CN1643136A - 人肝细胞增殖方法和人肝细胞的获取方法 - Google Patents

人肝细胞增殖方法和人肝细胞的获取方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及人肝细胞增殖方法和人肝细胞的获取方法，通过将人肝细胞移植到免疫缺陷肝损伤小鼠的肝脏中，在防御来自人肝细胞产生的人补体的攻击的状态下，对人肝细胞移植小鼠进行饲养，使移植的人肝细胞在小鼠肝脏中大量增殖。进一步利用这样增殖的人肝细胞反复进行上述操作，可以得到大量的人肝细胞。

Description

人肝细胞增殖方法和人肝细胞的获取方法
技术领域
本申请发明涉及到在小鼠体内使人肝细胞增殖的方法，肝脏内含有人肝细胞的嵌合小鼠，由嵌合小鼠获取人肝细胞的方法以及通过该方法获取的人肝细胞。由这样操作从嵌合小鼠得到的人肝细胞成为肝细胞试剂盒和体外人工肝脏的材料。
背景技术
肝脏具有500多种以上的多种多样的特异功能。作为肝脏的主要功能如血浆蛋白质的合成分泌、通过糖异生和糖原代谢进行血糖调节、脂质合成、尿素合成、胆汁合成分泌、解毒等。
摄入到体内的很多物质在肝脏中代谢。在医药品开发的领域中，医药品候补物质在肝脏受到什么样的代谢，对肝脏和其他脏器或组织有什么样影响等是必需的资料。另外，到目前为止，很多化学物质被合成也释放到环境。阐明这些物质每一个、或复合后对人体有什么样的影响对于社会也是非常重要的，对于这样的化学物质对人体的影响的评价中也需要对肝功能的毒性试验。
在以医药品候补物质为首的化学物质的安全性试验和药物代谢试验中，目前可以使用小鼠、大鼠、兔、狗、猴等。特别在医药品开发中，在进入以人为对象的第一相试验之前，有义务使用动物进行毒性试验和安全性试验，试验需要大量的时间和劳力，投资额也巨大。
然而，通过这些动物实验得到的资料不能保证直接可以应用于人。事实上，在动物实验中认为没有毒性的物质对人表现出毒性的事例很多，而相反的场合也有。因此，到目前为止，很多医药品候补物质在进入以人为对象的第一相试验后处于开发中止，而在动物实验中由于毒性强在进入临床试验前变成开发中止的物质中实际上认为对人没有毒性的个案也存在很多。
人们认为这起因于人的肝脏中的代谢功能和小鼠或大鼠的肝脏的代谢功能不同。最近，已经可以使用人肝细胞进行体外代谢试验或毒性试验了。可是，从通过不能用于移植的脑死亡患者的肝脏或肿瘤摘出等的切除肝得到的人肝细胞的量远远低于需要。因此，人肝细胞的增殖技术的开发在医药品开发中非常必要。
而大量的人肝细胞的必要性在体外型人工肝脏中也同样。人工肝脏是通过人工方式代行肝脏功能的医疗装置，将吸附、透析、过滤等依据物理化学原理的人工作用和通过摘出肝或肝组织的灌流产生的生物学作用组合的混合型人工肝脏的开发正全力进行着。在进行这样的人工肝脏开发时，在用于使物理化学方面的功能提高的膜或回路的性能提高的同时，可适用于人的大量肝细胞的供给是不可缺的。
然而，人的肝细胞到目前为止一直认为对成熟个体分离的原代细胞进行传代培养是不可能的。即，因为对于粘附依赖性的成熟肝细胞，为了进行该细胞的传代操作从培养基质进行剥离时会造成很大损伤，再使他粘附培养基质更困难。与此相反，本申请发明人发明了从由人肝脏分离的正常肝细胞分离具有克隆性的增殖能力的小型肝细胞，对该小型肝细胞进行原代培养，再将该培养肝细胞进行传代培养之后使肝细胞增殖的方法，获得了专利(特开平08-112092号公报；日本专利第3266766号；美国专利第6,004,810号、特开平10-179148号公报；日本专利第3211941号、特开平7-274951公报；日本专利第3157984号、特开平9-313172号公报；日本专利第3014322号)。
该专利发明的方法是提供用于在体外使肝细胞增殖，得到大量人肝细胞的新的手段的方法，但存在着在长期的传代培养中几种肝功能下降的问题。由于这一原因，虽然作为例如维持肝功能的药剂的筛选体系，或就长期传代培养后仍保存的特定功能进行药剂的毒性或药效进行试验的体系是有用的，但作为代替人肝功能的肝细胞，或作为混合型人工肝脏的材料还存在不充分的地方。
作为用于消除在体外的肝细胞增殖中的上述那样问题的手段，有人提出了在动物个体内(in vivo)使肝细胞增殖的方法。
例如，Heckel等人制作了清蛋白尿激酶型纤溶酶激活物转基因小鼠(uPA-Tg小鼠)。在该小鼠中，尿激酶型纤溶酶激活物(uPA)基因与清蛋白的增强子和启动子连接，合成对肝脏特异作用的uPA蛋白(HeckelJL，Sandgren EP，Degen JL，Palmiter RD，and Brinser RL.Neonatalbleeding in transgenic mice expressing urokinase-typeplasminogen activator.Cell 62：447-456，1990)。肝细胞被uPA损伤，肉眼看呈白色，也观察到由于出血或肝衰竭而死亡的个体。如果从该小鼠的脾脏移植lac转基因小鼠的正常肝细胞，可知在肝脏活存和增殖，最终被供体肝细胞置换(Rhim JA，Sandgren EP，Degen JL，PalmiterRD，and Brinster RL.Replacement of diseased mouse liver by hepaticcell transplantation.Science 263：1149-1152，1994)。另外，Rhim等人使uPA-Tg小鼠和由于先天缺损胸腺而不具有T细胞功能的NUDE小鼠交配，制作uPA-Tg/NUDE小鼠。通过向uPA-Tg/NUDE小鼠移植大鼠的肝细胞，制作带有大鼠肝细胞的小鼠(Rhim JA，Sandgren EP，PalmiterRD and Brinster RL.Complete reconstitution of mouse liver withxenogeneic hepatocytes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：4942-4946，1995)。然而，使用该小鼠的带有人肝细胞的嵌合小鼠的报告还没有。
Dandri等人使uPA-Tg小鼠和具有免疫缺陷性质的敲除小鼠Rag2小鼠交配，制作uPA-Tg/Rag2小鼠。向uPA-Tg(+/-)/Rag2小鼠移植由人肝脏採取的人肝细胞，显示出小鼠肝脏的15％被置换。他们成功地使B型肝炎病毒感染了该小鼠(Dandri M，Burda MR，Torok B，PollokJM，Iwanska A，Sommer G，Rogiers X，Rogler CE，Gupta S，Will H，GretenH，and Petersen J.Repopulation of mouse liver with humanhepatocytes and in vivo infection with hepatitis Bvirus.Hepatology 33：981-988，2001)。
另外，本申请发明人公布了在先前专利申请的发明(特开2002-45087号公报)中，向作为免疫缺陷小鼠的SCID小鼠与uPA-Tg交配得到的uPA-Tg/SCID小鼠移植人肝细胞，该移植肝细胞实质上承担着小鼠的肝功能的嵌合小鼠。先前申请发明的嵌合小鼠由于通过uPA基因的表达造成小鼠肝细胞功能缺陷，所以该肝功能被移植的人肝细胞保持。因此，可以正确评价移植的人肝细胞的个体内功能，作为用于对被检测物质的毒性和药效进行判定的实验动物个体是非常有用的。然而，对于先前申请发明的嵌合小鼠，人肝细胞移植后不能生存50天以上，另外由于在成长过程中正常化的小鼠肝细胞增殖，移植人肝细胞的增殖效率低，人肝细胞的置换率停止在约50％程度。
这种现象也可以通过最近的Mercer等人的报告(MercerDF，Schiller DE，Eliiott JF，Douglus DF，Hao C，Ricnfret A，AddisonWR，Fischer KP，Churchill TA，Lakey JRT，Tyrrell DLJ and KetemanNM.Hepatits C virus replication in mice with chimeric humanlivers.Repopulation of mouse liver with human hepatocytes and invivo infection with hepatitis B virus.Nature Medicine7：927-933，2001)证实。Mercer等人报告了与本申请发明人同样制作uPA-Tg/SCID，将冷冻保存的人肝细胞融解后进行移植，结果在小鼠血清中检测到2mg/ml以下的人清蛋白  (换算成血液中约1mg/ml以下)，约50％肝脏被人肝细胞置换。
如上所述，将人肝细胞移植到免疫缺陷肝损伤小鼠(uPA-Tg/SCID小鼠)，制作嵌合小鼠虽然在该嵌合小鼠本身中存在有用性(例如，对人肝细胞的毒性和药效的体内试验等)，但作为用于在小鼠个体内使移植肝细胞大量增殖的手段并不充分。
另外，由于移植了人肝细胞的嵌合小鼠不能长期生存，而且在成长过程中小鼠肝细胞增殖，作为对人肝细胞的毒性和药效的体内评价体系其利用对象被限定。
本申请发明作为课题提供用于在体内使人肝细胞充分增殖的改良方法作为人肝细胞的增殖方法。
另外作为课题也提供对通过长期生存在小鼠体内增殖的人肝细胞进行分离、回收的方法。
另外，作为课题还提供通过将分离的人肝细胞移植到许多小鼠中，在小鼠体内使人肝细胞增殖，可以大量获取在体内保持一定规格的人肝细胞的嵌合小鼠，可以大量获取从该小鼠中分离的一定规格的人肝细胞的方法。
另外，作为课题提供分离的肝细胞的利用方法。
另外，本申请作为课题也提供用于实施上述各个发明的单克隆抗体以及产生该单克隆抗体的新的杂交瘤细胞株。
发明内容
本申请作为解决上述课题的第1发明提供一种人肝细胞增殖方法，其特征是：通过将人肝细胞移植到免疫缺陷肝损伤小鼠的肝脏中，在防御来自人肝细胞产生的人补体的攻击的状态下，对人肝细胞移植小鼠进行饲养，使移植的人肝细胞在小鼠肝脏中增殖。
在第1发明的方法中，其中防御来自人补体的攻击的状态作为优选状态至少是以下的(a)和(b)中一种状态。
(a)至少投给人肝细胞移植小鼠1次补体抑制剂；
(b)作为免疫缺陷肝损伤小鼠，使用免疫缺陷肝损伤小鼠和衰变加速因子(decayaccelerating factor)(DAF/CD55)转基因小鼠交配后得到的后代小鼠。
在第1发明的方法中，作为优选的状态，其中免疫缺陷肝损伤小鼠是遗传性免疫缺陷小鼠和遗传性肝损伤小鼠交配后得到的后代小鼠。另外，作为各个优选状态，后代小鼠是半合子免疫缺陷肝损伤小鼠，而且在将肝细胞增殖抑制物质投给半合子免疫缺陷肝损伤小鼠后，进行人肝细胞移植。
在第1发明的方法中以及其优选的状态中，作为另外的一种优选状态是将抗小鼠Fas抗体投给移植了人肝细胞的免疫缺陷肝损伤小鼠。
在第1发明的方法中，也可以将移植到免疫缺陷肝损伤小鼠的肝细胞是增殖性人肝细胞，其增殖性人肝细胞是被特异识别形成集落增殖的人肝细胞的单克隆抗体识别的人肝细胞，而且单克隆抗体是小鼠-小鼠杂交瘤K8223(FERM BP-8334)产生的单克隆抗体作为各自的优选状态。
作为第2发明，本申请提供人肝细胞大量增殖方法，其特征是由以下步骤(1)～(3)构成，并且将步骤(2)和(3)重复一次以上。
(1)通过将人肝细胞移植到免疫缺陷肝损伤小鼠的肝脏，在防御来自人肝细胞产生的人补体的攻击的状态下对人肝细胞移植小鼠进行饲养，使移植的人肝细胞在小鼠肝脏中增殖的步骤；
(2)从小鼠肝脏分离增殖的人肝细胞的步骤；以及
(3)将分离的人肝细胞移植到免疫缺陷肝损伤小鼠的肝脏，在防御来自人肝细胞产生的人补体的攻击的状态下将人肝细胞移植小鼠饲养50天以上的步骤。
在该第2发明的方法中，作为优选的状态是：在步骤(1)和/或步骤(3)中防御来自人补体的攻击的状态至少是以下的(a)和(b)中的一种状态。
(a)至少投给人肝细胞移植小鼠一次补体抑制剂；
(b)作为免疫缺陷肝损伤小鼠使用免疫缺陷肝损伤小鼠和衰变加速因子(DAF/CD55)转基因小鼠交配后得到的后代小鼠。
在该第2发明的方法中，作为各个优选的状态是：在步骤(1)和/或步骤(3)中，免疫缺陷肝损伤小鼠是遗传性免疫缺陷小鼠和遗传性肝损伤小鼠交配得到的后代小鼠，后代小鼠是半合体免疫缺陷肝损伤小鼠，而且将肝细胞增殖抑制物质投给半合体免疫缺陷肝损伤小鼠后，进行肝细胞移植，
在该第2发明的方法以及上述的优选状态中，在步骤(1)和/或步骤(3)中，也可以将抗Fas抗体投给移植了人肝细胞的免疫缺陷肝损伤小鼠作为另一种理想状态。
另外，在该第2发明的方法中，各个优选的状态是：在步骤(1)和/或步骤(3)中向免疫缺陷肝损伤小鼠进行移植的人肝细胞是增殖性人肝细胞，增殖性人肝细胞是被特异识别形成集落增殖的人肝细胞的单克隆抗体识别的人肝细胞，而单克隆抗体是小鼠-小鼠杂交瘤K8223(FERM BP-8334)产生的单克隆抗体。
在该第2发明的方法中，更为优选的状态是：通过在步骤(2)中至少进行以下的(a)和(b)：
(a)对从小鼠肝脏分离的肝脏组织进行胶原酶处理，以及
(b)对被不识别非人肝细胞，特异识别人肝细胞的单克隆抗体识别的细胞进行分离，中的一种操作，实质上只分离人肝细胞。而在该状态中单克隆抗体是小鼠-小鼠杂交瘤K8216(FERM BP-8333)产生的单克隆抗体。
作为第3发明，本申请提供在肝脏内含有通过上述第1发明或第2发明的方法增殖的人肝细胞的嵌合小鼠。
该第3发明的嵌合小鼠优选的状态是：增殖的人肝细胞占肝脏内细胞的70％以上，和/或具有人型P450活性。
作为第4发明，本申请还提供人肝细胞获取方法，其特征是从上述第3发明的嵌合小鼠的肝脏分离人肝细胞。
在第4发明的方法中，更为优选的状态是：至少进行以下的(a)和(b)：
(a)对从小鼠肝脏分离的肝脏组织进行胶原酶处理，以及
(b)对被不识别非人肝细胞，特异识别人肝细胞的单克隆抗体识别的细胞进行分离，
中的一种操作，实质上只分离人肝细胞。而且在该状态下单克隆抗体是小鼠-小鼠杂交瘤K8216(FERM BP-8333)产生的单克隆抗体。
作为第5发明，本申请还提供通过第4发明的方法获取的人肝细胞。
另外，作为第6发明，本申请还提供含有上述第5发明的人肝细胞的细胞试剂盒。
另外，作为第7发明，本申请还提供充填了上述第5发明的人肝细胞的混合型人工肝脏。
另外，作为第8发明，本申请还提供一种不识别非人肝细胞，特异识别人肝细胞的单克隆抗体。该第8发明的一个例子是小鼠-小鼠杂交瘤K8216(FERM BP-8333)产生的单克隆抗体。
作为第9发明，本申请还提供将候补物质全身投给上述第3发明的嵌合小鼠，试验候补物质的药物动力学或毒性的方法。
以上各发明中的状态和用语、概念在发明的实施方式的说明和实施例中有详细的规定。另外为了实施本发明使用的各种各样的技术，除了明确给出其资料的技术外，只要是同行，根据众所周知的文献都可以容易而且确实地实施。例如，本发明的基因工程和分子生物学技术在Sambrook and Maniatis，in Molecular Cloning-A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，1989；Ausubel，F.M.et al.，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，N.Y，1995等有记载。
附图的简单说明
图1是补体抑制剂对人血清清蛋白浓度的效果的试验结果。
图2是对分别移植了人肝实质细胞和小型肝细胞的小鼠的血中清蛋白浓度进行测定的结果。
图3是补体抑制剂对小鼠体重的效果的试验结果。
图4是将补体抑制剂投给或不投给嵌合小鼠时人补体(hC3a)浓度的比较。
图5是表示小鼠血中人清蛋白浓度和被人肝细胞置换的置换率和功能的相关性的曲线图。
图6是利用人特异的细胞角蛋白8/18抗体染色后的免疫染色图。
图7是利用人特异的细胞角蛋白8/18抗体进行免疫染色的放大图。
图8是移植了人肝细胞的小鼠肝脏微粒体中人特异的CYP2CP的Western blot分析结果。
图9是表示小鼠和供体肝脏的微粒体中的双氯酚酸钠的代谢活性的图。
图10是表示各种各样的人肝细胞置换率的嵌合小鼠肝脏、以及投给了利福平的嵌合小鼠肝脏中的6种人型P450分子的表达量的图。
图11是对进行再移植人肝细胞的小鼠血中人清蛋白浓度进行试验的结果。
图12是将倒千里光碱投给uPA(+/+)SCID小鼠的效果的试验结果。
图13是对将抗小鼠Fas抗体投给人肝细胞嵌合小鼠后的小鼠血中的人清蛋白进行试验的结果。
图14是对各种各样年龄患者採取的肝细胞进行培养时的增殖曲线。
图15是为了制作单克隆抗体，作为抗原使用的培养人肝细胞的相差显微镜照片。
图16是通过荧光抗体观察杂交瘤培养上清(K8223)在人肝细胞中的反应性的照片。
图17是通过FACS对杂交瘤培养上清(No.23)在人肝细胞表面的反应性进行解析的结果。
图18是对与杂交瘤培养上清(No.23)反应的细胞集团(R2)和不反应的细胞集团(R3)分类收集、培养时的相差显微镜照片。
图19是通过FACS对杂交瘤培养上清(No.23)在传代培养人肝细胞表面的反应性进行解析的结果。
图20是通过FACS对杂交瘤培养上清(K8216)在刚分离后的人、小鼠、大鼠肝细胞表面的反应性进行解析的结果。
具体实施方式
第1发明的人肝细胞增殖方法，其特征是：通过将人肝细胞移植到免疫缺陷肝损伤小鼠的肝脏中，在防御来自人肝细胞产生的人补体的攻击的状态下，对人肝细胞移植小鼠进行饲养，使移植的人肝细胞在小鼠肝脏中增殖。
上述的Mercer等人(Nature Medicine 7：927-933，2001)报道了制作免疫缺陷肝损伤小鼠(uPA-Tg/SCID小鼠)，将冷冻保存的人肝细胞融解后移植到小鼠中，结果肝脏的50％左右细胞被人肝细胞置换。然而，Mercer等人制作的人肝细胞移植小鼠不能达到移植的人肝细胞的高置换率。
第1发明的方法通过防止移植的人肝细胞制造的补体攻击小鼠本体，可以使人肝细胞移植小鼠存活50天以上。而且由于使小鼠存活50天以上，可以使小鼠肝脏细胞70％以上置换为人肝细胞。
用于防御来自人补体对接受移植的小鼠的攻击的第1具体手段是给该小鼠注射「补体抑制剂」。作为补体抑制剂可以使用nafamostatmesilate(フサンR；鸟居制药)、gabexate mesilate(FOYR；小野制药)、comostat mesilate(フオイパンR；小野制药)、眼镜蛇毒因子等。另外，这些补体抑制剂是小鼠在细胞移植或脏器移植时使用的药剂。但是，在通常移植手术中，补体抑制剂可以用于防御接受移植的肝脏产生的补体对移植细胞或移植脏器的攻击。另外，在本发明中，由于接受移植小鼠因肝损伤，本身不能产生补体，所以补体抑制剂可以用于防御移植的人肝细胞产生的补体对接受移植的小鼠进行攻击。
用于防御来自人补体对接受移植的小鼠的攻击的第2具体手段是作为接受移植的小鼠，使用免疫缺陷肝损伤小鼠和人衰变加速因子(hDAF/CD55)转基因小鼠交配后得到的后代小鼠。有报道hDAF/CD55转基因小鼠在肾脏、心脏、肺、肝脏等内皮细胞表面高效表达hDAF，对人补体具有抗性能力。(Murakami H，Takahagi Y，Yoshitatsu M，Miyagawa S，Fujimura T，Toyomura K，Shigehisa.T，Shirakura R，and Kinoshita T.Porcine MCP gene promoterdirects high level expression of human DAF(CD55)in transgenic mice.Immunobiology，201：583-597，1999/2000；van Denderen BJW，PearseMJ，Katerelos M，Nottle MB，Du Z-T，Aminian A，Adam WR，Shenoy-Scaria A，Lublin DM，Shinkel TA，and D′Apice AJF.Expression offunctional decay-accelerating factor(CD55)in transgenic mice protectsagainst human complement-mediated attack.Transplantation，61：582-588，1996)。
因此，作为hDAF/CD55转基因小鼠和免疫缺陷肝损伤小鼠的后代动物的接受移植小鼠对于移植人肝细胞产生的人补体有很高的抗性能力。hDAF/CD55转基因小鼠可以根据上述文献(Immunobiology，201：583-597，1999/2000和Transplantation，61：582-588，1996)，使用例如在广泛的各种各样组织、器官中表达的膜辅因子蛋白(MCP)或H2K(b)(MHC class I)的启动子调控下hDAF可以表达那样构建的载体，通过众所周知的转基因小鼠制作方法(例如，Proc.Natl.Acad.Scl.USA 77；7380-7384，1980)进行制作。
在第1发明的人肝细胞增殖方法中使用的「免疫缺陷肝损伤小鼠」是本来的肝细胞受到损伤的「免疫缺陷肝损伤小鼠」，而且是对来自异种动物的细胞不表现出排斥反应的「免疫缺陷小鼠」。因此，免疫缺陷肝损伤小鼠可以通过对同一个小鼠实施肝损伤诱发处置和免疫缺陷处置制作。肝损伤诱发处置可以通过例如众所周知的肝损伤诱发物质(例如，四氯化碳、D-半乳糖胺、2-乙酰氨芴、焦精[染料]生物碱等)进行处理，或外科的肝切除等。而作为免疫缺陷处置，是投给免疫抑制剂或摘出胸腺等。
但在第1发明的方法中，作为优选状态小鼠，使用具有遗传性肝损伤的小鼠和遗传性免疫缺陷小鼠交配后作为后代个体得到的免疫缺陷肝损伤小鼠。作为遗传性肝损伤小鼠例如上述Rhim等人(Science，263，1149(1994))作成的uPA-Tg小鼠。或者使用使肝损伤发生的基因(例如，组织型纤溶酶原激活物基因等)，通过众所周知的转基因法(Proc.Natl.Acad.Scl.USA 77；7380-7384，1980)也可以制作转基因免疫缺陷肝损伤小鼠。另外，通过众所周知的基因寻靶法(Science，244，1288-1292，1989)敲除承担肝功能的基因，也可以得到基因遗传性肝损伤的小鼠。另外，作为遗传性免疫缺陷小鼠可以使用SCID小鼠、NUDE小鼠、RAG2敲除小鼠等众所周知的小鼠。以下将这样得到的小鼠记为「遗传性免疫缺陷肝损伤小鼠」。
遗传性免疫缺陷肝损伤小鼠优选使用肝损伤基因是纯合体的小鼠。这样的纯合小鼠由于正常的肝细胞几乎不增殖，小鼠肝细胞不妨碍人肝细胞的增殖。但是，这样的纯合小鼠在使半合体之间交配时概率上只得到1/4的比例。
另外，肝损伤基因为半合体的遗传性免疫缺陷肝损伤小鼠(「半合体免疫缺陷肝损伤小鼠」)由于在使半合体之间交配时，或半合体和SCID小鼠交配时可以得到的概率为1/2，所以第1发明可以低成本实施。然而，半合体免疫缺陷肝损伤小鼠由于二倍体染色体的一方的基因是正常的，所以由于肝损伤基因的缺失使得正常肝细胞可形成集落，进行增殖，出生后7周时小鼠肝脏就被正常的小鼠肝细胞占据了。所以一般来说，半合体免疫缺陷肝损伤小鼠作为用于使人肝细胞增殖的接受移植小鼠是不合适的。因此，作为该第1发明的优选状态，在向半合体免疫缺陷肝损伤小鼠移植人肝细胞之前，投给特异抑制肝细胞增殖的物质，预防正常化小鼠肝细胞增殖后形成集落。作为肝细胞增殖抑制物质如作为双吡咯烷(类)生物碱的一种的倒千里光碱、毛果天芥菜碱、千里光菲灵、单野百合碱、毛束草碱等。
在第1发明的方法中，移植中使用的人肝细胞可以使用通过常规方法从正常的人肝组织分离的人肝细胞。在第1发明的方法中，作为优选的状态使用在体内具有特别活跃增殖能力的增殖性肝细胞。而在本发明中所谓的「增殖性人肝细胞」指的是在培养条件下(in vitro)，形成单一细胞种集团的集落，进行增殖可以使集落增大的人肝细胞。另外，其增殖在集落构成细胞是单一种这一点上有时也称之为「克隆性增殖」。另外，这样的细胞是通过传代培养可以进一步增加细胞数的细胞。
这样的增殖性人肝细胞作为一个例子可以使用本申请发明人发明的人小型肝细胞。即本申请发明人在大鼠或人的肝脏中发现了增殖能力高的小型肝细胞，已经申请了专利(特开平08-112092号公报；日本专利第3266766号；美国专利第6,004,810号、特开平10-179148号公报；日本专利第3211941号、特开平7-274951公报；日本专利第3157984号、特开平9-313172号公报；日本专利第3014322号)。另外相关的论文也已经发表(Chise Tateno，and Katsutoshi Yoshizato：Growth and differentiation in culture ofclonogenic hepatocytes that express both phenotypes of hepatocytes andbiliary epithelial cells.American Journal of Pathology 149：1593-1605，1996.Hiroshi Hino，Chise Tateno，Hajime Sato，Chihiro Yamasaki，Shigeru Katayama，Toshihiko Kohashi，Akio Aratani，Toshimasa Asahara，Kiyohiko Dohi，and Katsutoshi Yoshizato：A long-term culture of humanhepatocytes which show a high growth potential and express theirdifferentiated phenotypes.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 256：184-191，1999.Chise Tateno，Kaori Takai-Kajihara，Chihiro Yamasaki，Hajime Sato，and Katsutoshi Yoshizato：Heterogeneity of growth potential of adult rat hepatocytes in vitro.Hepatology 31：65-74，2000.Shigeru Katayama，Chise Tateno，Toshimasa Asahara，and Katsutoshi Yoshizato：Size-dependent in vivogrowth potential of adult rat hepatocytes.American Journal of Pathology158：97-105，2001.)。
该人小型肝细胞由于其优越的增殖能力，可以在接受移植者的体内急速增殖，在短时间内可以形成能够发挥正常肝功能的人肝细胞集团。
这样的小型肝细胞的採取除了使用上述以前申请发明记载的那样的离心分离的方法之外，也可以通过淘析器或FACS等细胞分级装置採取。另外，也可以通过特异识别形成集落进行增殖的肝细胞的单克隆抗体採取。无论是在体外(in vitro)增殖的人肝细胞、冷冻保存肝细胞、通过端粒末端转移酶基因等的导入存活的肝细胞、使这些肝细胞和非实质细胞混合后的细胞都可以。
增殖性人肝细胞的其他例子是通过特异识别增殖性人肝细胞的单克隆抗体(实施例6)识别的人肝细胞。这样的单克隆抗体识别的增殖性人肝细胞根据对抗体的标记，可以通过众所周知的EIA、RIA、荧光抗体法等以高纯度获取。具体来说，例如使酶、放射性同位素、磁珠、或荧光色素等标记的单克隆抗体接触由人肝脏分离的肝细胞集团，通过分离发出标记信号的细胞进行。作为标记使用的酶只要满足转换数大、与抗体结合也稳定、使底物特异着色等条件的酶，没有特别限制，通常的EIA中使用的酶，例如可以使用过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。另外也可以使用酶抑制物质或辅酶等。这些酶和抗体结合可以通过使用马来酰亚胺化合物等架桥剂的众所周知的方法进行。作为底物可以根据使用的酶的种类使用众所周知的物质。例如作为酶使用过氧化物酶时，可以使用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，而作为酶使用碱性磷酸酶时，可以使用对硝基苯酚等。作为放射性同位素可以使用125I或3H等通常RIA中使用的同位素。作为荧光色素可以使用异硫氰酸荧光素(FITC)或四甲基罗丹明荧光素(TRITC)等通常在荧光抗体法中使用的荧光色素。另外，标记信号的检测在使用酶时加由于酶分解作用而发色的底物，通过对底物的分解量进行光学测定，求酶活性，将其换算为结合抗体量，从与标准值的比较可以算出抗体量。使用放射性同位素时，通过闪烁扫描计数器等测定放射性同位素发出的放射线量。而在使用荧光色素时，可以通过组合了荧光显微镜的测定装置测定荧光量。
在将象上述那样的人肝细胞、特别是增殖性人肝细胞移植到免疫缺陷肝损伤小鼠时，就象实施例所表示的那样，可以经由小鼠的脾脏移植到肝脏。另外，也可以由门静脉进行移植。移植的人肝细胞的数目可以是1～10000个程度。
另外在第1发明的方法中作为优选的状态之一是将抗小鼠Fas抗体投给移植了人肝细胞的小鼠。抗小鼠Fas抗体与小鼠肝细胞的Fas抗原反应，具有诱导凋亡的作用。通过将抗小鼠Fas抗体投给移植了人肝细胞的小鼠，小鼠的肝细胞发生凋亡，死掉。该抗体由于对人肝细胞没有影响，所以可以有选择地只增殖移植了的人肝细胞。通过该方法可以使小鼠肝脏中被人肝细胞置换的置换率进一步上升。
以下就第2发明的人肝细胞大量增殖方法进行说明。
第2发明的方法，其特征是进行以下步骤(1)～(3)。
步骤(1)：与第1发明的方法同样进行，使人肝细胞在小鼠肝脏中增殖。
步骤(2)：对在小鼠肝脏内增殖的人肝细胞进行分离。
步骤(3)：将分离的人肝细胞分别移植到免疫缺陷肝损伤小鼠的肝脏，与第1发明的方法同样使人肝细胞增殖。
而且，该第2发明的方法将上述步骤(2)和(3)重复1次以上。即在步骤(1)中，移植到1只小鼠的人肝细胞在该小鼠肝脏内增加到约100倍。因此，在步骤(2)中如果全部回收增殖的人肝细胞，那么在步骤(3)中从原理上讲可以向100只小鼠移植人肝细胞，最终可以回收最初移植的人肝细胞的100×100倍的人肝细胞。另外通过将步骤(2)和(3)反复进行2次，可以回收最初移植的人肝细胞的100×100×100倍的人肝细胞。
在该第2发明的方法中，可以与上述第1发明方法和其优选状态方法同样操作进行步骤(1)和/或步骤(3)。这里所谓「和/或」指的是对于上述第1发明方法中的一个要素可以只在步骤(1)进行，也可以只在步骤(3)进行，或者也可以在步骤(1)和步骤(3)两方中进行。例如，在步骤(1)中，将上述的单克隆抗体(第8发明)识别的增殖性肝细胞移植到小鼠中，也可以将在步骤(3)中回收的人肝细胞的全部用于移植。上述第1发明中各个要素可以根据使人肝细胞增殖的小鼠个体、或从小鼠回收的人肝细胞的用途等适当选择。
第2发明的步骤(2)是从小鼠肝脏分离在步骤(1)[反复进行步骤(2)和(3)时，其前面的步骤]中增殖的人肝细胞的步骤。分离方法可以采用各种各样的方法(例如，胶原酶灌流法)，优选是至少采用以下方法(a)和(b)中的一种方法进行。
方法(a)：
通过对从小鼠肝脏分离的肝脏组织进行胶原酶处理，实质上只回收人肝细胞。由于胶原酶的细胞毒性对小鼠肝细胞比对人肝细胞更高，所以通过调节胶原酶的消化时间可以造成肝细胞损伤，也可以只收获人肝细胞。胶原酶处理的时间也因人肝细胞和小鼠肝细胞的比例不同而不同，例如人肝细胞在70％以上时，可以进行8～20分钟程度的处理。
方法(b)：
通过对被不识别非人肝细胞，特异识别人肝细胞的单克隆抗体识别的细胞进行分离，可以回收纯度高的人肝细胞。作为这样的单克隆抗体例如小鼠-小鼠杂交瘤K8216(FERM P-18751)产生的单克隆抗体。
本申请的第3发明是在肝脏内含有通过上述第1发明或第2发明的方法增殖的人肝细胞的「嵌合小鼠」。该嵌合小鼠优选是从人肝细胞移植后生存50天以上，更优选的是生存70天以上的嵌合小鼠。另外，该嵌合小鼠鼠肝脏的70％以上、优选是90％以上、更优选的是98％以上被人肝细胞占据的小鼠。另外该嵌合小鼠是具有人细胞色素P450活性的小鼠。即，人型P450存在着CYP1A1、1A2、2C9、2C19、2D6、3A4等数十种的分子种类，本发明的嵌合小鼠的特征之一是这些人型P450与各个人肝细胞实质上同等程度地进行表达。细胞色素P450是肝脏中与外源性化学物质代谢等有关的蛋白质，表达人型P450的小鼠肝脏与人肝脏实质上同样对化学物质等进行代谢。因此，这个第3发明的嵌合小鼠使得试验例如药剂的药效和毒性对人肝细胞的影响的方法(第9发明)成为可能。而这样的嵌合小鼠的利用可以参照本申请发明人等先前提出的发明(特开2002-45087号公报：嵌合动物)。另外，肝脏内含有通过第2发明的大量增殖方法增殖的人肝细胞的嵌合小鼠的集团是分别含有来自同一人的肝细胞的嵌合小鼠的集团，可以在实质上均一的条件下进行大规模试验。
本申请的第4发明是从上述第3发明的嵌合小鼠分离人肝细胞的方法。该方法可以与上述第2发明的步骤(2)同样进行。
本申请的第5发明是通过上述第4发明的方法从嵌合小鼠的肝脏分离的人肝细胞。该人肝细胞通过在小鼠个体内增殖，实质上具有与人肝组织的正常肝细胞同样的肝功能。因此，通过该第5发明的人肝细胞可以提供用于药物代谢试验或安全性试验等的人肝细胞试剂盒(第6发明)以及混合型人工肝脏(第7发明)。另外，使用在混合型人工肝脏中使用的模件(充填了人肝细胞的模件)，可以回收人肝细胞生产的有用物质。
肝细胞试剂盒根据细胞的种类和用途有各种各样，只要是同行，通过采用第5发明的人肝细胞和众所周知的细胞试剂盒的构成，可以很容易制作第6发明的细胞试剂盒。另外模件和混合型人工脏器的构成也众所周知，只要是同行可以很容易制作第7发明的人工肝脏等。
作为第8发明，本申请还提供不识别非人肝细胞，特异识别人肝细胞的单克隆抗体。
该单克隆抗体根据众所周知的单克隆抗体制作方法(「单克隆抗体」，长宗香明、寺田弘共著、广川书店、1990年；“Monoclonal Antibody”James W.Goding，third edition，Academic Press，1996)，可以按照例如以下步骤制作。
1：杂交瘤细胞的制作
用含有传代培养的人正常肝细胞的免疫原免疫哺乳动物，根据需要可以适当进行追加免疫，对动物充分致敏。然后从该动物中摘出抗体产生细胞(淋巴细胞或脾脏细胞)，得到该细胞与骨髓瘤细胞株的融合细胞。然后从这些融合细胞中选择产生目的单克隆抗体的细胞，通过培养可以得到杂交瘤细胞。以下对各工序进行详细说明。
a)免疫原的制备
对通过胶原酶从正常肝组织分离到的人肝细胞进行传代培养，作为免疫原。人肝细胞可使用进行4次以上，优选是6次以上传代的，例如从15岁以下的人肝组织分离的肝细胞。
b)动物免疫
作为被免疫动物，可以使用众所周知的在杂交瘤制作法中使用的哺乳动物。具体来说，如小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、马等。但从与摘出的抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞容易获取等观点考虑，优选使用小鼠或大鼠作为被免疫动物。而实际使用的小鼠和大鼠的系统没有特别限制，使用小鼠时，可以使用例如各系统A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BR、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、RIII、SJL、SWR、WB、129等，使用大鼠时可以使用例如Low、Lewis、Spraque、Daweley、ACI、BN、Fischer等。其中如果考虑到与下面的骨髓瘤细胞的融合适合性，小鼠的BALB/c系统，大鼠的Low系统作为被免疫动物特别合适。另外这些小鼠或大鼠在免疫时的周龄优选为5～12周龄。
动物的免疫可以通过将作为免疫原的传代人肝细胞约104～108个注射到动物的皮下或腹腔内进行。免疫原投给的程序因被免疫动物的种类、个体差异等而有所不同，一般来说，投给免疫原次数为1～6次，多次投给时投给间隔优选1～2周。
c)细胞融合
在无菌条件下从上述投给程序的最终免疫日后1～5天的被免疫动物取出含有抗体产生细胞的脾脏细胞或淋巴细胞。可以根据众所周知的方法从这些脾脏细胞或淋巴细胞分离抗体产生细胞。
然后，对抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行融合。对于骨髓瘤细胞没有特别限制，可以从众所周知的细胞株中选用合适的。但考虑到从融合细胞选择杂交瘤时的便利性，优选使用其选择已经确立的HGPRT(Hpoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)缺损株。即，来自小鼠的X63-Ag8(X63)、NS1-Ag4/1(NS-1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/O-Ag14(SP2/O)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO，BU.1等，来自大鼠的210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等，来自人的U266AR(SKO-007)、GM1500·GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等。
抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的融合根据众所周知的方法可以在不使细胞存活率极度降低的条件下适宜实施。这样的方法如可以使用在聚乙二醇等高浓度聚合物溶液中对抗体产生细胞和骨髓瘤细胞进行混合的化学方法，利用电刺激的物理方法等。
融合细胞和非融合细胞的选择优选是通过例如众所周知的HAT(次黄嘌呤、氨甲蝶呤和胸苷)选择法进行。该方法在使用在氨甲蝶呤存在下不能存活的HGPRT缺损株的骨髓瘤细胞，获取融合细胞是有效的。即，通过将未融合细胞和融合细胞在HAT培养基培养，有选择地保留了对氨甲蝶呤具有抗性的融合细胞，而且可以使其增殖。
d)杂交瘤的筛选
对产生目的单克隆抗体的杂交瘤细胞的筛选可以通过众所周知的酶免疫检定法(EIA：Enzyme Immunoassay)、放射线免疫测定法(RIA：Radio Immunoassay)、荧光抗体法等进行。
通过这样筛选，可以得到分别产生与非人肝细胞不结合，而只与人肝细胞特异结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞群。
通过这样筛选后的杂交瘤细胞可以通过甲基纤维素法、软琼脂糖法、有限稀释法等众所周知的方法进行筛选，用于产生抗体。
通过以上那样方法得到的杂交瘤细胞可以在液氮中或-80℃以下的冷库中以冷冻状态保存。作为这样的杂交瘤细胞的具体例子，本申请提供小鼠-小鼠杂交瘤K8216(FERM BP-8333)。
2：单克隆抗体的获取和纯化
通过用众所周知的方法对上述1制作的杂交瘤细胞进行培养，可以获取不识别非人肝细胞，而只与人肝细胞特异结合的单克隆抗体。
培养可以在例如在上述克隆法中使用的同样组成的培养基中进行培养，或为了使单克隆抗体大量生产，也可以向小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞，从腹水中採取单克隆抗体。
这样得到的单克隆抗体可以通过硫铵盐析法、凝胶过滤法、离子交换层析法、亲和层析法等进行纯化。
作为单克隆抗体的具体例子，本申请提供上述杂交瘤(小鼠-小鼠杂交瘤K8216)产生的单克隆抗体。
第8发明的单克隆抗体可以用于上述第2发明和第4发明的方法中从小鼠肝脏只分离人肝细胞。而本第8发明的单克隆抗体由于不识别非人肝细胞，可以用于在小鼠以外的非人动物的体内使人肝细胞增殖时，或对非人肝细胞和人肝细胞进行混合培养时，对人肝细胞进行分离、纯化。
另外，本申请发明中使用的「特异识别增殖性人肝细胞的单克隆抗体」除了在筛选工序中选择产生目的抗体的杂交瘤，可以用与上述同样的方法作成(参照实施例6)。本申请作为那样的单克隆抗体的具体例子提供小鼠-小鼠杂交瘤K8223(FERM BP-8334)产生的单克隆抗体。
实施例
以下给出了实施例，对本申请发明进行详细而且具体的说明，但本申请发明并不限定于以下例子。
实施例1
使人肝细胞增殖的嵌合小鼠的作成
制作将人肝细胞移植到免疫缺陷肝损伤小鼠的肝脏，在肝脏内使人肝细胞增殖的嵌合小鼠。作成的材料、方法以及各种试验结果如下所述。
1材料
(a)清蛋白尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂转基因小鼠
(uPA-Tg)：B6SJL-TgN(AlblPlau)144Bri
(b)SCID小鼠(Scid)：C.B-17/Icr Scidjcl
(c)nafamostat mesilate
(d)倒千里光碱
(e)人肝细胞
小鼠(a)从The Jackson Laboratory购入，小鼠(b)从日本クレア购入。药品(c)从鸟居制药公司(商品名：フサン)购入，(d)从SIGMA公司购入。
而细胞(e)象下述那样制备。与进行肝切除手术的患者签订协议书，得到承诺后，从切除的肝获取正常组织，用UW液进行灌流，在4℃下进行搬运。通过胶原酶处理由正常肝脏组织得到肝脏分散液。通过低速离心法(50g，2分钟)分离为沉淀和上清，将他们含有的细胞(上清：小型肝细胞，沉淀：肝实质细胞)分别用培养基洗净后，对肝细胞计数。进行冷冻保存时加冷冻保存液(クラボウ生产)，用程序(控制)冷冻机进行冷冻。保存在液氮的沉淀或上清的肝细胞于37℃的恒温水槽中融解，对细胞数进行计数。在移植前用培养基调整到4×107个/ml。
2方法与结果
2.1免疫缺陷肝损伤小鼠的制作
使uPA-Tg小鼠(hemizygote，+/-)和SCID小鼠(homozygote，+/-)交配，获取具有两方性状的小鼠uPA-Tg(+/-)/SCID(+/-)的几率是35.2％。Tg(+/-)和Tg(-/-)的识别使用对Tg基因特异的序列作为引物，通过基因组PCR法进行。另外SCID(+/-)和SCID(-/-)的识别通过PCR-RFLP法进行。
使得到的Tg(+/-)/SCID(+/-)与SCID(+/+)逆转交配，得到Tg(+/-)/SCID(+/+)。结果，出现37.9％的Tg(+/-)，和52.8％的SCID(+/+)。使Tg(+/-)/SCID(+/+)相互间交配，得到目的Tg(+/-)/SCID(+/+)和Tg(+/+)/SCID(+/+)。
而uPA基因的纯合和杂合的识别通过以下方法进行。
将出生后8～10日的小鼠的尾巴切下5mm，使用Qiagen DNeasyTissue试剂盒提取基因组DNA。用分光光度计测定提取的DNA浓度和纯度。向master mix 25μl，引物F 1μl，引物R 1μl，Taqman探针1μl中加入DNA和蒸馏水，将总量调整到50μl，进行定量性PCR(ABI7700，Sequencer Detector，PE Applied Biosystems)。引物和Taqman探针以用于uPA基因导入用载体中含有的人生长激素的编码序列作为对象象下面那样设计。
引物F：gtcttggctcgctgcaatc(SEQ ID No：1)
引物R：cgggagactgaggcaggag(SEQ ID No：2)
Taqman探针：ccgcctcctgggttcaagcga(SEQ ID No：3)
作为对照，使用以小鼠G3PDH为对象的引物和Taqman探针。
引物F：ggatgcagggatgatgttc(SEQ ID No：4)
引物R：tgcaccaccaactgcttag(SEQ ID No：5)
Taqman探针：cagaagactgtggatggccctc(SEQ ID No：6)
PCR条件为95℃下变性10分钟后，每一个循环为95℃下变性15秒钟，60℃下延伸1分钟，共进行50循环。通过用内部对照的小鼠G3PDH编码序列的扩增片段量除人生长激素的编码序列的扩增片段量得到的相对值，对基因组中导入DNA的量进行比较。标准曲线使用样品中的杂合或纯合小鼠的基因组的稀释系列。将标准中使用的小鼠的值作为1，当该小鼠为杂合小鼠时，杂合表示接近1的数值，纯合表示接近2的数值。当标准中使用的小鼠是纯合时，纯合表示接近1的数值，杂合表示接近0.5的数值。通过解剖时的肉眼所见，利用该方法的正确率推定为约90％。
2.2人肝细胞向uPA-Tg/SCID小鼠的移植
将出生后14～48日的Tg(+/+)/SCID(+/+)小鼠用乙醚麻醉，将侧腹切开约5mm，由脾头一次注入4-8×107个/ml浓度的细胞悬浮液10-12.5μl(4-10×105个/ml)后，进行止血。向腹腔一次注入40μl的浓度为0.02g/ml的止血剂e-氨基己酸(SIGMA)，将脾脏放回腹腔、缝合。由于Tg小鼠肝细胞中产生的uPA向细胞外分泌，所以血中的uPA浓度高。uPA催化蛋白质分解和将纤溶酶原活化为纤溶原，具有分解血纤蛋白块的作用。因此，出生后，许多小鼠在肠道或腹腔内发生出血，所以出生后4日以内就死了。为了避免由于手术时出血导致死亡，投给有抑制纤溶酶原激活物和纤溶原作用的止血效果的e-氨基己酸。
已知用于交配的SCID/C.B-17小鼠不带有T细胞、B细胞，但带有NK细胞。因此，为了使移植的人肝细胞不受到NK细胞的攻击，在移植前一天和移植翌日向腹腔内注入抑制NK活性的asialo GM1抗体。在出生后4周断奶，从出生后5周开始在不同的笼子饲养雌雄。
2.3小鼠血中的人清蛋白的监测
从移植人肝细胞后第1周开始，每周1次或2次从小鼠尾巴採取10μl血液，使用定量ELISA免疫分析(Bethyl laboratories Inc.)测定人清蛋白浓度。
移植了人肝细胞的19只Tg(+/+)/SCID小鼠中有11只小鼠血中人清蛋白增加(图1)，高的可达到8mg/ml以上，该值相当于小鼠血中清蛋白的62％。
另外，对分别移植了人肝细胞经低速离心分离得到的上清中的细胞(小型肝细胞)和沉淀中的细胞(肝实质细胞)时的血中人清蛋白浓度进行比较时，发现与肝实质细胞移植小鼠相比，小型肝细胞移植小鼠一方清蛋白浓度的上升更多(图2)。
2.4由人肝细胞产生的人补体和补体抑制剂的投给
发现存在着血中人清蛋白超过3mg/ml的小鼠状态急剧恶化后死亡的情况(图1)。在死亡动物中观察到肺出血，证实是由于人肝细胞的补体产生造成的影响。使用针对人补体C3的抗体对小鼠肝脏组织中的人肝细胞进行免疫染色时，确认在人肝细胞中存在C3。因此，将200μl的2mg/ml浓度的补体抑制剂(フサン(镰菌素、镰孢素))投给人清蛋白浓度变高了的小鼠。投给频率开始为每2日一次。每日观察体重的变化，如果发现体重减少，增加投给频率和浓度(图3)。结果对于血中人清蛋白浓度超过2mg/ml的小鼠隔日投给一次补体抑制剂(フサン)，对于超过4mg/ml的小鼠每日投给一次，对于超过6mg/ml的小鼠1日投给2次(图3)。通过这样处理，血中人清蛋白浓度即使超过3mg/ml，小鼠也能长期生存，高的可以检测到8mg/ml的人清蛋白(图1)。
另外，通过ELISA法分别测定了没有投给补体抑制剂(フサン)的嵌合小鼠和投给抑制剂的嵌合小鼠的血中人补体(hC3a)。结果确认投给补体的嵌合小鼠的hC3a浓度比没有投给的嵌合小鼠的低(图4)。
2.5维生素C和SCID小鼠血清的投给
由于人肝细胞不能合成维生素C，带有用人肝细胞置换的肝脏的小鼠有成为维生素C缺乏症的可能性。因此，对于移植了人肝细胞的小鼠要投给溶解了1mg/ml浓度的抗坏血酸-2-磷酸的饮料水(参考日本クレア、抗坏血酸合成能力缺乏大鼠的饲养方法)。
另外，移植了人肝细胞的Tg(+/+)/SCID小鼠与Tg(+/-)/SCID小鼠相比，体重增加缓慢，毛色也不好。由于认为可能是小鼠肝脏中的人肝细胞合成的蛋白质和酶等对小鼠的成长和身体的维持不充分，所以每周一次向小鼠皮下注射50μl的SCID小鼠血清。投给SCID小鼠血清的与没有投给血清的Tg(+/+)/SCID小鼠的体重增加量进行比较，投给血清的小鼠一方体重增加。
2.6小鼠肝脏的肉眼病理检查和组织学的病理检查
在乙醚麻醉下採集小鼠血，测定血清中的清蛋白和GPT值。摘出肝脏和脾脏，测定重量，拍照后取样用于冷冻切片包埋、石蜡切片包埋，从剩下的样品中提取微粒体级分。确认随着人清蛋白浓度变高，血清清蛋白量增加和GPT值降低(图5)。
在人清蛋白为高值的小鼠中，可以看到整个肝脏呈桃色，在一部分残留着作为Tg(+/+)/SCID小鼠特征的白色部位的小鼠。另外。也看到了一部分呈红色的肝脏，认为该部位可能是由于uPA导入基因的缺损而正常化的小鼠的肝细胞。
制作肝脏的各个叶的冷冻切片，与人特异的细胞角蛋白8/18抗体(ICN Pharmaceuticals，Inc，Ohio)反应后，用过氧化物酶标记DAKOEnvision+TM(DAKO CORPORATION，CA)染色。算出各个叶的每一切片面积的细胞角蛋白8/18阳性部位的比例(图6、7)。在人清蛋白分泌量多的小鼠中细胞角蛋白8/18阳性肝细胞的面积的比例高。还观察到阳性细胞超过80％的小鼠。
2.7微粒体中P450分子种类的解析
使用针对P450分子种类的抗体(第一化学药品株式会社，东京)，通过Western blot分析检测在从小鼠採取的微粒体级分中的P450分子种类的表达。结果在人清蛋白高的小鼠中，作为P450的人特异的分子种类的CYP2C9的表达被证实(图8)。
另外，为了研究从小鼠採取的微粒体级分中的CYP2C9的活性，向微粒体中添加双氯酚酸钠，测定双氯酚酸钠的羟基化。结果在uPA(-/-)/SCID小鼠中几乎看不到双氯酚酸钠的羟基化活性，也没有看到投给补体抑制剂引起的诱导。然而，在移植了人肝细胞的嵌合小鼠中，看到向人细胞的置换率越高，双氯酚酸钠的羟基化活性也越高，在置换率89％的嵌合小鼠中，看到超过供体(人)的微粒体中的活性(图9)。
2.8嵌合小鼠肝脏中的P450各个分子种类的mRNA表达和用利福平的诱导
从嵌合小鼠肝脏提取总RNA，通过逆转录合成cDNA。合成针对6种人型P450分子种类(CYP1A1、1A2、2C9、2C19、2D6、3A4)的各个基因cDNA的引物，使用PRISM7700 Sequence Detector(ABI公司)，对各个mRNA的表达量进行定量。结果置换率0％的对照小鼠几乎没有表达人型P450，而在嵌合小鼠肝脏中所有的人型P450分子种类都表达，他们的表达图式近似于供体(人)的表达图式(图10)。
另外，在4日内向3只嵌合小鼠腹腔内注入利福平(50μg/kg b.w.)，在第5天採取肝脏，向上述那样对6种人型P450的各个表达进行定量。众所周知利福平只诱导人的CYP3A4表达。结果，确认在投给利福平的嵌合小鼠的肝脏中与没有投给利福平的小鼠相比，前者的人型CYP3A4的表达大约是后者的5.7倍(图10)。
实施例2
嵌合小鼠的人肝细胞的分离和通过单克隆抗体进行人肝细胞纯化
通过胶原酶灌流法从实施例1作成的嵌合小鼠分离肝细胞。胶原酶的浓度为0.05％，处理时间为9分钟。认为肝细胞中可能混入人肝细胞和小鼠肝细胞，但小鼠肝细胞与人肝细胞相比，由于胶原酶造成的毒性高，所以分离的许多肝细胞(80％)都是人肝细胞。
另外，为了提高人肝细胞的纯度，使用不识别小鼠肝细胞，而特异识别人肝细胞的表面的小鼠单克隆抗体(实施例6作成的杂交瘤K8216产生的单克隆抗体)，只分离人肝细胞。使上述抗体与通过胶原酶灌流分离的人肝细胞占有的比例约为80％的小鼠肝细胞反应，再使FITC标记小鼠IgG抗体反应，使用FACS分离与FITC标记小鼠IgG抗体反应的细胞。结果人肝细胞的纯度达到95％以上。
实施例3
由嵌合小鼠分离的人肝细胞向uPA-Tg/SCID小鼠的再移植
将实施例2分离的肝细胞与实施例1一样移植到另外的uPA-Tg(+/+)/SCID小鼠，进行饲养。结果发现小鼠血中人清蛋白量增加(图11)。
实施例4
由于uPA导入基因的缺失导致的正常化小鼠肝细胞的增殖抑制
向uPA-Tg(+/-)/SCID和uPA-Tg(+/+)/SCID腹腔内注入倒千里光碱30或60mg/kg。结果发现在uPA-Tg(+/-)/SCID小鼠中由于uPA导入基因的缺失(uPA-Tg(-/-)/SCID)造成的正常化肝细胞的集落减少(图12)。
接下来，与实施例1同样操作将人肝细胞移植到腹腔内注入了60mg/kg的倒千里光碱的uPA-Tg(+/-)/SCID和uPA-Tg(+/+)/SCID小鼠中，作成嵌合小鼠。结果发现即使在接受uPA-Tg(+/-)/SCID小鼠的嵌合小鼠中血中人清蛋白浓度增加的程度与来自uPA-Tg(+/+)/SCID小鼠的嵌合小鼠同等程度。
实施例5
将抗小鼠Fas抗体投给人肝细胞嵌合小鼠
对于1只实施例1制作的嵌合小鼠，在从人肝细胞移植后经过100天时，每隔1周腹腔内注入与小鼠肝细胞的Fas抗原反应，诱导小鼠肝细胞凋亡的抗小鼠Fas抗体(0.2μg/g b.w.)，共注入2次。
结果就象图13所表示的那样。该嵌合小鼠从人肝细胞移植后约80天以后，血中的人清蛋白表现出减少的倾向，但通过投给抗小鼠Fas抗体，血中人清蛋白浓度显著上升。
以上结果确认在本发明的方法中，将抗小鼠Fas抗体投给人肝细胞移植后的嵌合小鼠对于人肝细胞的增殖和/或活化是有效的。
实施例6
识别人增殖性肝细胞的单克隆抗体的制作
1.人肝细胞的培养
通过胶原酶灌流法从人肝脏组织得到细胞分散液。将细胞分散液经低速离心分离(50g，2分钟)，将该沉淀级分用添加了胎牛血清、人血清、EGF、尼克酰胺、活性持续型维生素C的Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)，与经丝裂霉素C处理后的Swiss 3T3细胞进行混合培养。Swiss 3T3细胞每10日添加一次。从培养第7天时开始观察到人肝细胞的集落。将增殖到铺满的肝细胞用EDTA/Trypsin进行传代。传代如用小孩的肝细胞可以传代6-9次，而60岁以上的患者的肝细胞只能传代3-4次(图14)。将表现出更高增殖能力的小孩(12岁)的肝细胞用作抗原(图15)。
2.动物的免疫
利用上述方法，在培养皿上使3-5次传代培养的小孩(12岁)肝细胞增加。将增殖至铺满的细胞(约1×107个)用PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗净后，除去PBS，用细胞刮棒搅和回收，悬浮于约1ml PBS中。然后将他注入6周龄的Balb/c小鼠的腹腔内。再于20天后或30天后用同样方法进行免疫。
3.细胞融合
经2次免疫后，看到抗体效价上升，第3次免疫(boost)72小时后，从1只免疫动物摘出脾脏，採取脾脏细胞。对该脾脏细胞和小鼠骨髓瘤细胞(细胞名NS-1)进行细胞融合，于96孔板播种372孔进行培养。
4.杂交瘤的筛选
1次筛选(ELISA、组织染色)
通过ELISA测定得到的融合细胞的培养上清对抗原的反应性。测定通过以下方法实施。将作为抗原使用的传代培养肝细胞播种到96孔板，培养后用PBS洗净，使其干燥，保存在-80℃下，使培养上清与其反应。然后使酶标记的抗小鼠IgG或抗小鼠IgM抗体反应，加入底物，发色，测定其吸光度。结果融合细胞372个样品的吸光度的平均值为0.149(SD：0.099)，将其中吸光度在0.20以上(81个样品，约20％)的样品作为阳性。另外通过目视，吸光度在0.15以上就可确认发色，所以对于0.15～0.20的样品(46样品)进行组织染色确认了反应性。只将其中感兴趣的表现出深的染色带作为阳性样品13。将选择的阳性样品的94个样品进一步培养、扩大，回收培养上清后，将细胞冷冻保存。
5. 2次筛选(ELISA、组织染色)
通过与1次筛选同样的ELISA测定来自在1次筛选中选择的94样品的扩大后培养上清对抗原的反应性，选择阳性样品88个。再通过组织染色研究这些样品在组织中的反应性。就其中含有与肝细胞的细胞膜或门静脉区的肝细胞特异反应的杂交瘤的样品，或通过从其中克隆得到的集落的培养上清对刚分离的人肝细胞的反应性进行研究。
就组织中门静脉区的肝细胞膜染色的杂交瘤培养上清(No.23)(图16)在刚分离的肝细胞表面中的反应性使用FACS(Fluorescenceactivated cell sorting)进行解析。将通过胶原酶灌流、低速离心从成年人男性(46岁和49岁)肝脏得到的细胞用该样品的培养上清在4℃下处理30分钟，然后再于4℃下进行30分钟FITC标记小鼠IgG抗体处理，可以用FACS进行检测。结果发现肝细胞集团的一部分(1～2％)细胞与该样品反应(图17)。在此将这些细胞集团作为R2收集，没有反应的细胞集团作为R3收集，进行培养。另外分类收集前的肝细胞也同样进行培养。结果在分类收集前的肝细胞中，就象上述那样，从培养到第7天时观察到集落形成。而在R3级分中没有观察到形成集落的细胞，但在与No.23反应的R2级分中，观察到许多集落(图18)。另外，通过FACS研究对传代培养的人肝细胞的反应性时，约80％的细胞呈阳性(图19)。即，认为不识别传代培养细胞中在培养过程中分化的细胞，只识别增殖性肝细胞。由此表明，在No.23中可能含有特异识别形成集落的细胞的杂交瘤。就通过克隆从No.23样品得到的集落也利用FACS对在刚分离的肝细胞表面的反应性进行解析。结果得到3个表现出同样反应性的克隆。将来自其中的一个克隆(小鼠-小鼠杂交瘤K8223)作为专利微生物于2002年3月6日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(委托号FERMP-18752)，另外于2003年3月20日进行了国际保藏(委托号FERM BP-8334)。
6.单克隆抗体的制作
通过培养上述的杂交瘤(K8223)细胞，再将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔内，通过从腹水採集单克隆抗体，得到与增殖性人肝细胞特异结合的单克隆抗体。
实施例7
特异识别人肝细胞的单克隆抗体的制作
通过肝脏组织的组织染色从实施例6的1次筛选选择的94个样品中ELISA为阳性的88个样品中选择产生不识别非人肝细胞，只识别人肝细胞的单克隆抗体的杂交瘤。就肝细胞的细胞膜与区域没有关系一样染色的杂交瘤培养上清3样品利用FACS对培养人肝细胞或刚分离的人肝细胞和非人动物(小鼠、大鼠)肝细胞的细胞表面的反应性进行解析。将通过胶原酶灌流、低速离心从成年人男性(46岁或68岁)肝脏得到的细胞用选择的3个样品的培养上清在4℃下处理30分钟，然后于4℃下进行30分钟FITC标记小鼠IgG抗体处理，可以用FACS进行检测。利用FACS筛选，结果选择出1个只与人的肝细胞反应，不与小鼠和大鼠肝细胞反应的杂交瘤(克隆前)样品。由此得到的单克隆的杂交瘤培养上清、2克隆都表现出同样的反应性(图20)。在用选择的杂交瘤培养上清的组织染色中，认为是人肝组织的毛细胆管的部位染色，在其染色性中看不到区域差别。另外小鼠和大鼠肝组织无论哪一个对该杂交瘤培养上清都表现为阴性。由以上结果得到产生不识别非人动物的肝细胞，而特异识别人肝细胞的抗人肝细胞单克隆抗体的杂交瘤。这个杂交瘤K8216株作为专利微生物于2002年3月6日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(委托号FERM P-18751)，另外于2003年3月20日进行了国际保藏(委托号FERM BP-8333)。
用与实施例6同样的方法从该K8216株得到了单克隆抗体。
产业上利用的可能性
就象以上详细说明的那样，通过本申请发明，可以以保持其功能的状态使人肝细胞大量增殖。另外提供肝脏内的许多细胞置换为人肝细胞的嵌合小鼠。可以使用该嵌合小鼠和人肝细胞进行化合物的药物代谢试验和安全性试验。
                         序列表
<110>Japan Science and Technology Corporation and
     Hiroshima Industrial Technology Organization
<120>人肝细胞增殖方法和人肝细胞的获取方法
<130>03-F-014
<150>JP 2002-84280
<151>2002-03-25
<160>6
<210>1
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>1
gtcttggctc gctgcaatc                                         19
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>2
cgggagactg aggcaggag                                         19
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>3
ccgcctcctg ggttcaagcg a                                       21
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>4
ggatgcaggg atgatgttc                                         19
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>5
tgcaccacca actgcttag                                         19
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>6
cagaagactg tggatggccc tc                                     22

Claims (33)

1.一种人肝细胞增殖方法，其特征是：是通过将人肝细胞移植到免疫缺陷肝损伤小鼠的肝脏中，使人肝细胞移植小鼠在防御来自人肝细胞产生的人补体的攻击的状态下进行饲养，使移植的人肝细胞在小鼠肝脏中增殖。
2.权利要求1的人肝细胞增殖方法，其中防御来自人补体的攻击的状态至少是以下的(a)和(b)中的一种状态，
(a)至少投给人肝细胞移植小鼠1次补体抑制剂；
(b)作为免疫缺陷肝损伤小鼠，使用免疫缺陷肝损伤小鼠和衰变加速因子(DAF/CD55)转基因小鼠交配后得到的后代小鼠。
3.权利要求1或2的人肝细胞增殖方法，其中免疫缺陷肝损伤小鼠是遗传性免疫缺陷小鼠和遗传性肝损伤小鼠交配后得到的后代小鼠。
4.权利要求3的人肝细胞增殖方法，其中后代小鼠是半合子免疫缺陷肝损伤小鼠。
5.权利要求4的人肝细胞增殖方法，在将肝细胞增殖抑制物质投给半合子免疫缺陷肝损伤小鼠后，进行人肝细胞移植。
6.权利要求1至5中的任一项的人肝细胞增殖方法，将抗小鼠Fas抗体投给移植了人肝细胞的免疫缺陷肝损伤小鼠。
7.权利要求1的人肝细胞增殖方法，其中移植到免疫缺陷肝损伤小鼠的人肝细胞是增殖性人肝细胞。
8.权利要求7的人肝细胞增殖方法，其中增殖性人肝细胞是被特异识别形成集落的同时增殖的人肝细胞的单克隆抗体识别的人肝细胞。
9.权利要求8的人肝细胞增殖方法，其中单克隆抗体是小鼠-小鼠杂交瘤K8223(FERM BP-8334)产生的单克隆抗体。
10.人肝细胞大量增殖方法，其特征是由以下步骤(1)～(3)组成，并且将步骤(2)和(3)重复一次以上，
(1)通过将人肝细胞移植到免疫缺陷肝损伤小鼠的肝脏，在防御来自人肝细胞产生的人补体的攻击的状态下对人肝细胞移植小鼠进行饲养，使移植的人肝细胞在小鼠肝脏中增殖的步骤；
(2)从小鼠肝脏分离增殖的人肝细胞的步骤；以及
(3)将分离的人肝细胞移植到免疫缺陷肝损伤小鼠的肝脏，使人肝细胞移植小鼠在防御来自人肝细胞产生的人补体的攻击的状态下饲养50天以上的步骤。
11.权利要求10的人肝细胞大量增殖方法，其中防御来自步骤(1)和/或步骤(3)的人补体的攻击的状态至少是以下的(a)和(b)中的一种状态，
(a)至少投给人肝细胞移植小鼠一次补体抑制剂；
(b)作为免疫缺陷肝损伤小鼠使用免疫缺陷肝损伤小鼠和衰变加速因子(DAF/CD55)转基因小鼠交配后得到的后代小鼠。
12.权利要求10或11的人肝细胞大量增殖方法，其中在步骤(1)和/或步骤(3)中，免疫缺陷肝损伤小鼠是遗传性免疫缺陷小鼠和遗传性肝损伤小鼠交配得到的后代小鼠。
13.权利要求12的人肝细胞大量增殖方法，其中后代小鼠是半合体免疫缺陷肝损伤小鼠。
14.权利要求13的人肝细胞大量增殖方法，其中，将肝细胞增殖抑制物质投给半合体免疫缺陷肝损伤小鼠后，进行肝细胞移植。
15.权利要求10至14中的任一项的人肝细胞大量增殖方法，其中在步骤(1)和/或步骤(3)中，将抗小鼠Fas抗体投给移植了人肝细胞的免疫缺陷肝损伤小鼠。
16.权利要求10的人肝细胞大量增殖方法，其中在步骤(1)和/或步骤(3)中向免疫缺陷肝损伤小鼠的肝脏进行移植的人肝细胞是增殖性人肝细胞。
17.权利要求16的人肝细胞大量增殖方法，其中增殖性人肝细胞是被特异识别形成集落的同时增殖的人肝细胞的单克隆抗体识别的人肝细胞。
18.权利要求17的人肝细胞大量增殖方法，其中单克隆抗体是小鼠-小鼠杂交瘤K8223(FERM BP-8334)产生的单克隆抗体。
19.权利要求10的人肝细胞大量增殖方法，其中，通过在步骤(2)中至少进行以下的(a)和(b)中的一种操作，实质上只分离人肝细胞，
(a)对从小鼠肝脏分离的肝脏组织进行胶原酶处理，以及
(b)对不识别非人肝细胞，而特异识别人肝细胞的单克隆抗体识别的细胞进行分离。
20.权利要求19的人肝细胞大量增殖方法，其中，单克隆抗体是小鼠-小鼠杂交瘤K8216(FERM BP-8333)产生的单克隆抗体。
21.一种嵌合小鼠，其在肝脏内含有通过权利要求1至9中任一项的人肝细胞增殖方法、或权利要求10至20中任一项的人肝细胞大量增殖方法增殖的人肝细胞。
22.权利要求21的嵌合小鼠，其中增殖的人肝细胞占肝脏内细胞的70％以上。
23.权利要求21或22的嵌合小鼠，具有人型P450活性。
24.人肝细胞获取方法，其特征是从权利要求21、22或23的嵌合小鼠的肝脏分离人肝细胞。
25.权利要求24的人肝细胞获取方法，其中，至少进行以下的(a)和(b)中的一种操作，实质上只分离人肝细胞，
(a)对从小鼠肝脏分离的肝脏组织进行胶原酶处理，以及
(b)对由不识别非人肝细胞，而特异识别人肝细胞的单克隆抗体识别的细胞进行分离。
26.权利要求25的人肝细胞获取方法，其中，单克隆抗体是小鼠-小鼠杂交瘤K8216(FERM BP-8333)产生的单克隆抗体。
27.通过权利要求24至26中任一项的方法获取的人肝细胞。
28.含有权利要求27的人肝细胞的细胞试剂盒。
29.充填了权利要求27的人肝细胞的杂交型人工肝脏。
30.一种不识别非人肝细胞，特异识别人肝细胞的单克隆抗体。
31.权利要求30的单克隆抗体，是由小鼠-小鼠杂交瘤K8216(FERMBP-8333)产生的。
32.一种小鼠-小鼠杂交瘤K8216(FERM BP-8333)。
33.将候补物质全身投给权利要求21、22或23的嵌合小鼠，试验候补物质的药物动力学或毒性的方法。
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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2480559A1 (en) * 2002-03-25 2003-10-02 Japan Science And Technology Agency Antibody recognizing proliferative human liver cells, proliferative human liver cells and functional human liver cells
WO2006007450A2 (en) * 2004-06-17 2006-01-19 The Texas A & M University System Detection, evaluation and treatment for advanced prostate cancer
US7273963B2 (en) * 2004-08-20 2007-09-25 Kmt Hepatech, Inc. Malarial animal model having a chimeric human liver
KR101159573B1 (ko) * 2004-08-20 2012-06-26 가부시키가이샤 페닉스바이오 약물의 사람에 있어서의 간대사 및 간기능의 예측방법
WO2006054755A1 (ja) * 2004-11-16 2006-05-26 Hiroshima Industrial Promotion Organization 医薬候補物質のスクリーニング方法
JP5025173B2 (ja) * 2005-06-30 2012-09-12 公益財団法人ひろしま産業振興機構 ヒト肝細胞を有するマウスの処置方法
CA2613849C (en) * 2005-06-30 2015-09-29 Hiroshima Industrial Promotion Organization Use of human growth hormone in mouse carrying human hepatocytes
JP4599315B2 (ja) * 2006-02-23 2010-12-15 クラレメディカル株式会社 バイオ人工臓器
JP5172670B2 (ja) * 2006-06-29 2013-03-27 公益財団法人ひろしま産業振興機構 非アルコール性脂肪性肝炎モデル動物及び脂肪肝モデル動物
JP5737821B2 (ja) * 2006-08-17 2015-06-17 一夫 大橋 血友病ｂ治療剤及びその製造方法
JP5497639B2 (ja) * 2007-06-05 2014-05-21 オレゴン ヘルス アンド サイエンス ユニバーシティ 生体内でヒト肝細胞を増大させる方法
CN102281758B (zh) 2009-01-16 2014-12-10 公益财团法人实验动物中央研究所 移植了人肝细胞的小鼠
US20120148542A1 (en) 2010-12-10 2012-06-14 Lifeline Scientific, Inc. Machine perfusion with complement inhibitors
US9532554B2 (en) 2011-09-30 2017-01-03 Public University Corporation Yokohama City University Method for inducing hepatocellular variation, and production method for chimeric non-human animal having humanized liver
JP5883265B2 (ja) * 2011-10-13 2016-03-09 株式会社フェニックスバイオ ヒト肝細胞を担持するキメラ非ヒト動物
US10004767B2 (en) * 2013-09-19 2018-06-26 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for producing hepatocyte-like cells
US9566315B2 (en) 2013-11-01 2017-02-14 Oregon Health & Science University Normalization of the enterohepatic circulation in animals with a chimeric humanized liver
JP7253692B2 (ja) 2014-12-26 2023-04-07 国立大学法人京都大学 肝細胞誘導方法
JP6865457B2 (ja) * 2015-06-11 2021-04-28 学校法人慶應義塾 ブタ肝障害モデル
EP3287521B1 (en) 2016-08-25 2021-06-23 Philip Morris Products S.A. Cell culture
WO2018152120A1 (en) 2017-02-14 2018-08-23 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods of engineering human induced pluripotent stem cells to produce liver tissue
WO2020122178A1 (ja) * 2018-12-14 2020-06-18 公益財団法人実験動物中央研究所 ヒト肝細胞が移植された非ヒト脊椎動物及びその製造方法
WO2021021612A1 (en) * 2019-07-26 2021-02-04 Ambys Medicines, Inc. Methods and compositions for producing hepatocytes
KR102362814B1 (ko) 2020-06-04 2022-02-15 한국생명공학연구원 인간 간세포 이식용 동물모델 및 이를 이용한 항바이러스제 스크리닝 방법

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0623763B2 (ja) * 1985-02-15 1994-03-30 日清製粉株式会社 モノクローナル抗体を含む肝疾患診断剤
IL106368A0 (en) * 1992-07-24 1993-11-15 Univ Pennsylvania Non-native liver generation in an animal with impaired native liver function,by cell implantation
CA2146735C (en) * 1994-04-11 2007-02-20 Chise Tateno Liver parenchymal cells having clonal growth ability, method for obtaining same, method for subculturing same, and subculturing system of primary hepatocytes
JP3266766B2 (ja) * 1994-08-23 2002-03-18 科学技術振興事業団 ローン性増殖能を有する肝実質細胞とその取得方法、並びにその継代培養方法
AU5688596A (en) * 1995-04-13 1996-10-30 Deutsche Om Arzneimittel Gmbh Anti-cd14 antibodies for use in the induction of il-10 secre tion
ATE313256T1 (de) * 1997-07-14 2006-01-15 Nippon Meat Packers Transgene schweine
US6129911A (en) * 1998-07-10 2000-10-10 Rhode Island Hospital, A Lifespan Partner Liver stem cell
AU757961B2 (en) 1998-09-30 2003-03-13 Sankyo Company Limited Anti-Fas antibodies
JP2000166574A (ja) * 1998-09-30 2000-06-20 Sankyo Co Ltd ヒト化抗Ｆａｓ抗体
US6297024B1 (en) * 1998-10-15 2001-10-02 Cell Activation, Inc. Methods for assessing complement activation
NZ513150A (en) * 1999-01-19 2004-09-24 Univ North Carolina Human liver progenitors
EP1045024A1 (en) * 1999-04-12 2000-10-18 K.U. Leuven Research & Development Use of human hepatocyte cell line for the treatment of chronic or acute liver failure
US6509514B1 (en) * 2000-03-17 2003-01-21 Kmt Hepatech, Inc. Chimeric animal model susceptible to human hepatitis C virus infection
JP2002045087A (ja) * 2000-05-19 2002-02-12 Japan Science & Technology Corp キメラ動物
WO2001087059A1 (fr) * 2000-05-19 2001-11-22 Japan Science And Technology Corporation Animal chimerique
AU2003217700A1 (en) * 2002-02-26 2003-09-09 Stelsys Llc Hepatocyte bioreactor system for long term culture of functional hepatocyte spheroids
CA2480559A1 (en) * 2002-03-25 2003-10-02 Japan Science And Technology Agency Antibody recognizing proliferative human liver cells, proliferative human liver cells and functional human liver cells

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