CN1407853A - 对流体进行生物修饰的装置及方法 - Google Patents

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Abstract

一种对流体进行生物修饰的装置，该装置包括(a)带有一个流体入口和一个流体出口的一种小室；以及(b)至少一种器官的微器官培养体的集合，用来对流体进行生物修饰，该集合的每个微器官培养体均含有细胞，并且培养体的尺寸能够使单个微器官培养体中位置最深的细胞离其最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而在各微器官培养体中可保持器官单位(如肝腺泡)的活体器官构造(器官结构)，微器官培养体的集合位于所述小室内，并至少能够与流经该小室的部分流体相接触。

Description

对流体进行生物修饰的装置及方法
发明背景
本发明涉及一种对流体进行生物修饰装置和方法，更具体地说，本发明涉及一种可补充、增加或替代器官功能的一种人工装置。在特定情况下，该人工装置含有肝微器官培养体。在更特定的情况下，该人工装置含有一种可存活的肾微器官组件。在更特定的情况下，该人工装置含有常用于血液透析的一种透析部件。肾微器官培养体与透析部件一同可作为肾脏代用品来发挥生理学作用。
此外，本发明还涉及一种装置和方法，通过使用同时含有肝微器官培养体和肾微器官培养体的单个人工装置来补充、增加或替代肝与肾的功能。
此外，本发明还涉及一种装置和方法，通过使用含有比率约为6∶1的肝微器官培养体及肾微器官培养体的单个人工装置来补充、增加或替代肝与肾的功能。
此外，本发明还涉及一种含有肝与肾的组合微器官培养体以及一种透析部件的人工装置。
此外，本发明还涉及一种制备可存活组织的方法，该组织无需进行前期培养即可保存在人工装置中，用于补充、增加或替代器官的功能，也可在此后移植到宿主内。
有多种体内器官，如肝脏和肾脏，可对血液等体液进行修饰。肾脏是一种多功能器官，它能够以尿素形式排泄含氮废物、排泄过量的无机盐，并能够主动分泌促红细胞生成素和其它物质，例如，但不局限于，凝乳酶和组织纤维蛋白溶酶原激活质。肝脏能够从血液中去除毒性物质，并能够行使多种生化功能，例如，但不局限于，将氨解毒成尿素、胆红素代谢、糖原储存、脂类合成、药物代谢、白蛋白分泌和凝血因子分泌。肝脏与肾脏的功能密切相关，有多种代谢副产物和毒素由肝脏经循环系统流至肾脏，继而被分泌到尿中。因此，肝脏和肾脏都是不可缺少的器官，这两种器官的协同作用至关重要。肝衰竭或肾衰竭病人若未能立即治疗，其死亡的可能性非常大。
有多种因素可导致肝衰竭，其中包括，例如，暴露于毒性物质、肝炎和遗传缺陷(Kasai，et al.，Artif.Organs，18：348-54，1994)。如今在急性肝衰竭患者中有70％因未能得到治疗而死亡(Kasai，etal.，Artif.Organs，18：348-54，1994)。此外，有10-30％的患者因等待供体肝器官而死亡(LePage，et al.，Am.J.Crit.Care，3：224-7，1994；Sussman，et al.Artif.Organs，18：390-6，1994；and Uchino& Matsushita，Asaio J.，40：74-7，1994)。
能够在肝衰竭期间暂时行使肝脏功能的床边生命维持装置称为体外肝脏装置——ELD。有多种原因说明该装置的开发和商品化会带来明显的巨大利益(Fox et al，Am.J.Gastroenterol.，88：1876-81，1993)。在美国，ELD每年使大约2000名爆发性肝功能衰竭(FH)患者受益(Hoofnagle，et al.，Hepatology，21：240-52，1995)。该装置还可作为等待供体器官的患者在肝移植前的过渡装置使用。
此外，可考虑使用能维持数周功能的ELD来恢复患者自身肝脏的正常功能。由于受损的肝脏中不可能所有肝细胞都被破坏，因而为肝脏提供2-3周的充分支持会使受损肝脏中幸存的肝细胞重新恢复。在患有致死性肝疾病的动物模型中，肝脏的重新恢复只需不到12个肝细胞(Sandgren et al.，Cell，66：245-56，1991)。90-95％肝脏坏死的患者只需几天的支持即可重新获得足以独立生存的功能(Sussman et al.Artif.Organs，19：390-6，1994)。
为了提供这种ELD，已努力开发出几种纯机械的非生物性血液处理装置。从最基本的形式来看，这些装置的目的是利用孔径较小的膜来选择性去除毒素，同时添加营养物质。HemocleanseTM开发出的非生物性装置是其中最先进的装置之一，最近已得到FDA的认证。在利用该HemocleanseTM装置进行的随机受控临床试验中发现，代谢物的去除很有限，同时对血液的氨含量没有明显影响(Hughes et al.，Int.J.Artif.Org.，17：657-662，1994)。很明显，肝脏的功能异常复杂，目前还不可能只用机械的或化学的装置来替代。
目前可使用的其它ELDs以生物材料为出发点。举例来说，有一种经过大多数临床试验的装置称为ELAD(体外肝脏辅助装置)，该装置用转化的无限增殖人细胞系作为肝细胞样细胞的来源(Sussman et al.Artif.Organs，19：390-6，1994)。该装置的初次试验符合“未批准医疗装置的急救备用”或“研究装置免责条例”的情况。其效率未经测定，但除了可通过药物治疗来加以控制的凝血现象之外，未发现严重的不良副作用。无限增殖人细胞系可作为细胞的消耗来源，所以其应用非常方便，但它并不是最理想的，其原因主要有两个。第一，在临床实践中使用无限增殖细胞系会带来明显的安全及控制问题。第二，并不认为无限增殖细胞具有最初肝细胞的所有正常生理特性，尤其是在大规模的扩增之后(Sussman et a1.Artif.Organs，19：90-6，1994)。
获得用于ELD的肝细胞源的另一种常规方法是由完整的肝脏分离出肝细胞或肝组织。此前常利用酶，如胶原酶，来分离肝脏细胞，但这些酶会破坏肝脏的正常显微结构。也有尝试使用肝脏碎片的方法，但未将碎片的形状设计成最适于维护组织的适当表面积/体积比(Lie etal.，Res Exp Med(Berl)185：483-94，1985)。
目前，培养哺乳动物肝细胞的方法在提供条件使细胞聚集成与完整机体中真实组织的三维空间形式类似的组织能力方面仍受到限制。由于类似的原因，传统的组织培养方法会限制培养组织对高度功能特异性状态或对哺乳动物细胞分化以及具有研究及药学意义的特定生物活性分子的分泌至关重要的不同状态的表现能力。与微生物不同的是，高等生物，如哺乳动物，的细胞可自身形成高度有序的多细胞组织。尽管这种自组装的确切机制仍不清楚，但从目前的情况来看，细胞发展成组织依赖于细胞相互间或相对于另一锚定基的取向和(或)诸如激素等特定物质的存在与否。总的来说，目前用于器官辅助装置的传统培养方法都无法既使细胞在体外发挥正常功能，同时又可维持关键性的细胞/细胞/基质相互作用和适当微环境以极好地模拟体内器官的组织结构与功能。本发明则提供一种方法，用于在ELD内使用器官组织，其中包括肝组织，这对于现有技术而言是一个重大的进步。
这种使用器官组织，其中包括但不局限于肝组织，的方法依赖于在微器官培养之前或之后的冷冻保存技术。适当冷冻保存液的成分可包括，但不局限于，美国专利5,879,875所授的蜜三糖或海藻糖，该专利在此全面引用作为参考。
在肝脏中，不同的细胞群体和基质成分呈独特的并置排列，与血管结构协调一致，构成一种精密的生物生态系统。因此不同于普通的肝细胞培养物，后者甚至连最低限度的肝脏功能都不可能实现。如前所述，高等生物，如哺乳动物，的细胞可自身形成高度有序的多细胞组织。细胞与非细胞基底(基质)间存在物理性接触，例如表皮细胞与其基底层之间的物理接触。细胞相互间还存在功能性接触，包括细胞间的电通讯或化学通讯。举例来说，心肌细胞可通过电脉冲与其它心肌细胞联络。此外，许多细胞可通过化学信息，如激素，与其它细胞联络，这些信息可局部扩散(旁分泌信号发放和自分泌信号发放)，或可通过血管系统被运送到更远的部位(内分泌信号发放)。细胞间旁分泌信号发放的实例有不同消化道细胞(称为肠内分泌细胞)产生的信息，如幽门D细胞可分泌生长抑素，该激素可转而抑制附近的幽门促胃液素(D)细胞释放促胃液素。这种显微结构对在基本培养基，如不含外源血清或生长因子的培养基，中维持器官的组织外植块极为重要，因为在这种基本培养基中可通过微器官内部特定细胞相互作用产生的旁分泌及自分泌因子来维持肝组织。
这种微器官培养体的制备方法在美国专利5,888,720和美国专利申请08/482,364中均有所描述，在此引入作为参考。在微器官培养体的制备方法中，构成外植块的细胞群体分离自肝脏，其分离方式可保持细胞间的天然亲和性，例如，可按器官本身的情况维持不同的细胞层。举例来说，在皮肤微器官培养体中，表皮的角化细胞仍与基质相联系，同时保留正常的组织结构，包括毛囊和腺体。这种基本结构是所有器官所共有的，例如含有上皮部分和基质部分的器官。此外，这种联系能够促进细胞间通讯。这对分化细胞来说尤其重要，此时“诱导”的定义是，一种(诱发)组织或细胞与另一种(应答)组织或细胞间的相互作用，其结果是应答细胞的分化方向发生改变。此外，在胚细胞和成体细胞间可产生相互的诱导作用，这种作用除能够诱导分化外，还可建立并维持形态发生的模式(Gurdon，Cell，68：185-199，1992)。
此外，按美国专利申请08/482,364制备的微器官培养体可保持正常的肝组织结构，甚至在经过长时间的培养后也是如此。这些培养体可在统一的受控条件下加以维持，并且与体内组织非常相似，因此可作为体外功能性肝细胞的唯一持续来源。
现有技术中的器官辅助装置或相关装置都不使用微器官培养体或冷冻微器官培养体来对流体进行生物修饰。
美国约有200,000人患有急性肾衰竭(ARF)。该群体的死亡率约为50％。其治疗仅限于支持性医护、透析和移植。甚至对这些人经常进行连续透析也不能满足要求。据National Kidney Foundation估计，约有53,000个美国人在等待移植器官来救命；每天有10人在等待中死亡。
保健行业的另一个重要需求是补充或替代肾透析。遗憾的是，目前透析方法作为肾衰竭的解决方法，不但临床应用困难，而且价格昂贵。因而尝试用一种较为简单的过滤系统来进行透析，以代替异常复杂并且使用受到限制的机械器官。
美国约有250,000人接受透析治疗，其费用达数十亿美元。ESRD人数每年增加7％-9％；到2010年，此类患者将超过350,000人。为每个接受透析的患者提供护理的平均费用为45,000美元/年。
尽管接受移植器官的患者可具有更灵活的生活方式，并且可保持更佳的状态，但如上文所述，等待肾移植器官的患者约有50,000人。去年，这些等待的人中只有约1/5接受了器官移植。
用血液透析作为处理方法有几个固有的缺点。第一，它需要使用昂贵的仪器和熟练的医疗辅助人员来操作该仪器。第二，由于门诊病人一般要每周进行几次处理，因而其费用昂贵，且患者不能远离治疗设施。此外，被治疗的患者必须在此期间保持严格的饮食，这样就通常会由于不能遵守而导致医疗危险。每次处理要持续数小时，而且要通过静脉穿刺来与血液透析机相联接。所以一些长期血液透析患者会在臂部最容易穿刺的静脉出现静脉萎陷。
对肾功能缺乏患者而言，尽管肾移植本身具有一些固有的缺点，但仍被认为是优选的治疗方法。许多医疗中心都将其作为常规方法使用，但该方法仍会带来与腹内手术相关的所有风险。此外，为了防止器官排异，往往要利用免疫抑制性药物对接受移植的患者进行长期处理，这种做法会使他们受感染的风险增加。最大的问题在于，可用来移植的肾脏长期短缺，而供体器官与适当受者相匹配的难度很大。甚至在移植成功的情况下，受者也只有一个肾脏。用诸如本发明的装置来补充移植肾脏的功能的方法可减轻移植肾脏的负荷，从而延长其移植后的存活时间。
为了解决供体肾长期短缺的问题，人们在开发人性化基因工程猪以充当器官供体方面付出了相当大的努力。遗憾的是，尽管它在技术上可行，但最近发现的猪内源性逆转录病毒(pervs)使人们对异种移植方法的合理性产生了相当的怀疑。使用按本发明所述经物理方法分离自患者的微器官培养体的技术是可行的，它有助于在人体内安全使用这些改造的猪器官。
因而人们普遍认为，需要一种不存在上述限制的装置和方法来补充、增加或替代肝脏的功能、肾脏的功能，或二者兼顾，这将会带来极大的利益。这种装置和方法能够使患者在等待移植的同时享受更高的生活质量，还能使患者在接受新器官后的平均寿命延长，在某些情况下还会使患者自身的器官在该装置支持下得以恢复。
美国专利5,888,720讲述了一种用来繁殖非胚胎性动物细胞群体的体外微器官培养系统及其制备方法，该系统将上皮细胞和基质细胞一同置于营养培养基中培养，这些细胞可存活24小时以上。更优选地，此专利涉及一种体外微器官培养系统，该系统将包括一种上皮组织和一种基质组织在内的群体共同培养，并且经组织学方法测定仍可保持基质组织与上皮组织的形式，同时经DNA合成方法测定在无血清的情况下至少可存活48小时。最优选地，此专利涉及一种体外微器官培养系统，该系统将上皮细胞和基质细胞共同培养，这些细胞经组织学方法测定仍可保持基质组织与上皮组织的形式，同时经DNA合成方法测定在无血清的情况下至少可存活7天。据美国专利5,888,720所述，这些微器官培养体无需在内部使用合成的支持结构，并且不使用层状支持结构。
美国专利5,888,720还指出，微器官培养体的第一条边不大于第二条边，而且小于第三条边，其中第一条边的测量方向基本与获得微器官培养体的原器官的外表面平行。该专利还指出，置于营养培养基上的非胚胎性动物细胞来自一种具有活体组织结构的器官，该器官含有上皮组织和毗连的基质组织，其中上皮组织的第一表面相当于器官的外表面，第二表面则与基质相接触。这种微器官培养体可来源于，例如但不局限于，肺、十二指肠、食管、肠、结肠、肝和胰等器官。
根据美国专利5,888,720，微器官培养体的表面积/体积指数被定义为“Aleph”，其中Aleph＝1/x+1/a＞1.5mm-1，x为组织厚度，a为组织宽度，单位均为毫米。该专利指出，微器官培养体的第一条边不大于第二条边，而且小于第三条边，其中第一条边不大于0.45mm。在确定表面积/体积指数时不考虑第三条边，这是因为第三条边的变化会使体积和表面积按比例改变。因此，在确定Aleph时，a和x应该是组织片最短的两条边。
该表面积/体积指数构成本发明独特的一方面，因为它能够使营养物质通过扩散均衡地到达组织中的所有细胞。使营养物质扩散到三维微器官培养体的每个细胞的要求是Aleph至少约为1.5mm-1。
此外，据美国专利5,888,720所述，细胞群体的聚集方式要能够维持一个细胞与另一个细胞的天然亲和力，从而保持上皮组织和基质组织的活体结构。举例来说，在皮肤微器官培养体中，表皮的角化细胞仍与基质相联系，同时保留正常的组织结构，其中包括毛囊。这种联系能够促进细胞间通讯。在动物细胞间存在多种类型的通讯方式。这对分化细胞来说尤其重要，此时“诱导”的定义是，一种(诱发)组织或细胞与另一种(应答)组织或细胞间的相互作用，其结果是应答细胞的分化方向发生改变。此外，在胚胎细胞和成体细胞间可相互产生诱导作用，这种作用除能够诱导分化外，还可建立并维持形态发生的模式(Gurdon，(1992)Cell 68：185-199)。
根据美国专利5,888,720，按本发明实施例1所述制备的微器官培养体含有以某种方式聚集的细胞群体，该细胞群体含有基质层和上皮层，从而可保持天然的组织结构。此专利讲述了由动物制备微器官培养体的方法，该方法包括分离成人的皮肤、小鼠、豚鼠和大鼠的皮肤，并在培养基上培育长达21天。但将培养体维持21天以上以及由其它动物获得这些培养体的情况亦处在该专利所述发明的范围之内。此外还讲述了来源于皮肤和其它器官，如哺乳动物的胰、肝、肾、十二指肠及食管，的微器官培养体。类似地，利用美国专利5,888,720所述的方法可制备出来源于诸如肠和结肠等食管的上皮微器官培养体，还可制备出来源于哺乳动物角膜、肾、乳房组织以及多种肠衍生组织的上皮微器官培养体。
美国专利5,888,720还指出，这些微器官培养体可维持在不含血清的Dulbecco’s Minimal Essential等简单培养基中，同时经组织学方法测定仍保持基质和上皮组织的形式，并且经DNA合成方法测定仍保持细胞存活能力。培养基和培养体可装在氧压基本不超过大气中氧分压的一种培养小室中。此外，培养体可在不含血清和任何其它生物流体的培养基中生长，并且可长时间保持，如48小时-21天。
据美国专利5,888,720所述，微器官培养体可保持在任何适当的培养小室中，如24孔或96孔微量滴定板，并且可保持在37℃和5％CO2的条件下。可将培养物进行振荡以促进通气，振荡速度为，例如，12rpm。
此外，美国专利5,888,720还讲述了具有上述特性的微器官培养体的制备方法。
发明概述
本发明提供一种对流体进行生物修饰的装置，该装置包括(a)带有一个流体入口和一个流体出口的一种小室；以及(b)至少一种器官的微器官培养体的集合，用来对流体进行生物修饰，该集合的每种微器官培养体均含有细胞，并且培养体的尺寸能够使单个微器官培养体中位置最深的细胞离其最近端表面至少约100或150微米，但又不超过约225微米，从而在各微器官培养体中可保持器官单位(如肝腺泡)的活体器官构造(器官结构)，微器官培养体的集合位于所述小室内，并至少能够与流经该小室的部分流体相接触。
本发明的优选实施方案的其它特点有，生物流体的人口和出口采用管道形式，并且该装置安装在患者体外。
本发明的优选实施方案的其它特点还有，生物流体的人口和出口采用半透膜形式，并且该装置以可体内移植装置的形式安装在患者体内。
优选的可选器官包括肝脏和(或)肾脏。同样优选地，微器官培养体的集合可含有至少来自一种器官的细胞，从而可维持细胞间的相互接触。最优选地，各微器官培养体集合的Aleph均至少约为2.6mm- 1。
根据本发明的优选实施方案，微器官培养体基本上都被封装在一种生物相容性聚合物薄片中，该薄片基本都处在所述小室内。优选地，该薄片的第一条边约为10-90cm，第二条边约为10-90cm，第三条边约为300-900μm。同样优选地，可将方向基本平行的多层薄片装在小室中，从而使流体能够在薄片间自由流动。
本发明的另一优选实施方案提供一种对受试者的流体进行生物修饰的装置，该装置包括(a)带有一个流体入口和一个流体出口的一种小室；(b)对流体进行生物修饰的微器官培养体的集合，该集合的每种微器官培养体均含有细胞，并且培养体的尺寸能够使单个微器官培养体中位置最深的细胞离其最近端表面至少约100或150微米，但又不超过约225微米，从而在各微器官培养体中可保持器官单位的活体器官构造，微器官培养体的集合位于所述小室内，并至少能够与流经该小室的部分流体相接触；(c)具有第一和第二末端的第一管道，第一末端用来联接受试者以接收流体，第二末端用来联接入口；以及(d)具有第一和第二末端的第二管道，第一末端用来联接出口，第二末端用来联接受试者以使生物修饰后的流体返回受试者。
本发明的其它一些实施方案提供一种对来自受试者的流体进行生物修饰的方法，该方法包括，用来自受试者的流体对含有微器官培养体集合的一种小室进行灌注，以使微器官培养体的集合能够对该流体进行生物修饰，其中，集合的各微器官培养体均含有细胞，并且培养体的尺寸能够使单个微器官培养体中位置最深的细胞离其最近端表面至少约100或150微米，但又不超过约225微米，从而在各微器官培养体中保持器官单位的活体器官构造。
本发明的其它一些实施方案提供一种制备连续平面器官的方法。该方法包括(a)获得一种器官的单个微器官培养体的集合，使该集合的每种微器官培养体均含有细胞，并且培养体的尺寸能够使单个微器官培养体中位置最深的细胞离其最近端表面至少约100或150微米，但又不超过约225微米，从而在各微器官培养体可保持器官单位的活体器官构造；以及(b)将来源于该器官的一种细胞悬浮液添加(如平铺)在微器官培养体上，并将细胞悬浮液与微器官培养体集合共培养，从而由衍生于微器官培养体的细胞与悬浮细胞的混合物形成连续平面器官。
根据本发明的一项优选实施方案，可在连续肝平面器官内提供肝微器官培养体的集合，该平面器官的制备方法是将肝细胞和(或)内皮细胞或其它类型的细胞与肝微器官培养体的集合共培养，从而由微器官培养体细胞与所选细胞的混合物形成连续肝平面器官。
本发明的其它一些实施方案提供一种制备连续肝平面器官的方法。该方法包括(a)获得单个肝微器官培养体的集合，使该集合的每种微器官培养体均含有肝细胞，并且培养体的尺寸能够使单个微器官培养体中位置最深的细胞离其最近端表面至少约100或150微米，但又不超过约225微米，从而在各微器官培养体中保持腺泡体的活体肝脏结构；以及(b)将肝细胞和(或)内皮细胞或其它类型的细胞的悬浮液添加(如平铺)在微器官培养体上，并将细胞悬浮液与肝微器官培养体的集合共培养，从而由衍生于微器官培养体的细胞与所选细胞的混合物形成连续肝平面器官。
一方面，本发明提供一种装置，用于在器官功能受损的情况下为受试者提供一种或多种器官功能，该装置包括一种小室，其中含有多个微器官培养体，从而使微器官培养体能够在所述受试者的血液流经该小室时至少与其中的一部分相接触，其中，多个微器官培养体的每个微器官培养体内位置最深的细胞离该单个微器官培养体的最近端表面至少约100或150微米，但又不超过约225微米，从而能够在各微器官培养体中保持活体组织的结构，同时能够使各微器官培养体内位置最深的细胞得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死。
另一方面，本发明提供一种方法，用于在器官功能受损的情况下为受试者提供一种或多种器官功能，该方法包括：(a)提供一种含有多个微器官培养体的小室，其中单个微器官培养体内位置最深的细胞离其最近端表面至少约100或150微米，但又不超过约225微米，从而能够在各微器官培养体中保持活体组织的结构，同时能够使各微器官培养体内位置最深的细胞得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死；以及(b)在小室与受试者的循环系统之间形成流体交通，使血液能够由受试者流经小室并由小室流回受试者，从而使微器官培养体在所述受试者的血液流经所述小室时至少能够与其中的一部分相接触。
本发明的优选实施方案的其它特点有，本发明的小室可安装在体外。
本发明的优选实施方案的其它特点还有，本发明的小室采用可体内移植的形式。
本发明的优选实施方案的其它特点还有，本发明还包括那些用来补充、增加或替代器官功能的系统，作为代用品时，这些系统依赖于微器官培养体，并且是其功能的组成部分。
本发明的优选实施方案的其它特点还有，本发明还包括那些以微器官培养体作为其功能的组成部分的用来补充、增加或替代器官功能的方法。
本发明的其它特点还有，被补充、增加或替代的器官功能为肝器官的功能。
本发明的其它特点还有，被补充、增加或替代的器官功能为肾器官的功能。
本发明的其它特点还有，被补充、增加或替代的器官功能为肾脏与肝脏的器官功能。
本发明的其它特点还有，被补充、增加或替代的器官功能包括将小分子排泄至体外的透析功能。
本发明的其它特点还有，血液可通过一个或多个与小室和受试者的循环系统相连的管道进出该小室。
本发明的其它特点还有，血液可通过由能够促进新血管形成的生物相容性膜构成的小室外壁进出该小室。在新血管形成前，血液通过扩散进出该小室。
本发明的优选实施方案的其它特点还有，内部的生物相容性半透膜中另含有MCs，因而小室中来自血液的血浆可扩散到膜内并与MCs相接触，同时MCs的分泌物可扩散到小室内的血液中，继而返回受试者的循环系统。
本发明的优选实施方案的其它特点还有，所述生物相容性膜为聚碳酸酯。
本发明的下述优选实施方案的其它特点还有，将来自细胞悬浮液的细胞与多种微器官培养体共培养以形成连续平面器官。
本发明的下述优选实施方案的其它特点还有，来自细胞悬浮液的细胞为肝脏衍生细胞。
本发明的下述优选实施方案的其它特点还有，来自细胞悬浮液的细胞为肾脏衍生细胞。
本发明的下述优选实施方案的其它特点还有，微器官培养体的特征是被冷冻保存，并在装入小室前融解。
本发明的优选实施方案的其它特点还有，利用冷冻保存的器官的一部分来制备微器官培养体。
本发明的优选实施方案的其它特点还有，利用冷冻保存的肝脏的一部分来制备肝微器官培养体。
本发明的优选实施方案的其它特点还有，利用冷冻保存的肾脏的一部分来制备肾微器官培养体。
本发明的其它一些实施方案提供一种制备冷冻微器官培养体的方法，该方法包括(a)至少将器官的一部分冷冻保存；(b)将冷冻保存的器官切成片，同时保持所得切片的冷冻保存状态；(c)在使用前将冷冻保存器官的冷冻保存切片融解；以及(d)用融解的切片作为微器官。这种冷冻微器官可在融解后加到装置中，或可在融解后进行体外培养，然后再加到装置中。
本发明的优选实施方案的其它特点有，将器官冷冻保存在一种溶液中，该溶液至少有一种组分选自DMEM、DMSO、甘油、海藻糖、蜜三糖、一种抗生素、一种抗霉菌素和葡萄糖。
本发明的优选实施方案的其它特点还有，将器官冷冻保存的温度以及将器官切片的温度为-180-0℃。
本发明的优选实施方案的其它特点还有，来自器官的一部分的切片厚度约为200-400微米。
本发明的优选实施方案的其它特点还有，在融解并用作微器官前，冷冻切片可再保存一段时间，也可立即融解并使用。
本发明的优选实施方案的其它特点还有，用融解的切片作为微器官的实施方法是(i)提供一种小室；(ii)将多个融解的切片置于该小室内；(iii)至少将受试者的部分血液引入该小室，以使多个融解的切片至少与受试者的部分血液相接触，其中多个融解切片的单个融解切片内位置最深的细胞离该单个融解切片的最近端表面至少约100或150微米，但又不超过约225微米，从而可在各融解切片中保持活体组织的结构，同时使多个融解切片的各融解切片内位置最深的细胞能够得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死；以及(iv)至少将一部分与融解切片接触过的受试者血液重新引入受试者。
本发明提供一种装置和方法，用于在肝脏功能受损、肾脏功能受损或两种功能均受损的情况下来补充、增加或替代这些功能，从而成功解决了目前已知装置的缺点。此外，本发明有助于解决供体移植器官长期短缺的问题，并可能减少组织排异以及移植器官传递疾病的问题。此外，本发明提供的方法可维持组织的结构，并且无需在使用前用人工培养基进行培养，因而可提高器官辅助装置中的细胞集结效率，尤其会减少细胞在制备过程中承受的压力。
附图简述
本发明将利用附图来加以说明，这些附图只作为实例。应该强调的是，在细节上参考特定附图时，提供的细节只作为例子来对本发明的优选实施方案进行说明性论述。提供这些细节的原因是，相信它们能够对本发明的原理和概念性问题进行最有效和最易于理解地描述。因此，除了为基本了解本发明而必需的一些描述之外，未对本发明的构造细节做更详细地描述，附图的描述会使该领域的技术人员清楚地了解本发明在实践中会有几种具体的表现形式。
附图中：
图1A-1D为用来容纳代谢活性微器官培养体的典型生物反应器的示意图；
图2A和2B为微器官培养体的免疫隔离室示意图；
图3A-3C为本发明的另一种生物反应器的示意图；
图4为使用图1或图3所示生物反应器的装置的示范性操作电路示意图；
图5显示几种微器官培养体的细胞增殖测定结果；
图6显示小鼠肝细胞在微器官培养体中产生白蛋白的测定结果；
图7显示小鼠肝微器官培养体中氨向尿素的转化；
图8显示人类肝微器官培养体可长期地将大量氨转化成尿素；
图9显示人类肝微器官培养体具有代谢活性；
图10显示冷冻保存的肝微器官培养体培育在37℃时仍具有功能；
图11显示冷冻保存的人类肝微器官培养体培育在37℃时重新恢复了功能；
图12显示封装在藻酸盐片中的小鼠肝微器官培养体具有代谢活性；
图13显示培育在100％胎牛血清中的小鼠肝微器官培养体仍具有功能；
图14A和14B显示封装在藻酸盐片中冷冻后再融解的大鼠肝微器官培养体具有代谢活性；
图15显示可安全地将本发明的一例装置与正常大鼠相连接；以及
图16显示小鼠肝微器官培养体的最佳厚度为450微米。
图17显示可为患者提供器官功能、同时进行血液透析的另一种附加系统的横断面图。
图18为肾MCs的氨产量随时间的作图，图中对包含及不含谷氨酰胺/Hepes的培养基进行了比较。
图19的曲线图显示本发明的肾MCs在低pCO2及高pCO2条件下的尿素产量和氨产量。氨产量不受CO2浓度的影响，而尿素产量取决于CO2浓度。T4时间为4小时。
图20A显示在含有指定培养基、正常大鼠血以及肝切除大鼠血的基本装置中生长的肾MCs培养体的HCO3 -浓度随时间的作图。对照为含有培养基或正常血但不含MCs的基本装置。
图20B显示在含有指定培养基、正常大鼠血以及肝切除大鼠血的基本装置中生长的肾MCs培养体的pH随时间的作图。对照为含有培养基或正常血但不含MCs的基本装置。
图20C显示在含有指定培养基、正常大鼠血以及肝切除大鼠血的基本装置中生长的肾MCs培养体的氧分压随时间的作图。对照为含有培养基或正常血但不含MCs的基本装置。
图20D显示在含有指定培养基、正常大鼠血以及肝切除大鼠血的基本装置中生长的肾MCs培养体的二氧化碳分压随时间的作图。对照为含有培养基或正常血但不含MCs的基本装置。
图20E显示在含有正常大鼠血以及肝切除大鼠血的基本装置中生长的肾MCs培养体的pH随时间的作图。
图21A显示基本装置中肝MCs与肾MCs混合培养物(比率6∶1)的葡糖浓度随时间的作图。所用培养基为正常大鼠与肝切除大鼠的混合血。
图21B显示基本装置中肝MCs与肾MCs混合培养物(比率6∶1)的HCO3 -浓度随时间的作图。所用培养基为正常大鼠与肝切除大鼠的混合血。
图21C显示基本装置中肝MCs与肾MCs混合培养物(比率6∶1)的pH随时间的作图。所用培养基为正常大鼠与肝切除大鼠的混合血。
图21D显示基本装置中肝MCs与肾MCs混合培养物(比率6∶1)的氧分压随时间的作图。所用培养基为正常大鼠与肝切除大鼠的混合血。
图21E显示基本装置中肝MCs与肾MCs混合培养物(比率6∶1)的二氧化碳分压随时间的作图。所用培养基为正常大鼠与肝切除大鼠的混合血。
图22显示经MCs处理的肝切除动物与利用不含MCs的相同装置处理的类似动物相比的存活百分率随时间的作图。处理使平均存活时间增加了10小时。
图23显示灌注到本发明所述装置之前和之后的肝微器官的RT-PCR结果。选择用于白蛋白及凝血因子IX和X的mRNA的特异性引物对来证明这些肝标记物的转录。第1-4泳道显示由白蛋白mRNA的特异性引物产生的718bp条带。第6-9泳道显示由凝血因子IX mRNA的特异性引物产生的821bp条带。第11-14泳道显示由凝血因子X mRNA的特异性引物产生的1158bp条带。第5和第10泳道为分子量标记。第1、6和11泳道的样品来自灌注前的第175号动物，第2、7和12泳道的样品来自灌注后4小时的同一动物。第3、8和13泳道的样品来自灌注前的第176B号动物，第4、9和14泳道的样品来自灌注后4小时的同一动物。
图24显示在培养基中生长的肝MCs介质的利多卡因浓度随时间的作图。浓度的下降表明该药物随时间的代谢。
图25A显示大鼠肝MCs与猪肝MCs的氧分压随时间的变化。所用MCs是用指定培养基或血清进行灌注。用于处理无肝大鼠时，猪肝MCs的效率等于或高于大鼠肝MCs的效率。
图25B显示大鼠肝MCs与猪肝MCs的二氧化碳分压随时间的变化。所用MCs是用指定培养基或血清进行灌注。用于处理无肝大鼠时，猪肝MCs的效率等于或高于大鼠肝MCs的效率。
图25C显示大鼠肝MCs与猪肝MCs的碳酸氢根离子浓度随时间的变化。所用MCs是用指定培养基或血清进行灌注。用于处理无肝大鼠时，猪肝MCs的效率等于或高于大鼠肝MCs的效率。
图25D显示大鼠肝MCs与猪肝MCs的葡糖浓度随时间的变化。所用MCs是用指定培养基或血清进行灌注。用于处理无肝大鼠时，猪肝MCs的效率等于或高于大鼠肝MCs的效率。
图26A显示由测量活性线粒体脱氢酶的MTT(3-[4，5-二甲噻唑-2-基]2，5-二苯四唑溴化物；噻唑兰)比色反应测定一组冷冻保存液(S1-S6)在第0及第120分钟时的活细胞百分率。S1-S6溶液的成分详列于下文表4。
图26B显示由吖啶橙染色法测定一组冷冻保存液(S1-S6)在第0及第120分钟时的活细胞百分率。S1-S6溶液的成分详列于下文表4。
图27A为二氧化碳产量随时间的变化，图中对新鲜肝MCs和在S4(S4溶液的成分见表4)中液氮保存72小时的MCs进行了比较。冷冻和融解没有对肝MCs产生不良影响。
图27B为耗氧量随时间的变化，图中对新鲜肝MCs和在S4(S4溶液的成分见表4)中液氮保存72小时的MCs进行了比较。冷冻和融解没有对肝MCs产生不良影响。
图27C为pH随时间的变化，图中对新鲜肝MCs和在S4(S4溶液的成分见表4)中液氮保存72小时的MCs进行了比较。冷冻和融解没有对肝MCs产生不良影响。
图27D为葡糖浓度随时间的变化，图中对新鲜肝MCs和在S4(S4溶液的成分见表4)中液氮保存72小时的MCs进行了比较。冷冻和融解没有对肝MCs产生不良影响。
图28显示由先在培养基中生长再与肝MC共培养的肝内皮细胞进行肝MC建群的显微图。培养的肝细胞可表达一种转基因的β-半乳糖苷酶。显象方法采用Lac Z染色，以使来源于细胞悬浮液的细胞呈蓝色。
图29显示肾MCs的体内功能性。将肾MCs移植到正常大鼠的腹膜腔内，并在48小时后用RT-PCR方法分析凝乳酶、促红细胞生成素(Epo)及T-PA的mRNAs表达情况。由图可见，48小时后的凝乳酶水平提高，而促红细胞生成素和T-PA的水平下降。M＝100bp梯形DNA分子量标记(Promega)。
优选实施方案详述
本发明涉及对流体进行生物修饰的装置，特别用于协助或替代在正常情况下行使这种修饰作用的器官来发挥功能。本说明书和附属权利要求中使用的短语“对流体进行生物修饰”是指改变该流体的生物成分，在正常情况下，流体中这些生物成分的引入、去除或变化是通过一般在体内对血液进行修饰的器官的分泌、摄取或其催化活性来完成。优选的是将本发明的装置直接与受试者或患者相连或植入其体内，以对该受试者的流体进行修饰。文中使用的术语“受试者”和“患者”可彼此互换，二者都是指与本发明所述装置联接的、或被植入本发明所述装置的、或被实施本发明所述方法的人或较低等动物。
利用附图和附述可更好地理解本发明所述装置对生物流体进行修饰的原理及操作。
在对本发明的至少一项实施方案进行详细说明之前，应该了解本发明在应用时并不局限于以下叙述或附图所指明的结构及配置细节。本发明可以有其它不同的实施方案或实践或执行方式。此外还应了解，文中使用的措词和术语只是用于说明，而不作为限制。
对该说明书和附属权利要求而言，术语“微器官”、“MC”和“MCs”是指仍保持原组织的细胞-细胞、细胞-基质和细胞-间质基本结构的至少一种组织，优选的为多种组织，的外植块。这些术语包括培养的外植块、培养后灌注到本发明所述装置中的外植块以及不预先培养而直接灌注到本发明所述装置中的外植块。此外，这些术语还包括与来自一种悬浮液的细胞共培养的外植块，以及由外植块和多种特定细胞的共培养物形成的平面器官。
由于外植块的尺寸对其细胞的存活力十分重要，所以若希望长时间维持微器官培养体，如1-21天或更长，就需要对组织外植块的尺寸进行选择，以使养分和气体，如氧气，能够充分扩散到三维微器官的每个细胞，同时使细胞废物能够扩散出外植块，以尽量减少废物在微器官内停留而导致的细胞毒性及伴随的死亡。因此，外植块大小的确定要能够满足在不具备专门的递送结构或合成基质的情况下对每个细胞最低限度的可达性的要求。据美国专利申请08/482,364所述，只要使表面积/体积指数处在特定范围内，就能够维持这种可达性。
处在该选定范围内的表面积/体积指数能够使细胞足以通过扩散来获取营养和排除废物，其依据是生物存在扩散极限，由发育的哺乳动物胚胎在血液循环开始前可达到的最大体积/表面积比以及细胞可通过扩散存活的最大体积/表面积比即可意识到这一点。而在含有上皮的哺乳动物组织中，细胞与毛细血管的距离几乎无一例外地都不超过约400微米，由此也可对生物的扩散极限有所认识。
若文中定义为“Aleph”或“Aleph指数”的表面积/体积指数至少约为2.6mm-1，则能够获得并维持该可达性水平。由于第三条边的变化，所以在确定表面积/体积指数时将其忽略。
而在确定Aleph时，a和x应被定义为组织片最短的两条边。
对该说明书和附属权利要求而言，“Aleph”是指由公式1/x+1/a确定的表面积/体积指数，其中x＝组织厚度，a＝组织宽度，单位均为毫米。在优选实施方案中，外植块的Aleph应约为2.7-25mm-1，更优选的约为2.7-15mm-1，再优选的则约为2.7mm-1至约10mm-1。表1给出Aleph的实例，其中，例如，厚度0.1mm、宽度1mm的组织，其Aleph指数为11mm-1。
因此，举例来说，单个微器官培养体或外植块中位置最深的细胞离其最近端表面至少约150微米，但又不超过约225微米，这样可使活体结构得以保留，同时确保所有细胞与气源和营养源的距离都不超过约225微米。
                      表1表面积/体积指数“Aleph”随a(宽度)和x(厚度)变化的不同mm-1
                        值
    x(mm)                           Aleph值
    a＝1     a＝2     a＝3     a＝4     a＝5
    0.1     11     10.51     10.33     10.2     10.2
    0.2     6     5.5     5.33     5.25     5.2
    0.3     4.3     3.83     3.67     3.58     3.53
    0.4     3.5     3     2.83     2.75     2.7
    0.5     3     2.5     2.33     2.25     2.2
    0.6     2.66     2.16     2     1.91     1.87
    0.7     2.4     1.92     1.76     1.68     1.63
    0.8     2.25     1.75     1.58     1.5     1.45
    0.9     2.11     1.61     1.44     1.36     1.31
    1.0     2     1.5     1.33     1.25     1.2
    1.2     1.83     1.3     1.16     1.08     1.03
    1.3     1.77     1.26     1.1     1.02     0.96
    1.6     1.625     1.13     0.96     0.88     0.83
    2.0     1.5     1     0.83     0.75     0.7
人们将直径约700微米、长约2mm的多角形肝小叶作为肝脏的基本结构与功能单位达一个世纪之久。直到50年代才认识到肝脏的基本结构与功能单位是更小的腺泡。一个腺泡大致上是围绕一根终动脉、一根微静脉和一根门管区侧支胆管排列的一个卵形的实质细胞团。腺泡两端各有一根导管，称为终末肝微静脉(该导管在以前用于小叶的术语中被称为中央静脉)。腺泡作为一种小单位，其较短的边约为300-450微米，它包括传统意义上的两个相邻的小叶部分。应该指出的是，自从腺泡被发现以来就被认为是肝脏最小的结构与功能单位，同时它确定了所有肝细胞与气源和营养源之间的最大距离。因此，以腺泡为代表的肝脏微观结构确定了肝脏内所有细胞与营养源的距离都不超过约150-225微米。事实上，其它所有身体器官都是如此，因为气体和营养的有效扩散上限被明显确定在大约150-225微米。有关腺泡结构与功能的其它说明材料可在任一本组织学教科书中找到。例如“组织学教材”，Bloom and Fawcett Eds.12th Edition.Chatman and Hall.N.Y.-London.1994的第652-656页。
在不受任何特定理论限制的前提下，该三维培养系统的许多因素都有助于其获得成功。首先是通过使用，例如，上述的Aleph计算方法来合理地选择外植块的尺寸，这样就可获得适当的表面积/体积比，使营养物能够充分扩散到外植块的所有细胞，并且使细胞废物能够由外植块的所有细胞充分扩散出去。
其次，由于外植块为立体结构，所以各种细胞仍能活跃生长，最重要的是仍可完全分化并发挥功能，相比之下，单层培养的细胞只能生长到铺满状态，然后表现出接触抑制并停止生长和分裂，从而使其功能受到限制。通过外植块细胞的复制而产生的生长因子和调节因子可承担起刺激增殖和调节分化、继而调节培养细胞功能的部分责任，甚至对，例如，总体积不变的微器官培养体也是如此。
第三，外植块的三维基质可保持一种与相应活体器官极为相似的细胞因子空间分布状态。第四，细胞-细胞及细胞-基质相互作用可建立起能够导致细胞成熟的局部微环境。人们已认识到，维持分化细胞的表型不但需要生长/分化因子，而且需要适当的细胞相互作用。本发明可有效地模仿组织的微环境。微器官培养体的生物活性：
本发明的一些实施方案中包含的肝微器官培养体被认为可行使所有种类的肝特异性生物学功能。这些功能的实例包括，例如，氨和尿素的代谢以及产生白蛋白。这些肝特异性生物学功能对于要在肝脏辅助装置(LAD)中使用的细胞而言特别重要。在用较短期形式的LADS对诸如患有爆发性肝衰竭(FHF)、等待肝移植或具有无功能肝移植物的受试者进行支持时，上述肝特异性生物学功能更显得至关重要。但除上文所述之外，还有其它同样重要或更重要的功能。其它功能性缺陷可利用其它方法来支持(如提供葡糖或监测葡糖水平)，或是无需给予严重关注(如胆汁酸的结合，或胆色素的产生，或药物的代谢活性)。可为肝衰竭或肝功能不全患者提供“充分支持”的肝脏特异性生物活性水平是指，该水生物活性平能够使血清蛋白、氨向尿素的转化率、凝血因子、氨基酸以及由肝脏产生或代谢的其它代谢物保持在或接近正常水平。
这些改进可通过生化方法或受试者临床状况的改善来加以衡量。这些不同的分子、代谢参数与临床参数、产物及其浓度或含量的生理学与病理学范围已为该领域所熟知，或在，例如，Zakim & Boyer，肝脏病学；肝脏疾病教材，W.B.Saunders Company；Harcourt，Brace，Jovanovich，Inc.，Philadelphia，London，Toronto，Montreal，Sydney，Tokyo，(1990)中有所描述，在此引入作为参考。
本发明所述装置的一些实施方案中包含的肾微器官培养体被认为可行使所有种类的肾特异性生物学功能。这些功能包括，例如，尿素代谢，分泌促红细胞生成素、凝乳酶以及维生素D调节。当受试者排出尿素的功能不是由肾微器官培养体本身来完成时，也可用本发明所述装置的一项优选实施方案的血液透析部件来完成。该血液透析部件的功能将在下文叙述，其应用实例则在实施例部分的实施例18和19进行详述。微器官培养体的保存：
作为本发明的一部分使用的微器官培养体的优选制备及冷冻保存方法是，在存在，例如，10％DMSO(二甲亚砜)和20％血清的条件下于-160℃将其逐渐冷冻和保存，直至使用。在一项优选实施方案中，肝微培养体可被封装在藻酸盐等半透性基质片中，如图2B所示，然后将其逐渐冷冻在，例如，含有10％DMSO和20％血清的诸如Ham’s F12等标准培养基中。再把冷冻的薄片保存于-160℃。举例来说，可将含有微器官培养体的平面薄片插入到四周密封且大小与薄片十分接近的无菌合成塑料袋中。袋子的一端应带有一个塑料管入口，反端则带有一个塑料管出口。然后在装入含有微器官培养体的平面薄片的塑料袋中灌注含有10％DMSO和20％血清的诸如Ham’s F12等标准培养基，并于一160℃逐渐冷冻和保存。
需要使用时，可将冷冻的薄片或冷冻的微器官培养体融解并装到本发明的装置中，优选的是同时进行，然后与系统联接。
本发明的一些优选实施方案是先培养微器官，然后将其冷冻，下文将对此做更详细的描述。
因此，本发明的另一方面涉及冷冻的微器官。该方面的根据是发现将器官或器官的一部分冷冻保存的多次尝试都不很成功，其原因与难以培育完整器官或部分器官的原因相同。即所述物体的表面积/体积比太小。在降低温度前通过器官内的天然循环网络用适当的冷冻保存液对细胞进行灌注并使其到达器官内的大多数细胞，这样就可在一定程度上克服这种限制。一旦器官被冷冻，就无法经循环网络到达所有细胞，原因是这些通道此时为冻结状态。在实施本发明时发现，若仍在冷冻条件下将冷冻保存的器官或其部分适当地切割，使其在融解时具有较大的表面积/体积比，就可确保所有细胞，包括微器官内位置最深的细胞，能够迅速而充分地接触流体并达到适当的温度条件。其实现方法是，例如，制备的冷冻微器官需保留原器官的上皮/间质基本相互作用，并且所有细胞与表面的距离都不超过约500微米，优选的是300微米，最优选的则是150微米。将冷冻器官或其冷冻部分切割成微器官时可采用任何适当的切割装置，例如，但不局限于，冷冻切片机或带有手动或机械传动刀片并且处在预冷至适当温度的小室内的装置。
作为不限制本发明范围的实例，冷冻微器官的制备方法可以是，利用该领域熟知的灌注方法用适当的冷冻保存液对器官进行灌注。然后以，例如，约每分钟1度的速度逐渐降低温度。当组织的温度达到，例如，-10℃--30℃时把器官切割成微器官。用于保存的微器官可在，例如，-70℃下进一步冷却，优选的是-100℃，更优选的则是在-196℃的液氮中。当需要使用微器官时，可将其快速融解，方法是，例如，将其快速浸泡在预热至37℃的适当溶液中。由于微器官具有很大的表面积/体积比，因而可快速融解，从而减少融解过程中可能出现的细胞损伤。用微器官培养体形成连续的人造平面器官：
本发明的事实依据是，如果能保持器官的显微结构(micro-architecture)，并选择适当条件(如尺寸)来确保所有细胞与气源和营养源的距离处在合理范围内，就能够使来自体内的细胞发挥与体内细胞类似的功能。
下文实施例部分的实验(见实施例13)可说明肝MC培养体的状态作为厚度的函数变化。它是在来自体内的条件下，根据肝MC培养体对转导的外源基因的表达能力而建立的。具有最佳结果的显然是厚度为450微米的MCs。对培养物的组织学检验也进一步证实了该结果。
因此，可把本发明的MCs片看作平面器官，每片都基本相当于一个去卷曲的器官。正常的成熟器官被移出身体时会缺乏系统支持和为器官内每个细胞提供充足营养及气体交换所必需的血液循环。另一方面，文中描述的来自体内平面器官可确保(i)能够维持器官的结构，尽管其外形为平面，同时(ii)器官内所有细胞与营养源的距离都不超过约150-225微米。本发明的另一实施方案是制备出连续平面器官并用来实现本发明的方法和装置。
连续平面器官的制备方法如下。用如上所述制备的单个微器官的集合作为滋养层或基底层来支撑或维持来源于相同组织但被制成悬浮液的细胞。因此，滋养层可提供一个表面，使悬浮液中的细胞粘附于该表面并增殖和(或)分化并且(或)发挥其生物学功能。最后，由粘附细胞产生的细胞能够与单个MCs的集合形成一种相互粘着的连续平面器官片。举例来说，连续肝平面器官的制备方法是将单个肝微器官培养体的集合与肝上皮细胞共培养。
因此，连续平面器官是一种重新设计的组合器官，它可保持基本的器官显微结构或构造。本发明的连续平面器官可借助其平面尺寸来确保所有细胞与营养源的距离都不超过约150-225微米，因而可避免对血液循环的依赖。
应该了解的是，用单细胞层作为滋养层或基底层来培育其它类型细胞的想法并不是新近出现的，它曾被广泛而又成功地使用过。
但用微器官的集合作为滋养层或基底层，更准确地说是作为“滋养器官”，的想法是崭新的，它具有几个优点，主要是滋养器官上生长的细胞有非常复杂的基底来支持，这种基底更类似于体内增殖细胞的基底。
根据本发明的一项替代优选实施方案，可利用肾微器官培养体来制备平面器官。
根据本发明的另一项替代优选实施方案，可同时使用肾微器官培养体和肝微器官培养体来制备一种既有肾脏功能又有肝脏功能的平面器官。
根据本发明的优选实施方案的其它一些特点，可在本发明所述装置中加入一种血液透析部件。
根据本发明的优选实施方案的另一些特点，可将平面器官或含有微器官培养体的其它人造器官植入患者体内，而不是安装在体外。
对该说明书和附属权利要求而言，术语“基本培养基”是指化学成分确定的一种培养基，它只含有细胞在培养基中存活和增殖所必需的营养成分。基本培养基一般不含生物提取物，如生长因子、血清、垂体提取物或细胞群体在培养基中存活和增殖的其它非必需物质。举例来说，基本培养基通常含有至少一种氨基酸、至少一种维生素、至少一种盐、至少一种抗生素、至少一种用来测定氢离子浓度的指示剂，如酚红，葡糖、至少一种抗生素，以及细胞存活和增殖所必需的其它各种成分。基本培养基不含血清。从Gibco BRL，Gaithersburg，MD可购买到多种商品形式的基本培养基。
参考下文的实施例、注解和附图可更好地理解本发明的装置和方法。先看附图，图1A-1C显示一种适于本发明所述装置使用的生物反应器。生物反应器2是一种带有灌注入口6和灌注出口24的小室4，其间有特定的流体流动通道。流体可如箭头8所示由入口6进入，并如箭头10所示由出口24流出。优选的是将至少一个，更优选的是多个，灌注室18置于小室4的流动通道上。每个灌注室18的范围至少由一层，优选的是多层，多孔膜19来确定。每个灌注室18含有至少一个，优选的是多个，微器官培养体20，如肝微器官培养体。有一个或多个托架16与固定夹14或其它固定工具相连接，从而将灌注室18固定在小室4的流体通道上。优选地，小室4内有导流板22来指导流体的流动。流体在小室4内流动的方向如箭头所示。同样优选的是加入折返器21，使微器官培养体20集合的至少一种产物能够返回受试者(未显示)。
在图1A-1C显示的实施方案中，每个灌注室18的流动通道和压力都基本相同。
因此，经多孔膜19向灌注室18的扩散受简单界面扩散原理的约束，如浓度梯度、布朗运动等。在这种扩散不能满足要求的情况下，可通过，例如，跨灌注室18的压力差来提高流体向小室4中渗透的速率。举例来说，图1D显示图1A的生物反应器2经改装后在小室4内具有两种不同的流动通道，一个“流体”室4A和一个“滤液”室4B，流体交换只能通过灌注室18来进行，也就是只能通过微器官培养体20的集合来进行。在所示生物反应器2中可通过，例如，用阀门来限制流体出口24A下游流速的方法来建立跨灌注室18的压力差。正压力差(P流体-P滤液)会使流体从流体室4A向滤液室4B流动，从而使流经小室4的流体能够与微器官培养体20的集合相接触，继而被生物修饰。一般而言，优选的是将滤液室4B的出口24B与流体室4A的出口24A重新合并后再返回受试者。
用于形成微器官灌注室的适当基质材料包括聚酰胺，其中包括尼龙，如聚已内酰胺和聚己二酸己二酯，聚酰胺-酰亚胺、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯，如聚甲基丙烯酸甲酯和聚甲基丙烯酸乙酯，和聚苯乙烯。对某些应用而言，适当的基质材料还包括不同类型的角蛋白(丝绸、羊毛、毛发)、胶原蛋白、聚烯烃，如聚乙烯、聚丙烯和聚丁烯，聚酯，如聚对苯二酸乙二酯和聚己二酸乙二酯，聚氨酯，如聚酯型聚氨酯和聚醚型聚氨酯，玻璃，如玻璃纤维，不锈钢、硅酮、有机聚硅氧烷和石墨，以及上文所述的组合。角蛋白基质可以是角蛋白、含角蛋白材料或角蛋白样材料。其它材料已为该领域所熟知。例如，可参考美国专利5,344,454；美国专利4,883,666；美国专利4,892,538和5,106,627；美国专利4,391,909；以及美国专利4,353,888。
优选的是将微器官培养体20的集合封装在一种半透性基质中以形成一个隔离室，例如可使用该领域已知的多种半透性材料。微器官培养体和被处理流体之间的半透膜等材料允许养分和活体小分子通过，其中包括氧气、葡糖和激素，但不允许免疫系统因子通过，如白细胞，如果需要，则还可包括抗体。文中使用的术语“颗粒”包括分子、细胞和蛋白。
更详细地说，当微器官培养体来自另一种动物时(即相对于被处理的受试者而言为异种的)，孔径的大小必须足以避免炎症细胞和分子免疫原性因子通过而由宿主进入植入组织小室。该说明书中使用的“分子免疫原性因子”是指诸如抗体和补体等分子。足以阻断人类炎症细胞和分子免疫原性因子通过的孔径大小约为0.015微米。当微器官培养体来自同种动物但其遗传组成不同时(即同种异体)，孔径的大小通常只需足以避免炎症细胞通过而由宿主进入植入细胞小室。足以阻断人类炎症细胞通过的孔径大小约为0.8微米。在大多数实施方案中，最好是将微器官培养体放置在一种免疫隔离室内，例如，可选择孔径大小和膜的厚度，以使截留的分子量(MW)约为10,000Da-250,000Da，这样就只能使分子量小于约10,000Da-250,000Da的分子通过。
图2A为该免疫隔离室的一种说明性实施方案，该图显示在由两片相对的半透膜30形成的免疫隔离室28中至少放置一个，优选的为其集合，微器官培养体26。可将微器官培养体26的集合放在两片半透膜30之间，也可如下图(图2B)所示封装在一张半透膜中。通过使用，例如，一个或多个螺钉34将相对的夹具32固定在一起，这样就能够由每个夹具32的凸面脊36在微器官培养体26周围形成基本防水的密封空间。作为选择，同样优选的是用胶水、热封、超声焊接或该领域其它适当的封接技术来代替夹具32将半透膜片30的边缘密封。更优选的是将微器官培养体26的集合直接封装在一张特定大小的平面藻酸盐片中。其外形显示于图2B，图中显示出多个平面藻酸盐片38。举例来说，可制备第一条边约为40cm、第二条边约为60cm、第三条边约为350微米的平面藻酸盐片。这种藻酸盐片每张可容纳大约1-2×1010个细胞。因此，为了获得与人类肝脏的细胞数量大致相同的细胞，需要使用，例如，约4-10张藻酸盐片。
应该了解的是，其它结构的受试者生物反应器流体/滤液型实施方案也可形成多灌注室系统。这些结构也可采用上述的一种薄片结构。
举例来说，图3A-3C显示一种基本的盒式装置40，它能够与其它盒式装置40串联，以形成一种带有多个灌注腔的生物反应器(未显示)。该说明性实施方案是将微器官培养体20的集合放在灌注室18中。两个端板(end plate)42和44与灌注室18之间至少插有一块隔板46，从而可在灌注室18的两侧形成流体室48和滤液室50。在运行时，由至少一个，优选的为多个，流体入口52进入的流体可穿过流体室48，然后沿灌注室18的渗透性表面流动，再通过至少一个，优选的为多个，横向贯穿灌注室18的孔道，即流体管54，而离开流体室48。此后，由流体管54提供的流体可通过至少一个，优选的为多个，流体出口56而离开盒式装置40，从而不与滤液室50内的任何流体相接触。与此方式类似，由至少一个，优选的为多个，滤液入口58进入的滤液可被直接输送到至少一个，优选的为多个，滤液管60，从而不与流体室48内的任何其它流体相接触。
但滤液管60可将滤液排到滤液室50中，使其与灌注室18的另一个(渗透性)表面直接接触。渗析液则通过至少一个，优选的为多个，滤液出口62而离开滤液室50。由此可见，来自流体室48的流体显然还会渗透过灌注室18，被微器官培养体20的集合作用后，以代谢衍生物的形式返回滤液室50。
实际上，将盒式装置40串联排列时可把两个相邻盒式装置中的第二个翻转180°，以使第二个盒式装置40的流体入口52和滤液入口58分别对准第一个盒式装置40的流体出口56和滤液出口62。重复这种组装方式即可将大量盒式装置40顺序连接，并有效地形成一种其间配有多个微器官培养体的流体室和滤液室。若将其中的第一个盒式装置40的滤液入口加盖或以其它方式封闭，则滤液室中流动的流体都是经处理后离开灌注腔的流体。
图4进一步说明了图1-3的上述生物反应器2在本发明所述装置中的应用。为了便于理解，优选实施方案是根据采用肝微器官培养体的肝脏辅助装置来加以描述。但是，如上文所述，也可利用本发明的装置实现其它的器官强化作用。
图4显示本发明所述装置的另一种实施方案，该方案优选地含有图1D、2B或3A-3C的生物反应器2。该实施方案只作为一个例子，并不限制本发明的范围。另外还给出了该实施方案的使用方法。
通过图中显示的动脉管道64可将血液从受试者的双腔静脉导管(等等)引出。进入系统的血流可优选地用，例如，一种蠕动泵66来控制。优选地，可利用注射器68将诸如肝素等抗凝剂输送到动脉管道64内。也可将尿素、凝血因子、来源于肝细胞的其它蛋白或转化产物等添加到血液中。此后，血液进入动脉滴注室70，并在此监测柱前压(PI)。血液离开滴注室70后即进入生物反应器2，因而使生物反应器2(含有微器官培养体集合的小室)充满受试者的血液。如果需要，还可将过滤器等(如商品形式的1mm筛网过滤器)装在滴注室70与生物反应器2之间以避免装置堵塞。生物反应器2有一组入口管道72，可接纳来自动脉管道64的含有或不含抗凝剂的血液。生物反应器2，特别是其中包含的微器官培养体的集合，可对血液进行处理。
在流经生物反应器2的过程中，分子，优选的是分子量约为10,000Da-250,000Da的分子，最优选的则是分子量约为60,000Da-80,000Da的分子，可通过扩散穿过免疫隔离膜而暴露于微器官培养体。血液中的细胞物质则不能与微器官培养体直接接触。低于截留分子量的小分子和蛋白可被送回血液。
生物反应器2可将处理后的(如修饰的或解毒的)血液输送到静脉滴注室74和静脉管道76，静脉滴注室还可作为监测血液中空气的装置的一部分。此外，该系统还可监测滴注室74内的压力，即静脉压(Pv)。由此可计算出柱压(PI-Pv)。
血浆穿过微器官培养体时可被超滤，优选的是在血流通过生物反应器2的同时进行。泵78的吸力可使血浆穿过微器官培养体室而进入滤液室，并在聚集后进入滤液滴注室80，然后流经细胞过滤器82，如0.45μm滤膜，这样可确保细胞或大分子不会进入受试者。测量滤液滴注室80的压力(P2)，由此可计算出膜压(PI-P2)。过滤器82可检测并容纳由微器官培养体渗漏出的所有细胞。然后将滤液与来自生物反应器2的血流重新混合。优选的是将过滤器82的出口与一个三通(如Y形或T形)管的接头相联接，该三通管有一个接头与氧合器管线联接，管线另一端为氧合器，这样就可以对流体充氧。
因此，图4所示的滤液循环可产生一种跨微器官培养体室的压力差，从而促进血清流过微器官培养体。优选地，还可在动脉管道64与注射器68之间的管线上装一个压力传感器84。压力传感器84可监测从受试者到生物反应器2的动脉血的压力。此外，优选的是在与生物反应器2联接的入口管处用一个压力传感器来监测将肝素等抗凝剂泵入动脉管线后的压力。优选地，还可将其它压力传感器装在出口静脉管线上来监测返回受试者的流体，或装在回流管的不同位置来提高安全性。这样就可利用压力传感器来监控受试者的接入压和回流压以及跨装置的压力，从而探测装置的堵塞或破裂问题。此外，在过滤器82两边使用压力传感器可监控由装置释放的任何细胞颗粒或大颗粒。
完整的管道组86包括上述实施方案中使用的所有管道。优选地，管道组86是由聚氯乙烯(PVC)挤压管等制成，其级别一般应能够用于在血液透析、治疗性血浆置换和心脏直视手术中使用的系统。优选的是将管道的泵送段设计成能在约100-500ml/分钟，优选的是250ml/分钟，的血液流速下工作约120小时而不会逐渐破裂并导致受试者血液损失。管道组86中的模压制件可含有硬PVC、Lexan HP树脂等材料，并且可设计成能够在符合上述应用的环境中与PVC管长期高强度结合。管道组86的消毒方法包括，用环氧乙烷对管道组86进行消毒。
此外，如图4所示，可利用控制系统88来对整个系统的运转进行控制。控制系统88可以是包含多个模块的单整合系统，也可以是分离的模块。其中有一个模块用于控制双泵系统的运行。这种控制模块可以在市场上买到(例如从CGH，Inc.of Lakew，Colo购买BSM-22DualPump Blood Safety Module)。
控制系统88的另一模块为辅助监控装置(AMU)，可用来监测压力、通过辅助键盘等接收操作者的报警设定，以及在达到某些报警极限时通知操作者。控制系统88的第三个模块是一种静脉压监测器(VPM)，可在治疗期间监测体外回路中返回受试者的静脉压。VPM也可以从CGH公司购买，它可包含有两种报警器。第一种报警器有一个上下限幅器，可在压力值比选定值低40mmHg或以上、或比选定值高70mmHg或以上时触发警报。第二种报警器即所谓的“溢出”报警器，可在压力值高于+450mmHg或低于+10mmHg时触发警报。当报警器被触发时，血液泵将停止。VPM包括压力传感元件及电源。
优选地，该说明性装置的管道及其结合处可承受3个大气压(2,300mmHg)的正压(由内向外)和0.75个大气压的负压而不会出现严重损坏或在管道组内部与外部之间逐渐泄漏的情况。这种设计的起因是考虑到，一般用于体外处理的泵和管道可在大约0.7个大气压的负压和1.5个大气压的正压时达到其传输极限。上文确定的压力范围包含这些极限值，因而是一种合理的安全范围。
优选地，血液流速的可调范围是0-500mls/分钟。其原因有几个方面。已经明确的是，连续血液透析可在150mls/分钟的血流速率下有效进行。与此相比，安静状态下正常肾脏中的流速约为1,000mls/分钟。而肝脏的储备能力要低于肾脏，因而最大流速在约为1,500ml/分钟的安静状态下正常肝脏的血液流速中占有较大的比例。另外还知道，这种体外流速可利用常规的血液接入装置来实现，如单腔或双腔锁骨下导管。更高的血液流速会提高治疗的效果。
再循环管道组的再循环流速，如排出流速，可约为5-120ml/分钟，优选的则约为20-80ml/分钟。也可根据占血液流速的比例来定义该流速。例如，排出流速约占血液流速的5％-30％，优选的则占血液流速的10％-20％。优选的是为操作者提供一份相对于血液流速的再循环流速表，作为选择，也可优选地将这些数据保存在控制系统88的存储器中。
此外，或作为选择，如果血液已经是被生物修饰的流体，可优选地在滤液回路上用一种血红蛋白监测器来显示一个或多个微器官培养体小室的所有泄漏情况。还可以用血红蛋白监测器来检测毛细血管外空间的任何细胞损失或颗粒损失，因为这些细胞能够使光散射，并相应地降低监测器的输出值。此外，还可将血红蛋白监测器与多种报警电路相联接，用来指明需要操作者注意的地方。可以把压力传感器接到类似的报警系统中，或是压力传感器本身就具有一种报警系统。血红蛋白监测器和压力传感器可以与一个控制器相联接，并用来关停闭合循环系统的一个或多个泵。优选的是利用可检测60份血浆中的1份积压红细胞的血红蛋白光学监测器来检测再循环线路的血液损失。优选地，该检测方法应即能检测完整的红细胞，又能检测特定量的完全溶血的细胞。
此外还可以在系统配置中添加一种动静脉瘘，这样就无需使用与动脉管道64连接的泵。另外还可将结构修改成适于用单个针头进行接入，方法是在生物反应器2的任一端添加一个贮器，同时在回流线路上加一个血液泵。在确定本发明所述装置的操纵方法时，采用的是常规的医疗操作，普通技术人员即能够很好地掌握设备的装配方法。简单地说，负责设备装配的操作者需要将管道组86接在控制部件88上，并将泵头正确地拧入泵66和78(如果存在)，将压力监控管与压力监测器74(如果存在)相联接，设置适合于起动模式的报警设定值，在抗凝剂(如肝素)注射器68中装满规定剂量的肝素，并将肝素注射器68与管道72相联接，再用控制部件88控制肝素注射器68，并将起动液加入动脉管64。起动液可以是一般的生理盐水。
对血液接入而言，负责该操作的医生需要确定适当的程序，并实施血液接入的操作。该操作必须要以上文所述的流速来输送血液，这是实现对受试者的预定治疗效果所必需的。接入的血液需要如上所述用肝素等进行适当的抗凝处理。本发明所述装置的工作原理要求某些血载物质能够不受阻碍地进入装有微器官培养体的灌注室，并可同样由微器官培养体进入血液。应该避免由抗凝作用不足而导致这种运载能力受损的情况出现。在循环开始时，应特别注意准备过程中出现接入口内郁积而导致凝集的问题。
首先应连接受试者接入线路，如动脉管64。将起动液引入动脉管64，其速率需足以确保回流管76和回流线路联接中没有残存空气。联接完毕后中断起动液的流动，使医生能够监控管道，以确保联接处不存在非容许数量的空气。然后联接动脉管64。
开始操作时，将泵66起动。松开静脉管76上的夹子，并注入肝素。检查压力监控室的读数，并在必要时进行调整。继续操作时，操作者和助理人员应定期检查装置的渗漏情况、旁路管道组的血细胞聚集情况以及监测室的读数是否正常。监测室的读数若与额定值的差异大于0.5cm，就需要重新调整，其中额定值为滴注室的50％或更高。经常调整监测室的给定值会促使操作者去充分检查管道的细微渗漏情况。另外还应监测注射器68的抗凝剂剩余量，并在适当情况下进行更换。
当需要结束操作并拆卸装置时，可依次终止泵66和肝素注射，然后夹紧动脉管64。利用流体或空气置换方法使系统中剩余的血液返回受试者，然后夹紧静脉管76。此时可以将控制部件88与联接的管道组86以及治疗装置从重症监护室或使用区移走。
上文的叙述以本发明的装置和方法为重点。以下则是成功制备可用于本发明所述装置和方法的微器官培养体的实例，以及在体内使用本发明所述装置的实例。这些实例只是用于说明，而不作为限制。
如下文说明性实施例所述，分离自肝脏的微器官培养体已在培养基中培育长达48天。但将培养体维持多于48天的情况亦处在本发明的范围内。
构成本发明所述实施方案的装置和方法不但可采用上文所述以及图1、2、3、4和17所示的配置方式，也可均采用能够移植于体内的配置方式。在那些可移植于体内的配置方式中，血液必须流经的小室4的主壁是由生物相容性半透膜构成。这种膜有利于血液成分扩散到小室中，也有利于器官分泌物扩散到小室外，并且在植入受试者后可通过血管重新生成作用而被血管化。这些新血管可以为小室中的MCs提供血液，也可以使分泌物或代谢物返回受试者。
如果将微器官培养体与来自一种细胞悬浮液的细胞共培养以形成一种连续平面器官，即可提高构成本发明所述实施方案的装置和方法的效率。来自细胞悬浮液的细胞与MCs之间的相互作用会使来自细胞悬浮液的细胞发生一定程度的组织化。
作为不限制本发明范围的实例，细胞悬浮液可来源于一种干细胞群体。这些干细胞可以是，例如，全能性胚胎干细胞，它们对微器官的微环境产生应答的可能性很高，因而可掺入平面器官而成为其组成部分，并且可发生分化。这些干细胞可以是，例如，骨髓干细胞、神经干细胞或其它任何有多种分化方向的干细胞，这些干细胞的分化方向取决于其微环境中的信号。这些部分组织化的细胞可补充MC的功能，并且可提高装置的整体活性。
由于器官衰竭的紧迫性和医疗突发事件的不可预测性，有利的做法是提前制备MCs并大量储备，以供后期使用。根据本发明的特定实施方案，可将微器官培养体冷冻保存，并在使用前融解。在下文的实施例中将提供相关的实验数据。
在MC的制备、操作和保存过程中，器官片承受的压力会导致其结构受损，这会限制MC的功能，因此本发明提供将器官和器官片不经培养而直接冷冻保存的特定实施方案。根据这些实施方案，可将完整器官或器官的一部分冷冻保存，然后冷冻切片至厚度约为200-400或450微米，用于形成微器官。冷冻的MCs可继续保存，直至使用，也可立即融解并使用。
该方法可确保组织和细胞在切片过程中承受的压力最小，并允许将组织精确切至所需的厚度。
利用该领域普通技术人员所了解的多种方法均可将器官或器官的一部分冷冻保存。有一种制备冷冻保存器官的方法，作为非限制性实例，其步骤包括(a)用一种冷冻保存液对器官进行体内灌注，使器官内的血液被置换成该冷冻保存液；(b)将器官由动物转移到一种含有冷冻保存液的小室中；(c)将器官的一部分冷冻；并且(d)在冷冻后将冷冻部分切割成适当大小的切片。
该领域普遍了解的任何常规冷冻保存技术均可用来进行冷冻。作为不限制本发明范围的实例，冷冻保存液可以是含有约5-30％DMSO(二甲亚砜)的诸如DMEM等适当培养基。培养基中还可添加海藻糖、葡糖以及该领域已知的其它添加剂。器官或器官的一部分可逐渐冷却或快速冷却，直至组织达到0℃以下的冷冻温度，更优选的是达到-70--100℃，最优选的则是达到约-160℃。逐渐冷冻至-160℃的最简单方法是将器官或其部分或器官切片以受控方式逐渐浸没在液氨中。
为了由器官的冷冻部分制备出微器官，可利用适当方法将冷冻后的完整器官修整成适当大小的片段。作为选择，也可以将冷冻前的器官修整成适当大小的片段，方法是直接由供体获得器官片段，或是由供体取出器官后再将器官切成片段。
片段的大小可根据器官来源、预定用途以及随后将其制备成MCs的方法而有所不同。作为不限制本发明范围的实例，可将来源于完整器官的肝脏或肾脏片段切成长度和厚度均约为1/2至数厘米的矩形方块。保持这些片段的冷冻状态，并将其转移到适当的冷冻切片装置中，利用该装置将片段制成厚度约200-400或450微米的切片，同时保持组织的冷冻保存状态。适当的冷冻切片装置可包括，但不必局限于，诸如低温切片机或冷冻切片机等该领域已知的装置。传统的低温切片机需进行改造，使其具有适当的夹具来固定器官/器官片段，从而使装置能够切出厚度约为200-400或450微米的切片。由于低温切片机一般是用来制备组织学检查使用的更薄的切片，因而进行这种改造十分必要。
利用上述方法由器官或器官片段获得的外植块的长度约为1/2至数厘米，厚度约为1/2至数厘米，宽度约为200-400或450微米，这种外植块可作为单个微器官。由于微器官在制备过程中始终保持冷冻状态，因而可将其贮存或立即使用。贮存时可使用该领域普通技术人员所了解的一种适当装置，如液氮瓶或Revco超低温冰箱。
上文主要以肝脏为例，但本发明的优选实施方案还包括肾MC装置和方法，以及肝与肾MCs均使用的装置和方法。其它器官也可以使用。
由于肾脏的一个重要功能是将尿素等小分子排泄出体外，因此本发明还提供一种利用装置中添加的透析部件来实现这种功能的实施方案。
参考图17，该实施方案显示一种装置112，该装置在充满血浆116的半透膜110中含有微器官102。在装置的外壁112内有一种贮器，可贮存流经该装置的受试者血液。在该装置的如图所示的体外实施方案中，血液可由装置112的一端管道104进入，由另一端管道106离开。结构的完整性由硅垫片116和聚碳酸酯板119来维持。用弹力夹(未画出)将整个装置合成一体。透析作用是由含透析溶液124的透析室122来完成，由于透析室122紧靠半透膜110，所以可吸收由微器官102分泌到血浆116中并向外扩散过半透膜110的小分子。利用能够与透析室122传递流体的管道126和128可不间断地或定期地更换透析溶液124。
通过下文的非限制性实施例，该领域的普通技术人员将了解本发明的其它目的、优势和新特点。此外，上文所述的以及下文权利要求部分申请专利保护的本发明的每个不同的实施方案和方面都可在下文实施例中找到实验证据的支持。
                           实施例
以下实施例可供参考，这些实施例将与上文的叙述一同来对本发明进行说明。
一般而言，文中使用的术语和下文有关重组DNA技术的实验方法均是该领域所熟知并经常使用的。克隆、DNA与RNA的分离、扩增和纯化均采用常规技术。涉及诸如DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切酶等的酶反应一般是根据产品说明书来进行。这些技术以及其它不同的技术一般都按照Sambrook et al.，分子克隆实验手册，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)来实施。以下将该手册称为“Sambrook”。书中提供了其它的一般参考文献。其中的方法被认为是该领域众所周知的，并且以方便读者的形式提供。其中包含的所有信息均在此引入作为参考。
以下是在下文实施例所述实验中使用的材料与方法，仅供参考。
                       材料与方法用于微器官培养体的外植体：
可分离出能够在本发明所述装置中使用的肝微器官培养体或肾微器官培养体的动物包括，例如，人和其它灵长类动物、猪，例如完全或部分近亲繁殖的猪(如微型猪和转基因猪)，以及啮齿动物等。肝组织可来源于同种异体的肝脏组织，如不适于移植但仍含有存活肝细胞的人类肝脏的小叶。
也可使用异种异体的器官，其中包括，但不局限于，牛和山羊的器官，优选的则是猪的器官。尽管长期暴露于异种抗原会引起免疫反应，但从短期来看，由于可避免受试者的血液细胞与肝微器官培养体相接触，因而免疫应答在最初的临床体验中并不是一个问题。培养基：
有多种组织培养基可用于动物细胞的培养。其中有复合型的，也有简单的。器官的微器官培养体可在复合培养基中生长，也可在诸如Dulbecco’s基本培养基等简单培养基中维持。此外，尽管培养体可在含有血清或其它生物提取物的培养基中生长，但血清或任何其它生物提取物都不是必需的(例如，参考美国专利申请08/482,364)。而且器官培养体可在不含血清的条件下维持很长一段时间。因此，在体外维持培养体的过程中，培养基内不必含有生长因子。
但也可通过添加这些因子或将其它特定细胞接种到培养体内来促进、改变或调节培养体细胞的增殖和成熟。这些因子包括，但不必局限于，胰岛素、生长激素、促生长因子、集落刺激因子、促红细胞生成素、表皮生长因子、肝红细胞生成因子(肝促红素)，以及肝细胞生长因子、前列腺素、白介素和天然的生长抑制因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子-β家族的成员、肝细胞以及肾细胞。培养小室：
微器官培养体可维持在任何适当的培养小室中，并且可维持在37℃和5％CO2的条件下。可将培养物进行振荡以促进通气。培养小室通常可以是任何材料和(或)形状。有多种不同的材料可用来制成小室，其中包括，但不局限于：尼龙(聚酰胺)、涤纶(聚酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸脂、聚乙烯化合物(如聚氯乙烯)、聚碳酸酯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE、特氟隆)、thermanox(TPX)、硝酸纤维素、棉花、聚乙醇酸(PGA)、肠线缝线、纤维素、明胶、葡聚糖等。这些材料中的任何一种都可编制成网。
若要长时间维持培养体或是将其冷冻保存，优选的是使用诸如尼龙、涤纶、聚苯乙烯、聚丙烯酸脂、乙烯类聚合物、特氟隆、棉花等非降解性材料。可按本发明使用的一种适当的尼龙网为Nitex，它是一种平均孔径210微米、尼龙纤维平均直径90微米的尼龙滤网(#3-210/36，Tetko，Inc.，N.Y.)。微器官的制备：
肾脏或肝脏基本可取自适当的正常供体动物(在下文实施例中为大鼠或小鼠)。对小型啮齿动物而言，可将肾脏沿中线切成大致相等的两半。对大型动物和人类而言，可沿中线切成厚度各约1-5cm的适当大小的数块。然后用传统的组织刀沿中线或横向切成厚度约300微米的外植块。然后按以下各实施例所述对所得MCs进行体外培养、来自体内灌注和体内灌注。基本实施方案：
本发明的基本实施方案，以下称为基本装置，须满足两条很特定的标准：(i)MCs与待修饰流体之间的接触面积最大；以及(ii)流体量最小。该基本装置的制备方法如下：将微器官彼此相邻地铺在5×25cm的聚碳酸酯片上，使MCs将125cm2的整个区域覆盖。这需要约3.5克肝脏(约相当于300-350g大鼠的肝脏总质量的30-40％)。该基本实施方案如图1B所示，其描述见上文。用另一张相同尺寸的聚碳酸酯片覆盖MCs(组合件A)。将整个组合件A装到5.5×25.5cm的扁平尼龙袋中则构成小室4。两端分别插上P90聚丙烯管6和24，再用热封机将两端密封。下文实施例15、16和17的实验均使用本发明的该基本装置。免疫隔离实施方案：
本发明的免疫隔离实施方案，以下称为免疫隔离装置(见图2A)，是基本装置的改进形式，该装置将其中包含的MCs密封在半透膜30中，使血浆能够穿膜与MCs接触，同时防止血细胞发生这种接触。该装置基本上可利用血液将相同浓度的氧气输送到每个MC的所有表面细胞，无论是在装置的入口处还是出口处。只有在氧气穿过300微米厚的MCs时才会形成浓度梯度。由于红细胞与MCs之间只隔有一层膜，所以该免疫隔离装置还可进行实时血浆过滤，以促使红细胞紧邻MCs，并在数微米，而不是数毫米，的短距离条件下发生血浆分离。因此，MCs并不直接与血液接触，而是只与血浆接触。在此将对该实施方案做详细描述。为了将该装置与动物或患者联接，可利用蠕动泵从髂动脉吸出血液。在生物反应器内，血浆可滤过半透膜30而被微器官中的细胞处理。处理过的血浆不断扩散出去，并再次进入半透膜30周围的血液，但仍处在该装置的小室4中。用另一个蠕动泵从该装置的小室中吸出血液，并使其返回被治疗受试者的颈静脉。下文实施例20的实验采用本发明的该实施方案。
免疫隔离装置须满足几个很特定的标准：(i)MCs与待修饰流体之间的接触面积最大；(ii)流体量最小；(iii)MCs的两个大表面均与流体接触；(iv)由血液实时分离血浆，以确保运输氧气的是紧邻MCs的血液中的最有效载体，即血红蛋白。透析免疫隔离实施方案：
图17显示的透析免疫隔离实施方案，以下称为透析免疫隔离装置，是免疫隔离装置的改进形式。它具有免疫隔离装置的所有特征，此外还在含血液室108内插有一种常用于血液透析的透析部件122，因而可对含血浆室110中的血浆进行透析。在附加实施方案中，如图所示，透析部件122的放置方法使其能够对血液108和血浆116都进行透析。透析部件122充满了常用于血液透析的透析溶液124。通过将附加管道126和128与分离的蠕动泵(未画出)相连可不断地更换透析溶液。作为选择，也可通过定期冲洗所述附加管道来更换透析溶液。这种配置可将相同浓度的氧气输送到每个MC的所有表面细胞，无论是在装置的入口处还是出口处。只有在氧气穿过300微米厚的MCs时才会形成浓度梯度。该装置还可进行实时血浆过滤，因此MCs102并不直接与血液108接触，而是只与血浆116接触。该装置通过管道104和106与动物联接。由两个蠕动泵驱动的附加回路可促使透析液进入该装置的透析部件122。透析液在进入该装置前可流经一种能够调节气体、葡糖和小分子的小小室。该透析免疫隔离装置须满足几个很特定的标准：(i)MCs与待修饰流体之间的接触面积最大；(ii)流体量最小；(iii)MCs的两个大表面均与流体接触；(iv)由血液实时分离血浆，以确保运输氧气的是紧邻MCs的血液中的最有效载体，即血红蛋白；以及(v)添加透析部件后，有可能利用扩散过小孔透析膜的方法来调节气体和小分子的浓度。下文实施例18和19的实验采用本发明的该实施方案。
                     实验结果
下文实施例1-13和21-26涉及对只含肝组织的MCs的实验。实施例1-12、22、23和26叙述对只含肝组织的MCs的体外实验。实施例13、21、24和25涉及活体血液对肝MCs的体外灌注。实施例14-20涉及与肾MCs有关的实验。实施例17演示了肾MCs与肝MCs在同一装置中的应用。实施例20涉及来自某一物种但与另一物种或受试者联接的MCs的应用。实施例14-17叙述的是体外实验。实施例18-20叙述活体血液对MCs的灌注。实施例27-30则对本发明及其优势和应用做进一步的详述。
                      实施例1
                肝微器官培养体的制备
小鼠肝微器官培养体的制备方法如下。取出器官并用解剖刀切成宽2mm、长3mm的适当片段，再用组织刀或其它适当的切割方法切成厚300微米的切片。将这些微器官放在24孔微量滴定板中，然后置于5％CO2及37℃条件下的不含胎牛血清(FCS)的400ml Dullbeco’s基本培养基(DMEM)中，并以12rpm的速度持续振荡1-8天。每孔培育20个微型外植块。
                      实施例2
             肝微器官培养体的细胞增殖测定
将几个小鼠器官切成微器官培养体，并利用实施例1的微器官细胞培养技术在37℃增湿培养箱中进行无血清培养。细胞分裂的评定是利用标准方案(Kobayashi，et al.(1994)，J Biomater Sci Polym Ed6(4)：325-42)对掺入的氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷进行测量。其结果说明在培养期间可进行DNA合成(图5)。另外还按实施例1所述将小鼠肝微器官培养体培育14天，并用溴脱氧尿苷脉冲标记4小时，然后固定，并用抗溴脱氧尿苷的荧光抗体进行染色，以标记有丝分裂的细胞核(Sigma Chemical)。在这些培养体中观测到DNA合成十分活跃的细胞核(数据未显示)。该结果说明MCs可在体外长期存活，并能够来自体内增殖。
                      实施例3
       微器官培养体中的小鼠肝细胞可产生白蛋白
白蛋白分泌及尿素产量的测定结果(见图6)显示，在实施例1的微器官培养体中生长的小鼠原始肝细胞至少可将功能维持4周。ELISA和比色法的测试结果都说明微器官培养体中的小鼠肝细胞可产生较大量的白蛋白(试剂盒No631，Sigma Chem.Co.St.Louis MO)。下文的直方图显示每106个细胞每小时产生的白蛋白量。应该指出的是，甚至在培养一个月后，白蛋白的产率仍然很高，与另两种传统培养条件相比则尤其明显。A是取自Nyberg et al.(Cell Transplant，2：441-52)的数据，B是取自Shatford et al.(J.Surg.Res.，53：549-57，1992)的数据。此结果说明肝MCs可长时间维持重要的生理功能。
                     实施例4
       小鼠肝微器官培养体中氨向尿素的转化
分离小鼠肝脏，并利用实施例1的微器官细胞培养技术进行无血清或无外源生长因子的体外培养。利用Urea-Nkit No 640-A(Sigma Chem.Co.St.Louis MO)以标准比色法测量上清液中的尿素和氨含量。图7所示数据说明，微器官培养体中的小鼠肝细胞甚至在培养48天后仍可产生大量尿素。相比之下，Dixit et al.(Transplantation，55：616-22)报道的微囊密封的体外大鼠肝细胞在培养1天后的尿素合成值为14.6mg/小时/百万细胞，培养10天后的值则为11.7mg/小时/百万细胞。该结果说明肝MCs可长时间维持重要的生理功能。
                      实施例5
     人类肝微器官培养体可长期地将大量氨转化成尿素
人类肝微器官培养体的制备方法如下。将楔形的人类活体肝脏制成块。再将肝脏块切成宽2mm、长3mm的适当大小，然后用组织刀切成厚300微米的切片。将这些切片放在24孔微量滴定板中，其中加有0.4ml含或不含胎牛血清(FCS)的DMEM，然后在5％CO2及37℃条件下以12rpm的速度持续振荡。每孔培育20个微型外植块。每两天更换培养基，并取样进行尿素和氨含量测定。图8显示分泌到培养基中的任意单位的尿素量，其数值相当于10-25微克尿素/小时/百万细胞。
人每天可产生11.2克尿素，而人类肝脏中至少有1011个肝细胞。因此，人类肝细胞的体内尿素产量约为5mg/小时/百万细胞。可以看出，人类肝微器官培养体可在体外将氨转化成尿素，其速率即使不高于正常的体内肝细胞，也是大致相等。
                      实施例6
        人类肝微器官培养体具有代谢活性
按实施例5所述制备人类肝微器官培养体。培养的肝MCs能够将氨转化成尿素。结果显示于图9。该结果说明在本发明的培养条件下至少可将人类器官的重要生理功能维持6天。
                      实施例7
     冷冻保存的肝微器官培养体培育在37℃时仍具有功能
按实施例1所述制备小鼠肝微器官培养体，并在10％DMSO中逐渐冷冻至-80℃，然后转移至液氮。几天后，将微器官培养体快速融解，清洗，并在10％FCS中培养几天。然后进行氨向尿素转化的能力测定，其结果说明微器官培养体中的肝细胞仍可存活，并能够发挥功能，甚至在培养数天后也是如此。测定结果显示于图10，这些结果与培养在类似条件下的新鲜微器官培养体的测定结果有可比性。这说明提前制备和保存鼠MCs以供后期使用的方法是可行的。
                      实施例8
  冷冻保存的人类肝微器官培养体培育在37℃时仍具有功能
按实施例5所述制备人类肝微器官培养体，并在10％DMSO中逐渐冷冻至-80℃，然后转移至液氮。几天后，将微器官培养体快速融解，清洗，并在10％FCS中培养几天。然后进行氨向尿素转化的能力测定，图11显示的测量结果说明微器官培养体中的肝细胞仍可存活，并能够发挥功能，甚至在培养数天后也是如此。这些结果与培养在类似条件下的新鲜微器官培养体的测定结果有可比性。这说明提前制备和保存人以供后期使用的方法是可行的。
                       实施例9
     封装在藻酸盐片中的肝微器官培养体具有代谢活性
按实施例1所述制备小鼠肝微器官培养体。将其中的一半封装在藻酸盐薄片(厚度约400微米)中。在含有10％FCS的DMEM中将藻酸盐片封装的微器官培养体来自体内培养12天。每两天更换培养基，并取样进行尿素和氨含量测定。图12显示分泌到培养基中的任意单位的尿素量，其数值相当于10-15微克尿素/小时/百万细胞。左边为单独的微器官培养体，右边为藻酸盐片中的微器官培养体。该结果说明封装的方法是可行的，当需要在医疗应用过程中将MCs取出人类患者时，此方法可作为潜在的重要考虑因素。
                      实施例10
   培育在100％胎牛血清中的小鼠肝微器官培养体仍具有功能
按实施例1所述制备小鼠肝微器官培养体。其中的一半在DMEM和10％FCS中培育5天(左)，另一半在100％FCS中培育5天(右)。每两天更换培养基，并取样进行氨和尿素含量测定。结果显示于图13，这些结果可证明，肝微器官培养体不但能在体外条件下良好地发挥功能，而且在更接近全血但经常对体外细胞产生毒性的100％血清中也是如此，所以这些结果具有特别的重要性。
                   实施例11
封装在平面藻酸盐片中冷冻并保存于-80℃然后再于37℃培育的
          大鼠肝微器官培养体仍具有代谢活性
按实施例1所述制备小鼠肝微器官培养体。将其中的一半封装在藻酸盐薄片(厚度约400微米)中。在10％DMSO中将微器官培养体和封装在藻酸盐片中的微器官培养体逐渐冷冻至-80℃，然后转移至液氮。几天后，将微器官培养体快速融解，清洗，并在10％FCS中培养几天。每两天更换培养基，并取样进行尿素和氨含量测定。图14显示分泌到培养基中的任意单位的尿素量(a)和白蛋白量(b)。该结果说明，先封装、再冷冻保存、然后融解并培养的MCs不会丧失生理功能。
                     实施例12
          确定肝微器官培养体的最佳厚度
小鼠肝微器官培养体的制备方法如下。用剪刀取出器官，并剪成宽2mm、长3mm的适当大小，然后用组织刀或其它适当的切割方法切成厚150-700微米不等的切片。将这些切片放在35mm培养皿中，其中加有2ml含10％胎牛血清(FCS)的F12培养基，然后在5％CO2及37℃条件下以12rpm的速度持续振荡3周。每个培养皿含有指定厚度的微器官培养体。每两天取一次样并进行常规组织学处理和尿素产量测定。此外还在培养6天后以1千万CFUs/ml的浓度用能够使lac-Z基因转录的腺衍生病毒构建体对微器官培养体进行转导(参考J.Clin.Invest.90：2598-2607，1992)。转导两周后取样，固定，并测定由重组β-半乳糖苷酶产生的β-gal含量。图16显示β-gal产量随厚度的变化。获得最大产量的450微米厚的微培养体器官。与此类似，在培养3周后进行的组织学及尿素产量测定的结果均说明，与150、300和700微米厚的微培养体器官相比，最理想的是450微米厚的微培养体器官。
                       实施例13含有封装在藻酸盐片中的肝微器官培养体的生物反应器可安全地与正
                  常活体大鼠相连接
通过右颈动脉和左颈静脉将大鼠与上述样机相联接。进行数小时的血液灌注。同时监测几种生化参数，其中当然包括整个动物的健康状况。利用蠕动泵将流经微器官培养体的血液重新引入颈静脉(见图15，为清晰起见，照片中的大鼠用轮廓表示)。在持续约8小时的实验过程中，该动物始终存活着。这说明用MCs来补充活体动物的肝脏功能的方法是可行的。
                    实施例14肾MCs可长期体外培养并能够在开始培养4天后被干扰的情况下对pH
                      进行调节
如上所述制备肾MCs，并将其培育在含有2mM谷氨酰胺的F-12中。培养4天后，用含有4mM谷氨酰胺和10mM HEPES的培养基更换培养体的F-12培养基。培养体的氨产量增加，甚至在实验开始8天后仍是如此(图20)。这说明微器官可长时间保持活力，并且还能维持内环境稳定，即调节pH水平。
                     实施例15
            肾MCs可在血液中良好地发挥功能
如上所述制备肾MCs，并在一种基本装置中(见上文“材料与方法”)无灌注培养4小时。与类似条件下的肝MCs相比，肾MCs中的尿素浓度随培养时间的延长而降低，氨浓度则增加(图19)。由于肝MCs和肾MCs均显示出该活性，所以此结果说明肝MCs中尿素浓度增加的观测结果是肝MC生理功能的表现，而不是培养系统的假象。
                      实施例16肾MCs适用于含有指定培养基、正常大鼠血以及肝切除动物血的来自
                     体内基本装置
如上所述制备肾MCs，并在正常动物血(+MC N)、肝切除动物血(+MCHEP)和含有2mM谷氨酰胺的F-12培养基(+MC MED)中培养5小时。作为基准，对含有相同培养基(-MC MED)或正常血(-MCN)但不含MCs的相同的基本装置(见上文的“材料与方法”)进行培养(图20A-E)。监测pH、碳酸盐离子浓度、O2饱和度和CO2饱和度随时间的变化值。肾MCs在培养基和正常动物血或肝切除动物血中能够同样良好地发挥功能。该结果进一步证明，肾MCs适用于补充活体动物的肾脏功能。
                      实施例17
     在基本装置中组合培养的肝与肾MCs可协同发挥功能
如上所述制备肾MCs。按前文所述制备肝MCs。方法基本上是，将正常成体大鼠的肝脏切成表面积为8mm×8mm的肝脏块。再用组织刀将组织块切成厚300微米的外植块。这样即获得8mm×8mm×0.3mm的肝MCs。在一种基本装置(见上文的“材料与方法”)中将肾MCs和肝MCs培养5小时，其比例与正常动物中的比例大致相等(即每1份肾用6份肝)。对含有正常动物血和肝切除动物血的该基本装置进行来自体内操作。随着培养时间的延长，pO2明显降低，而pCO2明显增加。尽管如此，在肾MCs的调节作用下，HCO3的浓度仍十分稳定(图21A-E)。这些结果说明混合使用MCs的装置是可行的。
                      实施例18肾MCs能够在与部分肾切除大鼠联接的一种透析免疫隔离装置中良好
                     地发挥功能
将一只大鼠的右肾完全切除，左肾70％切除。3小时后将其与包含透析室和小室的一种透析免疫隔离装置(见上文的“材料与方法”)相联接，所述小室中含有相当于该动物肾脏质量的30％的肾微器官。肾MCs的制备方法如上文所述。透析液为不含酚红但含有5％葡糖、30mg％/HCO3和1％葡聚糖的F12培养基。用16％O2、5％CO2与空气的混合物对透析液进行连续充气。如下表2所示，肾微器官在4个小时的总连接时间内始终具有生物活性。将处理后进入0期昏迷的大鼠移走。完成连接后，从生物反应器中取出MCs，提取RNA，并通过RT-PCR测定MCs的促红细胞生成素基因转录情况。在0时间与肾切除动物联接后，MCs能够以大致相同的水平连续转录促红细胞生成素。该结果进一步证明，肾MCs适用于补充活体动物的肾脏功能。
                  表2时间(小时)    动脉pO2  透析液pO2  生物反应器pO2
0          113.2                    73.9
1          103.4      159.3         100.8
2          102.6      151.2         110
4          112.6      147.1         114.3时间    动脉pCO2   透析液pCO2   生物反应器pCO20       35.5                         371       39.9         18.0            37.42       39.2         19.6            37.04       39.1         21.8            38.7时间    动脉葡糖    透析液葡糖    生物反应器葡糖0       96           -               972       114          106             744       103          112             87
                     实施例19装在透析免疫隔离装置中的肾MCs在与部分肾切除大鼠第二次联接后
                  仍可保持全部活性
24小时后，将实施例18的动物再次与实施例18的含有肾MCs的透析免疫隔离装置相联接。除使用2％葡聚糖溶液外，其余条件与上一实施例相同。动物进入0期昏迷即被释放，整个实验过程中的生理参数均正常。这说明制备24小时后的肾MCs是可以使用的。该结果进一步证明肾MCs适用于补充活体动物的肾脏功能。该结果说明，即使只定期地与动物相联接，肾MCs也同样适用于补充活体动物的肾脏功能。
                      实施例20装到一种免疫隔离装置中的猪肝MCs在与异种大鼠联接时可良好地发
                      挥功能
完全按照实施例17所述的相同条件制备猪肝MCs，只是组织的来源为猪的肝脏。将含有猪肝MCs的免疫隔离装置(见上文的“材料与方法”)与正常大鼠相联接。在该条件下处理的大鼠未显示出不良的副作用。此外，根据耗氧量和葡糖产量的测定结果判断，来源于猪肝的MCs比大鼠MCs更有活性。另外还发现，用猪MCs来处理大鼠也未对猪MCs产生不良影响。在零时间、在与正常大鼠联接的装置中使用4小时后，以及在F-12培养基中再体外培养18小时后对MCs进行MTT测定。这三种条件下测量的MTT活性水平都非常高，并且彼此之间难以区分。此外，在UV显微镜下检验吖啶橙掺入的结果显示，这三种情况下的细胞存活率都＞90％。
图25A-D显示，猪MCs至少在调节氧/二氧化碳压力平衡、碳酸盐离子浓度和葡糖浓度方面与大鼠MCs同样有效。在培养基和大鼠血清中都是如此。
这些结果表明，用猪肝脏对猪以外的其它哺乳动物进行处理是可行的。
                      实施例21
       肝MC装置可明显延长92％肝切除的大鼠的寿命
在受控体内实验中，用含有肝MC的本发明所述装置对12只肝切除大鼠进行处理(图22；已处理)。用不含MCs的装置在相同条件下对另外10只肝切除大鼠进行处理(图22；对照)。处理时间为4小时。处理完后将动物释放，并继续观察直至死亡。图22显示，利用含有MC的装置可将存活时间平均延长10个小时。该结果经t分布检验为有效结果(P＜0.05)。
                     实施例22
肝MCs在经连接至92％无肝大鼠的装置进行灌注期间和之后
能够以体内正常水平转录白蛋白和凝血因子IX及X的信使RNAs
肝MCs在对本发明的装置进行灌注后仍具有功能，并能够转录白蛋白和凝血因子IX与X的mRNA，其使用的RT-PCR方法如下。
逆转录的实现方法是，将1μg RNA(约10μl)、0.5μg Oligo-dT(1μl，Promega)和无RNase的H2O(总体积15μl)70℃保温5分钟。将混合物放在冰上冷却，然后添加以下成分：5μl RT缓冲液(Promega)、5μl dNTPs混合物(10mM，Promega)、20单位的RNAsin(Promega)和100单位的MLV-逆转录酶(Promega)。添加无RNase的H2O至终体积50μl。将反应体系置于42℃保温60分钟。
PCR扩增的方法是，制备含有2.5μl 10×反应缓冲液、0.2mMdNTPs、1.5mM MgCl2、2μl由RT反应获得的单链DNA、0.6mM(1μl)各种引物(上游引物和下游引物)、2.5单位(0.5μl)Taq DNA聚合酶(Promega)的混合物，并加H2O至终体积25μl。循环条件为：第1个循——94℃60秒，TM℃60秒和74℃5分钟；第2-34个循环——94℃45秒，TM℃60秒和74℃2分钟；最后一个循环——94℃60秒，TM℃60秒和74℃5分钟，其中TM为下文进一步详述的每对扩增引物的特征性解链温度。
反应采用以下扩增引物对。扩增白蛋白cDNA的678bp产物时使用TM为45℃的Alb1：5’-TGAACTGGCTGACTGCTGTG-3’(序列号：1)和Alb2：5’-CATCCTTGGCCTCAGCATAG-3’(序列号：2)。扩增凝血因子IX cDNA的821bp产物时使用TM为42℃的IX1：5’-TCTGT TGCCTACAATTCT-3’(序列号：3)和IX2：5’-TAGTATATATTCCATATT-3’(序列号：4)。扩增凝血因子X cDNA的1158bp产物时使用TM为46℃的X1：5’-ATAAAGAAAGGAAAT CTG-3’(序列号：5)和X2：5’-TCACAAAGTAGGTGTCTT-3’(序列号：6)。
在室温和100V条件下将所有PCR产物在0.5×TBE中进行1.5％琼脂糖凝胶(BRL)电泳。结果显示于图23。
在图23中，第1-4泳道显示由白蛋白mRNA的特异性引物产生的718bp条带。第6-9泳道显示由凝血因子IX mRNA的特异性引物产生的821bp条带。第11-14泳道显示由凝血因子X mRNA的特异性引物产生的1158bp条带。第5和第10泳道为分子量标准。
第1、6和11泳道的样品来自灌注前的第175号动物，第2、7和12泳道的样品来自灌注后4小时的同一动物。第3、8和13泳道的样品来自灌注前的第176B号动物，第4、9和14泳道的样品来自灌注后4小时的同一动物。这两只动物在灌注后均可转录所有3种肝脏基因，说明肝MCs可在灌注过程中维持其复杂的生理功能。
                    实施例23
           对利多卡因消耗量的测定结果说明
   来自体内培养在受控条件下的MCs可显示出P450功能
对来自体内培养的MCs进行利多卡因代谢测定，作为其肝脏功能的另一种指标(图24)。培养基中的利多卡因浓度持续下降了30个小时，说明微器官培养体的肝细胞具有摄取利多卡因的P450功能。
实验采用以下材料。DMEM培养基；HEPES；青霉素-链霉素溶液(10,000单位，10mg/ml)购买于Biological Industries Ltd.，Israel。甘氨酸；葡糖；谷氨酰胺；胰岛素；皮质醇购买于Sigma Israel。利多卡因(Esracain2％盐酸利多卡因，200mg/ml)购买于MedicalLaboratories Ltd.，Israel。
在补加有2mM谷氨酰胺、10mM HEPES、1/500(体积比)的抗生素溶液；3mM甘氨酸；2克/升(重量体积比)的葡糖；1mg/％(重量体积比)胰岛素；7.5μg/ml皮质醇的每毫升DMEM培养基(无酚红)中放4个Lewis大鼠肝MCs，开始培养时将80μg/ml(重量体积比)的利多卡因添加到培养基中，然后在37℃和5％CO2/95％空气的增湿培养箱(FormaScientific)中培养48小时。在下文所述的时间点取100μl培养基样品至微量离心管中，2,000rpm离心，然后保存于-20℃，直至利用荧光偏振免疫测定法进行TDx/TDxFLx利多卡因测定，测定采用商品化试剂和Pape B.E.et al；Clinical Chemistry24(11)：2020-2922，1978的方法。结果总结于下表3。
                        表3
              时间(小时)    盐酸利多卡因μg/ml
T0-10.50 AM      0               62.2
T1-18hr PM       7.1             33.9
T2-11hr AM       24.1            23.7
T3-17hr PM       30.1            20.9
                     实施例24
含有MC的装置可避免与其连接的无肝大鼠恶化达13小时
当无肝大鼠与含有肝MCs的本发明所述装置连接时，可以从II期昏迷恢复到I期昏迷，甚至可恢复到0期。这些大鼠在长达13个小时的整个灌注期内始终保持在该昏迷期。这些结果说明，本发明在肝衰竭病例中具有潜在的临床实用性。
                     实施例25
            冷冻保存后的肝MCs仍可恢复功能
配制并测试一系列不同的冷冻保存液(表4)。用MTT和吖啶橙染色法评定冷冻保存72小时并融解后的细胞活力(图26A和B)。根据这些标准来判断，最有效的是含有20％DMSO和100mM海藻糖的溶液(S4)，因而将其应用于其它研究。由二氧化碳产量、耗氧量、pH调节和葡糖产量的来自体内测试结果发现，冷冻保存的MCs表现出与新制备的MCs类似的性能(图27A-D)。
表4：MC的冷冻保存条件的优化*：
例1(S1)：20％EMSO
例2(S2)：20％甘油
例3(S3)：10％DMSO，10％甘油
例4(S4)：20％DMSO，100mM海藻糖
例5(S5)：20％甘油，100mM海藻糖
例6(S6)：10％DMSO，10％甘油，100mM海藻糖
*在液氮中将S1-S6各溶液中的肝MCs冷冻72小时。
这些冷冻保存方法具有重要意义，原因有三点。第一，这些方法允许用中央设施来制备MCs。可以制备出大批MCs并将其冷冻保存。在销售和使用前可由每批抽样融解并测试性能。
第二，可在1个小时之内将保存在液氮中的MCs安装到功能性生物装置中。这一点对处理急性器官衰竭患者而言至关重要。
第三，利用这种方式可将用于移植但仍未移植的供体人类器官无限期保存，以供后期使用。将这种方法与上文所述的免疫隔离装置协同使用可帮助消除器官排斥的问题，并且可提高供体器官的实际使用百分率。
                     实施例26
                肝平面器官的制备
由转基因Rosa26小鼠(参考Kennedy et al.(1997)Blood，1，90(3)：986-93)获得可通过组成型启动子表达β-半乳糖苷酶的原始肝脏间充质细胞。将表达转基因β-半乳糖苷酶的细胞植入MCs，然后可利用简单的比色反应来鉴别这些细胞。
将转基因间充质细胞植入原生肝MCs中，并进一步保温在适当条件下。如图28所示，MCs中掺入了转基因细胞(蓝色)。该结果论证了将多个掺有间充质细胞的MCs结合成平面器官的可能性。
                      实施例27
   冷冻微器官表现出能与新鲜微器官一样良好地发挥功能
通过4项实验来评定冷冻微器官相对于新鲜微器官的功能性。按本发明所述制备冷冻微器官。用改进的Krebs溶液和MEM-α溶液对大鼠肝脏进行灌注。分离出肝小叶并切成0.8cm的小块。将肝脏块在冰上放30分钟，然后转移至-15℃。用Leitz低温切片机在-15℃的温度下将冷冻块切成300微米的切片。然后将切片转到冰上，放置30分钟，再用液氮以缓慢冷冻的方法(-1℃/分钟)进行冷冻。然后迅速浸没在含有10％胎牛血清的37℃DMEM中(每ml放4个MCs)使切片融解，然后培养在37℃。同时并行制备和培养新鲜微器官以作为对照。所有在培养皿中进行的实验都是每4片MCs使用1ml FCS。
第一项实验(表5)是在培养皿中培育由冷冻保存组织获得的冷冻保存的MCs。第二项实验(表6)是在图17所述的装置中培育由冷冻保存组织获得的冷冻保存的MCs。第三项实验(图7)是在标准培养皿中培育由新鲜组织获得的冷冻保存的MCs。第四项实验(表8)则是在标准培养皿中培育由新鲜组织获得的新鲜的MCs。在这四种实验设置条件下分别对下文表5-8所示的几种象征肝脏功能的因素进行监测。在这四种不同的实验条件下，MC的功能未表现出明显的整体变化。
                                              表5
 时间(hours)  #  MTT(％)  吖啶橙(％)  葡糖(mg％)  白蛋白(gr/L)  乳酸酯(mg/dl)  胆酸(μmol/L)  Urea(mg/dl)  氨(o.d)
 0  1  100  80  95  3.677  230  18.6  180  0.077
 0  2  100  100  104  3.677  230  18.6  169  0.07
 2  3  100  100  190  3.453  160  61.8  148  0.08
 2  4  100  100  181  3.358  145  25.7  181  0.085
 4  5  100  100  293  4.315  163  145  0.09
 4  6  80  100  236  4.1  147  38.7  128  0.062
 7  7  80  100  473  4.8  208  48.8  170  0.126
 7  8  80  80  290  4.4  126  49.8  153  0.11
                                             表6
 时间(hours)  #  MTT(％)  吖啶橙(％)  葡糖(mg％)  白蛋白(gr/L)  乳酸酯(mg/dl)  胆酸(μmol/L)  Urea(mg/dl)  氨(o.d)
 0  9  100  100  98  4  230  17.6  212  0.09
 0  10  100  100  101  4.09  235  13.6  222  0.09
 2  11  100  100  170  4.156  142  1.56  213  0.103
 2  12  80  100  142  4.06  150  171  0.055
 4  13  80  100  197  3.964  145  6.6  192  0.084
 4  14  100  100  136  4.09  142  8.6  200  0.088
 7  15  80  50  274  4.124  138  14.6  161  0.105
 7  16  80  50  154  4.538  153  14.6  192  0.114
                                             表7
 时间(hours)  #  MTT(％) 吖啶橙(％) 葡糖(mg％)  白蛋白(gr/L)  乳酸酯(mg/dl) 胆酸(μmol/L)  Urea(mg/dl)  氨(o.d)
 0  17  100 100 97  3.86  186  54.8  170  0.0865
 0  18  100 100 108  3.83  198  56.8  189  0.0475
 2  19  100 100 209  3.77  135  111  147  0.07
 2  20  100 50 201  3.74  156  64.8  189  0.087
 4  21  100 100 354  4.123  130  97  176  0.0875
 4  22  100 100 289  4.25  120  8.6  160  0.115
 7  23  100 100 451  4.983  117  4.6  174  0.119
 7  24  100 100 418  7.826  135  4.6  155  0.098
                                                   表8
 时间(hours)  #  MTT(％) 吖啶橙(％) 葡糖(mg％) 白蛋白(gr/L)  乳酸酯(mg/dl) 胆酸(μmol/L)  Urea(mg/dl)  氨(o.d)
 0  124  100 50  75  2.57  272  189  0.075
 0  125  100 50  79  3.3  286  199  0.0655
 2  126  100 100  290  2.8  272  180  0.06
 2  127  100 80  297  1.95  273  169  0.0975
 4  128  100 50  378  2.7  244  207  0.0655
 4  129  100 50  478  293  190  0.0675
 Overnight  130  80 50  High  3.4  302  199  0.114
                    实施例28移植到大鼠体内48小时后的肾MCs可表达凝乳酶、Epo及T-PA的mRNA
按上文所述制备肾MCs，并移植到大鼠的腹膜腔内。48小时后取出肾MCs，利用RT-PCR分析凝乳酶、Epo和T-PA mRNAs的表达情况，并与时间计算起点时肾MCs中这些mRNAs的表达情况进行比较。
逆转录的实现方法是，将1μg RNA(约10μl)、0.5μg Oligo-dT(1μl，Promega)和无RNase的H2O(总体积15μl)70℃保温5分钟。将混合物放在冰上冷却，然后添加以下成分：5μl RT缓冲液(Promega)、5μl dNTPs混合物(10mM，Promega)、20单位的RNAsin(Promega)和100单位的MLV-逆转录酶(Promega)。添加无RNase的H2O至终体积50μl。将反应体系置于42℃保温60分钟。
PCR扩增的方法是，制备含有2.5μl 10×反应缓冲液、0.2mMdNTPs、1.5mM MgCl2、2μl由RT反应获得的单链DNA、0.6mM(1μl)各种引物(上游引物和下游引物)、2.5单位(0.5μl)Taq DNA聚合酶(Promega)的混合物，并加H2O至终体积25μl。循环条件为：94℃45秒，54℃ 60秒和74℃2分钟。
反应采用以下扩增引物对。扩增凝乳酶cDNA的657bp产物时使用Rennin1：5’-GCTTTG GACGAATCTTGC-3’(序列号：7)和Rennin2：5’-AATGTTGAGGGTCACTGC-3’(序列号：8)。扩增Epo cDNA的325bp产物时使用Epo1：5’-ACCACTCCCAACCCTCATCAA-3’(序列号：9)和Epo2：5’-CGTCCAGCACCCCGTAAATAG-3’(序列号：10)。扩增T-PA cDNA的493bp产物时使用T-PA1：5’-GCAGAAAATGGGGCTGAA-3’(序列号：11)和T-PA2：5’-GTTTGTATTGCCTCAGGC-3’(序列号：12)。
在室温和100V条件下将所有PCR产物在0.5×TBE中进行1.5％琼脂糖凝胶(BRL)电泳。结果显示于图29。由图可见，48小时后的凝乳酶含量增加，而促红细胞生成素和T-PA的含量降低。
                      实施例30
  与肝-肾装置相联接的无肝动物可表现出几乎正常的性能
通过Lewis大鼠(体重241克)的髂静脉和颈动脉将其与一种同时含有肾MCs和肝MCs的本发明所述体外装置相联接。利用已预先经过70％乙醇、生理盐水和含有200单位肝素的生理盐水清洗的Harvard泵使大鼠的血液以0.5ml/分钟的速度流经该装置。该装置包含一种夹层状的0.2μm聚碳酸酯膜，其间共含有9.7克肝MCs、0.5克肾MCs和13ml含有供体大鼠血液的培养基。用含有5％CO2的空气对含有95ml血溶胶、5ml 5.88％HCO3、280mg％葡糖、和4％葡聚糖的培养基进行饱和充气，并在培养基中添加抗生素和Hepes缓冲液。3天后将大鼠的肝脏切除(取出3.05克肝脏)。与装置相联接的大鼠在肝切除35小时后进入I期昏迷。不进行通气。死后检验的结果显示未出现腹部大量出血。脾脏、肾脏和胰脏看上去很正常。大鼠呈黄色，其尿液亦呈黄色。按下文表9所述在肝切除后的前5小时内取样并进行分析。肝切除2小时后将8μl维生素K和0.4ml 25％甘露醇注入大鼠。
因此，每小时取4份样品，并对每份样品的血细胞比容(Htc)、pH、pCO2、pO2、碳酸氢盐(HCO3 mM)以及葡糖进行测定。样品则来源于进入装置的动脉血(Art)、离开装置的血液(Bio)、进入装置的透析培养基(Min)和离开装置的透析培养基(mout)。血液气体的测定采用一种气体分析仪(ABL-330 Radiometer Copenhagen)。血糖的测定采用常规的便携式葡萄糖计(Elite)。此外还在实验过程中每小时记录一次昏迷期(C.S.)、呼吸率(Resp rate)和体温(B.T.)。
                                                         表9
 时间(min)  样品  品位  Hte  pH  pCO2  pO2  HCO3  葡糖单位  Resprate  Coagulation(In 20min)  C.S  B.T
 0  1  Art  35  7.469  42.6  112.6  30.8  62  90  100％  1  32.34
 2  Bio  49  7.315  43.9  63.8  21.9  145
 Mcd1  Min  7.707  28.4  151.7  36.4  277
 Med11  Mout  7.481  35.4  106.6  26.3  244
 60  Art  37  7.475  40.7  107.6  29.9  74  100  0-1  34.13
 Bio  36  7.401  47.7  80.6  29.2  93
 Min  7.718  28.4  151.2  37.5  268
 Mout  7.614  34.5  121.1  35.4  250
 120  3  Art  35  7.472  39.9  102.6  29  85  96  0-1  34.44
 4  Bio  36  7.316  55.2  63.6  27.5  144
 Med2  Min  7.709  27.8  149.2  35.9  277
 Mcd22  Mout  7.492  41  103.2  31.3  230
 180  Art  34.4  7.503  36.7  103.9  28.8  77  88  0-1  34.8
 Bio  37  7.355  53.1  64.5  29.1  133
 Min  7.697  28.9  149.4  36.2  275
 Mout  7.388  52.2  77.9  31  230
 300  5  Art  36  7.48  38.7  98.3  28.7  85  114  0-1  34.8
 6  Bio  37  7.396  46.7  58.4  28.3  122
 Med3  Min  7.7  28.3  147.4  35.8  278
 Med33  Mout  7.376  52.6  73.4  30.4  213
尽管已对本发明连同其特定实施方案进行了描述，但对该领域的技术人员而言，明显还存在其它的选择、改进和变化。因而希望将所有处在附加权利要求的精神和范围内的这些选择、改进和变化都包括在内。
                          序列表
                          序列表<110>Mitrani，Eduardo<120>对流体进行生物修饰的装置及方法<130>01/23134<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链DNA多聚核苷酸<400>1tgaactggct gactgctgtg                                      20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链DNA多聚核苷酸<400>2catccttggc ctcagcatag                                      20<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链DNA多聚核苷酸<400>3tctgttgcct acaattct                                 18<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链DNA多聚核苷酸<400>4tagtatatat tccatatt                                 18<210>5<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链DNA多聚核苷酸<400>5ataaagaaag gaaatctg                                 18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链DNA多聚核苷酸<400>6tcacaaagta ggtgtctt                                 18<210>7<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链DNA多聚核苷酸<400>7gctttggacg aatcttgc                                       18<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链DNA多聚核苷酸<400>8aatgttgagg gtcactgc                                       18<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链DNA多聚核苷酸<400>9accactccca accctcatca a                                   21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链DNA多聚核苷酸<400>10cgtccagcac cccgtaaata g                                    21<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链DNA多聚核苷酸<400>11gcagaaaatg gggctgaa                                        18<210>12<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>单链DNA多聚核苷酸<400>12gtttgtattg cctcaggc                                        18

Claims (184)

1.一种用来对流体进行生物修饰的装置，该装置包括：
(a)带有一个流体入口和一个流体出口的一种小室；以及
(b)用来对流体进行生物修饰的肝微器官培养体的集合，该集合的各肝微器官培养体都含有肝细胞，并且培养体的尺寸能够使所述单个肝培养体中位置最深的肝细胞离其最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体肝脏的基本显微结构，该肝微器官培养体集合位于所述小室内，并至少能够与流经该小室的部分流体相接触。
2.权利要求1的装置，其中的肝微器官培养体是由已被冷冻保存的肝脏的至少一部分制成。
3.权利要求1的装置，其中的肝微器官培养体集合是在一种连续肝平面器官中提供，该平面器官的制备方法是将来源于肝脏的细胞与所述肝微器官培养体集合共培养，从而由来源于所述微器官培养体的细胞与所述来源于肝脏的细胞的混合物形成所述连续肝平面器官。
4.权利要求1的装置，其中的肝微器官培养体集合被封装在一种生物相容性聚合物薄片中，该薄片被装在所述小室内。
5.权利要求4的装置，其中的薄片的第一条边约为10-90cm，第二条边约为10-90cm，第三条边约为300-900μm。
6.权利要求4的装置，其中有方向基本平行的多层所述薄片被装在所述小室中。
7.权利要求1的装置，该装置还包括一种基本位于所述小室内的多孔膜，该多孔膜可影响流体与所述肝微器官培养体集合的接触。
8.权利要求7的装置，其中的多孔膜允许分子量小于约10,000Da-250,000Da的颗粒通过。
9.权利要求7的装置，其中的多孔膜可限制白细胞和红细胞通过。
10.权利要求1的装置，该装置还包括多个管道，用来与含有待生物修饰流体的受试者相联接，所述管道中至少有一个与所述入口相联接，并且至少有另一个与所述出口相联接。
11.权利要求1的装置，其中的肝微器官培养体集合的特征是在装入所述小室之前被冷冻保存。
12.权利要求4的装置，其中的薄片的特征是被装在所述小室内。
13.一种用来对受试者的流体进行生物修饰的装置，该装置包括：
(a)带有一个流体入口和一个流体出口的一种小室；
(b)用来对流体进行生物修饰的肝微器官培养体的集合，该集合的每个肝微器官培养体都含有肝细胞，并且培养体的尺寸能够使所述单个肝培养体中位置最深的肝细胞离其最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体肝脏的基本显微结构，该肝微器官培养体集合位于所述小室内，并至少能够与流经该小室的部分流体相接触；
(c)具有第一和第二末端的第一管道，所述第一末端用来联接受试者以接收受试者的流体，所述第二末端用来联接所述入口；以及
(d)具有第一和第二末端的第二管道，所述第一末端用来联接所述出口，所述第二末端用来联接受试者以使生物修饰后的流体返回受试者。
14.权利要求13的装置，其中的肝微器官培养体是由已被冷冻保存的肝脏的至少一部分制成。
15.权利要求13的装置，其中的肝微器官培养体集合是在一种连续肝平面器官中提供，该平面器官的制备方法是将来源于肝脏的细胞与所述肝微器官培养体集合共培养，从而由来源于所述微器官培养体的细胞与所述来源于肝脏的细胞的混合物形成所述连续肝平面器官。
16.权利要求13的装置，其中有方向基本平行的多层所述薄片被装在所述小室中。
17.权利要求16的装置，其中的薄片的第一条边约为10-90cm，第二条边约为10-90cm，第三条边约为300-900μm。
18.权利要求16的装置，其中有方向基本平行的多层所述薄片被装在所述小室中。
19.权利要求13的装置，该装置还包括一种基本位于所述小室内的多孔膜，该多孔膜可影响流体与所述肝微器官培养体集合的接触。
20.权利要求19的装置，其中的多孔膜允许分子量小于约10,000Da-250,000Da的颗粒通过。
21.权利要求19的装置，其中的多孔膜可限制白细胞和红细胞通过。
22.权利要求19的装置，其中的薄片的特征是在装入所述小室之前被冷冻保存。
23.一种对受试者的流体进行生物修饰的方法，该方法包括，用受试者的流体对含有肝微器官培养体集合的一种小室进行灌注，以使所述肝微器官培养体集合能够对流体进行生物修饰，其中所述集合的各肝微器官培养体都含有肝细胞，并且培养体的尺寸能够使所述单个肝培养体中位置最深的肝细胞离其最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体肝脏的基本显微结构。
24.权利要求23的方法，该方法的步骤还包括，在制备用于安装在所述灌注室内的所述微器官培养体之前，至少将肝脏的一部分冷冻保存。
25.权利要求23的方法，其中的流体为血液。
26.权利要求23的方法，其中的肝微器官培养体集合是在一种连续肝平面器官中提供，该肝平面器官的制备方法是将来源于肝脏的细胞与所述肝微器官培养体集合共培养，从而由所述微器官培养体与来源于肝脏的细胞混合物形成所述连续肝平面器官。
27.权利要求23的方法，其中的肝微器官培养体集合被封装在一种生物相容性聚合物薄片中，该薄片被装在所述小室内。
28.权利要求27的方法，其中的薄片的第一条边约为10-90cm，第二条边约为10-90cm，第三条边约为300-900μm。
29.权利要求27的方法，其中有方向基本平行的多层所述薄片被装在所述小室中。
30.权利要求23的方法，其中的小室内包含一种多孔膜，该多孔膜可影响流体与所述肝微器官培养体集合的接触。
31.权利要求30的方法，其中的多孔膜允许分子量约为10,000Da-250,000Da的颗粒通过。
32.权利要求30的方法，其中的多孔膜可限制白细胞和红细胞通过。
33.权利要求30的方法，其中的薄片的特征是在基本装入所述小室之前被冷冻保存。
34.权利要求23的方法，该方法的步骤还包括，使流体返回受试者。
35.权利要求34的方法，该方法的步骤还包括，至少使所述肝微器官培养体集合分泌的一种产物返回受试者。
36.一种制备连续平面器官的方法，该方法包括：
(a)获得一种器官的单个微器官培养体的集合，使所述集合的各微器官培养体均含有细胞，并且培养体的尺寸能够使该单个微器官培养体中位置最深的细胞离其最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体结构；以及
(b)将一种细胞悬浮液添加在所述微器官培养体上，并将该细胞悬浮液与所述微器官培养体集合共培养，从而由来源于所述微器官培养体的细胞与所述悬浮液中的细胞的混合物形成连续平面器官。
37.权利要求36的方法，该方法的步骤还包括，在用于获得所述微器官培养体集合之前，至少将器官的一部分冷冻保存。
38.一种制备连续肝平面器官的方法，该方法包括：
(a)获得单个肝微器官培养体的集合，使该集合的各微器官培养体均含有肝细胞，并且培养体的尺寸能够使该单个微器官培养体中位置最深的细胞离其最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体肝脏的基本结构；以及
(b)将来源于肝脏的细胞的悬浮液添加在所述肝微器官培养体上，并将所述细胞悬浮液与所述肝微器官培养体集合共培养，从而由来源于所述微器官培养体的细胞与所述来源于肝脏的细胞的混合物形成连续肝平面器官。
39.权利要求38的方法，该方法的步骤还包括，在用于获得所述肝微器官培养体集合之前，至少将肝脏的一部分冷冻保存。
40.一种用来对流体进行生物修饰的装置，该装置包括：
(a)带有一个流体入口和一个流体出口的一种小室；以及
(b)用来对流体进行生物修饰的微器官培养体的集合，该集合的各微器官培养体都含有细胞，并且培养体的尺寸能够使所述单个微器官培养体中位置最深的细胞离其最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持器官单位的活体器官结构，该微器官培养体集合位于所述小室内，并至少能够与流经该小室的部分流体相接触。
41.权利要求40的装置，其中，所述器官的所述微器官培养体集合由该器官的冷冻保存部分制成。
42.权利要求40的装置，其中的微器官培养体集合是在一种连续平面器官中提供，该平面器官的制备方法是将悬浮细胞与所述微器官培养体集合共培养，从而由来源于所述微器官培养体的细胞与所述悬浮细胞的混合物形成所述连续平面器官。
43.权利要求40的装置，其中的微器官培养体集合被封装在一种生物相容性聚合物薄片中，该薄片被装在所述小室内。
44.权利要求43的装置，其中的薄片的第一条边约为10-90cm，第二条边约为10-90cm，第三条边约为300-900μm。
45.权利要求43的装置，其中有方向基本平行的多层所述薄片被装在所述小室中。
46.权利要求40的装置，该装置还包括一种基本位于所述小室内的多孔膜，该多孔膜可影响流体与所述微器官培养体集合的接触。
47.权利要求46的装置，其中的多孔膜允许分子量小于约10,000Da-250,000Da的颗粒通过。
48.权利要求46的装置，其中的多孔膜可限制白细胞和红细胞通过。
49.权利要求40的装置，该装置还包括多个管道，用来与含有待生物修饰流体的受试者相联接，所述管道中至少有一个与所述入口相联接，并且至少有另一个与所述出口相联接。
50.权利要求40的装置，其中的微器官培养体集合的特征是在装入所述小室之前被冷冻保存。
51.权利要求42的装置，其中的薄片的特征是在装入所述小室之前被冷冻保存。
52.一种用来对受试者的流体进行生物修饰的装置，该装置包括：
(a)带有一个流体入口和一个流体出口的一种小室；
(b)用来对流体进行生物修饰的微器官培养体的集合，该集合的各微器官培养体都含有细胞，并且培养体的尺寸能够使所述单个微器官培养体中位置最深的细胞离其最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持器官单位的活体器官结构，该微器官培养体集合位于所述小室内，并至少能够与流经该小室的部分流体相接触；
(c)具有第一和第二末端的第一管道，所述第一末端用来联接受试者以接收受试者的流体，所述第二末端用来联接所述入口；以及
(d)具有第一和第二末端的第二管道，所述第一末端用来联接所述出口，所述第二末端用来联接受试者以使生物修饰后的流体返回受试者。
53.权利要求52的装置，其中，所述器官的所述微器官培养体集合由该器官的冷冻保存部分制成。
54.权利要求52的装置，其中的微器官培养体集合是在一种连续平面器官中提供，该平面器官的制备方法是将悬浮细胞与所述微器官培养体集合共培养，从而由来源于所述微器官培养体的细胞与所述悬浮细胞的混合物形成所述连续平面器官。
55.权利要求52的装置，其中的微器官培养体集合被封装在一种生物相容性聚合物薄片中，该薄片被装在所述小室内。
56.权利要求55的装置，其中的薄片的第一条边约为10-90cm，第二条边约为10-90cm，第三条边约为300-900μm。
57.权利要求55的装置，其中有方向基本平行的多层所述薄片被装在所述小室中。
58.权利要求52的装置，该装置还包括一种基本位于所述小室内的多孔膜，该多孔膜可影响流体与所述微器官培养体集合的接触。
59.权利要求58的装置，其中的多孔膜允许分子量小于约10,000Da-250,000Da的颗粒通过。
60.权利要求58的装置，其中的多孔膜可限制白细胞和红细胞通过。
61.权利要求58的装置，其中的薄片的特征是在基本装入所述小室之前被冷冻保存。
62.一种对受试者的流体进行生物修饰的方法，该方法包括，用受试者的流体对含有微器官培养体集合的一种小室进行灌注，以使所述微器官培养体集合能够对流体进行生物修饰，其中，所述集合的各微器官培养体都含有细胞，并且培养体的尺寸能够使所述单个培养体中位置最深的细胞离其最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持器官单位的活体器官结构。
63.权利要求62的方法，该方法的步骤还包括，在用于获得所述微器官培养体集合之前，至少将器官的一部分冷冻保存。
64.权利要求62的方法，其中的流体为血液。
65.权利要求62的方法，其中的微器官培养体集合是在一种连续平面器官中提供，该平面器官的制备方法是将衍生的悬浮细胞与所述微器官培养体集合共培养，从而由来源于所述微器官培养体的细胞与所述悬浮细胞的混合物形成所述连续平面器官。
66.权利要求62的方法，其中的微器官培养体集合被封装在一种生物相容性聚合物薄片中，该薄片被装在所述小室内。
67.权利要求66的方法，其中的薄片的第一条边约为10-90cm，第二条边约为10-90cm，第三条边约为300-900μm。
68.权利要求66的方法，其中有方向基本平行的多层所述薄片被装在所述小室中。
69.权利要求62的方法，其中的述小室内包含一种多孔膜，该多孔膜可影响流体与所述微器官培养体集合的接触。
70.权利要求69的方法，其中的多孔膜允许分子量小于约10,000Da-250,000Da的颗粒通过。
71.权利要求69的方法，其中的多孔膜可限制白细胞和红细胞 通过。
72.权利要求69的方法，其中的薄片的特征是在基本装入所述小室之前被冷冻保存。
73.权利要求69的方法，该方法的步骤还包括，使流体返回受试者。
74.权利要求73的方法，该方法的步骤还包括，至少使所述微器官培养体集合分泌的一种产物返回受试者。
75.一种体外装置，用于为受试者提供一种或多种肝脏功能，该装置包括：
(a)一种位于受试者体外的小室，该小室配有能够与受试者的循环系统进行流体交通的第一管道和第二管道，从而使血液能够通过第一管道由受试者流入小室，并通过第二管道由小室流至受试者；以及
(b)装在所述小室中的多个肝微器官培养体，从而使所述的多个肝微器官培养体能够在所述受试者的血液流经该小室时至少与其中的一部分相接触，其中，在所述多个微器官培养体的单个微器官培养体内位置最深的细胞离该单个微器官培养体的最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体组织的结构，同时使所述多个微器官培养体的各微器官培养体内位置最深的这些细胞能够得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死。
76.权利要求75的装置，其中的多个肝微器官培养体是由已被冷冻保存的肝脏的至少一部分制成。
77.权利要求75的装置，该装置还包括：
(c)处在所述小室内并装有所述多个肝微器官培养体的生物相容性薄膜，该薄膜可以使血液成分和肝脏分泌物透过。
78.权利要求77的装置，其中的薄膜为聚碳酸酯膜。
79.权利要求75的装置，该装置还包括：
(d)来源于一种细胞悬浮液的细胞，这些细胞与所述多个肝微器官培养体共培养而形成一种连续平面器官。
80.权利要求79的装置，其中来源于一种细胞悬浮液的所述细胞为来源于肝脏的细胞。
81.权利要求75的装置，其中的多个肝微器官培养体的特征是被冷冻保存，并在装入所述小室之前融解。
82.一种体内装置，用于为受试者提供一种或多种肝脏功能，该装置包括：
(a)一种可移植于体内的小室，该小室由一个或多个所有边缘均被密封从而形成密封袋的生物相容性薄膜构成，选择的该薄膜使植入受试者后的所述密封袋中能够形成血管；以及
(b)装在所述小室中的多个肝微器官培养体，从而使所述多个肝微器官培养体能够在血管形成发生时至少与所述受试者的部分血液相接触，其中，在所述多个微器官培养体的单个微器官培养体内位置最深的细胞离该单个微器官培养体的最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体组织的结构，同时使所述多个微器官培养体的各微器官培养体内位置最深的这些细胞能够得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死。
83.权利要求82的装置，其中的多个肝微器官培养体是由已被冷冻保存的肝脏的至少一部分制成。
84.权利要求82的装置，其中的薄膜可以使血液成分和肝脏分泌物透过。
85.权利要求84的装置，其中的薄膜为聚碳酸酯膜。
86.权利要求82的装置，该装置还包括：
(d)来源于一种细胞悬浮液的细胞，这些细胞与所述多个肝微器官培养体共培养而形成一种连续平面器官。
87.权利要求86的装置，其中来源于一种细胞悬浮液的所述细胞为来源于肝脏的细胞。
88.权利要求84的装置，其中的多个肝微器官培养体为层状排列。
89.权利要求84的装置，其中的薄膜允许分子量小于约10,000Da-500,000Da的颗粒通过。
90.权利要求82的装置，其中的多个肝微器官培养体的特征是在装入所述小室之前被冷冻保存。
91.一种方法，用于为受试者提供一种或多种肝脏功能，该方法包括：
(a)提供一种配有第一管道和第二管道的小室；
(b)使该小室内装有多个肝微器官培养体，其中，在所述多个微器官培养体的单个微器官培养体内位置最深的细胞离该单个微器官培养体的最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体组织的结构，同时使所述多个微器官培养体的各微器官培养体内位置最深的这些细胞能够得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死；以及
(c)当位于患者体外时，在所述小室与受试者的循环系统之间形成一种流体交通，从而使血液能够通过第一管道由受试者流入小室，并通过第二管道由小室流至受试者，从而使所述肝微器官培养体能够在所述受试者的血液流经该小室时至少与其中的一部分相接触。
92.权利要求91的方法，该方法的步骤还包括，在用于获得所述多个肝微器官培养体之前，至少将肝脏的一部分冷冻保存。
93.权利要求91的方法，其中，处在所述小室内的生物相容性薄膜装有所述多个肝微器官培养体，该薄膜可以使血液成分和肝脏分泌物透过。
94.权利要求93的装置，其中的薄膜为聚碳酸酯膜。
95.权利要求91的方法，该方法的步骤还包括，将来源于一种细胞悬浮液的细胞与所述多个肝微器官培养体共培养，从而形成一种连续平面器官。
96.权利要求95的方法，其中来源于一种细胞悬浮液的所述细胞为来源于肝脏的细胞。
97.权利要求91的方法，其中的多个肝微器官培养体的特征是被冷冻保存，并在装入所述小室之前融解。
98.一种方法，用于为受试者提供一种或多种肝脏功能，该方法包括：
(a)提供一种可移植于体内的小室，该小室由一个或多个所有边缘均被密封从而形成密封袋的生物相容性薄膜构成，选择的该薄膜使植入受试者后的所述密封袋中能够形成血管；和
(b)使该小室内装有多个肝微器官培养体，从而使所述多个肝微器官培养体能够在血管形成发生时至少与所述受试者的部分血液相接触，其中，在所述多个微器官培养体的单个微器官培养体内位置最深的细胞离该单个微器官培养体的最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体组织的结构，同时使所述多个微器官培养体的各微器官培养体内位置最深的这些细胞能够得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死；以及
(c)将该小室植入受试者。
99.权利要求98的方法，该方法的步骤还包括，在用于获得所述多个肝微器官培养体之前，至少将肝脏的一部分冷冻保存。
100.权利要求98的方法，其中的薄膜可以使血液成分和肝脏分泌物透过。
101.权利要求100的方法，其中的薄膜为聚碳酸酯膜。
102.权利要求98的方法，该方法的步骤还包括，将来源于一种细胞悬浮液的细胞与所述多个肝微器官培养体共培养，从而形成一种连续平面器官。
103.权利要求102的方法，其中来源于一种细胞悬浮液的所述细胞为来源于肝脏的细胞。
104.权利要求100的方法，其中的多个肝微器官培养体为层状排列。
105.权利要求100的方法，其中的薄膜允许分子量小于约10,000Da-500,000Da的颗粒通过。
106.权利要求98的方法，其中的多个肝微器官培养体的特征是被冷冻保存，并在装入所述小室之前融解。
107.一种体外装置，用于为受试者提供一种或多种肾脏功能，该装置包括：
(a)一种位于受试者体外的小室，该小室配有能够与受试者的循环系统进行流体交通的第一管道和第二管道，从而使血液能够通过第一管道由受试者流入小室，并通过第二管道由小室流至受试者；以及
(b)装在所述小室中的多个肾微器官培养体，从而使所述的多个肾微器官培养体能够在所述受试者的血液流经该小室时至少与其中的一部分相接触，其中，在所述多个微器官培养体的单个微器官培养体内位置最深的细胞离该单个微器官培养体的最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体组织的结构，同时使所述多个微器官培养体的各微器官培养体内位置最深的这些细胞能够得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死。
108.权利要求107的装置，其中的多个肾微器官培养体是由已被冷冻保存的肾脏的至少一部分制成。
109.权利要求107的装置，该装置还包括：
(c)处在所述小室内并装有所述多个肾微器官培养体的生物相容性薄膜，该薄膜可以使血液成分和肾脏分泌物透过。
110.权利要求109的装置，其中的薄膜为聚碳酸酯膜。
111.权利要求107的装置，该装置还包括：
(d)来源于一种细胞悬浮液的细胞，这些细胞与所述多个肾微器官培养体共培养而形成一种连续平面器官。
112.权利要求111的装置，其中来源于一种细胞悬浮液的所述细胞为来源于肾脏的细胞。
113.权利要求107的装置，该装置还包括一种能够与所述小室进行流体交通的血液透析部件，用于对所述受试者的血液进行透析。
114.权利要求107的装置，其中的多个肾微器官培养体的特征是被冷冻保存，并在装入所述小室之前融解。
115.一种体内装置，用于为受试者提供一种或多种肾脏功能，该装置包括：
(a)一种可移植于体内的小室，该小室由一个或多个所有边缘均被密封从而形成密封袋的生物相容性薄膜构成，选择的该薄膜使植入受试者后的所述密封袋中能够形成血管；以及
(b)装在所述小室中的多个肾微器官培养体，从而使所述多个肾微器官培养体能够在血管形成发生时至少与所述受试者的部分血液相接触，其中，在所述多个微器官培养体的单个微器官培养体内位置最深的细胞离该单个微器官培养体的最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体组织的结构，同时使所述多个微器官培养体的各微器官培养体内位置最深的这些细胞能够得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死。
116.权利要求115的装置，其中的多个肾微器官培养体是由已被冷冻保存的肾脏的至少一部分制成。
117.权利要求115的装置，其中的薄膜可以使血液成分和肾脏分泌物透过。
118.权利要求117的装置，其中的薄膜为聚碳酸酯膜。
119.权利要求115的装置，该装置还包括：
(d)来源于一种细胞悬浮液的细胞，这些细胞与所述多个肾微器官培养体共培养而形成一种连续平面器官。
120.权利要求119的装置，其中来源于一种细胞悬浮液的所述细胞为来源于肾脏的细胞。
121.权利要求117的装置，其中的多个肾微器官培养体为层状排列。
122.权利要求117的装置，其中的薄膜允许分子量小于约10,000Da-500,000Da的颗粒通过。
123.权利要求115的装置，其中的小室包含一种装有可更换的透析缓冲液的透析袋，该透析袋有一个流体交通管道，该管道的远端装有一个阀门，选择的该管道的长度足以使所述阀门位于受试者的体外，从而可用来更换所述透析缓冲液。
124.权利要求115的装置，其中的多个肾微器官培养体的特征是在装入所述小室之前被冷冻保存。
125.一种方法，用于为受试者提供一种或多种肾脏功能，该方法包括：
(a)提供一种配有第一管道和第二管道的小室；
(b)使该小室内装有多个肾微器官培养体，其中，在所述多个微器官培养体的单个微器官培养体内位置最深的细胞离该单个微器官培养体的最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体组织的结构，同时使所述多个微器官培养体的各微器官培养体内位置最深的这些细胞能够得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死；以及
(c)当位于患者体外时，在所述小室与受试者的循环系统之间形成一种流体交通，从而使血液能够通过第一管道由受试者流入小室，并通过第二管道由小室流至受试者，从而使所述肾微器官培养体能够在所述受试者的血液流经该小室时至少与其中的一部分相接触。
126.权利要求125的方法，该方法的步骤还包括，在用于获得所述多个肾微器官培养体之前，至少将肾脏的一部分冷冻保存。
127.权利要求125的方法，其中，处在所述小室内的生物相容性薄膜装有所述多个肾微器官培养体，该薄膜可以使血液成分和肾脏分泌物透过。
128.权利要求127的装置，其中的薄膜为聚碳酸酯膜。
129.权利要求125的方法，该方法的步骤还包括，将来源于一种细胞悬浮液的细胞与所述多个肾微器官培养体共培养，从而形成一种连续平面器官。
130.权利要求129的方法，其中来源于一种细胞悬浮液的所述细胞为来源于肾脏的细胞。
131.权利要求125的方法，该方法的步骤还包括，提供一种能够与所述小室进行流体交通的血液透析部件，用于对所述受试者的血液进行透析。
132.权利要求125的方法，其中的多个肾微器官培养体的特征是在装入所述小室之前被冷冻保存。
133.一种方法，用于为受试者提供一种或多种肾脏功能，该方法包括：
(a)提供一种可移植于体内的小室，该小室由一个或多个所有边缘均被密封从而形成密封袋的生物相容性薄膜构成，选择的该薄膜使植入受试者后的所述密封袋中能够形成血管；和
(b)使该小室内装有多个肾微器官培养体，从而使所述多个肾微器官培养体能够在血管形成发生时至少与所述受试者的部分血液相接触，其中，在所述多个微器官培养体的单个微器官培养体内位置最深的细胞离该单个微器官培养体的最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体组织的结构，同时使所述多个微器官培养体的各微器官培养体内位置最深的这些细胞能够得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死；以及
(c)将该小室植入受试者。
134.权利要求133的方法，该方法的步骤还包括，在用于获得所述多个肾微器官培养体之前，至少将肾脏的一部分冷冻保存。
135.权利要求133的方法，其中的薄膜可以使血液成分和肾脏分泌物透过。
136.权利要求135的方法，其中的薄膜为聚碳酸酯膜。
137.权利要求133的方法，该方法的步骤还包括，将来源于一种细胞悬浮液的细胞与所述多个肾微器官培养体共培养，从而形成一种连续平面器官。
138.权利要求137的方法，其中来源于一种细胞悬浮液的所述细胞为来源于肾脏的细胞。
139.权利要求135的方法，其中的多个肾微器官培养体为层状排列。
140.权利要求135的方法，其中的薄膜允许分子量小于约10,000Da-500,000Da的颗粒通过。
141.权利要求133的方法，该方法的步骤还包括，使所述小室内装有一种包含可更换的透析缓冲液的透析袋，该透析袋有一个流体交通管道，该管道的远端装有一个阀门，选择的该管道的长度足以使所述阀门位于受试者的体外，从而可用来更换所述透析缓冲液。
142.权利要求133的方法，其中的多个肾微器官培养体的特征是被冷冻保存，并在装入所述小室之前融解。
143.一种体外装置，用于为受试者提供一种或多种肾脏和肝脏功能，该装置包括：
(a)一种位于受试者体外的小室，该小室配有能够与受试者的循环系统进行流体交通的第一管道和第二管道，从而使血液能够通过第一管道由受试者流入小室，并通过第二管道由小室流至受试者；以及
(b)包含在所述小室中的多个肾-及肝微器官培养体，从而使所述的多个肾-及肝微器官培养体能够在所述受试者的血液流经该小室时至少与其中的一部分相接触，其中，在所述多个微器官培养体的单个微器官培养体内位置最深的细胞离该单个微器官培养体的最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体组织的结构，同时使所述多个微器官培养体的各微器官培养体内位置最深的这些细胞能够得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死。
144.权利要求143的装置，其中的多个肾-及肝微器官培养体是由已被冷冻保存的肾脏的至少一部分和已被冷冻保存的肝脏的至少一部分制成。
145.权利要求143的装置，该装置还包括：
(c)处在所述小室内并装有所述多个肾-及肝微器官培养体的生物相容性薄膜，该薄膜可以使血液成分以及肾脏和肝脏的分泌物透过。
146.权利要求145的装置，其中的薄膜为聚碳酸酯膜。
147.权利要求143的装置，该装置还包括：
(d)来源于一种细胞悬浮液的细胞，这些细胞与所述多个肾-及肝微器官培养体共培养而形成一种连续平面器官。
148.权利要求147的装置，其中来源于一种细胞悬浮液的所述细胞选自来源于肾脏的细胞和来源于肝脏的细胞。
149.权利要求145的装置，该装置还包括一种能够与所述小室进行流体交通的血液透析部件，用于对所述受试者的血液进行透析。
150.权利要求143的装置，其中的多个肾-及肝微器官培养体的特征是在装入所述小室之前被冷冻保存。
151.一种体内装置，用于为受试者提供一种或多种肾脏和肝脏功能，该装置包括：
(a)一种可移植于体内的小室，该小室由一个或多个所有边缘均被密封从而形成密封袋的生物相容性薄膜构成，选择的该薄膜使植入受试者后的所述密封袋中能够形成血管；以及
(b)包含在所述小室中的多个肾-及肝微器官培养体，从而使所述多个肾-及肝微器官培养体能够在血管形成发生时至少与所述受试者的部分血液相接触，其中，在所述多个微器官培养体的单个微器官培养体内位置最深的细胞离该单个微器官培养体的最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体组织的结构，同时使所述多个微器官培养体的各微器官培养体内位置最深的这些细胞能够得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死。
152.权利要求151的装置，其中，在用于获得所述多个肾-及肝微器官培养体之前，至少将肾脏的一部分和肝脏的一部分冷冻保存。
153.权利要求151的装置，其中的薄膜可以使血液成分以及肾脏和肝脏的分泌物透过。
154.权利要求153的装置，其中的薄膜为聚碳酸酯膜。
155.权利要求151的装置，该装置还包括：
(d)来源于一种细胞悬浮液的细胞，这些细胞与所述多个肾-及肝微器官培养体共培养而形成一种连续平面器官。
156.权利要求155的装置，其中来源于一种细胞悬浮液的所述细胞选自来源于肾脏的细胞和来源于肝脏的细胞。
157.权利要求153的装置，其中的多个肾-及肝微器官培养体为层状排列。
158.权利要求153的装置，其中的薄膜允许分子量小于约10,000Da-500,000Da的颗粒通过。
159.权利要求151的装置，其中的小室内装有一种包含可更换的透析缓冲液的透析袋，该透析袋有一个流体交通管道，该管道的远端装有一个阀门，选择的该管道的长度足以使所述阀门位于受试者的体外，从而可用来更换所述透析缓冲液。
160.权利要求151的装置，其中的多个肾-及肝微器官培养体的特征是被冷冻保存，并在装入所述小室之前融解。
161.一种方法，用于为受试者提供一种或多种肾脏和肝脏功能，该方法包括：
(a)提供一种配有第一管道和第二管道的小室；
(b)使该小室内装有多个肾-及肝微器官培养体，其中，在所述多个微器官培养体的单个微器官培养体内位置最深的细胞离该单个微器官培养体的最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体组织的结构，同时使所述多个微器官培养体的各微器官培养体内位置最深的这些细胞能够得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死；以及
(c)当位于患者体外时，在所述小室与受试者的循环系统之间形成一种流体交通，从而使血液能够通过第一管道由受试者流入小室，并通过第二管道由小室流至受试者，从而使所述肾-及肝微器官培养体能够在所述受试者的血液流经该小室时至少与其中的一部分相接触。
162.权利要求161的方法，该方法的步骤还包括，在用于获得所述多个肾-及肝微器官培养体之前，至少将肾脏的一部分和肝脏的一部分冷冻保存。
163.权利要求161的方法，其中，处在所述小室内的生物相容性薄膜装有所述多个肾-及肝微器官培养体，该薄膜可以使血液成分以及肾脏和肝脏的分泌物透过。
164.权利要求163的装置，其中的薄膜为聚碳酸酯膜。
165.权利要求161的方法，该方法的步骤还包括，将来源于一种细胞悬浮液的细胞与所述多个肾-及肝微器官培养体共培养，从而形成一种连续平面器官。
166.权利要求165的方法，其中来源于一种细胞悬浮液的所述细胞选自来源于肾脏的细胞和来源于肝脏的细胞。
167.权利要求161的方法，该方法的步骤还包括，提供一种能够与所述小室进行流体交通的血液透析部件，用于对所述受试者的血液进行透析。
168.权利要求161的方法，其中的多个肾-及肝微器官培养体的特征是被冷冻保存，并在装入所述小室之前融解。
169.一种方法，用于为受试者提供一种或多种肾脏和肝脏功能，该方法包括：
(a)提供一种可移植于体内的小室，该小室由一个或多个所有边缘均被密封从而形成密封袋的生物相容性薄膜构成，选择的该薄膜使植入受试者后的所述密封袋中能够形成血管；和
(b)使该小室内装有多个肾-及肝微器官培养体，从而使所述多个肾-及肝微器官培养体能够在血管形成发生时至少与所述受试者的部分血液相接触，其中，在所述多个微器官培养体的单个微器官培养体内位置最深的细胞离该单个微器官培养体的最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各微器官培养体中保持活体组织的结构，同时使所述多个微器官培养体的各微器官培养体内位置最深的这些细胞能够得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死；以及
(c)将该小室植入受试者。
170.权利要求169的方法，该方法的步骤还包括，在用于获得所述多个肾-及肝微器官培养体之前，至少将肾脏的一部分和肝脏的一部分冷冻保存。
171.权利要求169的方法，其中的薄膜可以使血液成分以及肾脏和肝脏的分泌物透过。
172.权利要求171的方法，其中的薄膜为聚碳酸酯膜。
173.权利要求169的方法，该方法的步骤还包括，将来源于一种细胞悬浮液的细胞与所述多个肾一及肝微器官培养体共培养，从而形成一种连续平面器官。
174.权利要求173的方法，其中来源于一种细胞悬浮液的所述细胞选自来源于肾脏的细胞和来源于肝脏的细胞。
175.权利要求171的方法，其中的多个肾-及肝微器官培养体为层状排列。
176.权利要求171的方法，其中的薄膜允许分子量小于约10,000Da-500,000Da的颗粒通过。
177.权利要求169的方法，该方法的步骤还包括，使所述小室内装有一种包含可更换的透析缓冲液的透析袋，该透析袋有一个流体交通管道，该管道的远端装有一个阀门，选择的该管道的长度足以使所述阀门位于受试者的体外，从而可用来更换所述透析缓冲液。
178.权利要求169的方法，其中的多个肾-及肝微器官培养体的特征是被冷冻保存，并在装入所述小室之前融解。
179.一种制备和使用冷冻微器官的方法，该方法包括：
(a)至少将器官的一部分冷冻保存，以获得该器官的冷冻保存片段；
(b)在冷冻保存状态下将该冷冻保存片段切成片；
(c)在使用前将该冷冻切片融解，以获得融解的切片；以及
(d)用融解的切片作为微器官。
180.权利要求179的方法，其中，至少将所述器官的所述部分冷冻保存，以便在一种溶液中获得所述器官的所述冷冻保存组织，该溶液至少有一种组分选自DMEM、DMSO、甘油、海藻糖、蜜三糖、一种抗生素、一种抗霉菌素和葡萄糖。
181.权利要求179的方法，其中，用于冷冻保存的温度为-180℃-0℃。
182.权利要求179的方法，其中，所述切片的厚度约为200-400微米。
183.权利要求179的方法，该方法的步骤还包括：
(e)在将所述切片融解前，在能够维持其冷冻保存状态的温度下将该切片保存一段时间。
184.权利要求179的方法，其中，将所述融解切片作为微器官的方法是：
(i)提供一种小室；
(ii)将多个所述切片置于该小室内；
(iii)至少将受试者的部分血液引入该小室，以使所述多个融解切片与该受试者的血液相接触，其中，在所述多个融解切片的单个融解切片内位置最深的细胞离该单个融解切片的最近端表面至少约100微米，但又不超过约225微米，从而可在各融解切片中保持活体组织的结构，同时使所述多个微器官培养体的各融解切片内位置最深的这些细胞能够得益于扩散的营养物质和加氧作用，从而避免其坏死；以及
(iv)至少将一部分已经与融解切片接触的受试者血液重新引入受试者。
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