CN1420933A - 应用微器官诱导血管生成的方法 - Google Patents

应用微器官诱导血管生成的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1420933A
CN1420933A CN00811874A CN00811874A CN1420933A CN 1420933 A CN1420933 A CN 1420933A CN 00811874 A CN00811874 A CN 00811874A CN 00811874 A CN00811874 A CN 00811874A CN 1420933 A CN1420933 A CN 1420933A
Authority
CN
China
Prior art keywords
organs
micro
cell
polynucleotide sequence
exogenous polynucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN00811874A
Other languages
English (en)
Inventor
E·N·米特拉尼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Original Assignee
Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem filed Critical Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Publication of CN1420933A publication Critical patent/CN1420933A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets
    • A61B17/34—Trocars; Puncturing needles
    • A61B17/3468—Trocars; Puncturing needles for implanting or removing devices, e.g. prostheses, implants, seeds, wires
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets
    • A61B17/30—Surgical pincettes without pivotal connections
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/26—Lymph; Lymph nodes; Thymus; Spleen; Splenocytes; Thymocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/42—Respiratory system, e.g. lungs, bronchi or lung cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1858—Platelet-derived growth factor [PDGF]
    • A61K38/1866—Vascular endothelial growth factor [VEGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets
    • A61B17/00234—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets for minimally invasive surgery
    • A61B2017/00238—Type of minimally invasive operation
    • A61B2017/00243—Type of minimally invasive operation cardiac
    • A61B2017/00247—Making holes in the wall of the heart, e.g. laser Myocardial revascularization
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets
    • A61B2017/00969—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets used for transplantation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B17/00—Surgical instruments, devices or methods, e.g. tourniquets
    • A61B17/30—Surgical pincettes without pivotal connections
    • A61B2017/305—Tweezer like handles with tubular extensions, inner slidable actuating members and distal tools, e.g. microsurgical instruments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B18/00—Surgical instruments, devices or methods for transferring non-mechanical forms of energy to or from the body
    • A61B2018/00315—Surgical instruments, devices or methods for transferring non-mechanical forms of energy to or from the body for treatment of particular body parts
    • A61B2018/00345—Vascular system
    • A61B2018/00351—Heart
    • A61B2018/00392—Transmyocardial revascularisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Abstract

本发明提供了在哺乳动物组织中诱导血管生成的方法。所述方法包括在哺乳动物组织中植入至少一个微器官的步骤，其中，至少有一个微器官可以产生多种血管生成因子，进而诱导血管生成。

Description

应用微器官诱导血管生成的方法
发明领域和背景
本发明涉及应用微器官、微器官提取物和含有所述提取物的药用组合物刺激宿主组织血管生成的方法。本发明还进一步涉及转化了外源性核苷酸序列的微器官和应用这些微器官为宿主组织提供血管生成因子的方法。
在过去的几年中，很多研究为深入探讨诱导调控血管生成的分子机理提供了新的见解。血管生成生长因子的发现使研究人员意识到，可以在缺血组织区应用这些因子作为血管再生剂。所述血管生成生长因子如血管内皮生长因子(VEGF)，碱性成纤维生长因子(bFGF)，血管生成素和其他一些因子。业已尝试了应用基因治疗和重组蛋白技术的几种不同方法。尽管在动物实验中，初步结果喜人，但直到目前为止进行的临床试验，结果却令人失望(Ferrara and Alitalo，1999 Nature Medicine 5(12)：1359-1364)。
临床水平的不成功至少可以部分归结于在这些试验中应用的基因治疗或重组蛋白技术。
业已显示，体内血管生成受到一整套复杂、互动因子的影响和调控，所述因子包括刺激因子和抑制因子(见Irula-Arispe and Dvorak，1997Thrombosis and Haemostasis 78(1)，672-677；Gale and Yancopolous，1999Genes and Development 13，1055-1066)。此外，目前认为，诱导血管生成需要长期持续的刺激。因此，目前不能解决这些问题的基因治疗和重组生长因子技术，不能为促进体内血管生成提供必要的条件。
最近，本发明的发明者描述了一种生成微器官的方法，所述微器官可以在体外以自治功能状态维持相当长一段时间。这些微器官的制备、保存及其某些应用在下述文献中有述，这些文献在此引入，作为参考，如美国专利号5,888,720、美国专利申请号09/425,233、PCT/US98/00594以及下述部分的优选实施方案。
在将本发明付诸实践的过程中，也就是下面实施例部分的详细描述，我们发现，当将这些微器官植入活体组织时，它们为组织提供了持续的一整套复杂调控血管生成因子，诱导了显著的新生血管。我们还发现，无论正常动物还是老龄动物，植入的微器官都可以使外科手术诱导的缺血区恢复。
因此，本发明提供了诱导血管生成的新的有效方法，该方法可以用来治疗缺血组织，突破了先前方法的局限性。
发明简述
根据本发明的一个方面，提供了在第一个哺乳动物组织中诱导血管生成的方法，所述方法包括在第一个哺乳动物组织中植入至少一个微器官的步骤，其中，至少有一个微器官可以产生多种血管生成因子，进而诱导血管生成。
根据本发明的另一个方面，提供了在第一个哺乳动物组织中诱导血管生成的方法，所述方法包括步骤(a)从至少一个微器官中提取可溶性分子；和(b)给第一个哺乳动物的组织应用至少一剂预定剂量的从步骤(a)提取的可溶性分子。
根据本发明的另一个方面，提供了含有多种细胞的微器官，其中，多种细胞中至少有一部分包括至少一个外源性多核苷酸序列，所述至少一个外源性多核苷酸序列可以调控细胞中至少一种血管生成因子的表达。
根据本发明的另一个方面，提供了药用组合物，所述药用组合物包括从至少一种微器官中提取的可溶性分子和药用载体。
根据本发明的另一个方面，提供了在第一个哺乳动物组织中诱导血管生成的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在生长培养基中培养至少一个微器官，从而产生条件培养基；(b)在培养至少一个预定时期后，收获条件培养基；(c)给第一个哺乳动物的组织应用至少一剂预定剂量的从步骤(b)收获的条件培养基，进而诱导组织血管生成。
根据下述本发明优选实施方案的另一个特点，生长培养基是基本必需培养基。
根据所述优选实施方案的另一个特点，至少一个微器官取自第二个哺乳动物的器官组织。
根据所述优选实施方案的另一个特点，第一个哺乳动物和第二个哺乳动物是单个哺乳动物(single individual mammal)。
根据所述优选实施方案的另一个特点，器官选自肺脏、肝脏、肾脏、肌肉、脾脏、皮肤或其他任何内脏。
根据所述优选实施方案的另一个特点，至少一个微器官包括两种或两种以上类型的细胞。
根据所述优选实施方案的另一个特点，第一个哺乳动物是人类。
根据所述优选实施方案的另一个特点，在将至少一个微器官植入第一个哺乳动物组织内之前，体外培养至少4小时。
根据所述优选实施方案的另一个特点，至少一个微器官制备成在植入哺乳动物组织中时，依然具有活性。
根据所述优选实施方案的另一个特点，至少一个微器官具有维度，这样位于至少一个微器官最深处的细胞，距离至少一个微器官最近表面至少约100微米，但不超过约225-350微米。
根据所述优选实施方案的另一个特点，多种血管生成因子中的每一种在至少一个微器官中都具有独特的表达模式。
根据所述优选实施方案的另一个特点，至少一个微器官的至少一部分细胞包括至少一个外源性多核苷酸序列，选择的该序列可以调控血管生成。
根据所述优选实施方案的另一个特点，至少一个外源性多核苷酸序列整合到至少一个微器官的至少一部分细胞的基因组中。
根据所述优选实施方案的另一个特点，设计的至少一个外源性多核苷酸序列可以调控多种血管生成因子中至少一种血管生成因子的表达。
根据所述优选实施方案的另一个特点，至少一个外源性多核苷酸序列包括增强子或抑制子序列。
根据所述优选实施方案的另一个特点，至少一个外源性多核苷酸序列的表达产物可以调控多种血管生成因子中至少一种血管生成因子的表达。
根据所述优选实施方案的另一个特点，至少一个外源性多核苷酸序列编码至少一种重组血管生成因子。
本发明通过提供在哺乳动物组织中诱导血管生成的方法、提取物和药用组合物，成功克服了目前已知配制的缺陷。
附图简述
本发明仅通过实施例的方式阐释，附图作为参考。应用详细描述的特定附图作为参考，并强调特定附图仅以示例的形式呈现，目的仅仅是举例说明本发明的优选实施方案，并提供业已被认为是本发明最有用、并已被深入理解的原则和概念描述。在此方面，并未试图显示本发明的结构细节，只提供了为理解本发明的基本原则所必需的细节，采用的附图描述使本领域技术人员明确，在实践中，如何实现本发明的几种形式。
附图：
图1是一张照片，显示了在植入微器官周围的新生血管(以箭头标记)。
图2显示了移植微器官中表达的多种血管生成因子的相对水平。Ang1-血管生成素1，Ang2-血管生成素2，MEF2C-肌细胞增强因子2C，VEGF-血管内皮生长因子。
图3显示了微器官制备后体外培养多个时间点后，从中提取的RNA的血管生成因子特异性RT-PCR结果。Actin-β肌动蛋白(对照)。
图4代表了应用密度计量学测定图3所示RT-PCR产物的半定量结果，用β肌动蛋白RT-PCR产物密度(对照)进行标准化。
图5是一个柱状图，代表髂总动脉结扎大鼠植入微器官或安慰品(对照)后的选通控制图。(n)＝13。三个时间组(从左到右)的P值为0.16，1和0.841。评分：0-功能完全，9-完全不能移动肢体，10-肢体丧失。
图6是一个柱状图，代表与图5相同的实验组，只是在选通控制行为评分前给动物施加压力。三个时间组(从左到右)的P值为0.0001，0.0069和0.06。
图7是一个柱状图，代表代表髂总动脉结扎小鼠植入微器官或安慰品后的选通控制图。评分：0-功能完全，9-完全不能移动肢体，10-肢体丧失。三个时间组(从左到右)的P值为0.00025，0.00571和0.07362。
图8显示了植入同源小鼠皮下区6个月后的源于微器官的小鼠脾脏(以MC箭头标记)。箭头标记了围绕微器官的一根新生血管。
图9显示了植入同源大鼠肺脏微器官的大鼠角膜。植入的微器官(以箭头标记)为新生血管所包绕。
优选实施方案阐述
本发明是应用微器官、微器官提取物或含有所述提取物的药用组合物在哺乳动物组织中诱导血管生成的方法。具体地说，通过植入一个或多个微器官，或者通过具体施用可溶性微器官提取物，优选含有所述提取物的药用组合物，本发明可以用来在哺乳动物组织中诱导血管生成。
通过参考附图及附图简述，可以更好地理解本发明的原则和应用。
在详细阐述本发明至少一个实施方案前，应该理解，本发明并不局限于下面所述的构建物的细节应用和成分安排，也不局限于下面实施例部分的示例。本发明可以用于其他实施方案，或通过多种途经付诸实践或实施。而且，应该理解，这里应用的词汇或术语只是为了阐述问题，不应视为对发明的限制。
如这里应用的术语“微器官”是指从机体获得的器官组织，并以能够维持细胞活性和功能的方式制备，下面将有进一步阐述。所述制备可能包括体外培养一段预定时期。
复杂的多细胞有机体有赖于支持每个细胞氧气、营养和废物排除需要的血管网络。这一复杂的血管网络通过血管生成过程创建并维持。在人类，血管网络的退化可以导致阻塞性动脉疾病，所述阻塞性动脉疾病可以导致西方世界的病废和死亡。目前可行的绝大多数治疗选择都基于手术或其他创伤性过程，如血管搭桥或血管成形术。这些解决方案在最大程度上也只是部分成功，但可能导致患者短期存活，或不是对所有患者都适用。由于血管生成是组织和器官形成的基本元素，绝大多数组织在再生过程中，仍然保持诱导新生血管形成的能力。因此，本发明的发明者推测，从体内取出的组织大体上至少试图再生，因此，可以用作血管生成的刺激物。
本发明提供了基于应用微器官的诱导血管生成的新方法。所述微器官保持原始组织的基本微结构，同时，在制备过程中使器官外植体的细胞距离营养和气体源不超过100-450微米。这些微器官在体外培养和植入状态的相当长的一段时间内，保持功能自治和活性。
应当理解，尽管微器官在制备后可以立即应用，但为了增加活性，在某些情况下体外培养一段时间可能使有利的。例如，在需要提取可溶性分子的情况下，可以将微器官培养预定时间段，可以短如4小时，长如数天或数周。
因此，应用这些微器官或微器官提取物诱导血管生成有赖于在植入之前多段时间内，细胞功能的保持。本发明部分基于一个发现，即在给定条件下，一个器官外植体不同组织层的细胞生长可以被激活，并在培养中增殖、分化、发挥功能，所述不同组织层如间叶细胞层和上皮细胞层。
在外植体本身存在的细胞与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用就足以支持细胞的动态平衡，因此，可以在较长时间内维持器官的微结构和功能。这里应用的术语“动态平衡”是指在细胞增殖和细胞损失之间的平衡。
细胞动态平衡的支持保持了，例如，在源器官自然发生的细胞与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用。因此，有关细胞相互之间的定向和向其他锚定底物的定向，以及在调控物质如激素存在或不存在的情况下，允许源器官保持适宜的生化和生物活性。而且，微器官在没有坏死的情况下维持培养至少48小时，或更长时间。
微器官的外植体源
可以从中分离微器官的哺乳动物示例包括人类和其他灵长类动物，猪，如完全天然或部分天然的猪(如微型猪，和转基因猪)，啮齿类动物等。适宜的器官示例包括但不限于肝脏、肺脏、其他肠道衍生器官、心脏、脾脏、肾脏、皮肤和胰腺。
生长培养基
有大量组织培养基可以培养动物细胞。其中一些比较复杂，一些比较简单。尽管预期微器官可能需要在复杂培养基中生长，美国专利申请系列号08/482,364业已显示，培养物可以在简单培养基如Dulbecco’s基本必需培养基(DMEM)中维持。而且，尽管微器官可以在含有血清或其他生物提取物如垂体提取物的培养基中培养，但美国专利申请系列号08/482,364业已显示，并不需要血清或其他生物提取物。而且，在没有血清的情况下，微器官培养物可以维持一段相当长的时间。在本发明优选实施方案中，在体外微器官培养物维持过程中，培养基不包括生长因子。
有关在基本培养基中生长的要点是重要的。目前，为延长哺乳动物细胞的生长，绝大多数培养基或系统与未定义的蛋白质结合，或应用饲养细胞来提供维持生长所需的蛋白质。因为这些未定义蛋白的存在可以有意终止干扰微器官的应用，因此，在培养外植体时应尽量减少未定义蛋白的存在。
这里应用的语言“基本培养基”是指一种化学定义的培养基，该培养基仅仅含有培养细胞存活和增殖所需的营养物质。典型的基本培养基不含生物提取物，如生长因子、血清、垂体提取物或其他对培养细胞群体的存活和增殖不必需的物质。例如，基本培养基通常包括至少一种氨基酸，至少一种维生素，至少一种盐类，至少一种抗生素，至少一种指示剂，如酚红，来指示氢离子浓度，葡萄糖，和至少一种抗生素，以及其他细胞存活和增殖所必需的多种成分。基本培养基不含血清。多种基本培养基可以从Gibco BRL，Gaithersburg，MD购买，作为基本必需培养基。
但是，由于不必向培养基中添加生长因子和调控因子，添加这些因子或接种其他特定细胞可以用来增加、改变或调节培养物中细胞的增殖和成熟。多种生长因子可以影响培养细胞的生长和活性，所述生长因子如胰岛素、生长激素、生长素介质、集落刺激因子、促红细胞生成素、表皮生长因子、肝红细胞生成因子(肝红细胞生成素)和其他细胞生长因子，如前列腺素、白细胞介素、和天然负性生长因子、成纤维生长因子和β转化生长因子家族的成员。
培养容器
微器官可以在任何适宜的培养容器中维持，并可维持于37℃，5％CO2。可以摇动培养物来改善通气。
关于在其内/上优选提供微器官的培养容器，应该指出，在一个优选实施方案中，这种容器通常可以是任何材料和/或形状。多种不同的材料可以用来形成容器，包括但不限于：尼龙(聚酰胺)，涤纶(聚酯)，聚苯乙烯，聚丙烯，聚丙烯酸酯，聚乙烯化合物(如聚氯乙稀)，聚碳酸酯(PVC)，聚四氟乙烯(PTFE，特氟纶)，thermanox(TPX)，硝酸纤维素，棉花，聚羟基乙酸(PGA)，羊肠线，纤维素，白明胶，右旋糖苷等。可应用任何材料编织成筛网。
当培养物需要维持较长一段时间或需要冻存时，优选不能降解的材料，如尼龙、涤纶、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙稀酸酯、聚乙烯、特氟纶、棉花等。根据本发明可以应用的便利尼龙筛网是Nitex，所述尼龙筛网是尼龙过滤筛，平均孔径大小为210um，平均尼龙纤维直径为90um(Tetko，Inc.，N.Y.)。
外植体的维度
分离的外植体除了依然保持源组织细胞与细胞之间、细胞与基质之间和细胞与间质之间的结构外，外植体的维度对于那些细胞的活性也至关重要，如微器官有意要维持一段较长的时间，如7-21天或更长时间。
因此，选择的组织外植体的维度应该可以使充足的营养和气体，如氧气，扩散提供给三维微器官的每一个细胞，同时，使细胞废物扩散到外植体外，使细胞毒性和由于微器官废物不能排除而导致的伴随死亡最小化。因此，外植体的大小取决于在没有特定传输结构和合成底物的情况下，到达每个细胞所需的最低水平。业已发现，如美国专利申请号08/482,364所述，如果表面积比体积指数在某一特定范围，就可维持这一到达量。
表面积比体积指数的所选范围提供了与单层细胞培养相似的营养提供和废物排除的方式。如果表面积比体积指数至少约为2.6mm-1时，营养提供水平可以达到并维持，所述表面积比体积指数在这里定义为“Aleph或Aleph指数”。三维培养曾经忽略表面积比体积指数的测定，因为三个维度的变化可以导致体积和表面积的比例测定变化。但是，当测定Aleph时，a和x应定义为组织切片最小的两个维度。
这里应用的“Aleph”指通过公式1/x+1/a给定的表面积比体积指数，其中x＝以mm计的组织厚度，a＝以mm计的组织宽度。在优选实施方案中，一个外植体的Aleph范围大约为2.7mm-1-25mm-1，范围更优选2.7mm-1-15mm-1，范围更优选2.7mm-1-10mm-1。
表1提供了Aleph的示例，其中，例如，一个组织的厚度(x)为0.1mm，宽度(a)为1mm，那么Aleph指数为11mm-1。
表1.以mm-1计的表面积比体积指数“Aleph”的不同值，以a(宽度)和x(厚度)的函数计算
x(mm)                    Alpeh值
  a＝1   a＝2   a＝3   a＝4   a＝5
    0.1   11   10.51   10.33   10.2   10.2
    0.2   6   5.5   5.33   5.25   5.2
    0.3   4.3   3.83   3.67   3.58   3.53
    0.4   3.5   3   2.83   2.75   2.7
    0.5   3   2.5   2.33   2.25   2.2
    0.6   2.66   2.16   2   1.91   1.87
    0.7   2.4   1.92   1.76   1.68   1.63
    0.8   2.25   1.75   1.58   1.5   1.45
    0.9   2.11   1.61   1.44   1.36   1.31
    1.0   2   1.5   1.33   1.25   1.2
    1.2   1.83   1.3   1.16   1.08   1.03
    1.3   1.77   1.26   1.1   1.02   0.96
    1.6   1.625   1.13   0.96   0.88   0.83
    2.0   1.5   1   0.83   0.75   0.7
这样，例如，位于单个微器官最深处的细胞距离该单个微器官最近表面至少大约100微米，但不超过225-350微米，因此，可以保持体内微结构，同时保证没有细胞距离气体和营养源超过225-350微米。
没有任何一个特定理论能够解释，但三维培养系统提供的多种因子可能与成功有关。
首先，外植体大小的正确选择，例如，应用上述Aleph计算，提供了适宜的表面积体积比率，使外植体的所有细胞享有充足扩散的营养，同时使外植体所有细胞的细胞废物可以充分扩散。
其次，由于外植体的三维培养，多种细胞可以持续活性生长，与单层培养的细胞不同，所述单层培养的细胞在生长到汇合时，显示接触抑制，停止生长、分裂。外植体细胞复制产生的生长和调控因子可能与培养中细胞刺激增殖和调控分化部分相关，如，甚至在微器官总体积静止时。
第三，外植体三维基质维持了细胞元件的空间分布，与体内相应器官所见近似。
第四，细胞与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用允许局部微环境的建立，有益于细胞成熟。业已显示，细胞表型分化的维持不仅需要生长/分化因子，还需要适宜的细胞间相互作用。
在将本发明付诸实践的过程中，也就是下面实施例部分的详细描述，我们发现，当将这些微器官植入受体时，它们提供了持续的一整套复杂血管生成因子，导致宿主植入组织中新生血管的形成。我们还发现，无论正常动物还是老龄动物，微器官都可以逆转宿主组织的缺血。而且，我们还发现，体外培养的微器官表达相同的血管生成因子系统。
因此，根据本发明的一个方面，提供了在哺乳动物组织中一段血管生成的方法，例如人类。该方法通过在哺乳动物组织中植入至少一个微器官来进行。适于微器官植入的组织示例包括但不限于器官组织或肌肉组织。
植入可以通过外科手术技术或将微器官制剂注射到哺乳动物的预期组织区来实现，所述注射方法要应用特殊改造的注射器，该注射器有适于注射微器官的标准针头。
用于植入的微器官优选从待植入哺乳动物或同种哺乳动物的器官组织中制备，尽管也可应用异种组织制备微器官，但在植入前或植入过程中必需采取措施，避免移植物排斥反应和/或移植物抗宿主反应(GVHD)。多种预防或减轻移植物排斥反应或GVHD的方法是本领域熟知的，因此这里就不给出进一步的细节了。
根据本发明的一个优选实施方案，微器官的至少一部分细胞包括至少一个外源性多核苷酸序列。这些多核苷酸序列优选与这些细胞的基因组稳定整合，尽管也可应用暂时性多核苷酸序列。应当理解，这些外源性多核苷酸序列可以在哺乳动物器官组织外植后导入微器官细胞，也可以在制备器官组织外植体前用外源性多核苷转化哺乳动物。下面将详细阐述转化哺乳动物细胞的方法。
这些外源性多核苷酸序列可以，例如通过上调或下调这些细胞表达的一种或多种内源性血管生成因子的表达来增强血管生成。在这种情况下，多核苷酸序列可以包括反作用或顺作用增强子或抑制子元件，所述元件可以调控这些细胞表达的内源性血管生成因子的转录或翻译。可用于哺乳动物细胞的多种适于翻译或转录调控元件的示例是本领域熟知的。
例如，顺作用或反作用转录调控元件对于激活特定启动子的转录是必需的(Carey et al.(1989)，J.Mol.Biol.，209：423-432；Cress et al.(1991)Science，251：87-90；and Sadowski et al.(1988)，Nature，335：563-564)。
翻译激活子可以通过花椰菜嵌合病毒翻译激活子(TAV)示例说明。见，例如，Futterer and Hohn(1991)EMBO J.10：3887-3896。在这个系统中，产生了双顺反子mRNA。也就是说，在同一mRNA中，从同一启动子启动两个编码区的转录。在没有TAV的情况下，只有第一个顺反子在核糖体翻译。但是，表达TAV的细胞，两个顺反子都被翻译。
顺作用调控元件的多核苷酸序列可以通过常用的基因敲入技术导入微器官细胞。基因敲入/敲除方法学的综述见，例如，美国专利号5,487,922，5,464,764，5,387,742，5,360,735，5,347,075，5,298,422，5,288,846，5,221,778，5,175,385，5,175,384，5,175,383，4,736,866以及Burke and Olson，Methods inEnzumology，194：251-270，1991；Capecchi，Science 244：1288-1292；Dickinsonet al.，Human Molecular Genetics，2(8)：1299-1302，1993；Duff and Lincoln，“将病原性突变插入含有人APP基因的酵母人工染色体并在ES细胞中表达”，Research Advances in Alzheimer’s Disease and Related Disorders，1995；Huxley et al.，Genomics，9：742-750，1991；Jakobovits et al.，Nature，362：255-261，1993；Lamb et al.，Nature Genetics，5：22-29，1993；Pearson and Choi，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90：10578-82；Rothstein，Methods in Enzymology，194：281-301，1991；Schell et al.，Nature，362：258-261，1993；Strauss et al.，Science，259：1904-1907，1993，WO 94/23049，WO 93/14200，WO 94/06908and WO 94/28123也通过了相关信息。
通过反义RNA也可以下调内源性血管生成因子。在这种情况下，外源性多核苷酸序列可以编码序列，所述序列与微器官细胞转录的血管生成因子mRNA序列互补。下调还可以通过基因敲除技术实现。
上调可以通过过量表达或提供一种或多种血管生成因子编码序列的高拷贝数来实现。在这种情况下，外源性多核苷酸序列可以编码一种或多种血管生成因子，例如但不限于VEGF，bFGF，Ang1或Ang2，所述序列可以置于哺乳动物表达载体的适宜启动子转录控制下。适宜的哺乳动物表达载体包括但不限于可以从Invitrogen购买的pcDNA3，pcDNA3.1(+/-)，pZeoSV2(+/-)，pSecTag2，pDisplay，pEF/myc/cyto，pCMV/myc/cyto，pCR3.1，可以从Promega购买的pCI，可以从Stratagene购买的pBK-RSV和pBK-CMV，可以从Clontech购买的pTRES，以及它们的衍生物。
将外源性多核苷酸序列导入哺乳动物细胞的多种方法是本领域熟知的。这些方法包括但不限于DNA直接摄取技术，以及病毒或脂质体介导的转化(进一步细节见，例如“Methods in Enzymology”Vol.1-317，AcademicPress)。还可应用核酸包裹的颗粒轰击微器官。
应当理解，可以从微器官中提取其表达的血管生成因子，可以以提取原液或精制提取液的形式直接或作为药用组合物的一部分局部用于宿主组织，以诱导血管生成。应当进一步理解，由于微器官在植入后或培养过程中的不同时间点表达不同水平的多种血管生成因子，因此可以在不同时间点、从不同微器官培养物中提取可溶性分子，当系列局部应用时，可以模拟植入或培养微器官的时程表达。
因此，根据本发明的另一方面，提供了在哺乳动物组织中诱导血管生成的另一种方法。该方法通过从微器官中提取可溶性分子并在哺乳动物组织中应用至少一个预定剂量的可溶性提取分子来实现。本领域熟知多种给药方法。下面给出了有关药用组合物的一些给药方法的细节描述。
如上所述，根据本发明另一个优选实施方案，药用组合物包括可溶性提取物，还包括药用载体，所述载体可以稳定和/或增强可溶性提取物到达或定向靶定机体组织。
药用载体的示例包括但不限于生理溶液，病毒衣壳载体，脂质体载体，胶囊载体，复杂阳离子试剂载体，聚阳离子载体如聚赖氨酸和细胞载体。
含有药用组合物“活性成分”的可溶性提取物可以通过多种给药方式用于个体。
适宜的给药途经可能包括，例如经粘膜或肠道外给药，包括肌内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻腔内或眼内注射。
组合物和提取物优选局部给药，而非系统给药，例如通过注射直接将组合物和提取物导入个体缺血组织区。
本发明药用组合物可以通过本领域熟知的程序生产，例如，通过传统的混和、溶解、制粒、包裹糖衣、捻细成粉、乳化、装入胶囊、entrapping或冻干程序。
因此，根据本发明应用的药用组合物可以应用一种或多种生理可接受载体通过传统方式制备，所述载体包括可以药用的赋形剂和佐剂，可以更容易地使活性成分融入制剂。适宜的制剂取决于选择的给药途经。
对于注射用药，活性成分可以制备成水溶液，优选溶于生理兼容的缓冲液，如Hank’s溶液，Ringer’s溶液或生理盐缓冲液。对于经粘膜给药，制剂要应用能够渗透屏障的适宜渗透剂。这些渗透剂是本领域熟知的。
这里描述的组合物还可制备成肠道外给药，如弹丸注射或持续点滴。注射制剂可以以单位剂量形式存在，如分装在安瓿内或放置于多剂量容器内，并可选择性添加防腐剂。组合物可以用油或水载体制成悬液、溶液或乳剂，还可能含有制备剂如悬浮、稳定和/或分散剂。
肠道外给药的药用组合物包括活性成分的水溶液形式。此外，活性成分的悬液可以制备成适宜的基于油或水的注射悬液。适宜的亲脂溶剂或载体包括脂肪油，如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。水溶注射悬液可含有增加悬液粘性的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖苷。悬液还可选择性含有适宜的稳定剂或可以增加活性成分溶解性的制剂，这样可以制备高浓度的溶液。
此外，本发明组合物还可通过局部定位泵或时间释放池给药，所述装置可以植入个体的缺血组织内。
由于典型的血管生成因子是由产生细胞分泌的，因此，微器官还可在适宜培养基中培养，并在预定时间点收获含有分泌的血管生成因子的条件培养基，并将条件培养基作为上述可溶性提取物应用。
因此，根据本发明另一方面，提供了在第一个哺乳动物组织中诱导血管生成的方法。根据本发明的这一方面，该方法的实现需要通过下述步骤，在生长培养基中培养至少一个微器官以产生条件培养基，在培养至少一个预定时间段后收获条件培养基，将至少一个预定剂量的条件培养基导入第一个哺乳动物组织中，进而在该组织中诱导血管生成。
优选的生长培养基是基本必需培养基(见上述)，该培养基不含可能干扰条件培养基预期功能或在给哺乳动物应用时可能导致意外反应的未定义蛋白质或其他生长因子。
应当理解，收获的条件培养基还可应用如亲和柱层析等的层析技术处理，以产生基本纯化制剂，所述制剂含有一系列血管生成因子，当应用于哺乳动物时，适于诱导血管生成。
还应进一步理解，这里说明的条件培养基和可溶性提取物还可从如上所述包括外源性多核苷酸序列的微器官中获得。在这种情况下，如果应用的外源性多核苷酸序列编码血管生成因子，就适于选择这种外源性多核苷酸序列给预期的哺乳动物。例如，如果可溶性提取物或条件培养基是给人类应用的，优选应用人类或人类化的外源性多核苷酸序列。
根据本发明宗旨，微器官可以在制备后应用，也可冻存并储存于零下160℃直至应用。例如，微器官可以在10％DMSO(二甲亚砜)和20％血清中通过梯度冷冻法冻存。
例如，冻存可以通过下述方法实现，将微器官包裹在平坦的薄膜内，(例如，半透基质如藻酸盐)，然后将这些包裹好的微器官插入可以封口的无菌合成塑料袋中，所述塑料袋的大小与包裹好的微器官大小相似。塑料袋在一端包括一个塑料管状输入口，另一端包括一个塑料管状输出口。然后向含有平坦薄膜包裹的微器官的密封塑料袋中灌注含10％DMSO和20％血清的标准培养基，如Ham’s F12，并逐步冷冻，储存于零下160℃。
心血管医学的一个重要目标就是应用治疗性血管生成取代手术搭桥。尽管在冠状动脉缺血或肢体缺血的动物模型中应用血管生成因子观察到相当可观的效果，但是，临床结果却令人失望。最近，有提示指出，临床失败可能是由于应用的血管生成因子或联合应用这些因子。本发明的血管生成方法克服了以前这一领域多种方法的局限性。
本发明带来一个新方法，该方法认为，血管生成是一个通过多个调控因子介导的复杂、高度调控和持续的过程。本发明的结果提供了一个研究体内或体外诱导血管生成的模型，因此，允许建立关键调控因子的表达模式。这里提供的结果显示，植入的微器官无论体内、体外，以协同方式表达几种关键血管生成因子。而且，体内试验显示，微器官作为真正意义上的血管泵，不仅通过转录血管生成因子，而且通过诱导新生血管形成来发挥功能。而且，诱导效果显著，形成的血管足以为其周围区域提供血液供给，并使小鼠和大鼠的人工诱导组织缺氧区得以自救。
在以下实施例部分提供的大鼠缺血模型模拟了慢性缺血，因为没有发生不可逆转的损害。在未治疗动物中，缺血症状仅在施加压力后出现。我们假设，在一般状态下，通过侧支循环可以保持肢体存活足够的血供，但当面临其他挑战时，血供就不足以维持正常功能。微器官的植入通过增加缺血区血供，明显逆转了这种状况。结果显示，在微器官治疗组和对照组之间差异显著，这种差异无疑是由于微器官诱导的血管生成。
在这里提供的小鼠系列体内自救实验中，缺血损害加重。与大鼠相比，由于尾动脉发育不良，小鼠后肢侧支循环不良。在该组，在对照组中可以观察到急性不可逆转的缺血损伤征兆，如坏疽和肢体自行离断。这一发现提示本发明还可能用于急救过程，但这个问题需要进一步检测。
下面提供的另一系列试验中，通过在已经致病的动物中诱导缺血使缺血更加严重。同样，仅照组动物发生不可逆转的缺血损害。对照动物的损害非常严重，以至于无法尝试应激试验。小鼠的数量很少，但差异显著。这些结果非常重要，因为这些结果提示，微器官甚至能够在受到某种外周血管疾病影响的组织中诱导血管生成。
因此，本发明提供了在宿主组织中诱导并维持血管形成的方法和组合物，目的是挽救缺血组织或在阻塞血管周围产生天然旁路。
通过查看下述实施例，本领域一般技术人员均可领会本发明的其他目的、优势和新特征，但实施例并非为了限制本发明的应用范围。此外，上述多种实施方案的每一种和本发明的所有方面，以及在下述权利要求部分声明的权利要求，均可在下面实施例部分找到实验支持。
                         实施例
现在给出下述实施例的参考文献，与上面的描述一起，以非限定方式举例说明了本发明。
通常，这里应用的术语和本发明应用的实验室方法包括分子、生化、微生物和重组DNA技术。这些技术在文献中有十分透彻的说明。见，例如“Molecular Cloning：A laboratory Manual”Sambrook et al.，(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology”Volumes I-III Ausubel，R.M.，ed.(1994)；Ausubel et al.，“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wileyand Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“A Practical Guide toMolecular Cloning”，John Wiley & Sons，New york(1988)；Watson et al.，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren et al.，(eds)“Genome Analysis：A Laboratory Manual Series”，Vols.1-4，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York(1998)；公开的方法学如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057，“Cell Biology：ALaboratory Handbook”，Volumes I-III Cellis，J.E.，ed.(1994)；“CurrentProtocols in Immunology”Volumes I-III Coligan J.E.，ed.(1994)；Stites et al.(eds)，“Basic and Clinical Immunology”(8th Edition)，Appleton & Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell and Shiigi(eds)，“Selected Methods in CellularImmunology”，W.H.Freeman and Co.，New York(1980)；可供应用的免疫试验在专利和科学文献中均有详细描述，见如，美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,967,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait，M.J.，ed.(1984)；“NucleicAcid Hybridization”Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1985)；“Transcription and Translation”Hames，B.D.，and Higgins S.J.，eds.(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney，R.I.，ed.(1986)；“Immobilized Cells andEnzymes”IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”Perbal，B.，(1984)and“Methods in Enzymology”Vol.1-317，Academic Press；“PCR Protocols：A Guide To Methods And Applications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak et al.，“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；所有文献在此全文引入，作为参考。其他常用参考文献在本文件中贯穿给出。相信这些方法是本领域众所周知的，这里给出是为了方便读者。这些文献包含的所有信息在此引入，作为参考。
                        实施例1
                    实验材料和方法
Hebrew大学科学院动物关怀应用委员会批准了动物实验。
微器官制备：
成年动物(C-57小鼠或Sprague Dawley大鼠)应用CO2窒息处死，然后在无菌条件下取出肺脏。将肺脏置于冰上，用含有4.5gm/l D-葡萄糖的Ringer液或DMEM冲洗肺脏。通过应用Sorvall组织绞碎器将肺脏绞成宽度大约为300um的碎片，来制备微器官。应用含有100单位/ml青霉素、1mg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的DMEM(Biological Industries)冲洗微器官2次，微器官置于冰上直至应用。
微器官植入：
应用每克体重0.6mg戊巴比妥钠麻醉成年C-57小鼠。将小鼠刮毛，并在胃上区域的皮肤上做一个大约2cm长的切口。应用止血钳在切口两侧创建皮下“口袋”，在每个口袋内植入8-9个微器官。植入也可简单地通过将微器官置于肌肉层之上完成。切口缝合，将动物置于温暖、明亮的房间数小时后，转到动物房。4只动物以植入后4小时、24小时、72小时和7天的间隔处死，在外科显微镜下从周围组织分离植入的微器官，用来提取RNA。应用标准方法，逆转录提取的RNA，获得的cDNA作为PCR分析的模板。下表2给出了用于PCR反应的寡核苷探针序列、预期的产物大小和参考文献。
                       表2.RT-PCR探针序列和来源
名称 Genebank# 序列 产物
Ang2 AF004326.1 F：5-CGTGGGTGGAGGAGGGTGGAC-3′(SEQ IDNO：1)R：5′-′TGCGTCAAACCACCAGCCTCC-3′(SEO IDNO：2) 400bp
β-肌动蛋白 F：5′-TACCACAGGCATTGTGATGG-3′(SEQ IDNO：3) 310bp****
R：5′-AATAGTGATGACCTGGCCGT-3′(SEQ IDNO：4)
Ang1 U83509 F：5′-GGTC′(SEQ ID NO：5) 273bp*/**
R：5′-CCAAGGGCCGGATCAGCATGG-3′(SEQ IDNO：6)
 VEGF  U41383 F：5′-ACTTTCTGCTCTCTTGGGT-3′(SEQ IDNO：7) 444，573***/**
R：5′-CCGCCTTGGCTTGTCACA-3′(SEQ IDNO：8)
*在大约320bp处经常可以探测到另一条分离的带——这条带的来源未知。**探针(Ang1)和探针序列(VEGF)由以色列Eli Keshet教授赐予。***VEGF mRNA进行不同的接合。VEGF121的PCR产物大小为444bp，VEGF165为573bp，VEGF189为645bp。****Ibrahim et al.1998 Biochimica et Biophysica Acta 1403，254-264。
光密度分析和量化：
将每个PCR反应产物10ul在溴化乙啶染色的1.5％琼脂糖凝胶上电泳。应用Macintosh Centris 660 AV计算机和配备有Toyo Optics TV变焦透镜(75-125mm，F＝1.8，带有Colkin橙02滤镜)的富士热成像系统使凝胶成像。应用公开领域的NIH 1.61分析软件进行光密度分析。通过将每个PCR反应产物表达水平标准化到β-肌动蛋白的水平，进行定量分析。应用Welsh t检验，通过与平均值比较，对植入前后非配对样本的多种VEGF异构体相对表达水平进行统计学分析。
缺血组织自救实验：
应用32只1-4月龄、体重200-300g的Sprague Dawley大鼠。应用每克体重0.9-1.1mg的喷妥撒麻醉大鼠，然后在每只大鼠接近髂动脉分叉处结扎左髂总动脉。诱导缺血24小时后，16只大鼠每只植入3-4个微器官。肌内或皮下植入微器官，使之沿股动脉(中间)和坐骨神经(两侧)分布。其他16只大鼠在诱导缺血后24小时，植入安慰品。
还检测了26只1-3月龄、体重19-27g的C57/B小鼠。在接近髂动脉分叉处结扎麻醉小鼠的左髂总动脉。诱导缺血24小时后，每只小鼠植入3-4个微器官。9只小鼠肌内或皮下植入微器官，使之沿左后肢股动脉(中间)和坐骨神经(两侧)分布。17只对照小鼠在诱导缺血后准备植入，但一直未进行植入手术。手术过程中发生血管、神经损伤，以及有显著出血的动物从实验中排除。
7只22月龄、体重24-28g的老龄C57/B小鼠也进行了结扎，如上所述进行左髂总动脉结扎。3只小鼠立即植入从正常健康同种小鼠中获得的微器官。4只小鼠立即植入安慰品。在手术过程中，没有一只小鼠发生血管、神经损伤或出现显著出血。
功能试验：
动物在植入后第1天和第2天进行测试，以排除神经损伤。试验包括在浴缸中温暖适度的水中游泳，浴缸中所放水的水平使动物必须持续应用四肢以保持漂浮状态。锻炼的时间界限逐渐增加。第1周，时间界限是3分钟或直至竭尽全力而不能保持漂浮。第2周，时间界限增加到5分钟，从第3周起，时间界限是6分钟。创建0-10分量表来评价肢体跛行程度。0-1分表示步态正常或接近正常。2-3分表示轻到中度跛行，但可以负担正常体重。4-5分表示中度跛行，但在负担体重时有困难。6-7分表示严重跛行。8-9分表示肢体功能不全、萎缩或挛缩，10分表示肢体发生坏疽或自行离断。分数由与本试验无关的独立观察者给出，该观察者以前没有动物处理知识。
血管造影：
植入后4，14，26和31天，对几只大鼠进行了血管造影。大鼠如上述进行麻醉，然后从右侧表浅的股动脉插入P10导管，并置入主动脉。弹丸注射1cc Telebrix，然后给动物每0.5秒拍照一次。从试验组中排除进行血管造影的动物。
                        实验结果
植入微器官诱导血管生成：
图1显示了周围组织对植入微器官的反应。当同种动物皮下植入微器官，它可以诱导朝向微器官的血管生成反应(箭头，图1)。一条主要血管形成，并分支形成小血管，所述小血管进一步分支，在植入微器官周围形成毛细血管网。
同种小鼠皮下植入微器官时，微器官可以转录形成持续、互动的多种血管生成因子。图2显示了几种已知血管生成因子的半定量分析，所述生长因子是从微器官中提取RNA进行RT-PCR分析后测定的。从结果可以看出，血管生成因子的强诱导发生在植入后(PI)4小时。初次诱导后，每种单独的生长因子表现出不同的表达形式，在下面将进一步细化。
VEGF：VEGF转录水平持续上升至PI 24小时。PI 3天，VEGF转录水平下降。在随后的几天里，可以检测到该血管生成因子的较低mRNA水平，该水平为维持因此形成的新生血管生成状态可能是必需的。PI 7天，VEGF mRNA水平回复到微器官植入时(t0)检测到的相似水平。
血管生成素1：PI头4小时，Ang1 mRNA水平上升，尽管差异较大。PI 1-3天，转录水平降低到甚至比微器官植入时(t0)检测到的水平还低(见Maisonpierre et al.，1997，Science 277，55-60，Gale and Yancopolous，1999 Ibid.)。PI 7天，Ang1 mRNA水平回复到t0时检测到的相似水平。
血管生成素2：Ang2，Ang1拮抗剂，在PI 24小时高水平转录。PI 3-7天mRNA水平下降，尽管该水平仍较t0时检测到的水平高。该现象可能是因为在植入微器官内或周围存在的持续血管再建。
因此，如这些结果提供的证据所示，植入的微器官转录形成了互动的多种因子，包括刺激因子和抑制因子，参与血管生成的调控。与微器官周围新生血管生成有关的转录形式可以持续至少PI 1周。
培养微器官转录形成持续、互动的多种血管生成生长因子：
为了测定体外培养的微器官转录血管生成因子的能力，如上制备的微器官再没有血清的培养基中生长1个月以上。在多个时间点取出样本，分析几种因子的mRNA水平。图4显示了几种已知血管生成因子的半定量分析，所述生长因子是从培养微器官中提取RNA进行RT-PCR分析后测定的(图3)。在两个图中，血管生成因子表达的强诱导发生在培养后4小时。初次诱导后，每种不同的生长因子表现出不同的表达形式，在下面将详细阐述。
VEGF：VEGF表达水平持续上升至培养后24小时。培养后3天，VEGF表达水平下降，仅在PI 7天再次上升。在随后的几天里，表达水平下降，并且VEGF的表达回复到与微器官培养时可比的水平。
血管生成素1：培养后头4小时，Ang1表达水平上升，尽管差异较大。培养后1-3天，表达降低到甚至比培养时还低的水平。培养后7天，Ang1表达回复到与微器官培养时可比的水平。
血管生成素2：Ang2，Ang1拮抗剂，在培养后1天高水平表达。培养3-7天后，表达水平下降，尽管该水平仍较培养时的表达水平高。
因此，如这些结果提供的证据所示，体外培养的微器官在体外培养1个月以上，仍有活性和功能，并表达多种互动的血管生成因子，包括刺激因子和抑制因子，参与血管生成的调控。
微器官植入逆转大鼠、小鼠肢体缺血：
系列1：如上所述，32只大鼠结扎左髂总动脉。其中16只大鼠进行微器官植入，而其余16只大鼠作为对照组(安慰品植入)。所有32只大鼠手术后存活。两组在施加压力前没有显著差异(图5)。施加压力后，可以看到显著差异；对照组平均累计跛行评分为4.8，而微器官植入组评分为1.6(图6)。在整个研究阶段记录了相似的结果。对照组在手术后(PO)6-10天评分为5，PO 11-15天评分为5，PO 17天评分为4。微器官植入组的评分分别为1.67，1.5和1.7。应该指出，微器官植入组包括一只平均评分为6.5的大鼠。组织学检查发现，这只大鼠的微器官植入体存在坏死。
系列2：如上所述，26只C57/B年轻小鼠进行手术，无手术损伤或术前死亡。其中9只小鼠进行微器官植入，而其余17只小鼠作为对照组(安慰品植入)。在17只对照小鼠中，4只在缺血诱导肢体发生坏疽，并在PO 2-3天后死亡(23.5％)。该组另一只小鼠在手术后8天发生萎缩肢体的自行离断(5.9％)。微器官植入小鼠中无一只发生坏疽、肢体自行离断或术后死亡(0％)。对照组施加压力后平均累计跛行评分为6，PO 5-9天的评分为7.7，PO 13-19天的评分为6.2，PO 21-25天的评分为4.1。微器官植入组平均累计跛行评分为2.4，PO 5-9天的评分为1.8，PO 13-19天的评分为2.2，PO 21-25天的评分为3.1(图7)。
在老龄小鼠中微器官植入自救缺血肢体：
阶段3：7只老龄C57/B小鼠进行手术，无手术损伤或死亡。3只小鼠接受了微器官植入，4只作为对照。在对照组中，1只小鼠发生了坏疽并在PO 3天死亡(25％)，1只小鼠在PO 5天发生萎缩肢体自行离断(25％)。其余2只小鼠在静息时没有肢体功能障碍(跛行指数评分为8)。微器官植入组中没有一只小鼠发生坏疽或肢体自行离断(0％)，它们1周时的平均跛行评分为5.7。
植入的微器官具有活性和血管生成功能：
在大鼠切片样本中，微器官植入体具有活性，并保持结构完整，无证据显示存在排斥反应。通过显微镜观察可见血管提示，微器官及周围肌肉组织存在血管生成。
血管造影提示在微器官植入大鼠存在血管生成活性：
在PO 4，14，26和31天进行血管造影。微器官处理组和对照组存在轻微但可辨别的差异。植入肢体血管生成活性的增加早在PO 4天就可探测到。PO 16天，可以在植入肢体观察到中等大小的新生血管。
                        实施例2
                       脾脏微器官
小鼠脾脏微器官如上所述制备，并植入同种小鼠。图8显示植入同种小鼠皮下并在植入后6个月进行检查的微器官(箭头)。如图8清晰显示，微器官诱导了血管生成。实际上，血管形成的方式留给人的印象是，微器官是宿主固有的器官。
                        实施例3
                     角膜微器官植入
角膜是机体唯一没有血管的组织。因此，角膜是研究血管生成的绝佳模型组织。将大鼠肺微器官植入同种大鼠角膜。如图9所示，角膜中诱导出现明显的血管生成图象。这些显著的结果进一步显示，微器官可以有效诱导、促进血管生成。
尽管本发明是与特定实施方案共同阐述的，但对于本领域的技术人员来说，可以进行很多改变、修饰和变化是显而易见的。因此，有意进行的所有改变、修饰和变化都在随后所附的权利要求的宗旨和范围之内。这此说明书中提到的所有文献、专利、专利申请和公开序列和/或通过基因文库准入序号鉴定的序列，在此全文引入，作为本说明书的参考，其程度等同于每个单独的文献、专利、专利申请或序列在此特异、单独引入，作为参考。此外，本申请中任何参考文献的引用或提及都不应将这些参考文献视为是本发明的现有技术。
                    序列表<110>E.N.米特拉尼(Eduardo N.Mitrani)<120>应用微器官诱导血管生成的方法<130>20095<150>60/140,748<151>1999年6月25日<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物<400>1CGTGGGTGGA GGAGGGTGGA C 21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物<400>2TGCGTCAAAC CACCAGCCTC C 21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物<400>3TACCACAGGC ATTGTGATGG 20<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物<400>4AATAGTGATGA CCTGGCCGT 18<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物<400>5GGTCACACAG GGACAGCAGG 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物<400>6CCAAGGGCCG GATCAGCATG G 21<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物<400>7ACTTTCTGCT CTCTTGGGT 19<210>8<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：PCR引物<400>8CCGCCTTGGC TTGTCACA 18

Claims (36)

1.在第一个哺乳动物组织中诱导血管生成的方法，该方法包括在第一个哺乳动物组织中植入至少一个微器官的步骤，所述至少一个微器官可以产生多种血管生成因子，进而诱导血管生成。
2.权利要求1的方法，其中所述至少一个微器官是从第二个哺乳动物器官组织中获得的。
3.权利要求2的方法，其中第一个哺乳动物和所述第二个哺乳动物是单个哺乳动物。
4.权利要求2的方法，其中所述器官选自肺脏、肝脏、肾脏、肌肉、脾脏、皮肤和心脏。
5.权利要求1的方法，其中所述至少一个微器官包括两种或两种以上细胞类型。
6.权利要求1的方法，其中第一个哺乳动物是人类。
7.权利要求1的方法，其中所述至少一个微器官在植入第一个哺乳动物组织内之前，体外培养至少4小时。
8.权利要求1的方法，其中所述至少一个微器官在制备过程中需要保证，在植入第一个哺乳动物组织中时依然保持活性。
9.权利要求8的方法，其中所述至少一个微器官具有维度，这样位于所述至少一个微器官最深处的细胞，距离所述至少一个微器官最近表面至少约100微米，但不超过约225-350微米。
10.权利要求1的方法，其中所述多种血管生成因子中的每一种在所述至少一个微器官中都具有独特的表达模式。
11.权利要求1的方法，其中所述至少一个微器官的至少一部分细胞包括至少一个外源性多核苷酸序列，选择的所述序列是为了调控血管生成。
12.权利要求11的方法，其中所述至少一个外源性多核苷酸序列与所述至少一个微器官的所述至少一部分细胞的基因组整合。
13.权利要求12的方法，其中设计的所述至少一个外源性多核苷酸序列是为了调控所述多种血管生成因子中的至少一种血管生成因子表达。
14.权利要求13的方法，其中所述至少一个外源性多核苷酸序列包括一个增强子或抑制子序列。
15.权利要求11的方法，其中所述至少一个外源性多核苷酸序列的表达产物能够调控所述多种血管生成因子中至少一种血管生成因子的表达。
16.权利要求11的方法，其中所述至少一个外源性多核苷酸序列编码至少一种重组血管生成因子。
17.在第一个哺乳动物组织中诱导血管生成的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从至少一个微器官中提取可溶性分子；并
(b)将至少一个预定剂量的从步骤(a)提取的所述可溶性分子导入第一个哺乳动物的组织中。
18.权利要求17的方法，其中所述可溶性分子在进行步骤(b)之前与药用载体混和。
19.权利要求17的方法，其中所述至少一个微器官来自第二个哺乳动物的器官组织。
20.权利要求17的方法，其中所述至少一个微器官在提取所述可溶性分子前至少培养4小时。
21.权利要求17的方法，其中所述至少一个微器官具有维度，这样位于所述至少一个微器官最深处的细胞，距离所述至少一个微器官最近表面至少约100微米，但不超过约225-350微米。
22.一种药物组合物，包括作为活性成分的从至少一个微器官中提取的一种可溶性分子和一种药用载体。
23.含有多种细胞的微器官，其中所述多种细胞的至少一部分细胞包括至少一个外源性多核苷酸序列，所述至少一个外源性多核苷酸序列能够调控至少一种血管生成因子在所述细胞中的表达。
24.权利要求23的微器官，其中微器官来自第二个哺乳动物的器官组织。
25.权利要求24的微器官，其中第一个哺乳动物和第二个哺乳动物是单个哺乳动物。
26.权利要求23的微器官，其中所述器官选自肺脏、肝脏、其他胃肠道衍生器官、肾脏、脾脏和心脏。
27.权利要求23的微器官，其中所述至少一个微器官包括两种或两种以上细胞类型。
28.权利要求23的微器官，其中微器官具有维度，这样位于微器官最深处的细胞，距离微器官最近表面至少约100微米，但不超过约225微米。
29.权利要求23的微器官，其中所述至少一个外源性多核苷酸序列与所述多种细胞的所述至少一部分的基因组整合。
30.权利要求23的微器官，其中所述至少一个外源性多核苷酸序列包括一个增强子或抑制子序列。
31.权利要求23的微器官，其中所述至少一个外源性多核苷酸序列的表达产物能够调控所述至少一种血管生成因子的表达。
32.在第一个哺乳动物组织中诱导血管生成的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)在生长培养基中培养至少一个微器官，从而产生条件培养基；
(b)在培养至少一个预定时期后，收获条件培养基；并
(c)给第一个哺乳动物的组织应用至少一个预定剂量的从步骤(b)收获的条件培养基，进而诱导组织血管生成。
33.权利要求32的方法，其中所述至少一个微器官来自第二个哺乳动物的器官组织。
34.权利要求32的方法，其中所述至少一个微器官在收获所述条件培养基之前至少培养4小时。
35.权利要求32的方法，其中所述至少一个微器官具有维度，这样位于所述至少一个微器官最深处的细胞，距离所述至少一个微器官最近表面至少约100微米，但不超过约225-350微米。
36.权利要求32的方法，其中所述生长培养基是基本必需培养基。
CN00811874A 1999-06-25 2000-06-22 应用微器官诱导血管生成的方法 Pending CN1420933A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14074899P 1999-06-25 1999-06-25
US60/140748 1999-06-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1420933A true CN1420933A (zh) 2003-05-28

Family

ID=22492636

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN00811874A Pending CN1420933A (zh) 1999-06-25 2000-06-22 应用微器官诱导血管生成的方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20030086914A1 (zh)
EP (2) EP1374889A1 (zh)
JP (3) JP2003535025A (zh)
CN (1) CN1420933A (zh)
AU (1) AU5423300A (zh)
CA (2) CA2377541A1 (zh)
WO (1) WO2001000859A1 (zh)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030157074A1 (en) * 1994-11-16 2003-08-21 Mitrani Eduardo N. Vitro micro-organs, and uses related thereto
WO2003035851A1 (en) * 2001-10-23 2003-05-01 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem In vitro micro-organs, and uses related thereto
US7687057B2 (en) * 1998-01-09 2010-03-30 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem In vitro micro-organs, and uses related thereto
US20030152562A1 (en) * 2001-10-23 2003-08-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Vitro micro-organs, and uses related thereto
US7468242B2 (en) 2001-11-05 2008-12-23 Medgenics, Inc. Dermal micro organs, methods and apparatuses for producing and using the same
KR100954987B1 (ko) * 2001-11-05 2010-04-29 메드제닉스 인코포레이티드 조직 기재 치료를 위한 폐쇄된 자동화 시스템, 이를 이용한 투약 및 투여 방법
US8088568B2 (en) 2001-11-05 2012-01-03 Medgentics, Inc. Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same
US8501396B2 (en) 2001-11-05 2013-08-06 Medgenics Medical Israel Ltd. Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same
US7297540B2 (en) 2002-01-15 2007-11-20 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Methods of generating tissue using devitalized, acellular scaffold matrices derived from micro-organs
AU2003242967A1 (en) * 2002-07-12 2004-02-02 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Method and device for inducing biological processes by micro-organs
JP5128813B2 (ja) 2003-05-01 2013-01-23 メドジニックス・インコーポレイテッド 真皮小器官及びそれを作成及び使用するための方法及び器具
IL155783A (en) 2003-05-05 2010-11-30 Technion Res & Dev Foundation Multicellular systems of multi-potential embryonic human stem cells and cancer cells and their use
US20050244967A1 (en) * 2004-05-03 2005-11-03 Pearlman Andrew L Closed automated system for tissue based therapy
WO2007047718A2 (en) * 2005-10-18 2007-04-26 Caritas St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Generation and use of vasculogenic tumors
US8038595B2 (en) 2006-01-25 2011-10-18 Beth Israel Deaconess Medical Center Devices and methods for tissue transplant and regeneration
US8454948B2 (en) 2006-09-14 2013-06-04 Medgenics Medical Israel Ltd. Long lasting drug formulations
KR101470472B1 (ko) 2006-09-14 2014-12-09 메드제닉스 메디칼 이스라엘 리미티드 장기 지속형 약물 제형
IL196820A0 (en) 2009-02-01 2009-11-18 Yissum Res Dev Co Devitalized, acellular scaffold matrices derived from micro-organs seeded with various cells
KR101591887B1 (ko) 2010-06-15 2016-02-04 메드제닉스 메디칼 이스라엘 리미티드 장기 지속형 약물 제형
JP2017195778A (ja) * 2014-09-01 2017-11-02 株式会社オーガンテクノロジーズ 三次元血管網を有する器官をｉｎｖｉｖｏで形成させる方法、及び、三次元血管網を有する器官の形成用組成物
CN111500447B (zh) * 2020-04-26 2023-06-06 广东康盾创新产业集团股份公司 一种用于免疫细胞扩增的细胞培养装置
CN111588423A (zh) * 2020-06-08 2020-08-28 刘绍才 一种可微调切割面积的病变细胞组织切除装置
CN114812463B (zh) * 2022-06-27 2022-09-30 山西嘉世达机器人技术有限公司 检测清洁机到达边缘的方法、检测装置、清洁机和介质

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) * 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) * 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) * 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) * 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) * 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) * 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
US3850578A (en) * 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) * 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) * 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) * 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) * 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) * 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4391909A (en) * 1979-03-28 1983-07-05 Damon Corporation Microcapsules containing viable tissue cells
US4879219A (en) * 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
US4353888A (en) * 1980-12-23 1982-10-12 Sefton Michael V Encapsulation of live animal cells
JPS59134728A (ja) * 1983-01-21 1984-08-02 Seiji Takayama 免疫抗癌剤及びその製法
US5011771A (en) * 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4736866A (en) * 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals
US4666828A (en) * 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
JPS61233694A (ja) * 1985-04-08 1986-10-17 Morinaga & Co Ltd ウシ脾臓中に含まれる成長因子及びその単離方法
US4801531A (en) * 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US4883666A (en) * 1987-04-29 1989-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders
DE3854823T2 (de) * 1987-05-01 1996-05-23 Stratagene Inc Mutagenesetest durch Verwendung von nicht menschlichen Lebewesen, die Test-DNS-Sequenzen enthalten
US5175385A (en) * 1987-09-03 1992-12-29 Ohio University/Edison Animal Biotechnolgy Center Virus-resistant transgenic mice
US5106627A (en) * 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US4892538A (en) * 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5055296A (en) * 1988-08-04 1991-10-08 Wagle Sudhakar S Method of treating chronic fatigue syndrome
US5221778A (en) * 1988-08-24 1993-06-22 Yale University Multiplex gene regulation
US5272057A (en) * 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5175384A (en) * 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5175383A (en) * 1989-02-17 1992-12-29 President And Fellows Of Harvard College Animal model for benign prostatic disease
US5464764A (en) * 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
US5192659A (en) * 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
DE69133372T2 (de) * 1990-06-15 2005-02-24 Scios Inc., Sunnyvale Transgenes, nicht-menschliches säugetier das die amyloidbildende pathologie der alzheimerschen krankheit zeigt
US5288846A (en) * 1990-10-19 1994-02-22 The General Hospital Corporation Cell specific gene regulators
US5298422A (en) * 1991-11-06 1994-03-29 Baylor College Of Medicine Myogenic vector systems
US5281521A (en) * 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
US5888720A (en) * 1992-10-27 1999-03-30 Yissum Research And Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem In vitro micro-organs
US20030157074A1 (en) * 1994-11-16 2003-08-21 Mitrani Eduardo N. Vitro micro-organs, and uses related thereto
US20030152909A1 (en) * 1994-11-16 2003-08-14 Mitrani Eduardo N. In vitro micro-organs, and uses related thereto
US6472200B1 (en) * 1999-07-23 2002-10-29 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Device and method for performing a biological modification of a fluid
US6372482B1 (en) * 1997-01-16 2002-04-16 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Device and method for performing a biological modification of a fluid
US6090618A (en) * 1996-10-07 2000-07-18 Arch Development Corporation DNA constructs and viral vectors comprising a smooth muscle promoter
CA2274902C (en) * 1996-12-10 2011-02-01 Purdue Research Foundation Submucosa extracts
AU6691098A (en) * 1997-03-07 1998-09-22 Wistar Institute Of Anatomy & Biology, The Method and compositions for healing tissue defects and inducing hypervascularityin mammalian tissue
US6110459A (en) * 1997-05-28 2000-08-29 Mickle; Donald A. G. Transplants for myocardial scars and methods and cellular preparations
CA2298811A1 (en) * 1997-07-31 1999-02-11 St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Method for the treatment of grafts
EP1011328A4 (en) * 1997-08-15 2001-05-16 Ludwig Inst Cancer Res STIMULATING, MODULATING AND / OR INHIBITING ENDOTHELIAL PROTEOLYTIC ACTIVITY AND / OR ANIGIOGENIC ACTIVITY
US7687057B2 (en) * 1998-01-09 2010-03-30 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem In vitro micro-organs, and uses related thereto
US20030152562A1 (en) * 2001-10-23 2003-08-14 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Vitro micro-organs, and uses related thereto

Also Published As

Publication number Publication date
EP1190082A1 (en) 2002-03-27
AU5423300A (en) 2001-01-31
US20030086914A1 (en) 2003-05-08
JP2011087592A (ja) 2011-05-06
EP1190082A4 (en) 2003-07-02
WO2001000859A1 (en) 2001-01-04
CA2377541A1 (en) 2001-01-04
EP1374889A1 (en) 2004-01-02
CA2435411A1 (en) 2001-01-04
JP2004073206A (ja) 2004-03-11
JP2003535025A (ja) 2003-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1420933A (zh) 应用微器官诱导血管生成的方法
TWI278517B (en) Methods and compositions for the differentiation of human preadipocytes into adipocytes
CN102639692B (zh) 来源于胎盘的贴壁细胞及其在疾病治疗中的应用
CN1728946A (zh) 获得活的人肝细胞,包括肝干/祖细胞的方法
JP2001103968A (ja) 微小投射物衝撃による脊椎動物細胞のトランスフォーメーション
CN1372450A (zh) 强化的用于加速伤口愈合的伤口覆盖物
CN1622994A (zh) TGF－β特异性共价闭合反义分子
CN1571835A (zh) 在创伤治疗中可用作生物活性物质的角质细胞
CN1533431A (zh) 细胞移植的方法和试剂
CN1514723A (zh) 用于治疗炎症的脂肪醇和脂肪酸酯
CN1192781A (zh) 神经衍生胎儿细胞系在移植治疗中的应用
CN1860222A (zh) 用于临床和商业用途的干细胞
CN104548137A (zh) 一种含lncRNA抑制剂的药物组合物及其用途
CN1812800A (zh) 用于促进和增强神经修复和再生的肌肉来源的细胞(mdc)
CN108753682A (zh) 促内皮细胞成血管的外泌体活性制剂及其制备方法和应用
CN1897959A (zh) 用于治疗和预防脓毒病和粘连形成的组织保护细胞因子
CN111944748A (zh) 一种用于治疗心肌梗死的高表达il-10的人脂肪间充质干细胞外泌体及其用途
CN101076316A (zh) 用于促进纤蛋白－5产生和/或提高纤蛋白－5活性的组合物和方法
WO2022247848A1 (zh) 毛囊间充质干细胞的制备方法以及应用
JP2005533102A (ja) 微小器官によって生物学的プロセスを誘発する方法と装置
CN1289156C (zh) 组织工程自体角膜上皮及其制备方法
CN109234381A (zh) miR-2682-5p作为肾纤维化标志物的应用
CN1795204A (zh) 鹿角萃取液
CN111944747A (zh) 一种用于治疗心肌梗死的人脂肪间充质干细胞外泌体及其用途
CN111925983A (zh) 一种用于治疗心肌梗死的高表达il-10的人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1056379

Country of ref document: HK