CN1215587A - 化妆品组合物 - Google Patents

Abstract

本说明书涉及含有Croton birmanicus提取物作为活性成分的化妆品组合物,特别涉及头发生长组合物。该组合物不仅具有极好的头发再生作用,如防脱发作用和头发再生促进作用,以及抑制头屑和头皮瘙痒的作用,还能通过活化表皮毛乳头细胞或头发毛囊上皮细胞产生特殊的头发生长促进作用。

Description

化妆品组合物

本发明涉及植物提取物的用途，特别涉及一种以特定的生药形式用于人体头部的植物。

当今社会被称为现代社会或繁忙社会，人们因各种原因面临脱发的机会越来越多。

有鉴于此，尝试采用各种方法提供效果更好的“头发再生剂”。

头发再生剂对头发的主要作用有：如促进头发生长作用(头发生长促进作用，促进再生作用)，令头发浓密、令再生头发变长、5a-还原酶抑制作用、促进血液循环、杀菌作用、去头屑作用、滋润作用和抗氧化作用。对具有这些作用的物质的鉴别方法中，一般将防脱发、促进脱发再生作用，或者抑制头屑或头皮瘙痒的作用作为指标。

不过虽然尝试采用了上述各种方法，但常规的头发再生剂的头发再生作用(如防脱发及头发再生作用)并非总能令人满意。一般认为原因可能在于造成脱发的原因很多，并且头发再生的机理十分复杂。因此，生产头发再生剂的一种更有希望的方法应着眼于头发本身的特殊结构，并且亟需由此研制提供的有效成分。

因此，本发明的目的在于提供一种头部用组合物，该组合物不仅具有防脱发、促进头发生长和抑制头屑或头皮瘙痒的全面作用，还能直接作用于头发更为特殊的结构，特别是表皮的毛乳头细胞或毛囊上皮细胞。

本发明人首先研究制定了对能达到上述发明目的有效成分进行鉴定的筛选体系或称鉴定试验体系。结果发现被测物质在细胞增殖试验(采用经培养的取自人体的毛乳头细胞)或者在活化试验(采用经培养的取自人体的毛囊上皮细胞)中取得了良好效果，具体内容见下文，有效成分不仅能活化毛乳头(或毛乳头细胞)或者增加生长周期内再生头发的长度，还具有极好的头发生长促进作用、生发作用等。

在以上两项试验中，他们还采用了各种植物提取物，发现分类为大戟科巴豆属的植物提取物具有极好的效果，并且具有极好的头发再生作用，如防脱发或促进头发再生，以及抑制头屑或头皮瘙痒的作用。

因此，本发明提供了一种头部用组合物，该组合物中含有大戟科巴豆的植物提取物作为有效成分。在一具体实施方案提供的头发再生组合物中含有有效量的用于人体头发再生的大戟科巴豆属植物提取物以及适用于化妆品或适用于皮肤的其它辅料。

另外，在本发明的另一实施方案中也将上述提取物加入头发再生组合物中用作有效成分，或将该提取物应用于头发再生方法中。

另外，在本发明的另一实施方案中也提出了一种用于活化表皮毛乳头细胞和/或增加生长周期内再生头发长度的组合物，其中含有上述提取物作有效成分。

图1A-C所示的是对得自本发明Croton birmanicus Muell.Arg.提取物的特定馏分进行高压液相色谱法的4α-TPA洗脱对照谱线，其中有效成分的浓度经增浓。图1A和图1B是分别“得自其它制备实施例”的A馏分和B馏分，图1C是用作对照的4α-TPA。

本发明的头部用组合物包括适用于人体头部特别是头发和头皮的任何形式。该组合物可广泛用于头发再生，在本说明书中“头发再生”的概念包括促进头发再生、防脱发、抑制头屑或头皮瘙痒等作用，还包括活化表皮毛乳头细胞或毛囊上皮细胞的作用。

虽然在理论上并无特殊限定，但相信在本发明中用作有效成分的大戟科巴豆属植物提取物具有表皮毛乳头活化作用，因其能使经培养的人体表皮毛乳头细胞显著增殖，另外它还具有增加生长周期内再生头发长度的作用，因其能促进经培养的人体毛囊上皮细胞的增殖，详见下文。

因此该提取物通过直接作用于头发本身的结构而具有促进头发再生和防脱发的作用，还具有抑制头屑或头皮瘙痒的作用，因为该提取物在发挥其效能时并未对上述细胞的增殖产生任何不利影响。

尤其令人意外的是，注意到仅由大戟科巴豆属的巴豆籽(也称巴豆果实)胚芽乳液经压制得到的巴豆油在头发再生和生发作用方面明显低于本发明的提取物，另一方面，其对皮肤有刺激性。

已知巴豆油中包含12-氧-四癸酰基-佛波醇13-乙酸酯(下文中称为TPA)，已知是一种肿瘤促进剂，是建立肿瘤促进剂两步理论的基础。已知TPA对C3H小鼠具有较强的毛发生长作用(《表皮正常及异常分化》，M.Seiji和I.A.Bernstein编，159-170页，Todai-Shuppan1982年出版)，但局部施用于鼠耳时会引起严重炎症(P.L.Stanley等人，《皮肤药理学》，1991；4:262-271页)，并且在施用于Balb/c小鼠皮肤上时会令其表皮细胞产生严重变化(例如，棘皮症、角化过度等)。

注意到该背景技术后，意外地发现本发明的提取物具有极好的头发再生促进作用和生发作用，另外对皮肤几乎无刺激性，本发明人制定的筛选或鉴定试验方法的可用性得到了证明，并可采用经培养的表皮毛乳头细胞和经培养的毛囊上皮细胞。

用于本发明的提取物的特点在于它不是由大戟科巴豆属的巴豆籽胚芽乳液经压制得到的巴豆油，而是经提取处理得到的。

本发明提取物所用的植物可也是巴豆属的各种植物，以及提取物能达到本发明目的的那些植物。优选croton birmanicus Muell.Arg。该植物主要分布在东南亚，在泰国称为HADSAKHYYN.。

适用于本发明的植物提取物的叶、茎(包括地下茎)、根、果实、皮等或全草可经提取溶剂浸渍，或与提取溶剂一同经加热回流，过滤所得混合物，浓缩滤液。提取溶剂可以是任何常用于提取操作的溶剂，特别值得一提的一种溶剂或两种或两种以上溶剂的混合物选自可与水混溶的有机溶剂，例如低级醇如甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇，多元醇如丙二醇和1,3-丁二醇，丙酮，乙酸乙酯等。采用低级醇时，所得的提取物可直接应用，也可蒸馏除去提取溶剂和其中的残留物，如必要还可经干燥，掺混后得到本发明的头部用组合物。

根据不同目的，本发明的提取物可以是不同等级的加工产品，可将经上述提取溶剂提取过的提取物用含疏水溶剂(例如正己烷)和水的体系进行液液分离，例如用乙酸乙酯等提取其中的含水层，然后经适用的柱色谱法对上述提取物或未经提取的含水层进行分离或类似处理。

对该头部用组合物中本发明提取物的配制含量并无特殊限制，因其取决于组合物的剂型或使用方法。但当采用后面实施例所述方法提取得到的提取物时，其配制含量(以干物料计)一般占组合物总量的0.0005-20.0％(重量)，优选为0.001-10.0％(重量)。其用量高于20.0％(重量)时，不易进行配制，这是不利的。另外配制用量高于10.0％(重量)，随用量增高效果不再增高。

如必要，除上述必要成分外，本发明头部用组合物中还可加入适用于化妆品或适用于皮肤的其它辅料、拟药物、药物等，例如油性成分、保湿剂、增稠剂、螫合剂、其它活性成分、抗氧剂、紫外线吸收剂、表面活性剂、醇、粉类组分、着色剂、含水成分、水、各种皮肤用营养成分等。

特别值得一提的是例如高级脂肪酸、固体石蜡、液体石蜡、硅油、角鲨烷等油性成分；透明质酸、丙二醇、麦芽醇、粥样胶原蛋白(atherocollagen)、乳酸钠等保湿剂；榠栌子粘性物质、羧乙烯基聚合物、黄原胶等增稠剂；乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多磷酸钠、焦磷酸钠和葡糖酸等螯合剂；药物如咖啡因、单宁酸、维垃帕米、止血环酸及其衍生物，甘草提取物、光甘草廷(glabridin)、丘角菱的热水提取物，各种生药、乙酸生育酚和甘草亭酸及其衍生物或其盐、其它增白剂如维生素C、膦基抗坏血酸镁、抗坏血酸葡糖酐、熊果苷和曲酸、糖类如葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖和海藻糖等活性成分。

另外，制备组合物时可同时加入头发再生剂的辅料成分中除油性成分、保湿剂和增稠剂之外，还有例如油性物质如油酸单甘酯，血管扩张剂如烟酰胺、乙酸维生素E、当药提取物、氯化镒和乙酰胆碱衍生物，氨基酸如丝氨酸和甲硫氨酸，维生素如维生素B6、维生素E及其衍生物和生物素，皮肤功能促进剂如泛酸及其衍生物、甘草亭酸及其衍生物、烟酸、烟酸酯如烟酸甲酯、烟酸生育酚酯，以及头孢金素，雌性激素如雌二醇等。

另外，还可加入那些常用于头发再生剂的辅料，只要其不会破坏本发明的效果，这些辅料例如有抗菌剂如4-异丙基环庚二烯酚酮、双三氯酚、洁尔灭、十六烷基氯化吡啶鎓、十一碳烯酸、三氯-N-碳酰苯胺和硫二氯酚，香精如薄荷醇，药物如水杨酸、锌及其衍生物，乳酸及其烷基酯，有机酸如柠檬酸，氨基酸如精氨酸等。

本发明组合物的剂型可以是例如生发剂、发乳、摩丝、洗发剂和护发素。

实施例

将通过以下实施例具体描述本发明，但本发明并非仅限于此。除非特别指出，配制用量以重量百分比计。

首先，依次描述了有关①头发再生作用，②头发生长作用，③经培养的表皮毛乳头细胞的细胞增殖④经培养的人体毛囊上皮细胞的活化作用的试验方法和试验结果。①头发再生试验

1．提取物的制备(制备实施例1)

在室温下将Croton birmanicus(干药材)(500克)在5.0升甲醇中浸渍5天。从提取物中蒸去溶剂，干燥所得物质，得到15.2克经干燥的Croton birmanicus的甲醇提取物。

2．试样的制备

将所得的经干燥的甲醇提取物溶于75％乙醇溶液中，得到浓度为0.5％、1％和2％的试样1-3。

3．头发再生试验方法及其结果

对本发明的液态试样1-3进行以下头发再生试验，采用0.1％的巴豆油乙醇溶液作为对照试样。

采用Ogawa等人提出的方法进行试验(《表皮正常及异常分化》，M.Seiji和I.A.Bernstein编，159-170页，Todai-Shuppan1982年出版)，在头发生长周期的生长静止过程中采用C3H/HeNCrJ小鼠作为试验用动物。

即，将小鼠分为4组，每组10只鼠，分别用于试样1-3和对照试样。用推子和剃刀剃光小鼠背部毛发，并且每日涂敷0.1毫升各试样。18天和24天后，测定毛发再生的面积。结果用再生面积的平均值表示。结果见下表1。

表1

                   试样            头发再生面积(％)

                                   18天后   24天后试样1   (Croton birmanicus提取物0.5％) 76    96试样1   (Croton birmanicus提取物1％)   87    100试样1   (Croton birmanicus提取物2％)   92    100对照试样                               37    66

如表1所示，在小鼠毛发再生试验中，本发明的Croton birmanicus提取物表现出极好的毛发再生作用。

2．其它制备实施例

将按制备实施例1相同方法制得的甲醇提取物(299.2克，干重)用正己醇(6升)和水(3升)进行液液分离，由正己醇层得到51.83克干物质，并得到含水层。含水层经水和乙酸乙酯(10升)液液分离，由乙酸乙酯层52.7克干物质(下文中称为乙酸乙酯馏分)。

将乙酸乙酯馏分经硅胶柱分离(填充物：Wakogel C-200∶1千克，洗脱液：氯仿∶甲醇=50∶1→30∶1→20∶1→9∶1→2∶1)，将该用于测定C3H小鼠毛发再生作用的所得馏分进一步经ODS凝胶柱色谱法纯化(ODS凝胶；300克，洗脱液；70％甲醇→90％甲醇→100％甲醇)，测定由该中间阶段洗脱馏分得到的1.10克干物质对C3H小鼠毛发再生的效果。分离是通过硅胶柱进行的(填充物：Wakogel C-200∶170克，洗脱液：氯仿∶甲醇=20∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1→0∶1)。从最初阶段馏分到约经2/5洗脱的馏分约得到520毫克干物质(下文中称为馏分A)，由经3/5洗脱的馏分得到530毫克干物质(下文中称为馏分B)。

在以下条件下对以上得到的馏分A和馏分B以及4α-TPA进行高压液相色谱法。各成分所得的洗脱谱线分别见图1.A-C。高压液相色谱法条件流动相

0-50分钟：80％乙腈

50-60分钟：80-100％乙腈

60—80分钟：100％乙腈柱

Capcell Pak C18 UG120埃测定

紫外线238nm

试样经上述毛发再生试验时，还应同时观察C3H/HeNCrJ小鼠经剃毛并涂敷了试验的背部皮肤的刺激性情况。刺激情况是指脱皮和棘皮症，如能明显观察到，记作++，观察到一定程度的发生，记作+，完全未观察到记作-。

对于毛发再生作用，当毛发再生面积达80％或80％以上并为100％或100％以下时，记作+++，为60％或60％以上并且低于80％，记作++，为40％或40％以上并且低于60％，记作+。

试验结果见下表2(用75％乙醇调节试样浓度)。

                        表2试样                          头发再生刺激作用制备实施例1的提取物    0.5％    ++      -乙酸乙酯馏分           0.5％    +++     -

馏分A              0.1％    +++     -

馏分B              0.1％    +++     -

TPA                6ppm     +++     ++

TPA                0.6ppm   +++     ++

巴豆油             0.1％     +      +

由前述文献，认为TPA对皮肤具有显著刺激作用。②毛发生长试验(生发试验)

1．提取物的制备

按上述毛发再生试验实施例中制备实施例1的方法制备提取物。

2．试样的制备

将由上述方法得到的干燥甲醇提取物(0.5,1％或2％)与70％乙醇溶液(90％)、油酸钠(0.01％)、十二烷基苯磺酸(0.49％)、硬质蓖麻油氧化乙烯(40摩尔)加合物(0.5％)，以及去离子水(8％)搅拌混合形成溶液。再加入去离子水(剩余量)混合形成液态的试样4、5和6。

3．头发生长试验方法及试验结果

为测定本发明头部用组合物的头发的再生作用如防脱发和生发作用，对人体进行以下生发(trichogram)试验。

使用试样前后均采用显微镜观察拔出的毛发毛根的情况，根据毛根的结构计算毛发在生长静止期的毛根数，采用毛根数的增长率和降低率对毛发的再生作用进行比较。生长静止期间毛根的生长停止，发现苦于脱发的人中毛根处于生长静止期的情况高于正常人。

在10名男性被测者的头皮上每日2次涂敷各试样及对照试样，每次2毫升，持续6个月。涂敷试样前和经6个月涂敷后立即从每名被测者分别头上拔除100根头发，对毛根进行测定，然后进行有效试验。结果见下表3。

                    表3试样             头发生长静止期发根的增减率      对头发再生作用

        20％或20％以上减低    ±20％    20％或20％以上增高    的评价试样4(0.5％)     59                 33            10               有效试样5(1％)       72                 32            1                很有效试样6(2％)       80                 20            0                很有效对照试样         9                  31            59               无效

如表3所示，在人体生发试验中，本发明的Croton birmanicus提取物具有显著的生发作用。③经培养的表皮毛乳头细胞的细胞增殖试验

1．提取物的制备

按上述毛发再生试验实施例中制备方法1的方法制备提取物。然后用二甲基亚砜将干燥的甲醇提取物制成0.2％(重量)的溶液，然后用不含血清的培养基(MEM)稀释该溶液得到Croton birmanicus提取物(制备实施例2-5)浓度为1.0×10^-9至1.0×10^-5的溶液。

2．表皮毛乳头细胞的收集

采用矫形手术剥除32岁男性头部枕骨区域的皮肤(5毫米×1.5厘米)，分离除去皮肤的脂肪组织，剥下毛囊，从毛球部位分离出表皮毛乳头细胞。将分离出来的表皮毛乳头细胞在含20％FBS的MEM培养基(37℃,5％CO₂)中培养2周。当确定由表皮毛乳头细胞中细胞快速生长时，将培养基换为含10％FBS的MEM(MEM+10％FBS)，培养条件均相同。然后每隔两周更换一次MEM+10％FBS以保存细胞。

培养4周后进行次代培养，此后当细胞增殖到一定数目后，再次进行次代培养，并重复该步骤。

3．试验方法

采用第3代表皮毛乳头细胞和MEM+10％FBS培养基制备细胞密度为10000个细胞/毫升的细胞悬浮液。将200微升该悬浮液置于96孔微量板中(即每孔2000个细胞)，在37℃、5％二氧化碳条件下培养3天令细胞附着。培养72小时后，由用于对照组的肉汤培养基替换不含血清的MEM培养基，而采用肉汤培养基的体系则换用不含血清的MEM培养基，该培养基中含有Croton birmanicus提取物(制备实施例2-5)(制备实施例7-10)。

将对照组和试样体系再经4天培养。

培养结束后，将20微升alamar蓝(BIOSOURSE出品)加入各体系中，再培养8小时，用微量板读数器(Microplate reader)(BIO RAD出品)测定其对570nm和595nm的吸收性。根据所附的操作说明，根据测出的吸收结果计算alamar蓝的减少率。由于该减少率与细胞数目相应，可将对照组和被测试样体系中细胞的增殖率进行比较。

4．结果

测定Croton birmanicus提取物(试样7-10)对细胞增殖促进作用的指标见下表4。

                表4试样               增殖促进率(％)         效果试样7(1.0×10^-9％)    4.6±3.7*           有效试样8(1.0×10^-8％)    18.7±6.0**         有效试样9(1.0×10^-7％)    13.5±5.4**         有效试样10(1.0×10^-6％)    6.3±3.2           无效参照试样                2.1±3.1           无效*：显著差别 p＜0.05**：显著差别p＜0.01

如表4所示，在对经培养的毛乳头细胞活化试验中，本发明的Crotonbirmanicus提取物对毛乳头细胞增殖具有显著作用。④经培养的人体毛囊上皮细胞的活化试验

1．经培养的人体毛囊上皮细胞的收集

在体视显微镜下经机械方法收集由外科手术副产品得到的头发生长周期中生长旺盛期的男性人体毛囊。在37℃下将这些处于生长旺盛期的毛囊用经Dulbecco改性的MEM(DMEM)培养基(其中含1000单位/毫升分散酶和0.2％胶原酶)处理30分钟，用注射针头的针尖除去毛球部分的表皮层和表皮毛乳头以及上皮组织，将所得剩余部分在37℃下用含0.05％胰解蛋白酶和0.02％EDTA的磷酸盐缓冲剂[PBS(-)：(-)是指不含钙离子和镁离子]处理5分钟。

然后将毛囊加入涂有胶原蛋白(I型)的培养皿中，并进行移出物培养。培养基采用不含血清的培养基[角质细胞生长培养基(KGM)](也可采用角质细胞不含血清的培养基)。

培养4-5天后，当毛囊附着在培养皿上并能确定细胞出现增殖时，更换培养基，此后每隔两天更换一次培养基。

在37℃下将所得的增殖细胞用0.05％(重量)胰蛋白酶-0.02％EDTA处理5分钟，用等体积的0.1％胰蛋白酶抑制剂终止该反应，经离心(800×g,5分钟)收集细胞。

然后将细胞浮置于上述同样的不含血清的培养基中，该悬浮液在涂有胶原蛋白(Ⅰ型)的培养皿中的分散密度为5000个细胞/平方厘米，细胞出现微融合(subconfluent)时每隔两天更换一次培养基，在再次将细胞用0.05％(重量)胰蛋白酶-0.02％EDTA处理5分钟，用等体积的0.1％胰蛋白酶抑制剂终止该反应，进行离心(800×g,5分钟)，在所得的人体毛囊上皮细胞中加入冻细胞液(CellBanker:DIA-IATRON出品)将细胞浓度调整为1.0×10⁶个细胞/毫升，将含1.0×10⁶个细胞的各部分分别加入冷冻管中，冷冻保存。用细胞仪计算细胞数。

测定由上述步骤得到的毛囊上皮细胞中成纤细胞的结合率(FB结合率)(放大3000倍，5倍视野)，从被测物中除去细胞结合率为3％或3％以上的细胞。

将剩余的毛囊上皮细胞分散于培养瓶中，用0.05％(重量)胰蛋白酶-0.02％EDTA处理5分钟，用等体积的0.1％胰蛋白酶抑制剂终止该反应，将该体系离心(1500转)5分钟，除去上清液，在剩余物中加入20毫升KGM培养基，形成细胞悬浮液。

将该细胞悬浮液分散于96孔培养皿中(培养皿中涂有Ⅰ型胶原蛋白：FALCON出品)，分散率为0.2毫升/孔(1.0×10⁴个细胞/孔)，将该体系在室温下保存约20分钟，直到细胞沉降在孔底部。

随后，在37℃、5％二氧化碳条件下培养1天，形成所需的经培养的人体毛囊上皮细胞。

在经上述操作得到的毛囊中加入含0.25％胰蛋白酶的5毫升PBS(-)，将细胞悬浮液在37℃下培养5分钟。

培养结束后，加入5毫升胎牛血清(FBS)和5毫升Ham’s F12培养基，用细胞过滤器(100微升，NALGENE出品)过滤该细胞悬浮液，然后置于50毫升离心管中，细胞悬浮液经离心(4℃,1500转，5分钟)。从体系中除去上清液，剩余物为所需的毛囊上皮细胞。

2．毛囊上皮细胞的预培养

为除去可能会污染体系的成纤细胞，应对由上述步骤得到的毛囊上皮细胞进行预培养。步骤如下。

37℃下，在恒温容器中融化上述步骤得到的冷冻细胞。然后加入10毫升FAD培养基[混合体积比为3∶1的Ham’s F12培养基(见后)和MEN培养基、胰岛素(5.0μg/mL)、氢化可的松(0.45μg/ml)、表皮生长因子(EGF)(10.0ng/ml)、霍乱毒素(10^-9M)和胎牛血清(10％)](下同)用以稀释该细胞溶液，体系经离心(10℃或10℃以下，1500转，5分钟)。离心后除去上清液，在体系中加入10毫升FAD，反复移液直至细胞群消失。

用细胞仪计算出所得的细胞数，用FAD培养基将细胞浓度调节至2.5×10⁵个细胞/毫升。

将细胞分散于涂有Ⅰ型胶原蛋白的75立方厘米容积的烧瓶中，在37℃、5％二氧化碳条件下培养过夜。

培养结束后，用10毫升PBS(-)将体系洗涤2次，加入2毫升含0.25％胰蛋白酶的PBS(-)，在37℃、5％二氧化碳条件下培养4分钟。然后在体系中加入2ml胎牛血清(FBS)，混合物经一次轻轻振摇，除去上清液以便除去会污染体系的成纤细胞。

在体系中再加入15毫升KGK培养基[角质细胞生长培养基：是将牛垂体提取物(BPE)(0.4％容积)、胰岛素(0.5％μm/ml)、氢化可的松(0.5μm/ml)和h-表皮生长因子(0.1ng/ml)加入KGM培养基得到的(CLONETICS出品的改性MCDB153培养基，下同)]，在37℃、5％二氧化条件下培养3天。

测定成纤细胞对分散有经上述步骤得到的毛囊上皮细胞的培养烧瓶的污染率(FB污染率)(放大3000倍，5倍视野)，从被测物中除去成纤细胞污染率为3％或3％以上的细胞。

加入10毫升PBS(-)，用2毫升含0.25％胰蛋白酶的PBS(-)将体系洗涤2次，在37℃、5％二氧化碳条件下培养3分钟。采用上皮细胞和成纤细胞与胰岛素的反应性的差别从体系中除去成纤细胞，除去胰岛素，再加入2毫升含0.25％胰蛋白酶的PBS(-)，在37℃、20转/分钟条件下将混合物振摇5分钟。

然后用显微镜进一步测定细胞层，加入10毫升含10％FBS的DMEM培养基，移液至50毫升离心试管中，体系在1500转/分钟的转速下经5分钟离心。

除去上清液，加入20毫升KGM培养基，反复移液直至细胞群消失。

采用细胞过滤器(100微升，NALGENE出品)过滤该细胞悬浮液，并加入50毫升离心试管中。采用细胞仪计算出悬浮体中的活细胞数，在体系中加入KGM培养基，将体系中的细胞浓度调节至5.0×10⁴个细胞/毫升。

将该细胞悬浮液分散于96孔培养皿中(培养皿中涂有Ⅰ型胶原蛋白：FALCON出品)，分散率为0.2毫升/孔(1.0×10⁴个细胞/孔)，将该体系在室温下保存约20分钟，直到细胞沉降在孔底部。

随后，在37℃、5％二氧化碳条件下培养1天，形成所需的经培养的人体毛囊上皮细胞。

3．试验用培养基的制备

在上述制备实施例1中制得的Croton birmanicus甲醇提取物的0.2％二甲基亚砜溶液中加入1000体积的改性MCDB153培养基(CLONETICS出品)[提取物浓度：2.0×10^-4％(二甲基亚砜0.1％)]。

将这些加有被测物的培养基加入含0.1％二甲基亚砜的KBM培养基中用于将被测物的浓度从1.0×10^-8稀释到1.0×10^-5％(试样11-14)。用同样方法制备那些不含带有被测物的培养基的对照试样。

4．用加有被测物的培养基进行替换

在上述A和B中，分别用如上述3中制备的含被测物的培养基或对照培养基(200微升/孔)替换96孔培养皿中用于制备经培养的人体毛囊上皮细胞和经培养的鼠毛囊上皮细胞的KGM培养基，然后在37℃、5％二氧化碳条件下培养2天。

更换培养基是采用吸取器除去每孔中的KGM培养基，小心不使粘着在孔底部的细胞受到损伤，然后立即从孔的各向边缘加入含被测物的培养基。

5．细胞增殖试验

加入占培养基用量1/10(体积)的Alamar蓝(ALAMAR BIOSCIENCE出品)，将混合物在37℃(5％二氧化碳)条件下培养6小时。

然后用微量板读数器(BIO RAD出品)测定其对570nm和595nm的吸收性。根据所附的操作说明，根据测出的吸收结果计算alamar蓝的减少率。由于该减少率与细胞数目相应，可将对照组和被测试样体系中细胞的增殖率进行比较。

6．结果

测定Croton birmanicus提取物(试样11-14)对细胞增殖促进作用的指标见下表5。

                表5试样                 增殖促进率(％)          效果试样11(1.0×10^-8％)     5.3±6.3*            有效试样12(1.0×10^-7％)    13.5±5.2**           有效试样13(1.0×10^-6％)    15.5±3.1**           有效试样14(1.0×10^-5％)    25.6±5.1             有效参照试样                 1.2±2.7             无效*：显著差别p＜0.05**：显著差别p＜0.01

如表5所示，在对经培养的人体毛囊上皮细胞促进试验中，本发明的Crotonbirmanicus提取物对毛囊上皮细胞具有显著促进作用。⑤实际应用试验

本发明试样实施例15生发剂

(1)Croton birmanicus提取物(制备实施例1)1.0

(2)丙二醇        5.0

(3)透明质酸钠    0.01

 (4)75％乙醇     余量

测定上述配方中制备的生发剂实际应用于如有头屑、头发再生和脱发等头部症状时的效果。将生发剂施用于10名存在头屑、头发再生和脱发等头部症状男性(年龄25-55岁)，每日一次或两次，每次1-3毫升，经4个月时间，根据以下标准测定其防头屑效果、头发再生促进效果和防脱发效果。结果见表6。评价标准(1)防头屑的效果试验无效：经护理但未发现任何改善。有效：头屑的生成降低。很有效：头屑的生成终止。(2)头发再生效果试验无效：经护理但未发现任何改善。有效：2/3或2/3以上的脱发部位出现头发再生。很有效：整个脱发部位出现头发再生。(3)脱发效果试验无效：经护理但未发现任何改善。有效：脱发的发展减低。很有效：停止脱发。

                        表6被测者       年龄      头屑     头发再生      脱发1           43      很有效      有效        有效2           32      很有效      有效        有效3           45      很有效      有效        有效4           37       有效       有效        无效5           41       无效       有效        有效6           28       有效      很有效      很有效7           25       无效       有效        有效8           55       有效       无效        有效9           33       有效       有效        有效10          27       无效       有效       很有效

如表6所示，该生发剂具有极好的头发再生促进作用、防头屑和防头发作用。

本发明的头部用组合物的各种剂型的配制实例见以下实施例。实施例1洗发剂椰油酰基甲基牛磺酸钠    2.0聚氧乙烯(8mol)油酰醇    2.0月桂酸二乙醇胺          4.0乙二醇脂肪酸酯          1.0甘油                    0.2薄荷醇                  0.1Croton birmanicus提取物(制备实施例1)1.0香精                                 适量丙二醇                               2.0纯化水                               余量实施例2 头发护理剂液体石蜡                             25.0硬脂酸                                5.0十六醇                                5.0脱水山梨醇单油酸酯                    2.0聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯            3.0Croton birmanicus提取物(制备实施例1) 0.51,3-丁二醇                            5.0防腐剂                               适量纯化水                               余量实施例3生发剂Croton birmanicus提取物(制备实施例1)1.0硬脂基二甲基氧化胺                    0.5硬化蓖麻油氧化乙烯(40mol)加合物       1.095％乙醇                             54.0去离子水                             余量(制备方法)

将去离子水加入95％乙醇中，然后向其中加入硬化蓖麻油氧化乙烯(40mol)加合物和硬脂基二甲基氧化胺，加入经干燥的提取物，搅拌该混合物形成溶液。实施例4生发剂甘油                                2.0L-薄荷醇                            0.1Croton birmanicus提取物(制备实施例1)2.095％乙醇                           54.0香精                                0.5去离子水                           余量(制备方法)

将甘油、L-薄荷醇、香精和经干燥的提取物加入95％乙醇中，搅拌该混合物形成溶液，加入去离子水。实施例5生发剂N-椰油基月桂基-β-氨基丙酸钠        0.2Croton birmanicus提取物(制备实施例1)0.001十二烷基苯磺酸钠                    0.5硬化蓖麻油氧化乙烯(40mol)加合物     1.095％乙醇                           54.0去离子水                           余量(制备方法)

将去离子水加入95％乙醇中，然后向其中加入硬化蓖麻油氧化乙烯(40mol)加合物、硬脂基二甲基氧化胺和N-椰油棕榈基月桂基-β-氨基丙酸钠，加入经干燥的提取物，搅拌该混合物形成溶液。实施例6生发剂甘油                                   2.0L-薄荷醇                               0.1由Croton birmanicus提取物得到的活性馏分0.1A95％乙醇                              54.0香精                                   0.5去离子水                              余量(制备方法)

将甘油、L-薄荷醇、香精和活性馏分A加入95％乙醇中，搅拌该混合物形成溶液，加入去离子水。实施例7生发剂4-异丙基环庚二烯酸酮                     0.1当药提取物                               1.0维生素B6                                 0.2维生素                                   0.01薄荷醇                                   0.2水杨酸                                   0.1由Croton birmanicus提取物得到的活性馏分A 1.0表面活性剂                               0.1丙二醇                                   2.070％乙醇                                余量实施例8 生发剂4-异丙基环庚二烯酸酮                0.1当药提取物                          1.0维生素B6                            0.2维生素                              0.01薄荷醇                              0.2水杨酸                              0.1Croton birmanicus提取物(制备实施例1)1.0表面活性剂                          0.1丙二醇                              2.070％乙醇                           余量

Claims (11)

1．一种头发再生组合物，其中含有头发再生有效量的分类为大戟科巴豆属的植物提取物，该组合物中还含有适用于化妆品或适用于皮肤的其它辅料。

2．权利要求1的头发再生组合物，其中分类为巴豆属的植物为CrotonBirmanicus Muell.Arg。

3．权利要求1的头发再生组合物，其中的提取物是采用一种或两种或多种溶剂经提取得到的，溶剂选自与水相容的有机溶剂。

4．一种用于活化人体表皮头发毛乳头细胞的组合物，其中含有活化表皮毛乳头细胞有效量的分类为大戟科巴豆属的植物提取物，该组合物中还含有适用于化妆品或适用于皮肤的其它辅料。

5．权利要求4的组合物，其中分类为巴豆属的植物为Croton BirmanicusMuell.Arg。

6．一种用于增长人体头发生长周期中生长旺盛期头发的长度的组合物，其中含有增长再生发长度有效量的分类为大戟科巴豆属的植物提取物，该组合物中还含有适用于化妆品或适用于皮肤的其它辅料。

7．权利要求6的组合物，其中分类为巴豆属的植物为Croton BirmanicusMuell.Arg。

8．植物分类为大戟科巴豆属的植物提取物作为有效成分的用途，它可用于制备毛发再生组合物。

9．植物分类为大戟科巴豆属的植物提取物作为有效成分的用途，它可用于制备活化人体表皮头发毛乳头细胞的组合物或增长头发生长周期中生长旺盛期头发的长度的组合物。

10．权利要求8或9的用途，其中分类为巴豆属的植物为Croton BirmanicusMuell.Arg。

11．植物分类为大戟科巴豆属的植物提取物的用途，它可在头发再生组合物中用作有效成分。

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