JP2012206984A - 経口用マトリックスメタロプロテアーゼ(mmp)産生抑制剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】マメ科シカクマメ(Psophocarpus)属に属する植物の経口摂取によってもたらされる種々の影響の原因を特定し、且つシカクマメ抽出物からなる有用な経口摂取用機能剤を提供すること課題とする。
【解決手段】本発明は、経口用MMP産生抑制剤、より具体的には経口用のMMP産生関連遺伝子の発現抑制剤に関する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、経口用MMP産生抑制剤、より具体的には経口用のMMP産生関連遺伝子の発現抑制剤に関する。
【選択図】なし
Description
本発明は、経口用MMP産生抑制剤、より具体的には経口用のMMP産生関連遺伝子の発現抑制剤に関する。
シカクマメ(Psophocarpus tetragonolobus (L.) D.C.)はマメ科のつる性植物であり、実の断面が四角形のためこの名がある。栄養価が高く、他の豆類と同様に種々の効果が期待されている。
これまで出願人は、シカクマメの抽出物を有効成分とする皮膚外用剤が、表皮細胞におけるラミニン5の産生能を高め、抗老化、しわ形成抑制作用を有することを報告している(特許文献1)。また、シカクマメの抽出物には、細胞増殖促進、TGF−β産生促進、コラーゲンゲル収縮促進、インテグリン産生促進、コラーゲン産生促進、ヒアルロン酸産生促進、タンパク質糖化抑制といった効果を有することを見出し、シカクマメの抽出物を含む各種促進剤、抑制剤を提案している(特許文献2、3および4)。しかしながら、シカクマメの抽出物を経口摂取した場合の効果は知られていない。
また、従来のシカクマメの外用による効果はタンパク質レベルでの解明に留まるが、シカクマメの経口投与による遺伝子発現に対する影響について調べられた例はない。
上記事情に鑑み、本発明は、マメ科シカクマメ(Psophocarpus)属に属する植物の経口摂取によってもたらされる種々の影響の原因を特定し、且つシカクマメ抽出物からなる有用な経口摂取用機能剤を提供すること課題とする。
本発明者らは、シカクマメエキスの経口摂取による影響を調べたところ、皮膚の苔蘚化モデル(Brit. J. Derm. 2007, 156, 884-891)で見られる皮膚肥厚が抑制されることを発見した。この現象をさらに詳細に解明するために遺伝子解析を行ったところ、MMP産生に関連する遺伝子の発現量について、シカクマメ経口摂取の影響が顕著に現れることを見出し、本発明をなすに至った。
すなわち、本発明によれば以下の剤が提供される。
(1)マメ科シカクマメ(Psophocarpus)属に属する植物の中から選ばれる1種または2種以上の植物またはその抽出物からなる、経口用のマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)産生関連遺伝子の発現抑制剤。
(2)前記MMP産生関連遺伝子が、stratifin遺伝子である、(1)に記載のMMP産生関連遺伝子の発現抑制剤。
(3)マメ科シカクマメ(Psophocarpus)属に属する植物の中から選ばれる1種または2種以上の植物またはその抽出物からなる、経口用MMP産生抑制剤。
(1)マメ科シカクマメ(Psophocarpus)属に属する植物の中から選ばれる1種または2種以上の植物またはその抽出物からなる、経口用のマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)産生関連遺伝子の発現抑制剤。
(2)前記MMP産生関連遺伝子が、stratifin遺伝子である、(1)に記載のMMP産生関連遺伝子の発現抑制剤。
(3)マメ科シカクマメ(Psophocarpus)属に属する植物の中から選ばれる1種または2種以上の植物またはその抽出物からなる、経口用MMP産生抑制剤。
本発明は、MMP産生関連遺伝子の発現量に顕著な影響を及ぼすマメ科シカクマメ(Psophocarpus)属に属する植物の抽出物からなる、有用な経口用MMP産生抑制剤を提供できる。
マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)は、細胞外マトリックスタンパク質を主要な基質とする一群の金属依存性プロテアーゼの総称名である。MMPは、胚形成、正常組織再構築、創傷治癒、および血管形成等の多数の生物プロセスにおいて、さらにアテローム、関節炎、癌、および組織潰瘍等の疾患においても中心的な役割を担っている(Circ. Res. 2003, 92, 827-839)。正常な生理学的条件下では、MMPの活性が制御され、細胞外マトリックスの適切な分解が行われるが、この制御を失うと上記の疾患を発症する原因となり得る。また、皮膚においてMMPは真皮、表皮、および/または基底膜の構成成分を分解するため、皮膚の老化に関与することなども知られている。
MMPは、その構造および機能の面から、コラゲナーゼ群、ゼラチナーゼ群、ストロムライシン群、マトリライシン群、膜型MMP(MT−MMP)群、およびその他の群に分類されている。
コラゲナーゼ群には、MMP−1(間質コラゲナーゼ)、MMP−8、MMP−13およびMMP−18等が含まれる。これらのMMPの重要な特性は、間質コラーゲンI、II、およびIII型を切断できることである。また、その他の細胞外マトリックス(ECM)および非ECM分子も消化できる。
ゼラチナーゼ群には、MMP−2、MMP−9等が含まれる。MMP−2は、I、II、およびIII型コラーゲンを消化できるが、MMP−9にこの能力はない。コラゲナーゼ等により初期分解で変性したコラーゲン断片のさらなる分解に関与しているだけでなく、マクロファージや線維芽細胞の組織浸潤や遊走時、血管新生時等における基底膜の分解に関与している。
ストロムライシン群には、MMP−3、MMP−10等が含まれる。これらMMP−3、10は、MMPを活性化するだけでなく、プロテオグリカンや、タイプIVコラーゲン、ラミニン、その他フィブロネクチン等の細胞外マトリックスの分解に関与している。
マトリライシン群には、MMP−7、MMP−26が含まれる。MMP−7はECMを分解するだけでなく、プロ−α−デフェンシン、Fas−リガンド、プロ−TNF−α、およびE−カドヘリン等の細胞表面分子の分解に関与している。
MT−MMP群には、I型膜貫タンパク質であるMMP−14、MMP−15、MMP−16およびMMP−24、およびグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカータンパク質であるMMP−17およびMMP−25が含まれる。これらのMMPも多数の細胞外マトリックスの分解に関与している。
これらのMMP産生に関連する物質としてストラチフィン(stratifin)が知られている。Medinaらは、皮膚繊維芽細胞のMMP−1過剰発現にストラチフィンが関与すること、並びにMMP−3、MMP−10、MMP−8、およびMMP−24等のMMPがストラチフィンにより上方制御されることを報告している(Mol. Cell Bilchem. 2007, 305, 255-264)。
したがって、本明細書において、MMP産生抑制剤とは、制御を失った、または過剰なMMP産生を適切に抑制することができる剤のことを言う。より具体的には、MMP産生に関連する遺伝子の発現を抑制する。当該MMP産生に関連する遺伝子としては、stratifinが挙げられる。
本発明の経口用MMP産生抑制剤に用いられるシカクマメ(Psophocarpus)属に属する植物は、シカクマメ属に属する植物であれば特に限定されるものでなく、任意に用いることができる。中でもシカクマメ(学名:Psophocarpus tetragonolobus)が好ましく用いられる。シカクマメ(Psophocarpus tetragonolobus)は日本にも移入され、栽培されている。シカクマメは、翼マメ(ウイングドビーン)とも称されている。改良品種として「ウリズン」等が知られている。本発明ではこれら改良品種も含まれる。市販品はサカタのタネなどで購入することができる。
シカクマメは生のままでも乾燥したものでも使用することができるが、使用性、製剤化等の点から乾燥粉末あるいは溶媒抽出物として用いることが好ましい。シカクマメの使用部位としては、種子、莢、葉、花、根、全草等、任意に用いられ得る。中でも種子または莢が好ましく用いられる。
シカクマメの抽出物は常法より得ることができ、例えば、シカクマメを必要により乾燥した後、抽出溶媒に一定期間浸漬するか、あるいは加熱還流している抽出溶媒と接触させ、次いで濾過し、濃縮して得ることができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル等の有機溶媒を、それぞれ単独であるいは適宜組み合わせて用いることができる。上記溶媒で抽出して得た抽出液をそのまま、あるいは濃縮したエキスを用いるか、あるいはこれらエキスを吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー(例えばアンバーライトXAD−2)のカラムにて吸着させた後、メタノールまたはエタノールで溶出し、濃縮したものも使用することができる。また分配法、例えば水/酢酸エチルで抽出した抽出物等も用いることができる。
こうして得られる抽出液は、そのまま、あるいはエタノール等でさらに希釈し、または固化後、乾燥物をそのまま、もしくは乾燥物を例えばエタノールに再溶解して、本発明で用いることができる。
このようにして得られたシカクマメ抽出物は、安全性が高く、優れたMMP産生抑制作用を有する。シカクマメおよびその抽出物が経口によりMMP産生抑制作用を有することはこれまで全く知られておらず、本発明者らによってMMP産生関連遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが初めて確認されたものである。
本発明のMMP産生抑制剤を飲食品や飼料等に配合する場合、シカクマメ抽出物の配合量(乾燥質量)は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができ、例えば、飲食品全量中に0.0001〜50質量%程度とすることができる。特に、保健用飲食品等として利用する場合には、本発明の有効成分を所定の効果が十分発揮されるような量で含有させることが好ましい。
飲食品や飼料の形態としては、例えば、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状、固形状、または、液体状に任意に成形することができる。これらには、飲食品等に含有することが認められている公知の各種物質、例えば、結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤やpH調製剤などの賦形剤を適宜含有させることができる。
本発明のMMP産生抑制剤を機能性剤(例えば、栄養補助剤、機能性飲食品、疾病者用食品、特定保健用食品等)として用いる場合、剤型は任意で、例えば錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤など、いずれの形態にも公知の方法により適宜調製することができる。これらの機能性剤には、通常用いられる結合剤、崩壊剤、増粘剤、分散剤、再吸収促進剤、矯味剤、緩衝剤、界面活性剤、溶解補助剤、保存剤、乳化剤、安定化剤やpH調製剤などの賦形剤を適宜使用してもよい。
本発明のMMP産生抑制剤を、飲食品、飼料、機能性剤等として用いる場合、MMP産生に関連する遺伝子発現を有意に抑制するため、MMPの過剰発現が原因となる疾患や障害、例えば、アテローム、関節炎、癌、および組織潰瘍等、および/またはUVや乾燥による皮膚バリア破壊を引き起こすような皮膚障害の予防および/または改善に役立つ。このため、上記症状の治療、予防、改善等の生理機能をコンセプトとして、その旨を表示した機能性飲食品、疾病者用食品、特定保健用食品等に応用することができる。
1.シカクマメ種子エキス経口摂取とバリア破壊
HR-1 マウス(1群6匹)を3群用意し、シカクマメ種子エキスまたは溶媒(カルボキシメチルセルロース)を5週間、週5回(月から金曜日)、200 mg/kg/dayの量を経口摂取させた(シカクマメ種子エキス摂取は1群、溶媒摂取群は2群)。また、シカクマメまたは溶媒の摂取開始1週間後から、シカクマメ種子エキス摂取群および溶媒摂取群1群に対し、テープストリッピング(TS)によるバリア破壊を週3回(月、水、金曜日)、4週間行った。1回のバリア破壊操作はセロファンテープ(ニチバン社)を背部皮膚の左側に貼って剥がす操作を繰り返すことで行った。経皮水分蒸散量をVapometer(Delfin社)でモニターし、7〜10mg/cm2/hとなった時点でバリア破壊操作を終了した。
HR-1 マウス(1群6匹)を3群用意し、シカクマメ種子エキスまたは溶媒(カルボキシメチルセルロース)を5週間、週5回(月から金曜日)、200 mg/kg/dayの量を経口摂取させた(シカクマメ種子エキス摂取は1群、溶媒摂取群は2群)。また、シカクマメまたは溶媒の摂取開始1週間後から、シカクマメ種子エキス摂取群および溶媒摂取群1群に対し、テープストリッピング(TS)によるバリア破壊を週3回(月、水、金曜日)、4週間行った。1回のバリア破壊操作はセロファンテープ(ニチバン社)を背部皮膚の左側に貼って剥がす操作を繰り返すことで行った。経皮水分蒸散量をVapometer(Delfin社)でモニターし、7〜10mg/cm2/hとなった時点でバリア破壊操作を終了した。
2.マイクロアレイ解析
シカクマメ種子エキスまたは溶媒を経口摂取させたマウスの背部皮膚を採取し、液体窒素で凍結保存した。凍結皮膚組織を液体窒素中でクライオプレスにより破砕し、Isogenで細胞内のRNAを抽出し、さらにRNeasyキット(Qiagen社)により精製した。精製したRNAを鋳型として、マニュアル(Affymetrix社)に従い、ラベル化プローブを合成し、約4万個の遺伝子プローブについてGene Chip(whole mouse genome 320.2, Affymetrix社)上でハイブリダイゼーションを行い、蛍光ラベル強度をマイクロアレイ用スキャナー(Affymetrix社)でスキャンし、数値データを取得した。
取得したデータを統計分析ソフトウェア「R」を用いて、the Factor Analysis for Robust Microarray Summarization (FARMS) 法で正規化し、サンプルのクラスター解析を実施して、樹形図を得、各実験群が分離していることを確認した。Rank Products法によってデータをランク付けし、各Probe IDのfalse discovery rate (FDR)とランキング順の積が1以下となる、すなわち理論的に擬陽性が含まれる確率が1以下である遺伝子群を選択して以降の解析を行った。
シカクマメ種子エキスまたは溶媒を経口摂取させたマウスの背部皮膚を採取し、液体窒素で凍結保存した。凍結皮膚組織を液体窒素中でクライオプレスにより破砕し、Isogenで細胞内のRNAを抽出し、さらにRNeasyキット(Qiagen社)により精製した。精製したRNAを鋳型として、マニュアル(Affymetrix社)に従い、ラベル化プローブを合成し、約4万個の遺伝子プローブについてGene Chip(whole mouse genome 320.2, Affymetrix社)上でハイブリダイゼーションを行い、蛍光ラベル強度をマイクロアレイ用スキャナー(Affymetrix社)でスキャンし、数値データを取得した。
取得したデータを統計分析ソフトウェア「R」を用いて、the Factor Analysis for Robust Microarray Summarization (FARMS) 法で正規化し、サンプルのクラスター解析を実施して、樹形図を得、各実験群が分離していることを確認した。Rank Products法によってデータをランク付けし、各Probe IDのfalse discovery rate (FDR)とランキング順の積が1以下となる、すなわち理論的に擬陽性が含まれる確率が1以下である遺伝子群を選択して以降の解析を行った。
Ingemuity Pathway Analysis ver7.5 (IPA)を用いて、皮膚に関連する遺伝子リスト(1121個)を得て、また、シカクマメエキス摂取によって発現低下した遺伝子(1362個)と共通する遺伝子リスト(128個)を得た。そのうち、MMP産生に関連するstratifin遺伝子についてはシカクマメエキスの経口摂取の影響が顕著であった。
3.結果
上記実験による、MMP産生に関連するstratifin遺伝子発現量の変化を表1に示す。
上記実験による、MMP産生に関連するstratifin遺伝子発現量の変化を表1に示す。
マイクロアレイ解析より、バリア破壊処理のみを行った群は、未処置の群と比較して、MMP産生に関連するstratifin遺伝子発現量の上昇が認められた。これに対し、バリア破壊に加えてシカクマメエキスを投与した群は、バリア破壊処理のみを行った群と比較して、有意な発現量の減少が認められた。つまり、テープストリッピングによる皮膚バリア破壊を受けてMMP産生に関連する遺伝子発現は増加する傾向にあり、シカクマメ種子抽出物を経口摂取することにより、当該遺伝子発現を抑制する傾向にあることが示された。これは、皮膚バリア破壊に対しては、創傷治癒などに関与するとも言われるMMPの発現に関連するstratifin遺伝子の発現が増加し、これに対してシカクマメ種子抽出物を経口摂取させることにより、当該遺伝子の発現を適切に抑制したと考察することができる。
また、未処置の群と比較しても、シカクマメ種子抽出物を経口摂取した群では、stratifin遺伝子発現量が減少した。
以上の結果から、本発明のMMP産生抑制剤は、MMP産生に関連する遺伝子の発現量を有意に抑制する有効な剤であることが確認できた。
(処方例)
以下に、本発明のMMP産生抑制剤を含む製剤、サプリメント、食品、飲料等の処方例を示す。なお、配合量は、質量部または質量%で示す。
以下に、本発明のMMP産生抑制剤を含む製剤、サプリメント、食品、飲料等の処方例を示す。なお、配合量は、質量部または質量%で示す。
(錠剤)
(1,500mg/日)
(配合成分) (mg)
ショ糖エステル 70
結晶セルロース 74
メチルセルロース 36
グリセリン 25
MMP産生抑制剤:シカクマメ莢抽出物(乾燥残分) 475
N−アセチルグルコサミン 100
ヒアルロン酸 50
ビタミンE 30
ビタミンB6 20
ビタミンB2 10
α−リポ酸 20
コエンザイムQ10 40
セラミド(コンニャク抽出物) 50
L−プロリン 100
コラーゲン 400
(1,500mg/日)
(配合成分) (mg)
ショ糖エステル 70
結晶セルロース 74
メチルセルロース 36
グリセリン 25
MMP産生抑制剤:シカクマメ莢抽出物(乾燥残分) 475
N−アセチルグルコサミン 100
ヒアルロン酸 50
ビタミンE 30
ビタミンB6 20
ビタミンB2 10
α−リポ酸 20
コエンザイムQ10 40
セラミド(コンニャク抽出物) 50
L−プロリン 100
コラーゲン 400
(ソフトカプセル)
(1,500mg/日)
(配合成分) (mg)
食用大豆油 530
トチュウエキス 50
ニンジンエキス 50
MMP産生抑制剤:シカクマメ種子抽出物(乾燥残分) 100
ローヤルゼリー 50
マカ 30
γ−アミノ酪酸(GABA) 30
ミツロウ 60
ゼラチン 375
グリセリン 120
グリセリン脂肪酸エステル 105
(1,500mg/日)
(配合成分) (mg)
食用大豆油 530
トチュウエキス 50
ニンジンエキス 50
MMP産生抑制剤:シカクマメ種子抽出物(乾燥残分) 100
ローヤルゼリー 50
マカ 30
γ−アミノ酪酸(GABA) 30
ミツロウ 60
ゼラチン 375
グリセリン 120
グリセリン脂肪酸エステル 105
(顆粒)
(配合成分) (mg)
MMP産生抑制剤:シカクマメ莢抽出物(乾燥残分) 400
ビタミンC 100
大豆イソフラボン 250
還元乳糖 300
大豆オリゴ糖 36
エリスリトール 36
デキストリン 30
香料 24
クエン酸 24
(配合成分) (mg)
MMP産生抑制剤:シカクマメ莢抽出物(乾燥残分) 400
ビタミンC 100
大豆イソフラボン 250
還元乳糖 300
大豆オリゴ糖 36
エリスリトール 36
デキストリン 30
香料 24
クエン酸 24
(飲料)
(配合成分) (50ml中質量%)
トチュウエキス 1.6
ニンジンエキス 1.6
MMP産生抑制剤:シカクマメ莢抽出物(乾燥残分) 1.6
還元麦芽糖水飴 28
エリスリトール 8
クエン酸 2
香料 1.3
N−アセチルグルコサミン 1
ヒアルロン酸 0.5
ビタミンE 0.3
ビタミンB6 0.2
ビタミンB2 0.1
α−リポ酸 0.2
セラミド(コンニャク抽出物) 0.4
L−プロリン 2
コラーゲンペプチド 10
精製水 残余
(配合成分) (50ml中質量%)
トチュウエキス 1.6
ニンジンエキス 1.6
MMP産生抑制剤:シカクマメ莢抽出物(乾燥残分) 1.6
還元麦芽糖水飴 28
エリスリトール 8
クエン酸 2
香料 1.3
N−アセチルグルコサミン 1
ヒアルロン酸 0.5
ビタミンE 0.3
ビタミンB6 0.2
ビタミンB2 0.1
α−リポ酸 0.2
セラミド(コンニャク抽出物) 0.4
L−プロリン 2
コラーゲンペプチド 10
精製水 残余
(クッキー)
(配合成分) (質量%)
薄力粉 45.0
バター 17.5
グラニュー糖 20.0
MMP産生抑制剤:シカクマメ種子粉砕物 4.0
ニンジンエキス 適量
卵 12.5
レモンフレーバー 1.0
(配合成分) (質量%)
薄力粉 45.0
バター 17.5
グラニュー糖 20.0
MMP産生抑制剤:シカクマメ種子粉砕物 4.0
ニンジンエキス 適量
卵 12.5
レモンフレーバー 1.0
Claims (3)
- マメ科シカクマメ(Psophocarpus)属に属する植物の中から選ばれる1種または2種以上の植物またはその抽出物からなる、経口用のマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)産生関連遺伝子の発現抑制剤。
- 前記MMP産生関連遺伝子が、stratifin遺伝子である、請求項1に記載のMMP産生関連遺伝子の発現抑制剤。
- マメ科シカクマメ(Psophocarpus)属に属する植物の中から選ばれる1種または2種以上の植物またはその抽出物からなる、経口用MMP産生抑制剤。
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