CN1926233A - 可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及到作为含有插入到一对位点特异的重组序列中的无限增殖化基因、而且含有在该对位点特异的重组序列外的自杀基因的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株，是特征为在将该对位点特异的重组序列切除后自杀基因可表现其功能的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株，特别是CYNK－1(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305－8566)保藏日：平成16年3月10日，保藏号：FERM BP－08657)或它们的传代株、通过从该可逆性哺乳类肝细胞株或其传代株除去无限增殖化基因得到的哺乳类肝细胞株，以及这些细胞的用途。通过使用本发明的可能性无限增殖化哺乳类肝细胞株，可以确保满足需要数量的肝细胞，也可以作为人工肝脏反应器或细胞制剂材料使用。

Description

可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞及其用途
技术领域
本发明涉及到可以可逆增殖、即使在复原后的细胞也含有自杀基因的无限增殖哺乳类肝细胞和使用该肝细胞的生物人工肝脏和细胞制剂。
背景技术
据报道现在日本C型肝炎感染者人数200万人(美国400万)，B型肝炎患者人数约150万(在中国，B型肝炎感染患者在1亿2000万人以上)(日经科学，2000年2月号，肝炎情报中心)。由于C型肝炎的合并症，在日本年间约9000人死亡，至2010年，预测死亡人数跃到3倍。
根据这样的预测，对于肝细胞移植和肝功能衰竭治疗用生物人工脏器的需要量大，在代谢性肝病中的人肝细胞移植的有效例子已有报道(Strom SC，Fisher RA，Thompson MT，Sanyal AJ，Cole PE，HamJM，Posner MP.，Transplantation(1997)63，559-569，以及Fox IJ，RoyChowdhury J.Kaufman SS，et al.，New Eng.J.Med.(1998)338：1422-1426)。
另外在欧美、中国，虽然使用猪肝细胞的生物人工肝脏治疗试验都已经在人中进行了，但要正视的问题是猪内源性逆转录病毒等人畜共通感染症问题，今后的进展处于严峻的现状。
作为这样的细胞移植或生物人工肝脏的来源，健康人细胞最理想，但由于提供者严重不足，获得该细胞是非常困难的。
因此，人们研究了胚胎干细胞(embryonic stem(ES)细胞)、干细胞、异种动物的细胞。然而，在利用干细胞或前体细胞时，从本质上看还包含来自于这样的细胞的多分化能力和本身活跃的增殖能力的控制的困难，虽然有一些有关向肝细胞分化诱导的报道，但不充分(Rambhatla L，Chiu CP，Kundu P，et al.，Cell Transplant，2003；12：1-11；Schwartz RE，Reyes M，Koodie L，et al.，J.Clin.Invest.109；1291-1302，2002)。另外，就异种动物细胞来说，不能保证移植细胞最终被排斥，与异种动物的稳定的嵌合状态和HLA非适合的同种肿瘤的偶尔生长在人中已有报道(Gartner etal.，N.Eng.J.Med.，335，1494，(1996)；K.Paradis et al.，Science，285，1236，(1999))。
另外，已知通过导入癌基因使细胞无限增殖，可以产生出保持适度分化功能的细胞株(Kobayashi N，et al.，Transplantation69：202-207，2000)，但通过将无限增殖细胞株注入生物体内，或在生物人工肝脏等体外循环辅助装置中使用，有可能使患者暴露于不能预期的癌化的危险性。
人们也研究了导入无限增殖基因使细胞无限增殖，增殖后可以切除该无限增殖基因的可逆性无限增殖细胞(Westerman KA，LeboulchP.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8971-8976，1996)。然而，当使用逆转录病毒载体时，存在着病毒的构造上的LTR引起肿瘤性等问题，以及导入的拷贝数变多的缺点。另外，人们指出即便通过部位特异的重组酶将无限增殖基因切出，由于进行了基因操作的细胞残留，这样的细胞对宿主的坏影响(形成肿瘤等)的可能性并不是零，所以有可能给接受治疗的患者带来不安。
本发明的目的在于提供消除以往的问题，可以代替正常人肝细胞的可大量增殖，而且其生存可以调控的安全性更高的可逆性无限增殖哺乳类肝细胞以及使用该细胞的生物人工肝脏和细胞制剂。
发明内容
为了解决上述课题，进行了不断深入研究，结果我们发现通过将在被夹在一对部位特异的重组序列的无限增殖基因的外侧编码自杀基因的载体导入哺乳类的肝细胞，可以建立具有可逆性增殖的无限增殖细胞，而且在除去无限增殖基因后自杀基因具有可以表现其功能的特征的安全的肝细胞株，使本发明完成。
即本发明涉及到可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株或其传代株，是含有插入到一对位点特异的重组序列中的无限增殖化基因、且含有在该一对位点特异的重组序列外的自杀基因可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株，其特征是在将该对位点特异的重组序列切除后自杀基因可表现其功能。
在上述的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株中，哺乳类优选是人。
上述的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株，优选是不含有来自病毒的启动子。
上述的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株优选是CYNK-1(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)。
本发明涉及到从上述的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株或其传代株除去无限增殖化基因得到的哺乳类肝细胞(以下称为复原细胞)。
本发明还涉及到含有上述的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株或其传代株或它们的复原细胞的生物人工肝脏。
本发明还涉及到含有上述的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株或其传代株或它们的复原细胞的细胞制剂。
本发明涉及非病毒载体，含有非病毒性启动子、在一对位点特异的重组序列间编码无限增殖化基因的、而且在该对位点特异的重组序列以外编码自杀基因。
附图的简单说明
图1是表示非病毒载体pYK1的模式图。其中ATG是起始密码子，CAG为CAG启动子序列，LoxP为LoxP序列，HygR为潮霉素抗性基因，HSVTK为单纯疱疹病毒-胸腺嘧啶脱氧核苷激酶，EMCV IRES表示脑心肌炎病毒内核糖体进入部位，SV40T表示猿病毒40大的T抗原基因，ZeoR表示紫霉素抗性基因，pA表示聚A信号。
图2是表示非病毒载体pYK1的制造方法的一个例子的图。其中ATG是起始密码子，CAG为CAG启动子序列，LoxP为LoxP序列，HygR为潮霉素抗性基因，HSVTK为单纯疱疹病毒-胸腺嘧啶脱氧核苷激酶，EMCV IRES表示脑心肌炎病毒内核糖体进入部位，SV40T表示猿病毒40大的T抗原基因，ZeoR表示紫霉素抗性基因，pA表示聚A信号。
图3是表示通过CreDNA重组酶切出LoxP序列的机制的图。其中ATG是起始密码子，LoxP为LoxP序列，HygR为潮霉素抗性基因，HSVTK为单纯疱疹病毒-胸腺嘧啶脱氧核苷激酶，EMCV IRES表示脑心肌炎病毒内核糖体进入部位，SV40T表示猿病毒40大的T抗原基因，ZeoR表示紫霉素抗性基因，pA表示聚A信号。
图4是可逆性无限增殖的人肝细胞CYNK-1(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)的相差显微镜照片。部分1表示核小体，部分2表示含有核小体的大的核，部分3表示细胞内颗粒。
图5是以本发明的生物人工肝脏反应器的实施方式作为一个例子，表示制作过程的一个实施方式的图。图5(a)是将中空丝膜6排列在挂了里衬4的无纺布5的上面的图。其中在挂了里衬4的无纺布5上设置槽(slit)7。图5(b)是表示将图5(a)卷成卷的过程图。图5(c)是图5(b)的X-X线断面放大图。图5(d)是表示在两端设置了防止液体漏出的元件8的筒状容器9中装入了由中空丝膜6和无纺布5组成的卷的生物人工肝脏反应器10的概略图。在反应器中设置了细胞注入口11和可进行细胞的样品采集的排出12，槽7按照可与细胞注入口11联络那样配置。
图6(a)是表示在CYNK-1(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)中肝特异的基因和SV40T基因的表达的照片。带1至带7分别表示白蛋白基因、脱唾液酸糖蛋白受体(以下称为ASGPR)基因、肝脏性胆红素-尿苷二磷酸葡糖酸基转移酶(以下称为胆红素-UGT)基因、谷氨酰胺合成酶(以下称为GS)基因、谷胱甘肽-S-转移酶π(以下称为GST-π)基因、人血液凝固因子X(以下称为HBCF-X)基因和SV40T基因的表达。M为标记(marker)。
图6(b)是表示在复原CYNK-1细胞中肝特异的基因和SV40T基因的表达的照片。带1至带7分别表示白蛋白基因、ASGPR基因、胆红素-UGT基因、GS基因、GST-π基因、HBCF-X基因和SV40T基因的表达。M为标准。
图7是可逆性无限增殖的人肝细胞CYNK-1(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)的更昔洛韦感受性的曲线。
图8是经更昔洛韦处理的可逆性无限增殖的人肝细胞CYNK-1(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)的相差显微镜照片。观察到死亡细胞13。
图9是经更昔洛韦处理的复原CYNK-1细胞的相差显微镜照片观察到死亡细胞13。
图10是表示给予D-半乳糖胺后的猪的生存曲线的曲线图。
图11是在生物人工肝脏治疗中活动后的BAL-1的无纺布的扫描显微镜照片。细胞14很好地粘附在无纺布的纤维15上。
图12是在生物人工肝脏治疗中活动后的BAL-1的中空丝膜的扫描显微镜照片。在中空丝膜16的表面完全没有粘附细胞。
具体实施方式
在本发明中，所谓“可逆性无限增殖”或“可以可逆增殖”指的是将无限增殖基因转化细胞后，可使该细胞处于无限增殖的状态，一直增殖到目的细胞数后，通过除去该无限增殖基因，使细胞增殖停止，能够恢复到原来的安全性高的状态的状态。
本发明中使用的哺乳类肝脏细胞是例如猪、猴、类人猿、人的肝细胞等，优选人的肝细胞。例如，在本发明中可以使用人的成人肝细胞和人的胎儿肝细胞等。
所谓本发明中使用的“肝细胞”是例如具有作为肝功能指标的白蛋白和各种凝固因子等蛋白质的产生能力、糖新生能力、尿素产生能力、血液解毒和净化能力以及氨基酸、糖和脂代谢能力的细胞。具体来说，如肝细胞、肝类洞内皮细胞、肝星状细胞、隐窝细胞和肝窦星形细胞等。
本发明中使用的肝细胞可从商业购入(例如，三光纯药株式会社、大日本制药株式会社等)。
本发明中所谓“部位特异的重组序列”是被部位特异的重组酶识别的特异碱基序列，当在同一DNA分子上存在同方向的一对序列时，在该序列间可进行DNA链的切断。
作为部位特异的重组序列有LoxP序列和FRT序列等，优选LoxP序列。LoxP序列是用Cre重组酶可识别的众所周知的部位特异的重组序列，当在同一DNA分子上存在同方向的一对LoxP序列时，来自大肠杆菌的P1噬菌体的Cre重组酶单独进行，1)识别由34个碱基组成的LoxP序列，2)与该部位结合后切出在LoxP序列间编码的DNA等一系列反应。
因此，在一对LoxP序列间编码的基因然后通过Cre重组酶作用可以切出。
本发明中的所谓“无限增殖基因”指的是可使人体细胞具有无限分裂寿命的基因，例如SV40T基因和人端粒逆转录酶(hTERT)基因等。
上述SV40T基因是众所周知的DNA型肿瘤病毒的肿瘤抗原(T抗原)基因。
上述的hTERT基因是来自正常细胞的TERT基因。hTERT基因是在暴露于经血液、皮肤、肠管黏膜、子宫内膜等生命中重复再生的脏器的干细胞和前体细胞、以及特定的抗原中克隆增殖的淋巴细胞中自然表达增强的基因。
在本发明中所谓的“自杀基因”指的是编码具有来自细菌或病毒的酶，使活性低的药物前体代谢后变换为有强的细胞伤害活性物质的作用的酶的基因，导入了这样的自杀基因的细胞通过给予药物前体有选择地死亡。
因此，将自杀基因导入靶细胞时，可以通过给予药物前体按照目的有选择地除去靶细胞。作为代表性的自杀基因和药物前体的组合，如单纯疱疹的胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(HSVTK)基因和作为抗病毒剂临床使用的更昔洛韦组合、大肠杆菌的胞嘧啶脱氨酶基因和作为抗菌剂的5-氟胞嘧啶的组合等(Elion GB.Am.J.Med.73.7.1982；CraigAM.Proc.Acad.Sci.USA 89，33，1992)。作为本发明中使用的自杀基因，是其有效性已经经动物实验证明的(Moolten FL，Wells JM：J NatlCancer Inst.82：297-300，1990；Culver KW，Ram Z，WallbridgeS，Ishii H，Oldfield EH.Science 1992；256：1550)，而从在人前列腺癌的基因治疗的临床应用中确认其有效性方面看优选HSVTK基因。
本发明的可逆性无限增殖哺乳类肝细胞可以通过将编码夹在一对部位特异的重组序列的无限增殖基因和处于该一对部位特异的重组序列外的自杀基因的DNA序列通过载体导入哺乳类肝细胞制作。
作为载体，可以使用病毒载体和非病毒载体中任一个，病毒载体在将重组病毒载体产生细胞的培养上清过滤，只添加到目的细胞，可高效导入基因方面看优选，但存在着病毒的结构上的LTR引起肿瘤性等问题，另外还有导入的拷贝数也变多的缺点。因此，更优选使用非病毒载体。
作为这样的载体，例如可以使用含有非病毒性启动子CAG，编码成为Cre重组酶的靶的夹在一对LoxP序列间的SV40T基因和潮霉素抗性(HygR)。单纯疱疹病毒胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(HSVTK)融合基因，以及同时编码处于该LoxP序列外的紫霉素抗性(ZeoR)。HSVTK融合基因的非病毒载体pYK1(图1)。其中，作为非病毒性启动子，可以使用CAG启动子或CMV(巨细胞病毒)启动子等，但从表达强方面出发优选CAG启动子。而CAG启动子由巨细胞病毒IE增强子(cytomegalovirus IE enhancer)、鸡β-肌动蛋白启动子(chickenβ-actin promoter)和兔β-珠蛋白聚腺苷酸化信号(rabbit β-globin polyadenylation signal)构成，通过参照以下论文，本领域技术人员都可制造(Kanegae Y，Takamori K，Sato Y，etal.，Gene(1996)181：207-212.)。
作为非病毒载体的导入方法，如磷酸钙法、脂转染法、Nucleofector等电穿孔法。从基因的导入效率方面看优选使用Nucleofector等的电穿孔法。
有关该基因导入以及之后的无限增殖株的建立、传代，优选用无血清培养基的细胞培养。作为无血清培养基如CS-C无血清培养基或ISE-RPMI或HGM(hepatocyte growth medium)等。从细胞供应方面考虑，优选可从细胞系统(Cell System)公司(西雅图、华盛顿州、美国)和大日本制药株式会社购买到的CS-C无血清培养基。
由以上可知即使在本发明的可逆性无限增殖哺乳类肝细胞中，通过向正常人肝细胞导入作为非病毒载体的pYK1建立的CYNK-1细胞株(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)以及其传代株最优选。而本发明的可逆性无限增殖肝细胞就像图2(CYNK-1细胞(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657))表示的那样，具有含数个核小体1的大的核2的细胞内颗粒3中富含的所谓肝脏的实质细胞的形态学的特征。
本发明的可逆性无限增殖哺乳类肝细胞就像上述那样通过使部位特异的重组酶作用，可以除去无限增殖基因。重组酶就像上述那样与使用的部位特异的重组序列一致，本领域技术人员可很容易选择。
作为使部位特异的重组酶作用的方法，例如对于Cre重组酶，(1)通过基因导入效率高的腺病毒载体转化导入Cre重组酶的方法，(2)通过磷酸钙法将Cre重组酶DNA添加到细胞培养液中的方法，(3)在培养上清中添加来自人免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus)(HIV)的TAT蛋白质和Cre重组酶的融合蛋白质的方法，(4)将Cre重组酶蛋白质阳性化，添加到细胞培养液中的方法，以及(5)通过导入药剂诱导性Cre重组酶表达载体，通过添加药剂附加自由引起该基因除去的系统的方法等。
通过从本发明的可逆性无限增殖哺乳类肝细胞或其传代株除去无限增殖基因得到的的复原的细胞比复原前的细胞稍大些，维持着在带有含数个核小体的核的细胞内颗粒中富含的所谓的肝脏的实质细胞的形态学特征。
另外作为用于改善肝功能衰竭的肝细胞，必须要满足几个生物化学方面的要求。即i)胆红素血浆或黄疸的减轻，ii)起因于高氨血症的肝性脑症的改善，iii)血液的解毒和净化作用，iv)白蛋白和血液凝固因子的补给等。高氨血症的减轻尤其对于防止肝性脑症和脑死亡的发展非常重要(Strom SC.Transplantation 63，559，1997)。谷氨酰胺合成酶(GS)是除去氨的主要酶，作为用于改善肝功能衰竭的建立肝细胞株，该酶的表达是重要的(Strom SC.Transplantation63，559，1997)。
因此，可逆性无限增殖哺乳类肝细胞和其传代细胞以及它们的复原细胞优选是可以至少表达白蛋白基因、胆红素-UGT基因、GS基因、GST-π基因和HBCF-X基因中的任一个基因，更优选是表达所有这些基因。
这样的本发明的可逆性无限增殖哺乳类肝细胞和其传代细胞以及它们的复原细胞可以作为生物人工肝脏或细胞制剂在各种肝病的治疗中使用。
作为本发明中的“肝病”，包括例如由于病毒、药剂、以及中毒(蘑菇等)导致的急性肝衰竭等肝衰竭、血友病、α1-抗胰蛋白酶缺损症、半乳糖血症、肝肾性酪氨酸血症、槭糖浆尿症、糖原病1a型、肝性卟啉症、低β脂蛋白血症、高胆固醇血症、原发性高草酸尿症1型、克-纳综合症1型、高苯丙氨酸血症等代谢性肝病、慢性肝病的急性恶化等。本发明的治疗剂优选用于肝衰竭和代谢性肝病的治疗中。
本发明的细胞制剂，可举出将上述可逆性无限增殖哺乳类肝细胞或其传代细胞或它们的复原细胞悬浮于培养基、等渗液、或缓冲液的悬浮液、或通过离心等浓缩的粒状沉淀等细胞块等。培养基、等渗液或缓冲液按照适合上述肝细胞那样进行适当选择。另外，上述细胞制剂液可以加DMSO等保护剂、冷冻保存。另外，作为上述细胞制剂，优选是考虑接种到人体内的情况，使用除去无限增殖基因的复原细胞。细胞制剂为了更安全地利用，可以进行加热处理、放射线处理、或丝裂霉素C处理等保留作为细胞制剂的功能、同时在病原细胞的蛋白质变性程度的条件下处理。
作为细胞制剂的给予方式(移植方法)，可以使用经门脉给予、腹腔内给予、脾脏内给予等。其中优选经门脉给予和脾脏内给予，更优选经门脉给予。细胞制剂的给予量(移植量)优选1亿个～100亿个/固体，更优选5亿个～100亿个/固体、最优选10亿个至100亿个/固体。另外，给予量(移植量)可以根据给予的患者的年龄、体重、症状等适当变更。
作为生物人工肝脏，如使中空丝型的反应器(device)和分离·培养细胞组合的杂合型的人工肝脏等。生物人工肝脏有装在体外与血管相连的，有留置在体内与血管相连的，或不接血管留在腹腔内的三种类型。本发明的可逆性无限增殖肝细胞和复原肝细胞无论哪一种都可以在任一种形式的生物人工肝脏中使用。
在生物人工肝脏的开发中，反应器的设计和开发是重要的要素。作为生物人工反应器，已知有Circe Biomedical Inc.公司(莱克辛顿、马塞诸塞州、美国)的支援下以Cedars-Sinai Medical Center(洛杉矶、加利福尼亚州、美国)的Demetriou等人为中心的使用猪肝细胞的生物人工肝脏治疗用的HepatAssist(Hui T，RozgaJ，Demetriou AA.J Hepatobiliary Pancreat Surg 2001；8：1-15.)和使用猪肝细胞的德国的Gerlach等人的MELS(模块体外肝脏系统(Modular Extracorporeal Liver System))等各种各样的类型。这些反应器不用说都可以在本发明中使用，但由于没有用于细胞附着的立足点，所以有细胞只是简单地被充填到中空丝内空间，或中空丝外空间，成浮游的状态的倾向。肝细胞如果是浮游状态，存在着分化功能不能充分表达的倾向，另外还与周围的细胞冲突，容易受到应力刺激。
因此，在本发明中优选能够为肝细胞提供立足点那样的由中空丝和无纺布组成的反应器。
作为中空丝膜，只要是细胞能够附着在膜表面，不妨碍物质交换，可以使用任一种膜。具体来说，例如到现在为止在医疗中使用的市售产品，优选例如聚砜膜、乙烯-醋酸乙烯无规共聚物皂化物膜(例如商品名：エバ-ル、クラレメデイカル株式会社生产等)等。市售的中空丝膜的孔大小从其用途分有透析膜(～5nm)、血浆成分分离膜(20～30nm)、血浆分离膜(30～200nm)等。从物质的通透性方面考虑优选血浆分离膜(30～200nm)。
作为无纺布，优选能够使细胞粘附那样加工和修饰的无纺布。其中从其加工容易程度方面考虑，优选对聚四氟乙烯(PTFE)实施聚氨基酸尿烷(PAU)的无纺布。
图5表示以本发明的生物人工肝脏反应器的一个实施方式为例，直至ハウジング的过程。其中在挂了里衬4的无纺布5上放置中空丝膜6(图5(a))。其中在挂了里衬4的无纺布5上设置槽7。然后卷成卷状(图5(b))。图5(c)是其X-X线断面放大图。然后将卷筒装入在两端设置了防止液体漏出的元件8的筒状容器9中。在反应器中设置了细胞注入口11和可进行细胞的样品采集的排出口12，槽7按照可与细胞注入口11联络那样配置。
生物人工肝脏治疗为了安全、且科学地实行生物人工肝脏治疗，优选用将1)人工肝脏反应器的流入压和流出压的实时检测，2)气泡发生时的警报的运转，3)反应器能够保温(37度)等功能一体化的装置来实施。
以下给出具体的实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些例子。
实施例1
非病毒载体pYK-1的制造
按照以下顺序制作非病毒载体pYK-1(图1)(参照图2)。
(1)为了获得紫霉素抗性基因(ZeoR)片段，以pCMV/Zeo(Invetrogen公司生产)作为模板，在紫霉素区域两端设定5’侧插入了XhoI的引物P3、3’侧插入了HSVTK的引物P5’，使用该引物，按照反应条件95℃5分钟、(95℃30秒、60℃30秒、72℃2分钟)×30循环、72℃15分钟进行PCR反应。P3引物将紫霉素起始密码子除去，使其不能表达紫霉素。
(2)为了获得HSVTK片段，以SSR#69(Westerman KA，LeboulchP.，Proc，Natl.Acad.Sci.USA 93：8971-8976，1996)作为模板，在HSVTK区域两端设定引物P6’、P7，使用该引物，按照反应条件95℃5分钟、(95℃30秒、60℃30秒、72℃2分钟)×30循环、72℃15分钟进行PCR反应。
(3)为了获得紫霉素、HSVTK结合片段，以在上述(1)中回收的紫霉素、(2)中回收的TK片段的混合物作为模板，使用引物P3、P7，按照反应条件95℃5分钟、(95℃30秒、61℃1分钟、72℃3分钟)×30循环、72℃15分钟进行PCR反应。为了将引物P5’的3’侧和P6’的5’侧设计为互补，通过该PCR使紫霉素和HSVTK片断结合。
(4)为了获得含有潮霉素抗性基因、HSVTK基因、EMCV-IRES基因、SV40T基因的片段，以SSR69作为模板，使用设定在区域两端的引物P1、P2，按照反应条件95℃5分钟、(95℃30秒、60℃1分钟、72℃5分钟)×30循环、72℃15分钟进行PCR反应。
另外在P1引物的5’侧插入HCV5’UTR和LoxP，在P2引物的3’侧插入LoxP和XhoI。
得到的PCR产物用含有1.2％的按照3∶1比例将NuSieve琼脂糖和SeaKem琼脂糖混合的混合物的凝胶进行电泳，然后用DNACELL(第一化学药品株式会社生产)纯化、回收。
然后，使用LigaFast Rapid DNA连接系统(Promega公司)插入连接到将紫霉素、HSVTK结合片段用XhoI、T4PNK处理、经XhoI、SmaI处理的LoxP开关表达载体pCALNL5/pBR322H上。pCALNL5/pBR322H通过将pCALNL5(理研バンクRDB-1862)的pUC Ori交换为pBR322 Ori进行制作。通过电穿孔转化感受态细胞(JM109)，通过含有氨苄青霉素的LB板进行筛选。得到的克隆用MluI、T4poI、XhoI处理，然后向处理后产物插入含有经XhoI、T4K处理的潮霉素抗性基因、HSVTK基因、EMCV-IRES基因、SV40T基因的片段，转化感受态细胞(JM109)，用含有氨苄青霉素的LB板进行筛选，制造pYK1。
实施例2
可逆性无限增殖人肝细胞株CYNK-1(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)的建立。
在T-25烧瓶内用胰蛋白酶处理80％铺满状态的传代数1的正常人肝细胞(CS-ABI-3716、大日本制药株式会社销售)，得到100万个人肝细胞。将处理的细胞使用Nucleofector系统用缓冲液(NucleofectorTM Solution、和光纯药工业株式会社生产)1ml稀释，再向里面添加pYK-1质粒DNA的TE缓冲液的悬浮液(TEbuffer，シグマ公司制)(1μg/μl)2μl，通过Nucleofector系统用缓冲液(NucleofectorTM Solution、和光纯药工业株式会社生产)，按照该系统的程序进行基因导入。将得到的细胞接种到T-25烧瓶中，于CS-C无血清培养基(CS-SF-4Z0-500、大日本制药株式会社销售)继续培养。进行了基因导入48小时后，于含有100μg/ml的潮霉素的CS-C无血清培养基中进行抗性克隆筛选。筛选开始2周后看到抗性克隆的出现，4周后使用克隆化试剂盒，建立CYNK-1(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)。
将该细胞寄托于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657))。
得到的CYNK-1(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566))、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)表现出在带有含数个核小体1的大的核2的细胞内颗粒3中富含的所谓的肝脏实质细胞的形态学特征(图4)。CYNK-1细胞(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)没有增殖停止极期(crisis)，无限增殖化，在无血清的CS-C培养基下单层增殖，在约48小时其数量倍增。
实施例3
通过Cre重组酶切出SV40T基因(参照图3)
用MOI(感染多重度＝5)使产生局限于核内信号(NLS)标记的Cre重组酶的不能复制的腺载体AxCANCre(3×108pfu/ml)(理研基因库、日本RDB No.1748)感染CYNK-1细胞(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657))。用AxCANCre感染1小时后，将细胞用胰蛋白酶处理、回收，通过5天的紫霉素选择(用含有5μg/ml紫霉素(Sigma公司)CS-C无血清培养基培养)达到完全的SV40T基因表达细胞的排除。通过瞬时的Cre重组酶的表达，LoxP序列间的DNA被切除。
得到的细胞比复原前的细胞稍大些，维持着在带有含数个核小体的核的细胞内颗粒中富含的所谓的肝脏的实质细胞的形态学特征。
试验例1
在SV40T基因除去前后的CYNK-1(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)中的基因表达
通过RT-PCR法研究在SV40T基因切出前后的CYNK-1(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)中与肝脏代谢有关的重要基因、即白蛋白基因、白蛋白基因、ASGPR基因、胆红素-UGT基因、GS基因、GST-π基因和HBCF-X基因、以及SV40T基因的表达。通过RT-PCR法使用RNAzol(シンナ/バイオテツクス公司、フレンズウツド、德克萨斯州、美国)由CYNK-1细胞(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)提取RNA，将1μg的总RNA使用RNA逆转录酶于22℃下进行10分钟、再于42℃下进行20分钟的逆转录反应。
对于得到的2μg逆转录产物使用均为20pmol/ml的各个引物、AmpliTag Gold试剂盒(Perkin Elmer Cetus，Norwalk，康涅狄格州美国)，按照其程序用于PCR扩增。PCR于95℃下温育10分钟，然后进行包括95℃下30秒、60℃下30秒和72℃下30秒的温育的35次循环，最后于72℃下实施7分钟温育。对于各个基因的引物使用如下的引物。
白蛋白基因(576bp)
5’引物：AAACCTCTTGTGGAAGAGCC
(序列1)
3’引物：CAAAGCAGGTCTCCTTATCG
(序列2)
ASGPR基因(495bp)
5’引物：TAGGAGCCAAGCTGGAGAAA
(序列3)
3’引物：ACCTGCAGGCAGAAGTCATC
(序列4)
胆红素-UGT基因(495bp)
5’引物：ATGACCCGTGCCTTTATCAC
(序列5)
3’引物：TCTTGGATTTGTGGGCTTTC
(序列6)
GST-π基因(496bp)
5’引物：GCCCTACACCGTGGTCTATT
(序列7)
3’引物：GGCTAGGACCTCATGGATCA
(序列8)
GS基因(535bp)
5’引物：ATGCTGGAGTCAAGATTGCG
(序列9)
3’引物：TCATTGAGAAGACACGTGCG
(序列10)
HBCF-X基因(493bp)
5’引物：GTGCATGGAAGAGACCTGCT
(序列11)
3’引物：GAAGTCAAGCAGGTCGAAGG
(序列12)
SV40T基因(422bp)
5’引物：CAGGCATAGAGTGTCTGC
(序列13)
3’引物：CAACAGCCTGTTGGCATATG
(序列14)
在可逆性无限增殖化的前后，确认这样的肝功能基因的表达被保存，通过Cre/loxP重组除去了SV40T基因(图6(a)和图6(b))。
而该结果是暗示了可以使SV40T基因除去前后的CYNK-1细胞(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657))制造白蛋白和称之为血液凝固因子的生理活性物质，应用于细胞性医药品开发的资料。
试验例2
SV40T基因除去前后的CYNK-1(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所  专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)的更昔洛韦感受性
将200个CYNK-1细胞(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所  专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)加到96孔板中，于只有CS-C无血清培养基中、或添加了各种浓度的更昔洛韦(5、10、20、50和100μM)的CS-C无血清培养基进行培养，通过MTT解析(McsmannT.J.，Immunol.Methods，65，55，1983)研究细胞增殖。
在图7中以相对感受性给出了细胞的存活率。CYNK-1细胞(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)对更昔洛韦的感受性依赖于更昔洛韦的浓度，通过于5μM的GCV中培养1周，停止增殖，一部分细胞死亡(图7和8)。
复原的CYNK-1细胞对GCV也同样表现出感受性，通过在5μM的GCV存在下，培养1周，停止增殖，一部分细胞死亡(图9)，10日以内所有的细胞都死亡了。
这些数据表明细胞的增殖可通过给予更昔洛韦进行控制。
试验例3
复原CYNK-1细胞对肝功能衰竭的治疗效果
使用T225的细胞培养烧瓶(Corning公司，纽约州、美国)对CYNK-1细胞(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所  专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)使用培养液A(在CS-C无血清培养基(CS-SF-4Z0-500、大日本制药株式会社销售)中加了0.1mg/L链霉素、100U/ml青霉素G的培养液)，于室温37℃下在二氧化碳浓度5％的培养箱中进行培养。CYNK-1细胞(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所  专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)进行增殖，在一个烧瓶中调制达到2千万个细胞。使用在PBS(磷酸缓冲液生理盐水)中加了0.02％EDTA的0.25％胰蛋白酶液8ml，将细胞从烧瓶的表面剥落下来，再加培养液A 40ml后进行搅拌，然后于4℃、800rpm下通过离心分离器进行离心7min，回收细胞。向得到的CYNK-1细胞(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所  专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657(3个T225细胞培养烧瓶分，共计6千万个))中加培养液A 30ml、搅拌后，接种到滚瓶(roller bottle)(正式名：1700cm2 Expanded Surface Roller Bottle，Corning公司)中，加培养液A 500ml继续进行培养。对4个滚瓶利用细胞制造滚动装置(Cell preparation roller apparatus)(Bellco公司)，实施大量培养。在细胞达到铺满状态，添加腺病毒载体AxCANCre，进行重组反应。添加AxCANCre48小时后，于含紫霉素的培养基中培养5天后，进行同样胰蛋白酶处理，回收细胞。从1个滚瓶可以获得3亿个，共计4个滚瓶、12亿个复原细胞。
使用从冈山县美星町农协购买的Landrace White种雌性猪(5kg)10头，术前进行12小时绝食。肌肉注射硫酸阿托品(扶桑药品工业株式会社生产、大阪、日本)0.5mg和动物用氯胺酮(盐酸氯胺酮)(三共株式会社生产、东京、日本)3mg，镇静后，静脉内注射Droleptan(氟哌利多)(三共株式会社生产、东京、日本)1mg、泮库溴铵(オルカノン公司生产、オランダ)2mg，进行气管内插管。使用氧、一氧化二氮、七氟烷(セボフルレン)，于人工呼吸器中维持麻醉，露出左外颈脉，进行6Fr原子管(アトムチユ一ブ)(アトムメデイカル株式会社生产、东京、日本)的插管。然后，于腹部正中切开，开腹后由脾静脉插入6Fr原子管(アトムメデイカル株式会社生产、东京、日本)的插管，将管前端留置在门脉本干。通过触诊确认前端留置在门脉本干。各个原子管的末端在形成皮下通道后缝合固定于皮肤表面。术前、术后静脉内注射0.5gセパトレン(头孢菌素系抗生素)(住友制药株式会社生产、大阪、日本)。术后确认完全觉醒后拔去气管内管子。紧接着由插入到左外颈静脉的原子管用10分钟时间静脉注入将0.5g/kg的D-半乳糖胺(Sigma公司生产)溶解在50ml生理盐水后的溶液，诱导药剂性肝损伤。
为了防止各个原子管形成血栓，用肝素1ml(100单位)进行封闭。给予D-半乳糖胺18小时后，将滚瓶培养调制达到的10亿个复原CYNK-1细胞稀释到100ml林格液，由插入到脾静脉的6Fr原子管经门静脉用约30分钟进行移植(移植组n＝5)。作为对照组实验，剩下的5头不移植细胞(对照组n＝5)。
为了把握猪的全身状态，进行心电图、心博数、动脉压的监测。在移植组，虽然移植时看到瞬时性的门脉压的上升(25cmH2O)，但猪可以耐受肝细胞移植。
结果如图10所示。对照组所有例子都由于肝功能衰竭死亡，但在复原CYNK-1细胞移植组猪，5例中4例存活了1个月以上，从统计学上看为有意义差别。该数据表明复原CYNK-1细胞的移植对于人肝功能衰竭也是有效的。
实施例4
生物人工肝脏的制作
按照以下顺序制作由中空丝和无纺布构成的全血还流型系统的生物人工肝脏(BAL)(参照图5)。根据中空丝膜的种类可以分为象表1所示那样的各自的BAL-1～BAL-6。
表1
  生物人工肝脏               中空丝膜
  原材料   孔大小
  BAL-1   聚砜*1   透析膜
  BAL-2   聚砜   血浆分离膜
  BAL-3   聚砜   血浆成分分离膜
  BAL-4   エバ-ル*2   透析膜
  BAL-5   エバ-ル   血浆分离膜
  BAL-6   エバ-ル   血浆成分分离膜
*1クラレメデイカル株式会社生产
*2クラレメデイカル株式会社生产
将10cm的中空丝膜550根很规则地置于用人造丝挂里的无纺布(10×10cm)上(参照图5(a))，将其卷成卷状(参照图5(b))。图5(c)给出了断面的模式图。将由这个无纺布和中空丝膜构成的卷装入到两端设置了防止液体漏出的元件的筒状容器(参照图5(d))。向这样制作的反应器中填充悬浮于10mlCS-C无血清培养基(CS-SF-4Z0-500、大日本制药株式会社销售)的约10亿个CYNK-1细胞(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)。
而作为无纺布，使用具有细胞粘接性的聚氨基酸尿烷(PAU)的PTFE(polytetrafluoroethylene)无纺布(クラレメデイカル株式会社生产)。
为了判定得到的反应器的生物相容性，可以将各个反应器分别装在健壮猪的颈部动静脉间使其运转，可以对24小时循环动态无坏影响、安然地运转。另外，也没有看到红血球和血小板等血细胞成分的减少。
另外为了安全、且科学地实行RAL治疗，开发了将1)BAL反应器的流入压和流出压的实时检测，2)气泡发生时的警报的运转，3)反应器能够保温(37度)的功能一体化的装置，通过猪的实验验证系统可良好运转。
试验例4
生物人工肝脏的肝功能衰竭效果
根据设施动物实验处理指南，使用检疫完后的カニクイザル(从日本クレア购入)，研究实施例4中制作的生物人工肝脏的安全性和有效性。
对雄性カニクイザル(4kg、n＝6)静脉注入0.5g/kg的D-半乳糖胺(由Sigma公司购入)，诱导药剂性肝损伤。
注入D-半乳糖胺18小时后，在全身麻醉下向治疗组的猴子(n＝2)的左内颈动脉插入原子6Fr的导管(アトムメデイカル株式会社生产、东京、日本)，然后再向左外颈静脉插入原子6Fr的导管，其间连接上实施例4制作的反应器BAL-1。对于泵使用PERISTA BIO-MINIPUNP(ATTO、东京、日本)，以10ml/分钟的流量进行体外循环6小时。麻醉，作为静脉麻醉使用デユプリバン(5ml/小时)。作为抗血栓疗法，在血液就要通过反应器之前，由反应器的中枢侧注入肝素1000单位，以后体外循环中通过肝素的持续注入(肝素500单位/小时)，进行全身肝素化。
作为阳性对照组(n＝2)，取代CYNK-1细胞(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所  专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、保藏日：平成16年3月10日、保藏号：FERM BP-08657)，通过充填约10亿个新鲜分离猪肝细胞(存活率＞90％)的反应器，与治疗组同样实行6小时的BAL治疗。新鲜分离的猪肝细胞通过使用分散酶和胶原酶的4阶段回流法分离通过外科手术切下的肝脏外侧区域(丸山昌伸，小林直哉，都津川敏范等人，Organ Biology、Vol.9.No.3.295-301，2002)。
作为阴性对照组(n＝2)，使用不充填细胞的空反应器，进行同样的试验。
结果在阴性对照组，2例猴子都在注入D-半乳糖胺1周以内因肝功能衰竭死亡。解剖看到肝脏的出血坏死、显著的萎缩、黄疸性的胸腹水的潴留，组织学上也确认肝细胞的广泛坏死。而装填了约10亿个猪肝细胞的阳性对照组中任一个猴都存活3周以上，解剖也没有看到什么异常。
在治疗组，2例都存活3周以上。肝脏无论肉眼观察，还是组织学分析都完全正常。另外，在治疗组看到フイシヤ-比(支链氨基酸/芳香族氨基酸的比)的改善。
治疗后，在扫描电子显微镜下观察固定反应器后细胞的粘附程度。细胞很好地粘附在无纺布的纤维上(图11)，还观察到由数个细胞组成的集块。这样的集块对于细胞的分化功能的发挥非常理想。另外在中空丝膜的表面细胞完全没有粘附(图12)，借助于中空丝膜的物质交换，获得了非常理想的观察结果。
产业上利用的可能性
本发明的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株可容易地确保尽可能合乎需要的数量，而且安全性更优，不会造成患者不安全感，可作为生物人工肝脏或细胞制剂的材料使用。另外，本发明的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株由于可以制造白蛋白或称之为血液凝固因子的生理活性物质，所以也可以应用于细胞性医药品的开发。另外，复原细胞安全性更优，而且保持肝细胞的能力，在肝脏疾病的治疗中非常有用。
                         序列表
<110>Kobayashi，Naoya
     Tanaka，Noriaki
     TOKYO METROPOLITAN ORGANIZATION FOR MEDICAL RESEARCH
<120>无限增殖化哺乳类肝细胞及其用途
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<213>人工
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<223>用于检测白蛋白基因的聚合酶链式反应用5’引物。
<400>1
aaacctcttg tggaagagcc                                            20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于检测白蛋白基因的聚合酶链式反应用3’引物。
<400>2
caaagcaggt ctccttatcg                                            20
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于检测ASGPR基因的聚合酶链式反应用5’引物。
<400>3
taggagccaa gctggagaaa                                            20
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于检测ASGPR基因的聚合酶链式反应用3’引物。
<400>4
acctgcaggc agaagtcatc                                              20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于检测胆红素-UGT基因的聚合酶链式反应用5’引物。
<400>5
atgacccgtg cctttatcac                                              20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于检测胆红素-UGT基因的聚合酶链式反应用3’引物。
<400>6
tcttgattt gtgggctttc                                            20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于检测GST-π基因的聚合酶链式反应用5’引物。
<400>7
gccctacacc gtggtctatt                                           20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于检测GST-π基因的聚合酶链式反应用3’引物。
<400>8
ggctaggacc tcatggatca                                           20
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于检测GS基因的聚合酶链式反应用5’引物。
<400>9
atgctggagt caagattgcg                                             20
<210>10
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于检测GS基因的聚合酶链式反应用3’引物。
<400>10
tcattgagaa gacacgtgcg                                             20
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于检测HBCF-X基因的聚合酶链式反应用5’引物。
<400>11
gtgcatggaa gagacctgct                                          20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于检测HBCF-X基因的聚合酶链式反应用3’引物。
<400>12
gaagtcaagc aggtcgaagg                                          20
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于检测SV40T基因的聚合酶链式反应用5’引物。
<400>13
caggcataga gtgtctgc                                            18
<210>14
<211>20
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>用于检测SV40T基因的聚合酶链式反应用3’引物。
<400>14
caacagcctg ttggcatatg                                          20

Claims (8)

1.可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株或其传代株，是含有插入到一对位点特异的重组序列中的无限增殖化基因、且含有在该一对位点特异的重组序列外的自杀基因的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株，其特征是在将该一对位点特异的重组序列切除后自杀基因可表现其功能。
2.权利要求1所述的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株或其传代株，其中哺乳类是人。
3.权利要求1所述的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株或其传代株，其中不含有来自病毒的启动子。
4.权利要求1所述的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株或其传代株，其中可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株是CYNK-1(保藏机构：独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)，保藏日：平成16年3月10日，保藏编号：FERM BP-08657)。
5.通过从权利要求1所述的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株或其传代株除去无限增殖化基因得到的哺乳类肝细胞。
6.含有权利要求1所述的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株或其传代株、或者权利要求5所述的哺乳类肝细胞的生物人工肝脏。
7.细胞制剂，作为有效成分含有权利要求1所述的可逆性无限增殖化哺乳类肝细胞株或其传代株、或者权利要求5所述的哺乳类肝细胞。
8.非病毒载体，其中含有非病毒性启动子，在一对位点特异的重组序列间编码无限增殖化基因、而且编码在该一对位点特异的重组序列外的自杀基因。
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