CN1823160A - 单核细胞来源的自体的自身耐受性诱导细胞和它们在药物制剂中的用途 - Google Patents

单核细胞来源的自体的自身耐受性诱导细胞和它们在药物制剂中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1823160A
CN1823160A CNA2004800198394A CN200480019839A CN1823160A CN 1823160 A CN1823160 A CN 1823160A CN A2004800198394 A CNA2004800198394 A CN A2004800198394A CN 200480019839 A CN200480019839 A CN 200480019839A CN 1823160 A CN1823160 A CN 1823160A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
stic
lymphocyte
substratum
monocyte
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2004800198394A
Other languages
English (en)
Inventor
B·K·F·克雷梅
F·费德里奇
M·舒泽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BLASTICON BIOTECHNOLOGISCHE FO
Original Assignee
BLASTICON BIOTECHNOLOGISCHE FO
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from PCT/EP2003/007551 external-priority patent/WO2004007701A1/en
Application filed by BLASTICON BIOTECHNOLOGISCHE FO filed Critical BLASTICON BIOTECHNOLOGISCHE FO
Publication of CN1823160A publication Critical patent/CN1823160A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/122—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells for inducing tolerance or supression of immune responses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]

Abstract

本发明涉及单核细胞来源的细胞，适合于预防和/或治疗与被扰乱的自身耐受性相关的疾病，特别是自身免疫疾病和变态反应，并涉及含有这些细胞的药物制剂。所述细胞对于待施用这些细胞的病人而言是自体的。本发明进一步涉及用于产生和/或增殖自体的调节T细胞的方法。

Description

单核细胞来源的自体的自身耐受性诱导细胞 和它们在药物制剂中的用途
本发明涉及单核细胞来源的自体细胞，其能够诱导病人的免疫学自身耐受。以下将这些细胞称为“STIC”(自身耐受性诱导细胞)。本发明进一步涉及STIC在制备用于预防和/或治疗与被扰乱的自身耐受性相关的疾病，特别是自身免疫疾病和变态反应的药物制剂中的用途。
对于本发明来说，术语“自体的”表明STIC来源于待施用该STIC的相应病人的血液的单核细胞。
本发明人已经证明，本发明的细胞能够诱导调节T细胞(TregCD4+25+)。因此本发明还涉及调节T细胞的诱导和/或体外制备。
免疫系统保护身体免于遭受潜在的致病抗原，例如微生物的侵害，而其通常避免了与身体自身的成分反应，即，健康的免疫系统耐受“自身抗原”。
当驱使特定的适应性(获得性)免疫反应针对自身抗原时，出现被扰乱的自身耐受性。
针对外来抗原的适应性免疫反应的正常结果是从身体中清除该抗原。然而，当适应性免疫反应针对自身抗原展开时，免疫效应物机制通常不可能完全地消除抗原，从而出现持续的反应。结果，免疫的效应物途径导致了对组织的慢性炎症性损伤，其可能是致命的(参见，Immuno Biology 5，The Immune System In Health and Disease，Garland Publishing 2001，第13章，第501-522页)。
适应性免疫反应由抗原特异性T细胞和/或B细胞的活化来启动，人们相信自身免疫是同样地启动的(Immuno Biology，loc.cit.第501页)。
本发明的一个优选的实施方式涉及利用含有STIC的药物制剂来治疗和/或预防自身免疫疾病。
可以区分出自身免疫疾病的两种主要形式。自身免疫的表现形式限于身体的特定器官的疾病，被称为“器官特异性”自身免疫疾病，而在“全身性”自身免疫疾病中，身体的许多组织受到影响。器官特异性自身免疫疾病的实例有桥本甲状腺炎和Grave病，都显著地影响甲状腺，还有I型胰岛素依赖性糖尿病，其影响胰岛。全身性自身免疫疾病的实例有全身性红斑狼疮和原发性Sj_gren′s综合症，其中如皮肤、肾和脑的各种组织可能都受到影响(参见，Immuno Biology，loc.cit，第503页)。
主要认为是T细胞介导的自身免疫疾病例如胰岛素依赖性糖尿病、类风湿性关节炎和多发性硬化，而在其他情况下，对细胞表面或基质抗原形成抗体起到了显著的作用，例如在自身免疫溶血性贫血症、自身免疫性血小板减少性紫癜、肺出血肾炎综合症(Goodpasture′s syndrome)、寻常天疱疮或急性风湿热中；其他的类型有免疫复合物疾病，其中涉及到T细胞和B细胞，例如mixed essentialcyroglobulinemia、全身性红斑狼疮或类风湿性关节炎(参见ImmunoBiology，loc.cit，第502页，图13.1)。
本发明的进一步的实施方式涉及用被配制为药物制剂的本发明的STIC治疗变态反应。
近来提出，调节T细胞在控制免疫稳态方面起到重要的作用，免疫稳态是一种包括免疫学自身耐受性的、对任何与传染性或抗原有关的目标的谐调组合的免疫反应，参见Takeshi Takahashi和ShimonSakaguchi，International Review of Cytology， 225，1-32(2003)；Shimon Sakaguchi，Vox Sang  83，151-153(2002)，Kathryn J.Wood和Shimon Sakaguchi，Nature Reviews Immunology， 3.199-210(2003)。
如Takahashi等，loc.cit.，第1页，摘要所表述的，“不断增加的证据表明，T细胞介导的对自身反应性T细胞的有力控制有助于维持免疫学自身耐受性，它的交替可能导致自身免疫性疾病的发展。描绘这种调节T细胞群体的努力已经显示，在正常的自然动物，包括人中的CD4+群体中的CD25+细胞拥有调节活性。CD25+外加CD4+调节T细胞作为T细胞的功能上独特的亚群由正常的胸腺产生。它们不仅在阻止自身免疫方面，而且在控制各种免疫反应方面起到了关键的作用”。
除了T细胞介导的自身免疫疾病之外，免疫系统的B细胞区室可以触发与产生针对自身细胞(包括肥大细胞)、组织和器官结构的抗体有关的自侵性疾病。
公知的是，B细胞活化取决于T细胞以这样的方式的辅助，即T辅助细胞在呈递特定抗原时刺激无性系B细胞增殖。那些抗原可来源于片段化的过敏原，然后在T细胞内被加工成小分子肽。然后以MHC-限制性的方式呈现这些肽来刺激抗原特异性活化。
为了防止由特定过敏原导致的不受控制的或过多的B细胞活化，所述特定过敏原一方面导致过敏性疾病，另一方面可诱导被扰乱的自身耐受性(参见上文)，调节T细胞具有干扰T细胞相关性B细胞活化和防止过多的和不受控制的抗体产生的能力。
与自身免疫疾病类似，通过增加调节T细胞(CD4+/CD25+T细胞)的数量，也可以影响和控制过敏性疾病。特别地，在患有EAE(“实验性过敏性脑脊髓炎”)的小鼠中已经表明，在向这些动物施用CD4+T细胞之后几周疾病减轻了，治愈与对任何进一步的疾病诱导的抗性有关(Bach，J.F，“Regulatory T Cells under Scrutiny″Nature ReviewsImmunology 3：189-198(2003)；Lando，Z.等″Effect ofcyclophosphamide on suppressor-cell activity in miceunresponsive to EAE″J.Immunol.123：21556-2160(1979))。这些效果类似于那些NOD小鼠表明的效果，其中可以通过施用CD4+细胞停止自身免疫性糖尿病的发展，进一步引起了使小鼠免于自身免疫性疾病的新近发作的保护(Bach，J.F.，loc.cit.)。
可能与自身免疫反应有关的过敏性疾病的实例有由身体遭遇的非自身蛋白、有机物和无机物诱导的各种类型的变态反应。在这方面特别重要的是由花粉等诱导的变态反应，例如枯草热，和由过敏原诱导的变态反应，所述过敏原如药物、化学药品、病毒、细菌、真菌、室内尘埃、食物成分、金属、气体、动物的身体成分例如皮屑或毛发和动物排泄物。
迄今为止对于预防和/或治疗由被扰乱的自身耐受性引起的疾病没有可用的有效疗法。
对于器官特异性自身免疫疾病，替换治疗、移植或用抗炎药物如可的松进行对症治疗是常用的。对于全身性自身免疫疾病，常用免疫抑制剂进行治疗。显然，这些“疗法”在许多方面是有疑问的，并有严重的副作用。
据估计，多达5％的人群遭受着自身免疫疾病的困扰(Sakagushi，loc.cit.，第151页，左栏)。因此，急需有效的手段来预防和/或治疗与被扰乱的自身耐受性相关的疾病，其应是易于操作的，并且与迄今为止在治疗这种疾病中应用的方法和药剂所涉及的威胁健康的副作用和高成本无关。
因此，本发明解决的问题是提供改进的用于预防和/或治疗与被扰乱的自身耐受性相关的疾病的手段。
为了解决这个难题，建议使用来源于脊椎动物、特别是来源于哺乳动物、更优选的来源于人的单核细胞的自体的自身耐受性诱导细胞(STIC)。通过以下所述的本发明的方法可以获得这些细胞，这种过程产生修饰的细胞，能在个体的身体中增加调节T淋巴细胞(CD4+/CD25+T细胞)的数量。在施用了约105细胞/kg体重(BW)之后，这些细胞适合于预防和/或治疗与被扰乱的自身耐受性相关的疾病。
附图说明
图1：在根据本发明修饰细胞之前(左图)和之后(右图)GM-7对原始单核细胞的结合能力的流式细胞计数测定。X轴表示结合的细胞的数目。
图2：来自个体B的CD14+单核细胞(GM-7-：灰色柱；GM-7+：黑色柱)、来自MHC相异供体A的效应物细胞、和来自供体B的经照射的细胞进行混合淋巴细胞培养，来比较CD14+/GM-7+和CD14+/GM-7-细胞的抑制物活性。
图3：对单核细胞馏分中的CD14+单核细胞和CD2+淋巴细胞的数量，以及作为TAIC作用的CD-14+/CD3+细胞的数量进行流式细胞计数测定，来测定在培养开始时用于富集单核细胞的细胞纯化对形成免疫抑制性CD14+/CD3+细胞的影响。
图4：在两个实验中与吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)的抑制剂(1-MT)预先孵化的PHA刺激的淋巴细胞(PhaLy)和TAIC(“Mo+Ly”或“Mo”)进行混合淋巴细胞培养，来测定1-MT对TAIC的抑制物活性的影响。
图5：对注射TAIC之前(左图)和之后(右图)对手术后病人的血液中GM-7表达的流式细胞计数测定，来测定TAIC对血细胞中体内GM-7表达的影响。
图6：对患有葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的慢性结肠炎的小鼠的结肠切片进行H&E着色，说明组3的未处理的动物(图6A/B)、在用DSS处理后+1天用STIC处理的组1的动物(图6C/D)、在+1天用“对照细胞”处理的组4的动物(图6E)和在+7天用STIC处理的动物(图6F)的结肠的情况。(在图6A/C/E中放大倍率×2.5；在图6B/D/F中放大倍率×10)
图7：在DSS处理结束之后3周期间，患有葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的慢性结肠炎的小鼠的体重变化。组1的动物(■)已经在+1天用STIC处理，组2的动物(▲)已经在+7天用STIC处理，组3的动物(_)未经处理，而组4的动物(●)已经在+1天用“对照细胞”处理。数值是从每组的5到7只小鼠中获取的平均值，标准偏差总是低于±15％。
图8：对患有葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的慢性结肠炎的小鼠的组织化学着色的结肠切片的计分结果。组1的动物已经在+1天用STIC处理，组2的动物已经在+7天用STIC处理，组3的动物未经处理，而组4的动物已经在+1天用“对照细胞”处理。(分值0＝健康的不突出的表现；分值1＝最轻的结肠炎；分值2＝中度结肠炎；分值3＝重度结肠炎；和分值4＝伴随有整个粘膜的破坏的溃疡性结肠炎)。
图9：在接受细胞疗法时，比照开始实验后6周的小鼠重量，慢性实验性结肠炎的CD62L+/CD4+SCID转移模型的小鼠体重变化。组1的动物(◆)已经在6周后用STIC处理，组2的动物(■)未经处理，组3的动物(▲)已经在6周后用“对照细胞”处理。数值是从每组的6只小鼠中获取的平均值，标准偏差总是低于+15％。
图10：对慢性实验性结肠炎的CD62L+/CD4+SCID转移模型中接受STIC的小鼠(组1)、未处理的对照小鼠(组2)和接受“对照细胞”的小鼠(组3)的结肠长度(图10A)和脾重量(图10B)进行测量。数值是平均值±SEM。
图11：在细胞转移六周后慢性实验性结肠炎的CD62L+/CD4+CID转移模型的小鼠的组织化学着色的结肠切片的分值。组1的动物已经接受STIC，组2的动物未经处理，没有接受细胞注射，而组3的动物接受了“对照细胞”。数值是平均值±SEM。(分值0＝健康的不突出的表现；分值1＝最轻的结肠炎；分值2＝中度结肠炎；分值3＝重度结肠炎；和分值4＝伴随有整个粘膜的破坏的溃疡性结肠炎)。
图12：对慢性实验性结肠炎的CD62L+/CD4+SCID转移模型的小鼠的结肠切片进行H&E着色，说明组2的两个未处理的动物(图12A/B)、组3的用“对照细胞”处理的两个动物(图12C/D)，和组1用STIC处理的两个动物(图12E/F)的结肠的情况。(放大倍率×100)
发明概述
用于制备单核细胞来源的自体的自身耐受性诱导细胞(STIC)的方法的基本步骤包括：
(a)从待施用所述细胞的相应病人的血液分离单核细胞；
(b)在含有作为生长促进剂的巨噬细胞集落刺激因子(在下文中称为M-CSF)的适合的培养基中繁殖所述单核细胞；
(c)用γ-干扰素(在下文中称为γ-IFN)刺激所述单核细胞；和
(d)通过从所述培养基分离细胞，获得在阶段c)中形成的自身耐受性诱导细胞。
在德国专利申请DE 102 31 655.4和国际专利申请PCT/EP03/07551中描述了类似的方法。在上述的较早的专利申请中，这样制备的细胞被命名为“移植接受诱导细胞”(TAIC)。它们被用于在受体中诱导对异源供体组织的接受。重要地，在DE 102 31 655.4中和在PCT/EP03/07551中描述的TAIC来源于供体的单核细胞施用于受体来诱导移植接受。这意味着TAIC对于待用所述TAIC治疗的个体而言是异源的。
与此相反，本发明基于“自体治疗”的概念；这意味着患有被扰乱的自身耐受性，特别是自身免疫疾病和/或变态反应的个体是用自身耐受性诱导细胞(STIC)治疗的，其来源于自体的单核细胞。
因此，虽然TAIC和STIC都通过基本上相同的方法来源于单核细胞，但是TAIC对于待治疗的病人是异源的，而STIC在这一点上是自体的。
对于生产STIC的方法，已经表明用γ-IFN刺激是决定性的步骤(参见实施例2)。
在本发明的上下文中，术语单核细胞来源的自身耐受性诱导细胞(STIC)是指从上述方法的步骤(d)获得的细胞群体。这种细胞群体除包含在诱导自身耐受性方面是有效的、来源于单核细胞的细胞之外，还包含淋巴细胞，参见实施例4，以及选择性地进一步包含来源于单核细胞馏分的细胞，例如粒细胞。参照总细胞数，在STIC群体中来源于单核细胞的细胞数量优选的是50到90％，更优选的是60到70％。
对于本发明，术语“总细胞数”是指在细胞群体之中活细胞的数量。该数量可以通过“锥石蓝染色排阻技术”来确定，这种染料可通过光学手段将非存活细胞与活细胞区分开来。
STIC通常可以以每公斤体重104-106个细胞的数量使用，优选的每公斤体重105个细胞，来诱导自身耐受性。可以重复地进行STIC施用。
在动物实验和培养中都已经证明本发明的STIC对于形成恶性肿瘤是无风险的；本发明的细胞来自原始单核细胞，由于原始单核细胞的性质，这是在任何其他途径中不能预期的结果。
以下将详细说明的是，可以从存在于STIC中的细胞的馏分中分离出具有优化的自身耐受性诱导性质的进一步的细胞亚群，所述STIC来源于单核细胞。
在体外培养和用γ-干扰素刺激原始细胞(单核细胞)之后，形成了STIC，其包含结合单克隆抗体GM-7的细胞亚群，参见实施例3，单克隆抗体GM-7是由杂交瘤细胞系DSM ACC2542表达的。单克隆抗体GM-7是一种免疫球蛋白同种型IgG2a的抗体，其轻链表现出kappa同种型。这个抗体的特征是其与由本发明的培养条件修饰的单核细胞的严格结合能力，其不识别原始的单核细胞，即，没有发生抗体与原始细胞的结合(参见实施例3)。此外，用20位志愿者已经表明，GM-7不与外周血中的人细胞结合，参见图5。
如PCT/EP03/075551中描述的，通过利用本领域技术人员公知的方法用来源于人单核细胞的TAIC(相应于STIC)免疫小鼠来制备抗体(Davis，W.C.″Methods in Molecular Biology：MonoclonalAntibody Protocols″，New York：Humana Press Totowa，1995)。然后通过使产生该抗体的B细胞与鼠的骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞系。用于制备这种细胞系的方法是本领域已知的(Davis，W.C.″Methods in Molecular Biology：Monoclonal Antibody Protocols″，New York：Humana Press Inc.Totowa，1995；Kohlerr G.，Milstein，C.″Continuous cultures of fused cells secreting antibody ofpredefined specificity″，Nature 256，495-497(1975))。产生抗体GM-7的杂交瘤细胞系根据布达佩斯条约的规定以保藏号DSMACC2542保藏在DSMZ(德意志微生物保藏中心，Brauschweig，德国)。
图1显示了通过流式细胞计数确定的、GM-7与根据本发明进行体外修饰后的单核细胞的结合能力。可以看出，直接从单核细胞馏分中获得的CD14阳性单核细胞不与抗体GM-7结合(云斑遮盖的灰色部分与未遮盖的抗体对照相应)。与此相反，在存在M-CSF的情况下培养和用γ-IFN刺激之后，部分单核细胞表达出被单克隆抗体GM-7识别的抗原。单克隆抗体GM-7表现出同种型κ-IgG2a的特征。本发明的方法引起在修饰的单核细胞的细胞膜上抗原表达模式的变化(图1)。
单克隆抗体GM-7特异性地与细胞群体结合，所述细胞群体在本发明的方法产生的那些细胞之中，诱导最有效的自身耐受性诱导细胞(参见图5)。
本发明的一个优选的实施方式涉及这样的STIC，其能够结合抗体GM-7。这些细胞以下被称为STICGM7。
本发明的抗体GM-7是一种用于选择和纯化自身耐受性诱导细胞(STIC)的非常有效的和易于操作的试剂。通过抗体，根据本发明有可能产生均质的和高效的STIC群体。
本发明的优选实施方式，在本发明的上述方法中的步骤c)中形成的、表达与抗体GM-7结合的抗原的自身耐受性诱导细胞，通过与杂交瘤细胞系DSM ACC2542产生的抗体GM-7结合，可以从步骤c)后的培养基中直接选出，或在本发明的上述方法的步骤d)从培养基中分离出细胞之后从细胞群体中选出。
为了挑选本发明的STIC，在允许抗体与样品中的自身耐受性诱导细胞结合的情况下，使抗体与样品接触。随后从样品中分离结合反应产生的反应复合物。为此，可以在与样品接触前将抗体固定在载体材料上；例如，抗体可以结合到适合于层析的基质上，或结合到所谓“磁性微球”上。这个步骤可用于从大量的样品中选取和浓缩自身耐受性诱导细胞。
为了获得自身耐受性诱导细胞，在从样品中分离反应复合物之后使抗体与自身耐受性诱导细胞之间的结合分开。这可以通过本领域已知的方法进行，例如通过竞争性置换或通过用盐溶液洗涤。相应的方法例如Utz U.等描述的方法(″Analysis of the T-cell Receptorrepertoire of human T-cell leukemia virus type-1(HTLV-1)Tax-specific CD8+Cytotoxic T Lymphocytes from patients withHTLV-1 associated disease：Evidence for the oligoclonalexpansion″J.of Virology Feb.1996，843-851)。
此外，单克隆抗体GM-7可用于定性地和定量地体外检测病人的血液和/或组织样品中的、本发明的单核细胞的来源的自身耐受性诱导细胞。通过已知的方法检测样品中反应复合物的形成，其可表明自身耐受性诱导细胞的存在，或如果可行的话，还可以检测自身耐受性诱导细胞的数量。
为了检测反应复合物，在这种情况下有可能，直接用例如与抗体共价结合的可检测的分子，来偶联(“标记”)抗体GM-7。适合的可检测分子在分子诊断领域有大量的描述，包括，荧光染料例如异硫氰酸荧光素或四甲基罗丹明-5-异硫氰酸盐、发光染料、放射性标记分子和酶，例如过氧化物酶等(参照Lottspeich，F.，Zorbas，H.″Bioanalytik″，Spektrum Akademischer Verlag GmbH，HeidelbergBerlin，1998)。
对抗体的检测根据用于标记抗体的分子来决定。对于本发明，抗体GM-7与荧光分子异硫氰酸荧光素(FITC)结合，从而对抗体的检测可以通过流式细胞计数法和/或荧光显微法来进行。用FITC标记抗体的方法是在本领工作的技术人员所熟知的。
做为选择，也可以利用第二抗体在两阶段程序中检测反应复合物。就此而言，可以在与进一步的标记抗体的反应复合物中检测未标记的抗体GM-7(参照Lott-speich，F.，Zorbas，H.″Bioanalytik″，Spektrum Akademischer Verlag GmbH，Heidelberg-Berlin，1998)。由于多个标记的次级抗体可以与一个GM-7抗体结合(信号放大)，这种二阶段检测方法比直接检测本发明的抗体的结合要更敏感得多。
因此抗体GM-7可用于检测用STIC治疗的病人的外周血中的STIC，例如以“监视”的形式，在监视期间在特定的时间点测定外周血中的细胞数量。
对于本领域技术人员很明显的是，有可能针对根据本发明修饰的、来自非人脊椎动物的单核细胞、特别是来自灵长类和猪的单核细胞的STIC制备单克隆抗体。在这点上，如上所述对人源的STIC进行相应宿主动物的免疫并产生相应的杂交瘤细胞系。
本发明的特别优选的实施方式涉及本发明的STIC的亚群，其在它们的细胞表面上共同表达CD3和CD14抗原。这些细胞以下称为STICCD3+/CD14+。以下将更详细解释的是，已经表明这些细胞可诱导调节T淋巴细胞的形成。
共表达表面抗原CD3和CD14的STIC可以直接从本发明的上述方法的步骤c)中形成的自身耐受性诱导细胞中选出，或可以从本发明的上述方法的步骤d)从培养基分离出细胞后、从细胞群体中选出，也可以从STICGM7群体中选出。
此外，通过参考PCT/EP03/07551的TAIC已经表明，根据在此描述的方法制备的细胞强烈地表达基因Foxp3、CTLA4和整联蛋白αEβ7(参见，实施例7，相应于PCT/EP03/07551的实施例12)。与此相反，这些基因没有或仅仅少量地表达于原始的单核细胞。因此，基因Foxp3、CTLA4和整联蛋白αEβ7表达的增量调节是STICCD3+/CD14+细胞的特征。
如在实施例6中讨论的，标记物FoxP3、CTLA4和整联蛋白αEβ7的表达先前仅是描述调节T淋巴细胞的。共表达表面抗原CD4和CD25的T淋巴细胞是调节T淋巴细胞的亚群，其也被称为“抑制物细胞”。它们的功能是抑制身体的免疫反应。特别地，Foxp3被看作特定的转录因子，其充当了调节T细胞发育的控制基因，是这些细胞特异性表达的。根据本发明，优选的是，STICCD3+/CD14+细胞在每μg总RNA中至少表达1×10-9、更优选的至少5×10-9、在特别优选的方案中至少1×10-8μg Foxp3-RNA。
CTLA4类似地被看作检测T淋巴细胞，特别是CD4/CD25阳性T淋巴细胞的调节功能的标记物(参见实施例6中引用的文献)。根据本发明，STICCD3+/CD14+细胞优选的应在每μg总RNA中表达至少5×10-7、更优选的至少3×10-6和在特别优选的方案中至少5×10-6μg CTLA4-RNA。
近来Lehmann等在PNAS  99，第13031-13036页(2002)中描述了识别上皮钙黏着蛋白的整联蛋白αEβ7是高效力调节T淋巴细胞亚群的新型标记物，其与上皮环境相互作用。根据本发明在STICCD3+/CD14+细胞中整联蛋白αEβ7RNA的表达量在每μg总RNA中优选的至少1×10-12、更优选的至少1×10-11，和在特别优选的方案中至少1×10-10，和最优选的至少1×10-9μg。
如实施例6中的表格所示，本发明的细胞与淋巴细胞直接共同培养引起了在调节T淋巴细胞的数量方面，特别是淋巴细胞群体中具有基因Foxp3、CTLA4和整联蛋白αEβ7表达的强烈增量调节的CD4+/CD25+细胞的数量方面的显著升高。该实施例进一步表明，如果将本发明的细胞间接地与淋巴细胞共同培养，没有观察到这种效果。
这些结果表明，用本发明的细胞刺激调节T淋巴细胞的形成和/或增殖，与用这些细胞诱导自身耐受性有关。
通过参考PCT/EP03/07551的TAIC(见上述)，实施例7(相应于PCT/EP03/07551的实施例13)证实了在诱导免疫反应抑制中涉及本发明的细胞的假设。在这个实施例中，来自受体动物的淋巴细胞在体外与来自各个供体动物的免疫抑制细胞孵化。为了诱导耐受性，将与供体衍生的TAIC预孵化的来自受体的淋巴细胞代替TAIC注射到动物中。按照这种方式还可以诱导供体特异性耐受性，而施用了未与供体衍生的TAIC共孵化的受体淋巴细胞的动物没有发展出耐受性。
因而本发明的STIC可以被用作药物制剂。可以直接使用从如上所述的本发明方法的步骤d)获得的细胞。如此获得的群体的总细胞的约10-50％由淋巴细胞和粒细胞形成，其产生于最初的单核细胞分离物(单核细胞馏分)。这些细胞证明了来源于培养步骤中的单核细胞的本发明的STIC的形成(参见实施例4)；如果本发明的STIC被用作药物制剂，它们不会干扰自身耐受性的诱导。
然而，本发明的进一步优选的实施方式，亚群STICGM7和/或STICCD3+/CD14+可以从本发明的方法中获得的STIC群体的总体中分离出来(见上文)，并可用于自身耐受性诱导。
在培养基中(参见实施例2)，STIC和/或STICGM7和/或STICCD3+/CD14+可以保持至少48小时而不使其自身耐受性诱导效果受到损失。
为了用作药物制剂，悬浮在例如人ABO兼容性血清(普遍适用)中的STIC和/或亚群STICGM7和/或STICCD3+/CD14+可以静脉内施用，如短时输液。
对此，药物制剂可以包含与本发明的STIC组合的常规抗炎剂和/或常规免疫抑制剂，例如类固醇，特别是可的松、氨甲蝶呤、环磷酰胺、咪唑硫嘌呤、5-氨基水杨酸(5-ASA)、TNF-α抗体、α-干扰素和B细胞抗体，例如，Rituximab，用于器官特异性或全身性自身免疫疾病的治疗。
此外，本发明的STIC可以与抗组胺剂、二甲基黄嘌呤制备物、β-模拟物、类固醇，特别是可的松、和chromoglycine组合用于治疗变态反应。
发明的详细说明
用于本发明的方法的起始细胞是自体的血液单核细胞，即，来源于待施用本发明的细胞的相应病人的血液的单核细胞。优选的，自体的单核细胞来自人类血液。单核细胞可以通过任何分离方法获得，特别是通过白细胞去除法或从来自全血的单核细胞馏分(暗黄层)中分离。白细胞去除法是特别优选的。
白细胞去除法是利用市场上可买到的单采血液成分术设备进行的多步法的通用术语，其中取出来自人类患者的全血，分离成馏分，将除单核细胞馏分之外的馏分重新输入到人类患者体内。可以按照例如在EP 0 591 194 B1中进一步描述的进行这个步骤。
做为选择，可以在通常的抗凝剂处理之后，利用本领域已知的方法，优选的通过离心作用，将血液首先分离成血浆和分离成白细胞与红细胞。在离心之后，血浆存在于上清液中，在上清液之下，有包含所有白细胞的一层。这一层被也被称为暗黄层。在这之下是包含红细胞(血细胞比容)的相。
关于本发明的方法，首先根据已知方法通过离心分离单核细胞馏分来获得单核细胞。根据优选的方法的实施方式，将单核细胞馏分放置到淋巴细胞分离介质(Ficoll-Hypaque)上，并进行离心(参见实施例1)。实施例1描述了本发明的优选的实施方式，其中通过离心分离出可能仍包含在单核细胞馏分中的红血球和死细胞，包括单核细胞的白细胞作为分离介质上的分离物存在。其后，小心地移出白色相，为了富集分离物中的单核细胞，重复进行离心和洗涤。在这个过程中，单核细胞将与一部分淋巴细胞一起聚集在离心管的底部。
根据本发明方法的特别优选的实施方式，控制获得包含单核细胞的分离物的条件，参照细胞的总数，使得分离物除单核细胞外含有约10-50％的淋巴细胞。优选的，都参照细胞的总数，分离物含有约50-90％，在特别优选的方案中60-70％的单核细胞，和约10-50％，在特别优选的方案中20-50％的淋巴细胞，其中差异选择性地由粒细胞(granolocytes)提供。
如实施例4中所示，参照细胞总数，淋巴细胞以20-30％的数量存在，在用M-CSF和γ干扰素培养原始单核细胞期间将导致产生显著更高数量的CD3/CD14双阳性STIC，如果仅存在少量的淋巴细胞(约5％)可以得到例证(参见图3)。
为了制备足够数量的STIC，首先必需的是容许单核细胞的增殖。为此，可以使用适合于单核细胞的已知的生长培养基；然而，培养基必须含有生长因子M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)。M-CSF(也称作CSF-1)由单核细胞、成纤维细胞、淋巴细胞和内皮细胞产生。在培养基中M-CSF的浓度优选的可以是从2到20μg/l培养基的数量，更优选的是4到6μg/l，在特别优选的方案中为5μg/l。
优选的，所述生长培养基不含有粒细胞-巨噬细胞系集落刺激因子(GM-CSF)，因为存在这个因子时STIC的产量降低。
随后地或同时地，所述细胞必须用γ-IFN刺激，即，必需在存在γ-IFN的情况下培养它们。在最初的增殖阶段之后，用γ-IFN刺激单核细胞，在含有生长因子的培养基中持续3到6天。优选的在存在M-CSF的情况下的培养开始后第4天开始γ-IFN刺激，这种刺激在孵化条件下，即，37℃和5％CO2大气中延续优选的24到72小时，更优选的48小时。
在培养基中γ-IFN的浓度可以是0.1到20ng/ml，优选的1到10ng/ml，特别优选的5ng/ml。
用γ-IFN的刺激可以与在含有生长因子的培养基中增殖单核细胞同时开始。然而，在如上所指出的，在3到6天之久的最初增殖阶段之后进行刺激是优选的。细胞的增殖和用γ-IFN刺激应当优选的总共不超过8天。无论如何，应当这样进行γ-IFN处理，从而在增殖阶段后，其持续至少24小时，最大限度的72小时，优选的48小时。因此增殖和刺激细胞的时间应当优选的总共持续4到8天。
本发明的优选的实施方式，如在实施例2中指出的，这样进行增殖和用γ-干扰素刺激，从而单核细胞首先在含有生长因子的培养基中增殖，在3到6天之后向培养基中添加γ-IFN，使培养基中达到0.1到20ng/ml、优选的1到10ng/ml，和特别优选的5ng/ml的浓度。
优选的，在培养容器中进行本发明的方法，在培养容器的表面已经预先用胎牛血清(FCS)包被，或优选的用人类ABO兼容性血清包被(参见实施例2)。通过在使用前用FCS包被培养容器的表面来进行FCS包被，在几个小时的相互作用之后，特别是4到72小时、优选的12到48小时、特别是24小时之后，用合适的方式除去未附着到表面上的FCS。按照与如上所述相同的方法进行人类ABO兼容性血清的包被。
在培养步骤期间，在约24小时之后细胞将沉积在培养容器的底部。由于它们的粘附性质，单核细胞和来源于单核细胞的STIC在处理期间，将附着到各自的培养容器的底部。如在实施例2中描述的，如果在培养期间改变培养基，先小心地除去上清液，例如通过移液出或轻轻倒出，随后装入新鲜培养基。然而，优选的，不洗涤或仅仅小心地洗涤附着于底部的细胞，从而不除去存在的任何淋巴细胞。
可以机械地移除附着的细胞，例如通过精细的细胞刮刀或刮铲的方法。
然而，本发明的方法的优选的实施方式，通过用适合的酶，例如用胰蛋白酶处理来完全移除细胞(参见实施例2)。容许胰蛋白酶溶液(0.1到0.025g/l，优选的0.05g/l)在存在5％CO2的情况下在35℃到39℃，优选的在37℃作用于细胞2到10分钟。
然后以常规的方式阻断酶活性，现在可以通过离心按常规方法获得自由漂浮的STIC。然后它们就是可以直接使用了，选择性地悬浮在适合的介质中，例如在PBS中。然而，也可以在营养培养基中将它们保留几天，特别是约2到3天(参见实施例2)，其中这个保存培养基既不应含有生长因子也不应含有γ-IFN。细胞可以作为STIC在这种营养培养基中保存至少48小时。
为了存储较长的时间，可以将细胞深度冷冻。深度冷冻活细胞的方案是本领域已知的，参照Griffith M.等，(″Epithelial CellCulture，Cornea″，in Methods of tissue engineering，Atala A.和Lanza R.P.，Academic Press 2002，第4章，第131-140页)。用于深度冷冻本发明的细胞的优选的悬浮培养基是都补充有DMSO的ABO兼容性血清或FCS。
根据本发明一个实施方式，从步骤c)或d)的含有自身耐受性诱导细胞的细胞悬液可以针对那些结合抗体GM-7的细胞进一步纯化，从而获得STICGM7亚群。这种纯化的方法在上文中详细地描述了。
本发明的进一步优选的实施方式，从STIC群体中选出在它们的细胞表面上共同表达CD3和CD14抗原的细胞。选出这种细胞的方法是本领域已知的。这种方法的实例是“荧光激活细胞分选”(FACS)，“免疫磁性微球分选”和“磁性活化的细胞分选”(MACS)，或所谓“丛簇法”[参见，Gmelig-Meyling F.等，″Simplified procedurefor the separation of human T-and non T-cells”，Vox Sang.33，5-8(1977)]。
可以直接从在本发明的上述方法的步骤c)或d)中获得的STIC群体，或从STICGM-7亚群中选择STIC亚群STICCD3+/CD14+。进行后一个方法意味着逐步地富集STICCD3+/CD14+。
在本发明的优选的实施方式中，根据本发明STICCD3+/CD14+亚群的细胞本身被用于生产药物组合物，用于体内地预防和/或治疗自身免疫疾病。
这种自身免疫疾病的实例有：
●有自身免疫特征的风湿疾病，特别是类风湿性关节炎、SLE、Sj_gren′s病、硬皮症、皮肌炎、多肌炎、莱特尔氏综合征；
●糖尿病；
●血液和血管的自身免疫疾病，特别是自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ITP)、抗磷脂抗体综合症、血管炎(多发性结节性动脉炎类、眶坏死性肉芽肿病、超敏性脉管炎、巨细胞性动脉炎)、系统性红斑狼疮、mixed essentialcyroglobulinemia；
●肝脏的自身免疫疾病，特别是自身免疫肝炎、夏科氏肝硬变和原发性硬化性胆管炎；
●甲状腺的自身免疫疾病，特别是桥本甲状腺炎、Grave病；
●中枢神经系统的自身免疫疾病，特别是多发性硬化、重症肌无力；和
●大疱皮肤疾病，特别是寻常天疱疮、增殖性天疱疮、落叶状天疱疮、Senear-Usher综合症和巴西天疱疮。
在类似自身免疫性疾病的人工诱导的结肠炎的两个模型系统的小鼠中，显示了STIC对于诱导自身耐受性是有用的(参见实施例8和9)。
这些模型是葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的慢性结肠炎(实施例8)和小鼠慢性实验性结肠炎的CD62L+/CD4+SCID转移模型。在两个模型中，小鼠都发展出具有类似人类结肠炎溃疡的症状的慢性结肠炎。
在两个模型系统中，与未处理的动物或用不含STIC的“对照细胞”处理的动物相比，在疾病发作后不久施用STIC引起了对结肠炎的典型症状的抑制(参见实施例8和9)。
正如以上的讨论，在变态反应的发展中涉及到过度的免疫反应。Bach等(loc.cit.)已经证明，含有CD4+/CD25+细胞作为亚群的CD4+细胞可以缓解实验性变应性脑脊髓炎(EAE)的进展。因为，如在此所示的，施用STIC产生了对增加CD4+/CD25+T细胞群体的诱导，所述细胞对于治疗变态反应也是有用的。
所以，本发明的进一步优选的实施方式，用含有STIC的药物预防和/或治疗变态反应。
药物制剂可含有本发明的活STIC，所述细胞是从本发明的方法的步骤d)获得的，优选的以约1×105到1×107细胞/ml、更优选的约1×106细胞/ml制剂的数量悬浮在药学上可接受的载体中。
在本发明的进一步优选的实施方式中，根据本发明STICGM7亚群的细胞本身被用于生产药物组合物，用于体内地预防和/或治疗与被扰乱的自身耐受性有关的自身免疫疾病。
在本发明的一个实施方式中，这种药物制剂可含有本发明的、与抗体GM-7结合的活STICGM7细胞，优选的以约1×106到1×108细胞/ml、更优选的约1×106细胞/ml制剂的数量悬浮在药学上可接受的液体载体中。
在本发明最优选的实施方式中，这种药物制剂优选的约5×105到5×107细胞/ml、更优选的约5×106细胞/ml制剂的含有本发明的、共表达抗原CD3和CD14的活STICCD3+/CD4+细胞。
以上描述的药物制剂可含有本发明的、悬浮在生理学地良好耐受的培养基中的细胞。适合的培养基例如Ringer溶液、生理盐水或5到20％人白蛋白溶液等等。
取决于受各自疾病影响的身体位置，含有本发明的STIC的药物组合物可以通过各种给药途径施用。在本发明优选的实施方式中，所述药物组合物可以静脉内地、intraportally、皮下地、皮内地、腹膜内地或鞘内地施用。此外，所述药物组合物可以直接施用到特定器官中，例如肝脏或肌肉，经吸入或施用到体腔中。
在那些与疾病的发展有关的基因是已知的，含有STIC作为活性成分的药物制剂也可以用于预防自身免疫疾病。如果个体被诊断为是与一个或多个自身免疫疾病有关的基因的携带者，可以通过在生命的早期施用来源于自体单核细胞的STIC来预防疾病的发作。在本发明的一个优选的实施方式中，将自体的STIC与自体的淋巴细胞和与各个基因表达的肽一同培养。这将引起特异于各个基因产物的自体的调节T淋巴细胞的发育。如以下在实施例7中描述的，然后这些调节T淋巴细胞可以再次施用给相应个体(相应于PCT/EP03/07551的实施例13)。
在本发明的进一步的实施方式中，STIC可用于预防间隔性发生的自身免疫性疾病的情况，例如类风湿性关节炎。如果在疾病第一次或后来的突发之后施用含有STIC的药物制剂，可以预防进一步的突发。
本发明的细胞制剂可以含有活STIC，所述STIC是从本发明的方法的步骤d)获得的。做为选择，所述制剂可含有属于STICGM7细胞亚群的细胞，所述细胞与抗体GM-7结合，或含有属于STICCD3+/CD14+细胞亚群的细胞，所述细胞在它们的细胞表面上共表达抗原CD3和CD14。所述制剂可以含有以每ml优选的至少1×105、更优选的至少5×105和最优选的至少1×106细胞的数量悬浮在液体载体培养基中的相应细胞。所述培养基可以是细胞能良好耐受的细胞培养或运输培养基，例如5到20％人白蛋白溶液。做为选择，在制剂中的细胞可以是深度冷冻的，并被包含在适合的存储培养基中，例如含有50％人白蛋白溶液和10％DMSO的RPMI。
最后，本发明还涉及一种方法，其中本发明的自身耐受性诱导细胞(STIC或STICGM7或STICCD3+/CD14+)被用于在体外产生或增殖自体的调节T淋巴细胞。如实施例6(相应于PCT/EP03/07551的实施例12)所示，相应于STIC的TAIC与淋巴细胞直接的体外共培养引起了调节T淋巴细胞，特别是CD4+/CD25+淋巴细胞的显著增殖。因此有可能通过直接使来源于个体的单核细胞的STIC与自体的淋巴细胞共培养，来产生和/或增殖自体的调节T淋巴细胞，特别是CD4+/CD25+淋巴细胞。
根据本发明直接的体外培养意思是，STIC和淋巴细胞在同一培养基中以直接的物理接触共同培养，如上述引文中在实施例6中例举的。
在这个方法中，培养基优选含有大约相等数量的细胞，即STIC和淋巴细胞，每种细胞的数量优选的至少每ml 1×105、更优选的至少5×105和最优选的至少1×106个细胞，悬浮在液体载体培养基中，培养基可以是细胞能良好耐受的细胞培养或传输培养基，例如5到20％人白蛋白溶液。共培养优选的在生理情况下，在约37℃，例如在孵化器中，进行优选的约3到5天，更优选的4天。
在实施例7(相应于PCT/EP03/07551的实施例13)中表明，既不能通过将产自供体单核细胞的TAIC施用给受体，也不能通过将受体淋巴细胞再次施用给受体来诱导移植接受，所述受体淋巴细胞先前已经在体外与如上所述从供体单核细胞制备的TAIC直接共培养了。类似地，通过向病人再次施用自体的淋巴细胞可以诱导自身耐受性，所述自体的淋巴细胞先前已经与从病人自己的单核细胞制备的STIC直接共培养了。
本发明的进一步的实施方式，因此可以通过将来自个体的淋巴细胞与来源于这个个体的单核细胞的STIC共培养，在体外从来源于待治疗个体的淋巴细胞制备调节T淋巴细胞。将共培养的淋巴细胞再次施用给受体将引起自身耐受性的诱导，如实施例7中所示。
如此制备的调节T淋巴细胞可以通过在此描述(见上文)的FACS分离，可以被用在药物制剂中，用于预防和/或治疗与被扰乱的自身耐受性相关的疾病，其中所述细胞悬浮在如上所述的药学上可接受的载体中。
通过实施例进一步详细的说明本发明。
如果在实施例中没有定义，使用的培养基和物质的成分如下：
1.青霉素/链霉素溶液：
每ml生理氯化钠溶液(NaCl 0.85％)(Gibco目录No.15140122)10,000单位的作为青霉素G的钠盐的青霉素，和1000μg作为硫酸链霉素的链霉素。
2.胰蛋白酶-EDTA
0.5g胰蛋白酶和0.2g EDTA(4Na)/l
3.RPMI1640(1×，液体(11875))含有L-谷氨酰胺
RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培养基1640是浓缩的制剂，其可广泛地用于哺乳动物细胞。
  成分   分子量   浓度(mg/l)   摩尔浓度(nM)
  无机盐
  硝酸钙(Ca(NO3)24H2O)氯化钾(KCl)硫酸镁hate(MgSO4)氯化钠(NaCl)碳酸氢钠ate(NaHCO3)磷酸氢钠te(Na2HPO4)   236751205884142   100.00400.0048.846000.002000.00800.00   0.4245.300.407103.4423.8005.63
  进一步的成分
  葡萄糖谷胱甘肽，还原的酚红   180307398   2000.001.505.00   11.100.00320.0125
  氨基酸
  L-精氨酸L-天冬酰胺L-天冬氨酸L-二盐酸半胱氨酸L-谷氨酸L-谷氨酰胺甘氨酸L-组氨酸L-羟脯氨酸L-异亮氨酸L-亮氨酸L-盐酸赖氨酸L-甲硫氨酸L-苯基丙氨酸L-脯氨酸L-丝氨酸L-苏氨酸L-色氨酸L-酪氨酸二钠，二水合物L-缬氨酸   17413213331314714675155131131131146149165115105119204261117   200.0050.0020.0065.0020.00300.0010.0015.0020.0050.0050.0040.0015.0015.0020.0030.0020.005.0029.0020.00   1.100.3790.1500.2060.1362.050.1330.09670.1530.3820.3820.2190.1010.09090.1740.2860.1680.02450.1100.171
  维生素
  生物素D-泛酸钙氯化胆碱叶酸i-肌糖烟酰胺p-氨基苯酸(PABA)HCl吡哆醇核黄素HCl硫胺素维生素B2   2444771404411801221372063763371355   0.200.253.001.0035.001.001.001.000.201.000.005   0.0080.00050.02140.00220.1940.00810.00720.00480.00050.00290.00000369
参考：Moore G.E.，et al.，J.A.M.A.199：519(1967)
4.PBS(Dulbecco′s磷酸盐缓冲盐水)cf.J.Exp.Med.98：167(1954)：
  成分   g/l
  KCl   0.2
  KH2PO4   0.2
  NaCl   8.00
  Na2PHO4   1.15
5.Ficoll-Hypaque：
淋巴细胞分离介质(蔗糖/表氯醇共聚物Mg 400,000；密度1.077，用泛影钠调整)。
6.L-谷氨酰胺
液体：29.2mg/ml
7.巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)
来自大肠杆菌的重组人M-CSF；含有包括N-末端甲硫氨酸的作为单体(18.5kD)的135个氨基酸残基；以37kD的摩尔质量作为同二聚体存在；(SIGMA目录No.M 6518)
8.γ-干扰素(γ-IFN)
来自大肠杆菌的重组人γ-IFN；含有143个氨基酸残基的16.7kD蛋白(CHEMICON目录No.IF002)
9.葡聚糖硫酸钠
Sigma-Aldrich 31403，盐，MW 40kD
                          实施例1
                     从全血分离单核细胞
通过两种不同的方法从病人获得全血：
a)白细胞去除法：利用COBE_SpectraTM单采血液成分术系统(Gambro BCT，Lakewood，CO，USA)，按照根据厂家说明(COBE光谱版本4.7/5.1/6.0/7.0))的单核模式(MNZ)进行白细胞去除法。
b)血液成分的常规分离：将450ml全血在含有63ml稳定剂溶液三室袋中混合以避免血液的凝结并饲育细胞，所述稳定剂溶液每升H2O含有3.27g柠檬酸、26.3g柠檬酸钠、25.5g葡萄糖和22.22g磷酸二氢钠。溶液的pH值是5.6-5.8。
为了分离血液的成分，随后对这个混合物在20℃以4000rpm进行“急剧离心”7分钟。这产生了在三个分层中的血球和非血球成分的分层。利用放置在为此而设的压缩机中的袋子，然后将红血球挤压到下袋，将血浆挤压到上袋，所谓的暗黄层保持在中袋中，含有约50ml的体积。
然后将从这两种方法新鲜获得的50ml数量的单核细胞馏分分成每个25ml的2份，分别层铺在先前已经导入到两个50ml Falcon管的25ml Ficoll-Hypaque分离介质上。
以2500rpm无制动地将这个制剂离心30分钟。此后，可能仍存在于单核细胞馏分中的任何红血球和死细胞在Ficoll相下方，而白细胞，包括单核细胞在Ficoll上作为白色中间相被分离。
随后，通过移液管将包括单核细胞的白色中间相小心地移出，与10ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)混合。
然后将这个制剂以1800rpm无制动地离心10分钟三次，在每个离心过程之后用移液管移除上清液并导入新鲜的PBS。
聚集在离心管(Falcon管)底部的细胞团含有单核细胞馏分，即，单核细胞。
c)鼠实验8和9所需的单核细胞(用遗传学相同的小鼠进行)从同基因的供体鼠的脾脏获得。使脾脏在低压下通过细筛，将这样分离的细胞重悬浮于PBS中。将悬浮的脾脏细胞层铺在先前已经导入到50ml Falcon管中的25ml Ficoll-Hypaque分离介质上。然后按如上所述相同的方法继续进行步骤。
                    实施例2
               单核细胞的增殖和修饰
单核细胞的培养和增殖在营养培养基中利用以下组合物进行：
  PRMI 1640培养基   440ml
  胎牛血清(FCS)，作为选择，ABO兼容性血清   50ml
  青霉素/链霉素溶液   5ml
  总体积   500ml
营养培养基含有2.5μg/500ml的M-CSF。
将在实施例1中分离的单核细胞以106个细胞的总量悬浮在10ml营养培养基中，转移到培养皿(直径为100mm)上。培养皿先前已经用纯的钝化FCS填满，在24小时后倒出FCS，来这样获得包被有FCS的平皿。
用适合的盖子覆盖培养皿，在孵化器中37℃保持3天。在24小时后细胞沉积在培养皿的底部。在第二天，移除上清液，用10ml新鲜营养培养基填满培养皿。
在第4天，添加含50ngγ-干扰素的10ml营养培养基，再次闭合平皿，在孵化器中进一步在37℃保持48小时。
随后，将各用PBS按1∶10稀释的10ml胰蛋白酶溶液移液到培养皿中。闭合培养皿在孵化器中在37℃保持10分钟。
此后，用细胞刮刀对附着于培养皿底部的细胞进行分离，使得细胞的主要部分(＞90％)漂浮在上清液中。
将总上清液(10ml胰蛋白酶溶液+10ml培养基)移出，组合到50ml Falcon管中，在1800rpm进行离心10分钟。然后弃去上清液，向沉淀(剩余的细胞团)中添加新鲜的营养培养基(见上文)，每106个细胞添加1ml营养培养基。根据已知的方法确定细胞数量用于确定确切的剂量，参照Hay R.J.，″Cell Quantification andCharacterisation″，in Methods of Tissue Engineering，AcademicPress 2002，第4章，第55-84页。
将这个细胞悬液离心(1800rpm，10分钟，见上文)，将细胞团混和到PBS中，或用于人类施用混合到NaCl(生理学的)中。随后，可以直接进行静脉内施用，或在48小时内施用。
做为选择，在离心和弃去含有胰蛋白酶的上清液之后，向细胞中添加FCS/DMSO作为冷冻培养基，以10ml的体积进行深度冷冻。
冷冻培养基含有95％FCS和5％DMSO。在所有情况下，将约106个细胞混和到1ml培养基中，按以下步骤冷却：
冰上30分钟；
-20℃在预冷却的Styropor盒中2小时；
在Styropor中-80℃ 24小时；
在小试管中在液氮(N2)中-180℃存储。
图1显示了通过流式细胞计数法测定的单核细胞上抗原表达方面的表型变化，所述单核细胞是对原始的单核细胞进行培养和γ-IFN刺激之后使用的。与修饰之前的细胞相比(图1中的左图)，对原始单核细胞的培养和γ-IFN刺激引起了修饰后对GM-7结合的显著增加(图1中的右图)。
下文的实施例3到7取自PCT/EP03/07551。它们表征了其中公开的移植接受诱导细胞(TAIC)。由于PCT/EP03/07551的TAIC与本发明的自身耐受性诱导细胞(STIC)类似(见上文)，在这些实施例中报告的结果也适于STIC。
更确切地说，下文的实施例3到7显示了：
●通过利用单克隆抗体GM-7，从用M-CSF培养原始单核细胞和γ-IFN刺激之后获得的TAIC群体中可以分离出具有优化的抑制物功能的细胞群体(实施例3)；
●存在于单核细胞馏分中的淋巴细胞对产生作为TAIC作用的CD14+/CD3+细胞有很大的影响(实施例4)；
●IDO抑制剂1-甲基色氨酸对TAIC的抑制物功能没有影响(实施例5)；
●供体A的TAIC与供体B的淋巴细胞在体外直接共培养诱导了调节T细胞，即，CD4+/CD25+淋巴细胞的形成(实施例6)；和
●在体内在供体TAIC和受体淋巴细胞之间的物理的细胞与细胞的相互作用诱导了能防止器官排异反应的调节T细胞的产生(实施例7)。
                      实施例3
                抗体GM-7与TAIC的结合
通过用按PCT/EP03/07551中描述制备的人类TAIC免疫小鼠产生单克隆抗体GM-7。产生所述抗体的杂交瘤细胞以保藏号DSM ACC2542保藏在“德意志微生物保藏中心”。下文报告的结果表明，该抗体特异性地与仅在CD14+细胞上表达的抗原结合，所述CD14+细胞已经根据本发明经历了用M-CSF外部修饰6天和γ-IFN刺激2天。
图1显示了通过流式细胞计数法测定的、GM-7与体外修饰后的单核细胞，即转化成TAIC后的细胞的结合能力。可以看出，直接从暗黄层中获得的CD14阳性单核细胞不与抗体GM-7结合(左图：灰色遮盖的云斑与抗体对照相符)。与此相反，在M-CSF中培养和用γ-IFN刺激之后，部分单核细胞表达抗原，该抗原被单克隆抗体GM-7识别。在如实施例2中描述的培养之后，约80％的转化的单核细胞能与单克隆抗体GM-7结合(右图)。
在进一步的实验中，CD14+/GM-7+细胞的抑制物活性与混合淋巴细胞培养(MLC)中的CD14+/GM-7-细胞的抑制物活性进行比较。如Kurnick，J.T.″CellularAssays″in：Diagnostic Immunopathology，[Colvin R.B.，Bhan A.K.，McCluskey，R.U.(ed.)，Raven Press，New York，751-771页(1994)]中描述的进行MLC。
在这个实施例中，TAIC来自个体B。如图2所示，在GM-7阳性与GM-7阴性的TAIC的抑制物活性之间存在显著差异。仅有在用M-CSF处理6天和用γ-IFN刺激2天后获得的TAIC群体的GM-7阳性馏分显示出对用B的细胞刺激后的个体A的效应物细胞的T细胞增殖活性的显著抑制效果。
                       实施例4
在单核细胞培养期间淋巴细胞对形成CD3+/CD14+细胞的影响
通过比较两个不同的组别，测定存在于单核细胞馏分中的淋巴细胞对产生作为TAIC作用的CD14+/CD3+细胞的影响。
对于第一个组别(以后称为“Mo”)，单核细胞馏分最初取自如实施例1中描述的暗黄层的中间相。如实施例2中描述的，随后将细胞转移到应用M-CSF的培养步骤。在培养的起始点后的一小时内，每次用10ml PBS将附着于组织培养烧瓶底部的单核细胞洗涤五次，从而培养物中存在的淋巴细胞数量被减少到＜5％(4.8±2.4％)，而如此获得的富集的单核细胞(CD14+)数量达到90％以上(92±5.6％)。在该组别中额外的细胞成分是B-淋巴细胞和粒细胞。
在第二个组别中的细胞(以后称为“Mo+Ly”)作为单核细胞馏分也取自如实施例1中描述的暗黄层的中间相。然而，不同于组别“Mo”，在培养阶段开始后的24小时仅对附着于组织培养烧瓶底部的细胞洗涤一次，如实施例2中所述。结果，获得的细胞群体由45±5.3％CD14+单核细胞和23.5±8.9％CD2+淋巴细胞组成。如组别“Mo”中一样，淋巴细胞和粒细胞也存在于这个组别中。
通过对三个实验组别分别进行的流式细胞计数法，确定每个组别的总细胞群体中各种细胞类型的数量。结果报告为包括标准偏差的平均值。
在培养开始时(d0＝第0天)在组别“Mo”和组别“Mo+Ly”中都不能测定出CD14+/CD3+细胞。在五天的培养时间后，终止实验，如实施例2中描述的将细胞从组织培养烧瓶底部分离下来之后通过FACS分析来表征细胞。发现，在这些组别中CD14+细胞的相对的数量下降，在组别“Mo”中从92％到42％，在组别“Mo+Ly”中从45％到28％。表面上，淋巴细胞的增殖比单核细胞更快；淋巴细胞的相对数量在组别“Mo”中从4.8％增加到69.8％，在组别“Mo+Ly”中从23.5％增加到50.6％。在培养期间，在两个培养中都形成了作为TAIC作用的CD14+/CD3+细胞。关于这点重要的是，在组别“Mo+Ly”中观察到CD14+/CD3+细胞的显著更高的增加，其数量为32.0±5.3％，而组别“Mo”仅7.2±3.2％。
这些结果表明，在培养开始时用于将单核细胞富集到超过90％的相对数量的细胞纯化，对于TAIC群体中免疫抑制性CD14+/CD3+细胞的产生有消极的影响，而在实施例1和2中描述的方法引起了显著更高的CD14+/CD3+细胞产量。
                      实施例5
测定IDO抑制物1-甲基色氨酸对TAIC的免疫抑制活性的影响
为了确定酶吲哚胺-2，3-双加氧酶(IDO)的抑制剂1-甲基色氨酸(1-MT)是否影响组别“Mo”和“Mo+Ly”中产生的TAIC(参见实施例4)的抑制物功能，建立了在存在或不存在1-MT的情况下，与用PHA(植物凝集素)刺激的T细胞的各种混合淋巴细胞培养(MLC)。
在这些混合淋巴细胞培养中，将带有2μg PHA的50,000个淋巴细胞转移到96孔板的加样孔中，随后进行超过144小时的增殖(称为“PhaLy”)。仅在未添加PHA的培养基中培养的淋巴细胞作为进一步的对照(称为“Ly”)。
为了测定在不同的共培养中PHA刺激的淋巴细胞的增殖，进行以下4个不同的组别并检查：
PhaLy+“Mo+Ly”PHA刺激的淋巴细胞和TAIC[来自根据实施例4的组别“Mo+Ly”的105个细胞]。
PhaLy+“Mo+Ly”+1-MT在存在2μmol 1-MT的情况下PHA刺激的淋巴细胞和TAIC[来自根据实施例4的组别“Mo+Ly”的105个细胞]。
PhaLy+“Mo”PHA刺激的淋巴细胞和TAIC[来自根据实施例4的组别“Mo”的105个细胞]。
PhaLy+“Mo”+1-MT  在存在2μmol 1-MT的情况下PHA刺激的淋巴细胞和TAIC[来自根据实施例4的组别“Mo”的105个细胞]。
在144小时的培养之后，在存在3[H]-胸腺嘧啶核苷的情况下将所有的对照和共培养物进一步培养24小时(“脉冲”)，此后按每分钟计数(cpm)测定掺合的放射性标记的胸腺嘧啶核苷的数量，参见图4。在这样的配置之中，测定的放射活性的数量是对掺合到DNA中的标记的胸腺嘧啶核苷的数量的度量，因此是对淋巴细胞增殖率的度量。在图4中报告的数值相应于各来自3个实验的三重测定的平均值，每个都带有标准偏差指标。
结果表明，未用PHA刺激的淋巴细胞(“Ly”)没有显著地增殖，观察到的平均放射性为367cpm(参见图4)。与此相反，用2μg PHA刺激引起淋巴细胞增殖率的显著增加(“PhaLy”)，在这些样品中测量的最高的掺合是18459cpm的平均值。
向淋巴细胞培养物中添加TAIC明显降低了增殖率，如果是添加了来自实施例4的组别“Mo+Ly”的细胞(PhaLy+“Mo+Ly”，测定值1498cpm)则强烈地降低增殖比率，当添加来自实施例4的组别“Mo”的细胞(PhaLy+“Mo”，测定值3369cpm)时则较少强烈地降低增殖比率。
在向含有“Mo+Ly”和“Mo”与刺激的淋巴细胞的组别中添加2μmol1-甲基色氨酸(1-MT)之后获得的结果表明，1-甲基色氨酸(1-MT)协同地增加了TAIC的抑制物功能，而用来自组别“Mo+Ly”的TAIC(测定值267cpm)比用来自组别“Mo”的TAIC(390cpm)降低更强。
                     实施例6
人TAIC与异源淋巴细胞体外共培养用于产生调节T细胞
为了检查TAIC是否在受体中诱导了调节T细胞，即CD4+/CD25+淋巴细胞的形成，进行TAIC与淋巴细胞的几种不同的体外培养，分析由此产生的调节T细胞的形成。
为此，供体A的TAIC在体外直接地或间接地与供体B的淋巴细胞共培养。在直接共培养中，TAIC(供体A的)和淋巴细胞(供体B的)之间的细胞与细胞的直接接触成为可能，而在间接共培养中，一种膜(“细胞培养插入”，0.4μm孔径，Falcon，序号353090)容许培养基的交换，但抑制两种细胞群体的物理接触。直接的或间接的共培养在孵化条件下，即在37℃、5％CO2的空气中，优选的进行3到5天，更优选的4天。
在培养之后，确定两个组别中以及对照中各自的调节T细胞(CD4+/CD25+)的数量，其中分别单独培养TAIC或淋巴细胞。此外，确定对照组别中CD3+/CD14+细胞的数量，所述细胞是混合淋巴细胞培养中具有最显著的抑制物功能的TAIC细胞群体的成分，其中单独培养TAIC。
在所有组别中，通过FACS分析确定细胞的表面抗原，分析在细胞总数中各个细胞群体的数量。
此外，通过PCR确定各个细胞群体中由调节T细胞特异性表达的三种新的主要基因(Foxp3、CTLA-4和整联蛋白αEβ7)的相对表达(见表格)。Foxp3是特殊的转录因子，其被认为是调节T细胞发育的控制基因，并由这些细胞特异性地表达[参见，Hori，S.等，″Controlof Regulatory T-cell Development by the Transcription FactorFoxp3″，Science  229，1057-1061(2003)]。
CTLA-4是另一种因子，其被用作标记物用于确定CD4+/CD25+T细胞的调节功能(参见Khattri，R.等，″Anessential role for Scurfinin CD4+/CD25+T regulatory cells Nature Immunology，onlinepublication，doi：10.1038/ni909(2003)；Shimizu，J.等″Stimulation of CD25+/CD4+ regulatory T cells through GITR breaksimmunological self-olerance″.Nature Immunology，onlinepublication，doi：10.1038/ni759(2003)；Cobbold，S.P.等“Regulatory T cells in the induction and maintenance ofperipheral transplantation tolerance”，Transpl.Int.16(2)，66-5(2003)。
整联蛋白αEβ7是一种与上皮钙黏着蛋白结合的整联蛋白，其可被用作调节CD25+T细胞的最有效的亚群的标记物[参见Lehmann，J.等“Expression of the inegrin αEβ7 indentifies unique subsetsof CD25+ as well as CD25- regulatory T cells″PNAS 99(20)，13031-13036(2002)]。
通过利用GAPDH和β-肌动蛋白，两种“看家基因”作为对照，通过定量PCR的方法进行Foxp3-、CTLA-4-和整联蛋白αEβ7-表达的测定；一方面，使测定的数值相互关联，从CD14+/CD3-细胞获得的数值被设定为1；另一方面，按μg表示每μg总RNA中的绝对RNA数量，来使在体外受TAIC影响的、测量到的抑制以及CD4+/CD25+双阳性细胞的形成与各个基因的表达比率相关。用于定量PCR的标准方法是本领域技术人员公知的(参见Lottspeich，F.，Zorbas，H.″Bioanalytika″，Spektrum Akademischer Verlag GmbH，Heidelberg-Berlin，1998)。
表格显示，在直接共培养获得的淋巴细胞群体中，双阳性细胞CD4+/CD25+的百分比大量增加到8.7％的数值，相比较从间接共培养或对照获得的CD4+/CD25+淋巴细胞的数值，其几乎是相等的，分别是2.38％和2.65％。
与CD4+/CD25-细胞中的表达相比，CD4+/CD25+细胞的亚群从所有测试的主基因中表达出最高相对数量的mRNA(见表格)。而Foxp3的表达增加约因素10(37比3.75)，CTLA-4表达达到甚至更高的最大表达(4699比0.376)。在共培养期间第三个主基因整联蛋白αEβ7在CD4+/CD25+细胞中的表达的增加几乎与CTLA-4一样高，因为整联蛋白αEβ7mRNA的绝对数量在CD4+/CD25+细胞中达到1.4×10-9/μg总RNA，相比较CD4+/CD25-细胞中为3.4×10-12μg mRNA/μg总RNA。
                        对照         直接共培养         间接共培养
           TAIC          淋巴细胞          淋巴细胞          淋巴细胞
  CD14+/CD3+   CD14+/CD3-   CD4+/CD25+   CD4+/CD25-   CD4+/CD25+   CD4+/CD25-  CD4+/CD25+   CD4+/CD25-
  FACS[阳性细胞％]   41   20   2.65   30,8   8.7   49  2.38   27.6
  相对Foxp3表达[PCR]   50   1   15   1.5   37   3.76  10   1.5
  绝对RNA数量Foxp3   1.6×10-8   3.2×10-10   4.8×10-9   8×10-10   1.2×10-8   1.2×10-9  3.2×10-9   4.8×10-10
  相对CTLA4-表达[PCR]   12500   1   0.375   0.1   4699   0.376
  绝对RNA数量CTLA4   6,5×10-6   5.2×10-10   1.9×10-10   5.2×10-10   2.4×10-6   1.9×10-10
  绝对RNA数量整联蛋白αEβ7   3.4×10-9   没有可检测   1.4×10-9   3.4×10-12
表格：参考细胞的表面标记物CD3、CD4、CD14、CD25，测定在直接和间接培养之后细胞总数中特定细胞群体的数量，测定这些细胞群体中三种基因(Foxp3、CTLA-4和整联蛋白αEβ7)的RNA的相对表达和绝对数量。
在间接的共培养之后，在CD4+/CD25+亚群中Foxp3-mRNA的相对数量仅达10，甚至比对照的淋巴细胞表达的相对数量更低，对照的淋巴细胞表达相对数量15的Foxp3-mRNA。
对照的淋巴细胞表达的CTLA-4mRNA的相对数量在CD4+/CD25+群体中低达0.375，在CD4+/CD25-群体中低达0.1。
在TAIC细胞的CD14+/CD3+亚群中的CTLA-4表达类似于Foxp3的表达，也比所有其它细胞群体中的显著更高。
在这点上，值得注意的是，在CD14+/CD3+亚群中CTLA-4表达(相对值12.500)比Foxp3表达强得多，Foxp3表达的相对值为50。
在TAIC的CD14+/CD3-亚群中没有可检测的整联蛋白αEβ7的表达，而类似于其它两个被分析基因的表达的状态，在TAIC的CD14+/CD3+亚群中整联蛋白的表达，测量为按每μg总RNA的μg RNA绝对值，达到了最高值(3.4×109μg/μg总RNA)。
与正常的淋巴细胞相比，在来自单核细胞的TAIC上三种淋巴细胞标记物Foxp3、CTLA-4和整联蛋白αEβ7的显著增加的表达是完全意外的，迄今为止在单核细胞或来源于单核细胞的细胞上还从未被观察到。
总之，如上所示的这个实施例的结果表明：如果假定Foxp3-、CTLA-4-和整联蛋白αEβ7表达的水平与各个细胞的免疫调节性质相关，在此表明的是，TAIC的CD3+/CD14+亚群的抑制物活性与这三个基因的高表达相关。考虑到迄今为止仅对淋巴细胞描述了这些标记物，但从未在单核细胞来源的细胞中描述过，这是更加令人惊讶的。
进一步表明的是，与间接的共培养和仅淋巴细胞的培养相比，TAIC与淋巴细胞的直接共培养产生了显著更高数量的CD4+/CD25+淋巴细胞。这支持了这样的假定，在施用TAIC后在体内(即，在病人体内)也形成调节T细胞。这些结果与CD4+/CD25+淋巴细胞的已知免疫调节功能相一致，并与以下事实相一致，即，在这些细胞中Foxp3-、CTLA-4-和整联蛋白αEβ7mRNA的含量比在间接共培养的淋巴细胞中或对照淋巴细胞中显著更高。
                       实施例7
       体外与TAIC共培养的淋巴细胞在体内诱导移植耐受性
在动物试验中体内证实了实施例6中的结果和结论。在这个实施例中，用来自受体的淋巴细胞注射选定的自交组合中的动物，所述淋巴细胞在5天期间预先与来自供体的TAIC直接共培养。用来自受体的淋巴细胞注射其他动物，所述淋巴细胞在培养基中单独培养作为对照。
已经接受了来自受体的自体的共培养的淋巴细胞的动物，在异源心脏移植之前发展出供体特异性耐受，而接受了来自受体的天然的未共培养的对照淋巴细胞的对照动物在10到14天内剧烈地排斥移植的心脏。
在注射与TAIC共培养的淋巴细胞之前(左图)和之后(右图)，通过手术后对病人的血液中GM-7表达的流式细胞计数测定也显示了这一点。GM-7结合细胞的馏分从注射前的约0.5％上升到注射后的约21％，表明能结合GM-7的调节T细胞的发育。
这些结果表明，在供体TAIC和受体淋巴细胞之间的物理的细胞与细胞的相互接触诱导了调节T细胞的产生，其本身能修饰受体的同基因的免疫系统，从而抑制潜在地同种异体反应T细胞和从而阻止器官排异反应。
                       实施例8
      自身耐受性诱导细胞(STIC)用于治疗葡聚糖硫酸钠
              (DSS)诱导的慢性结肠炎的用途
通过饮用水口服葡聚糖硫酸钠可以在小鼠中化学地诱导结肠炎。在7天之内的施用产生急性结肠炎的发展，包含DSS施用和随后10天的普通水的至少四个循环的重复施用产生了类似人类结肠炎溃疡的慢性结肠炎的发展。
这个系统对于免疫学的或分子的检验是使用已久的[参见，例如Herfarth，H.等″Nuclear factor B activity and intestinalinflammation in dextran sulphate sodium(DSS)-induced colitisin mice is suppressed bygliotoxin″Clin.Exp.Immunol.120，59-65(2000)；Egger，B.等″Mice lacking transforming growthfactor a have an increased suscep-tibility to dextransulfate-inducedcolitis″Gastroenterology 113，825-832(1997)]，在此被用于检查STIC在治疗类似人自身免疫结肠炎溃疡的DSS诱导的结肠炎的慢性型式方面的潜力。
保持正常的雌性BALB/c小鼠(每只20g)非限制性地使用水和标准食物。根据以下方案，小鼠接受含有5％(w/v)葡聚糖硫酸钠(DSS；该溶液以下称为DSS水)的水和随后的未处理的水的四个循环：
第一循环：第1到7天DSS水(7天)；第8到17天普通水(10天)；
第二循环：第18到24天DSS水(7天)；第25到34天普通水(10天)；
第三循环：第35到41天DSS水(7天)；第42到51天普通水(10天)；和
第四循环：第52到58天DSS水(7天)。
在第58天后所有小鼠显示出慢性结肠炎的症状，其持续至少2个月(图6A和6B)。
随后将小鼠随机分配到四个不同的组中：
组1(n＝5)：在完成用DSS水滋养的第四个循环之后+1天(第59天)，小鼠静脉内地接受0.25ml PBS中的62.5国际单位的肝素(以防止血栓形成)，在30秒之后静脉内地在1ml PBS中施用来自遗传相同的供体鼠的5×106个STIC(参见实施例2)。
组2(n＝7)：在完成用DSS水滋养的第四个循环之后+7天(第65天)，小鼠静脉内地接受0.25ml PBS中的62.5国际单位的肝素(以防止血栓形成)，在30秒之后静脉内地在1ml PBS中施用来自遗传相同的供体鼠的5×106个STIC(参见实施例2)。
组3(n＝12)：第一对照组经历DSS处理但不接受任何细胞注射。
组4(n＝6)：第二对照组经历DSS处理；在完成用DSS水滋养的第四个循环之后+1天(第59天)，小鼠静脉内地接受0.25ml PBS中的62.5国际单位的肝素(以防止血栓形成)，在30秒之后静脉内地在1ml PBS中施用来自遗传相同的供体鼠的5×106个“对照细胞”(参见实施例1)(“对照细胞”是骨髓细胞、外周血细胞和脾细胞的混合，代表了在根据实施例2培养产生STIC之前的细胞，即，从同基因小鼠的脾脏获得的未培养的细胞)。
在第79天，完成用DSS水滋养的第四个循环之后的三周，处死所有小鼠。
在实验的过程中，在DSS诱导期间和随后的三周期间每周测量三次动物的体重。当接受细胞疗法时，参考第59天小鼠的体重，动物体重的变化用百分比表示(体重损失或增加)。在约5到15％范围内的变化被认为是显著的。
在DSS处理结束后的3周期间小鼠体重的变化在图7中示出。可以看出，在+1天施用STIC(组1＝□)引起取决于年龄的足够的体重增加，在未处理的动物(组3＝_)中，或在+1天用“对照细胞”处理的动物中(组4＝●)，或在+7天用STIC处理的动物中(组2＝▲)，在疾病的进展期间都没有发现体重增加。数值是从每组的5到7只小鼠中获取的平均值，标准偏差总是低于±15％。
在进一步的的实验中，用苏木精&曙红(H&E)对结肠组织进行组织着色。如Woods，A.E.和Ellis，R.C.(eds.)(LaboratoryHistopathology：A Complete Reference，vol.1&2；Churchill&Livingstone，1994)描述的进行H&E着色。根据以下方案由对试验设计不了解的两个独立操作的病理学家对着色的粘膜的情况进行计分：
分值0 健康的不突出的表现；
分值1 最轻的结肠炎；
分值2 中度结肠炎；
分值3 重度结肠炎；和
分值4 伴有整个粘膜的破坏的溃疡性结肠炎。
计分的结果在图8中示出。在完成用DSS水饲养的第四个循环之后的三周，组3的对照动物(没有细胞注射)具有约4的平均分值，而组1的动物(在+1天施用STIC)，或组2的动物(在+7天施用STIC)分别具有约1(组1)和约1.5(组2)的显著降低的平均分值。用“对照细胞”处理的动物(组4)具有约3的平均分值，其几乎与未处理小鼠(组3)的分值一样高。
这些结果与着色的结肠切片(H&E着色，见上文)的组织学评估的发现相一致，可在图6中看出。这个评估对于确定STIC处理的效果是最关键的。图6A(放大倍率×2.5)和6B(放大倍率×10)说明了组3的未处理的动物的结肠的情况，有大程度破坏的粘膜以及围绕组织被炎性细胞严重地侵入。这些图显示了结肠炎的进展的病期。与未处理的动物中结肠炎的进展(图6A/B)相反，在+1天接受STIC的组1的动物中在很大程度上维持了粘膜的形态(图6C(放大倍率×2.5)和6D(放大倍率×10))。在这些动物中仅可以看到较轻的炎症病征和粘膜破坏，但没有对围绕组织的侵入。在+1天用“对照细胞”处理的组4的动物的结肠切片(图6E；放大倍率×2.5)，和在+7天用STIC处理的组2的动物的结肠切片(图6F；放大倍率×2.5)都显示出进展的结肠炎的症状，有大程度破坏的粘膜和围绕组织被炎性细胞严重地侵入，与在未处理的动物中看到的那些类似(图6A/B)。
上述实验的结果显示，在用于诱导结肠炎的DSS处理结束之后在+1天施用STIC能够抑制或明显地减轻结肠炎的症状。STIC处理的动物没有显著地减轻体重(图7)，与未处理的动物相比它们的组织学计分被显著地降低了(图8)，结肠粘膜的整体情况几乎是正常的，这可以从结肠切片的组织学着色看出(图6C/D)。在+7天施用STIC(组2)未能治疗在施用STIC前的7天期间发展的结肠炎。尽管没有发生结肠炎病程的逆转，但疾病的发展被停止了，这可以从组2的动物与未处理的组3动物相比较低的组织学得分看出(图8)。这个现象对于该实施例中使用的DSS诱导的结肠炎模型是特定的，不能容易地转移到其他情况。
代表未培养的细胞的、从同基因小鼠的脾脏获得的骨髓细胞、外周血细胞和脾细胞的混合物对于治疗结肠炎是不可行的，因为用这些细胞处理的动物(组4)显示出与未处理的动物一样严重的症状(图6E/F；图7和8)。这提供了明显的证据，仅STIC能够治疗结肠炎，在培养期间，细胞混合物中STIC发育相伴的其他细胞不能。
                       实施例9
     自身耐受性诱导细胞(STIC)用于治疗SCID小鼠中
     通过转移CD4+CD62L+淋巴细胞诱导的结肠炎的用途
在SCID(严重联合免疫缺陷)小鼠中人工诱发结肠炎是用于分析STIC和它们在治疗自身免疫疾病方面的潜力的另一种方法。
SCID小鼠既不拥有T细胞也不拥有B细胞。通过转移甲状腺细胞的特定亚群可以重构它们的免疫系统。这些称为CD4+CD62L+或CD62Lhigh细胞的细胞恢复免疫系统，但由于缺乏控制，他们还诱导了具有慢性炎症的自发性结肠炎。这个模型系统是所谓的“小鼠慢性实验性结肠炎的CD62L+/CD4+SCID转移模型”[参见，例如，Mudter，J.等″A newmodel of chronic colitis in SCID mice induced by adoptivetransfer of CD62L+CD4+T cells：Insights into the regulatory roleof interleukin-6 on apoptosis″Pathobiology 70，170-176(2002)]，其作为自身免疫疾病的实例容许对结肠炎的发展中涉及的细胞群体进行更具体的分析。
在此使用该模型来检查STIC在治疗由不受调控的免疫系统诱导的结肠炎方面的潜力。这个模型容许更为机械化的研究，但由于免疫系统没有充分地恢复，与DSS模型系统(参见上文的实施例8)相比被认为是较弱的系统。
SCID BALB/c小鼠(每只18到22g)接受PBS中的1×106个CD4+/CD62L-selectinhigh T细胞的腹膜内注射，所述T细胞利用″Macs″磁性微球细胞分选系统(Milteny Biotechy Germany)从正常BALB/c小鼠的脾脏中分离。使小鼠保持非限制性地使用水和标准食物。
在转移CD4+/CD62L-selectinhigh T细胞之后的4到6周内小鼠发展出结肠炎。结肠炎的发展通过判断体重变化来确定。
随后将小鼠随机分配到三个不同的组中：
组1(n＝10)：通过施用CD4+/CD62L-selectinhigh T细胞诱导结肠炎开始后的6周，小鼠静脉内地接受0.25ml PBS中的62.5国际单位的肝素(以防止血栓形成)，在30秒之后静脉内地在1ml PBS中施用来自遗传相同的供体鼠的5×106个STIC(参见实施例2)。
组2(n＝10)：第一对照组仅接受CD4+/CD62L-selectinhigh T细胞但在6周后不接受任何进一步的细胞注射。
组3(n＝10)：第二对照组接受CD4+/CD62L-selectinhigh T细胞。在6周之后小鼠静脉内地接受0.25ml PBS中的62.5国际单位的肝素(以防止血栓形成)，在30秒之后静脉内地在1ml PBS中施用来自遗传相同的供体鼠的5×106个“对照细胞”(参见实施例2)。“对照细胞”与在实施例8中定义的相同(骨髓细胞、外周血细胞和脾细胞的未培养的混合物)。
在转移疾病诱导T细胞之后10到12周，或当根据基本对照组2中的体重变化判断出对照动物发展出结肠炎的病征时，处死所有小鼠。
类似于在实施例8中描述的DSS模型，在整个实验周期中每周三次测量动物的体重。当接受细胞疗法时，参考实验开始后6周的小鼠体重，动物体重的变化用百分比表示(动物体重损失或增加)。同样，在约5-15％范围内的变化被认为是显著的。
在整个实验周期中小鼠的体重变化在图9中示出。在6周后所有组的小鼠具有几乎相同的体重。而在6周后施用STIC(组1＝◆)后来引起取决于年龄的足够的体重增加，来自未处理的动物组(组2＝■)的小鼠，以及在6周后用“对照细胞”处理的小鼠(组3＝▲)在疾病的进展期间显示出相对降低的体重变化(组2)或完全没有体重增加(组3)。数值是从每组的6只小鼠中获取的平均值，标准偏差总是低于±15％。
在处死动物之后立即测定这些动物的结肠长度和脾脏的重量。这两个数值都容许判断炎症的程度，但不太灵敏。
图10说明了测量结肠长度(图10A)和脾脏重量(图10B)的结果。在该图中可以看出，与对照动物的相比，用STIC处理的动物(组1)的结肠显著更长(约11cm)，它们的脾脏显著较小(约50mg)。组2的对照动物具有缩短的结肠(约10.3cm)和肿大的脾(约100mg)表明严重的炎症，而接受对照细胞的动物(组3)与对照动物(组2)相比发展出较少严重的结肠炎症状(结肠长度约10.6cm和脾脏重量约60mg)，但与用STIC处理的动物(组1)相比发展出更为进展的结肠炎。
随后，在进一步的实验中，用苏木精&曙红对结肠组织进行组织学着色(H&E着色；Woods，A.E.和Ellis，R.C.(eds.)(LaboratoryHistopathology：A Complete Reference，vol.1&2；Churchill&Livingstone，1994)。如已经在实施例8中描述的，由对试验设计不了解的、两位独立操作的病理学家对粘膜的情况计分。对粘膜的计分与实施例8中相同：
分值0 健康的不突出的表现；
分值1 最轻的结肠炎；
分值2 中度结肠炎；
分值3 重度结肠炎；和
分值4 伴有整个粘膜的破坏的溃疡性结肠炎。
平均分在图11中显示。转移处理之后的六周，组2的没有接受细胞注射的对照动物具有约3的平均分，表明严重的结肠炎。在6周后接受STIC的组1的小鼠，和接受对照细胞的组2的小鼠分别具有约1.5(表明最轻的结肠炎；组1)和约2.5(表明中度结肠炎；组2)的降低的平均分。
这些结果又与用H&E着色结肠切片的组织学评估的发现相一致，可在图12中看出(放大倍率×100)。图12A/B说明了组3的动物的结肠的情况，所述动物在用CD62Lhigh T细胞诱导结肠炎之后留下未被处理。两个实施例都显示了单核细胞的标记的渗入和粘膜的完整性的实质损失、粘膜下层和鞘肌支撑层的隐窝损伤和渗入。如描述的注射“对照细胞”(来源于血液、骨髓和/或脾脏组织的无M-CSF和γ-干扰素刺激的单核细胞)没有防止单核细胞渗入和粘膜损失，这可在图12C/D中看出。两个样品还都显示出淋巴细胞的实质的粘膜下层渗入，但鞘肌支撑仍是完整的。在用CD62Lhigh T细胞诱导结肠炎之后施用STIC深深地改善了粘膜的完整性(图12E/F)。在分析的肠片段中可以看出，在两个样品的结肠切片中都仅有较轻的淋巴细胞渗入，没有隐窝损失和没有对粘膜下层和鞘肌支撑层的损害。
类似于施用STIC用于治疗葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的慢性结肠炎获得的结果(参见上文实施例8)，在此利用小鼠慢性实验性结肠炎的CD62L+/CD4+SCID转移模型显示出，STIC能够抑制或明显地减轻诱导的结肠炎的症状。STIC处理的小鼠显示出取决于年龄的足够的体重增加(图9)，与患有结肠严重炎症的对照组小鼠相比，它们的结肠显著更长(图10A)，它们的脾脏重量显著更低(图10B)。最后，STIC处理的小鼠的组织学分值与未处理的动物相比显著更低(图11)，用STIC处理的小鼠的结肠切片的组织学分析显示仅有较轻的结肠炎或没有结肠炎的症状(图12)。
与用STIC治疗结肠炎的效果相比，从同基因小鼠的脾脏获得的代表未培养的细胞的骨髓细胞、外周血细胞和脾脏细胞的混合物显示出显著降低的效力，因为与用STIC处理的动物中所见的相比，用这些细胞处理的动物(组3)显示出更严重的症状(图9、10A/B、11和12。与利用DSS模型系统在实施例8中获得的结果相反，在用CD62Lhigh细胞诱导的结肠炎模型中，对照细胞能在一定程度上减轻症状，因为接受对照细胞的动物与没有接受任何细胞的对照动物相比显示出较不严重的症状。
根据实施例8的结果，这再次提供了明显的证据，本发明的STIC能够治疗自身免疫疾病。

Claims (39)

1.一种制备用于在病人中预防和/或治疗与被扰乱的自身耐受性相关的疾病的自体的细胞的方法，其特征在于：
a)从待施用所述细胞的病人的血液分离单核细胞；
b)在含有细胞生长因子M-CSF的适合的培养基中增殖所述单核细胞；
c)与步骤b)同时地或在步骤b)之后，在含有γ-IFN的培养基中培养所述单核细胞；和
d)通过从培养基分离细胞获得在步骤c)中形成的细胞。
2.根据权利要求1的方法，其特征是，所述单核细胞是人源的。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征是，按此种方式从血液中分离单核细胞，使得参照分离物中的总细胞数，除单核细胞外淋巴细胞以至少10％的数量存在。
4.根据权利要求1到3的方法，其特征是，通过与杂交瘤细胞系DSM ACC2542产生的抗体结合来选择在步骤c)中形成的细胞或在步骤d)中获得的细胞。
5.根据权利要求1到4的方法，其特征是，在权利要求1的步骤c)中形成的细胞或步骤d)中获得的细胞、或根据权利要求4的选择步骤中获得的细胞之中，选择在其细胞表面上共表达抗原CD3和CD14的细胞。
6.根据权利要求1到5的方法，其特征是，培养基中M-CSF的浓度是1到20μg/l。
7.根据权利要求1到6的方法，其特征是，在步骤b)之后，在含有γ-IFN的培养基中培养所述单核细胞24到72小时，其中，在培养步骤b)开始后3到6天开始在存在γ-IFN的情况下进行培养。
8.根据权利要求7的方法，其特征是，在培养基中γ-IFN的浓度是0.1到20ng/ml。
9.根据权利要求1到8的方法，其特征是，步骤b)和c)的总培养时间是4到8天。
10.根据权利要求1到9的方法，其特征是，在权利要求1的步骤d)之后，或在根据权利要求4和5的选择步骤之后，将所述细胞悬浮在适合的细胞培养基或PBS或NaCl溶液中。
11.根据权利要求1到10的方法，其特征是，将所述细胞悬浮在冷冻培养基中，随后深度冷冻。
12.根据权利要求11的方法，其特征是，所述冷冻培养基包含胎牛血清(FCS)或ABO兼容性血清和DMSO。
13.由权利要求1到12的任何一个的方法可获得细胞，其特征在于所述细胞是用于在病人中预防和/或治疗与被扰乱的自身耐受性相关的疾病的自体的细胞，。
14.根据权利要求13的细胞，其特征是，它们在它们的细胞表面上共表达抗原CD3和CD14。
15.根据权利要求13或14的细胞，其特征是它们是人源的。
16.在适合的培养基中的含有根据权利要求13到15的细胞的细胞制剂。
17.含有单核细胞来源的自体的细胞的药物组合物，其中所述自体细胞用于在病人中预防和/或治疗与被扰乱的自身耐受性相关的疾病。
18.含有根据权利要求13到15的细胞或根据权利要求16的细胞制剂的药物组合物。
19.用于预防和/或治疗自身免疫疾病的根据权利要求17和18的药物组合物。
20.用于预防和/或治疗变态反应的根据权利要求17和18的药物组合物。
21.根据权利要求13到15的细胞或根据权利要求16的细胞制剂在制备用于制造用于预防和/或治疗与被扰乱的自身耐受性相关的疾病的药物组合物中的用途。
22.根据权利要求21的用途，用于预防和/或治疗自身免疫疾病。
23.权利要求22的用途，其特征是，所述自身免疫性疾病是选自具有自身免疫特征的风湿疾病、糖尿病、血液和血管的自身免疫疾病、肝脏的自身免疫疾病、甲状腺的自身免疫疾病、中枢神经系统的自身免疫疾病和大疱皮肤疾病的一种或多种疾病。
24.根据权利要求21的用途，用于预防和/或治疗变态反应。
25.根据权利要求24的用途，其特征是，变态反应选自由非自身蛋白、有机物和/或无机物诱发的变态反应。
26.根据权利要求25的用途，其特征是，变态反应选自枯草热和/或由药物、化学药品、病毒、细菌、真菌、食物成分、金属、气体、猫皮屑和/或动物毛发诱发的变态反应。
27.根据权利要求13到15的自身耐受性诱导细胞或权利要求16的细胞制剂在制备用于体外产生和/或增殖自体的调节T淋巴细胞中的用途。
28.根据权利要求27的用途，其中所述调节T淋巴细胞在它们的细胞表面上共表达抗原CD4和CD25。
29.用于产生和/或增殖自体的调节T淋巴细胞的方法，其特征是：
a)将根据权利要求13到15的自身耐受性诱导细胞或根据权利要求16的细胞制剂与自体的T淋巴细胞制剂共培养，和
b)从培养基中选择性地获得所述调节T淋巴细胞。
30.根据权利要求29的方法，其特征是所述调节T淋巴细胞在它们的细胞表面上共表达抗原CD4和CD25。
31.根据权利要求29或30的方法，其特征是，通过FACS分选从培养基中获得所述调节T淋巴细胞。
32.通过权利要求29到31的方法获得的调节T淋巴细胞。
33.杂交瘤细胞系DSM ACC2542产生的抗体在用于检测和/或选择适合于在病人中预防和/或治疗与被扰乱的自身耐受性相关的疾病的自体的细胞中的用途。
34.一种在病人中预防和/或治疗与被扰乱的自身耐受性相关的疾病的方法，其特征是，向病人施用药学有效量的根据权利要求13到15的自体的细胞或根据权利要求16的自体的细胞制剂。
35.根据权利要求34的方法，用于预防和/或治疗自身免疫疾病。
36.根据权利要求35的方法，其中所述自身免疫性疾病是选自具有自身免疫特征的风湿疾病、糖尿病、血液和血管的自身免疫疾病、肝脏的自身免疫疾病、甲状腺的自身免疫疾病、中枢神经系统的自身免疫疾病和大疱皮肤疾病的一种或多种疾病。
37.权利要求34的方法，用于预防和/或治疗变态反应。
38.权利要求37的方法，其中所述变态反应选自由非自身蛋白、有机物和/或无机物诱发的变态反应。
39.权利要求38的方法，其中变态反应选自枯草热和/或由药物、化学药品、病毒、细菌、真菌、食物成分、金属、气体、动物皮屑、毛发和/或动物排泄物诱发的变态反应。
CNA2004800198394A 2003-07-11 2004-01-09 单核细胞来源的自体的自身耐受性诱导细胞和它们在药物制剂中的用途 Pending CN1823160A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EPPCT/EP03/07551 2003-07-11
PCT/EP2003/007551 WO2004007701A1 (en) 2002-07-12 2003-07-11 Transplant acceptance inducing cells of monocytic origin and their preparation and use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1823160A true CN1823160A (zh) 2006-08-23

Family

ID=34042673

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2004800198394A Pending CN1823160A (zh) 2003-07-11 2004-01-09 单核细胞来源的自体的自身耐受性诱导细胞和它们在药物制剂中的用途

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20060188485A1 (zh)
EP (1) EP1644484B1 (zh)
JP (1) JP2007525473A (zh)
KR (1) KR20060040671A (zh)
CN (1) CN1823160A (zh)
AT (1) ATE408670T1 (zh)
AU (1) AU2004256154A1 (zh)
BR (1) BRPI0412506A (zh)
CA (1) CA2531627A1 (zh)
DE (1) DE602004016664D1 (zh)
DK (1) DK1644484T3 (zh)
HK (1) HK1088926A1 (zh)
NO (1) NO20060637L (zh)
PL (1) PL379549A1 (zh)
RU (1) RU2346041C2 (zh)
WO (1) WO2005005620A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110904024A (zh) * 2019-11-13 2020-03-24 武汉济源高科技有限公司 一种悬浮细胞培养中去除死细胞的方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1944361A1 (en) * 2007-01-11 2008-07-16 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) A method for expanding monocytes
US20100167399A1 (en) * 2008-12-29 2010-07-01 Loyola University Chicago Method of generating regulatory t cells using cord blood and adult blood cd14+ monocyte cells
JP5771917B2 (ja) * 2010-08-04 2015-09-02 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 単核球分離管及び単核球分離システム
JP2019519483A (ja) * 2016-05-03 2019-07-11 スクイーズ バイオテクノロジーズ カンパニー 寛容性を誘導するための生体分子の細胞内送達

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5766920A (en) * 1982-08-11 1998-06-16 Cellcor, Inc. Ex vivo activation of immune cells
US7112440B2 (en) * 1995-02-02 2006-09-26 Ghazi Jaswinder Dhoot Method of increasing the relative number of CD45 low cells in a cell population
US9068164B1 (en) * 1995-02-02 2015-06-30 Tristem Trading (Cyprus) Limited Method of preparing an undifferentiated cell
GB9502022D0 (en) * 1995-02-02 1995-03-22 Abuljadayel Ilham M S A method for preparing lymphohaematopoietic progenitor cells
US7410773B2 (en) * 1995-02-02 2008-08-12 Ghazi Jaswinder Dhoot Method of preparing an undifferentiated cell
US6461867B1 (en) * 1995-03-08 2002-10-08 The Scripps Research Institute Synthetic antigen presenting matrix
NL1017973C2 (nl) * 2000-05-10 2002-11-08 Tristem Trading Cyprus Ltd Inrichting.
ATE323151T1 (de) * 2001-05-30 2006-04-15 Fond Telethon Ex-vivo isolierte cd25+cd4+ t zellen mit immunsuppressiver aktivität und deren anwendungen
TWI288779B (en) * 2002-03-28 2007-10-21 Blasticon Biotech Forschung Dedifferentiated, programmable stem cells of monocytic origin, and their production and use
DE10231655A1 (de) * 2002-07-12 2004-02-26 Blasticon Biotechnologische Forschung Gmbh Transplantat-Akzeptanz induzierende Zellen monozytären Ursprungs, sowie deren Herstellung und Verwendung

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110904024A (zh) * 2019-11-13 2020-03-24 武汉济源高科技有限公司 一种悬浮细胞培养中去除死细胞的方法

Also Published As

Publication number Publication date
PL379549A1 (pl) 2006-10-16
JP2007525473A (ja) 2007-09-06
RU2346041C2 (ru) 2009-02-10
HK1088926A1 (en) 2006-11-17
US20060188485A1 (en) 2006-08-24
CA2531627A1 (en) 2005-01-20
ATE408670T1 (de) 2008-10-15
EP1644484A1 (en) 2006-04-12
AU2004256154A1 (en) 2005-01-20
RU2006104112A (ru) 2006-08-27
DK1644484T3 (da) 2009-01-05
BRPI0412506A (pt) 2006-09-05
NO20060637L (no) 2006-04-03
KR20060040671A (ko) 2006-05-10
DE602004016664D1 (de) 2008-10-30
EP1644484B1 (en) 2008-09-17
WO2005005620A1 (en) 2005-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1681918A (zh) 单核细胞起源的移植物接纳诱导性细胞及其制备和用途
CN100347293C (zh) 来源于单核细胞的去分化的可程序化干细胞及其制备和应用
CN1123574C (zh) Flt3受体的配体
CN1291757C (zh) 炎性肠疾病的治疗剂
CN1518458A (zh) 移植物排斥反应抑制剂
CN1317301C (zh) Il－2－和il－15－介导的t细胞应答的调节
CN1643136A (zh) 人肝细胞增殖方法和人肝细胞的获取方法
CN1192779A (zh) 人b7.1和/或b7.2特异的猴源单克隆抗体灵长动物化形式,药用组合物
CN1237909A (zh) 联合使用肿瘤细胞与混合淋巴细胞的癌症免疫治疗
CN101028519A (zh) 治疗免疫性疾病的药用组合物
CN1599754A (zh) 抗trail－r抗体
CN1688340A (zh) 调节t辅助(th)细胞发育和功能的方法和组合物
CN1325441A (zh) 经修饰的胞外体及其用途
CN1454215A (zh) 树突状细胞特异的抗原结合片段、组合物及其使用方法、被其识别的抗原及由其获得的细胞
CN1929855A (zh) 诱导或调节免疫反应的方法
CN1272345C (zh) 沉默型抗cd－28抗体及其应用
CN1646564A (zh) 修饰的因子ⅷ
CN1511041A (zh) 利用抑制cd21的药剂治疗抗体介导的病变的方法
CN1237910A (zh) 可溶性β－淋巴毒素受体和抗淋巴毒素受体的抗体以及抗淋巴毒素配体的抗体的用途
CN1171792A (zh) 具有ii型磷脂酶a2抑制作用的新型单克隆抗体及含其一部分的蛋白质
CN102112491A (zh) 抗-cd8抗体阻断细胞毒素效应物的引发并导致调节性cd8+t细胞的产生
CN1917898A (zh) 用于治疗非典型肺部感染的血管活性肠肽的生物活性物质
CN1202200A (zh) Fas配体融合蛋白
CN1823160A (zh) 单核细胞来源的自体的自身耐受性诱导细胞和它们在药物制剂中的用途
CN101056979A (zh) 抗组蛋白h1单克隆抗体及用于产生其的杂交瘤

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
AD01 Patent right deemed abandoned

Effective date of abandoning: 20060823

C20 Patent right or utility model deemed to be abandoned or is abandoned