.Attwood，T.K.和Findlay，J.B.C在“蛋白质工程”(Protein Eng)1993年卷6(2)167-176页；Watson，S.和Arkinsall，S，G蛋白偶联受体纲要(“The G Protein-Linked Receptor Factsbook”)学术出版社(Academic press)，1994年PP 80-83页)。该氨基酸的共有序列包括序列3到9的共7个蛋白区。

CB1受体的拮抗剂，包括逆向或反转激动剂，先前已被描述。包括WO 03/077847中描述的取代酰胺，WO 03/087037中描述的取代芳基酰胺，W0 03/063781中描述的取代咪唑，WO 03/086288所描述的双环酰胺，WO 03/084943中描述的三联苯衍生物，EP-B-656354描述的N-哌啶酮(piperidono)-3-吡唑甲酰胺和N-哌啶-5-(4-对氯苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡唑-3-甲酰胺，US 5596106和US5747524分别描述的芳基苯并[b]噻吩和苯并[b]呋喃化合物，FR2805817所描述的氮杂环丁烷衍生物，FR2805810所描述的3-氨基-氮杂环丁烷，或FR2805818所描述的3-取代或3，3-双取代1-(双-((杂)芳基)-甲基)-氮杂环丁烷。这些文献在此都被收入参考文献。其他的拮抗剂可以通过商业途径获得，例如N-(哌啶-1-基)-1-(2，4-二氯苯基)-5-(4-碘苯基)-4-甲基-1H-吡唑-3-甲酰胺，即商业上所谓的AM251，和被称为LY-320135的化合物。

CB1受体拮抗剂应用于治疗性功能障碍(专利申请WO03/082256)，或腹泻(专利申请书WO 01/85092)，或神经炎症性疾病或药物滥用疾病、肥胖、哮喘、便秘(专利申请书WO 03/087037)。

文献US 5,939,429、WO 03/077847，WO 03/084930，WO 03/084943，WO03/063781和WO 03/087037公开了CB1拮抗剂可以逆转肝硬化门静脉高压大鼠的全身血液动力学改变。

发明内容

但是，以上文献从未公开CB1拮抗剂可以降低任何病因(酒精、病毒、毒素)导致的肝病中的纤维化。此外，尚未了解到CB1受体或CB1拮抗剂效应与非酒精性脂肪性肝炎和肝癌变有关联。

发明人令人惊讶地证实，CB1拮抗剂具有潜在的抗肝纤维化特性，可以用于肝病治疗，优选的是导致肝纤维化的肝病。

因此，本发明，基于发现了CB1受体的失活可以降低与肝损伤和疾病相关的肝纤维化，提供了治疗肝病，优选的是导致肝纤维化的肝病的多种方法和组合物。本发明因此涉及到：

1.一种CB1受体的拮抗剂在制备治疗肝病的组合物中的应用。

2.根据第1项所述的应用，其中所述CB1受体拮抗剂是一种特殊的CB1受体拮抗剂。

3.根据第1或2项所述的应用，其中所述肝病导致肝纤维化。

4.根据第1-3项所述的应用，其中所述肝病是酒精性肝硬化。

5.根据第1-3项的所述应用，其中所述肝病是慢性病毒性肝炎。

6.根据第1-3项所述的应用，其中所述肝病是非酒精性的脂肪性肝炎。

7.根据1-3项所述的应用，其中所述肝病是原发性肝癌。

8.根据1-7项所述的应用，其中所述拮抗剂是一种为结构式II的化合物或其在制药学上可以接受的盐之一，其中，g₂、g₃、g₄、g₅和g₆以及w₂、w₃、w₄、w₅和w₆是等同或不同的，并且分别是氢、一个氯原子或溴原子、一个(C₁-C₃)烷基、一个(C₁-C₃)烷氧基、一个三氟甲基或一个硝基基团，g₄可以选择性地为一个苯基基团；R₄是氢或一个(C₁-C₃)烷基；X可以是一个直接键或是一个-(CH₂)_x-N(R₃)-基团，其中R₃是氢或一个(C₁-C₃)烷基，x是0或1；R是一个-NR₁R₂基团，其中R₁和R₂各自是一个(C₁-C₆)烷基；一个被选择性地取代的非芳香族的(C₃-C₁₅)碳环基，所述的取代基不是取代羰基；一个氨基(C₁-C₄)烷基基团，其中氨基可以被一个(C₁-C₃)烷基选择性地双取代；一个环烷基(C₁-C₃)烷基，其中环烷基是C₃-C₁₂；一个非取代的或被一个卤素、一个(C₁-C₅)烷基或一个(C₁-C₅)烷氧基单取代或多取代的苯基；一个苯基(C₁-C₃)烷基；一个双苯基(C₁-C₃)烷基；一个萘基；一个蒽基；一个不被取代的或被一个(C₁-C₃)烷基、一个羟基或一个苄基取代的饱和的5到8个原子数的杂环基，一个1-金刚烷甲基；一个不被取代的或被一个卤素、一个(C₁-C₅)烷基或一个(C₁-C₅)烷氧基单取代或多取代的芳香族杂环；被一个芳香族杂环取代的(C₁-C₃)烷基，其中的芳香族杂环不被取代或被一个卤素、一个(C₁-C₅)烷基或一个(C₁-C₅)烷氧基单取代或多取代；或者，R₁是氢，R₂如上所定义；或者，R₁和R₂与它们结合的氮原子形成一个饱和的5到8个原子数的杂环基，当w₂、w₃、w₄、w₅、w₆、g₂、g₃、g₄、g₅和g₆都是氢时，所述的杂环基不是吗啉；当X是-(CH₂)_XN(R₃)-时，如上所定义的一个R2基；一个R5基，当X是一个直接键时，R5是一个(C₁-C₃)烷基；一个不被取代或被一个(C₁-C₅)烷基取代的(C₃-C₁₂)环烷基；一个不被取代或被一个卤素或一个(C₁-C₅)烷基所取代的苯基(C₁-C₃)烷基；一个环烷基(C₁-C₃)烷基，其中环烷基是C₃-C₁₂，其不被取代或被一个(C₁-C₅)烷基所取代；或者一个2-降莰基甲基。

9.根据第1-7项所述的应用，其中所述拮抗剂是N-哌啶酮-3-吡唑甲酰胺或是其在药物学上可接受的一种盐。

10.根据第1-7项所述的应用，其中所述拮抗剂是N-哌啶-5-(4-溴苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-乙基吡唑-3-甲酰胺或是其在药物学上可接受的一种盐。

11.根据第1-7项所述的应用，其中的拮抗剂是N-哌啶-5-(4-氯苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡唑-3-甲酰胺或是其在药物学上可接受的一种盐。

12.根据上述任何一项应用，其中CB1受体选自由下述组成的组：

a)具有包括序列1或序列1一部分的氨基酸序列，具有G蛋白偶联细胞受体的生物学功能，能够结合THC并传导细胞信号的蛋白；

b)具有包括序列2或序列2一部分的氨基酸序列，具有G蛋白偶联细胞受体的生物学功能，能够结合THC并传导细胞信号的蛋白；

c)具有序列1或序列2的氨基酸序列，具有G蛋白偶联细胞受体的生物学功能，能够结合THC并传导细胞信号的由等位基因编码的蛋白质；

d)具有序列1的氨基酸序列，在200位有一个苯丙氨酸对亮氨酸的替代；和/或在216位一个异亮氨酸对缬氨酸的替代；和/或在246位缬氨酸对丙胺酸的替代的蛋白；

e)具有序列2的氨基酸序列，在139位有一个苯丙氨酸对亮氨酸的替代；和/或在155位一个异亮氨酸对缬氨酸的替代；和/或在185位缬氨酸对丙胺酸的替代的蛋白；以及

f)具有包括序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8和序列9的氨基酸序列或与它们80％同源的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有G蛋白偶联细胞受体的生物学功能，能够结合THC并传导细胞信号的蛋白。

13.根据第1-11项所述的应用，其中CB1受体是一个与序列1在氨基酸水平上同源性至少为45％，具有G蛋白偶联细胞受体的生物学功能，能够结合THC并传导细胞信号的蛋白质。

14.根据前项所述的应用，其中同源性至少为60％，优选70％，更为优选的是80％，又更为优选的是90％，更为优选的是95％。

15.如上述任何一项的应用，其中CB1受体拮抗剂的每日剂量从0.01mg到500mg，优选为1mg到100mg。

16.编码包括序列1或序列2或序列1的一部分或序列2的一部分的蛋白的核苷酸，在制备通过下调或抑制CB1受体来治疗肝病的组合物的应用。

17.一种治疗哺乳动物肝病的方法，包括将治疗有效剂量的至少其中的一种CB1受体拮抗剂给药于需要的患者。

18.根据第17项所述的治疗肝病的方法，其中，CB1受体拮抗剂是具有结构式II的化合物或其在药物学上可接受的盐之一，其中，g₂、g₃、g₄、g₅和g₆以及w₂、w₃、w₄、w₅和w₆是等同或不同的，并且分别是氢、一个氯原子或溴原子、一个(C₁-C₃)烷基、一个C₁-C₃)烷氧基、一个三氟甲基或一个硝基基团，g₄可以选择性地为一个苯基基团；R₄是氢或一个(C1-C3)烷基；X可以是一个直接键或是一个-(CH₂)_x-N(R₃)-基团，其中R₃是氢或一个(C₁-C₃)烷基，x是0或1；R是一个-NR₁R₂基团，其中R₁和R₂各自是一个(C₁-C₆)烷基；一个被选择性地取代的非芳香族的(C₃-C₁₅)碳环基，所述的取代物不是取代羰基；一个氨基(C₁-C₄)烷基基团，其中氨基可以被一个(C₁-C₃)烷基选择性地双取代；一个环烷基(C₁-C₃)烷基，其中环烷基是C₃-C₁₂；一个非取代的或被一个卤素、一个(C₁-C₅)烷基或一个(C₁-C₅)烷氧基单取代或多取代的苯基；一个苯基(C₁-C₃)烷基；一个双苯基(C₁-C₃)烷基；一个萘基；一个蒽基；一个不被取代的或被一个(C₁-C₃)烷基、一个羟基或一个苄基取代的饱和的5到8个原子数的杂环基，一个1-金刚烷甲基；一个不被取代的或被一个卤素、一个(C₁-C₅)烷基或一个(C₁-C₅)烷氧基单取代或多取代的芳香族杂环；被一个芳香族杂环取代的(C₁-C₃)烷基，其中的芳香族杂环不被取代或被一个卤素、一个(C₁-C₅)烷基或一个(C₁-C₅)烷氧基单取代或多取代；或者，R₁是氢，R₂如上所定义；或者，R₁和R₂与它们结合的杂原子形成一个饱和的5到8个原子数的杂环基，当w₂、w₃、w₄、w₅、w₆、g₂、g₃、g₄、g₅和g₆都是氢时，所述的杂环基不是吗啉；当X是-(CH₂)_xN(R₃)-时，如上所定义的一个R₂基；一个R₅基，当X是一个直接键时，R₅是一个(C₁-C₃)烷基；一个不被取代或被一个(C₁-C₅)烷基取代的(C₃-C₁₂)环烷基；一个不被取代或被一个卤素或一个(C₁-C₅)烷基所取代的苯基；一个环烷基(C₁-C₃)烷基，其中环烷基是C₃-C₁₂，其不被取代或被一个(C₁-C₅)烷基所取代；或者一个2-降莰基甲基。

19.根据第17项所述的治疗肝病的方法，其中所述CB1受体拮抗剂是N-哌啶酮-3-吡唑甲酰胺或是其在药物学上可接受的一种盐。

20.根据第17项所述的治疗肝病的方法，其中所述CB1受体拮抗剂是N-哌啶-5-(4-对溴苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-乙基吡唑-3-甲酰胺或是其在药物学上可接受的一种盐。

21.根据第17项所述的治疗肝病的方法，其中所述CB1受体拮抗剂是N-哌啶-5-(4-对氯苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡唑-3-甲酰胺或是其在药物学上可接受的一种盐。

22.根据第17-21项所述的治疗肝病的方法，其中所述肝病是肝纤维化。

23.根据第17-21项所述的治疗肝病的方法，其中所述肝病是酒精性肝硬化。

24.根据第17-21项所述的治疗肝病的方法，其中所述肝病是慢性病毒性肝炎。

25.根据第17-21项所述的治疗肝病的方法，其中所述肝病是非酒精性的脂肪性肝炎。

26.根据第17-21项所述的治疗肝病的方法，其中所述肝病是原发性肝癌。

27.根据第17-26项所述的治疗肝病的方法，其中所述CB1受体拮抗剂的每日剂量从0.01mg到500mg，优选为1mg到100mg。

附图说明

图1：柱图显示了每mg可溶性蛋白中肝TGFβ-1的以pg计的含量(A组)和肝平滑肌α肌动蛋白表达量占截面表面积染色总量的百分比(B组)。两者都以野生型小鼠(用WT表示)和CB1缺陷型小鼠(用CB1-/-表示)分组。00表示只接受橄榄油的小鼠组，CC14则显示CC14中毒小鼠的结果。

对肝TGFβ-1的产量进行了测定(统计学意义p＜0.05)。为评价平滑肌α肌动蛋白，对每个动物4-5个肝组织切片的染色进行了定量(统计学意义p＜0.05)。

图2：柱图分别显示了在野生型小鼠(用WT表示)和CB1缺陷型小鼠(用CB1KO表示)中肝成肌纤维细胞的初始存活力和血清撤除48小时后的存活力(A组)以及半胱氨酰-天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)样的初始活性及血清撤除48小时后的活性(B组)。通过血清撤除48小时诱导细胞凋亡。肝成肌纤维细胞的存活力被表示为存活细胞的平均百分比±SEM，结果来自根据3只WT和2只CB1-/-小鼠肝脏的细胞分离株进行的6-9个实验(CB1-/-的统计学意义p＜0.05)。半胱氨酰-天冬氨酸蛋白酶-3样活性被表示为从第0天起测定的活性的倍数(根据3只WT和3只CB1-/-小鼠肝脏的细胞分离株进行的6-9个实验获得平均值±SEM)。统计学上p＜0.05。

图3：显示了CB1受体拮抗剂SR141716增大剂量对人(A组)和野生型小鼠(表示为WT)和CB1缺陷型小鼠(表示为CB1KO)(B组)肝成肌纤维细胞DNA合成的效应。DNA合成被表示为细胞经SR141716的赋形剂(vehicle)处理后根据SR141716的以nM计增高的浓度作图得出的DNA合成百分比。在存在20ng/ml的PDGF-BB的情况下，人肝成肌纤维细胞经不同浓度的CB1受体拮抗剂SR141716刺激30个小时。通过测量3-6个实验的掺入DNA的[³H]胸腺嘧啶脱氧核苷(以平均值±SEM计)，以对照的百分比表示(p＜0.05)。图中显示均值相关区间。小鼠肝成肌纤维细胞(图中野生型小鼠表示为圆圈，CB1缺陷型小鼠表示为菱形)，在存在20ng/ml的PDGF-BB的情况下，经不同浓度的CB1受体拮抗剂SR141716刺激30个小时。根据3-6个来自于3只WT和3只CB-/-小鼠肝的细胞分离株实验的数据对掺入DNA的[³H]胸腺嘧啶脱氧核苷进行测定，以平均值±SEM计，以对照的百分比表示(p＜0.05)。图中显示了均值相关区间。

图4：显示了SR141716或其赋形剂对经四氯化碳引起的小鼠的死亡率的效应。根据以天计的时间给出了用CCl₄伴SR141716(虚线)或不伴SR141716(实线表示只有赋形剂没有CB1拮抗剂的操作)处理的小鼠的存活率。CCl₄给药的时间以箭头表示。

具体实施方式

本发明提供了治疗包括肝纤维化在内的肝病的方法和组合物(例如药物组合物)。肝病还包括但不限于，酒精性肝硬化、慢性病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎和原发性肝癌。

申请人显示了CB1受体的下调和拮抗剂的应用或CB1受体的反向激动剂构成了不同类型肝纤维化的治疗。通过几个实验得到了证明。

首先，在被实施CB1受体敲除而缺少CB1受体表达的小鼠(CB1KO，n＝15)和与其对应野生型小鼠(WT，n＝12)的慢性四氯化碳中毒导致肝纤维化的模型中，研究了CB1受体在肝纤维化进程中的角色。用METAVIR产生的评分(METAVIR-derived score)对纤维化和坏死性炎症进行评估。CB1KO小鼠与WT小鼠相比显示出纤维化程度降低(纤维化评分：2.59±0.13对3.33±0.13，p＜0.05)。因此，CB1KO小鼠与WT小鼠相比，以羟脯氨酸测定评估，肝脏胶原质下降了40％(0.46±0.06对0.73±0.11mg/mg组织，p＜0.05)。坏死性炎症评分在两组中近似。该CB1受体失活与通过药物学方法完全的拮抗阻断CB1受体具有相同的表现。根据肝脏组织学分析和羟脯氨酸，即一种胶原质沉积的生化标记物的含量测定，与对照组相比，CB1小鼠的肝纤维化显著降低。另外还可以观察到，当用四氯化碳处理时，与野生型小鼠相比，CB1缺陷型小鼠TGF-β1和平滑肌α肌动蛋白表达减少。最后观察到，CB1失活增加了小鼠肝成肌纤维细胞的凋亡。因此，CB1受体的失活降低了肝纤维化。

第二，对正常人、硬化肝脏和培养的肝成肌纤维细胞进行免疫化学标记。免疫化学显示，正常人肝脏中(n＝3)CB1受体微弱表达，与此相对照的是，各种原因的肝硬化标本(n＝13)CB1受体显著上调，以纤维间隔内的非实质细胞内和纤维间隔边缘的非实质细胞占优势。经双免疫组织化学鉴定，成肌纤维细胞是CB1受体的主要来源，因此，CB1受体在培养的人肝成肌纤维细胞中也有表达。CB1受体在正常肝脏窦内细胞中微弱表达，在慢性肝病中显著上调。双免疫组织化学显示，肝成肌纤维细胞在硬化肝脏中是表达CB1受体的优势细胞型。因此，CB1受体表达和激活与肝纤维化相关。

第三，对一组慢性丙肝患者进行了流行病学研究，发现每天吸入大麻对于慢性丙肝的纤维化进程是一个危险因素，因为，这些病人的纤维化速度大于非大麻吸入者。研究表明大麻素信号传导参与了肝纤维化。因此，大麻信号途径与肝纤维化相关。

第四，进行了商业上称为SR141716(或SR141716A)的CB1受体拮抗剂N-哌啶-5-(4-对氯苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡唑-3-甲酰胺或利莫那班(rimonabant)对人和小鼠的肝成肌纤维细胞培养物体外效应的研究，结果显示CB1拮抗剂可以抑制肝成肌纤维细胞的生长。欧洲专利申请EP656354-A1描述了该化合物及其制剂，并提出了结构式I：

该CB1拮抗剂及其在药物学上可接受的盐可以按照欧洲专利申请EP656354制备，同样地药物组合物可以根据同一专利的说明书进行制备。

第五，对小鼠的体内研究显示，CB1拮抗剂SR141716可以减少作为肝纤维化诱发模型的四氯化碳诱发的致死率。

CB1受体拮抗剂在这里被定义为能够限制CB1受体活化或表达的化合物。

能够限制CB1受体活化的化合物包括尤其是能够与CB1受体激动剂相互作用的化合物，限制所述的激动剂的结合，或限制所述的结合导致的CB1受体的活化。

特别是，合适的CB1受体拮抗剂可以特别地针对CB1或者不是针对CB1，并且包括反向激动剂。这些拮抗剂也包括WO 03/077847中描述的取代酰胺，WO 03/087037中描述的取代芳基酰胺，WO 03/063781中描述的取代咪唑，W0 03/086288所描述的双环酰胺，WO 03/084943中描述的三联苯衍生物，EP-B-656354描述的N-哌啶酮-3-吡唑甲酰胺和N-哌啶-5-(4-对氯苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡唑-3-甲酰胺，US5596106和US5747524分别描述的芳基苯并[b]噻吩和苯并[b]呋喃化合物，FR2805817所描述的氮杂环丁烷衍生物，FR2805810所描述的3-氨基-氮杂环丁烷，或FR2805818所描述的3-取代或3，3-双取代1-(双-((杂)芳基)-甲基)-氮杂环丁烷，N-(哌啶-1-基)-1-(2，4-二氯苯基)-5-(4-碘苯基)-4-甲基-1H-吡唑-3-甲酰胺(所谓的AM251)以及商业上所谓的化合物LY-320135。合适的CB1受体拮抗剂也包括专利EP1150961所描述的N-哌啶-5-(4-对溴苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-乙基吡唑-3-甲酰胺。

专利EP576357描述了其他合适的CB1拮抗剂，包括结构式II的化合物，其中，g₂、g₃、g₄、g₅和g₆以及w₂、w₃、w₄、w₅和w₆是等同或不同的，并且分别是氢、一个氯原子或溴原子、一个(C₁-C₃)烷基、一个(C₁-C₃)烷氧基、一个三氟甲基或一个硝基基团，g₄可以选择性地为一个苯基基团；R₄是氢或一个(C₁-C₃)烷基；X可以是一个直接键或是一个-(CH₂)_x-N(R₃)-基团，其中R₃是氢或一个(C₁-C₃)烷基，x是0或1；R是一个-NR₁R₂基团，其中R₁和R₂各自是一个(C₁-C₆)烷基；一个被选择性地取代的非芳香族的(C₃-C₁₅)碳环基，所述的取代基不是取代羰基；一个氨基(C₁-C₄)烷基基团，其中氨基可以被一个(C₁-C₃)烷基选择性地双取代；一个环烷基(C₁-C₃)烷基，其中环烷基是C₃-C₁₂；一个非取代的或被一个卤素、一个(C₁-C₅)烷基或一个(C₁-C₅)烷氧基单取代或多取代的苯基；一个苯基(C₁-C₃)烷基；一个双苯基(C₁-C₃)烷基；一个萘基；一个蒽基；一个不被取代的或被一个(C₁-C₃)烷基、一个羟基或一个苄基取代的饱和的5到8个原子数的杂环基，一个1-金刚烷甲基；一个不被取代的或被一个卤素、一个(C₁-C₅)烷基或一个(C₁-C₅)烷氧基单取代或多取代的芳香族杂环；被一个芳香族杂环取代的(C₁-C₃)烷基，其中的芳香族杂环不被取代或被一个卤素、一个(C₁-C₅)烷基或一个(C₁-C₅)烷氧基单取代或多取代；或者，R₁是氢，R₂如上所定义；或者，R₁和R₂与它们结合的氮原子组成一个饱和的5到8个原子数的杂环基，当w₂、w₃、w₄、w₅、w₆、g₂、g₃、g₄、g₅和g₆都是氢时，所述的杂环基不是吗啉；当X是-(CH₂)_XN(R₃)-时，如上所定义的一个R₂基；一个R₅基，当X是一个直接键时，R₅是一个(C₁-C₃)烷基；一个不被取代或被一个(C₁-C₅)烷基取代的(C₃-C₁₂)环烷基；一个不被取代或被一个卤素或一个(C₁-C₅)烷基所取代的苯基(C₁-C₃)烷基；一个环烷基(C₁-C₃)烷基，其中环烷基是C₃-C₁₂，其不被取代或被一个(C₁-C₅)烷基所取代；或者一个2-降莰基甲基。

这些结果不只限定在人类，通常可以应用到哺乳动物。

包括CB1拮抗剂的组合物可以用于预防性治疗和/或治疗。药物组合物中的活性组分(例如，CB1受体拮抗剂)以“有效剂量”存在。药物组合物的“有效剂量”是指充足的但非毒性的以提供理想效果的试剂剂量。该术语是指治疗一个受治疗对象(例如一个哺乳动物，特别是一个人)所需的充足剂量。因此术语“治疗量”是指通过预防、阻碍、延迟、或逆转疾病或任何其他不适症状的进程来治愈一种疾病状态或症状的充足剂量。术语“预防性有效”剂量是指给予还未患病的受治疗对象的剂量，因此是一种预防、阻碍或延迟疾病发作的有效剂量。

在治疗应用上，组合物以所述的治愈或至少部分阻止疾病的症状及其并发症出现的充足剂量应用于已经患病的患者。根据几个已经建立起来的方案，可以容易地确定药物组合物的合适剂量。例如，动物研究(例如小鼠或大鼠)通常被用于确定每公斤体重生物活性剂的最大耐受剂量。通常，至少有一种被测试动物是哺乳动物。从动物研究获得的结果可以外推确定其他物种的应用剂量，例如人。有效剂量的制定也依赖于疾病或状态的属性和严重性，以及病人一般健康状况。

在预防性应用上，包括例如CB1受体拮抗剂的组合物应用于肝病的易感患者或具有肝病风险的其他人。这样一种量被定义为“治疗有效”量或剂量。在该应用中，精确的量依赖于病人的健康状况或体重。

在治疗和预防性治疗中，药物组合物中所包括的拮抗剂可以以几种剂量或单一剂量应用直到达到理想反应。对治疗进行特征性的监控，根据需要可以给予重复剂量。一旦需要灭活CB1受体，可以根据建立起的剂量配方来应用本发明的化合物。

本产品的每日剂量可以在每个成人每天0.01到1,000mg的范围内变动。优选的是，组合物包括0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50.0、100、250和500mg的活性成分，以用于待治疗病人的剂量的症状调节。一种药物典型性地包括从约0.01到约500mg的活性成分，优选是从1mg到约100mg的活性成分。药物的有效量通常从0.0002mg/kg体重到约20mg/kg体重每天的剂量水平来提供，尤其是从0.001mg/kg体重每天到约10mg/kg体重每天。但是，可以理解的是，对于任何一个具体病人的具体剂量水平和用药频率可以变化，并依赖多种因素，其中包括：具体所应用化合物的活性、代谢稳定性、化合物的作用时间、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、应用的方式和时间、排泄速率、药物结合、具体状态的严重性和宿主经历的治疗。

在用于口服、舌下、皮下、肌肉内、静脉内、经皮、局部或直肠给药的本发明药物组合物中，有效成分，单独或与其他有效成分结合，可以以一个单位应用形式与常规的药物载体组成混合物，对动物和人进行应用。合适的单位应用形式包括经口途径的形式例如片剂、胶囊、粉剂、颗粒和口服的悬浮液或溶液，舌下和口腔的应用形式，气溶胶、植入物、皮下、经皮、局部、腹膜内、肌肉内、静脉内、真皮下、经皮、鞘内、和鼻内的应用形式和直肠应用形式。

适当的应用单位形式包括口服应用形式，例如片剂、明胶胶囊、粉剂、颗粒和口服的溶液或悬浮液，舌下和口腔的应用形式，气溶胶、植入物，皮下、肌肉内、静脉内、鼻内和眼内的应用形式和直肠应用形式。

在本发明的药物组合物中，有效成分通常制备成每剂量单位含0.5到1000mg，优选的是从1到500mg，更为优选的是从2到200mg的所述有效成分的剂量单位，作为每天一次的用量单位。

当制备片剂形式的固体组合物时，可以将润湿剂例如月桂硫酸钠加入到选择性微粉化的有效成分，有效成分与药物载体例如硅土、明胶、淀粉、乳糖、硬脂酸镁、滑石粉、阿拉伯胶或类似物混合。片剂可以包被有蔗糖、各种聚合物或其他适合的物质，或者其可以通过加工使活性得到延长或滞后以持续释放设定剂量的有效成分。

将有效成分与诸如乙二醇或甘油酯的稀释剂混合并将混合物灌注进软或硬的明胶胶囊内制备成明胶胶囊形式的制剂。

糖浆或酏剂形式的制剂可以包括有效成分与甜味剂，优选是不含热量的甜味剂，作为防腐剂的羟苯甲酯或羟苯丙酯，调味品和适当的着色剂。

水分散性粉末和颗粒可以包括与分散剂或润湿剂，或诸如聚乙烯吡咯烷酮的悬浮剂相混合的有效成分，同时混合有甜味剂或矫味剂。

和在直肠温度融化的粘合剂，例如，可可油脂和聚乙二醇，一起制备成的栓剂进行直肠用药是有效的。

应用含有药理学上兼容的分散剂和/或润湿剂，例如丙二醇、丁二醇、或聚乙二醇的水悬浮液、等渗盐溶液或无菌的注射液进行非肠胃、鼻内或眼内用药是有效的。

因此，一种助溶剂，例如诸如乙醇的醇类或诸如聚乙二醇或丙二醇的二醇类，以及诸如吐温.RTM.80(Tween.RTM.80)的亲水表面活性剂可以用于制备经静脉内途径可注射的水溶液。通过甘油三酯或甘油酯可以溶解有效成分并制备成通过肌内途径的油性注射液。

应用含有有效成分的醇溶液的多层片或贮存器进行经皮用药是有效的。

含诸如三油酸山梨坦或油酸并伴有三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或其他生物学上兼容的推进气相混合的气溶胶进行吸入给药是有效的。

有效成分也可以制备成选择性地伴有一种或多种载体或添加剂的微胶囊或微球。

在用于慢性治疗的延长释放形式中，可以应用植入物。可以制备成等渗介质中的油性悬浮液或微球的悬浮液的形式。

有效成分也可以与环糊精混合物的形式存在，例如，α-、β-或γ-环糊精，2-羟丙基-β-环糊精或甲基-β-环糊精。

另外一个合适的CB1受体拮抗剂可以存在于直接针对CB1受体的，阻碍CB1受体与拮抗剂结合的抗体中。

有多种的同工型和其他变异型的CB1受体。因此，对任何这些变异CB1受体的拮抗剂的应用都将不会位于本发明领域之外。通常，并且除了蛋白质序列一致性或同源性之外，CB1受体的生物学功能可以定义作为G蛋白偶联细胞受体，能够结合THC并传递细胞信号。技术人员能够通过已知的标准程序来检测CB1受体功能。其可以包括CHO细胞中假定的CB1 cDNA的表达，其后应用CB1配体的检测和被激活的假定的CB1受体的细胞信号传导活性的测量，例如测量环磷酸腺苷的产量。

降低大麻素通过CB1受体的信号传导的可供选择的药理学手段包括下调或抑制该受体。有多种技术人员能够实施的已知技术来下调或抑制基因的表达。一个非穷尽目录包括同源重组失活(Gossen，当代遗传学杂志(J，trends Genet).1993年卷9：27-31页)，RNA干预(ElbashirS.M.，自然(Nature)，2001年5月24日411卷(6836)：428-9页)，显性失活受体的表达(Dosil，M.等，分子和细胞生物学(Mol Cell Biol)1998年10月，卷18(10)：5981-91页)和抑制性转录因子的转基因表达。

根据先前的报道(Li，L.等，胃肠病学(Gastroenterology)2003年卷125，460-9页，Davaille J等，生物化学杂志(J Biol Chem)2002年)，可以通过外科技术从正常人肝脏中取得样品，用所述样品制备移植物，应用从移植物的生长物中获得的成肌纤维细胞培养物来筛选出具有选择性抗纤维化特性的CB1拮抗剂。筛选具有选择性抗纤维化特性的CB1拮抗剂的方法具体包括以下步骤：

a)制备多份成肌纤维细胞培养物，

b)将每一个细胞培养物暴露于一种待检测的化合物，

c)通过评估所述化合物对细胞存活和生长方面的作用来评价其在成肌纤维细胞纤维化特性方面的作用，

d)选择被检测的化合物中的一种。

一个可选择的方法是如上所述的方法，在步骤c)中，通过评估化合物在合成细胞外基质和防止其降解的组分的能力方面的作用来评价其在成肌纤维细胞纤维化特性方面的作用。

一个可选择的方法是如上所述的方法，在步骤c)中，通过评估细胞因子的产生和转移来评价化合物在成肌纤维细胞纤维化特性方面的作用。

技术人员可以通过众所周知的操作来实施这些特定的步骤，例如Li，L.等在胃肠病学(Gastroenterology)2003年卷125，460-9页的报道，Davaille J等在生物化学杂志(J Biol Chem)2002年的报道，Li，L.等在生物化学杂志(J Biol Chem)2001年的报道，以及Davaille J等在生物化学杂志(J Biol Chem)2000年卷275，34628-33页的报道。

通过这些方法分离到的化合物可以用于制备治疗肝病的组合物。

实施例

实施例1：人硬化肝的CB1受体的上调

材料：

细胞培养基和试剂来自Gibco(Invitrogen，法国)。胎牛血清来自JBio Laboratories(法国)。人混合AB阳性血清由国家输血中心(National Transfusion Center)提供。兔抗CB1受体抗血清(抗人CB1受体第1-14位氨基酸残基)和CB1阻断肽(人CB1受体第1-14位氨基酸残基)来自Cayman(Spibio，法国)。

RNA制备和反转录PCR(RT-PCR)

应用RNA提取试剂盒(RNeasy试剂盒，Qiagen，法国)，从100mm培养皿中融合的静止期细胞提取总RNA。使用200单位的M-MLV反转录酶(Invitrogen，法国)，20μl的反应混合物包括0.05ug/μl的寡聚(dT)_12-18引物(Invitrogen，法国)，0.5mM的脱氧核苷三磷酸(dNTPs)(Promega，法国)和在第一链缓冲液中的10mM二硫苏糖醇(Invitrogen，法国)，以2μg总RNA为模板通过37℃反转录反应1小时，合成cDNA。为检验最终的基因组DNA的污染，设置不含反转录酶的相同条件为对照。进行多聚酶链反应(PCR)，使用2μl的反转录反应液，1.25单位的AmpliTaq Gold DNA聚合酶(Applied Biosystems，法国)和相应的缓冲液，其中缓冲液补充有2mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，和各25pmol的每条引物，总体积为50μl。在GeneAmp 2700热循环仪(AppliedBiosystems，法国)中进行40个PCR循环，每个循环包括：变性95℃45秒，退火58℃45秒，延伸72℃30秒，第一个循环中包括一个延长的变性期(10分钟)以激活聚合酶，最后一个循环包括一个延长的延伸期(10分钟)。CB1的寡聚核苷酸引物(MWG Biotech，法国)如下：CB1正义引物5′-TTTGGCTACACAATTGGAAGTCTAAGAACCC-3′，CB1反义引物5′-GCACACATTGACACGTATCCACTGCTTG-3′，预期的PCR产物长度为287bp。应用1.5％琼脂糖凝胶分析PCR扩增产物，并转印至Hybond-N+膜(Amersham Pharmacia Biotech，法国)上，在包括6×SSC，5mM EDTApH 8，5×denhardt，0.1％SDS和0.1mg/ml ssDNA的缓冲液中进行42℃2小时的预杂交，之后，在含50ng的用T4激酶(Invitrogen，法国)标记上[γ-³²P]三磷酸腺苷的CB1寡核苷酸探针5’-CCTGTGAGATGTGTATCAGTGTTTATGTGC-3’的相同缓冲液中，所述膜进行42℃过夜的杂交反应。杂交后在室温下，用0.1％SDS，1×SSC溶液冲洗印膜两次30分钟，应用phospho-imager(Molecular Dynamics，法国)分析结果。

人肝标本

对来自13名病人(男性8名，女性5名，平均年龄55，年龄范围39-72)的快速冷冻手术肝切除术进行了回顾性研究。从因结肠直肠转移病灶而进行肝切除术的3名女性病人采集了正常肝标本(n＝3)，从进行了肝移植的病人的8个肝脏和2名因肝细胞癌而经历肝切除术的病人采集到了硬化标本。硬化继发于慢性丙肝(n＝1)或乙肝(n＝2)感染、原发性胆管肝硬化(n＝1)、酒精性肝病(n＝4)或Wilson病(n＝1)和病因仍然不明的1个病例。

正常和硬化肝CB1受体的免疫组织化学检测

冷冻切片(5-7μm)经空气干燥并经-20℃10分钟的冰冻丙酮固定。用含20％人血清的pH为7.6的50mM TBS缓冲液(Tris-bufferedsaline)在室温下预孵育1小时以阻断非特异结合。用抗体稀释液(Dakopatts，法国)将兔抗人CB1受体的多克隆抗血清(Cayman，Spibio，法国)1/2000稀释，将切片在4℃进一步孵育过夜。用TBS冲洗3次，用1/50稀释的鼠单克隆抗兔免疫球蛋白G抗体(Dakopatts，法国)在室温下进一步孵育切片45分钟，用TBS冲洗3次，用1/50稀释的兔抗鼠免疫球蛋白抗体(Dakopatts，法国)进一步孵育切片30分钟，然后，用出版物Li，L.等2003年胃肠病学(Gastroenterology)卷125，460-9页报道的碱性磷酸酶-抗碱性磷酸(APAAP)复合免疫酶法处理切片。为确定一抗的特异性，设置包括了用相应的合成肽(100μg/ml，室温1小时)预吸附一抗或省略一抗的对照。为了确定肝成肌纤维细胞是否表达CB1蛋白，进行CB1和平滑肌α肌动蛋白的免疫双重染色。为进行CB1免疫染色，首先用标准的3阶段生物素-链霉亲和素(biotin-streptavidin)免疫过氧化物酶方法对切片进行处理。简而言之，通过在TBS/0.3％H₂O₂中进行丙酮固定切片的30分钟孵育将内源性过氧化物酶灭活，再用TBS冲洗。通过与TBS/20％人血清预孵育切片30分钟阻断非特异性结合。切片在抗生物素蛋白(avidin)中孵育15分钟，然后在生物素中孵育15分钟(Vector Laboratories，抗生物素蛋白/生物素阻断试剂盒)，与抗CB1抗血清进一步4℃孵育过夜。随后，切片用TBS冲洗，再与生物素酰化的羊抗兔二抗(Dakopatts，法国)(1/500)和链霉亲和素-辣根过氧化物酶复合物(1/50)(Pierce，Perbio，Interchim，法国)分别孵育30分钟。通过金属增强二氨基联苯胺(DAB)底物(Pierce，Interchim，法国)揭示过氧化物酶的活性。除另有提示外，所有的步骤都在室温下进行。平滑肌α肌动蛋白的免疫染色用上述的APAAP方法处理，其中抗平滑肌α肌动蛋白的单克隆抗体(Sigma，法国)按1/5000稀释。用苏木精水溶液对载玻片进行对比染色。通过装配有数码影像系统(Hamamatsu 3CCD彩色摄影机，HamamatsuPhotonics，法国)的Axioplan亮视野光学显微镜(Zeiss，Oberkochen，德国)可以观察到单染色或双染色。

人肝成肌纤维细胞的分离和培养

可通过Davaille，J.等在生物化学杂志(J Biol Chem)2000年卷275，34628-33页所描述的方法，从良性或恶性肝肿瘤的外科手术中获得正常肝脏的手术标本，从由其制备的移植物的培养物中获得人肝成肌纤维细胞。细胞在含10％血清(5％胎牛血清和5％人血清，DMEM5/5)的Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(DMEM)中培养，并采用第三代到第七代之间的培养细胞。除特别提示外，实验所应用的细胞是通过在无血清的Waymouth培养基中孵育48小时获得的静止期细胞。按照Davaille，J.等在生物化学杂志(J Biol Chem)2000年卷275第34628-33页中所述的方法，对这些细胞的成肌纤维的属性进行了评价，这些显示了在肝纤维化过程中原位发现的促纤维化细胞的表型和功能特征(Win，K.M.等，肝脏病学(Hepatology)1993年卷18，137-45页)。发现培养物表达平滑肌α肌动蛋白和肝成肌纤维细胞的2个标记，锚定素-2(fibulin-2)和白细胞介素-6(Davaille，J.等，生物化学杂志(JBiol Chem)2000年卷275，34628-33页)。

培养的人肝成肌纤维细胞中CB1受体的免疫细胞化学检测

人肝成肌纤维细胞被接种(10,000/cm²)到35个培养皿中，在含血清培养基中生长24小时，血清撤除48小时，用TBS冲洗，用4％的多聚甲醛固定10分钟。用TBS冲洗一次后，细胞在含20％人血清的TBS室温下孵育30分钟，进一步和抗CB1抗血清(用TBS/20％人血清按1/500的比例稀释)室温下孵育3小时，并在保湿箱中4℃过夜。细胞在TBS中反复冲洗，与荧光素Cy3-共轭的(Cy3-conjugated)羊抗兔IgG(Sigma，法国)(用TBS/20％人血清按1/50的比例稀释)在室温下、避光孵育30分钟，冲洗，用VECTASHIELD Mounting培养基包覆(VectorLaboratories，Burlingame，CA)，并在荧光显微镜下观察。为确定一抗的特异性，设置包括了用相应的合成肽(100μg/ml，室温1小时)预吸附一抗或省略一抗的对照。

用直接抗人CB1受体的多克隆抗体在冰冻组织切片上通过免疫组织化学法研究CB1受体的表达，所述冰冻组织切片从正常肝的手术标本(n＝3)，不同病因的肝硬化手术标本(n＝10)(慢性丙肝(n＝1)或乙肝(n＝2)感染、原发性胆管肝硬化(n＝1)、酒精性肝病(n＝4)或Wilson病(n＝1)和病因不明1例)制备。在正常肝脏中，沿着窦状小管壁可以检测到离散的、间断的CB1免疫反应性，在硬化肝中，CB1免疫染色总强度明显增强，与肝硬化的病因无关。沿着纤维化间隔分布的大量纺锤形细胞中CB1是非常明显的。在其他非实质细胞中也发现了CB1受体的表达，包括炎症细胞和沿着纤维间隔分布的胆管增生细胞。在孵育时存在CB1阻断肽或缺少一抗时切片没有信号，证明了抗体的特异性。

双免疫组织化学法，用抗CB1受体抗体和抗平滑肌α肌动蛋白抗体，清楚地鉴定出在纤维化间隔内作为表达CB1受体的主要细胞类型的肝成肌纤维细胞。因此，通过RT-PCR分析和免疫细胞化学证实，培养的人肝成肌纤维细胞也表达CB1受体。

实施例2：CB1缺陷型小鼠纤维化反应的降低

动物和实验设计

根据Ledent，C.等在科学(Science)1999年卷283，401-4页报道的方法产生CB1受体失活的雄性CD1小鼠和野生型同窝小鼠。在产生用于本研究的野生型和突变型小鼠之前，将杂交小鼠在CD1背景下饲育到15代以上。采用40只雄性鼠：WT(n＝20)和CB1-/-(n＝20)，8-10周龄。动物分组如下：WT空白对照组(橄榄油n＝8)；WT CCl₄组(n＝12)；CB1-/-空白对照组(橄榄油n＝5)；CB1-/-CCl₄组(n＝15)。动物被放置于控制温度和湿度的房间内，保持12小时光亮和黑暗的循环，不限制食物和水的供应，除非另有提示。施予四氯化碳(CCl₄)(Sigma，St Quentin-Fallavier，法国)和橄榄油的混合物(1∶10体积比)，按0.5ml/公斤体重的量腹膜内注射，一周两次诱导纤维化，与等体积的酒精与聚氧乙烯氢化蓖麻油(Cremophor)和PBS的混合物(5/5/90)一周三次交替。CCl₄的空白对照动物给予橄榄油。4周后，动物禁食过夜，在接受最后一次CCl₄注射48小时后被处死。肝脏标本取自几个肝叶并且进行1)用液氮快速冷冻并在RNA提取液中均质化，或2)在水中均质化，用液氮快速冷冻用于羟脯氨酸测定，或3)固定在福尔马林缓冲液中。快速冷冻标本保存在-80℃待用。血液标本也采集到含惰性胶屏障和促凝剂盘(clot activator disc)的硅树脂管内(Venoject，Terumo，法国)，通过离心分离血清，在-20℃保存待用。

肝功能检测

在自动化分析仪上进行常规的肝功能血液检测(胆红素、碱性磷酸酶和天门冬氨酸转氨酶)。

纤维化、炎症和坏死的评价

肝脏标本在10％福尔马林中固定，石蜡包埋。组织切片(4μm厚)用苏木精-伊红染色(H&E)以用于常规检测，或用Picro-Sirius红染色以用于观察肝脏胶原质沉积。组织学分级(坏死和炎性浸润)和分阶段(纤维化)通过一位独立的病理解剖学家对来自每个肝脏的不同区域的至少4个片段进行盲法评价。根据半定量的改良METAVIR评分系统将纤维化分成0到4个阶段：无纤维化＝0，门静脉处纤维化但不包括间隔＝1，几个间隔＝2，大量的间隔但没有硬化＝3，以及硬化＝4。通过估算相应于每个片段中个体得分水平的面积百分比和结合每一肝脏的数据资料来考虑所存在的纤维化在整个肝脏中的不均匀性。坏死，通过嗜酸小体、气球样变性和/或肝细胞坏死的分散性病灶来定义，其被分级为：无＝0，轻微＝1(包括1/3肝叶或小结)，中等(包括1/3-2/3肝叶或小结)＝2，显著(包括2/3以上肝叶或小结)。炎性浸润被分为0-3：无＝0，轻微(门静脉和/或肝小叶)的少于1/3肝小叶或小结的炎性浸润＝1，中等(门静脉和/或肝小叶)的1/3-2/3的肝小叶或小结的炎性浸润＝2，显著(门静脉和/或肝小叶)的大于2/3的肝小叶或小结的炎性浸润＝3。所有的标本本同时评分。

羟脯氨酸含量

根据Grenard，P.等在肝脏病学杂志(J Hepatol)1997年卷26，1356-62页的报道进行羟脯氨酸含量测定。汇集每个肝脏的3个小片段，在蒸馏水中均质化，冻干并在6N HCl中在110℃过夜水解(10mg肝脏干粉/ml HCl 6N)。水解物用活性碳处理，过滤，蒸发脱水，重悬于蒸馏水中。根据Woessner，J.F.在生物化学与生物物理文献(Arch Biochem Biophys)1961年卷93，440-7页报道的并经Creemers，L.B等在生物技术杂志(Biotechniques)1997年卷22，656-8页报道加以改进的方法，用等份水解物与Ehrlich′s试剂反应通过分光光度计测定羟脯氨酸(HP)含量。肝羟脯氨酸含量用每毫克组织(干重)中的微克数表示。

小鼠肝成肌纤维细胞的分离和培养

根据Vrochides，D.等在肝脏病学杂志(Hepatology)1996年卷23(6)1650-5页的报道，通过胶原酶灌注和在Nicodenz内进行密度梯度纯化分离小鼠成肌纤维细胞。分离后，在含20％胎牛血清的DMEM培养基中培养细胞。第1天，通过冲洗去除细胞碎片和非粘附细胞，然后继续在含10％胎牛血清(FCS)的DMEM培养基中培养细胞。采用第3到第9代的细胞，发现有表达平滑肌α肌动蛋白、锚定素-1和白介素-6。

Caspase-3样活性的测定

对贴壁过夜生长于含10％胎牛血清DMEM培养基，在指定时间内实施血清饥饿的非融合细胞进行细胞凋亡分析。根据Davaille，J.等在生物化学杂志(J Biol Chem)2002年卷277(40)37323-30页；Li，L.等在生物化学杂志(J Biol Chem)2001年卷276(41)：38152-8页报道的方法，以AC-DEVD-AFC为底物，分析细胞溶解物的Caspase-3样活性。

细胞存活力的评价

鼠肝成肌纤维细胞(96孔板中7,000个细胞/孔)贴壁过夜生长于DMEM10％培养基，在指定时间内实施血清饥饿。每孔内加CellTiter96 AQueous One Solution试剂，记录在490nm处的吸收值。

肝TGF-β1的测定

在酸激活全肝组织匀浆中测定TGF-β1的含量。冰冻肝标本在裂解缓冲液(25mM HEPES pH7.4，1％NP40，5mM MgCl₂，1.3mM EDTA，1mMEGTA，磷酸酶和蛋白酶抑制剂)中4℃30分钟被均质化。12,000g4℃10分钟离心，收集裂解上清液保存于-80℃待分析。用BCA蛋白分析法(Pierce)以牛血清白蛋白(BSA)为标准品确定蛋白浓度。为将隐性TGF-β1激活为免疫反应性形式，组织裂解液在等体积的2.5N乙酸，10M尿素内室温10分钟酸化，再在1M HEPES中用2.7M NaOH中和。用鼠TGF-β1 Quantikine(R&D Systems，法国)根据厂商说明书，进行ELISA检测，以鼠TGF-β1重组蛋白作为标准品。结果以TGF-β1的pg数/mg可溶性蛋白计。

平滑肌α肌动蛋白的免疫组织化学染色

肝组织在福尔马林中固定，在石蜡中包埋。应用Vector M.O.M.免疫检测试剂盒，根据生产商(Vector Laboratories)的详细说明书，进行平滑肌α肌动蛋白的免疫组织化学染色。简而言之，石蜡包埋的切片进行脱蜡处理，通过二甲苯和乙醇进入TBS(50mM Tris，150mMNaCI，pH7.6)进行再水化作用。每个载玻片在枸橼酸盐缓冲液中以700W的功率被微波加热2次，每次5分钟。在含0.3％H₂O₂的TBS中孵育1小时以灭活内源性过氧化物酶活性。切片在含1.5％马血清的TBS内预孵育1小时以阻断非特异结合，之后，切片在抗生物素蛋白中孵育15分钟，接着在生物素中孵育15分钟(Avidin/Biotin blocking试剂盒，Vector Laboratories)，进一步与MOM Mouse Ig Blocking溶液孵育1小时。然后用TBS冲洗切片，接着依次与MOM稀释液孵育5分钟，与抗平滑肌α肌动蛋白的单克隆抗体的1∶1000稀释液孵育30分钟(Sigma，法国)，与MOM生物素酰化的抗鼠IgG试剂孵育10分钟，最后与Vectastain ABC Reagent孵育5分钟。通过金属增强二氨基联苯胺(DAB)底物(Pierce，Interchim，法国)得出过氧化物酶的活性。所有的步骤都在室温下进行。与替代一抗的MOM稀释液一起染色的对照载玻片不显示任何的阳性染色。用带有Image-Pro Plus软件(MediaCybernetics，MicroMecanique，法国)的形态学分析系统对每个动物的4-5个肝片段进行阳性染色区域的测定。

统计学数据

结果以n个实验的平均数±SEM表示。对结果进行双向方差分析(two-way analysis of variance，ANOVA)，再根据Student-Newmann-Keuls方法进行配对对比校正。最小统计学意义设为p＜0.05。

CB1受体缺陷型小鼠(CB1-/-)及其同窝出生的野生型小鼠(WT)暴露于长期CCl₄的处理下。空白对照小鼠(CB1-/-和WT)给予橄榄油。如表1所列的4个实验组之间的体重、肝重和肝重/体重比的平均数无明显差别。

表1.野生型小鼠(WT)和CB1缺陷型小鼠经4周CCl₄的处理后生命指征和肝功检测

参数	WT橄榄油	WT CCl₄	CB1-/-橄榄油	CB1-/-CCl₄
参数	WT橄榄油	WT CCl₄	CB1-/-橄榄油	CB1-/-CCl₄	体重(g)	36.3±1.7	35.2±0.8	34.8±2.1	36.6±0.9
肝重(g)	1.9±0.1	2.1±0.1	1.8±0.1	2.1±0.1	体重(g)	36.3±1.7	35.2±0.8	34.8±2.1	36.6±0.9
肝重(g)	1.9±0.1	2.1±0.1	1.8±0.1	2.1±0.1	肝重/体重比(×100)	5.26±0.45	6.0±0.3	5.4±0.4	5.7±0.1
天冬氨酸转氨酶(IU1-1)	94.7±9.2	1887.2±656.6*	139.6±24.3	1341.9±457.1#	肝重/体重比(×100)	5.26±0.45	6.0±0.3	5.4±0.4	5.7±0.1
天冬氨酸转氨酶(IU1-1)	94.7±9.2	1887.2±656.6*	139.6±24.3	1341.9±457.1#	碱性磷酸酶(IU1-1)	37.9±5.9	55.0±6.2*	33.6±2.0	56.4±4.6#
总胆红素	3.5±1.0	15.1±4.2*	3.6±0.9	10.0±3.4#	碱性磷酸酶(IU1-1)	37.9±5.9	55.0±6.2*	33.6±2.0	56.4±4.6#

结果表示为平均数±SEM。*P＜0.05对WT橄榄油；#P＜0.05对CB1-/-橄榄油

经PicroSirius红染色的肝组织切片的组织学分析显示，CCl₄处理4周后WT小鼠发生了肝纤维化。CCl₄处理的WT小鼠肝脏显示大量的伴有节结的间隔形成。显著的是，CCl₄处理的CB1-/-小鼠显示出较弱的纤维化反应，纤维化间隔的形成减少。因此，CCl₄处理的CB1-/-小鼠的纤维化得分比CCl₄处理的WT小鼠明显低(分别为2.59±0.13和3.33±0.13，p＜0.05)。而且，根据羟脯氨酸定量估算的肝胶原质含量，CCl₄处理的CB1-缺陷小鼠与WT对照组相比，大幅降低了40％(分别为0.45±0.06和0.73±0.11mg/组织mg数(干重)p＜0.05)。最后，如表2所示，坏死和炎症在CCl₄处理的WT和CB1-/-小鼠之间无显著差别。

表2.野生型(WT)和CB1-/-小鼠经4周CCl₄的处理4周后的坏死和炎症

参数	WT CCl₄	CB1-/-CCl₄
参数	WT CCl₄	CB1-/-CCl₄	坏死	1.3±0.3	1.3±0.2
炎症	1.4±0.3	1.5±0.2	坏死	1.3±0.3	1.3±0.2

结果表示为平均数±SEM

对肝内纤维化细胞因子TGF-β1的含量进行测定，并对平滑肌α肌动蛋白的表达进行估计，其是肝成肌纤维细胞和活化的肝星形细胞的标志。在CCl₄处理的动物中，CB1缺陷鼠与野生型对照组比，TGF-β1生成降低(图1A)。另外，与CCl₄处理的WT小鼠比较，CCl₄处理的CB1-/-小鼠的平滑肌α肌动蛋白明显降低(1.23±0.09对2.58±0.23；p＜0.05)(图1B)。

最后，为评价CB1的失活是否通过降低肝成肌纤维细胞的增生和/或凋亡而降低其积聚，利用了分离于WT和CB1-/-小鼠的肝成肌纤维细胞。用血清撤除刺激凋亡的发生。血清剥夺几乎不影响分离于野生型小鼠(WT)的肝成肌纤维细胞的存活能力(图2)。与此相对照的是，血清饥饿对分离于CB1-/-动物的肝成肌纤维细胞产生了细胞毒性效应，即所显示的细胞圆形化(cell rounding)，萎缩、分离及存活力降低(图2A)。与WT细胞相比，血清撤除也加强刺激了CB1-/-细胞的caspase-3样活性(图2B)。因此，CB1-/-小鼠的肝成肌纤维细胞与WT小鼠的相比，显示出更高的凋亡率。

结果说明CB1受体的失活使肝成肌纤维细胞对凋亡变得敏感。

实施例3：每天吸入大麻是慢性丙型肝炎纤维化进程中得一个危险因素。

包含了长期暴露于危险因素的195名连续未经过治疗的病人(男性/女性：140/55，年龄42±10)。收集的数据包括病程持续阶段的大麻，酒精和烟草的消耗量，接触年龄、性别、传播途径、基因型、体重指数(BMI)、脂肪变性、活性和纤维化(METAVIR分期)，以及纤维化进程速度(中值为每年0.08)。

通过单变量分析，大于每年0.08的纤维化进程速度与如表3显示的大麻吸入量，酒精摄入量≥30g/天(64％，p＝0.03)，中等或显著脂肪变性(65％，p＝0.004)，接触年龄≥25(63％，p＜0.01)，组织学活性≥A2(65％，p＜0.001)相关。在多变量分析中，纤维化进程速度＞0.08独立与日大麻吸入量(OR＝3.8；95％可信限(1.7-8.7))，酒精摄入量≥30g/天(OR＝2.1；95％可信限(1.0-4.6))，接触年龄≥25(OR＝4.0；95％可信限(1.9-8.4))，活性≥A2(OR＝7.5；95％可信限(3.5-16.1))相关。因此在日大麻吸入量与纤维化进程存在因果联系。

表3大麻消耗量对纤维化进程的影响。

大麻	纤维化进程速度＞0.08/年	p
大麻	纤维化进程速度＞0.08/年	p	无，n＝102(52％)	43(42％)
偶尔，n＝30(16％)	15(50％)	0.029	无，n＝102(52％)	43(42％)
偶尔，n＝30(16％)	15(50％)	0.029	每天，n＝63(32％)	40(63％)

实施例4：在CB1受体拮抗剂存在时肝成肌纤维细胞培养

人肝成肌纤维细胞的分离和培养

根据先前的报道，从良性或恶性肝肿瘤的外科手术中获得正常肝脏的手术标本，从由其制备的外植物的培养物中获得人肝成肌纤维细胞。本操作的实施符合法国立法的伦理准则。细胞在含10％血清(5％胎牛血清和5％人血清，DMEM5/5)的Dulbecco′s改良Eagle′s培养基(DMEM)中培养，并采用第三代到第七代之间的培养细胞。除特别提示外，实验所应用的细胞是通过在无血清的Waymouth培养基培养48小时获得的静止期细胞。

小鼠肝成肌纤维细胞的分离和培养

根据报道，通过胶原酶灌注和在Nicodenz内进行密度梯度纯化分离小鼠成肌纤维细胞。分离后，在含20％胎牛血清的DMEM培养基中培养细胞。第1天，通过冲洗去除细胞碎片和非粘附细胞，然后继续在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养细胞。采用第3到第9代的细胞。

细胞凋亡检测

根据Davaille，J.等在生物化学杂志(J Biol Chem)2002年卷277(40)37323-30页和Li，L.等在生物化学杂志(J Biol Chem)2001年卷276(41)：38152-8页报道的方法，对贴壁过夜生长于DMEM5/5培养基，血清饥饿48小时的非融合细胞进行细胞凋亡分析。用DAP1染色进行核形态学分析，以AC-DEVD-AFC为底物，分析细胞溶解物的Caspase-3样活性。应用琼脂糖凝胶电泳分析DNA梯度片段(DNA laddering)，总DNA用Apoptotic DNA Ladder试剂盒提取。

细胞存活能力

细胞(96孔板中7,000个细胞/孔)贴壁过夜生长于DMEM5/5培养基，在不含酚红的DMEM中血清饥饿48小时，用效应指示物处理16小时。每孔内加CellTiter 96 AQueous One Solution试剂，记录在490nm处的吸收值。

DNA合成的测定

根据先前报道(Tao，J.等，生物化学杂志(J Biol Chem)，1999年卷274(34)：23761-23769页)，用[³H]胸腺嘧啶掺入法在一式三份的孔中测定DNA合成。融合的人肝成肌纤维细胞血清饥饿48小时，用20ng/ml PDGF-BB进一步刺激30小时。融合的鼠肝成肌纤维细胞在0.1％BSA存在的情况下血清饥饿24小时，在0.01％BSA存在的情况下用20ng/ml PDGF-BB进一步刺激30小时。在孵育的最后24小时加入[³H]胸腺嘧啶(0.5μCi/孔)。

按照实施例1所描述的方法处理细胞培养物。人和小鼠的肝成肌纤维细胞都暴露在CB1受体拮抗剂SR141716增高剂量下，并测定肝成肌纤维细胞的DNA合成。

在人肝成肌纤维细胞中，20ng/ml的PDGF-BB引起SR141716剂量依赖性抑制的DNA合成(图3A)。当化合物的浓度在300-400nM时，出现最大半数抑制。

在分离于野生型小鼠的肝成肌纤维细胞中，SR141716也抑制由20ng/ml的PDGF-BB引起的DNA的合成，但是，其只轻微影响CB1-/-细胞的增殖(图3B)。

这些结果说明CB1拮抗剂SR141716导致人和小鼠的肝成肌纤维细胞生长受限，并且是通过CB1受体起作用的。

实施例5：SR141716对被诱导的肝硬化的治疗效果评价

对CB1受体拮抗剂SR141716在通过四氯化碳的慢性中毒诱导出的肝纤维化实验模型上的抗纤维化潜力进行了评估。

施药

SR141716(10mg/每kg体重)用前溶解在赋形剂溶液里(含10％二甲亚砜和5％乙醇的PBS10ml中加入2滴Tween 80)并做超声处理。

动物和实验设计

CD1小鼠来自Janvier(法国)。所有的实验都根据伦理准则进行操作。采用36只10-12周大的雄性小鼠，动物分为以下各组：赋形剂治疗的橄榄油组(n＝3)；赋形剂治疗的四氯化碳组(n＝14)；SR141716治疗的橄榄油组(n＝3)；SR141716治疗的四氯化碳组(n＝16)。动物被放置于控制温度和湿度的房间内，保持12小时光亮和黑暗的循环，不限制食物和水的供应，除非另有提示。施予四氯化碳(CCl₄)(Sigma，St Quentin-Fallavier，法国)和橄榄油的混合物(1∶10体积比)按0.5ml/公斤体重，一周两次腹膜内注射1个月，诱导纤维化。SR141716或赋形剂每天通过腹膜内注射施药。在四氯化碳(CCl₄)注射前7天开始治疗并一直持续贯穿于CCl₄处理的过程。

CCl₄和赋形剂(包括10％DMSO，5％乙醇，0.1％Tween 80的PBS)联合施药在1个月后引起大量的达到组群的50％的死亡率(图4)。与此相对照的是，CCl₄和10mg/kg的SR141716联合施药在1个月时却有更高的存活率(83％)。空白对照动物没有死亡，不论是用SR141716或赋形剂进行处理。

因此，这些结果都表明了CB1受体拮抗剂SR141716的肝保护的作用。

实施例6：在治疗肝纤维化中SR141716口服给药的最优疗法的评价

为了确定SR141716长期治疗的最优条件，实施了以下研究。

40只雄性CD1小鼠分为以下各组：空白组(橄榄油，n＝3)；CCl₄组(n＝12)；SR141716治疗的空白组(橄榄油，n＝3)；2组SR141716治疗的CCl₄组(n＝2×12)。动物被放置于控制温度和湿度的房间内，保持12小时光亮和黑暗的循环，不限制食物和水的供应，除非另有提示。施予四氯化碳(CCl₄)(Sigma，St Quentin-Fallavier，法国)和橄榄油的混合物(1∶10体积比)按0.5ml/公斤体重，腹膜内注射(IP)，一周两次诱导纤维化。CCl₄空白组的动物给予橄榄油。SR141716以65mg/kg的浓度包含在RM1鼠食中(DIETEX，法国)，施予SR141716治疗组。假定一只30g的小鼠每天吃5g的食物，SR141716施药的最后期望剂量是10mg/kg。SR141716的治疗既可在四氯化碳(CCl₄)注射前的7天开始(12只小鼠)，也可在第一次注射四氯化碳(CCl₄)后开始(12只小鼠)，且持续贯穿整个四氯化碳处理过程。5周后，动物禁食过夜，在接受最后一次CCl₄注射48小时后被处死。肝脏标本取自几个肝叶并且进行1)在液氮中快速冷冻并在RNA提取液中均质化，或2)在水中均质化，在液氮中快速冷冻用于羟脯氨酸测定，或3)用福尔马林缓冲液固定。快速冷冻标本保存在-80℃待用。血液标本也采集到含惰性胶屏障和促凝剂盘的硅树脂管内(Venoject，Terumo，法国)，通过离心分离血清，保存在-20℃待用。结果用于评估治疗上可接受毒性的浓度。

序列表

<110>因瑟姆公司

萨诺飞阿文蒂斯公司

<120>一种CB1受体拮抗剂在制备有益于肝疾治疗的组合物中的应用

<130>CB1

<150>EP04290633

<151>2004-03-09

<160>9

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>472

<212>PRT

<213>人

<400>1

Met Lys Ser Ile leu Asp Gly Leu Ala Asp Thr Thr Phe Arg Thr Ile

1 5 10 15

Thr Thr Asp Leu Leu Tyr Val Gly Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Glu Asp

20 25 30

Ile Lys Gly Asp Met Ala Ser Lys Leu Gly Tyr Phe Pro Gln Lys Phe

35 40 45

Pro Leu Thr Ser Phe Arg Gly Ser Pro Phe Gln Glu Lys Met Thr Ala

50 55 60

Gly Asp Asn Pro Gln Leu Val Pro Ala Asp Gln Val Asn Ile Thr Glu

65 70 75 80

Phe Tyr Asn Lys Ser Leu Ser Ser Phe Lys Glu Asn Glu Glu Asn Ile

85 90 95

Gln Cys Gly Glu Asn Phe Met Asp Ile Glu Cys Phe Met Val Leu Asn

100 105 110

Pro Ser Gln Gln Leu Ala Ile Ala Val Leu Ser Leu Thr Leu Gly Thr

115 120 125

Phe Thr Val Leu Glu Asn Leu Leu Val Leu Cys Val Ile Leu His Ser

130 135 140

Arg Ser Leu Arg Cys Arg Pro Ser Tyr His Phe Ile Gly Ser Leu Ala

145 150 155 160

Val Ala Asp Leu Leu Gly Ser Val Ile Phe Val Tyr Ser Phe Ile Asp

165 170 175

Phe His Val Phe His Arg Lys Asp Ser Arg Asn Val Phe Leu Phe Lys

180 185 190

Leu Gly Gly Val Thr Ala Ser Phe Thr Ala Ser Val Gly Ser Leu Phe

195 200 205

Leu Thr Ala Ile Asp Arg Tyr Ile Ser Ile His Arg Pro Leu Ala Tyr

210 215 220

Lys Arg Ile Val Thr Arg Pro Lys Ala Val Val Ala Phe Cys Leu Met

225 230 235 240

Trp Thr Ile Ala Ile Val Ile Ala Val Leu Pro Leu Leu Gly Trp Asn

245 250 255

Cys Glu Lys Leu Gln Ser Val Cys Ser Asp Ile Phe Pro His Ile Asp

260 265 270

Glu Thr Tyr Leu Met Phe Trp Ile Gly Val Thr Ser Val Leu Leu Leu

275 280 285

Phe Ile Val Tyr Ala Tyr Met Tyr Ile Leu Trp Lys Ala His Ser His

290 295 300

Ala Val Arg Met Ile Gln Arg Gly Thr Gln Lys Ser Ile Ile Ile His

305 310 315 320

Thr Ser Glu Asp Gly Lys Val Gln Val Thr Arg Pro Asp Gln Ala Arg

325 330 335

Met Asp Ile Arg Leu Ala Lys Thr Leu Val Leu Ile Leu Val Val Leu

340 345 350

Ile Ile Cys Trp Gly Pro Leu Leu Ala Ile Met Val Tyr Asp Val Phe

355 360 365

Gly Lys Met Asn Lys Leu Ile Lys Thr Val Phe Ala Phe Cys Ser Met

370 375 380

Leu Cys Leu Leu Asn Ser Thr Val Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Leu Arg

385 390 395 400

Ser Lys Asp Leu Arg His Ala Phe Arg Ser Met Phe Pro Ser Cys Glu

405 410 415

Gly Thr Ala Gln Pro Leu Asp Asn Ser Met Gly Asp Ser Asp Cys Leu

420 425 430

His Lys His Ala Asn Asn Ala Ala Ser Val His Arg Ala Ala Glu Ser

435 440 445

Cys Ile Lys Ser Thr Val Lys Ile Ala Lys Val Thr Met Ser Val Ser

450 455 460

Thr Asp Thr Ser Ala Glu Ala Leu

465 470

<210>2

<211>411

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Ala Leu Gln Ile Pro Pro Ser Ala Pro Ser Pro Leu Thr Ser Cys

1 5 10 15

Thr Trp Ala Gln Met Thr Phe Ser Thr Lys Thr Ser Lys Glu Asn Glu

20 25 30

Glu Asn Ile Gln Cys Gly Glu Asn Phe Met Asp Ile Glu Cys Phe Met

35 40 45

Val Leu Asn Pro Ser Gln Gln Leu Ala Ile Ala Val Leu Ser Leu Thr

50 55 60

Leu Gly Thr Phe Thr Val Leu Glu Asn Leu Leu Val Leu Cys Val Ile

65 70 75 80

Leu His Ser Arg Ser Leu Arg Cys Arg Pro Ser Tyr His Phe Ile Gly

85 90 95

Ser Leu Ala Val Ala Asp Leu Leu Gly Ser Val Ile Phe Val Tyr Ser

100 105 110

Phe Ile Asp Phe His Val Phe His Arg Lys Asp Ser Arg Asn Val Phe

115 120 125

Leu Phe Lys Leu Gly Gly Val Thr Ala Ser Phe Thr Ala Ser Val Gly

130 135 140

Ser Leu Phe Leu Thr Ala Ile Asp Arg Tyr Ile Ser Ile His Arg Pro

145 150 155 160

Leu Ala Tyr Lys Arg Ile Val Thr Arg Pro Lys Ala Val Val Ala Phe

165 170 175

Cys Leu Met Trp Thr Ile Ala Ile Val Ile Ala Val Leu Pro Leu Leu

180 185 190

Gly Trp Asn Cys Glu Lys Leu Gln Ser Val Cys Ser Asp Ile Phe Pro

195 200 205

His Ile Asp Glu Thr Tyr Leu Met Phe Trp Ile Gly Val Thr Ser Val

210 215 220

Leu Leu Leu Phe Ile Val Tyr Ala Tyr Met Tyr Ile Leu Trp Lys Ala

225 230 235 240

His Ser His Ala Val Arg Met Ile Gln Arg Gly Thr Gln Lys Ser Ile

245 250 255

Ile Ile His Thr Ser Glu Asp Gly Lys Val Gln Val Thr Arg Pro Asp

260 265 270

Gln Ala Arg Met Asp Ile Arg Leu Ala Lys Thr Leu Val Leu Ile Leu

275 280 285

Val Val Leu Ile Ile Cys Trp Gly Pro Leu Leu Ala Ile Met Val Tyr

290 295 300

Asp Val Phe Gly Lys Met Asn Lys Leu Ile Lys Thr Val Phe Ala Phe

305 310 315 320

Cys Ser Met Leu Cys Leu Leu Asn Ser Thr Val Asn Pro Ile Ile Tyr

325 330 335

Ala Leu Arg Ser Lys Asp Leu Arg His Ala Phe Arg Ser Met Phe Pro

340 345 350

Ser Cys Glu Gly Thr Ala Gln Pro Leu Asp Asn Ser Met Gly Asp Ser

355 360 365

Asp Cys Leu His Lys His Ala Asn Asn Ala Ala Ser Val His Arg Ala

370 375 380

Ala Glu Ser Cys Ile Lys Ser Thr Val Lys Ile Ala Lys Val Thr Met

385 390 395 400

Ser Val Ser Thr Asp Thr Ser Ala Glu Ala Leu

405 410

<210>3

<211>20

<212>PRT

<213>人

<400>3

Phe Arg Thr Ile Thr Thr Asp Leu Leu Tyr Val Gly Ser Asn Asp Ile

1 5 10 15

Gln Tyr Glu Asp

20

<210>4

<211>23

<212>PRT

<213>人

<400>4

Asp Met Ala Ser Lys Leu Gly Tyr Phe Pro Gln Lys Phe Pro Leu Thr

1 5 10 15

Ser Phe Arg Gly Ser Pro Phe

20

<210>5

<211>20

<212>PRT

<213>人

<400>5

Thr Glu Phe Tyr Asn Lys Ser Leu Ser Ser Phe Lys Glu Asn Glu Glu

1 5 10 15

Asn Ile Gln Cys

20

<210>6

<211>20

<212>PRT

<213>人

<400>6

Arg Met Ile Gln Arg Gly Thr Gln Lys Ser Ile Ile Ile His Thr Ser

1 5 10 15

Glu Asp Gly Lys

20

<210>7

<211>12

<212>PRT

<213>人

<400>7

Val Tyr Asp Val Phe Gly Lys Met Asn Lys Leu Ile

1 5 10

<210>8

<211>20

<212>PRT

<213>人

<400>8

His Lys His Ala Asn Asn Ala Ala Ser Val His Arg Ala Ala Glu Ser

1 5 10 15

Cys Ile Lys Ser

20

<210>9

<211>20

<212>PRT

<213>人

<400>9

His Lys His Ala Asn Asn Thr Ala Ser Met His Arg Ala Ala Glu Ser

1 5 10 15

Cys Ile Lys Ser

20

Claims

1.一种CB1受体的拮抗剂在制备治疗肝病的组合物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于CB1受体拮抗剂是一种特殊的CB1受体拮抗剂。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述肝病导致肝纤维化。

4.根据权利要求1-3所述的应用，其特征在于所述肝病是酒精性肝硬化。

5.根据权利要求1-3的所述应用，其特征在于所述肝病是慢性病毒性肝炎。

6.根据权利要求1-3所述的应用，其特征在于所述肝病是非酒精性的脂肪性肝炎。

7.根据权利要求1-3所述的应用，其特征在于所述肝病是原发性肝癌。

8.根据权利要求1-7所述的应用，其特征在于拮抗剂是一种结构式II的化合物或其在制药学上可以接受的盐之一，其中，g₂、g₃、g₄、g₅和g₆以及w₂、w₃、w₄、w₅和w₆是等同或不同的，并且分别是氢、一个氯原子或溴原子、一个(C₁-C₃)烷基、一个(C₁-C₃)烷氧基、一个三氟甲基或一个硝基基团，g₄可以选择性地为一个苯基基团；R₄是氢或一个(C₁-C₃)烷基；X可以是一个直接键或是一个-(CH₂)_x-N(R₃)-基团，其中R₃是氢或一个(C₁-C₃)烷基，x是0或1；R是一个-NR₁R₂基团，其中R₁和R₂各自是一个(C₁-C₆)烷基；一个被选择性地取代的非芳香族的(C₃-C₁₅)碳环基，所述的取代物不是取代羰基；一个氨基(C₁-C₄)烷基基团，其中氨基可以被一个(C₁-C₃)烷基选择性地双取代；一个环烷基(C₁-C₃)烷基，其中环烷基是C₃-C₁₂；一个非取代的或被一个卤素、一个(C₁-C₅)烷基或一个(C₁-C₅)烷氧基单取代或多取代的苯基；一个苯基(C₁-C₃)烷基；一个双苯基(C₁-C₃)烷基；一个萘基；一个蒽基；一个不被取代的或被一个(C₁-C₃)烷基、一个羟基或一个苄基取代的饱和的5到8个原子数的杂环基，一个1-金刚烷甲基；一个不被取代的或被一个卤素、一个(C₁-C₅)烷基或一个(C₁-C₅)烷氧基单取代或多取代的芳香族杂环；被一个芳香族杂环取代的(C₁-C₃)烷基，其中的芳香族杂环不被取代或被一个卤素、一个(C₁-C₅)烷基或一个(C₁-C₅)烷氧基单取代或多取代；或者，R₁是氢，R₂如上所定义；或者，R₁和R₂与它们结合的氮原子组成一个饱和的5到8个原子数的杂环基，当w₂、w₃、w₄、w₅、w₆、g₂、g₃、g₄、g₅和g₆都是氢时，所述的杂环基不是吗啉；当X是-(CH₂)_XN(R₃)-时，一个如上所定义的R₂基；一个R₅基，当X是一个直接键时，R₅是一个(C₁-C₃)烷基；一个不被取代或被一个(C₁-C₅)烷基取代的(C₃-C₁₂)环烷基；一个不被取代或被一个卤素或一个(C₁-C₅)烷基所取代的苯基(C₁-C₃)烷基；一个环烷基(C₁-C₃)烷基，其中环烷基是C₃-C₁₂，其不被取代或被一个(C₁-C₅)烷基所取代；或者一个2-降莰基甲基。

9.根据权利要求1-7所述的应用，其特征在于所述拮抗剂是N-哌啶酮-3-吡唑甲酰胺或是其在药物学上可接受的一种盐。

10.根据权利要求1-7所述的应用，其特征在于所述拮抗剂是N-哌啶-5-(4-对溴苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-乙基吡唑-3-甲酰胺或是其在药物学上可接受的一种盐。

11.根据权利要求1-7所述的应用，其特征在于所述拮抗剂是N-哌啶-5-(4-对氯苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡唑-3-甲酰胺或是其在药物学上可接受的一种盐。

12.根据上述任何一权利要求的应用，其特征在于所述CB1受体选自由下述组成的组：

c)具有序列1或序列2的氨基酸序列，具有G蛋白偶联细胞受体的生物学功能，能够结合THC并传导细胞信号的由等位基因编码的蛋白；

f)具有包括序列3、序列4、序列5、序列6、序列7、序列8和序列9的氨基酸序列或与它们80％同源的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有G蛋白偶联细胞受体的生物学功能，能够结合THC并传导细胞信号的蛋白质。

13.根据权利要求1-11项所述的应用，其特征在于所述CB1受体是一个与序列1在氨基酸水平上同源性至少为45％，具有G蛋白偶联细胞受体的生物学功能，能够结合THC并传导细胞信号的蛋白质。

14.根据前一项权利要求所述的应用，其特征在于同源性至少为60％，优选70％，更为优选的是80％，又更为优选的是90％，更为优选的是95％。

15.根据上述任何一权利要求的应用，其特征在于CB1受体拮抗剂的每日剂量从0.01mg到500mg，优选为1mg到100mg。

16.编码包括序列1或序列2或序列1的一部分或序列2的一部分的蛋白的核苷酸在制备通过下调或抑制CB1受体来治疗肝病的组合物中的应用。

17.一种治疗哺乳动物肝病的方法，包括将治疗有效剂量的至少其中的一种CB1受体拮抗剂给药于需要的哺乳动物。

18.根据权利要求17所述的治疗肝病的方法，其特征在于CB1受体拮抗剂是具有结构式II的化合物或其在药物学上可接受的盐之一，其中，g₂、g₃、g₄、g₅和g₆以及w₂、w₃、w₄、w₅和w₆是等同或不同的，并且分别是氢、一个氯原子或溴原子、一个(C₁-C₃)烷基、一个C₁-C₃)烷氧基、一个三氟甲基或一个硝基基团，g₄可以选择性地为一个苯基基团；R₄是氢或一个(C₁-C₃)烷基；X可以是一个直接键或是一个-(CH₂)_x-N(R₃)-基团，其中R₃是氢或一个(C₁-C₃)烷基，x是0或1；R是一个-NR₁R₂基团，其中R₁和R₂各自是一个(C₁-C₆)烷基；一个被选择性地取代的非芳香族的(C₃-C₁₅)碳环基，所述的取代基不是取代羰基；一个氨基(C₁-C₄)烷基基团，其中氨基可以被一个(C₁-C₃)烷基选择性地双取代；一个环烷基(C₁-C₃)烷基其中环烷基是C₃-C₁₂；一个非取代的或被一个卤素、一个(C₁-C₅)烷基或一个(C₁-C₅)烷氧基单取代或多取代的苯基；一个苯基(C₁-C₃)烷基；一个双苯基(C₁-C₃)烷基；一个萘基；一个蒽基；一个不被取代的或被一个(C₁-C₃)烷基、一个羟基或一个苄基取代的饱和的5到8个原子数的杂环基，一个1-金刚烷甲基；一个不被取代的或被一个卤素、一个(C₁-C₅)烷基或一个(C₁-C₅)烷氧基单取代或多取代的芳香族杂环；被一个芳香族杂环取代的(C₁-C₃)烷基，其中的芳香族杂环不被取代或被一个卤素、一个(C₁-C₅)烷基或一个(C₁-C₅)烷氧基单取代或多取代；或者，R₁是氢，R₂如上所定义；或者，R₁和R₂与它们结合的氮原子组成一个饱和的5到8个原子数的杂环基，当w₂、w₃、w₄、w₅、w₆、g₂、g₃、g₄、g₅和g₆都是氢时，所述的杂环基不是吗啉；当X是-(CH₂)_xN(R₃)-时，一个如上所定义的R₂基；一个R₅基，当X是一个直接键时，R₅是一个(C₁-C₃)烷基；一个不被取代或被一个(C₁-C₅)烷基取代的(C₃-C₁₂)环烷基；一个不被取代或被一个卤素或一个(C₁-C₅)烷基所取代的苯基；一个环烷基(C₁-C₃)烷基，其中环烷基是C₃-C₁₂，其不被取代或被一个(C₁-C₅)烷基所取代；或者一个2-降莰基甲基。

19.根据权利要求17所述的治疗肝病的方法，其特征在于所述CB1受体拮抗剂是N-哌啶酮-3-吡唑甲酰胺或是其在药物学上可接受的一种盐。

20.根据权利要求17所述的治疗肝病的方法，其特征在于所述CB1受体拮抗剂是N-哌啶-5-(4-对溴苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-乙基吡唑-3-甲酰胺或是其在药物学上可接受的一种盐。

21.根据权利要求17所述的治疗肝病的方法，其特征在于所述CB1受体拮抗剂是N-哌啶-5-(4-对氯苯基)-1-(2，4-二氯苯基)-4-甲基吡唑-3-甲酰胺或是其在药物学上可接受的一种盐。

22.根据权利要求17-21所述的治疗肝病的方法，其特征在于所述肝病是肝纤维化。

23.根据权利要求17-21所述的治疗肝病的方法，其特征在于所述肝病是酒精性肝硬化。

24.根据权利要求17-21所述的治疗肝病的方法，其特征在于所述肝病是慢性病毒性肝炎。

25.根据权利要求17-21所述的治疗肝病的方法，其特征在于所述肝病是非酒精性的脂肪性肝炎。

26.根据权利要求17-21所述的治疗肝病的方法，其特征在于所述肝病是原发性肝癌。

27.根据权利要求17-26所述的治疗肝病的方法，其特征在于所述CB1受体拮抗剂的每日剂量从0.01mg到500mg，优选为1mg到100mg。