JP2001512689A - Ｔ細胞を遺伝子改変するための方法 - Google Patents

Ｔ細胞を遺伝子改変するための方法

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Abstract

(57)【要約】 遺伝子改変したＴ細胞の集団を産生するための方法が提供される。この方法では、Ｔ細胞のインビトロ集団は、この集団をＣＤ３結合因子と接触させることによって活性化される。次いで、遺伝子改変は、この活性化Ｔ細胞を用いて、これを適切な遺伝子移入ベクターと接触させることによって行われる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般に、高い効率で細胞の集団を遺伝子改変するための方法および
遺伝子送達の方法に関する。より具体的には、本発明は、エキソビボでＴ細胞の
集団を遺伝子改変するための方法に関する。
【０００２】 （発明の背景） 遺伝子治療は、所望の遺伝子を被験体に移入し、その後のそのインビボ発現の
ための方法を提供する。遺伝子移入は、一般に、適切なベクターを使用して、エ
キソビボで被験体の細胞または組織を遺伝子改変し、そして改変した細胞を宿主
に再導入することによって達成される。あるいは、遺伝物質は、被験体の細胞お
よび組織に直接的に移入され得る。
【０００３】 多くのウイルスベースの系が、遺伝子送達に使用されている。例えば、レトロ
ウイルス系は公知であり、そして一般に、ウイルスの遺伝子のすべてを発現する
が、サイ（Ψ）配列として公知のパッケージングシグナルの欠失のため、それ自
体のゲノムをパッケージし得ない組込まれた欠損プロウイルス（「ヘルパー」）
を有する、パッケージング株を用いる。したがって、細胞株は、空のウイルス殻
を生じる。プロデューサー株は、パッケージング株に由来し得る。プロデューサ
ー株は、ヘルパーに加えて、長末端反復（ＬＴＲ）として公知の、ウイルスの複
製およびパッケージングのためにシスで必要とされる配列を含むウイルスベクタ
ーを含む 目的の遺伝子は、ベクターに挿入され、そしてレトロウイルスヘルパ
ーによって合成されたウイルス殻中にパッケージされ得る。次いで、組換えウイ
ルスは、単離され、そして被験体に送達され得る。（例えば、米国特許第５，２
１９，７４０号を参照のこと）。
【０００４】 効果的な遺伝子移入を達成することに重要な因子は、接触した細胞の十分な割
合のウイルス感染を得る能力である。遺伝子移入においてはしばしば、エキソビ
ボでウイルスに接触した細胞の３分の１未満が効率的に改変される。さらに、多
数の遺伝子改変した細胞は、ほとんどの遺伝子送達適用に必要とされる。したが
って、ウイルス感染の効率が低い場合、遺伝子改変した細胞の十分な数を得るこ
との困難性は、効果的な治療を達成することにおいて限定された工程を示し得る
。したがって、哺乳動物細胞の効率的および効果的遺伝子改変の必要性がある。
本発明は、この必要性を満たし、そしてさらに関連する利点を提供する。
【０００５】 （発明の要旨） 遺伝子改変したＴ細胞の集団を産生するための方法が提供される。この方法で
は、Ｔ細胞のインビトロ集団は、この集団をＣＤ３結合因子と接触させることに
よって活性化される。次いで、遺伝子改変は、活性化Ｔ細胞を用いて、これを適
切な遺伝子移入ベクターと接触させることによって行われる。本発明の実施にお
いて、遺伝子改変は、Ｔ細胞集団の細胞密度が、約０．１×１０6と５×１０6と
の間である場合に行われる。
【０００６】 本発明の種々の局面では、遺伝子移入ベクターは、遺伝子改変した細胞に、選
択された細胞傷害性因子に対する増強された感受性を提供するように発現され得
る第１のヌクレオチド配列に作動可能に連結されるプロモーターを含む。したが
って、第１のヌクレオチド配列は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｈ
ＳＶ−ｔｋ）遺伝子のような薬物感受性遺伝子であり得る。さらに、遺伝子移入
ベクターは、目的の１つ以上のヌクレオチド配列を含むレトロウイルスベクター
を含み得る。
【０００７】 他の実施態様では、形質導入Ｔ細胞の選択されていない集団において１００％
以上の形質導入効率を得るための方法が提供される。この方法は、以下の工程を
包含する：（ａ）Ｔ細胞のインビトロ集団を提供する工程；（ｂ）Ｔ細胞集団を
ＣＤ３結合因子と接触させることによってＴ細胞を活性化する工程；および（ｃ
）約３以上の感染多重度（ＭＯＩ）で活性化Ｔ細胞をレトロウイルスベクターで
形質導入する工程であって、ここで、Ｔ細胞集団の細胞密度が約５×１０5と２ ×１０6との間である場合に、形質導入が行われる、工程。
【０００８】 さらに他の実施態様では、形質導入Ｔ細胞の集団を産生するためのキットが提
供される。このキットは、１つ以上の容器に含まれるＣＤ３結合因子、１つ以上
の容器に含まれる遺伝子移入ベクター、補助試薬および／またはハードウエア、
およびキットの使用のための指示書を含む。
【０００９】 本発明のこれらおよび他の実施態様は、本明細書の開示を考慮して、当業者が
容易に行い得る。
【００１０】 （好ましい実施態様の詳細な説明） 本発明の実施は、他に指示がなければ、当該技術分野内のウイルス学、微生物
学、分子生物学、組換えＤＮＡ技法、および免疫学の従来の方法を用いる。この
ような技法は、文献に十分に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第
２版，１９８９）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐ
ｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．ＩおよびＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ａ Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１
９８４）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，ｖｏｌ．Ｉお
よびＩＩ（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）；Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａ
ｎ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；およびＨａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＶ（
Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，１９８６，Ｂｌａｃｋ
ｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）を参照のこと。
【００１１】 本明細書および添付の請求の範囲で使用される場合、単数形態「ａ」、「ａｎ
」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他を明らかに示さなければ、複数の言及を含む
。
【００１２】 （Ｉ．定義） 本発明を記載するにおいて、以下の用語が用いられ、そして以下に示すように
定義されることを意図する。
【００１３】 「遺伝子移入」または「遺伝子送達」とは、目的のＤＮＡを宿主細胞に確実に
挿入するための方法またはシステムをいう。このような方法は、組込まれていな
い移入されたＤＮＡの一過性発現、移入されたレプリコン（例えば、エピソーム
）の染色体外複製および発現、あるいは宿主細胞のゲノムＤＮＡへの移入された
遺伝物質の組込みを生じ得る。
【００１４】 「Ｔリンパ球」または「Ｔ細胞」は、免疫系の細胞媒介性免疫の一部を構成す
る非抗体産生リンパ球である。Ｔ細胞は、骨髄から胸腺に移動する未成熟リンパ
球から発生し、胸腺でこれらは、胸腺ホルモンの指示下で成熟プロセスを受ける
。ここで、成熟リンパ球は、迅速に分割し、非常に多数にまで増加する。成熟中
のＴ細胞は、特異的抗原を認識しそして結合する能力に基づいて、免疫応答性に
なる。免疫応答性Ｔ細胞の活性化は、抗原がリンパ球の表面レセプターに結合す
る場合に、引き起こされる。
【００１５】 用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みをいうた
めに使用される。細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されている場合に
「トランスフェクト」されている。多くのトランスフェクション技法が、一般に
、当該技術分野で公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍら（１９７３）Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ，５２：４５６、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｄａｖ
ｉｓら（１９８６）Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、およびＣｈｕら（１９８１）Ｇｅｎｅ １
３：１９７を参照のこと。このような技法は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適
切な宿主細胞に導入するために使用され得る。この用語は、遺伝物質の安定なお
よび一過性の両方の取り込みをいい、そしてペプチド結合または抗体結合したＤ
ＮＡの取り込みを含む。
【００１６】 用語「形質導入」は、レトロウイルス遺伝子移入ベクターのような複製欠損ウ
イルスベクターを介して、インビボまたはインビトロのいずれかでのＤＮＡ分子
のレシピエント細胞への送達をいう。
【００１７】 「遺伝子改変」されているレシピエント細胞は、目的のＤＮＡ分子を含む遺伝
子移入ベクターを用いて、インビボまたはインビトロのいずれかで、トランスフ
ェクトまたは形質導入されている。
【００１８】 「ベクター」、「ベクター構築物」、および「遺伝子移入ベクター」とは、目
的の遺伝子の発現を指示し得、そして遺伝子配列を標的細胞に移入し得る、任意
の核酸構築物を意味する。したがって、この用語は、クローニングおよび発現ビ
ヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００１９】 「自殺遺伝子」（例えば、薬物感受性遺伝子）の標的細胞への移入は、正常細
胞に対して比較的非毒性である化合物または組成物に対して、細胞を感受性にす
る。Ｍｏｏｌｔｅｎ，Ｆ．Ｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ
．１：２７９−２８７。自殺遺伝子の例は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキ
ナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトクロムＰ４５０（Ｍａｎｏｍｅら（１９９６）Ｇ
ｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：５１３−５２０）、ヒトデオキシシチジンキナー
ゼ（Ｍａｎｏｍｅら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２（５）：
５６７−５７３）、および細菌酵素シトシンデアミナーゼ（Ｄｏｎｇら（１９９
６）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：７１３−７２０）である。こ
れらの遺伝子を発現する細胞は、比較的非毒性のプロドラッグのガンシクロビル
（ＨＳＶ−ｔｋ）、シクロホスファミド（シトクロムＰ４５０ ２Ｂ１）、シト
シンアラビノシド（ヒトデオキシシチジンキナーゼ）、または５−フルオロシト
シン（細菌シトシンデアミナーゼ）の効果に対して感受性になる。Ｃｕｌｖｅｒ
ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１５５０−１５５２、Ｈｕｂｅｒら（
１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８３０２−
８３０６。
【００２０】 「選択マーカー」とは、治療活性がないが、むしろ、遺伝子移入ベクターのよ
り簡単な調製、製造、特徴づけ、またはテストを可能にするために含まれる、遺
伝子移入ベクターに含まれるヌクレオチド配列をいう。
【００２１】 「特異的結合因子」とは、分子の特異的結合対のメンバーをいい、ここで、分
子の１つは、化学的および／または物理的手段によって第２の分子に特異的に結
合する。
【００２２】 「コード配列」または選択された分子を「コードする」配列は、適切な調節配
列の制御下に配置された場合、インビボでポリペプチドに、転写（ＤＮＡの場合
）されそして翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。
【００２３】 「核酸分子」または「ヌクレオチド配列」は、原核生物配列、真核生物ｍＲＮ
Ａ、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡか
らのゲノムＤＮＡ配列、およびさらに合成ＤＮＡ配列を含み得るが、これらに限
定されない。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいず
れかを含む配列を含む。
【００２４】 「作動可能に連結した」とは、エレメントの配置をいい、ここでは、このよう
に記載された成分が、通常の機能を行うように配列される。したがって、コード
配列に作動可能に連結した所定のプロモーターは、適切な酵素が存在する場合に
、コード配列の発現をもたらし得る。プロモーターは、コード配列の発現を指示
するように機能する限り、コード配列と連続している必要はない。したがって、
例えば、介在している翻訳されないが転写された配列は、プロモーター配列とコ
ード配列との間に存在し得、そしてプロモーター配列は、なお、コード配列に「
作動可能に連結する」と考えられ得る。
【００２５】 核酸分子を記載するために本明細書で使用される場合、「組換え体」とは、そ
の起源または操作によって、（１）天然で結合されるポリヌクレオチドのすべて
または一部と結合せず；および／または（２）天然に連結するもの以外のポリヌ
クレオチドに連結する、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源のポリヌク
レオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用する場合、用
語「組換え体」とは、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生するポリペプ
チドを意味する。
【００２６】 （ＩＩ．本発明の実施の態様） 本発明は、Ｔ細胞の集団が、エキソビボ方法論においてベクター構築物を使用
して高い効率で遺伝子改変され得るという驚くべき知見に基づく。
【００２７】 Ｔ細胞は、当業者に公知の種々の手順によって末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から
単離され得る。例えば、Ｔ細胞集団は、アクセサリー細胞およびＢ細胞の除去に
よってＰＢＬの集団から「富化」され得る。特に、Ｔ細胞富化は、抗ＭＨＣクラ
スＩＩモノクローナル抗体を使用して非Ｔ細胞の除去によって達成され得る。同
様に、他の抗体は、非Ｔ細胞の特定の集団を枯渇させるために使用され得る。例
えば、抗Ｉｇ抗体分子は、Ｂ細胞を枯渇させるために使用され得、そして抗Ｍａ
ｃＩ抗体分子は、マクロファージを枯渇させるために使用され得る。
【００２８】 Ｔ細胞は、さらに、当業者に公知の技法によって多くの異なる亜集団に分画さ
れ得る。２つの主要な亜集団は、細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ８の差別的
発現に基づいて単離され得る。例えば、上記のようにＴ細胞の富化の後、ＣＤ４ + 細胞は、ＣＤ４に特異的な抗体を使用して富化され得る（Ｃｏｌｉｇａｎら、 前出を参照のこと）。抗体は、磁性ビーズのような固体支持体に結合され得る。
逆に、ＣＤ８＋細胞は、（ＣＤ４+細胞を除去するために）ＣＤ４に特異的な抗 体の使用によって富化され得るか、または固体支持体に結合されたＣＤ８抗体の
使用によって単離され得る。ＨＩＶ−１関連した患者からのＣＤ４リンパ球は、
Ｗｉｌｓｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７２：８８に記載の
ように形質導入の前または後に、エキソビボで増殖され得る。
【００２９】 Ｔ細胞の精製後、当業者に公知の遺伝子改変の種々の方法が、本明細書に記載
のように構築された非ウイルスまたはウイルスベースの遺伝子移入ベクターを使
用して行われ得る。例えば、１つのこのようなアプローチは、ベクター産生細胞
に由来するベクター含有上清培養物での、精製されたＴ細胞集団の形質導入を含
む。第２のアプローチは、ベクター産生細胞の照射された単層と、精製されたＴ
細胞との同時培養を含む。第３のアプローチは、同様の同時培養アプローチを含
むが；精製されたＴ細胞は、種々のサイトカインで予備刺激され、そして照射さ
れたベクター産生細胞との同時培養の４８時間前に培養される。このような形質
導入の前の予備刺激は、効果的な遺伝子移入を増加させる（Ｎｏｌｔａら（１９
９２）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２０：１０６５）。特定の理論に結びつけるこ
とを望まないが、形質導入の増加したレベルは、効率的なレトロウイルス形質導
入に必要なＴ細胞の増加した増殖に寄与する。増殖させるためのこれらの培養物
の刺激も、患者への再注入のための増加した細胞集団を提供する。同時培養に続
いて、Ｔ細胞はベクター産生細胞単層から収集され、増殖され、そして液体窒素
中で凍結される。
【００３０】 単離されたＴ細胞への送達に適切な制御エレメントと結合した目的の１つ以上
のコード配列を含む、遺伝子移入ベクターは、公知の方法を使用してアセンブリ
され得る。
【００３１】 選択マーカーはまた、遺伝子移入ベクターの構築に使用され得る。例えば、遺
伝子移入ベクターで形質導入された哺乳動物細胞に、細胞傷害性因子に対する耐
性を与えるマーカーが、使用され得る。細胞傷害性因子は、ネオマイシン、アミ
ノグリコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、スルホンアミド、ア
クチノマイシン、ネトロプシン、ジスタマイシンＡ（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ Ａ
）、アントラサイクリン、またはピラジンアミドであり得るが、これらに限定さ
れない。例えば、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩは、ネオマイシン
アナログのゲンチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｇ４１８）に対する耐性を与え
る。
【００３２】 非免疫原性選択マーカーが、本明細書における使用に好ましい。「非免疫原性
」とは、遺伝子送達ビヒクルの一部として投与される場合、大多数の患者におい
て望ましくない免疫反応を引き起こさない選択マーカーまたはプロドラッグ活性
化酵素をいう。このような遺伝子は、ヒト遺伝子、非ヒト遺伝子、または正常ヒ
ト遺伝子との十分な差がない（通常１０％未満のアミノ酸配列の差）変異したヒ
ト遺伝子であり得る。本明細書での使用のためのヒト起源ではない遺伝子は、患
者においてＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ提示を介してタンパク質配列の効果
的な提示を可能にするエピトープを有さないか、あるいは、他の免疫原性エピト
ープの効果的な提示を抑える配列を有する遺伝子であり得る。少なくともいくつ
かの非免疫原性選択マーカーが種特異的であることに留意することが重要である
。臨床使用のために、非免疫原性マーカーは、一般に、ヒト起源である。
【００３３】 広範に種々の非免疫原性マーカーは、本発明の遺伝子移入ベクターによって発
現され得る。簡単にいえば、このようなマーカーは、種々のアッセイによって免
疫原性について容易にテストされ得、これには、例えば、生物が既に免疫を生成
している抗原についてのＣＴＬアッセイ、および生物が既に存在する応答を有さ
ない抗原で形質導入した樹状細胞を利用するＴ細胞応答のインビトロ生成が挙げ
られる（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら（１９９６）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５６：３７６３
；Ｈｓｕら（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：５２を参照のこと）。ＣＴＬアッ
セイは、例えば、国際公開公報第ＷＯ ９１／０２８０５号に記載のように行わ
れ得る。マーカーが非免疫原性であることを確実にするためのもう１つの方法は
、アレルギー反応をテストするために利用されるような標準的皮膚テストにおい
てマーカーを投与することである。しかし、上記のテストは、本発明の状況内で
非免疫原性であるマーカーを確かめるために利用され得るが、少しの割合の患者
は、それにもかかわらずマーカーに対して反応し得ることに留意すべきである。
【００３４】 適切な非免疫原性マーカーは、種々の供給源から得られ得る。例えば、マーカ
ーは、そのネイティブの状態で、ヒト酵素であり得、従ってその性質からは、非
免疫原性であり得る。同様に、マカクのような密接に関連する種からのマーカー
は、同様に非免疫原性であり得る。マーカーは、非ヒト起源であり得、そして変
異（例えば、置換、欠失、または挿入）によって非免疫原性になり得る。このよ
うなマーカーと関連のプロドラッグ分子との代表的な例には、アルカリホスファ
ターゼ、ならびにフェノールマスタードホスフェート（ｐｈｅｎｏｌｍｕｓｔａ
ｒｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ドキソルビシンホスフェート、マイトマイシンホ
スフェート、およびエトポシドホスフェートのような種々の毒性リン酸化化合物
；β−ガラクトシダーゼとＮ−［４−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）ベニルオ
キシカルボニル］−ダウノルビシン（Ｎ−［４−（β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙ
ｒａｎｏｓｙｌ）ｂｅｎｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ］−ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃ
ｉｎ）；アゾレダクターゼ（ａｚｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）とアゾベンゼンマスタ
ード；β−グルコシダーゼとアミグダリン；β−グルクロニダーゼとフェノール
マスタードグルクロニドおよびエピルビシングルクロニド；カルボキシペプチダ
ーゼＡとメトトレキセート−アラニン；シトクロムＰ４５０とシクロホスファミ
ドまたはイフォスファミド；ＤＴジアフォラーゼと５−（アジリジン−１−イル
）−２，４−ジニトロベンザミド（ＣＢ１９５４）（Ｃｏｂｂら（１９６９）Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １８：１５１９、Ｋｎｏｘら（１９９３）
Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ．１２：１９５）；β−グルタミ
ルトランスフェラーゼとβ−グルタミルｐ−フェニレンジアミンマスタード；ニ
トロレダクターゼとＣＢ１９５４または４−ニトロベンジルオキシカルボニルの
誘導体；グルコースオキシダーゼとグルコース；キサンチンオキシダーゼとヒポ
キサンチン；ならびにプラスミンとペプチジル−ｐ−フェニレンジアミン−マス
タードが挙げられる。非免疫原性マーカーはまた、通常には発現されない細胞の
コンパートメントにおいて酵素を発現することによって作成され得る。例えば、
トランスゴルジで通常は発現される酵素フリン（ｆｕｒｉｎ）は、細胞表面上で
発現され得る。次いで、トランスゴルジに通常には達し得ない薬物を活性化し得
る。
【００３５】 あるいは、外因性選択マーカーは、マーカーを発現する細胞が、免疫化学的ま
たはレセプターリガンド結合方法によって集団において他の細胞から物理的に分
離され得るように、細胞の表面上で発現されるタンパク質であり得る。細胞表面
マーカーは、細胞外マトリクスタンパク質に対する細胞の結合を調節する、イン
テグリンのような、細胞接着因子を含み得る。
【００３６】 １つの特定の実施態様では、自殺遺伝子を発現するベクターが提供される。自
殺遺伝子についてのコード配列は、公知の方法を使用して得られ得る。例えば、
ＨＳＶ−Ｉチミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ）のコード領域および転写終
結シグナルは、プラスミド３２２ＴＫ（ＭｃＫｎｉｇｈｔら（１９８０）Ｎｕｃ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：５９４９）から単離され、次いで適切な遺伝子移入
ベクターにクローニングされ得る。
【００３７】 他の実施態様では、ヒト第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸ因子を発現するベクター
は、血友病の処置における使用のために提供され得る。特に、Ｂドメイン欠失第
ＶＩＩＩ因子タンパク質を発現するベクターは、以下の実施例に記載される。Ｂ
ドメインは、新しく合成された一本鎖分子において第ＶＩＩＩ因子の第２および
第３のＡドメインを分離する。Ｂドメインは、分子のアミノ酸７１２〜１６４８
に及ぶ。Ｗｏｏｄら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３３０−３３７。第Ｖ
ＩＩＩ因子のタンパク質分解性の活性化は、３７２、７４０、および１６８９位
に位置する特異的Ａｒｇ残基での切断を含む。トロンビンまたは第Ｘａ因子によ
る、Ａｒｇ３７２およびＡｒｇ１６８９での血漿第ＶＩＩＩ因子の切断は、活性
第ＶＩＩＩ因子を得るために必須である。活性化第ＶＩＩＩ因子は、アミノ酸残
基１〜３７２（Ａ１ドメインを含む）および残基３７３〜７４０（Ａ２ドメイン
を含む）、ならびに残基１６９０〜２３３２（Ａ３−Ｃ１−Ｃ２ドメインを含む
）を含む、カルシウム架橋したヘテロダイマーからなる。
【００３８】 本発明の実施においてＢドメイン欠失した第ＶＩＩＩ因子分子を使用すること
における重要な利点は、減少したサイズが、あまりタンパク質分解しない傾向が
あるようであり、したがって血漿由来アルブミンの添加が、最終産物の安定化の
ために必要でないことである。第ＶＩＩＩ因子タンパク質に関して本明細書で使
用される場合、用語「Ｂドメイン欠失」とは、残基７１１と１６９４との間のア
ミノ酸のいくつかまたはすべてが欠失しており、そしてなお生物学的に活性な第
ＶＩＩＩ因子分子を保存する第ＶＩＩＩ因子タンパク質をいう。
【００３９】 Ｂドメインの欠失の範囲は、Ｂドメインにおいてどのアミノ酸残基が欠失され
るかに依存して存在し得る。「ＳＱＮ欠失」と称される、１つの特定のＢドメイ
ン欠失が存在し、そしてＳｅｒ７４３とＧｌｎ１６３８を融合することによって
生成されている（Ｌｉｎｄら（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２３
：１９−２７、および国際公開公報第ＷＯ ９１／０９１２２号）。これは、Ａ
２とＡ３の第ＶＩＩＩ因子ドメインとの間のＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ（ＳＱＮ）
連結を生じるＢドメインから、アミノ酸残基７４４〜１６３７を除去する。血漿
由来第ＶＩＩＩ因子と比較した場合、ＳＱＮ欠失は、第ＶＩＩＩ因子分子のイン
ビボでの薬物動態学的に影響を及ぼさない（Ｆｉｊｎｖａｎｄｒａａｔら（１９
９７）Ｐ．Ｒ．Ｓｃｈａｔｔａｕｅｒ Ｖｅｒｔａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｔ
ｔ ｍｂＨ（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）７７：２９８−３０２）。本明細書で使用さ
れる場合、用語「第ＶＩＩＩ因子ＳＱＮ欠失」または「ＳＱＮ欠失」とは、この
欠失をいい、そして単一のＳ−Ｑ−Ｎトリペプチド配列を保存しそして２つのＢ
ドメインＳＱＮ配列間のアミノ酸の欠失を生じる他の欠失をいう（このアミノ酸
配列の記載については、国際公開公報第ＷＯ ９１／０９１２２号を参照のこと
）。
【００４０】 多数の他の第ＶＩＩＩ因子のＢドメインを欠失した形態が存在する。これらの
Ｂドメインを欠失した第ＶＩＩＩ因子タンパク質の全てをコードするｃＤＮＡは
、標準的な分子生物学的技術を使用して遺伝子導入ベクターに挿入され得る。例
えば、以下の第ＶＩＩＩ因子のＢドメイン欠失をコードするｃＤＮＡ分子が、本
発明の実施において使用され得る：ｄｅｓ ７９７−１５６２（Ｅａｔｏｎ（１
９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：８３４３）；ｄｅｓ ７６０−１６
３９（ＬＡ−ＦＶＩＩＩ）（Ｔｏｏｌｅ（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：５９３９）；ｄｅｓ ７７１−１６６６（ＦＶＩ
ＩＩ ｄｅｌ ＩＩ：１つのトロンビン部位を欠いている）（Ｍｅｕｔｉｅｎ（
１９８８）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．２：３０１）；ｄｅｓ ７４７−１５６０（Ｓａ
ｒｖｅｒ（１９８７）ＤＮＡ ６：５５３）；ｄｅｓ ８６８−１５６２および
ｄｅｓ ７１３−１６３７（トロンビン耐性）（Ｍｅｒｔｅｎｓ（１９９３）Ｂ
ｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．８５：１３３）；ｄｅｓ ７９７−１５６２（Ｅｓ
ｍｏｎ（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：１５９３）；ｄｅｓ ７４１−１６６８
（Ｄｏｎａｔｈ（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１２：４９）；ｄｅｓ７４
８−１６４８（部分的にプロセシングされた）、ｄｅｓ ７５３−１６４８（部
分的にプロセシングされた）、ｄｅｓ ７７７−１６４８（部分的にプロセシン
グされた）、ｄｅｓ ７４４−１６３７（ＦＶＩＩＩ−ＳＱ）、ｄｅｓ ７４８
−１６４５（ＦＶＩＩＩ−ＲＨ）、ｄｅｓ Ｂドメイン＋０，１，２Ａｒｇ（部
分的にプロセシングされた）、ｄｅｓＢ＋３Ａｒｇ（ＦＶＩＩＩＲ４）、ｄｅｓ
Ｂ＋４Ａｒｇ（ＦＶＩＩＩＲ５）（Ｌｉｎｄ（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．２３２：１９）；ｄｅｓ ７４１−１６８９またはｄｅｓ ８１６−１
５９８（Ｌａｎｇｎｅｒ（１９８８）Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ Ｍｉｔｔ １
６−２５）；ｄｅｓ ７４６−１６３９（Ｃｈｅｕｎｇ（１９９６）Ｂｌｏｏｄ
８８：３２５ａ）；およびｄｅｓ７９５−１６８８（トロンビン部位が変異し
た）（Ｐｉｐｅｓ（１９９６）Ｂｌｏｏｄ ８８：４４１ａ）。
【００４１】 本明細書中で使用され得る他の第ＶＩＩＩ因子Ｂドメイン欠失として、ＩｇＧ
ヒンジ領域が挿入されているＢドメイン欠失（例えば、米国特許第５，５９５，
８８６号を参照のこと）、および１９９７年６月４日に代理人番号１１５５．０
０４として提出された、「血友病および他の障害の処置のための組換え送達ビヒ
クルの投与のための方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅｓ
ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ａｎｄ Ｏｔｈｅ
ｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」と題される共有に係る米国特許出願に記載されてい
るＢドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】 全長の第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ（例えば、国際公開番号第ＷＯ ９６／２１０
３５号に記載されているｃＤＮＡ分子）もまた、本発明の遺伝子導入ベクター中
に挿入され得る。本明細書中での使用にまた適切である種々の第ＶＩＩＩ因子欠
失、変異、および第ＶＩＩＩ因子のポリペプチドアナログとして、例えば、国際
公開番号第ＷＯ ９７／０３１９３号、同第ＷＯ ９７／０３１９４号、同第Ｗ
Ｏ ９７／０３１９５号、および同第ＷＯ ９７／０３１９１号に記載されてい
るこれらのアナログが挙げられる。
【００４３】 Ｂ型血友病はまた、第ＩＸ因子を発現する遺伝子導入ベクターを用いる遺伝子
送達技術を使用して処置され得る。ヒトの第ＩＸ因子欠損（クリスマス病または
Ｂ型血友病）は、主として男性に影響を与える。なぜなら、これは、性に関連す
る劣性の形質として遺伝されるからである。米国で約２０００人がこれに罹患し
ている。ヒト第ＩＸ因子遺伝子は、４１６アミノ酸残基の成熟タンパク質をコー
ドする。
【００４４】 ヒト第ＩＸ因子ｃＤＮＡは、例えば、Ｋｕｒａｃｈｉら（１９８２）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６４６１−６４６４によって記
載されているようなプラスミド構築物ｐＨｆＩＸ１から得られ得る。ｃＤＮＡ配
列は、約１．５ｋｂのＰｓｔＩフラグメントとして切り出され得、そしてＴ４
ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端にされ得る。次いで、この因子ｃＤＮＡ
フラグメントは、例えば、ベクター中の適切な制限部位に容易に挿入され得る。
【００４５】 本発明はまた、ＡＰＣ耐性に起因する血栓症、ならびに血栓症および高凝固（
ｈｙｐｅｒｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）の他の障害の治療および／または予防にお
いて、第Ｖ因子を発現し得る遺伝子導入ベクターを提供することによって使用さ
れ得る。血液の凝固は、一連の、循環しているセリンプロテアーゼチモーゲンの
連続的な活性化、トロンビンを形成するためのプロトロンビンの活性化を最高に
達すること、および続く、血餅の基質であるフィブリンの生成によって構成され
る。これらの反応の２つである、プロトロンビンおよび第Ｘ因子の活性化は、大
きなタンパク質様（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ）補因子である第Ｖａ因子およ
び第ＶＩＩＩａ因子の関与を、それぞれ必要とする。セリンプロテアーゼチモー
ゲン（プロテインＣ）は、それが活性化されたプロテインＣを形成するようにト
ロンビンによって切断された場合に、抗凝固効果を発揮する。活性化されたプロ
テインＣ（ＡＰＣ）は、特異的なアルギニン残基での切断によって第Ｖａ因子お
よび第ＶＩＩＩａ因子の活性を破壊する。プロテインＣまたはその補因子である
プロテインＳにおける遺伝的な欠損は、家族性栓友病の症例の約５〜１０％の原
因である。１９９３年には、Ｄａｈｌｂａｃｋは、活性化されたプロテインＣ耐
性（ＡＰＣ耐性）と呼ばれる、栓友病の新たな形態を記載した。そこでは、添加
されたＡＰＣは、患者の血漿の凝固時間を延長できなかった。Ｄａｈｌｂａｃｋ
（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１００４
。これは、続いて、４０％までの家族性栓友病の症例についての原因であること
が示され、これによって、それを、血栓症についての遺伝した素因の最も一般的
な形態にする（Ｓｕｎら（１９９４）Ｂｌｏｏｄ ８３：３１２０）。９５％よ
り多いＡＰＣ耐性の症例は、第Ｖ因子における単一の点変異；Ｒ５０６Ｑによっ
て生じる（Ｂｅｒｔｉｎａら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６４、Ｇｒｅ
ｅｎｇａｒｄら（１９９４）Ｌａｎｃｅｔ ３４３：１３６１）。この変異が、
種々の健常な欧州集団において１〜１０％のレベルで存在することが、続いて見
出された（Ｓｖｅｎｓｓｏｎら（１９９４）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３
００：５１７、Ｇｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ｂｌｏｏｄ ８２：１９８９、Ｋ
ｏｓｔｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ３４２：１５０３）。そして症状の存在／非存在
は、多数のホモ接合型を有する家族においてかなり変化し得（Ｇｒｅｅｎｇａｒ
ｄら（１９９５）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：１５５９）、これに
よって血栓形成性の疾患の多機能性の性質を明白にする。Ｒｏｓｅｎｄａａｌら
（１９９５）Ｂｌｏｏｄ ８５：１５０４は、ＡＰＣ耐性について、ヘテロ接合
型における血栓症の相対的な危険性を７倍と推定し、ホモ接合型については８０
倍と推定した。
【００４６】 Ｇｒｅｅｎｇａｒｄら（１９９５）Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔａｓ ７３
：１３６１（要約）は、第Ｖ因子欠損およびＡＰＣ耐性についての無効な対立遺
伝子の両方を有することを記載した。これらの２つの第Ｖ因子欠損が別々に分類
されるので、これらは、２つの異なる第Ｖ因子対立遺伝子を提示する。ヘテロ接
合型である化合物は、ＡＰＣ耐性第Ｖ因子対立遺伝子のみに由来する循環してい
る第Ｖ因子を有した。そして３つの症候性のファミリーのメンバーの２つは、こ
の「偽ホモ接合型」の遺伝子型を有した。１つの第Ｖ因子欠損のみを有する他の
ファミリーメンバーは、血栓症を有さなかった。理論に束縛されることは望まな
いが、ＡＰＣ耐性対立遺伝子の危険因子は、いくつかの正常な（ＡＰＣ応答性の
）第Ｖ因子の単なる存在によっていくつかの症例において補われ得る。従って、
正常な第Ｖ因子の送達は、同じ量の耐性の第Ｖ因子の存在下でもなお、おそらく
この機構に起因して治療的な利点であり得る。
【００４７】 従って、第Ｖ因子をコードするヌクレオチド配列が、本発明に従う遺伝子導入
ベクター中に取り込まれ得る。第Ｖ因子ｃＤＮＡは、標準的な分子生物学的技術
を使用して、ｐＭＴ２−Ｖ（Ｊｅｎｎｙ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４８４６、ＡＴＣＣ寄託番号４０５１５）からＳ
ａｌＩでの消化によって得られ得、そして７ｋｂのｃＤＮＡバンドが、アガロー
スゲルから切り出され得、そしてベクター中にクローン化され得る。全長の第Ｖ
因子ｃＤＮＡ、またはそのＢドメイン欠失もしくはＢドメイン置換のいずれかが
、使用され得る。第Ｖ因子のＢドメイン欠失（例えば、Ｍａｒｑｕｅｔｔｅ（１
９９５）Ｂｌｏｏｄ ８６：３０２６およびＫａｎｅ（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ２９：６７６２によって報告されるＢドメイン欠失）が、編者ら
によって記載されているように作製され得る。
【００４８】 遺伝子導入ベクターが、同様に、高凝固症状を処置または予防するための抗ト
ロンビンＩＩＩを発現させるために、本明細書中で構築され得る。凝固経路の中
心的な酵素であるトロンビンは、血餅の基質であるフィブリンを形成するための
フィブリノーゲンの切断によって直接作用するか、または他の血餅形成因子の活
性化に関連するポジティブなフィードバック機構を通じて間接的に作用する。最
も一般的に使用される急性相の抗凝固物質は、トロンビンの阻害を増大するヘパ
リンである。血漿中の主要なトロンビンインヒビターは、抗トロンビンＩＩＩ（
ＡＴＩＩＩ）である。ＡＴＩＩＩ欠損の頻度は、１：５００程度の高さである（
Ｔａｉｔ（１９９０）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．７５：１４１）。ほとんど
の症例が、臨床的には無症状であるが、欠損は、他と共作動性である危険因子の
ような挙動をし得る。ほとんどの患者は、外科的または他の主要な外傷について
、ＡＴＩＩＩ濃縮物によって補充された経口的な抗凝固物質で処置される（Ｗｉ
ｎｔｅｒ（１９８１）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．４９：４４９−４５７）。
経口的な抗凝固物質は、高凝固状態の処置には不便であり、そして不適切である
と考えられている。一方、血漿に由来するタンパク質は、感染性の因子の伝達お
よび他の問題の危険性を有する。後天性のＡＴＩＩＩの欠損は、例えば、未熟児
、白血病のＬアスパラギナーゼ治療、ＤＩＣ、敗血症、ネフローゼ症候群、外傷
性の鬱血、重篤な火傷、悪性腫瘍、ＡＲＤＳ、ＤＶＴ／ＰＥ、および腸疾患にお
いて、より頻繁である。濃縮物は、これらの状態のいくつかの動物モデルについ
て使用されている（Ｅｍｅｒｓｏｎ（１９９４）Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇ．Ｆｉｂ
ｒｉｎｏｌ．５：３７）。本明細書中に記載される方法を使用するＡＴＩＩＩを
送達するための遺伝子治療の使用は、特に、ＡＴＩＩＩ欠損状態において、有用
な治療を提供する。
【００４９】 従って、ＡＴＩＩＩを発現する遺伝子導入ベクターが、ベクターｐＫＴ２１８
（Ｐｒｏｃｈｏｗｎｉｋ（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：８３８
９、ＡＴＣＣ寄託番号５７２２４／５７２２５）からＰｓｔＩでの消化によって
構築され得る。１．６ｋｂのｃＤＮＡ挿入物が、アガロースゲルから回収され得
、そして適切なウイルスまたは非ウイルスベクター系中にクローン化され得る。
【００５０】 上記のように、プロテインＣは、凝固カスケードをダウンレギュレートするよ
うに作用するセリンプロテアーゼチモーゲンである。プロテインＣ欠損は、再発
性の血栓症、電撃性紫斑病、およびワルファリン誘導性の皮膚の壊死の増大した
危険性に関連する（Ｂａｕｅｒ，Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｏｆ Ｈｅｍｏｓｔａｓ
ｉｓ，ＲａｔｎｏｆｆおよびＦｏｒｂｅｓ（編）、ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐ
ｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９６））。ヘテロ接合性の発生率は、１／２００
程度の高さである（Ｍｉｌｅｔｉｃｈ（１９８７）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅ
ｄ．３１７：９９１）。ほとんどの症例は、臨床的には無症状であるが、欠損は
、他と共作動性である危険因子のような挙動をし得る。組換えプロテインＣが、
重篤に罹患したホモ接合型に対して特別に配慮された基準で投与される（Ｍｉｎ
ｆｏｒｄ（１９９６）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．９３：２１５）。ホモ接合
型および症候性のヘテロ接合型は、遺伝子送達技術によってより効果的に処置さ
れ得る。さらに、漸増するレベルの活性化されたプロテインＣ（ＡＰＣ）が、高
凝固性の他の原因（遺伝的または後天的）を有する患者における血栓症の予防に
おいて主要な役割を果たし得ることを示唆する証拠が存在する。このことに関し
て、Ｇｒｕｂｅｒ（１９９２）Ｂｌｏｏｄ ７９：２３４０は、健常な個体の血
漿においては低レベルのＡＰＣが循環することを示し、そして基底レベルのＡＰ
Ｃが低レベルのプロトロンビン性シグナルに応答して凝固をダウンレギュレート
するように作用することを提案した。プロテインＣチモーゲンレベルに対する循
環している内因性のＡＰＣレベルの比は、血栓症の病歴を有するプロテインＣ欠
損個体においては、血栓症を有さない親族中におけるよりもより低い。しかし、
ＡＰＣレベルは一般的には、チモーゲンプロテインＣレベルと比例する（Ｅｓｐ
ａｎａ（１９９６）Ｔｈｒｏｍｂｏｓ Ｈａｅｍｏｓｔａｓ ７５：５６−６１
）。特定の理論に束縛されることは望まないが、他の原因による血栓症の危険性
を有する非欠損個体中でプロテインＣを発現する遺伝子治療ベクターは、この機
構に起因して、プロテインＣの正常なレベルを有する個体中で防御的な影響を有
し得る。プロテインＣの人工的な変異体であるＨＰＣ−ＦＬＩＮＱ（Ｒｉｃｈａ
ｒｄｓｏｎ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３６０：２６１、Ｋｕｒｚ（１９９７）
Ｂｌｏｏｄ ８９：５３４）が、通常必要とされる補因子トロンボモジュリンを
伴わずに、トロンビンの存在下で増強された活性化プロフィールを有し、その結
果、ＡＰＣが血漿の血餅形成の間に達成されたトロンビンレベルの存在下で生成
されることが最近記載された。さらに、ヒトプロテインＣの第２の人工的な変異
体であるＨＰＣ−Ｓ４６０Ａは、正常な活性化プロフィールを有するが、血漿の
ｓｅｒｐｉｎによる続く阻害のはるかにより低下させられた傾向を有する。理論
に束縛されることは望まないが、ｓｅｒｐｉｎに対する結合が循環からのＡＰＣ
の除去のための主要な機構であるので、この変異体について実証された非酵素的
抗凝固活性（Ｇａｌｅ（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．６：１３２）が好まれ得
る。なぜなら、それが、活性化の際に有意に延長された血漿半減期を有するから
である。なお別のアプローチが、分泌プロセスの間に活性化されるプロテインＣ
の変異体を作製した、Ｅｈｒｌｉｃｈ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６４：１４２９８によって行われ、それによって活性化された酵素の分泌を生じ
た。詳細には、本明細書中で記載される遺伝子導入ベクターによる、および遺伝
的改変の方法によるこれらの変異体の送達が、その危険性を有する個体中で血栓
症を減少させることにおいて有用である。
【００５１】 従って、プロテインＣを発現し得る遺伝子導入ベクターが、当業者に公知の技
術を使用して作製され得る。例えば、プロテインＣのｃＤＮＡが、同じ物を含有
する既知のベクターの制限酵素消化によって得られ得る（Ｆｏｓｔｅｒ（１９８
４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：４７６６、Ｂｅｃ
ｋｍａｎｎ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：５２３３
）。次いで、１．６ｋｂのｃＤＮＡ挿入物がアガロースゲルから回収され得、そ
して標準的な条件下でウイルスおよび非ウイルスベクターの適切なクローニング
部位にクローン化され得る。
【００５２】 正常なプロテインＣ抗凝固経路は、酵素トロンビンによる活性化を必要とする
。トロンビンは、通常は、フィブリノーゲンを切断してフィブリンを形成するプ
ロコアギュラント酵素であり、血小板を活性化し、そして凝固カスケードの成分
に対してポジティブなフィードバック反応を行う。生理学的条件下での抗凝固経
路におけるトロンビン活性は、内非細胞表面結合補因子であるトロンボモジュリ
ンに対する結合に依存する。このタンパク質への結合の際に、トロンビンは、上
記のプロコアギュラント反応を行うその能力を大きく低下する立体構造的な変化
を受ける。一方、プロテインＣチモーゲンの活性化の速度が大きく増大し、従っ
て、抗凝固酵素に対するプロコアギュラントに由来する特異性を変更する。この
モデルに従って、低レベルのトロンビンの注入が、抗血栓性であることが示され
ている（Ｇｒｕｂｅｒ（１９９０）Ｃｉｒｃ．８２：５７８、Ｈａｎｓｏｍ（１
９９３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：２００３、ＭｃＢａｎｅ（１９９
５）Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．７４：８７９）。トロンボモジュリン
の非存在下での特異性において類似の変更を有するトロンビン変異体が、開発さ
れている（Ｄａｎｇ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：１４６
、Ｇｉｂｂｓ（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７８：４１３（１９９１）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７３７１、Ｗｕ（１９９１）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：６７７５、およびＧｕｉ
ｎｔｏ（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１
１１８５）。従って、本明細書中に記載される遺伝子導入ベクターの手段および
遺伝的改変の方法によるこれらの変異体の送達が、その危険性を有する個体にお
ける血栓症を減少させることにおいて有用である。
【００５３】 プロトロンビンおよびその変異体を発現する遺伝子導入ベクターは、当業者に
既知の方法によって構築され得る。例えば、プロトロンビンｃＤＮＡは、公開さ
れたベクター（Ｄｅｇｅｎ（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２：２０
８７）の制限酵素消化によって得られ得る。次いで、１．９ｋｂのｃＤＮＡ挿入
物が、アガロースゲルから回収され得、そして本明細書中で記載される技術を使
用して適切なベクター中にクローン化され得る。
【００５４】 最後に、内皮細胞表面タンパク質であるトロンボモジュリンは、トロンビンに
よるプロテインＣの正常な活性化のための必須の補因子である。可溶性の組換え
形態が記載されている（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６５：１２６０２）。これは、プロテインＣ経路を介して作用する臨床的
な治療用の抗凝固物質としての使用が提案された。従って、本発明の遺伝子導入
ベクターおよび遺伝子改変方法論によるこのおよび他の変異体の送達が、危険性
を有する個体中の血栓症を減少させることにおいて有用である。
【００５５】 トロンボモジュリンおよびその変異体を発現する遺伝子導入ベクターが、当業
者に公知の技術を使用して構築され得る。これに関して、トロンボモジュリンｃ
ＤＮＡは、ベクターｐｕｃ１９ＴＭ１５（Ｊａｃｋｍａｎ（１９８７）Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６４２５、Ｓｈｉｒａｉ（１９
８８）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０３：２８１、Ｗｅｎ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ２６：４３５０、Ｓｕｚｕｋｉ（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：
１８９１、ＡＴＣＣ寄託番号６１３４８、６１３４９）から、ＳａｌＩでの切り
出しによって得られ得る。３．７ｋｂのｃＤＮＡ挿入物が、アガロースゲルから
回収され得、そしてウイルスまたは非ウイルスベクター系中にクローン化され得
る。
【００５６】 本発明の方法によってインビボで発現され得る、遺伝性の障害の処置のために
有用な多数のタンパク質が存在する。欠損遺伝子の遺伝によって引き起こされる
多くの遺伝的疾患（例えば、地中海貧血症、フェニルケトン尿症、 レッシュー ナイハン症候群、重篤な複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、Ａ型血友病およびＢ型血友
病、嚢胞性繊維症、デュシエン筋ジストロフィー、遺伝性気腫、および家族性高
コレステロール血症）が、正常な遺伝子残物を産生することに失敗する（Ｍｕｌ
ｌｉｇａｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６、Ａｎｄｅｒｓｏｎ
ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：８０８、Ｆｒｉｅｄｍａｎら（１９８
９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２７５）。遺伝的疾患は遺伝子産物の非存在を
生じ得るが、内分泌障害（例えば、糖尿病および下垂体機能低下症）は、この遺
伝子が十分なレベルの適切なホルモンインシュリンおよびヒト成長ホルモンのそ
れぞれを産生することができないことによって引き起こされる。
【００５７】 本発明の方法による遺伝子治療は、これらの型の障害を処置するための強力な
アプローチである。この治療は、新規のまたは欠失しているタンパク質が、患者
へのその導入または再導入後にＴ細胞によって産生されるように、Ｔ細胞中への
正常な組換え遺伝子の導入を含む。多数の遺伝的疾患が、遺伝子治療での処置に
ついて選択されており、これらには、アデニンデアミナーゼ欠損、嚢胞性繊維症
、α1−抗トリプシン欠損、ゴーシェ症候群、および非遺伝的疾患が含まれる。
【００５８】 詳細には、ゴーシェ症候群は、酵素グルコセレブロシダーゼの欠損によって特
徴付けられる遺伝的障害である。この酵素の欠損は、体内の全ての細胞のリソソ
ーム中でのグルコセレブロシドの蓄積を誘導する。概説については、Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ ２５６：７９４（１９９２）およびＳｃｒｉｖｅｒら、Ｔｈｅ Ｍｅｔａ
ｂｏｌｉｃ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ Ｄｉｓｅａｓｅ、第６版
、第２巻、１６７７頁を参照のこと。従って、グルコセレブロシダーゼを発現す
る遺伝子導入ベクターは、この障害の処置における使用のために構築され得る。
同様に、ラクターゼをコードする遺伝子導入ベクターが、遺伝性のラクトース不
耐症の処置において使用され得、ＡＤを発現する遺伝子導入ベクターが、ＡＤＡ
欠損の処置のために使用され得、そしてα1−抗トリプシンをコードする遺伝子 導入ベクターが、α1−抗トリプシン欠損を処置するために使用され得る。Ｌｅ ｄｌｅｙ，Ｆ．Ｄ．（１９８７）Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ １１０：１５７−
１７４、Ｖｅｒｍａ，Ｉ．（Ｎｏｖ．１９８７）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ ６８−８４頁、ならびに、遺伝的疾患の遺伝子治療処置の記載につ
いては、「種々の疾患および障害についての遺伝子治療処置（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ａ Ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ Ｄｉｓｅ
ａｓｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」と題された国際公開番号第ＷＯ ９
５／２７５１２号を参照のこと。
【００５９】 別の遺伝的障害である、家族性の高コレステロール血症は、以下によって特徴
付けられる：低密度のリポタンパク質（ＬＤＬ）（ヒト血漿中の主要なコレステ
ロール輸送リポタンパク質）の生存期間中続く上昇によって臨床的に；未成熟な
冠状動脈性心疾患を誘導する、腱、皮膚、および動脈中のＬＤＬに由来するコレ
ステロールの蓄積によって病理学的に；ならびに常染色体性の優性の遺伝形質に
よって遺伝的に。ヘテロ接合型（世界中に約５００人のうちに１人で生じる）に
おいては、細胞は、正常な細胞の割合の約半分でコレステロールに結合し得る。
ヘテロ接合型血漿のコレステロールレベルは、出生時で開始する２倍の上昇を示
す。ホモ接合型は、約１００万人に１人の頻度で生じる。これらの個体は、通常
は２０歳までに生じる死亡を伴う、重篤なコレステロール血症を有する。この障
害に関連する疾患（動脈硬化）は地理学に依存し、そして米国では１００，００
０人あたり１５．５人（全部で２０，０００人）が罹患し、そして日本では１０
０，０００人あたり３．３人が罹患している。従って、上昇した血清ＬＤＬを有
することが明らかである障害の処置のためのＬＤＬレセプターを発現する遺伝子
導入ベクターが、当業者に公知の技術によって構築され得る。
【００６０】 本発明のなおさらなる実施態様において、遺伝子移入ベクターに組み込まれ得
るヌクレオチド配列は、酵素欠損障害に関連するタンパク質（例えば、嚢胞性線
維症膜貫通レギュレータ（例えば、米国特許第５，２４０，８４６号およびＬａ
ｒｒｉｃｋら（１９９１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋを参照）、およびアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）（米国特許第５
，３９９，３４６号を参照））；成長因子、または成長因子のアゴニストもしく
はアンタゴニスト（Ｂａｎｄａｒａら（１９９２）ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１：２２７）；１またはそれ以上の腫瘍抑制遺伝子（例えば
、ｐ５３、Ｒｂ、またはＣ−ＣＡＭＩ（Ｋｌｅｉｎｅｒｍａｎら（１９９５）Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５：２８３１））；生物の免疫系を調整する
分子（例えば、ＨＬＡ分子（Ｎａｂｅｌら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１１３０７））；リボザイム（Ｌａｒｓｓｏｎ
ら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１９：１６１）；ペプチド核酸（Ｈｉｒｓ
ｈｍａｎら（１９９６）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．４４：３４７）； 異常な
もしくは外来のタンパク質の発現もしくは合成をダウンレギュレートするために
使用され得るアンチセンス分子（Ｂｏｒｄｉｅｒら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：９３８３）（例えば、ＨＩＶタンパク
質、もしくはｐ５３のような種々のオンコジーン（Ｈｅｓｋｅｔｈ、Ｔｈｅ Ｏ
ｎｃｏｇｅｎｅ Ｆａｃｔｓ Ｂｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅ
ｗ Ｙｏｒｋ，（１９９５）））；ＨＩＶ感染を処置するために使用される生物
薬剤もしくはアンチセンス分子（例えば、ｐ２４のインヒビター（Ｎａｋａｓｈ
ｉｍａら、（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５００４
））；または逆転写酵素（Ｂｏｒｄｉｅｒ（前出）を参照）を含むが、これらに
限定されない。
【００６１】 治療目的の他のタンパク質は、本発明の方法を使用して遺伝子移入ベクターに
よりインビボで発現され得る。例えば、組織因子阻害タンパク質（ＴＦＰＩ）の
持続性のインビボ発現は、敗血症およびＤＩＣを含む病的状態の処置、および再
灌流傷害の予防に有用である。（国際公開ＷＯ９３／２４１４３、ＷＯ９３／２
５２３０、およびＷＯ９６／０６６３７を参照）。種々の形態のＴＦＰＩをコー
ドする核酸配列は、例えば、米国特許第４，９６６，８５２号；第５，１０６，
８３３号；および第５，４６６，７８３号に記載されるように入手され得、そし
て本明細書に記載される遺伝子移入ベクターに組み込まれ得る。
【００６２】 エリスロポエチン（ＥＰＯ）およびレプチンもまた、本発明の方法に従って遺
伝的に改変されたＴ細胞から、インビボで発現され得る。例えば、ＥＰＯは、貧
血を含む種々の障害の遺伝子治療処置において有用である（「Ｇｅｎｅ Ｔｈｅ
ｒａｐｙ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｎｅｍｉａ」と題する国際公
開ＷＯ９５／１３３７６を参照）。本発明の方法によるレプチンの持続性送達は
、肥満の処置に有用である。レプチン遺伝子および肥満の処置におけるその使用
については国際公開ＷＯ９６／０５３０９を参照。
【００６３】 他の種々の障害もまた、本発明の方法により処置され得る。例えば、遺伝的に
改変されたＴ細胞からのアポリポタンパク質Ｅまたはアポリポタンパク質Ａの持
続性で全身性のインビボ産生は、高脂血症の処置に使用され得る（Ｂｒｅｓｌｏ
ｗら（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：３６５）。アンジオテン
シンレセプターインヒビター（Ｇｏｏｄｆｒｉｅｎｄら（１９９６）Ｎ．Ｅｎｇ
ｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：１４６９）の持続性産生は、本明細書に記載の方法に
より提供され得る。なおさらなる例として、アンギオスタチンの長期間の全身性
インビボ産生は、種々の腫瘍の処置において有用である。（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら
（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２：６８９を参照）。
【００６４】 他の実施態様において、本発明の遺伝子移入ベクターは、サイトカインまたは
他の免疫調節分子をコードするように構築され得る。例えば、ネイティブのＩＬ
−２およびγ−インターフェロンをコードする核酸配列は、それぞれ米国特許第
４，７３８，９２７号および第５，３２６，８５９号に記載されるように入手さ
れ得るが、これらのタンパク質の有用なムテインは、米国特許第４，８５３，３
３２号に記載されるように入手され得る。短い形態および長い形態のｍＣＳＦを
コードする核酸配列は、それぞれ米国第４，８４７，２０１号および第４，８７
９，２２７号に記載されるように入手され得る。本発明の特定の局面において、
サイトカインもしくは免疫調節遺伝子を発現するレトロウイルスベクターは、本
明細書および「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」と題する国際出願ＰＣＴ ＵＳ
９４／０２９５１に記載のように産生され得る。
【００６５】 本明細書における使用に適切な免疫調節分子の例には、以下が挙げられる：Ｉ
Ｌ−１およびＩＬ−２（Ｋａｒｕｐｉａｈら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏ
ｇｙ １４４：２９０−２９８、Ｗｅｂｅｒら（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ
．１６６：１７１６−１７３３、Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら（１９９０）Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１７２：１２１７−１２２４、および米国特許第４，７３８，９２
７号）；ＩＬ−３およびＩＬ−４（Ｔｅｐｐｅｒら（１９８９）Ｃｅｌｌ ５７
：５０３−５１２、Ｇｏｌｕｍｂｅｋら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：
７１３−７１６、および米国特許第５，０１７，６９１号）；ＩＬ−５およびＩ
Ｌ−６（Ｂｒａｋｅｎｈｏｆら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：４１
１６−４１２１、および国際公開ＷＯ ９０／０６３７０）；ＩＬ−７（米国特
許第４，９６５，１９５号）；ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、
ＩＬ−１２、およびＩＬ−１３（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｓｕｍ
ｍｅｒ １９９４）；ＩＬ−１４およびＩＬ−１５；αインターフェロン（Ｆｉ
ｎｔｅｒら（１９９１）Ｄｒｕｇｓ ４２：７４９−７６５、米国特許第４，８
９２，７４３号および第４，９６６，８４３号、国際公開ＷＯ ８５／０２８６
２、Ｎａｇａｔａら（１９８０）Ｎａｔｕｒｅ ２８４：３１６−３２０、Ｆａ
ｍｉｌｌｅｔｔｉら（１９８１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ．７８：３８７
−３９４、Ｔｗｕら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８６：２０４６−２０５０、およびＦａｋｔｏｒら（１９９０）Ｏｎｃｏｇ
ｅｎｅ ５：８６７−８７２）；β−インターフェロン（Ｓｅｉｆら（１９９１
）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：６６４−６７１）；γ−インターフェロン（Ｒａｄｆ
ｏｒｄら（１９９１）Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅ
ｐａｔｏｌｏｇｙ ２００８−２０１５、Ｗａｔａｎａｂｅら（１９８９）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：９４５６−９４６０、Ｇａ
ｎｓｂａｃｈｅｒら（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：７８
２０−７８２５、Ｍａｉｏら（１９８９）Ｃａｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｔｈｅｒ．３０：３４−４２、および米国特許第４，７６２，７９１号および
第４，７２７，１３８号）；Ｇ−ＣＳＦ（米国特許第４，９９９，２９１号およ
び第４，８１０，６４３号）；ＧＭ−ＣＳＦ（国際公開ＷＯ ８５／０４１８８
）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（Ｊａｙａｒａｍａｎら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｌｏｇｙ １４４：９４２−９５１）；ＣＤ３（Ｋｒｉｓｓａｎｅｎら（１
９８７）Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ２６：２５８−２６６）；ＩＣＡＭ−
１（Ａｌｔｍａｎら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３３８：５１２−５１４、Ｓｉ
ｍｍｏｎｓら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３１：６２４−６２７）；ＩＣＡＭ
−２、ＬＦＡ−３（Ｗａｌｌｎｅｒら（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６
：９２３−９３２）；ＭＨＣクラスＩ分子、ＭＨＣクラスＩＩ分子、Ｂ７．１−
．３、β2−ミクログロブリン（Ｐａｒｎｅｓら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２２５３−２２５７）；シャペロン（例
えば、カルネキシン）；およびＭＨＣ関連輸送体タンパク質もしくはそのアナロ
グ（Ｐｏｗｉｓら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：５２８−５３１）。免疫
調節因子はまた、これらの分子のアゴニスト、アンタゴニスト、もしくはリガン
ドであり得る。例えば、可溶性形態のレセプターは、その因子自体の変異形態と
同様に、しばしば、これらのタイプの因子のアンタゴニストとして挙動し得る。
【００６６】 上記物質をコードする核酸分子、および本発明における使用に有利な他の核酸
分子は、例えば、アメリカン タイプ カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ、
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）のような寄託機関を含む種々の供給源
から、またはＢｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ
（Ｃｏｗｌｅｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）のような商業的供給源から容
易に入手され得る。代表例には、ＢＢＧ １２（１２７アミノ酸の成熟タンパク
質をコードするＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を含む）、ＢＢＧ ６（γインターフェロン
をコードする配列を含む）、ＡＴＣＣ寄託番号３９６５６（ＴＮＦをコードする
配列を含む）、ＡＴＣＣ寄託番号２０６６３（α−インターフェロンをコードす
る配列を含む）、ＡＴＣＣ寄託番号３１９０２、３１９０２、および３９５１７
（β−インターフェロンをコードする配列を含む）、ＡＴＣＣ寄託番号６７０２
４（インターロイキン−１ｂをコードする配列を含む）、ＡＴＣＣ寄託番号３９
４０５、３９４５２、３９５１６、３９６２６、および３９６７３（インターロ
イキン−２をコードする配列を含む）、ＡＴＣＣ寄託番号５９３９９、５９３９
８、および６７３２６（インターロイキン−３をコードする配列を含む）、ＡＴ
ＣＣ寄託番号５７５９２（インターロイキン−４をコードする配列を含む）、Ａ
ＴＣＣ寄託番号５９３９４および５９３９５（インターロイキン−５をコードす
る配列を含む）、ならびにＡＴＣＣ寄託番号６７１５３（インターロイキン−６
をコードする配列を含む）が含まれる。
【００６７】 サイトカイン遺伝子もしくは免疫調節遺伝子を含むプラスミドは、適切な制限
酵素で消化され得、そして目的の特定の遺伝子を含むＤＮＡフラグメントは、標
準的な分子生物学技術を使用して、遺伝子移入ベクターに挿入され得る。（例え
ば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）、またはＡｕｓｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ
ｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７））。詳細には、サイトカインおよび免疫調節分子
を発現するレトロウイルスベクターは、国際公開ＷＯ ９４／０２９５１および
ＷＯ ９６／２１０１５に記載されるように構築され得る。
【００６８】 種々の公知のポリペプチドホルモンおよび成長因子もまた、これらのタンパク
質の治療的な長期発現を提供するために、本発明の遺伝子移入ベクターにおいて
使用され得る。例示的なホルモン、成長因子、および本発明のベクターによる長
期発現に有用な他のタンパク質は、例えば、「Ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ−Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ」と題する欧州公開第０４３７４７８Ｂ１号に
記載されている。種々のホルモンをコードする核酸配列が使用され得る。これに
は、ヒト成長ホルモン、インスリン、カルシトニン、プロラクチン、卵胞刺激ホ
ルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（Ｈ
ＣＧ）、および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）をコードする核酸配列が含まれる
。種々の異なる形態のＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２成長因子ポリペプチドもまた
、当該分野において周知であり、そしてインビボにおける長期の発現のために遺
伝子移入ベクターに組み込まれ得る。例えば、１９９３年９月１９日に特許許可
のために発行された、「Ｈｙｂｒｉｄ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ Ｍ
ａｔｕｒｅ Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ」と題
する欧州特許第０１２３２２８Ｂ１号を参照。さらなる例として、異なる形態の
線維芽細胞増殖因子の長期のインビボ発現もまた、本発明の方法によって達成さ
れ得る。異なる線維芽細胞増殖因子の記載については、例えば、米国特許第５，
４６４，７７４号、第５，１５５，２１４号、および第４，９９４，５５９号を
参照。
【００６９】 特定の実施態様において、本発明の遺伝子移入ベクターは、自殺遺伝子、およ
び免疫アクセサリー分子を提供するために発現され得る付属のヌクレオチド配列
を含み得る。本明細書において使用される場合、句「免疫アクセサリー分子」と
は、免疫応答（細胞媒介性もしくは体液性のいずれか）の認識、提示、もしくは
活性化を増加または減少させ得る分子をいう。免疫アクセサリー分子の代表例は
、上に記載されている。
【００７０】 本明細書に記載される遺伝子移入ベクターが、１より多い異種配列の発現を指
向する場合、このような複数の配列は、単一プロモーター、または好ましくはさ
らなる二次プロモーター（例えば、内部リボソーム結合部位もしくは「ＩＲＢＳ
」）のいずれかにより制御され得る。
【００７１】 上記分子をコードするポリヌクレオチド配列は、組換え法を使用して、例えば
、その遺伝子を発現する細胞由来のｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーをスクリ
ーニングすることによって、またはその遺伝子を含むことが既知のベクターから
同遺伝子を誘導することによって入手され得る。例えば、改変細胞産物をコード
する配列を含むプラスミドは、ＡＴＣＣのような寄託機関から、またはＡｄｖａ
ｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍａｒｙｌａ
ｎｄ）のような商業的供給源から入手され得る。目的のヌクレオチド配列を含む
プラスミドは、適切な制限酵素で消化され得、そしてそのヌクレオチド配列を含
むＤＮＡフラグメントは、標準的な分子生物学技術を使用して、遺伝子移入ベク
ターに挿入され得る。
【００７２】 あるいは、本発明での使用のためのｃＤＮＡ配列は、その配列を発現するかま
たは含む細胞から、標準的な技術（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡのフェ
ノール抽出およびＰＣＲ）を使用して入手され得る。ＤＮＡを入手および単離す
るために使用される技術の記載については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出
）を参照。簡潔には、目的の遺伝子を発現する細胞に由来するｍＲＮＡは、オリ
ゴ−ｄＴまたはランダムプライマーを使用して逆転写酵素を用いて逆転写され得
る。次いで、一本鎖ｃＤＮＡは、所望の配列の両側の配列と相補的なオリゴヌク
レオチドプライマーを使用するＰＣＲにより増幅され得る（米国特許第４，６８
３，２０２号、第４，６８３，１９５号、および第４，８００，１５９号を参照
。ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｅｒｌｉｃｈ
編、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）もまた参照）。詳細には、二本
鎖ＤＮＡは、熱安定性Ｔａｑポリメラーゼ、配列特異的ＤＮＡプライマー、なら
びにＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＴＴＰの存在下での加温により変性される
。合成が終了したとき、二本鎖ＤＮＡが産生される。このサイクルは、何回も繰
り返され得、所望のＤＮＡの階乗増幅を生じる。
【００７３】 目的のヌクレオチド配列また、クローニングされるよりもむしろ、ＤＮＡ合成
機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ３９２ Ｄ
ＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、ＡＢＩ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａ）から入手可能）を使用して、合成的に産生され得る。ヌクレオチド
配列は、所望の発現産物に適切なコドンで設計され得る。一般に、意図される、
配列を発現させる宿主に好ましいコドンを選択する。完全な配列は、標準的な方
法によって調製される重複オリゴヌクレオチドから組み立てられ、そして完全な
コード配列に組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ ２
９２：７５６；Ｎａｍｂａｉｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９
９；Ｊａｙら（１９８４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：６３１１を参照。
【００７４】 次に、１またはそれ以上のコード配列が、所望のコード配列に作動可能に連結
しかつ標的宿主種におけるインビボ発現を可能にする制御配列を含むベクターに
挿入され得る。例えば、哺乳動物細胞発現のために代表的なプロモーターには、
とりわけ、ＳＶ４０初期プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーターのようなＣＭ
Ｖプロモーター、マウス乳がんウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主
要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、および単純ヘルペスウイルスプロモータ
ーが挙げられる。他の非ウイルスプロモーター（例えば、マウスメタロチオネイ
ン遺伝子由来のプロモーター）もまた、哺乳動物発現のための使用を見出される
。代表的には、転写終結およびポリアデニル化配列もまた存在し、翻訳停止コド
ンの３’側に位置する。好ましくは、翻訳開始の最適化のための配列（コード配
列の５’側に位置する）もまた存在する。転写ターミネーター／ポリアデニル化
シグナルの例には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるＳＶ４０由来のも
の、ならびにウシ成長ホルモンターミネーター配列が挙げられる。イントロン（
スプライスドナーおよびアクセプター部位を含む）もまた、本発明での使用のた
めに構築物中に設計され得る。
【００７５】 エンハンサーエレメントもまた、ベクター構築物の発現レベルを増大させるた
めに、本明細書において使用され得る。例としては、Ｄｉｊｋｅｍａら（１９８
５）ＥＭＢＯ Ｊ．４：７６１に記載されるＳＶ４０初期遺伝子エンハンサー、
Ｇｏｒｍａｎら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
７９：６７７７に記載されるラウス肉腫ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）由来のエ
ンハンサー／プロモーター、およびＢｏｓｈａｒｔら（１９８５）Ｃｅｌｌ ４
１：５２１に記載されるヒトＣＭＶ由来のエレメント（例えば、ＣＭＶイントロ
ンＡ配列に含まれるエレメント）が挙げられる。
【００７６】 哺乳動物宿主細胞用の遺伝子移入ベクターとして使用するために、多くのウイ
ルスベースの系が開発されてきた。例えば、レトロウイルスは遺伝子送達系に便
利なプラットフォームを提供する。選択された遺伝子は、当該分野において公知
の技術を使用して、ベクターに挿入され得、そしてレトロウイルス粒子にパッケ
ージされ得る。次いで、組換えウイルスが単離され得、そしてインビボまたはエ
キソビボのいずれかで被験体の細胞に送達され得る。多くのレトロウイルス系が
記載されており、本発明での使用を見出される。これには、例えば、米国特許第
５，２１９，７４０号；Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｓ ７：９８０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ １：５；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８
０：８４９；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ９０：８０３３；Ｂｏｒｉｓ−Ｌａｗｒｉｅら（１９９３）Ｃｕｒ．
Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２；ＧＢ ２２００６５１；
ＥＰ ０４１５７３１；ＥＰ ０３４５２４２；ＷＯ ８９／０２４６８；ＷＯ
８９／０５３４９；ＷＯ ８９／０９２７１；ＷＯ ９０／０２８０６；ＷＯ
９０／０７９３６；ＷＯ ９０／０７９３６；ＷＯ ９４／０３６２２；ＷＯ
９３／２５６９８；ＷＯ ９３／２５２３４；ＷＯ ９３／１１２３０；ＷＯ
９３／１０２１８；ＷＯ ９１／０２８０５；Ｕ．Ｓ．５，２１９，７４０；
Ｕ．Ｓ．４，４０５，７１２；Ｕ．Ｓ．４，８６１，７１９；Ｕ．Ｓ．４，９８
０，２８９；およびＵ．Ｓ．４，７７７，１２７；米国特許出願第０７／８００
，９２１；およびＶｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：３８６０
−３８６４；Ｖｉｌｅ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：９６２−９６
７；Ｒａｍ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５３：８３−８８；Ｔａｋａｍ
ｉｙａ（１９９２）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ ３３：４９３−５０３；Ｂ
ａｂａ（１９９３）Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ ７９：７２９−７３５；Ｍａｎｎ
（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３：１５３；Ｃａｎｅ（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔ
ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：６３４９；およびＭｉｌｌｅｒ（１９９
０）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １に記載されるものが含まれる。
レトロウイルス遺伝子移入ベクターが、本発明の実施に好ましい。
【００７７】 本発明の実施に使用されるレトロウイルス遺伝子移入ベクターは、種々のレト
ロウイルス（例えば、Ｂ型、Ｃ型、およびＤ型レトロウイルス、ならびにスプマ
ウイルスおよびレンチウイルス（例えば、ＲＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ
，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１
９８５を参照）を含む）から容易に構築され得る。簡潔には、レトロウイルスは
、電子顕微鏡検査下で観察される形態に従って分類されてきた。「Ｂ」型レトロ
ウイルスは偏心コアを有するようであり、他方、「Ｃ」型レトロウイルスは中心
コアを有する。「Ｄ」型レトロウイルスは、Ｂ型レトロウイルスとＣ型レトロウ
イルスの中間の形態を有する。適切なレトロウイルスの代表例には、例えば、Ｒ
ＮＡ Ｔｕｍｏｒ Ｖｉｒｕｓｅｓ（２〜７頁）に記載のもの、ならびに種々の
異種栄養性レトロウイルス（例えば、ＮＺＢ−Ｘ１、ＮＺＢ−Ｘ２、およびＮＺ
Ｂ９−１（Ｏ’Ｎｅｉｌｌら（１９８５）Ｊ．Ｖｉｒ．５３：１００−１０６）
）および多栄養性（ｐｏｌｙｔｒｏｐｉｃ）レトロウイルス（例えば、ＭＣＦお
よびＭＣＦ−ＭＬＶ（Ｋｅｌｌｙら（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒ．４５（１）：２９
１−２９８を参照））が含まれる。このようなレトロウイルスは、寄託機関また
は収集機関（例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（「ＡＴＣＣ」
；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ））から容易に入手され得るか、また
は通常に利用可能な技術を使用して、公知の供給源から単離され得る。
【００７８】 本発明のレトロウイルス遺伝子移入ベクターの調製または構築に特に好ましい
レトロウイルスには、ニワトリ白血病ウイルス、ウシ白血病ウイルス、マウス白
血病ウイルス、ミンク細胞フォーカス形成ウイルス、マウス肉腫ウイルス、テナ
ガザル白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、細網内皮症ウイルス、およびラウ
ス肉腫ウイルスが含まれる。特に好ましいマウス白血病ウイルスには、４０７０
Ａおよび１５０４Ａ（Ｈａｒｔｌｅｙら（１９７６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９：１
９−２５）、アーベルソン（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９９）、フレンド（ＡＴＣＣ
番号ＶＲ−２４５）、グラフィ、グロス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−５９０）、キルス
テン、ハーベイ肉腫ウイルスおよびラウシャー（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−９９８）、
およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１９０）が含まれる
。特に好ましいラウス肉腫ウイルスとしては、ブラチスラバ（Ｂｒａｔｉｓｌａ
ｖａ）、ブライアン高力価（例えば、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−３３４、ＶＲ−６５７
、ＶＲ−７２６、ＶＲ−６５９、およびＶＲ−７２８）、ブライアン標準、カー
ル−ジルバー（Ｃａｒｒ−Ｚｉｌｂｅｒ）、エンゲルブレス−ホルム（Ｅｎｇｅ
ｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ）、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）、プラグ（Ｐｒａｇｕｅ）
（例えば、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−７７２および４５０３３）、およびシュミット−
ルピン（Ｓｃｈｍｉｄｔ−Ｒｕｐｐｉｎ）（例えば、ＡＴＣＣ番号ＶＲ−７２４
、ＶＲ−７２５、ＶＲ−３５４）が挙げられる。
【００７９】 上記のレトロウイルスのいずれもが、本明細書で提供されている開示および標
準の組換え技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、Ｋｕｎｋｌｅ（１９８５
）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：４８８）で与えられ
るレトロウイルス遺伝子移入ベクターを組み立てるまたは構築するために、容易
に利用され得る。本発明の特定の実施態様内では、レトロウイルス遺伝子移入ベ
クターの一部が、異なるレトロウイルスに由来し得る。例えば、レトロウイルス
ベクターＬＴＲはマウス肉腫ウイルス、ｔＲＮＡ結合部位はラウス肉腫ウイルス
、パッケージングシグナルはマウス白血病ウイルス、および第二鎖合成の起点は
鳥類白血病ウイルスに由来し得る。
【００８０】 レトロウイルスベクター構築物もまた提供され得、これは、５’ＬＴＲ、ｔＲ
ＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、一つ以上のヘテロ異種配列、第二鎖Ｄ
ＮＡ合成の起点および３’ＬＴＲを含み、ここでベクター構築物は、ｇａｇ／ｐ
ｏｌまたはｅｎｖコード配列を欠く。簡単には、長末端反復（「ＬＴＲ」）は、
Ｕ５、ＲおよびＲ３と称される三つの要素に細分される。これらの要素は、例え
ば、Ｕ３内に位置するプロモーターおよびエンハンサー要素を含む、レトロウイ
ルスの生物学的活性の原因となる様々なシグナルを含む。ＬＴＲは、ゲノムのい
ずれかの末端に正確な重複があるために、プロウイルス中で容易に同定され得る
。本明細書で用いられるように、５’ＬＴＲは、５’プロモーター要素と、ベク
ターのＤＮＡ形態の逆転写および組込みを可能にするために十分なＬＴＲ配列と
を含むと理解される。３’ＬＴＲは、ポリアデニル化シグナルと、ベクターのＤ
ＮＡ形態の逆転写および組込みを可能にするために十分なＬＴＲ配列とを含む。
【００８１】 ｔＲＮＡ結合部位および第二鎖ＤＮＡ合成の起点もまた、レトロウイルスが生
物学的に活性であるために重要であり、当業者によって容易に同定され得る。例
えば、レトロウイルスｔＲＮＡは、ワトソン−クリック塩基対形成によってｔＲ
ＮＡ結合部位に結合し、レトロウイルスゲノムと共にウイルス粒子中に運ばれる
。次いで、ｔＲＮＡは逆転写酵素によるＤＮＡ合成のためにプライマーとして用
いられる。ｔＲＮＡ結合部位は、５’ＬＴＲのすぐ下流にあるその位置に基づい
て容易に同定され得る。同様に、第二鎖ＤＮＡ合成の起点は、レトロウイルスの
第二鎖ＤＮＡ合成にとって重要である。ポリプリン路（ｐｏｌｙ−ｐｕｒｉｎｅ
ｔｒａｃｔ）とも称されるこの領域は、３’ＬＴＲのすぐ上流に位置する。
【００８２】 ５’および３’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、ならびに第二鎖ＤＮＡ合成の起点
に加えて、レトロウイルス遺伝子移入ベクターは、パッケージングシグナルおよ
び一つ以上の異種配列をさらに含み得、それらの各々が以下でさらに詳細に論じ
られる。
【００８３】 例えば、レトロウイルス遺伝子移入ベクターが提供され得、これは、ｇａｇ／
ｐｏｌおよびｅｎｖコード配列の両方を欠く。一例として、ｇａｇ／ｐｏｌまた
はｅｎｖ配列を欠くレトロウイルス遺伝子移入ベクターの構築は、延長されたパ
ッケージングシグナル（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ
）を欠くベクター構築物を調製することによって達成され得る。本明細書で用い
られるように、句「延長されたパッケージングシグナル」は、パッケージングに
必要とされる最小コア配列を超えるヌクレオチドの配列を指す。この配列は、パ
ッケージングが増強されることによってウイルス力価を増加させることを可能に
する。一例として、マウス白血病ウイルスＭｏＭＬＶについて、最小コアパッケ
ージングシグナルは、５’ＬＴＲの末端から始まりＰｓｔＩ部位を通る配列によ
ってコードされる。ＭｏＭＬＶの延長されたパッケージングシグナルは、ヌクレ
オチド５６７を超え、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子（ヌクレオチド６２１）の開始点を
通り、ヌクレオチド１５６０を超える配列を含む。従って、延長されたパッケー
ジングシグナルを欠くレトロウイルス遺伝子移入ベクターは、ヌクレオチド５６
７の前にパッケージングシグナルを欠失または切断することによって、ＭｏＭＬ
Ｖから構築され得る。
【００８４】 他のレトロウイルス遺伝子移入ベクターが提供され得、ここではレトロウイル
スｇａｇ／ｐｏｌ配列内に延びる、またはこの配列と重複するパッケージングシ
グナルが欠失または切断される。例えば、ＭｏＭＬＶの代表的な場合において、
パッケージングシグナルは、ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の開始点の前に欠失または切
断される。
【００８５】 ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の開始を超えて延びるパッケージングシグナルを含むレ
トロウイルス遺伝子移入ベクターもまた提供され得る。このようなレトロウイル
スベクター構築物が利用されるときには、ｇａｇ／ｐｏｌ発現カセット中のｇａ
ｇ／ｐｏｌ遺伝子の５’末端が、ｇａｇについて縮重されたコドンを含むように
改変された組換えウイルス粒子の生成のために、パッケージング細胞株を用いる
ことが好ましい。
【００８６】 さらに別のレトロウイルスベクター構築物が提供され得、これは、５’ＬＴＲ
、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成の起点、およ
び３’ＬＴＲを含み、ここでベクター構築物は、５’ＬＴＲの上流のレトロウイ
ルス核酸配列を含まない。これらのベクター構築物は、５’ＬＴＲの上流のｅｎ
ｖコード配列を含まない。
【００８７】 ５’ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、パッケージングシグナル、第二鎖ＤＮＡ合成
の起点、および３’ＬＴＲを含むレトロウイルス遺伝子移入ベクターもまた提供
され得、ここでベクターは、３’ＬＴＲの下流のレトロウイルスパッケージング
シグナル配列を含まない。本明細書で用いられるように、用語「パッケージング
シグナル配列」は、ＲＮＡゲノムのパッケージングを可能にするために十分な配
列を意味すると理解される。
【００８８】 上記のレトロウイルス遺伝子移入ベクター構築物と共に用いるために適したパ
ッケージング細胞株は容易に調製され得（１９９４年５月９日出願の米国特許出
願第０８／２４０，０３０号を参照のこと。また１９９１年１１月２７日出願の
米国特許出願第０７／８００，９２１号も参照のこと）、組換えベクター粒子の
生成のためにプロデューサー細胞株（ベクター細胞株または「ＶＣＬ」とも称さ
れる）を作るために用いられ得る。
【００８９】 レトロウイルスに基づくもの以外の多数のウイルスベクター系が当該分野にお
いて公知であり、本発明の実施において用いられ得る。ウイルスベクター系は治
療上有用な改変細胞を提供するために用いられるので、ウイルスベクター系はこ
れらを非溶解性にするために好ましくは遺伝子的に改変される。
【００９０】 多数のアデノウイルスベクター（Ａｄベクター）が記載され、本発明と共に用
いられ得る。例えば、Ｈａｊ−Ａｈｍａｄら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７
：２６７、Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１、Ｍｉｔｔ
ｅｒｅｄｅｒら（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７１
７、Ｓｅｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３、Ｂａｒｒら（１９
９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５１、Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｋ．Ｌ．（１９
８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６、およびＲｉｃｈら（１９９３
）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：４６１を参照のこと。
【００９１】 原型組換えアデノウイルスベクターは、概して、初期の領域１（Ｅｌａ／Ｅｌ
ｂ、またはＥ１）領域中で欠失され、これらのベクターを複製欠損にする。目的
のヌクレオチド配列を欠失された領域に挿入することに続いて、組換えＥ１欠失
アデノウイルスベクターの伝播が２９３細胞中で達成され、相補的なヒト胎児腎
臓細胞株がＡｄ Ｅ１領域と共に安定して形質転換され、イントランスでＡｄ
Ｅ１領域遺伝子産物を提供する。この様式で生成された組換えＡｄベクターは、
１０11から１０13粒子／ｍｌの力価で調製物を生成し得る（Ｂｅｒｋｎｅｒ（１
９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６−６２９中で概説されている
）。しかし、この原型Ａｄベクター系にはいくつかの欠点があり、それらは（１
）異種遺伝子材料がおよそ４．５から５．０ｋｂまたはそれ未満に大きさが制限
されること、（２）Ｅ１欠失Ａｄベクターの複製能力が部分的であること（Ｒｉ
ｃｈ（１９９３）Ｈｕｍ．Ｇｅｎ．Ｔｈｅｒ．４：４６１−４７６）を含む。こ
の後者の点は、一部はヒト細胞中で発現される「Ｅ１様活性」を相補するために
生じ、その結果として、高度に免疫抗原性の「後期」すなわち構造的遺伝子産物
（例えば、ペントンタンパク質）を含む、これらのベクター中に存在する他のウ
イルス遺伝子産物の発現が生じる。Ｅ１欠失ベクターによって発現されたＡｄ特
異的タンパク質に対するレシピエントの免疫学的応答の結果、異種遺伝子、すな
わちトランスジーンの発現は一過性であり、遺伝子移入の部位での病理学発生と
関連付けられ得る。
【００９２】 従って、第二世代Ａｄベクターは、ウイルス特異的遺伝子産物を複製および発
現するベクターの能力をさらに「失わせる」こと、および異種遺伝子材料の能力
を増大させようとすることが求められてきた。このようなベクターは三つのタイ
プである。すなわち、（１）欠失されたＥ１およびＥ３遺伝子（Ｂｅｔｔ（１９
９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８０２−８８
０６）（２）欠失されたＥ１およびＥ４遺伝子（Ｗａｎｇ（１９９５）Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．２：７７５−７８３）および（３）全てのＡｄウイルス遺伝子の欠
失、すなわち「ガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）」（Ｆｉｓｈｅｒ（１９９６）Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ ２１７：１１−２２、Ｈａｒｄｙ（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．７１：１８４２−１８４９、およびＫｏｃｈａｎｅｋ（１９９６）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：５７３１−５７３６）である。こ
れらの第二世代組換えアデノウイルスベクターを接種された動物中でのトランス
ジーン発現の持続時間は、レシピエントのＡｄベクターに対する免疫学的応答の
緩和の結果として、劇的に増大した。
【００９３】 予期されるように、第二世代Ａｄベクター中のウイルス特異的遺伝子の欠失が
増大することによって、異種遺伝子材料について能力を増大させる結果ともなり
、従って、ヒト遺伝子移入に適用するためのこの系の有用性が拡大される。異種
遺伝子材料についてのこの能力は、Ｅ１／Ｅ３およびＥ１／Ｅ４ベクター中では
およそ８ｋｂであり、「ガットレス」Ａｄベクターについては３０ｋｂよりも大
きく、このことは、関連した遺伝子発現コントロール領域を含む遺伝子全体の挿
入を可能にする。
【００９４】 Ｅ１／Ｅ３、Ｅ１／Ｅ４および「ガットレス」ベクターを含む組換えＡｄベク
ターの生成は、当業者に周知の方法に従って達成され得る。例えば、（１）目的
のヌクレオチド配列がプラスミドｐＢＨＧ１１に挿入され得（Ｂｅｔｔ（１９９
４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：８８０２−８８０
６）、それにより２９３細胞のトランスフェクションおよびそれに続く細胞内同
種組換えの後に、組換えＥ１／Ｅ３欠失Ａｄベクターが生成される。（２）目的
のヌクレオチド配列が、様々なＥ１欠失ＡｄベクターのいずれかのＥ１領域にま
ず置換され、ＣｌａＩ消化したＨ５ｄｌ１０１４と同時トランスフェクトされ得
、２９３Ｅ４細胞のトランスフェクション（Ｗａｎｇ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｔ
ｈｅｒ．２：７７５−７８３）および、それに続く細胞内同種組換えの後に組換
えＥ１／Ｅ４欠失Ａｄベクターが生成される。および（３）目的のヌクレオチド
配列が、例えば、バクテリオファージλＤＮＡ由来の適切な量の「スタッファー
（ｓｔｕｆｆｅｒ）」配列と共にΔｒＡｄプラスミドにまず挿入され得（Ｆｉｓ
ｈｅｒ（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２１７：１１−２２）、２９３細胞上に
トランスフェクトされ、Ｈ５．ＣＢＡＬＰヘルパーウイルスで感染された組換え
「ガットレス」アデノウイルスベクターゲノムの有効なパッケージングを可能に
する（Ｙａｎｇ（１９９５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６９：２００４−２０１５）。
組換え「ガットレス」アデノウイルスベクター粒子のヘルパーウイルスからの精
製は、例えば、ヘルパーウイルスの密度よりも低い浮遊密度の結果として、セシ
ウム勾配上の遠心分離によって達成され得る。
【００９５】 さらに、様々なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系は、遺伝子送達のた
めに開発され、本明細書において用途を見出す。ＡＶＶベクターは、当該分野に
おいて周知の技術を用いて容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３
，４１４号および第５，１３９，９４１号、国際特許公開ＷＯ第９２／０１０７
０号（１９９２年１月２３日公開）およびＷＯ第９３／０３７６９号（１９９３
年３月４日公開）、共有に係る米国仮特許出願第６０／０２５６４９号、Ｌｅｂ
ｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８、
Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９０（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｃａｒｔｅｒ、Ｂ．
Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ ３：５３３、Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：
９７、Ｋｏｔｉｎ、Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐ
ｙ ５：７９３、Ｓｈｅｌｌｉｎｇら（１９９４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
１：１６５、およびＺｈｏｕら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８
６７を参照のこと。
【００９６】 目的のヌクレオチド配列をコードする核酸分子を送達するために用途を見出す
さらなるウイルスベクターは、ワクシニアウイルスおよび鶏類ウイルスを含む、
ウイルスのポックスファミリー由来のウイルスベクターを含む。一例として、遺
伝子を発現するワクシニアウイルス組換えは、以下のように構築され得る。特定
の遺伝子をコードするＤＮＡが、ワクシニアプロモーターおよび配列コードチミ
ジンキナーゼ（ＴＫ）などのフランキングワクシニアＤＮＡ配列に隣接するよう
に、適切なベクターにまず挿入される。次いで、このベクターは、ワクシニアで
同時に感染された細胞をトランスフェクトするために用いられる。同種組換えは
、ワクシニアプロモーターに加えて遺伝子をウイルスゲノムに挿入するために役
立つ。結果として生じるＴＫ組換え体は、５−ブロモデオキシウリジンが存在す
る状態で細胞を培養し、それに対して耐性のあるウイルスプラークを取ることに
よって選択され得る。
【００９７】 あるいは、鶏痘およびカナリア痘ウイルスなどの鳥類痘ウイルス（ａｖｉｐｏ
ｘｖｉｒｕｓｅｓ）も遺伝子を送達するために用いられ得る。哺乳類病原体から
免疫抗原を発現する組換え鳥類痘ウイルスは、非鳥類腫に投与した場合、保護免
疫性を付与ことが公知である。鳥類痘属のメンバーは、感染しやすい鳥類種中で
生産可能に複製し得るのみであり、従って、哺乳類細胞中では感染しないので、
鳥類痘ベクターの使用はヒトおよび他の哺乳類種において特に望ましい。ワクシ
ニアウイルスの生成に関して上記されるように、組換え鳥類痘ウイルスを生成す
るための方法は当該分野において公知であり、遺伝子組換えを用いる。例えばＷ
Ｏ第９１／１２８８２号、ＷＯ第８９／０３４２９号、およびＷＯ第９２／０３
５４５号を参照のこと。
【００９８】 Ｍｉｃｈａｅｌら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：６８６６お
よびＷａｇｎｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８９：６０９９に記載されているアデノウイルスキメラベクターなどの分子
結合体ベクターも、遺伝子送達のために用いられ得る。
【００９９】 シンドビスウイルスおよびセムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ）ウ
イルス由来のベクターなどであるが、これらに限定されないアルファウイルス属
のメンバーも、目的のヌクレオチド配列を送達するための遺伝子送達ベクターと
しての使用を見出す。本方法の実施のために有用なシンドビスウイルス由来ベク
ターの記載について、例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．７０：５０８、および国際公開公報ＷＯ第９５／０７９９５号およびＷＯ第９
６／１７０７２号を参照のこと。
【０１００】 哺乳類宿主細胞のための遺伝子移入ベクターとして用いるために、多数の非ウ
イルスベース遺伝子送達系もまた開発されており、例えば、核酸発現ベクター、
死滅（ｋｉｌｌｅｄ）アデノウイルスのみに連結されるかまたは連結されないポ
リカチオン凝縮ＤＮＡ（例えば、１９９４年１２月３０日に出願の米国特許出願
第０８／３６６，７８７号およびＣｕｒｉｅｌ（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４を参照のこと）、リガンド連結ＤＮＡ（Ｗｕ（１
９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７を参照のこ
と）、真核細胞送達ヒビクル細胞（１９９４年５月９日出願の米国特許出願第０
８／２４０，０３０号、および米国特許出願第０８／４０４，７９６号を参照の
こと）、光重合ヒドロゲル材料の積層（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、携帯型遺伝子
移入粒子ガン（例えば、米国特許第５，１４９，６５５号を参照のこと）、イオ
ン化放射線（例えば、米国特許第５，２０６，１５２号および国際特許公開ＷＯ
第９２／１１０３３号に記載されるような）、核酸電荷中性化（ｎｕｃｌｅｉｃ
ｃｈａｒｇｅ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）または細胞膜との融合を含む
。さらなるアプローチが、Ｐｈｉｌｉｐ（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ
ｌ．１４：２４１１−２４１８、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ（１９９４）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１５８１−１５８５に記載さ
れている。
【０１０１】 粒子媒介遺伝子移入は非ウイルスベース系と共に用いられ得、例えば、米国特
許仮出願第６０／０２３，８６７号を参照のこと。簡潔には、目的の配列は、高
レベルの発現に適したコントロール配列を含む従来の遺伝子移入ベクター中に挿
入され得、次いで、アシアロオロソムコイド（ａｓｉａｌｏｏｒｏｓｏｍｕｃｏ
ｉｄ）（例えば、Ｗｕら（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２
９−４４３２に記載されるような）、インシュリン（例えば、Ｈｕｃｋｅｄ（１
９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４０：２５３−２６３に記載さ
れるような）、ガラクトース（例えば、Ｐｌａｎｋ（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊ
ｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：５３３−５３９に記載されるような）、乳糖、また
はトランスフェリンなどの細胞標的化リガンドに連結されている、ポリリシン、
プロタミンおよびアルブミンのような高分子ＤＮＡ結合カチオンなどの合成遺伝
子移入分子とともにインキュベートされ得る。
【０１０２】 裸のＤＮＡ送達技術も用いられ得る。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＷＯ第
９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。
取り込み効率は、生分解性ラテックスビーズを用いて改善され得る。ＤＮＡ被覆
ラテックスビーズは、ビーズによるエンドサイトーシス開始の後に、細胞内に効
率的に輸送される。この方法は、疎水性を高めるためにビーズを処理し、それに
よってエンドソームの破壊および細胞質中へのＤＮＡの放出を促進にすることに
より、さらに改善され得る。
【０１０３】 遺伝子移入ベクターのためのビヒクルとして作用するリポソームは、米国特許
第５，４２２，１２０号、国際特許公開ＷＯ第９５／１３７９６号、ＷＯ第９４
／２３６９７号、およびＷＯ第９１／１４４４４５号、ならびに欧州特許公開第
５２４，９６８号に記載される。米国特許仮出願第６０／０２３，８６７号に記
載されるように、核酸配列が、高レベル発現に適するコントロール配列を有する
ベクター中に挿入され得、次いで、アシアロオロソムコイド、インシュリン、ガ
ラクトース、乳糖、またはトランスフェリンなどの細胞標的化リガンドに連結さ
れている、ポリリシン、プロタミンおよびアルブミンのような高分子ＤＮＡ結合
カチオンなどの合成遺伝子移入分子とともにインキュベートされ得る。他の送達
システムは、様々な組織特異的なまたは偏在的に活性のプロモーターの制御下に
ある遺伝子を含むＤＮＡをカプセル化するためにリポソームを用いることを含む
。本明細書における使用に適するさらなる非ウイルス送達技術は、Ｗｏｆｆｅｎ
ｄｉｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：
１１５８１−１１５８５に記載されているアプローチなどの機械的送達システム
を含む。さらに、コード配列は、光重合ヒドロゲル材料の積層を介して送達され
得る。用いられ得る遺伝子送達のための他の従来の方法は、例えば、米国特許第
５，１４９，６５５号に記載されているような携帯型遺伝子移入粒子ガンの使用
、および米国特許第５，２０６，１５２号および国際特許公開ＷＯ第９２／１１
０３３号に記載されているような転移された遺伝子を活性化するためのイオン化
放射線を含む。
【０１０４】 例示的なリポソームおよびポリカチオン性遺伝子送達ビヒクルは、以下に記載
されるものである：米国特許第５，４２２，１２０号および同第４，７６２，９
１５号、国際公開第ＷＯ９５／１３７９６号、同第ＷＯ９４／２３６９７号およ
び同第ＷＯ９１／１４４５号、欧州特許公開第５２４，９６８号、ならびにＳｔ
ａｒｒｉｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２３６−２４０ページ（１９７
５）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｓｈｏｋａｉ（
１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｃｔ． ６００：１；Ｂａｙ
ｅｒ（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｃｔ．５５０：４６４
；Ｒｉｖｅｔ（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ． １４９：１１９；Ｗａ
ｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：７８
５１；Ｐｌａｎｔ（１９８９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７６：４２０。
【０１０５】 一旦生成されると、上記の遺伝子移入ベクターは、本明細書中に記載されるよ
うに単離されたＴ細胞の集団を遺伝的に改変するために使用される。レトロウイ
ルス導入ベクターが使用される場合、培養されたＴ細胞の集団は、この細胞を刺
激することによって、トランスフェクションを最も受容するＳ期の部分に最初に
活性化される。Ｓ期の最初の４分の１〜２分の１は、レトロウイルス形質導入に
最適である。細胞のウイルスベクター形質導入に対する受容性を増強する他の方
法は、感染多重度を変化させること、ホスフェートのようなイオンを枯渇させる
こと、硫酸プロタミンのようなポリカチオンを添加すること、接触時間、温度、
ｐＨを調整すること、ならびに細胞およびウイルスを共に遠心分離することを含
む。
【０１０６】 本発明の実施において、Ｔリンパ球は、好ましくは、モノクローナル抗体ＯＫ
Ｔ−３のようなＣＤ３結合因子と接触させることによって活性化される。ＣＤ３
結合因子は、細胞の表面上のＣＤ３分子に結合するリガンドである。このリガン
ドは、ＯＫＴ−３のような抗体であり得、２つ以上のＣＤ３分子を架橋し得る。
このような架橋は、Ｔリンパ球のようなＣＤ３保有細胞の増殖および活性化の原
因であり得る。ＣＤ３結合因子によるＴリンパ球の活性化は、結合因子濃度、接
触時間、細胞の数、接触温度、結合因子の親和性、結合活性、および細胞を活性
化する効力のような特定の要因を調整することによって増加する。
【０１０７】 このＴ細胞はまた、選択される前に少なくとも１つの型の増殖因子を含む培地
中で維持され得る。種々の増殖因子は当該分野で公知であり、これは特定の細胞
型の増殖を維持する。このような増殖因子の例は、ｒＩＬ−２、ＩＬ−１０、Ｉ
Ｌ−１２、およびＩＬ−１５のようなサイトカインマイトジェンであり、これら
はリンパ球の増殖および活性化を促進する。特定の型の細胞は、ホルモン（ヒト
絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）およびヒト成長ホルモンを含む）のようなほ
かの増殖因子によって刺激される。特定の細胞集団に適切な増殖因子の選択は、
当業者によって容易に達成される。
【０１０８】 例えば、分化した前駆体および幹細胞のような白血球は、種々の増殖因子によ
って刺激される。より詳細には、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、Ｉ
Ｌ−９、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ（活性化ＴHおよび活性 化マクロファージによって産生される）は、骨髄性幹細胞を刺激し、これらは次
いで、多能性幹細胞（顆粒球−単球前駆体、好酸球前駆体、好塩基球前駆体、巨
核球、および赤血球前駆体）に分化する。分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、Ｉ
Ｌ−６、ＩＬ−１１、およびＥＰＯのような増殖因子によって調節される。
【０１０９】 次いで、多能性幹細胞は、リンパ球系幹細胞、骨髄支質細胞、Ｔ細胞前駆体、
Ｂ細胞前駆体、胸腺細胞、ＴH細胞、ＴC細胞、およびＢ細胞に分化する。この分
化は、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、
Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、およびＩＬ−５のような増殖因子によって調節される。
【０１１０】 顆粒球−単球前駆体は、単球、マクロファージ、および好中球に分化する。こ
のような分化は、増殖因子ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、およびＩＬ−８によって
調節される。好酸球前駆体は、好酸球に分化する。このプロセスは、ＧＭ−ＣＳ
ＦおよびＩＬ−５によって調節される。
【０１１１】 好塩基球前駆体の肥満細胞および好塩基球への分化は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−
４、およびＩＬ−９によって調節される。巨核球は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、お
よびＩＬ−６に応答して血小板を産生する。赤血球前駆体細胞は、ＥＰＯに応答
して赤血球に分化する。
【０１１２】 従って、ＣＤ−３結合因子による活性化の間、Ｔ細胞はまた、マイトジェン（
例えば、ＩＬ−２のようなサイトカイン）と接触され得る。特に好ましい実施態
様において、ＩＬ−２は、約５０〜１００μｇ／ｍｌの濃度で、Ｔ細胞の集団に
添加される。ＣＤ３結合因子を用いる活性化は、２〜４日間行われ得る。
【０１１３】 一旦安定に活性化されると、そのＴ細胞は、ベクターのＴ細胞へのトランスフ
ェクションを可能にする条件下で、これを適切な遺伝子移入ベクターと接触させ
ることによって、遺伝的に改変される。遺伝的改変は、Ｔ細胞集団の細胞密度が
約０．１×１０6と５×１０6との間、好ましくは、約０．５×１０6と２×１０6 との間である場合に行われる。多数の適切なウイルスおよび非ウイルスベースの
遺伝子移入ベクターが本明細書中における使用のために記載されているが、本発
明は、本明細書中で以後、ウイルスベースのベクター系を用いるＴ細胞の形質導
入によって例示される。
【０１１４】 遺伝子移入ベクターを用いる形質導入は、一般的には、約３以上の感染多重度
（ＭＯＩ）で、ウイルスベクターを用いて行われる。
【０１１５】 １つの実施態様において、このＴ細胞は、ＣＤ３結合因子を用いた活性化の後
に洗浄され、次いで約５×１０5の細胞密度で、細胞培養物に再播種される。
【０１１６】 別の特定の実施態様において、この遺伝子移入ベクターは、第１のヌクレオチ
ド配列に作動可能に連結されるプロモーターを含み、この配列は、選択された細
胞傷害性因子に対して増強された感受性を有する細胞を提供するために、形質導
入された細胞において発現され得る。好ましくは、第１のヌクレオチド配列は、
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子のような自殺遺
伝子である。この遺伝子移入ベクターはまた、選択マーカーを含み得る。多数の
適切な選択マーカーが本発明の実施において使用され得、これらは、例えば、選
択された細胞傷害性因子に対する耐性を有する形質導入された細胞を提供する。
本明細書中における使用のための１つの特定の選択マーカーは、ネオマイシンホ
スホトランスフェラーゼＩＩである。本明細書において有用な他のマーカーは、
アルカリホスファターゼ、神経成長因子、または任意の他の適切な膜会合部分の
ような、細胞表面マーカーを含む。
【０１１７】 本発明のこの実施態様において使用される遺伝子移入ベクターは、好ましくは
、レトロウイルスベクターであり、このベクターは、自殺遺伝子および適切な選
択マーカーを含む。以下の実施例において使用されるレトロウイルスは、以下の
ベクターの産物である：１）ｐＬＸＳＮ−Ｔ８４．６６ｇ、２）ｐＬＸＳＮ−Ｎ
２９ｇ、およびＴｋレトロウイルスベクター（これは、ＤＡＨＳＶＴＫ９Ａレト
ロウイルスを産生する）（Ｖｉａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。最
初の２つのベクターのマップは、それぞれ、図１および図２に提供される。Ｔｋ
レトロウイルスベクター（ＤＡＨＳＶＴＫ９Ａ）の全体のマップは、図３に示さ
れる。図４は、ＲＶＶ ＨＳＶ−ＴＫプロベクターの構造を図示する。
【０１１８】 ｐＬＸＳＮ−Ｔ８４．６６ｇおよびｐＬＸＳＮ−Ｎ２９ｇベクターは、ＳＶ４
０プロモーターの制御下でｎｅｏ遺伝子、ならびにレトロウイルス５’ＬＴＲお
よびΨパッケージング配列を有する。レトロウイルスＴｋベクター（ＤＡＨＳＶ
ＴＫ９Ａ）は、モロニー５’ＬＴＲ初期プロモーターの制御下で転写されるＨＳ
Ｖ−ｔｋ遺伝子、およびＳＶ４０プロモーターの制御下で転写されるｎｅｏ遺伝
子を有する。ＲＶＶ ＨＳＶ−ＴＫプロベクターもまた、モロニー５’ＬＴＲ初
期プロモーターの制御下で転写されるＨＳＶ−ｔｋ遺伝子、およびＳＶ４０プロ
モーターの制御下で転写されるｎｅｏ遺伝子を有する。
【０１１９】 従って、１つの実施態様において、自殺遺伝子（例えば、ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子
）を含むレトロウイルス遺伝子送達ベクターは、上記のように調製され、そして
上記のようなＴ細胞の集団を形質導入するために使用される。一般的なＴ細胞形
質導入方法論は、共有に係る米国特許出願第０８／４２５，１８０号（発明の名
称「Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｅｘ ｖｉｖｏ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉ
ｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｈｉｇｈ Ｔｉｔｅｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎ
ｔ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」）に記載される。Ｔ細
胞の増殖および形質導入の他の方法が使用され得、そして当業者には公知である
（例えば、Ｃｈｕｃｋら（１９９６）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ７：７４
３；Ｈｅｓｌｏｐら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ２：５５１；Ｒｉｄ
ｄｅｌｌら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：２１６）。Ｔ細
胞はまた、ＨＩＶ患者からのＴ細胞を増殖および形質導入するために使用される
方法によって形質導入され得る（例えば、Ｖａｎｄｅｎｄｄｒｉｅｓｓｃｈｅら
（１９９５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６９：４０４５；Ｓｕｎら（１９９５）Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７２７２）。
【０１２０】 本明細書中に記載されるＴ細胞形質導入方法は、形質導入されたＴ細胞の非選
択集団において１００％以上の形質導入効率を得るために使用され得る。この形
質導入効率は、今までは、以前の方法論を用いて到達できていなかった。
【０１２１】 形質導入後、形質導入された細胞は、公知の技術を用いて非形質導入細胞細胞
から選択される。例えば、形質導入に使用される遺伝子移入ベクターが、細胞傷
害性因子に対する耐性を付与する選択マーカーを含む場合、その細胞は適切な細
胞傷害性因子と接触され得、それにより、形質導入されていない細胞から消極的
に選択消去され得る。その選択マーカーが細胞表面マーカーである場合、その細
胞は、特定の細胞表面マーカーに特異的な結合因子と接触され得、それにより形
質導入された細胞は、集団から積極的に選択消去され得る。この選択工程はまた
、蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）技術（例えば、ここでＦＡＣＳは、特定の表面
マーカーを含む集団から細胞を選択するために使用される）を含み得るか、また
はこの選択工程は、標的細胞捕獲および／もしくはバックグラウンド除去のため
の取り出し可能な支持体として磁性応答性粒子の使用を含み得る。
【０１２２】 より詳細には、形質導入された細胞の陽性選択は、ＦＡＣＳソーター（例えば
、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅTM Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ、 Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉ
ｃｋｉｎｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｓａｎ
Ｊｏｓｅ， ＣＡ）を用いて実施されて、選択細胞表面マーカーを発現する形
質転換された細胞が分離および収集され得る。形質導入の後、その細胞は、特定
の細胞表面マーカーに対する蛍光標識した抗体分子で染色される。各細胞におい
て結合した抗体の量は、この細胞を含む液滴を、細胞分析分離装置に通過させる
ことによって測定され得る。電磁荷電を、染色された細胞を含む液滴に与えるこ
とによって、形質導入された細胞は、他の細胞から分離され得る。次いで、積極
的に選択された細胞は、滅菌回収容器に採取される。これらの細胞選別手順は、
例えば、ＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅTM Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｍａｎｕａｌに、３−
１１から３−２８および１０−１〜１０−１７節に対する特定の参照とともに、
詳細に記載される。
【０１２３】 形質導入された細胞の陽性選択はまた、発現に基づく細胞の磁性分離または特
定の細胞表面マーカーを用いて実施され得る。このような分離技術において、積
極的に選択される細胞は最初に、特定の結合因子（例えば、細胞表面マーカーと
特異的に相互作用する抗体または試薬）に接触される。次いで、この細胞は、取
り出し可能な粒子（例えば、磁性応答性粒子）と接触され、この粒子は、特異的
結合因子（陽性細胞に結合した）を結合する試薬と結合される。次いで、細胞結
合因子−粒子複合体は、標識されていない細胞から、例え場、磁場を用いて、物
理的に分離され得る。磁性応答性粒子を使用する場合、標識された細胞は、磁場
を用いて容器中に保持され得るが、陰性細胞は除去される。これらおよび同様の
分離手順は、例えば、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｉｓｏｌｅ
ｘ トレーニングマニュアルに記載される。
【０１２４】 選択された形質導入された細胞におけるベクターの発現は、当業者に公知の多
数のアッセイによって評価され得る。例えば、ウエスタンブロットまたはノーザ
ン分析は、目的の挿入されたヌクレオチド配列の性質に依存して使用され得る。
一旦発現が達成され、そして形質転換されたＴ細胞が外来性因子の存在について
試験されると、これらは、末梢血流を介する患者への注入について準備が整って
いる。
【０１２５】 本発明はさらに、原発性哺乳動物細胞のエキソビボ集団の遺伝子改変のための
キットを含む。このキットは、１つ以上の容器に含まれる、少なくとも１つの選
択マーカーおよび少なくとも１つのヌクレオチド配列をコードする遺伝子移入ベ
クター、付属試薬またはハードウェア、およびこのキットの使用のための説明書
を含む。この説明書は、紙、プラスチック、磁性媒体のような任意の適切な媒体
、またはＣＤに記録され得る。
【０１２６】 容器は、環境から容器を物理的に分けるように密封して封入されて、水分、気
体、粒子、微生物、ウイルスなどの交換を防ぎ得る。このような容器は、ガラス
もしくはプラスチックアンプル、またはゴム栓付の容器であり得、ここからサン
プルは、例えば、シリンジを使用して繰り返し取り出され得る。この中の遺伝子
移入ベクターは、このようなベクターの保存のために設計された種々の媒体にお
いて、冷凍、液体、または凍結乾燥形態で保存され得る。温度、時間、および保
存媒体のような保存条件は、使用される特定のベクターに依存して変化し、そし
て当業者によって容易に決定される。この容器はまた、緩衝液（すなわち、ＰＢ
Ｓ）、塩（すなわち、多価イオン）、ならびに安定化剤および保存剤（すなわち
、グリセロールおよび抗酸化剤）のような他の試薬を含み得る。特定の遺伝子改
変方法を実施するために有用なさらなる試薬は、遺伝子移入ベクターを含むバイ
アルまたは他のバイアルに含まれ得る。
【０１２７】 付属試薬および／またはハードウェアもまた、このキットに含まれ得る。例は
、緩衝液、試薬、容器、シリンジ、ピペット、針、チューブ、生体適合性プラス
チックバッグ、密閉された液体経路、密閉された培養環境などである。方法を実
施するのに必要な全ての付属試薬およびハードウェアは、単一のキットに提供さ
れる必要はない。
【０１２８】 １つの特定の実施態様において、産生キットが提供される。この産生キットは
、遺伝的に改変された初代哺乳動物細胞のエキソビボ産生に必要な、全ての成分
、要素、およびプロセスを含みかつ／または記載する。従って、産生キットのた
めの成分は、以下を含むかまたは記載する：（１）デバイスおよびハードウェア
システム（例えば、形質導入された細胞の産生のための細胞分離および／または
プロセシング装置、例えば、Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）Ｍｏｄｅｌ ＣＳ３００
０血球分離機、Ｔｅｒｕｍｏ Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｃｏｎｎｅｃｔ Ｄｅｖｉｃｅ
（Ｂａｘｔｅｒ）など）；（２）遺伝子送達ベクター内の遺伝子（適切な遺伝子
送達ベクター内に含まれる目的の遺伝子、ここでこの遺伝子送達ベクターは、上
記のデバイスおよびハードウェアシステムとともに使用するために設定された、
滅菌密閉された単回使用用容器内に封入するために、適切に処方される）；（３
）使い捨て容器（例えば、エキソビボで改変された細胞の操作、培養、取り扱い
、および／または凍結保存のための使い捨て単回使用用容器、ここでこの容器は
、滅菌され、生体適合性であり、そして密閉された液体経路維持と共に使用する
ために適切であり、そして上記のデバイスおよびハードウェアシステムと共に使
用するために設定される）；（４）試薬および溶液（例えば、エキソビボで改変
された細胞の操作、培養、取り扱いまたは凍結保存における使用のための任意の
試薬および／または溶液、ここでこの試薬および溶液は、滅菌容器内に含まれ得
、そして上記のデバイスおよびハードウェアシステムと共に使用されるために適
合され得る）；（５）生物製剤（例えば、エキソビボで改変された細胞の操作、
培養、取り扱いまたは凍結保存における使用のための生物学的薬剤および／また
は試薬、これらは、増殖因子、マイトジェン、および抗体分子もしくは他の特異
的結合因子のような細胞選択試薬を含む）；（６）付属試薬（例えば、磁性応答
粒子もしくは選択試薬（Ｇ４１８）のような、遺伝的に改変された細胞の集団か
ら選択マーカーを発現する細胞の選択および／または富化のために使用されるも
の）；ならびに（７）説明書（例えば、本発明に従って遺伝的に改変された細胞
を産生するために必要な製造手順を記載するプロトコル）。
【０１２９】 従って、本発明の多数の実施態様が記載されている。以下の実施例において、
本発明の特定の実施態様が例示される。実施例１において、高効率の形質導入方
法が使用されて、１×１０9 Ｔｋ−ＮｅｏR形質導入Ｔ細胞が産生される。この
細胞数は、エキソビボ遺伝子治療プロトコルにおける複数回投与および全ての適
切な品質管理サンプリングの両方に収容する。現在まで、ほとんどの臨床研究は
、マルチウェル組織培養プレートを使用する開放培養系において実施されてきた
。これらの系は、臨床用材料を生成するために受容可能または実用的ではない。
なぜなら、これらは、夾雑物に感受性であり、そして商業的に有用ではないから
である。以下の例の方法において、自動化洗浄手順は、培地交換を完了するのを
可能にし、それによりウシ血清のような付属成分が、容量交換手順で培養培地か
ら除去される。
【０１３０】 複数の骨髄腫および白血病の処置のための高用量化学療法に続く同種異系骨髄
移植（ＢＭＴ）は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）および移植片対白血病（ＧＶ
Ｌ）効果に起因する治療的潜在能力を有する。しかし、同種異系ＢＭＴレシピエ
ントは、不合理な高頻度の重篤かつ致死性ＧＶＨＤを有する。この問題を解決す
るために、ＢＭＴのＴ細胞枯渇が使用されてきた。このアプローチを用いて、Ｇ
ＶＨＤの頻度は減少される；しかし植え付けの成功および患者の生存もまた、減
少した。それゆえ、同種異系ＢＭＴにおける好ましい戦略は、ＧＶＬまたは植え
付けに影響せずに、ＧＶＨＤを効果的に制御する手段を組み合わせる。
【０１３１】 次いで、１つの戦略は、ドナーＴ細胞を遺伝的に改変して、注入の前に自殺遺
伝子を発現することである。例えば、本発明の方法が使用されて、Ｔ細胞が遺伝
的に改変されて、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）自殺
遺伝子が発現され得る。従って、このような遺伝的に改変されたＴ細胞（ＨＳＶ
−ＴＫを発現する）は、ガンシクロビル（ＧＣＶ）（Ｓｙｎｔｅｘ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）（非改変の細胞に耐性である
がＨＳＫ−ＴＫを発現する細胞には有害な薬物）に対する感受性が付与される。
プロドラッグの最初の活性化は、ウイルスチミジンキナーゼによって触媒される
ので、遺伝的に改変された細胞のみが影響を受ける。次いで、これらの改変され
たドナーＴ細胞は、Ｔ細胞枯渇骨髄を注入されて、植え付けを伴うＧＶＬの有益
な効果をが提供され得る。続くＧＶＨＤは、ＧＣＶを投与することによって制御
されて、同種異系反応性Ｔ細胞が減少され得る。
【０１３２】 適合性細胞導入のための約１×１０11までの遺伝的に改変されたＴリンパ球の
生成は、いくつかのチャレンジを示す。腫瘍免疫治療のためのリンホカイン活性
化キラー細胞（ＬＡＫ）を生成するための手動の大規模産生技術は、手動の分離
、洗浄、および遠心分離を必要とする。各患者のための細胞のプロセシングは、
チューブ、フラスコ、および回転ボトルへの、約４００の流入を必要とする（Ｌ
ｅｅら（１９９４）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８：１２０３
）。本明細書中に記載される技術は、上記の手動技術の大部分を排除することに
よって、大規模産生方法におけるいくつかの利点を提供し、このことは、密閉さ
れた液体系における自動化液体分離および／または取り扱い技術の使用を最大化
する。
【０１３３】 形質導入後、Ｔ細胞は、適切な脊椎動物被験体に投与され得る。さらに、温血
動物（例えば、ヒト、マカク、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワト
リ、ラット、およびマウスのような哺乳動物または脊椎動物）が、上記の方法に
おいて例示されているが、このような方法はまた、種々のほかの動物（例えば、
魚を含む）に容易に適用可能である。
【０１３４】 （ＩＩＩ．実験） 以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の例である。この例は、例示
の目的にのみ提供され、そして如何なる方法においても本発明の範囲を制限する
ことを意図されない。
【０１３５】 使用される数（例えば、量、温度、など）に関して正確さを確実にするための
努力がなされているが、いくらかの実験誤差および偏差は、もちろん許容される
べきである。
【０１３６】 （実施例Ｉ） （Ｔ細胞の高効率形質導入） 本実施例は、効率的な細胞プロセシング手順を実証し、ここでＴ細胞を活性化
し、Ｔｋ−ＮｅｏRレトロウイルスで形質導入し、Ｇ４１８中で選択し、そして 密閉系で増殖する。この手順は、少なくとも１×１０9の形質導入された細胞を 容易に生成し、そして臨床適用に必要な規模のＴ細胞の形質導入のためのこのプ
ロトコルを使用する可能性を実証する。
【０１３７】 ＯＫＴ−３によるＴ細胞の活性化のための最良の培地を評価するために、３１
の異なる増殖培地で培養したＴ細胞の増殖速度論を以下のように決定した。簡潔
には、単核細胞を、新鮮に引き抜いた末梢血から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕ
ｅ（登録商標）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ
， ＭＯ）密度勾配分離を用いて単離した。末梢血単核細胞を、６０ＩＵ／ｍｌ
のｒＩＬ−２（組換えヒトＩＬ−２、Ｃｈｉｒｏｎ， Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，
ＣＡ）および１０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ−３抗体（Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ
， Ｒａｒｉｔａｎ， ＮＪ）を含む培地または溶液の各々に、０．５×１０6 細胞／ｍｌで、６ウェルプレートに播種し、そして３７℃にて５％ＣＯ2で培養 した。各実験について、コントロール単核細胞を、０．５×１０6細胞／ｍｌで 、ＡＩＭ Ｖ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ， ＭＤ）＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｂｉｏｗ
ｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）、６０ＩＵ／ｍｌの
ｒＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ−３に播種した。
【０１３８】 ＯＫＴ−３による活性化の３日後、細胞を遠心分離にって採取し、計数し、そ
してＯＫＴ−３を含まない同じ培地または溶液に、０．５×１０6×細胞／ｍｌ で再懸濁した。生存度を、トリパンブルー排除によって決定した。細胞周期分析
を、ＯＫＴ−３活性化の前およびＯＫＴ−３活性化の３日後に、ＦＡＣＳ分析に
よって行った。これらのデータから、細胞増殖周期の（Ｓ＋Ｇ２／Ｍ）期におけ
る細胞の割合を、試験した培地の各々について算出した。ＡＩＭ Ｖ＋７％ＦＢ
Ｓ培地は、Ｓ＋Ｇ２／Ｍ期における細大割合の細胞を生じ、従って以下に示すよ
うな、形質導入のさらなる開発および細胞プロセシングプロトコルについて選択
した。
【０１３９】 （大規模細胞プロセシングおよび形質導入プロトコル） Ｔ細胞を単離し、ＯＫＴ−３活性化し、形質導入し、Ｇ−４１８選択し、そし
て以下に記載のように増殖した。Ｔ細胞を、３つのドナーの白血球アフェレーシ
ス産物から得、これを本明細書中以後、Ａ０５、Ａ０６、およびＡ０７と称す。
このアフェレーシス産物の産生のために、適切な血液分離機（例えば、ＣＳ３０
００ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａ
ｌｌ）またはＣｏｂｅ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ ｓｅｐａｒ
ａｔｏｒ）を使用した。
【０１４０】 （Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）手順による単核細胞の単離） 精製されたヒト単核細胞を提供するために、以下の手順を実施した。開放系ア
フェレーシスキット（Ｏｐｅｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｋｉｔ）
（Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ）を製造業者の指示書に従って使用し、そしてヒ
トドナーＡ０５、Ａ０６、およびＡ０７のアフェレーシス産物を単離した。アフ
ェレーシス産物を、２００ｍｌの生理食塩水／ＡＣＤ溶液（Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅ
ｎｗａｌ）を含むＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）産物フラスコに移し、Ｆｅｎｗ
ａｌ（登録商標）ＣＳ−３０００（登録商標）プラス血球分離機（Ｂａｘｔｅｒ
Ｆｅｎｗａｌ）を製造業者の指示書に従って使用して希釈した。アフェレーシ
ス産物は、少なくとも約３×１０9単核細胞を有した。約３×１０9未満の数の細
胞を有するアフェレーシス産物は、その後の手順のいずれにおいても採取されな
かった。このように回収した細胞の特徴を、表１に示す。
【０１４１】
【表１】
【０１４２】 単核細胞を、製造業者の指示書に従うＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商
標）密度勾配遠心分離によって、Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）ＣＳ−３０００（登
録商標）プラスを使用して、希釈されたアフェレーシス産物から単離した。Ｆｉ
ｃｏｌｌ（登録商標）−Ｈｙｐａｑｕｅ精製手順によって、約２×１０9〜約５ ×１０9の単核細胞が得られた。精製された細胞性産物は、その後の手順におい て使用されるように、約１×１０9単核細胞を有さなくてはならない。単核細胞 の一部（３×１０8）を、ＯＫＴ−３活性化のために保存した。過剰の細胞を、 Ｃｒｙｏｃｙｔｅ（登録商標）容器（Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ）中に凍結保
存した。Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）−Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）によって精製
された細胞の収量および生存率を決定した；結果を表２に示す。
【０１４３】 Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）−Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）によって精製された
単核細胞産物を、ＣＳ−３０００（登録商標）プラス収集チャンバーから、自重
を測定したＦｅｎｗａｌ（登録商標）トランスファーパックフラスコに、滅菌技
術を使用して移した。閉鎖系Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコからの品質
管理サンプルの回収を、Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）血漿トランスファーセット（
Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ）を使用して行った。Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標
）フラスコの内容物を混合し、均一の細胞懸濁物を得て、その後、培養物の一部
を、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコから滅菌サンプル管に移した。
【０１４４】 細胞を、Ｃｒｙｏｃｙｔｅ（登録商標）容器中、１/３細胞容量の３×凍結溶 液（１０％ ＡＩＭ Ｖ培地、６０％ ＦＢＳ、および３０％ ＤＭＳＯ）を含
む、５０×１０6細胞／ｍｌ以下のアリコートで凍結した。所望の場合、ウシ産 物（ＦＢＳ）を回避するために、凍結溶液には２０％自己血漿を使用し得る。凍
結した細胞サンプルを、液体窒素中に保存した。
【０１４５】
【表２】
【０１４６】 （Ｔ細胞のＯＫＴ−３活性化） 細胞が、レトロウイルスによる感染に最適に感受性であることを確認するため
に、以下の活性化手順を実施した。少なくとも約３×１０8Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙ ｐａｑｕｅ（登録商標）によって精製された単核細胞を、１ＬのＬｉｆｅｃｅｌ
ｌ（登録商標）フラスコ中でリンパ球活性化培地（１０％ ＦＢＳを有するＡＩ
Ｍ Ｖ、２ｍＭグルタミン、６０ＩＵ／ｍｌ ｒＩＬ−２、および１０ｎｇ/ｍ ｌ ＯＫＴ−３）に等しく分配し、約２００ｍＬ〜約４００ｍＬの培地中、５×
１０5単核細胞／ｍｌの最終細胞濃度を達成した。Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）に よって精製された単核細胞産物を、最初にＳｅｐａｃｅｌｌ（登録商標）アダプ
ターセットおよび血漿トランスファーセット、および６０ｃｃシリンジを使用し
て空のＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコに手動で分配し、続いて活性化培
地を分配した。
【０１４７】 リンパ球活性化培地中にＦｉｃｏｌｌ（登録商標）によって精製された細胞を
含むＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコを、ワイヤーラック上で、約３７℃
、約５％ＣＯ2にて、約３日間インキュベートした。気体交換を増強するために 、ワイヤーラックを使用した。上記のＯＫＴ−３活性化手順の結果を、表３に要
約する。
【０１４８】
【表３】
【０１４９】 （レトロウイルス形質導入前のＴ細胞の収集） ＯＫＴ−３活性化のおよそ３日後に、活性化した単核細胞を、本質的に製造業
者の指示書に示されるようにＣＳ−３０００（登録商標）プラスの単一チャンバ
ー方法を使用して、リンパ球活性化培地から収集した。ＯＫＴ−３活性化細胞の
サンプルを、チューブストリッパー（Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗａｌ）を使用する
品質管理試験のために滅菌的に採取し、試験すべきアリコートを含む管の最小の
長さを得た。収集された活性化した単核細胞を、自重を測定した１ＬのＬｉｆｅ
ｃｅｌｌ（登録商標）フラスコに移し、品質管理試験のために２０ｍＬのサンプ
ルを維持した。
【０１５０】 収集された活性化した単核細胞の特徴を、以下の表４に示す。表４において示
されるように、活性化手順によって、約１×１０8以上の単核細胞を得た。培養 物のグルコース濃度は、約１００ｍｇ／ｄＬ以上であり、そして乳酸濃度は約１
．０ｍｇ／ｍｌ未満であった。これらの変数は、その後の方法についての閾値放
出基準である。
【０１５１】 形質導入のための調製において、リンパ球形質導入培地（１０％ ＦＢＳを有
するＡＩＭ Ｖ、２ｍＭグルタミン、６０ＩＵ／ｒＩＬ−２、および５μｇ／ｍ
ｌの硫酸プロタミン）中、少なくとも約１．５×１０8の収集されたＯＫＴ−３ 活性化単核細胞を、約５×１０5単核細胞／ｍｌの濃度で１ＬのＬｉｆｅｃｅｌ （登録商標）フラスコに手動で移した。収集された活性化単核細胞およびリンパ
球形質導入培地の組み合わせの好ましい総容量は、１リットルのＬｉｆｅｃｅｌ
ｌ（登録商標）フラスコあたり約２００ｍｌ〜約４００ｍｌであり、最大容量は
約５００ｍｌであった。収集された活性化単核細胞およびリンパ球形質導入培地
の組み合わせの少量のサンプル（各々、５ｍｌ）を、それより後に、その後の滅
菌試験のために凍結した。サンプル中のグルコースおよび乳酸の濃度を、ＹＳＩ
−２７００グルコース分析機（Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｉｎｓｔｒｕｍ
ｅｎｔ Ｃｏ．，Ｙｅｌｌｏｗ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｏｈｉｏ）を製造業者の指示
書に従って使用して決定した。
【０１５２】
【表４】
【０１５３】 （Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入） モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来のレトロウイルス上清（ＤＡ
ＨＳＶＴＫ９Ａ）（３．９×１０7ＣＦＵ／ｍｌ；Ｖｉａｇｅｎｅ Ｃｏｒｐ． 、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を製造業者から購入した。上清調製物を、以下に
記載する手順に従って、少なくとも約３：１〜約５：１を超える多重感染度（Ｍ
ＯＩ）で、ＯＫＴ−３活性化単核細胞に添加した。
【０１５４】 レトロウイルス上清調製物を、−７０℃で保存した。使用直前に、上清調製物
を無菌的に３７℃の水浴中で、穏やかに振盪しながら解凍した。レトロウイルス
物質をＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコに直ぐに注入し、液−液接触を確
実にした。新しいシリンジおよび針を、各Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラス
コについて使用した。
【０１５５】 １．５×１０7ｃｆｕ／ｍｌ未満の力価の上清調製物を、直接リンパ球形質導 入培地に添加した。上清の力価が約１．５×１０6未満の場合、レトロウイルス 物質を、ＡＩＭ Ｖ培地でさらに希釈することなく、直接細胞に適用した。この
場合、プロタミンサルフェートおよびｒＩＬ−２を、ＡＩＭ Ｖ、Ｌ−グルタミ
ン、またはＰＢＳを添加しないレトロウイルス上清に直接添加した。約１．５×
１０7ｃｆｕ／ｍｌを超える力価を有する上清調製物を、細胞および形質導入培 地を含有するＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコ中に送達した。
【０１５６】 上清調製物のサンプルを、マウス細胞株ＮＩＨ３Ｔ３、ヒト細胞株ＨＴ１０８
０および１４３Ｂ、ならびにイヌ細胞株Ｃｆ２Ｔｈを使用する、その直後の力価
測定のために、確保した。上清調製物をアッセイするために使用される特定の指
標細胞株は、分析するウイルスベクターの宿主範囲に依存する。力価をより正確
に測定するために、アッセイの１日目および２日目にプレートあたりの細胞数を
計数することにより力価を測定したことを除いて、力価を、Ｃｅｐｋｏ、Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、
Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅ
ｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９２）の一般的な方法を使用して測
定した。
【０１５７】
【表５】
【０１５８】 （必要に応じた、形質導入後の細胞の増殖 ＃１） 形質導入した単核細胞を、形質導入後に、必要に応じて増殖させ得る。そのよ
うな、増殖の目的は、十分な数の形質導入細胞が培養物中に存在し、従ってＧ４
１８選択で生存することを確実にすることにある。最初の活性化された形質導入
培養物中の全細胞数が約３×１０8細胞を超える場合、以下に記載のＧ４１８選 択工程は増殖を伴わずに行われた。約３×１０8未満の細胞数について、以下の 形質導入後の増殖手順を続けるべできある。
【０１５９】 増殖の間に、細胞の数、生存率、ならびにグルコースおよび乳酸の濃度を、約
２日毎に測定した。後の手順において使用されるサンプルについて、培養物中の
グルコース濃度は、約１００ｍｇ／ｄｌを超えるべきであり、そして培養物中の
乳酸濃度は、約１．０ｍｇ／ｍｌ未満であるべきである。
【０１６０】 白血球数を、製造業者の指示に従い、以下の変更について特に注意を払って、
Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）Ｋ−１０００細胞カウンター（ＴＯＡ Ｍｅｄｉｃａ
ｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｋｏｂｅ、Ｊａｐａｎ）を使用して測定した。細
胞数が、９９．９×１０6／ｍｌを超えるようになった場合、サンプルをＤ−Ｐ ＢＳを用いて１：１０に希釈した。
【０１６１】 リンパ球培養培地を、ＡＩＭ Ｖ培地に対して、１０％ ＦＢＳ、２ｍＭ グ
ルタミンおよび６０ＩＵ／ｍｌのｒＩＬ−２の最終濃度を生じるように、栄養物
および増殖補助物を添加することにより、調製した。グルコースおよび乳酸の濃
度を上記のように決定し、そして培地を調製したその日に使用した。
【０１６２】 少なくとも２×１０6細胞／ｍｌの細胞密度について、形質導入単核細胞を、 Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコ中のリンパ球培養培地中に、約５×１０ 5 細胞／ｍｌに希釈することにより、増殖させた。約５×１０8未満の全白血球細
胞を有するサンプルを、１ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコ中に、約
５×１０5細胞／ｍｌで分配した。約５×１０8を超える全白血球細胞を有するサ
ンプルを、約５×１０5細胞／ｍｌで、３ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フ ラスコ中に分配した。培養物を、上記のように、３７℃／５％ ＣＯ2でインキ ュベートした。Ａ０５、Ａ０６およびＡ０７ドナー細胞の第１の増殖の結果を、
表６に示す。
【０１６３】
【表６】
【０１６４】 （必要に応じた、形質導入後の細胞の増殖 ＃２） 第１の形質導入後の増殖工程の終了時の３×１０8細胞以上の全細胞数につい て、第２の形質導入後増殖工程を省略した。細胞密度が約２×１０6細胞／ｍｌ を超えるようになった場合、形質導入した単核細胞を、１ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ
（登録商標）フラスコ中のリンパ球培養培地中に約５×１０5白血球細胞／ｍｌ まで希釈することにより、増殖させた。約５×１０8未満の全白血球細胞数を有 する増殖培養物について、細胞を、１ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラス
コ中に約５×１０5細胞／ｍｌの濃度に、分配および希釈した。約５×１０8を超
える全白血球細胞数を有する増殖培養物を、３ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標
）フラスコ中に、約５×１０5細胞／ｍｌの濃度に、分配および希釈した。
【０１６５】 増殖培養物を、上記のように、３７℃で５％ ＣＯ2とともに、インキュベー トした。活性化形質導入単核細胞培養物の、細胞数、生存率、ならびにグルコー
スおよび乳酸濃度を、第１の形質導入後の増殖の後に、上記のように約２日毎に
測定した。第２の増殖において得られた結果を、表７に示す。
【０１６６】
【表７】
【０１６７】 （増殖した細胞の収集） 増殖した細胞の総数が約３×１０9細胞を超えるようになった場合、細胞を、 収集した。ドナーＡ０５由来の形質導入した単核細胞を、上記のように製造業者
の指示に従い、ＣＳ−３０００（登録商標）プラスの単一チャンバー方法を使用
して収集した。ドナーＡ０６およびＡ０７由来の形質導入細胞を、２μｍフィル
ターを有するＡｕｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｃを、１２００ｒｐｍで使用して、収
集した。Ｇ４１８選択前の収集した細胞の特徴を、以下の表８に記載する。
【０１６８】
【表８】
【０１６９】 （Ｇ４１８選択） 収集した形質導入単核細胞を、手動の分配方法を使用して、Ｇ４１８選択培地
中に、約５×１０5細胞／ｍｌの濃度に、希釈および分配した。約５×１０8未満
の全白血球細胞を有する収集した集団を、１ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）
フラスコ中に約５×１０5細胞／ｍｌの濃度で、希釈および分配した。約５×１ ０8を超える白血球細胞を有する収集した集団を、３ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登 録商標）フラスコ中に約５×１０5細胞／ｍｌの濃度で、希釈および分配した。
【０１７０】 Ｇ４１８選択培地（ＡＩＭ Ｖ培地中の１０％ＦＢＳ、２ｍＭ グルタミン、
０．８ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８および６０ＩＵ／ｍｌのｒＩＬ−２）を熱非働化Ｆ
ＢＳ、１００×Ｌ−グルタミン、およびｒＩＬ−２を使用して調製した。０．８
ｍｇ／ｍｌの活性薬物濃度のＧ４１８を添加した。Ｇ４１８は、粉末として市販
されており、非常に安定である。しかし、Ｇ４１８の効力は、各ロット間で相当
変化し、そして一般的に低い（約４５０μｇ／ｍｇ粉末）ので、各ロットの比活
性に言及すること、および薬物を適切な濃度で適用することには、注意を払わな
ければならない。他の培地について、グルコースおよび乳酸濃度を測定して、そ
して選択培地を調製したその日に使用した。
【０１７１】 Ｇ４１８選択培地の少量のサンプル（５ｍｌ）を、上記の閉鎖系トランスファ
ー方法を使用する品質管理試験のために確保した。培養物を、３７℃で、５％
ＣＯ2とともにインキュベートした。この手順によって得られた結果を、表９に 示す。
【０１７２】
【表９】
【０１７３】 （必要に応じての、新鮮な選択培地の供給） 所望される場合、単核細胞に、上記のように調製した新鮮なＧ４１８選択培地
を、約２日後に供給する。細胞密度を、約５×１０5細胞／ｍｌに維持した。細 胞培養物のサンプルを、品質管理試験のための収集前に採取し得る。
【０１７４】 細胞を、Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）血漿エクストラクターを使用して、製造業
者の指示に従って、６００ｍｌのトランスファーパックコンテナを遠心分離する
ことにより収集した。適切な細胞ペレットの形成を確実にするために、トランス
ファーパックコンテナを６００ｍｌまで満たす。細胞を１２００ｒｐｍ（３００
ｇ）１５分間の遠心分離により収集する。トランスファーパックコンテナを、穏
やかに遠心分離ホルダーから取り外し、そしてペレットの形成について、ペレッ
トを調べる。堅固なペレットが形成されていない場合、トランスファーパックコ
ンテナを、さらに１０分間遠心分離する。Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）血漿エクス
トラクターを使用して、上清を除去する。
【０１７５】 形質導入して、Ｇ４１８選択した単核細胞を、新鮮なＧ４１８選択培地中に、
約５×１０5細胞／ｍｌの濃度に分配する。約５×１０8未満の白血球細胞を有す
るサンプルについて、単核細胞を、１ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラス
コ中に、約２００〜４００ｍｌの全最終容量について、約５×１０5細胞／ｍｌ の濃度で分配する。約５×１０8を超える単核細胞を有するサンプルを、好まし くは約１Ｌであるが、約１．５Ｌ以下の全最終容量について、３ＬのＬｉｆｅｃ
ｅｌｌ（登録商標）フラスコ中に、約５×１０5細胞／ｍｌの濃度に分配する。 培養物を３７℃で、５％ ＣＯ2とともにインキュベートする。
【０１７６】 （必要に応じての、Ｎｅｏ選択増殖 ＃１） 上記のように、Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）Ｋ−１０００およびＹＳＩ Ｍｏｄ
ｅｌ ２７００を使用して、Ｇ４１８選択の約２日目に、細胞数、生存率、グル
コースおよび乳酸濃度を決定する。Ｇ４１８選択の２日後に、細胞密度が、約２
×１０6細胞／ｍｌを超える場合、形質導入単核細胞を、上記のように調製した Ｇ４１８選択培地中に、約５×１０5細胞／ｍｌで希釈することにより、増殖さ せる。細胞密度が約２×１０6細胞／ｍｌ未満である場合、培養を連続して、細 胞密度をＧ４１８選択後の３日目に観察する。
【０１７７】 約５×１０8未満の全白血球細胞を有するサンプルを、１ＬのＬｉｆｅｃｅｌ ｌ（登録商標）フラスコ中に、約５×１０5細胞／ｍｌに分配する。約５×１０8 を超える全白血球細胞を有するサンプルを、３ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標
）フラスコ中に、約５×１０5細胞／ｍｌに分配する。培養物を３７℃で、５％ ＣＯ2とともにインキュベートする。
【０１７８】 （収集） Ｇ４１８選択の開始後約４日目に、以下のオプション１、２、または３の１つ
を使用して、選択された単核細胞を穏やかに収集することによって、Ｇ４１８選
択培地を細胞培養物から除去した。
【０１７９】 （遠心分離による収集） Ｇ４１８選択培地を、上記のように、製造業者の指示に従い、Ｆｅｎｗａｌ（
登録商標）血漿エクストラクターを使用して除去した。
【０１８０】 （Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）ハイパークによる収集） ５０％を超える生存率を有する培養物のために、製造業者の指示に従い、Ｆｉ
ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）分離手順を使用するＣＳ−３０００（登
録商標）プラスを用いて、Ｇ４１８選択培地および死細胞を除去した。
【０１８１】 ＡＩＭ Ｖ培地を含み、そしてスパイクおよび針アダプターを有する血漿トラ
ンスファーセット（Ｐｌａｓｍａ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｅｔ）を取り付けた１
０００ｍｌのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコを、滅菌チューブウェルダ
を使用して、生理食塩水および排出ラインに連結した（一方は、排出口に通じ、
もう一方は、生理食塩水ラインに通じる）。６００ｍｌのトランスファーパック
コンテナ（Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａｃｋ Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）（産物用）およ
び２０００ｍｌのトランスファーパックコンテナ（廃棄用）を、２つのカプラー
を用いて８００ｍｌのトランスファーパックユニット（Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｐａ
ｃｋ Ｕｎｉｔ）から得られる「Ｙ」チュービングリード（ｌｅａｄ）を使用し
て、血漿コレクト（Ｐｌａｓｍａ Ｃｏｌｌｅｃｔ）ラインに無菌的に連結させ
た。次に、生理食塩水、排出口（Ｖｅｎｔ）および血漿コレクトラインのローラ
ークランプを開いた。インレット（Ｉｎｌｅｔ）、リターン（Ｒｅｔｕｒｎ）、
およびＡＣＤラインのローラークランプを閉じた。
【０１８２】 アフェレーシス産物の受容を、以下の手順を使用して行った。スパイクカプラ
ーを使用して、フラスコにスパイクする場合、スパイクが安全に挿入されること
を確実にすることが重要である。なぜなら、不適切な挿入は、空気ブロックの形
成をもたらし得るからである。滅菌チューブウェルダを使用して、細胞を穏やか
に再懸濁して、２００ｍｌの培地を保有する新しい６００ｍｌのトランスファー
パックコンテナにトランスファーした。最初のフラスコからの適切な量の生理食
塩水／ＡＣＤを、細胞数、生存率、および滅菌度を測定するために確保した。細
胞計数を、上記のようにＳｙｓｍｅｘ（登録商標）Ｋ−１０００を使用して行っ
た。細胞の生存率パーセントもまた測定した。産物／生理食塩水フラスコを、３
リードタイプ血液溶液受容セット（Ｔｈｒｅｅ Ｌｅａｄ−Ｔｙｐｅ Ｂｌｏｏ
ｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ Ｓｅｔ）の１つのリードに接続し
た。第２のリードを、生理食塩水ＡＣＤの５００ｍｌフラスコに接続した。最後
に、第３のリードを、Ｓｅｐａｃｅｌｌ（登録商標）ラボアダプターセット（Ｌ
ａｂ Ａｄａｐｔｅｒ Ｓｅｔ）の２つのめすポートの１つにスパイクした。血
漿トランスファーセットの他方のめすポートに、針アダプターを備え付け、針ア
ダプターをＦｉｃｏｌｌ（登録商標）フラスコ中に挿入して、粘着テープを用い
て接続を確実にした。次に、Ｓｅｐａｃｅｌｌラボアダプターセットのスパイク
した末端を、加熱密封する。８００ｍｌトランスファーパックユニットから得ら
れる「Ｙ」チュービングリードを、フラスコを含む３リードタイプ血液溶液受容
セットの長いリード（ローラークランプを保持する）に溶接した。「Ｙ」チュー
ビングリードを、滅菌チューブウェルダを使用して、アフェレーシスセットのラ
イン５（成分に富む血漿のライン）につなぎ合わた。Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）
分離手順を、製造業者の指示に本質的に従って、行った。
【０１８３】 （Ａｕｔｏｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｃによる収集） Ｇ４１８選択培地を、上記のように、製造業者の指示に従って、Ａｕｔｏｐｈ
ｅｒｅｓｉｓ Ｃを使用して除去した。上記の３つのオプションを使用するＧ４
１８によって収集された収集の結果を、以下の表１０に記載する。
【０１８４】
【表１０】
【０１８５】 単離され、形質導入された、Ｇ４１８選択単核細胞を、新たなＬｉｆｅｃｅｌ
ｌ（登録商標）フラスコ中の白血球培養培地中に、フラスコからフラスコへのト
ランスファー方法を使用して、約１×１０6細胞／ｍｌの濃度に再懸濁し、品質 管理試験のためにサンプルを確保した。別の少量サンプル（６ｍｌ）を、Ｓｙｓ
ｍｅｘ（登録商標）Ｋ−１０００分析、細胞生存率、滅菌度試験、およびトラン
スジーンの組込みを決定するサザン分析のために、閉鎖系分配方法を使用して、
培養培地から確保した。
【０１８６】 約５×１０8未満の単核細胞を有する培養物を、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標 ）フラスコ中に、約１×１０6細胞／ｍｌに分配して、３７℃で５％ ＣＯ2とと
もにインキュベートした。
【０１８７】 （選択後の増殖） 選択後の増殖を、以下のように行った。培養物中の細胞濃度が、少なくとも約
２×１０6細胞／ｍｌに達した場合、形質導入された単核細胞を、白血球培養培 地（上記のように、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコ中で調製）中に約１
×１０6細胞／ｍｌの濃度に希釈することによ増殖させた。約５×１０8未満の単
核細胞を有する培養物を、１ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコ中に約
１×１０6細胞／ｍｌで分配し、一方、約５×１０8を超える単核細胞を有する培
養物を、３ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコ中に約１×１０6細胞／ ｍｌに、希釈および分配した。約２×１０6細胞／ｍｌ未満の濃度の細胞につい て、増殖を行わなかった。少なくとも２日毎に、細胞数、生存率、ならびにグル
コースおよび乳酸濃度を測定した。
【０１８８】 （細胞の凍結保存および細胞の解凍） Ｇ４１８選択白血球細胞の増殖の約３日後、単核細胞を上述の３つの収集オプ
ションの１つを使用して収集した。細胞を収集する前に、培養培地の３５ｍｌの
サンプルを、Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）Ｋ−１０００での細胞数試験；生存率試
験；ＹＳＩ Ｍｏｄｅｌ ２７００機器を用いるグルコースおよび乳酸濃度分析
；凍結保存；およびサザンブロット分析のために、取り出した。最終の収集細胞
産物および培養培地の一部を、品質管理試験のために確保した。
【０１８９】 収集した細胞を、Ｃｒｙｏｃｙｔｅ（登録商標）コンテナ中で、２０％のヒト
ＡＢ血清または自己由来の血漿を有する１０％ ＤＭＳＯ中で、５０×１０6細 胞／ｍｌまでの濃度で凍結保存した。細胞を、速度コントロールフリーザー（Ｃ
ｏｎｔｒｏｌ Ｒａｔｅ Ｆｒｅｅｚｅｒ）中で、−６０℃まで−１℃／分の速
度で低下し、次に−９０℃まで−１０℃／分の速度で低下する４℃の開始温度で
凍結した。
【０１９０】 サンプルを液体窒素の蒸気相中に保存した。
【０１９１】 （形質導入Ｔ細胞中のＨＳＶ−ＴＫ遺伝子のコピー数の決定） 定量的サザンブロットを使用して、以下の手順を使用して、形質導入した臨床
スケールおよび分析スケールの細胞集団における１細胞ゲノムあたりの遺伝子コ
ピー数を決定した。アッセイＩとＩＩとの間の変化は、Ｇ４１８選択の前、およ
び直後において遺伝子コピー数における有意な変動を明らかにする。例えば、Ｇ
４１８の除去後３日において、遺伝子コピー数は、２倍〜１０倍まで増加し、こ
のことは、選択条件が、ＨＳＶ−ＴＫ形質導入細胞を富化したことを示した。ア
ッセイＩおよびＩＩにおいて、臨床スケールにおいて形質導入されそして増殖し
た細胞の形質導入効率は、０．５と１との間に匹敵する遺伝子コピー数を示した
（表１１を参照のこと）。
【０１９２】 ＤＮＡを調製して、そして以下のようにサザンブロットによって分析した。手
短には、ゲノムＤＮＡのミニプレップを、製造業者の指示に従って、Ｑｉａｇｅ
ｎキット（Ｑｕｉａｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を使用し
て行った。ゲノムＤＮＡをｐＨ８．０、６５℃で可溶化し、そして製造業者の指
示に従って、ＴＫＯ１００デバイス（Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を使用して定量し
た。
【０１９３】
【表１１】
【０１９４】 コピー数の標準を、１レーンあたり５ｍｇの末梢血白血球（ＰＢＬ）ゲノムＤ
ＮＡの標準に基づき調製した。この標準を、シリコナイズした微量遠心管におい
て、新鮮に調製した。標準ストック溶液は、２０ｎｇ／ｍｌのｐＬＴＩＮ／Ｎｈ
ｅＩ（７０６８ｂｐプラスミド／約４ｋｂフラグメント）を含んだ。各コピー数
希釈の１μｌを、５μｇのＮｈｅＩ消化ｈｕＰＢＬ ＤＮＡに添加した。コピー
数標準の調製を、以下の表１２に要約する。
【０１９５】
【表１２】
【０１９６】 Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））の一般的な方法により、Ｔｒ
ｉｓ−酢酸緩衝液中でのアガロース電気泳動を使用して、これらのサンプルの成
分を分離した。
【０１９７】 以下のように、電気泳動サンプルについてサザンブロットを行った。穏やかに
振盪しながら、０．２５Ｎ ＨＣｌ中で２０分間ゲルをインキュベートすること
により、アガロースゲル中のＤＮＡを脱プリン化した。穏やかに振盪しながら、
０．５Ｎ ＮａＯＨ−１．５Ｍ ＮａＣｌ中で２０分間インキュベートすること
により、アガロースゲル中のＤＮＡを変性した。１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ
７．５−１．５Ｍ ＮａＣｌ中で２０分間穏やかに振盪することにより、ゲルを
中和して、ゲルを２０×ＳＳＣで２０分間穏やかに振盪することにより平衡化し
た。
【０１９８】 ＤＮＡを、実質的にＲｅｅｄら（（１９８５）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１３（２０）：７２０７〜７２２１）に記載のように、サザンブロットによりメ
ンブレンにトランスファーした。ハイブリダイゼーション前に、湿らせたメンブ
レンをＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ
Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して架橋し、風乾した。
【０１９９】 ブロットを、ＱｕｉｋＨｙｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃ
Ａ）中の１０ｍｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ中でプレハイブリダイゼーション
をした。32Ｐ標識プローブを、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して調製し、ローラーボトル中か、またはハ
イブリダイゼーションオーブン中でハイブリダイズした。メンブレンを２×ＳＳ
Ｃ／０．１％ ＳＤＳ中で室温で洗浄した後、０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤ
Ｓ中で６５℃で３０分間、５回、ハイブリダイゼーションオーブン中で洗浄した
。増感スクリーンを用いて−７０℃でオートラジオグラフィーを行った。オート
ラジオグラフィックシグナルをデンシトメトリーを用いて定量した。
【０２００】 （実施例２） （臨床スケールレトロウイルス形質導入） この実施例は、約２×１０9〜２×１０11の形質導入細胞が閉鎖系において生 成され得ることを実証する。養子性に移入されたリンホカイン活性化キラー（Ｌ
ＡＫ）細胞を有する動物腫瘍モデルに基づき、約１×１０11細胞がヒト腫瘍を処
置するために必要であることが確立されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、（１９
９０）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３
２３：５７０）。本実施例に記載されるスケールアップ手順は、閉鎖系において
約２×１０11のレトロウイルス形質導入Ｔ細胞を生成する。実施例１におけるよ
うに、すべてのＦｅｎｗａｌ（登録商標）製品は、Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉ
ｏｎ、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬより入
手可能である。
【０２０１】 この手順は、本実施例が異なる手順または変更された手順を要求しない限り、
実施例１に記載の手順に従う。
【０２０２】 （Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）による単核細胞の単離） 少なくとも４×１０9白血球細胞を、アフェレーシス産物から取得し、実施例 １に記載のようにＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）精製に供する。従
って、得られた精製産物が２×１０9未満の白血球細胞を含む場合、精製産物を 使用しない。
【０２０３】 （Ｔリンパ球のＯＫＴ−３活性化） Ｔ細胞のＯＫＴ−３活性化を、実質的に実施例１のように行う。容量の増加に
起因して、１ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコを、３ＬのＬｉｆｅｃ
ｅｌｌ（登録商標）フラスコに換えた。さらに、細胞および培地を、製造業者の
指示に従い、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコおよびＢａｘｔｅｒ−Ｆｅ
ｎｗａｌ（登録商標）溶液トランスファーポンプ（Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）＃
６４５５）を使用する下記の種々の機器中にトランスファーする。リンパ球活性
化培地を、以下のように、１０ＬのＡＩＭ Ｖ培地フラスコを使用して調製する
。Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）トランスファーセット（Ｆｅｎｗａｌ（登録商
標）＃４Ｃ２４７４）を、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フィルターアダプター
セット（Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）＃４Ｃ２４７５）のように、パッケージの指
示に従い、溶液トランスファーポンプに取り付ける。Ｓｅｐａｃｅｌｌ（登録商
標）ラボラトリーアダプターセット（Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）＃４Ｃ２４５９
）を、１０Ｌの培地フラスコに挿入する（必要であれば、さらなるめすポートを
提供するために、次にアダプターセットを抱き合わせる）。血漿トランスファー
セット（Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）＃４Ｃ２２４３）を、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登
録商標）アダプターセットの１つのめすポートに挿入する。血漿トランスファー
セットの別のスパイクを、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）アダプターセットのリ
ードチューブに挿入し、全てのクランプが閉じていることを確実にする。２００
０ｍｌトランスファーパックコンテナ（Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）＃４Ｒ２０４
１）を、溶液トランスファーポンプの最終のコンテナフックに掛け、そして最終
のコンテナコネクターをトランスファーセットジャンクションに挿入する。
【０２０４】 １０リットルのＡｉｍ Ｖフラスコから過剰培地を除去するために、溶液トラ
ンスファーポンプを、製造業者の指示に従って、１．００に設定された特定の重
力を用いて、添加される補充物の容量と等量の培地容量を吸引するようにプログ
ラムした。ポンプサイクルの完了後、トランスファーパックコンテナおよび培地
フラスコからのチューブ先端を加熱封印した。リンパ球活性化培地を、２０００
ｍｌのトランスファーパックコンテナを３００ｍｌ容器に代えて、実施例１のよ
うに調製する。
【０２０５】 細胞を、以下の範囲に従って、リンパ球活性化培地中に約５×１０5細胞／ｍ ｌの最終濃度で分散させる。約５×１０9白血球未満を有するサンプルについて 、約５×１０5白血球／ｍｌをリンパ球活性化培地を用いて分散させて、３Ｌの Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコあたり約１Ｌ〜約１．５Ｌの総容量に分
散させる。約５×１０9を超える白血球を有するサンプルについて、約７×１０5 白血球／ｍｌを、３ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコあたり約１Ｌ〜
約１．５Ｌを用いて分散させる。３ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコ
において好ましい総容量は、約１Ｌであり、最大容量は約１．５Ｌである。Ｌｉ
ｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコを、ワイヤラック上で約３７℃で、約５％の
ＣＯ2で約３日間インキュベートする。
【０２０６】 （Ｔリンパ球のレトロウイルス形質導入） 活性化Ｔ細胞を、Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）ＣＦ３０００プラス（Ｂａｘｔｅ
ｒ Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）＃４Ｒ４５３８）の二重チャンバ法を用いて採取
した。二重チャンバ法は、単一チャンバ法について使用されるものに加えて、以
下の物質を使用する。カプラーつきの６００ｍｌトランスファーパックユニット
（Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）＃４Ｒ２０２３）；Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）
フラスコ（１０００ｍｌ容量；Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）＃４Ｒ２１１０）；お
よび２つのカプラーを備えた血漿トランスファーセット（Ｆｅｎｗａｌ（登録商
標）＃４Ｃ２２４３）。少量の容量採取チャンバの代わりにＡ３５チャンバを、
ＣＳ−３０００（登録商標）プラスの採取ホルダに挿入する。プライミング手順
は、実施例１に記載されるとおりである。
【０２０７】 以下の工程を、最初の２つの工程が行われた後に、実施例１の採取手順におい
て置き換える。２つの血漿トランスファーセットを、６００ｍｌトランスファー
パック容器に、カプラーを用いて接続する（この６００ｍｌトランスファーパッ
ク容器を「プーリングパック」として使用する。トランスファーパック容器を、
マニホルドの導入管に接続する。滅菌チューブウェルダを使用して、８００ｍｌ
のトランスファーパックユニット（Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）＃４Ｒ２０５５）
から得られた「Ｙ」チューブの先端を、血漿トランスファーセットの１つに接続
する。「Ｙ」チューブを、オープンシステムアフェレーシスセットのライン５（
成分富化血漿ライン）へとつなぐ。他の血漿トランスファーセットをインレット
ラインに接続する。次いで、ローラークランプを両方の血漿トランスファーセッ
トの上で開ける。生理食塩水クランプおよびインレットクランプもまた開ける。
【０２０８】 プーリングパックへのインレットラインを、プライム培地を圧迫することによ
ってプライムして、そのプーリングパックに約５０ｍｌの培地を押し出す。次い
で、インレットクランプを閉める。止血剤を、成分富化血漿ラインの上の接続部
上に配置する。血液ポンプ（約２０ｍｌ／分）にスイッチを入れてラインをプー
リングパックへプライムする。プーリングパックにさらに５０ｍｌの培地を満た
す。血液ポンプのスイッチを切り、そして接続部の下に止血剤を配置する。生理
食塩水クランプを閉じ、そして排出口および血漿リターンクランプを開ける。遠
心分離を開始し、そして最大速度（約１６００ｒｐｍ）に達したときに、排出口
および血漿リターンクランプを閉じる。
【０２０９】 次いで、血漿採取クランプを開け、これにより、廃水フラスコが閉塞しないこ
とを確実にする。また、プーリングパックへ導く血漿トランスファーセット上の
ローラークランプが開いていることを確実にすることは重要である。血漿流方向
スイッチを前向きに設定し、そして血漿流速度制御を１０ｍｌ／分に合わせて、
それにより、廃水フラスコへの流れが存在することを確実にする。インレットク
ランプおよび血漿リターンクランプを開け、そして血液流速度制御を１０ｍｌ／
分に設定し、それにより、廃水フラスコへの流れが存在することを確実にする。
全てのローラークランプを培養フラスコに向けて開け、そしてプーリングパック
を満たさせる。洗浄培地上のローラークランプが閉まっていることを注意するこ
とが重要である。また、培養フラスコの１つ下のレベルにプーリングパックを配
置することが必要であり得る。両方のポンプの流速は、最大速度（約８７ｍｌ／
分）に増加される。すべての培養フラスコが空にされ、そしてプーリングパック
がほぼ空になったときに、全てのポンプを止め、全てのクランプを閉じ、そして
遠心分離を止める。次いで、遠心分離区画および各チャンバーへと導く止血剤ラ
インを開ける。得られたペレットを、付属のＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラ
スコを緩和にマッサージすることによって再懸濁する。Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録
商標）フラスコを、その各々のチャンバに再挿入し、そして遠心分離ドアを閉じ
る。マニホルドセットとプーリングパックとの間のローラークランプを閉じる。
その培地を洗浄し、そしてこれを、ローラークランプを開けることによってＬｉ
ｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコを満たさせる。そして、フラスコを反転によ
ってリンスする。このローラークランプをプーリングパックに対して開ける。
【０２１０】 上記の手順を反復して、遠心分離を再開し、そしてその細胞を培地のポンピン
グを継続することによって洗浄する。一旦その培地がプーリングパックから空に
されると、すべてのポンプ、クランプおよび遠心分離のスイッチを切る。両方の
チャンバーのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコの封をはがし、そして各フ
ラスコにおける先端を充分保持して滅菌接続を行う。ＣＳ−３０００（登録商標
）におけるＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコを、採取フラスコに両方の産
物をプールするために滅菌的に接続する。採取フラスコを、はかりのゼロ点調整
をするために空のフラスコを用いて秤量して容量を決定する。
【０２１１】 この手順の残りは、３ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコが１ＬのＬ
ｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコに置換されていることを除いて、実施例の
手順の実質的に類似する。さらに、リンパ球形質導入培地を、Ｆｅｎｗａｌ（登
録商標）溶液トランスファーポンプを用いて１０ＬのＡＩＭ Ｖ培地フラスコか
ら調製した。この溶液トランスファーポンプについての初期パラメーターのため
の工程は、上記でリンパ球活性化培地について議論される。次いで、Ｌｉｆｅｃ
ｅｌｌ（登録商標）フラスコを（少なくとも１２時間というよりはむしろ）一晩
インキュベートする。
【０２１２】 （細胞維持および増殖） レトロウイルス上清の添加後約２４時間に、この形質導入した白血球を、ＣＳ
−３０００（登録商標）プラスの二重チャンバ−法を用いて採取する。手順の残
りは、３ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコが１Ｌの種類と置換したこ
とを除いて、実施例１と実質的に同一である。約２０×１０9未満の白血球を有 するサンプルについては、約１〜約１．５Ｌのリンパ球培養培地とともに約５×
１０5白血球細胞／ｍｌが、各３ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコに 分散される。約２０×１０9を超える白血球を有するサンプルについては、約１ 〜約１．５Ｌのリンパ球培養培地とともに約７×１０5白血球細胞／ｍｌが、各 ３ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコに分散される。各３ＬのＬｉｆｅ
ｃｅｌｌ（登録商標）フラスコについて好ましい培地容量は、約１Ｌであり、最
大培地容量は、約１．５Ｌである。
【０２１３】 リンパ培養培地は、Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）溶液トランスファーポンプを用
いて、リンパ球活性化培地を調製するのに使用されるのと類似の様式で調製され
、そしてレトロウイルス上清／形質導入培地（例えば１０Ｌ ＡＩＭ Ｖ培地フ
ラスコは、通常の手順に加えて、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）トランスファー
セット、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フィルターアダプタセットおよび２００
０ｍｌトランスファーパック容器を使用して、操作する）。
【０２１４】 細胞増殖を、実施例１に記載のように無菌的に観察する。細胞密度が約２×１
０6細胞／ｍｌに達するとき、この細胞を分け、そしてさらなるリンパ球培養培 地中で約５×１０5細胞／ｍｌで再播種する。白血球は、約９０％生存度を超え るべきであり、そして白血球濃度は、約５×１０5細胞／ｍｌを超えるべきであ る。培地中のグルコース濃度は、約１００ｍｇ／ｄＬを超えるべきであり、そし
て乳酸濃度は、約１．０ｍｇ／ｍｌ未満であるべきである。この細胞および培地
が、これらの基準を満たさなければ、それらは、後の手順には適していない。
【０２１５】 （ｎｅｏ形質導入Ｔリンパ球のＧ４１８選択） この細胞を、上記のようにＣＳ−３０００（登録商標）プラス上で二重チャン
バ法を使用して単離した後、形質導入した白血球をＧ４１８選択培地中に再懸濁
した（Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）溶液トランスファーポンプおよびＡＩＭ Ｖの
１０Ｌのフラスコを使用してなされた）。この選択培地および細胞を、３ＬのＬ
ｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコに、溶液トランスファーポンプを製造業者
の指示に従って用いて、移した。約２０×１０9白血球未満を有するサンプルに ついて、約５×１０5白血球／ｍｌを、約１ＬのＧ４１８選択培地とともに分散 して、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコ１つあたり１．５Ｌの総培地容量
を得る。各Ｌｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコ中に約２０×１０9を超える 白血球を有する形質導入細胞のサンプルについては、約７×１０5白血球細胞／ ｍｌを分散させ、そして充分なＧ４１８選択培地を添加して、Ｌｉｆｅｃｅｌｌ
（登録商標）フラスコ１つあたり、総容量約１〜約１．５Ｌの最終容量を得る。
好ましい培地容量は、３ＬのＬｉｆｅｃｅｌｌ（登録商標）フラスコあたり約１
Ｌであり、最大培地容量は、約１．５Ｌにものぼる。
【０２１６】 細胞には、新鮮なＧ４１８選択培地が、約３日後に供給され得る。形質導入白
血球は、上記のようにＣＳ−３０００(登録商標)上で二重チャンバー法を用いる
か、または他の適用可能な方法によって採取され得る。いくつかのドナー細胞で
は、細胞密度がＧ４１８選択の間に、約２×１０6白血球／ｍｌを超える場合、 その細胞を分け、希釈し、そして約５×１０5白血球／ｍｌで再播種する必要が あり得る。
【０２１７】 選択開始の約５日後に、選択された細胞を、新鮮さリンパ球培養培地中で穏や
かに洗浄することにより採取する。形質導入した白血球を、上記のようにＣＳ−
３０００(登録商標)プラスを用いる二重チャンバ法か、または他の適用可能な方
法を用いて採取し得る。
【０２１８】 形質導入されＧ４１８選択された白血球を、リンパ球培養培地に約１×１０6 細胞／ｍｌで再懸濁する。Ｇ４１８選択した白血球を、以下の変数を以って観察
し、そして培養する。生存細胞密度を、頻繁な培地交換を伴って約１×１０6白 血球／ｍｌで維持して、抵抗性細胞に数回の細胞分割を受けさせ、その時点で、
播種密度を、約５×１０5白血球／ｍｌに減少させ得る。
【０２１９】 （細胞の凍結保存および続く解凍） この手順を、Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）細胞採集器（Ｂａｘｔｅｒ Ｆｅｎｗ
ａｌ（登録商標）＃４Ｒ４９６０）を用いて形質導入したＧ４１８選択細胞を採
取することを除いて、実質的に実施例１のように行う。Ｆｅｎｗａｌ（登録商標
）細胞採集器を、Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）携帯ワークステーション（Ｂａｘｔ
ｅｒ Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）＃４Ｒ４９６２）とともに使用する。実施例１
においてＦｅｎｗａｌ（登録商標）血漿抽出機とともに使用した成分を、この実
施例においても適用する。Ｆｅｎｗａｌ（登録商標）細胞採集器を作業者マニュ
アルに示されるように用いる。
【０２２０】 （細胞の観察およびサンプリング手順） 一般的に、最小限で、培養および細胞の観察を初期産物について、および各処
理工程の初期および完了において行う。アッセイの選択は、利用可能な装置およ
び資源に依存する。特定の観察方法は実施例１に示される。
【０２２１】 （実施例３） （レトロウイルスベクター骨格の調製） 本実施例は、本発明の遺伝子移入ベクターの調製において有用ないくつかのレ
トロウイルス骨格の構築を記載する。
【０２２２】 （Ａ．ｐＫＴ−１およびｐＫＴ−３Ｂベクターの調製） Ｎ２ベクター（Ａｒｍｅｎｔａｎｏら、（１９８７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：
１６４７−１６５０、Ｅｇｌｉｔａｓら、（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０
：１３９５−１３９８）からのモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）の
５’長末端反復（ＬＴＲ）ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（ｇａｇ配列を
含む）をプラスミドＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）
に連結する。得られた構築物を、Ｎ２Ｒ５と命名する。このＮ２Ｒ５構築物を、
部位特異的インビトロ変異誘発により変異させて、ＡＴＧ開始コドンを、ＡＴＴ
に変化させ、これによりｇａｇ発現を妨害する。この変異誘発されたフラグメン
トをは、２００塩基対（ｂｐ）長であり、そしてＰｓｔＩ制限部位が隣接する。
ＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ変異誘発したフラグメントを、ＳＫ＋プラスミドから精製し
、そしてプラスミドｐＵＣ３１中のＮ２ ＭｏＭＬＶ ５’ＬＴＲのＰｓｔＩ部
位に挿入して、変異誘発されていない２００ｂｐフラグメントを置換する。プラ
スミドｐＵＣ３１は、ｐＵＣ１９（Ｓｔｒａｇｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ
、ＣＡ）に由来し、ここでは、さらなる制限部位ＸｈｏＩ、ＢｇｌＩＩ、Ｂｓｓ
ＨＩＩおよびＮｃｏＩが、ポリリンカーのＥｃｏＲＩ部位とＳａｃＩ部位との間
に挿入されている。この構築物を、ｐＵＣ３１／Ｎ２Ｒ５ｇＭと命名する。
【０２２３】 Ｎ２からの１．０キロベース（ｋｂ）のＭｏＭＶＬ ３’ＬＴＲ ＥｃｏＲＩ
−ＥｃｏＲＩフラグメントを、プラスミドＳＫ＋にクローニングし、Ｎ２Ｒ３−
と命名された構築物を得る。１．０ｋＢ ＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメン
トを、この構築物から精製する。
【０２２４】 ｐＡＦＶＸＭレトロウイルスベクター（Ｋｒｉｅｇｌｅｒら（１９８４）Ｃｅ
ｌｌ ３８：４８３、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓら、（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３１５０−３１５４）からのＣｌａＩ−Ｃｌ
ａＩ優性選択マーカー遺伝子フラグメント（これは、ネオマイシン（ｎｅｏ）ホ
スホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を駆動するＳＶ４０初期プロモーターを含
む）を、ＳＫ＋プラスミドにクローニングする。この構築物をＳＫ＋ＳＶ２−ｎ
ｅｏと命名する。１．３ｋｂのＣｌａＩ−ＢｓｔＢＴ遺伝子フラグメントを、Ｓ
Ｋ＋ＳＶ２−ｎｅｏとプラスミドから精製する。
【０２２５】 ＫＴ−３ＢまたはＫＴ−１ベクターを、３つの部分の連結によって構築し、こ
こで、目的の遺伝子を含むＸｈｏＩ−ＣｌａＩフラグメント、および１．０ｋｂ
ＭｏＭＬＶ ３’ＬＴＲ ＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＵＣ
３１／Ｎ２Ｒ５ｇＭプラスミドのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入する。こ
れは、ＫＴ−１骨格を有するとして表されるベクターを与える。次いで、１．３
ｋｂ ｐＡＦＶＸＭレトロウイルスベクターからのＣｌａＩ−ＢｓｔＢＩ ｎｅ
ｏ遺伝子フラグメントを、このプラスミドのＣｌａＩ部位にセンス方向に挿入し
て、ＫＴ−３Ｂ骨格を有するとして表されるベクターを得る。
【０２２６】 （Ｂ．ｐＢＡ−５ａ、ｐＢＡ−５ｂ、ｐＢＡ−５ｃ、ｐＢＡ−９ｂおよびｐ
ＢＡ−８ｂＬ１の調製） レトロウイルスｇａｇ／ｐｏｌおよびエンベロープ発現構築物に対しての配列
相同性を減少させる、いくつかの改変を、レトロウイルスベクターｐＫＴ−１に
行い得る。さらに、２つの終止コドンを、これらのベクターの安全性を増強する
ために、パッケージングシグナル配列のＤＮＡ配列に導入する。得られたレトロ
ウイルス骨格をｐＢＡ−５ａ、ｐＢＡ−５ｂ、およびｐＢＡ−５ｃと呼ぶ。ｐＢ
Ａ−５ａ、ｐＢＡ−５ｂ、およびｐＢＡ−５ｃの構築におけるさらなる詳細は、
共有に係る米国特許出願第０８／７２１，３２７および共有に係る米国特許出願
（発明の名称「Ｃｒｏｓｓｌｅｓｓ Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ」
（１９９７年５月５日出願）（代理人整理番号１１４７．００４））に見い出さ
れ得る。
【０２２７】 （拡張されたパッケージング配列（Ψ＋）におけるナンセンスコドンの置換
） 拡張されたパッケージングシグナル（Ψ＋）の改変を、拡張されたパッケージ
ングシグナル配列において２つの終止コドンを導入するプライマーを用いる、テ
ンプレートＫＴ−１上でのＰＣＲを使用して、行った。特に、テンプレートｐＫ
Ｔ−１は、ｇａｇの正常のＡＴＧ開始部位に改変ＡＴＴを含む。ここで、この開
始部位は、さらに、終止コドンＴＡＡに改変され、そしてさらなる終止コドンＴ
ＧＡを付加して、共有に係る米国仮特許出願（発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆ
ｏｒ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎ
ｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、１９９
７年６月４日出願（代理人整理番号１１５５．００４））の配列番号１５に示さ
れる配列の６４５〜６４７位のコドンＴＴＡを置換する。
【０２２８】 手短には、２つのセットのＰＣＲ反応を、ｐＫＴ−１において実施し、これら
各々は、１つの終止コドンを導入する。このＰＣＲについてのプライマーを、２
つのＰＣＲ産物が、重複領域を有するように設計し、そしてスプライス重複延長
ＣＰＲ（ＳＯＥ−ＰＣＲ）を、１つの鎖上に２つの導入された終止コドンを合わ
せるために、２つのＰＣＲＴ産物とともに実施されるように実施する。ＡＴＴか
らＴＡＡに変化を導入する、第一のセットのオリゴヌクレオチドは以下： ５’−ＧＧＧ ＡＧＴ ＧＧＴ ＡＡＣ ＡＧＴ ＣＴＧ ＧＣＣ ＴＴＡ
ＡＴＴ ＣＴＣ ＡＧ；および ５’−ＣＧＧ ＴＣＧ ＡＣＣ ＴＣＧ ＡＧＡ ＡＴＴ ＡＡＴ ＴＣ、 であり、そしてＴＴＡからＴＧＡへの変化を導入する、第二のセットのオリゴヌ
クレオチドは以下： ５’−ＣＴＧ ＧＧＡ ＧＡＣ ＧＴＣ ＣＣＡ ＧＧＧ ＡＣＴ ＴＣ；お
よび ５’−ＧＧＣ ＣＡＧ ＡＣＴ ＧＴＴ ＡＣＣ ＡＣＴ ＣＣＣ ＴＧＡ
ＡＧＴ ＴＴＧ ＡＣである。最後の７０８塩基対ＰＣＲ産物の隣接プライマー
は、それぞれ、５’および３’の末端に、ＡａｔＩＩおよびＸｈｏＩ部位を導入
した。
【０２２９】 ７０８塩基対産物の末端を平滑末端化し、そしてリン酸化し、そしてこの産物
をＳｍａＩおよびＥｃｏＲＶ消化したベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に導入した。得られたプ
をｐＢＡ−２と命名した。
【０２３０】 （３’ＬＴＲの上流および下流ならびに５’ＬＴＲの上流およびその内部の
レトロウイルス配列の除去） レトロウイルスエンベロープ配列を、このエンベロープコード配列のＣｌａＩ
部位とＴＡＧ終止コドンとの間の３’ＬＴＲの上流で除去した。このＤＮＡ配列
を、ＰＣＲによって、ＴＡＧ終止コドンが、ＣｌａＩ部位に置換され、そしてこ
の新たなＣｌａＩ部位の９７ヌクレオチド上流からもとのＣｌａＩ部位までを除
去し、そして３’ＬＴＲのレトロウイルス配列下流の２１２塩基対を除去するよ
うに改変した。
【０２３１】 手短には、以下の２つのオリゴヌクレオチドをＰＣＲについて使用し： ５’−ＣＡＴ ＣＧＡ ＴＡＡ ＡＡＴ ＡＡＡ ＡＧＡ ＴＴＴ ＴＡＴ Ｔ
ＴＡ ＧＴＣ；および ５’−ＣＡＡ ＡＴＧ ＡＡＡ ＧＡＣ ＣＣＣ ＣＧＣ ＴＧＡ Ｃ、そして
、テンプレートはｐＫＴ−１であった。ＰＣＲ産物をｐＰＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてクローニングし、そして
ｐＢＡ−１と称した。
【０２３２】 続いて、ｐＢＡ−２を、ＸｂａＩおよびＡａｔＩＩで消化し、これにより、ｐ
ＫＴ１から、多重クローニング部位の一部およびＮｈｅＩからＡａｔＩＩまでの
７８０塩基対フラグメントを除去し、これを線状化したベクターにクローニング
し、プラスミドｐＢＡ−３を得た。プラスミドｐＢＡ−３は、短縮化された５’
ＬＴＲと、上記の２つの導入された終止コドンを含むパッケージング領域を合わ
せた。
【０２３３】 次いで、このｐＢＡ−１構築物を、ＣｌａＩおよびＡｐａＩで消化して６４０
塩基対のフラグメントを得、これをＣｌａＩおよびＡｐａＩで消化したｐＢＡ−
３にクローニングし、プラスミドｐＢＡ−４を得た。このプラスミドは、上記の
５’ＬＴＲおよびパッケージングシグナルを３’ＬＴＲち結合させる。
【０２３４】 ｐＢＡ−４をＡｐａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、平滑末端改変し、そして外
来性３’ポリリンカー部位を除去するために再連結してプラスミドｐＢＡ−５ａ
を得た。
【０２３５】 引き続いて、ｐＢＡ−５ａをＮｏｔＩ（平滑化）およびＥｃｏＲＩで切断し、
そしてＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＵＣ18（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇ
ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）に導入してｐＢＡ−５ｂを得た。この構築物は
、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ骨格由来のレトロウイルスベクターを別のｐＵＣ１８
ベクターに移した。
【０２３６】 ｐＢＡ−５ｃを、ＸｈｏＩ／ＣｌａＩマルチクローニング部位をｐＵＣ−１９
に導入したことを除いて、ｐＢＡ−５ｂと同じ様式で構築した。
【０２３７】 レトロウイルスベクターｐＢＡ−５ｂに対する幾つかのさらなる改変を、簡便
なクローニングのための複数の独自の制限酵素部位を有するベクターを提供する
ために実施した。ｐＢＡ−９ｂベクターを調製するために、単純ヘルペスウイル
スチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）遺伝子を、ＸｈｏＩおよびＥｃｏＲＩでｐＢ
Ｈ−１構築物を消化することにより取り出して１．２ｋｂのフラグメントを得た
。（ｐＢＨ−１を、国際公開ＷＯ９１／０２８０５（「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ Ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｎｓ
ｔｒｕｃｔｓ ｔｏ Ｔａｒｇｅｔ Ｃｅｌｌｓ」」と題される）に記載される
ように調製した）。ＳＶ４０プロモーターにより駆動されるネオマイシン遺伝子
を、ｐＴＫ−１をＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＢＩで消化することにより取り出して
１．３ｋｂのフラグメントを得た。両方のフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＣｌ
ａＩで消化したｐＢＡ−５ｂにクローニングし、レトロウイルスベクターｐＭＯ
−ＴＫを得た。
【０２３８】 レトロウイルスベクターであるｐＭＯ−ＴＫ由来のＴＫ遺伝子をＸｈｏＩ−Ｃ
ｌａＩフラグメントとして単離し、そしてＸｈｏＩおよびＣｌａＩで消化したｐ
ＢＡ−５ｂに挿入し、プラスミドｐＢＡ−５ｂＴＫを得た。５’ＬＴＲの上流の
ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩおよびＨｉｎｃＩＩ制限酵素部
位を欠失させるために、ｐＢＡ−５ｂＴＫをＨｉｎｄＩＩＩおよびＨｉｎｃＩＩ
で消化し、そして突出末端を、Ｔ４ポリメラーゼを使用して除去し、そして平滑
末端を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して連結した。これにより、５’ＬＴＲの
上流領域から取り出した１６塩基（ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＣＴ ＧＣＡ ＧＧＴ
Ｃ）を有するプラスミドｐＴＪＢＡ−５ｂＴＫを得た。このプラスミドｐＴＪＢ
Ａ−５ｂＴＫは５’ＬＴＲの上流にＢａｍＨＩを有する。このＢａｍＨＩ部位を
除去することが望ましい。なぜなら、それがクローニングに使用される一般的な
部位だからである。５’ＬＴＲの上流のＢａｍＨＩ部位を破壊するために、ｐＴ
ＪＢＡ−５ｂＴＫのＢａｍＨＩを含むＴＫ遺伝子を、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩ消
化物を介してＩＬ−２遺伝子に置換し、プラスミドｐＴＪＢＡ−５ｂＩＬ−２を
得た。このプラスミドｐＴＪＢＡ−５ｂＩＬ−２をＢａｍＨＩで消化し、この末
端をクレノウフラグメントで充填し、そして再連結し、ｐＴＪＢＡ−５ｂＩＬ−
２（ＢａｍＨＩ ｄｅｌ.）を得た。
【０２３９】 プラスミドｐＢＡ−９ｂを生成するために、ｐＴＪＢＡ−５ｂＩＬ−２（Ｂａ
ｍＨＩ ｄｅｌ.）由来のＩＬ−２遺伝子を、ＸｈｏＩ−ＣｌａＩ消化物を介し て欠失させ、そしてマルチプルクローニング部位（ＭＣＳ）を導入し、かつ制限
酵素部位、５’−ＸｈｏＩ ＡｐａＩ ＢｇｌＩＩ ＮｏｔＩ ＮｒｕＩ Ｓａ
ｌＩ ＨｉｎｄＩＩＩ ＢａｍＨＩ ＣｌａＩ−３’をコードするポリリンカー
に置換する。このリンカーを生成するために使用される２つのプライマーの配列
は以下のものである。 ５’−ＴＣＧ ＡＧＧ ＧＧＣ ＣＣＡ ＧＡＴ ＣＴＧ ＣＧＧ ＣＣＧ Ｃ
ＴＣ ＧＣＧ ＡＧＴ ＣＧＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＡＴ−３
’（プラス鎖のプライマーとして）；および ５’−ＣＧＡ ＴＧＧ ＡＴＣ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＧＴ ＣＧＡ ＣＴＣ Ｇ
ＣＧ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＧＡ ＴＣＴ ＧＧＧ ＣＣＣ Ｃ−３’（
マイナス鎖のプライマーとして）。
【０２４０】 この実施例はまた、ＳＶ４０プロモーターにより駆動される、ヒト胎盤アルカ
リホスファターゼ遺伝子（ＰＬＡＰ）をコードするベクターを生じるレトロウイ
ルスベクターｐＢＡ−５ｂのいくつかの改変型を記載する。
【０２４１】 プラスミドｐＢＡ−８ｂＬ１を、以下の３個のフラグメントを使用して３段階
の連結により構築した：（１）３’ＬＴＲおよびｐＵＣ１８骨格を含むｐＢＡ−
５ｂ（上記）由来のＮｄｅＩ−ＣｌａＩフラグメント；（２）ＰＬＡＰをコード
するｐＣＩ−ＰＬＡＰからのＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント；および（
３）５’ＬＴＲおよびＳＶ４０プロモーターを含むｐＢＡ−６ｂＬ１からのＨｉ
ｎｄＩＩＩ−ＮｄｅＩフラグメント。プラスミドｐＢＡ−６ｂＬ１はｐＢＡ−６
ｂ（上記）に基づき、ここで、ＨＩＶ ｅｎｖ／ｒｅｖコード領域をＸｈｏＩ−
ＣｌａＩ消化物を介して欠失させ、そして５’末端にＸｈｏＩ、そして３’末端
にＣｌａＩを含むいくつかの制限酵素部位をコードするＬ１リンカーに置換した
。
【０２４２】 （実施例４） （Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子を発現するｐＢＡ−５ａ、ｐＢＡ−５ｂお
よびｐＢＡ−５ｃレトロウイルスベクターの調製） Ｂドメイン欠失型第ＶＩＩＩ因子のｃＤＮＡフラグメントを、下記のようにＸ
ｈｏＩ／ＮｏｔＩ消化により得た。Ｂドメイン欠失型第ＶＩＩＩ因子を発現する
レトロウイルスベクター（ｐＭＢＦ８）を、以前に記載（Ｔｒｕｅｔｔ（１９８
５）ＤＮＡ ４：３３３および米国特許第５，０４５，４５５号）のように調製
した発現プラスミドｐＳＶＦ８−２００から構築する。このｐＳＶＦ８−２００
プラスミドを、１９８５年７月１７日にＡＴＣＣに寄託し、そしてＡＴＣＣ受託
番号第４０１９０号が付与された。
【０２４３】 Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子分子をコードするＤＮＡフラグメントをｐＳＶ
Ｆ８−３０２から得た。ｐＳＶＦ８−３０２はポリＧテイル後の５’非コード領
域に９塩基対の欠失を有する。プラスミドｐＳＶＦ８−３０２をｐＳＶＦ８−２
００と同じ様式で構築た。ｐＳＶＦ８−３０２はＴｒｕｅｔｔ（前出）および米
国特許第５，０４５，４５５号に詳細に記載されている。ｐＳＶＦ８−３０２の
構築もまた、米国特許第５，５９５，８８６号に記載されている。
【０２４４】 以下に概説される手順は、ｐＳＶＦ８−３０２から得られたＢドメイン欠失第
ＶＩＩＩ因子タンパク質を発現するレトロウイルスベクターの構築を記載する。
しかしながら、同じ手順をまた、ｐＳＶＦ８−２００由来のレトロウイルスベク
ターの構築に使用し得る。
【０２４５】 ヒト第ＶＩＩＩ因子の全長ｃＤＮＡ配列およびその全長のアミノ酸配列は、「
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｔｒｅ
ａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｄｉｓｏｒ
ｄｅｒｓ」（１９９７年６月４日出願）（代理人整理番号１１５５．００４）と
題される、共有される米国仮特許出願で開示される。Ｂドメインが欠失されたＳ
ＱＮ欠失体のｃＤＮＡ配列およびＳＱＮ欠失アミノ酸配列もまた、上記の仮特許
出願に開示されている。
【０２４６】 ｐＳＶＦ８−２００のヌクレオチド５５００−６２４８を包含するフラグメン
ト１（Ｔｒｕｅｔｔ（前出）の図８を参照のこと）は、ＰＦ１Ｍ１部位を３’末
端に、そして５’ＳＱＮ配列およびＨｉｎｄＩＩＩ部位を５’末端にコードする
第ＶＩＩＩ因子プライマーを使用するＶＥＮＴ−ＰＣＲにより得た。この５’プ
ライマーは、５’ＳＱＮの領域２４４６−２４６０および３’ＳＱＮ配列の直ぐ
下流にある領域５１４４−５１６７を含む。従って、このフラグメントは、Ｂド
メイン内の２つのＳＱＮ部位（２４６１位および５１４２位）の間の配列に及ぶ
。この使用される特定のプライマー配列は： ５’−ＧＡＡ ＧＣＴ ＴＣＴ ＣＣＣ ＡＧＡ ＡＣＣ ＣＡＣ ＣＡＧ Ｔ
ＣＴ ＴＧＡ ＡＡＣ ＧＣＣ ＡＴＣ；および ５’−ＧＴＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＴＴＴ ＧＧＴ ＣＴＣ ＡＴＣ ＡＡＡ Ｇ
であった。
【０２４７】 フラグメント１を、ＳｍａＩで切断して脱リン酸化したベクターＳＫ−に平滑
末端クローニングし、ｐＳＫ−Ｐｆ１を形成した。ヌクレオチド１１９０−２４
４８を含むフラグメント２を、ＨｉｎｄＩＩＩ消化後に単離し、そしてＳＫ−Ｐ
ｆ１のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングしてＳＫ−Ｐｆ１−Ｈｉｎｄを形成し
た。この挿入物の方向をＡｃｃＩおよびＰｓｔＩ消化物を使用して決定した。ｐ
ＳＶＦ８−２００をＨｐａＩで消化し、そして第ＶＩＩＩ因子ｃＤＮＡ挿入物の
３’側の２つの小さなＨｐａＩフラグメントを除去するように再連結し、ｐＦ８
−３００−ｄｅｌ−Ｈｐａを形成した。残るＨｐａＩ部位を、ＮｏｔＩリン酸化
リンカーを使用してＮｏｔＩ部位に転換し、Ｆ８−３００−Ｈｐａ／Ｎｏｔを形
成した。ヌクレオチド５８８５−７６０４を含むフラグメント３を、ＰｆｌＭＩ
およびＮｏｔＩ消化後に単離し、そしてＳＫ−ｐｆ１−ＨｉｎｄのｐｆｌＭＩお
よびＮｏｔＩ消化後にＳＫ−ｐｆ１−ＨｉｎｄにクローニングしてｐＦ８：２１
３を形成した。フラグメント４（ヌクレオチド１０４−１３３から１２０４まで
を含む）を、５’のＸｈｏＩおよび３’のＡｃｃＩ部位をそれぞれ含むプライマ
ーを使用するＰＳＶ７ｄＦ８−３００のＶＥＮＴ−ＰＣＲ後に得た。５’プライ
マーはヌクレオチド１０４−１３３を含み、そして３’プライマーはヌクレオチ
ド１２００−１２２４を含む。ｐＦ８：２１３をＸｈｏＩで、次いでＡｃｃＩで
続けて消化し、そしてＸｈｏＩおよびＡｃｃＩで消化したフラグメント４に連結
してｐＦ８：４２１３を提供した。５’ＵＴプライマーおよびＸｈｏＩプライマ
ーのプライマー配列は： ５’−ＣＴＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＡ ＡＡＧ ＡＴＡ ＴＴＴ ＴＡＧ Ａ
ＧＡ ＡＧＡ ＡＴＴ ＡＡＣ；および ５’−ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＧＧ ＡＣＡ ＧＣＴ ＧＴＣ ＴＡＣ ＴＴＴ Ｇ
であった。
【０２４８】 この上記の改変型ｃＤＮＡを、ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＭＢＡ骨
格（これもまた上に記載される）にクローニングする。同様に、この非交差（ｃ
ｒｏｓｓ−ｌｅｓｓ）型骨格であるｐＢＡ−９ｂ、ｐＢＡ−５ａ、ｐＢＡ−５ｂ
およびｐＢＡ−５ｃを、ＣｌａＩでの線状化、平滑末端改変、そしてＮｏｔＩリ
ン酸化リンカー存在下での再連結により改変する。この改変型ｃＤＮＡフラグメ
ントをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ線状化ベクターにクローニングする。
【０２４９】 （実施例５） （ヒト第ＶＩＩＩ因子の重鎖および軽鎖を発現する組換えアデノ随伴ウイル
ス（ｒＡＡＶ）ベクターの構築） この実施例は、２つのｒＡＡＶ遺伝子移入ベクター（一方がヒト第ＶＩＩＩ因
子の軽鎖を発現し、他方がヒト第ＶＩＩＩ因子の重鎖を発現する）の構築を記載
する。両方の鎖が、第ＶＩＩＩ因子リーダー配列および可変量のＢドメインを含
む。
【０２５０】 重鎖をクローニングするため、ＡＴＧの５’側の１７４ｂｐからアミノ酸７４
５までの第ＶＩＩ因子遺伝子の領域をＰＣＲにより増幅した。このフラグメント
は、重鎖全体と、Ｂドメインの最初の５アミノ酸とを含む。使用したオリゴは： （正方向）５’−ＣＡＣ ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＡＴＧ ＣＴ−
３’；および （逆方向）５’−ＧＡＣ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＴＣ ＡＡＴ ＴＣＴ ＧＧＧ
ＡＧＡ ＡＧＣ ＴＴＣ ＴＴＧ Ｇ−３’であった。ＰＣＲ反応で鋳型とし
て使用したプラスミドは、Ｂドメイン欠失第ＶＩＩＩ因子発現構築物であるｐＣ
ＭＶＫｍＨＳＴＢであった。増幅フラグメントをＳａｌＩで消化し、ＳａｌＩお
よびＸｈｏＩで消化したＣＭＶ発現ベクターであるｐＣＭＶＫｍＬＩＮＫにクロ
ーニングした。このプラスミドをｐＣＭＶＫｍ９０Ｈと呼んだ。ｐＣＭＶｋＭＬ
ＩＮＫは、ＣＭＶプロモーター／イントロン、目的の遺伝子をクローニングする
ためのポリリンカー、およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む発
現ベクターである。重鎖を発現するｒＡＡＶベクターを作製するため、ｐＣＭＶ
Ｋｍ９０ＨをＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そのＢａｍＨＩ部位を、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼで充填し、このフラグメントを、ＳａｌＩおよびＥｃｏＲ
Ｖで消化したｒＡＡＶベクターｐＫｍ２０１ＣＭＶ−ＣＩにクローニングした。
ｐＫｍ２０１ＣＭＶ−ＣＩは、ＡＡＶの逆方向末端反復、ＣＭＶプロモーター、
ｐＣＩからのキメライントロン（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、お
よびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。最終のＡＡＶベクターを
ｐＫｍ２０１−９０Ｈと呼んだ。
【０２５１】 軽鎖をクローニングするため、第ＶＩＩＩ因子５’非翻訳およびリーダー領域
配列を、以下のプライマーを用いて増幅した： （正方向）５’−ＣＡＣ ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＧＡ ＣＴＴ ＡＴＧ ＣＴ−
３’；および （逆方向）５’−ＣＡＡ ＣＧＣ ＴＣＧ ＡＧＡ ＡＧＣ ＡＧＡ ＡＴＣ
ＧＣＡ ＡＡＡ ＧＧＣ−３’。 再び、ｐＣＭＶＫｍＨＳＴＢを、ＰＣＲ反応において鋳型として使用した。増幅
領域は、第ＶＩＩＩ因子のＡＴＧの１７４ｂｐ上流からアミノ酸１９までの配列
を含む。このフラグメントを、ＸｈｏＩおよびＳａｌＩで消化し、ＸｈｏＩおよ
びＳａｌＩで消化したｐＣＭＶＫｍＬＩＮＫにクローニングした。このプラスミ
ドをｐＣＭＶＫｍＦ８Ｌ（第ＶＩＩＩ因子リーダー用）と呼んだ。軽鎖を増幅す
るため、以下のプライマーを用いた： （正方向）５’−ＴＣＧ ＧＣＴ ＣＧＡ ＧＧＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ＧＧＧ
ＡＡＡ ＴＡＡ ＣＴＣ ＧＴ−３’；および （逆方向）５’−ＣＣＧ ＡＣＴ ＣＧＡ ＧＴＣ ＡＧＴ ＡＧＡ ＧＧＴ
ＣＣＴ ＧＴＧ ＣＣＴ Ｃ−３’。 再び、ｐＣＭＶｋＭＨＳＴＢを、ＰＣＲのための鋳型として使用した。増幅フラ
グメントは、第ＶＩＩＩ因子のアミノ酸１６４５からアミノ酸２３３２の後の終
止コドンまでの配列を含んでいた。これは、Ｂドメインの最後の４アミノ酸と、
完全な軽鎖とを含んでいた。このフラグメントをＸｈｏＩで消化し、ｐＣＭＶＫ
ｍＦ８ＬのＸｈｏＩ部位にクローニングした。これによって、ｐＣＭＶＫｍ８０
Ｌと呼ばれる第ＶＩＩＩ因子リーダーを含む軽鎖構築物が生じた。ｐＣＭＶＫｍ
８０ＬをＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化して軽鎖構築物を取り除き、そしてこ
のフラグメントを、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐＫｍ２０１ＣＭＶ−
ＣＩにクローニングして、ｐＫｍ２０１−８０Ｌを作製した。
【０２５２】 （実施例６） （第ＶＩＩＩ因子の重鎖および軽鎖を発現するｒＡＡＶベクターとの細胞の
同時感染により、生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子の作製がもたらされる） 重鎖および軽鎖構築物ｐＫｍ２０１−８０ＬおよびｐＫｍ２０１−９０Ｈを、
ｒＡＡＶの作製のための標準的手順（Ｚｈｏｕら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１７９：１８６７−１８７５）に従ってパッケージした。ｒＡＡＶを、記述
されるように精製し（Ｗａｎｇら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１２４１６−１２４２０）、そして６ウェルプレートに
プレートした２９３細胞に感染させるために使用した。感染した細胞の上清を感
染４８時間後に収集し、Ｃｏａｍａｔｉｃ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩ（Ｋａｂｉ
Ｖｉｔｒｕｍ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ）を用いて、製造業者の指示に従って、生物
学的に活性な第ＶＩＩＩ因子に関してアッセイした。正常ヒト血漿（Ｇｅｏｒｇ
ｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ−Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｏｖｅｒｌａｎｄ Ｐａｒ
ｋ，Ｋａｎｓａｓ）を用いて、標準曲線を作成した。細胞を、１細胞当たり６０
００個のｒＡＡＶ粒子の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。この実験を、培地
にエトポシド（０．３Ｍ）を加えた場合および加えなかった場合の両方で行った
。エトポシドは、ｒＡＡＶベクターの形質転換効率を増大させることが示されて
いる（Ｒｕｓｓｅｌｌら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９２：５１７１９−５１７２３）。この研究の結果、ｒＡＡＶ−８０Ｌ
およびｒＡＡＶ−９０Ｈの同時感染によって、生物学的に活性な第ＶＩＩＩ因子
の作製がもたらされた。第ＶＩＩＩ因子の量は、エトポシドの存在下で増加した
。
【０２５３】 （実施例７） （ヒトＬＤＬレセプターを発現するレトロウイルスベクターの構築） この実験は、ヒトＬＤＬレセプターを発現するレトロウイルス遺伝子移入ベク
ターの作製を記載する。ヒトＬＤＬレセプター発現プラスミドｐＬＤＬＲ１７は
、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＩｏｗａのＢｅｖ Ｄａｖｉｄｓｏｎから入手
した。あるいは、発現プラスミドは、（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６４：２１６８２−８８により記載されるように調製され得る。５’フラグメン
トは、ＶＥＮＴ−ＰＣＲを用いて再構築した。３’プライマーはＸｈｏＩ部位を
含んだ。３’プライマーは、ＬＤＬＲ ｃＤＮＡ内の固有のＥｃｏＲＩ部位を含
む。ＥｃｏＲＩ消化５’フラグメントをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−にサブク
ローニングし、ＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで切断した。ＬＤＬＲ１７中のＬＤＬ
Ｒ ｃＤＮＡの３’末端のＳｍａＩ部位を、ＮｏｔＩリンカーを用いて改変し、
ｐＬＤＬＲ１７−Ｓ／Ｎを作製した。２つのフラグメント（５’フラグメント：
ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ、および３’フラグメント：ＥｃｏＲＩ〜ＮｏｔＩ）を、
ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＢＡ−６ｂに連結した。ＰＣＲプライマー
の配列は： ５’−ＧＣＧ ＡＣＴ ＣＧＡ ＧＣＡ ＴＧＧ ＧＧＣ ＣＣＴ ＧＧＧ
ＧＣ；および ５’−ＧＣＡ ＣＴＧ ＧＡＡ ＴＴＣ ＧＴＣ ＡＧＧ ＧＣＧ であった。得られたベクターをｐ６ｂ−ＬＤＬＲと名づけた。
【０２５４】 ｐ６ｂ−ＬＤＬＲのための高力価ＤＡプロデューサークローンを、Ｇ４１８の
下で選択した。上清中のＧ４１８ベクター力価は、約２×１０7ｃｆｕ／ｍｌで あった。インビトロでの標的細胞における発現は、ウエスタンブロットまたは機
能的アッセイのいずれかを使用して、正常レベルに匹敵することが実証された。
【０２５５】 （実施例８） （抗トリプシン欠乏症の治療のためのヒトα１抗トリプシンレトロウイルス
ベクター） この実施例は、ヒトα1−抗トリプシンをコードするレトロウイルス遺伝子移 入ベクターの調製を記載する。ヒトα1−抗トリプシンｃＤＮＡクローンを、Ａ ＴＣＣ（クローン番号２５６９７６）から得た。プラスミドをＥｃｏＲＩで消化
し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ大フラグメント（クレノウ）を用いて平滑化した
。ｃＤＮＡを含むフラグメントを、ＳｒｆＩ線状化ｐＢＡ−９ベクターにクロー
ニングして、プロベクターｐＢＡ９−ＡＡＴを作製する。米国特許第４，７３２
，９７３号に記載されるように調製された酸化抵抗性ｃＤＮＡクローンを、制限
酵素で消化し、ｐＢＡ−５ｂに連結した。
【０２５６】 したがって、Ｔ細胞の集団を遺伝的に改変するための方法、およびこの改変を
実施するための遺伝子移入ベクターを開示する。本発明の好適な実施態様をある
程度詳細に説明したが、自明の変形が、添付の特許請求の範囲によって規定され
る本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、プラスミドｐＬＸＳＮ−Ｎ２９ｇのマップである。
【図２】 図２は、プラスミドｐＬＸＳＮ−Ｔ８４．６６ｇのマップである。
【図３】 図３は、レトロウイルスＴＫベクターＤＡＨＳＶＴＫ９Ａのマップである。
【図４】 図４は、ＲＶＶ ＨＳＶ−ＴＫプロベクターのマップである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ルンダク， シェリル アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608, エミリービル， ホートン ストリート 4560， カイロン コーポレイション内 (72)発明者 キリオン， キャサリン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94608, エミリービル， ホートン ストリート 4560， カイロン コーポレイション内 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 DA02 EA02 HA17

Claims (50)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 形質導入Ｔ細胞の集団を産生するための方法であって、該方
    法が： （ａ）Ｔ細胞のインビトロ集団を提供する工程； （ｂ）該集団をＣＤ３結合因子と接触させることによって該Ｔ細胞を活性化す
    る工程；および （ｃ）該Ｔ細胞を適切な遺伝子移入ベクターと接触させることによって工程（
    ｂ）で得られる活性化Ｔ細胞を形質導入する工程であって、ここで、形質導入が
    、該Ｔ細胞集団の細胞密度が約０．１×１０6と５×１０6との間である場合に行
    われる、工程、 を包含する、方法。
  2. 【請求項２】 工程（ｃ）の形質導入が、前記Ｔ細胞集団の細胞密度が約０
    ．５×１０6と２×１０6との間である場合に行われる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記遺伝子移入ベクターが、形質導入細胞に、選択された細
    胞傷害性因子に対する増強された感受性を提供するように発現され得る第１のヌ
    クレオチド配列に、作動可能に連結されるプロモーターを含む、請求項１に記載
    の方法。
  4. 【請求項４】 前記第１のヌクレオチド配列が自殺遺伝子である、請求項３
    に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記第１のヌクレオチド配列が、単純ヘルペスウイルスチミ
    ジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記遺伝子移入ベクターが、選択マーカーをコードする第２
    のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記選択マーカーが、形質導入Ｔ細胞に選択された細胞傷害
    性因子に対する耐性を提供し得る、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラー
    ゼＩＩである、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記選択マーカーが、細胞表面マーカーである、請求項６に
    記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記遺伝子移入ベクターが、選択マーカーをさらに含む、
    請求項５に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラ
    ーゼＩＩである、請求項１０に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 請求項７に記載の方法であって、該方法が： 工程（ｃ）の後に得られる前記Ｔ細胞を前記選択された細胞傷害性因子と接触さ
    せる工程であって、それによって非形質導入Ｔ細胞が前記集団からネガティブに
    選択され得る、工程、 を包含する選択工程をさらに包含する、方法。
  13. 【請求項１３】 請求項９に記載の方法であって、該方法が： 工程（ｃ）の後に得られる前記Ｔ細胞を前記細胞表面マーカーに特異的な結合分
    子と接触させる工程であって、それによって形質導入Ｔ細胞が前記集団からポジ
    ティブに選択され得る、工程、 を包含する選択工程をさらに包含する、方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１に記載の方法であって、該方法が、 工程（ｃ）の後に得られる前記Ｔ細胞の蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）工程であ
    って、それによって非形質導入Ｔ細胞が形質導入Ｔ細胞から分離され得る、工程
    、 を包含する選択工程をさらに包含する、方法。
  15. 【請求項１５】 前記選択工程が、工程（ｃ）の後に得られるＴ細胞の蛍光
    細胞分析分離（ＦＡＣＳ）工程を包含する、請求項１３に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記遺伝子移入ベクターが、レトロウイルスベクターであ
    る、請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記遺伝子移入ベクターが、レトロウイルスベクターであ
    る、請求項５に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記Ｔ細胞集団が、工程（ｂ）においてＣＤ３結合因子と
    ３〜４日間接触する、請求項１に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記ＣＤ３結合因子が、ＣＤ３に特異的な抗体分子である
    、請求項１に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記抗体分子が、ＯＫＴ−３抗体である、請求項１９に記
    載の方法。
  21. 【請求項２１】 工程（ｃ）の形質導入が、約３以上の感染多重度（ＭＯＩ
    ）でウイルスベクターを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 形質導入Ｔ細胞の集団を産生するための方法であって、該
    方法が： （ａ）Ｔ細胞のインビトロ集団を提供する工程； （ｂ）該集団をＣＤ３結合因子およびマイトジェンと接触させることによって
    該Ｔ細胞を活性化する工程；および （ｃ）該Ｔ細胞を適切な遺伝子移入ベクターと接触させることによって工程（
    ｂ）で得られる活性化Ｔ細胞を形質導入する工程であって、ここで、形質導入は
    、該Ｔ細胞集団の細胞密度が約０．１×１０6と５×１０6との間である場合に行
    われる、工程、 を包含する、方法。
  23. 【請求項２３】 前記工程（ｂ）のマイトジェンが、サイトカインである、
    請求項２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記サイトカインが、ＩＬ−２である、請求項２３に記載
    の方法。
  25. 【請求項２５】 工程（ｂ）で前記Ｔ細胞の集団と接触した前記ＩＬ−２が
    、約５０〜１００μｇ／ｍＬの濃度で該集団に添加される、請求項２４に記載の
    方法。
  26. 【請求項２６】 工程（ｃ）の形質導入が、前記Ｔ細胞集団の細胞密度が約
    ０．５×１０6と２×１０6との間である場合に行われる、請求項２２に記載の方
    法。
  27. 【請求項２７】 前記遺伝子移入ベクターが、形質導入細胞に選択された細
    胞傷害性因子に対する増強された感受性を提供するように発現され得る第１のヌ
    クレオチド配列を含む、請求項２２に記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記第１のヌクレオチド配列が、自殺遺伝子である、請求
    項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記第１のヌクレオチド配列が、単純ヘルペスウイルスチ
    ミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である、請求項２８に記載の方法。
  30. 【請求項３０】 前記遺伝子移入ベクターが、レトロウイルスベクターであ
    る、請求項２２に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記レトロウイルスベクターが、約３以上の感染多重度（
    ＭＯＩ）で前記工程（ｃ）におけるＴ細胞集団に添加される、請求項３０に記載
    の方法。
  32. 【請求項３２】 形質導入Ｔ細胞の集団を産生するための方法であって、該
    方法が： （ａ）Ｔ細胞のインビトロ集団を提供する工程； （ｂ）該集団をＣＤ３結合因子と接触させることによって該Ｔ細胞を活性化す
    る工程； （ｃ）工程（ｂ）で得られる該Ｔ細胞集団を洗浄し、そして約５×１０5の細 胞密度で該Ｔ細胞を再播種する工程；および （ｄ）該Ｔ細胞を適切な遺伝子移入ベクターと接触させることによって工程（
    ｃ）で得られる該Ｔ細胞集団を形質導入する工程であって、ここで、形質導入が
    、該Ｔ細胞集団の細胞密度が約５×１０5と２×１０6との間である場合に行われ
    る、工程、 を包含する、方法。
  33. 【請求項３３】 前記遺伝子移入ベクターが、形質導入細胞に選択された細
    胞傷害性因子に対する増強された感受性を提供するように発現され得る第１のヌ
    クレオチド配列を含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記第１のヌクレオチド配列が、自殺遺伝子である、請求
    項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記第１のヌクレオチド配列が、単純ヘルペスウイルスチ
    ミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である、請求項３４に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記遺伝子移入ベクターが、レトロウイルスベクターであ
    る、請求項３２に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 形質導入Ｔ細胞の選択されていない集団において、１００
    ％以上の形質導入効率を得るための方法であって、該方法が： （ａ）Ｔ細胞のインビトロ集団を提供する工程； （ｂ）該集団をＣＤ３結合因子と接触させることによって該Ｔ細胞を活性化す
    る工程； （ｃ）該Ｔ細胞をレトロウイルスベクターと約３以上の感染多重度（ＭＯＩ）
    で接触させることによって、工程（ｂ）で得られる活性化Ｔ細胞を形質導入する
    工程であって、ここで、形質導入が、該Ｔ細胞集団の細胞密度が約５×１０5と ２×１０6との間である場合に行われる、工程、 を包含する、方法。
  38. 【請求項３８】 前記レトロウイルスベクターが、形質導入細胞に選択され
    た細胞傷害性因子に対する増強された感受性を提供するように発現され得る第１
    のヌクレオチド配列を含む、請求項３７に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記第１のヌクレオチド配列が、自殺遺伝子である、請求
    項３８に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記第１のヌクレオチド配列が、単純ヘルペスウイルスチ
    ミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である、請求項３９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 形質導入Ｔ細胞の集団を産生するためのキットであって、
    該キットが、 １つ以上の容器に含まれるＣＤ３結合因子、１つ以上の容器に含まれる遺伝子移
    入ベクター、補助試薬および／またはハードウエア、および該キットの使用のた
    めの指示書、 を含む、キット。
  42. 【請求項４２】 前記ＣＤ３結合因子が、ＣＤ３に特異的な抗体分子である
    、請求項４１に記載のキット。
  43. 【請求項４３】 前記抗体分子が、ＯＫＴ−３抗体である、請求項４２に記
    載のキット。
  44. 【請求項４４】 前記遺伝子移入ベクターが、形質導入細胞に選択された細
    胞傷害性因子に対する増強された感受性を提供するように発現され得る第１のヌ
    クレオチド配列に、作動可能に連結したプロモーターを含む、請求項４１に記載
    のキット。
  45. 【請求項４５】 前記第１のヌクレオチド配列が、自殺遺伝子である、請求
    項４４に記載のキット。
  46. 【請求項４６】 前記第１のヌクレオチド配列が、単純ヘルペスウイルスチ
    ミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子である、請求項４５に記載のキット。
  47. 【請求項４７】 前記遺伝子移入ベクターが、選択マーカーをコードする第
    ２のヌクレオチド配列をさらに含む、請求項４１に記載のキット。
  48. 【請求項４８】 前記選択マーカーが、形質導入Ｔ細胞に選択された細胞傷
    害性因子に対する耐性を提供し得る、請求項４７に記載のキット。
  49. 【請求項４９】 前記選択マーカーが、ネオマイシンホスホトランスフェラ
    ーゼＩＩである、請求項４８に記載のキット。
  50. 【請求項５０】 前記選択マーカーが、細胞表面マーカーである、請求項４
    ８に記載のキット。
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