CN101076316A - 用于促进纤蛋白－5产生和/或提高纤蛋白－5活性的组合物和方法 - Google Patents

用于促进纤蛋白－5产生和/或提高纤蛋白－5活性的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于促进纤蛋白－5产生和/或提高纤蛋白－5活性的组合物，其包含作为有效成分的一种或多种选自大托叶云实(Caesalpinia crista)提取物、四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)提取物、植酸及其生理可接受盐、以及L－羟脯氨酸及其生理可接受盐的药物。

Description

用于促进纤蛋白-5产生和/或提高纤蛋白-5活性的组合物和方法
技术领域
本发明涉及用于促进纤蛋白-5(fibulin-5)产生和/或提高纤蛋白-5活性的组合物和方法。
背景技术
在具有伸缩性的器官：皮肤、血管、肺等中，弹性对发挥其功能而言是重要的。弹力纤维是带来组织弹性的细胞基质，关于弹力纤维的构建的研究在以老化为首的多种生理学现象方面是盛行的。
肌原纤蛋白-1(fibrillin-1)形成微原纤维，构成弹力纤维形成的骨架。弹性蛋白在微原纤维内通过赖氨酰氧化酶的作用形成交联并聚合、沉积在组织内而构建弹力纤维。纤蛋白为广泛表达的分泌蛋白质，为在血液中、大部分组织的基底膜和间质中存在的生理活性物质。纤蛋白在这些地方自缔合(Balbona，K.等人，J.Biol.Chem.267：20120-20125，1992；Pan，T.C.等人，J.Biol.Chem.123：1269-1277，1993)和/或与多种细胞外基质成分(如纤连蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、内皮抑制素、弹性蛋白)相互作用(Aspberg，A.等人，J.Biol.Chem.274：20444-20449，1999；Nakamura，T.等人，Nature 415：171-175，2002；Timpl，R.等人，2003(见上文)；Yanagisawa，H.等人，Nature 415：168-171，2002)。认为纤蛋白与细胞外基质结构的构建和稳定化有关，以前也指出纤蛋白参与器官形成、血管形成、纤维形成、肿瘤形成的调节(Roark，E.f.等人，J.Histochem.Cytochem.43：401-411，1995；Tran，H.等人，J.Biochem.270：19458-19464，1995；Zhang，H.Y.等人，Dev.Dyn.205：348-364，1996)。据报道纤蛋白基因家族中有5种不同的基因，自这些基因通过选择性剪接能产生9种以上的蛋白质产物(Timpl，R.等人，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.4：479-489，2003)。
虽然对构建弹力纤维的关键蛋白质还没有充分地了解，但通过2002年所揭示的纤蛋白家族最新成员纤蛋白-5的基因敲除小鼠的弹力纤维形成异常(Nakamura，T.等人，2002(见上文)；Yanagisawa，H.等人，2002(见上文))，了解到纤蛋白-5对于构建弹力纤维而言是重要的。
纤蛋白-5为由448个氨基酸组成的糖蛋白，具有很让人感兴趣的构造上的特点。纤蛋白-5包含与整联蛋白结合的RGD基序、与钙结合的上皮生长因子样的6个重复区域、与钙结合的第一上皮生长因子样重复区域中的富含脯氨酸的插入部位、以及球状的C末端结构域(Kowal，R.C.等人，Circ.Res.84：1166-76，1999；Nakamura，T.等人，1999(见上文))。纤蛋白-5基因具有与αvβ3整联蛋白、αvβ5整联蛋白、α9β1整联蛋白结合(Nakamura，T.等人，2002(见上文))，通过RGD基序附着内皮细胞的功能(Nakamura，T.等人，1999(见上文))。在小鼠中失活纤蛋白-5基因会引起皮肤、肺、血管系统显著的弹性纤维病(elastinopathy)(Nakamura，T.等人，2002(见上文)；Yanagisawa，H.等人，2002(见上文))。
另外，明白了提高纤蛋白-5产生的转化生长因子β1(TGFb1)(Schiemann，WP.等人，J.Biol.Chem.2002年7月26日，277(30)：27367-77)在使用平滑肌细胞或成纤维细胞的三维培养体系中促进弹力纤维的再构建，并明白了提高纤蛋白-5产生不仅对胎儿期的弹力纤维构建重要，对弹力纤维的再构建也是重要的(Long，JL.等人，Matrix Biol.2003年6月，22(4)：339-50)。因此，调节纤蛋白-5的产生和/或活性对调节弹力纤维的再构建是重要的，由此期待发现能够调节纤蛋白-5的产生和/或活性的物质。
发明公开
本发明的课题是提供促进纤蛋白-5产生和/或提高纤蛋白-5活性的药物。
本发明人向人成纤维细胞应用不同的药物，在研究纤蛋白-5基因表达的动向时，发现特定的药物，具体地说是大托叶云实(Caesalpinia crista)提取物、四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)提取物、植酸和L-羟脯氨酸能显著地提高纤蛋白-5基因的表达，从而完成了本发明。
因此，本申请提供了以下发明：
(1)用于促进纤蛋白-5产生和/或提高纤蛋白-5活性的组合物，其包含作为有效成分的一种或多种选自大托叶云实提取物、四棱豆提取物、植酸及其生理可接受盐、以及L-羟脯氨酸及其生理可接受盐的药物。
(2)用于促进生物体组织的纤蛋白-5产生和/或提高纤蛋白-5活性的方法，其通过向生物体组织应用组合物而实施，其中所述组合物包含作为有效成分的一种或多种选自大托叶云实提取物、四棱豆提取物、植酸及其生理可接受盐、以及L-羟脯氨酸及其生理可接受盐的药物。
(3)(2)的方法，其中所述生物体组织为皮肤。
本发明提供了用于促进纤蛋白-5产生和/或提高纤蛋白-5活性的组合物。所述组合物和方法可有效地促进生物体内弹力纤维的发生和再构建、防止老化、治愈创伤、抑制血管形成。
用于实施发明的最佳方案
如开头所述，纤蛋白-5有助于正常弹力纤维的发生和再构建，因此认为在皮肤、血管、肺等弹力纤维于其中发挥重要作用的生物体组织器官内，纤蛋白-5的产生和其所具有的生理活性的显现对所述器官的正常功能而言是必需的。因此，认为本发明的对于促进纤蛋白-5产生和/或提高纤蛋白-5活性有效的药物(下文中有时仅称为“本发明的药物”)可有效地改善以弹力纤维异常为病因的多种症状，如肺气肿、动脉弯曲、由年龄增加所引起的皮肤老化现象如皮肤松懈和皱纹等。
进一步地，作为本发明的药物所发挥的其它效果，根据纤蛋白-5的已知功能，可例举如下。
M.J.Lee等人，J.Am.Coll.Surg.2004年(9月)，199(3)：403-10中描述了将纤蛋白-5逆转录病毒导入兔子的皮肤创伤部位，通过在该部位过量表达纤蛋白-5而引起创伤早期闭合、促进治愈。因此，可预期通过将本发明的药物应用至创伤部位，能促进创伤治愈。
Ping-ping Kuang等人，Am.J.Physiol.Lung Cell Mol.Physiol.285(5)：L1147-52，Epub 2003年(8月8日)发表的文章描述了在患有高氧症所致肺损伤的小鼠中，提高纤蛋白-5的表达量可修复肺损伤，因此纤蛋白-5为与弹性蛋白协同的修复肺损伤的关键蛋白质。因此，可预期通过通过将本发明的药物应用于高氧症所致肺损伤，能促进肺损伤的治愈。
A.R.Albig等人，DNA Cell Biol.2004年6月，23(6)：367-79中描述了纤蛋白-5能抑制血管形成，教导了其作为不适当血管形成的新拮抗物使用的可能性。因此，可预期本发明的药物作为血管形成的拮抗物如作为糖尿病、网膜症、关节炎、癌症的预防药和治疗药的效果。
本发明的用于促进纤蛋白-5产生和/或提高纤蛋白-5活性的组合物含有作为有效成分的一种或多种选自大托叶云实提取物、四棱豆提取物、植酸及其生理可接受盐、以及L-羟脯氨酸及其生理可接受盐的药物，优选地根据所述组合物的用途，其还含有药学可接受的或化妆学可接受的载体和/或添加物。
“大托叶云实(学名：Caesalpinia crista)”为豆科(Leguminosae)云实属(Caesalpinia)植物。本发明的大托叶云实提取物主要自种子提取。所述提取物可用常规方法制备，也可使用市售产品(如可获自丸善制药)。
“四棱豆(学名：Psophocarpus tetragonolobus)”为豆科(Leguminosae)四棱豆属(Psophoearpus)植物。本发明的四棱豆提取物主要自种子提取。所述提取物可用常规方法制备。
上述大托叶云实提取物和四棱豆提取物如上所述，可通过通常公知的方法自各自的原料植物提取而制备。例如，将原料植物新鲜的或根据需要干燥后，原样地或粉碎后与提取溶剂一同浸渍或加热回流后，过滤并浓缩而获得。此时所用的提取溶剂可为通常用于提取植物提取物的任一溶剂。可以例举例如热水、低级醇(甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇等)、多价醇(丙二醇、1，3-丁二醇等)、这些醇类的含水物、烃类溶剂(正己烷、甲苯等)、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳、乙酸乙酯、醚等、或它们的混合物等有机溶剂，优选乙醇或1，3-丁二醇。
本发明的组合物中所述提取物的混合量为：其作为干燥物，占组合物总量的0.0002～20.0质量％，优选地为0.001～1.0质量％。由于该混合量不足0.0002质量％时不能充分发挥本发明的效果，并且超过20.0质量％时难于制剂，所以不优选。
植酸，别名为“肌醇六磷酸”，在谷类等种子植物和幼植物中大量存在，为发挥磷酸的主要贮存物质的生物体物质。显示强的金属螯合作用，能除去铁等金属离子或使其无活性。近年，其癌抑制效果令人瞩目。
其生理可接受的盐形式中可例举例如碱金属盐例如钠盐、钾盐，如二钠盐、二钾盐；碱土金属盐例如钙盐、镁盐、铝盐、镁盐、钙镁混合盐；由各种有机胺即脂肪族或芳基脂肪族的伯、仲或叔单胺、二胺或多胺、或者由杂环碱形成的胺盐，如衍生自三乙胺、2-羟乙胺、二-(2-羟乙基)胺、三-(2-羟乙基)胺、4-氨基苯甲酸-2-二乙基氨基乙基酯、1-乙基哌啶、双环己胺、N，N’-二苄基-乙二胺、吡啶、可力丁、喹啉、普鲁卡因、二苄基胺、1-ephenamine和N-烷基哌啶的盐，但不限于此。植酸的结构如下所示。
L-羟脯氨酸，别名“(2S，4R)-4-羟基吡咯烷-2-甲酸”，为动物的结构蛋白质，如为构成胶原蛋白和弹性蛋白的亚氨基酸。其作用已知有促进成纤维细胞中胶原蛋白的产生、促进表皮细胞增殖的效果、与胶原蛋白相同或更高的保湿效果等。
其生理可接受的盐形式中可例举例如碱金属盐例如钠盐、钾盐；碱土金属盐例如钙盐、镁盐和铝盐；由各种有机胺即脂肪族或芳基脂肪族的伯、仲或叔单胺、二胺或多胺、或者由杂环碱形成的胺盐，如衍生自三乙胺、2-羟乙胺、二-(2-羟乙基)胺、三-(2-羟乙基)胺、4-氨基苯甲酸-2-二乙基氨基乙基酯、1-乙基哌啶、双环己胺、N，N’-二苄基-乙二胺、吡啶、可力丁、喹啉、普鲁卡因、二苄基胺、1-ephenamine和N-烷基哌啶的盐，但不限于此。L-羟脯氨酸的结构如下所示。
Figure A20058004243600081
本发明的组合物中上述植酸或L-羟脯氨酸的混合量为占组合物总量的0.0002～20.0质量％，优选地为0.001～1.0质量％。由于该混合量不足0.0002质量％时不能充分发挥本发明的效果，并且超过20.0质量％时难于制剂，所以不优选。
本发明的组合物根据其用途可制剂为多种剂型。例如，当本发明的组合物作为用于改善皮肤松弛的抗老化剂使用时，可采用皮肤外用剂的剂型，例如作为化妆品，可采用化妆水、美容液、胶状体、粉底、乳液、面霜、软膏、面膜、气溶胶、凝胶、液体剂等涂抹剂；绑带剂、贴片剂等贴剂；或喷剂、粉剂等喷雾剂。另外，当本发明的组合物用于血管或肺的预防、治疗等处理方法中时，根据方案，可采用适合经皮施与、经口施与、非经口施与、经肠施与、静脉内施与、皮下施与、骨髓注射等任一施用方法的多种剂型，如溶液、悬浮液、固体、半固体、粉状体、颗粒、胶囊、脂质体封入体等剂型。
本发明的组合物根据其目的，可含有合适量的与本发明药物相适应的且药学或化妆学可接受的载体。合适的载体为例如水、生理盐水如磷酸缓冲的生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇或它们的混合物。进一步地，根据希望，组合物可适当包含增强所述药物的效果的辅助物质，如湿润剂、保湿剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂、抗氧化剂、香料、风味剂、pH缓冲剂等药学或化妆学可接受的添加物。
作为这样的药学或化妆学可接受的添加物的例子为例如甘露醇、山梨醇、乳糖、胶原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙二醇、双甘油、甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、十八烷醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂等。
预计本发明的组合物如上所述，通过例如防止老化、促进创伤治愈、促进高氧症所致肺损伤的治愈、抑制血管形成，对例如糖尿病、网膜症、关节炎、癌症等产生预防和治疗效果。因此，预计本发明的组合物根据其目的，应用于包括人在内的多种哺乳动物的生物体组织如皮肤组织、肺组织、血管组织，可发挥所希望的效果。所述应用方法根据应用组织和应用目的而不同，可例举例如经皮施与、经口施与、非经口施与、经肠施与、静脉内施与、皮下施与、骨髓注射等，能由医师、兽医、药剂师等医药专家决定合适的方法和用量。
以下通过具体实施例对本发明进行更具体的说明。另外，所述实施例不应解释为对本发明的限定。
实施例：
定量纤蛋白-5mRNA表达的方法
(1)人成纤维细胞的培养
自新生儿包皮分离人成纤维细胞，在含有10质量％胎牛血清(FBS)的Dulbecco’Modified Eagle’s Medium(DMEM)中培养。通过胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)处理使贴壁细胞悬浮，过滤，获得均一的细胞悬浮液。通过离心分离收集细胞，悬浮为0.2×106个细胞/ml。将每3ml细胞悬浮液接种至6孔板，待细胞贴壁后，将培养基换为含有0.25质量％FBS的DMEM。37℃培养24小时后，将培养基换为分别含有数十种药物的含0.25质量％FBS的DMEM。再培养24小时后，除去培养上清液，使用ABIPRISM 6100 Nucleic Acid PrepStation Kit(Applied Biosystems公司)回收mRNA。
(2)通过定量PCR法定量纤蛋白-5mRNA
纤蛋白-5mRNA的表达量通过利用5’核酸酶测定法的定量PCR法，使用ABI PRISM(商标)7900HT序列检测体系(Applied Biosystems公司)进行分析。本实施例使用的引物、探针如下。
上游引物：5′-CATCTTGTACCGGGACATGGA-3′
下游引物：5′-CGTTTGCCGCATGTAAAATTCT-3′
探针：5′-CAAATGCAAGCCACGACCCGCTACCCT-3′
以三组进行mRNA表达的定量，相对无添加对照组的平均表示百分比。
结果如下表所示，显示大托叶云实(丸善制药)提取物、四棱豆(90％乙醇)提取物、植酸(Sigma)以及L-羟脯氨酸(日光ケミカルズ(公司))对纤蛋白-5的产生具有显著的促进效果。
表1各种药物对人成纤维细胞中纤蛋白-5产生的效果
  药物名称   浓度()内为质量％   (相对对照的％)平均值±标准差
  大托叶云实   5μg/ml(0.0005％)50μg/ml(0.005％)   121.1±19.9152.7±44.1
  四棱豆   5μg/ml(0.0005％)50μg/ml(0.005％)   109.9±27.7153.5±13.3
  植酸   25μg/ml(0.0025％)250μg/ml(0.025％)   93.0±24.4126.1±16.4
  L-羟脯氨酸   25μg/ml(0.0025％)250μg/ml(0.025％)   110.1±11.0147.3±8.9
粗体字表示显著性差异(P＜0.05)
制剂例
显示了混合有本发明的发挥抗老化效果或创伤治愈效果的活性成分的化妆水的制剂例。
制剂例1：雪花膏(O/W型，同时用肥皂+非离子型表面活性剂)
药物          大托叶云实        0.1质量％
油分          硬脂酸            8.0
              十八烷醇          4.0
              硬脂酸丁酯        6.0
保湿剂：      丙二醇            5.0
表面活性剂：  单硬脂酸甘油酯    2.0
碱：          氢氧化钾          0.4
防腐剂：                        适量
抗氧化剂：                      适量
香料：                          适量
纯化水：                        74.5
制备方法：
向纯化水中加入药物、保湿剂和碱制备水相，加热调节至70℃。加热溶解油分后，加入表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂和香料，调节至70℃。将它加入先前的水相，进行预乳化。使用均相混合机均一乳化粒子后，进行脱气、过滤和冷却。
制剂例2：润肤膏(O/W型，同时用非离子型表面活性剂)
药物            四棱豆               0.1质量％
油分            十八烷醇             6.0
                硬脂酸               2.0
                氢化羊毛脂           4.0
                角鲨烷               9.0
                辛基十二醇           10.0
保湿剂：        1，3丁二醇           6.0
                PEG1500              4.0
表面活性剂：    POE(25)十六烷醇醚    3.0
                单硬脂酸甘油酯       2.0
防腐剂：                             适量
抗氧化剂：                           适量
香料：                               适量
纯化水：                             53.9
制备方法：
向纯化水中加入药物、保湿剂制备水相，加热调节至70℃。加热溶解油分后，加入表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂和香料，调节至70℃。将它加入先前的水相，使用均相混合机均一乳化粒子后，进行脱气、过滤和冷却。
制剂例3：润肤膏(O/W型，同时用肥皂+非离子型表面活性剂)
药物        植酸二钾盐        0.1质量％
油分        十六烷醇          5.0
            硬脂酸            3.0
            凡士林                      5.0
            角鲨烷                      10.0
            甘油三2-乙基己酸酯          7.0
保湿剂：    双丙甘醇                    5.0
            甘油                        5.0
表面活性剂：丙二醇单硬脂酸酯            3.0
            POE(25)十六烷醇醚           3.0
碱：          三乙醇胺                  1.0
防腐剂：                                适量
抗氧化剂：                              适量
香料：                                  适量
纯化水：                                52.9
制备方法：
向纯化水中加入药物、保湿剂和碱制备水相，加热调节至70℃。加热溶解油分后，加入表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂和香料，调节至70℃。将它加入先前的水相，进行预乳化。使用均相混合机均一乳化粒子后，进行脱气、过滤和冷却。
制剂例4：按摩膏(O/W型，同时用蜂蜡+硼砂+非离子型表面活性剂)
药物        L-羟脯氨酸        0.1质量％
油分        固体石蜡          5.0
            蜂蜡              10.0
            凡士林            15.0
            流体石蜡          41.0
保湿剂：    1，3丁二醇        4.0
表面活性剂：单硬脂酸甘油酯    2.0
POE(25)失水山梨糖醇单月桂酸酯 2.0
碱：        硼砂              0.2
防腐剂：                                    适量
抗氧化剂：                                  适量
香料：                                      适量
纯化水：                                    20.7
制备方法：
向纯化水中加入药物、保湿剂。加入硼砂制备水相，加热调节至70℃。加热溶解油分后，加入表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂和香料，调节至70℃。将它慢慢加入先前的水相，进行预乳化。使用均相混合机均一乳化粒子后，进行脱气、过滤和冷却。
                       序列表
<110>株式会社资生堂
<120>用于促进纤蛋白-5产生和/或提高纤蛋白-5活性的组合物和方法
<130>R921
<150>JP 2004-365935
<151>2004-12-17
<160>3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<223>正向引物
<400>1
catcttgtac cgggacatgg  a                                             21
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<223>反向引物
<400>2
cgtttgccgc atgtaaaatt ct                                             22
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<223>探针
<400>3
caaatgcaag ccacgacccg ctaccct                                        27

Claims (3)

1.用于促进纤蛋白-5产生和/或提高纤蛋白-5活性的组合物，其包含作为有效成分的一种或多种选自大托叶云实(Caesalpinia crista)提取物、四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)提取物、植酸及其生理可接受盐、以及L-羟脯氨酸及其生理可接受盐的药物。
2.用于促进生物体组织的纤蛋白-5产生和/或提高纤蛋白-5活性的方法，其通过向生物体组织应用组合物而实施，其中所述组合物包含作为有效成分的一种或多种选自大托叶云实提取物、四棱豆提取物、植酸及其生理可接受盐、以及L-羟脯氨酸及其生理可接受盐的药物。
3.权利要求2所述的方法，其中所述生物体组织为皮肤。
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