JP5027001B2

JP5027001B2 - 酵素処理ローヤルゼリー及びそれを含有する皮膚繊維芽細胞の増殖促進剤

Info

Publication number: JP5027001B2
Application number: JP2008033395A
Authority: JP
Inventors: 広恵丸山; 陽子荒木; 嘉記角藤
Original assignee: API Co Ltd
Current assignee: API Co Ltd
Priority date: 2007-07-05
Filing date: 2008-02-14
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2028-02-14
Also published as: JP2009029772A

Description

本発明は、ローヤルゼリーエキス抽出時に用いる親水性有機溶媒等に対し不溶性の画分を中性プロテアーゼ処理することにより得られる酵素処理ローヤルゼリー及びそれを有効成分として含有する皮膚繊維芽細胞の増殖促進剤に関する。

一般に、ローヤルゼリーは、羽化後３〜１５日の雌のミツバチが下咽頭腺及び大腮腺から分泌する分泌物を混合して作るゼリー状の物質で、特有のタンパク質、脂肪酸及びミネラル等が含有されていることが知られている。ローヤルゼリーは、血圧降下作用、抗腫瘍作用、創傷治癒促進、血清コレステロール低下作用、血流増加作用、性中枢老化防止作用、抗菌作用、成長促進作用、放射線及び化学療法剤の副作用軽減作用、慢性疾患に対する作用等の種々の生理作用を有していることが知られている。したがって、従来よりローヤルゼリーは、栄養価の高い健康食品のみならず、医薬品、化粧品等の用途にも用いられてきた。

従来より、ローヤルゼリーを利用する形態として、特許文献１に開示される方法が知られている。特許文献１は、生ローヤルゼリー又は乾燥ローヤルゼリーに例えば含水エタノールを添加して混合液を調製し、ローヤルゼリー中の可溶性成分を含水エタノール中に溶解させた後、これを濾過して得られるローヤルゼリーエキスの製造方法について開示する。ローヤルゼリーエキスはデセン酸をはじめとするローヤルゼリーに特有な脂肪酸、そのエステルからなる脂質、ローヤルゼリーにのみ含有される特殊な水溶性タンパク質、アミノ酸、糖質、ミネラル等を含有している。
特開２０００−６０４５５号公報

ところで、ローヤルゼリーエキス製造中に生成する抽出溶媒に不溶性の沈澱は、主として水溶性タンパク質から構成される。従来、この不溶性の沈殿は、工程ロス、除菌濾過の障害の原因となるとともに、安定性低下等の品質低下の原因となるため、通常、抽出溶媒よりろ過除去され、ローヤルゼリーエキスの抽出残渣として破棄されていた。

本発明は、ローヤルゼリーエキス抽出後の抽出溶媒に不溶性の画分に対して、中性プロテアーゼを作用させることにより、抗酸化作用の向上効果等の生体に有用な作用効果が得られることを発見したことに基づくものである。

本発明の目的とするところは、医薬品の用途に利用することが可能な酵素処理ローヤルゼリー及びそれを含有する皮膚繊維芽細胞の増殖促進剤を提供することにある。

上記目的を達成するために、請求項１に記載の発明の酵素処理ローヤルゼリーは、生ローヤルゼリー及び乾燥ローヤルゼリーから選ばれる少なくとも一種に抽出溶媒として親水性有機溶媒又は含水親水性有機溶媒を添加して可溶性画分を分離した後、前記抽出溶媒に対して不溶性の画分に中性プロテアーゼを作用して得られ、前記親水性有機溶媒は、エタノールであり、前記中性プロテアーゼは、サーモリシンである酵素処理ローヤルゼリーにおいて、前記酵素処理ローヤルゼリーは、皮膚繊維芽細胞の増殖促進剤として適用され、服用、血管内投与又は経皮投与により投与されることを特徴とする。

請求項２に記載の発明の皮膚繊維芽細胞の増殖促進剤は、生ローヤルゼリー及び乾燥ローヤルゼリーから選ばれる少なくとも一種に抽出溶媒として親水性有機溶媒又は含水親水性有機溶媒を添加して可溶性画分を分離した後、前記抽出溶媒に対して不溶性の画分に中性プロテアーゼを作用して得られ、前記親水性有機溶媒は、エタノールであり、前記中性プロテアーゼは、サーモリシンである酵素処理ローヤルゼリーを有効成分として含有し、服用、血管内投与又は経皮投与により投与されることを特徴とする。

本発明によれば、医薬品の用途に利用することが可能な酵素処理ローヤルゼリー及びそれを含有する皮膚繊維芽細胞の増殖促進剤を提供することができる。

以下、本発明の酵素処理ローヤルゼリーを具体化した実施形態を説明する。以下、ローヤルゼリーをＲＪと略記する。
本実施形態の酵素処理ＲＪは、生ＲＪ及び乾燥ＲＪから選ばれる少なくとも一種より抽出溶媒を用いて得られる不溶性の分画が原料として使用される。一方、生ＲＪ及び乾燥ＲＪから選ばれる少なくとも一種に抽出溶媒を添加して得られる可溶性画分は、一般にＲＪエキスとよばれ、デセン酸をはじめとするローヤルゼリーに特有な脂肪酸、そのエステルからなる脂質等が含有されている。本実施形態において使用される生ＲＪ及び乾燥ＲＪの産地は、中国、台湾、日本等のアジア諸国、ヨーロッパ諸国、北アメリカ諸国、南アメリカ諸国のいずれでも良い。生ＲＪ又はＲＪ粉末（生ＲＪを凍結乾燥処理等により乾燥させて粉末化したもの）のうち、取り扱い性の観点より、ＲＪ粉末が好ましい。

生ＲＪ及び乾燥ＲＪから選ばれる少なくとも一種に添加する抽出溶媒としては、親水性有機溶媒又は含水親水性有機溶媒が使用される。親水性有機溶媒としては、例えばエタノール、メタノール、ブタノール及びプロパノール等の低級アルコール類、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類が挙げられる。これらの親水性有機溶媒を単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの中で、不溶性の高タンパク質分画の抽出効率、生体に対する適用性等の観点からエタノールが最も好ましい。含水親水性有機溶媒として例えば含水エタノールが使用される場合、抽出溶媒中におけるエタノールの濃度は、５０〜９９容量％が好ましく、８０〜９９容量％がより好ましく、９０〜９９容量％が最も好ましい。これらの抽出溶媒の添加量は、抽出効率の点から、生ＲＪ及び乾燥ＲＪから選ばれる少なくとも一種の１重量部に対して１〜１０重量部が好ましく、２〜８重量部がより好ましく、３〜６重量部が最も好ましい。これらの抽出溶媒は、生ＲＪ及び乾燥ＲＪから選ばれる少なくとも一種とともに混合及び撹拌される。

抽出の温度は、溶媒の揮発を防ぐ点から、１０〜４０℃が好ましく、２０〜３０℃がより好ましい。抽出の時間は、収率の点から、１〜２４時間が好ましく、１．５〜１２時間がより好ましく、２〜６時間がさらに好ましい。得られた抽出物は、溶媒に可溶性の画分と沈殿物からなる不溶性の画分から構成される。これらの可溶性画分と不溶性画分は、公知の方法、例えば濾過処理、遠心分離を用いることにより、容易に分離することができる。

本実施形態の酵素処理ＲＪは、原料に抽出溶媒を添加して得られる可溶性画分であるＲＪエキスを分離した後の不溶性画分が原料として使用される。この抽出溶媒に不溶性の画分には、主として水溶性タンパク質が高含有されている。以下、ＲＪエキス抽出原料に抽出溶媒を添加して得られる抽出溶媒に不溶性の画分を「高タンパクＲＪ」と呼ぶ。

本実施形態の酵素処理ＲＪは、高タンパクＲＪをタンパク分解処理することにより得られる。タンパク分解処理は、中性プロテアーゼを用いて高タンパクＲＪ中に含有されるタンパク質のペプチド結合を加水分解し、低分子化する処理である。中性プロテアーゼとしては、至適ｐＨを中性付近（ｐＨ５．０〜８．５、好ましくはｐＨ６．５〜７．５）に有するプロテアーゼを挙げることができる。中性プロテアーゼには、ペプチドの末端から加水分解するエキソ型プロテアーゼとペプチドの途中から分解するエンド型プロテアーゼとが存在するが、いずれのプロテアーゼも使用することができる。中性プロテアーゼとして、具体的には、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）（バチルス・サーモプロテオライティクス・ロッコ（Bacillus thermoproteolyticus Rokko））由来の中性プロテアーゼであるサーモリシン、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）由来の中性プロテアーゼ、及びバチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）由来の中性プロテアーゼを挙げることができる。これらの中で、酵素処理により抗酸化活性等の作用向上効果の高いサーモリシン及びアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）由来の中性プロテアーゼが好ましい。

サーモリシンは、金属プロテアーゼに分類され、至適ｐＨは約６．５〜８．５である。サーモリシンは、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン等の大きな疎水性側鎖を持つアミノ残基を含むペプチド結合を切断するエンドペプチダーゼである。市販品としては、例えばサモアーゼＰＣ１０Ｆ（大和化成社製）を挙げることができる。また、中性付近に至適ｐＨを有するとともに単独で又は組み合わせることによりサーモリシンと同様の部位を切断することができる他の中性プロテアーゼも使用することができる。サーモリシンを用いたタンパク質分解酵素処理は、好ましくは１０〜８０℃、より好ましくは４０〜７５℃、さらに好ましくは５０〜７０℃の条件下で行われる。

アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）由来の中性プロテアーゼとして、市販品としては、例えばスミチームＦＰ（新日本化学工業社製）を使用することができる。スミチームＦＰは、エンド型とエキソ型プロテアーゼを含有し、タンパク質をアミノ酸レベルにまで高度に分解することができる。また、中性付近に至適ｐＨを有するとともに単独で又は組み合わせることによりスミチームＦＰ（新日本化学工業社製）と同様の部位を切断することができる他の中性プロテアーゼも使用することができる。スミチームＦＰ（新日本化学工業社製）を用いたタンパク質分解酵素処理は、好ましくは１０〜８０℃、より好ましくは４０〜７５℃、さらに好ましくは４５〜６０℃の条件下で行われる。

バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）由来の中性プロテアーゼとして、市販品としては、例えばプロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）を使用することができる。プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇは、至適ｐＨは約５．０〜７．０である。また、中性付近に至適ｐＨを有するとともに単独で又は組み合わせることによりプロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）と同様の部位を切断することができる他の中性プロテアーゼも使用することができる。プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）を用いたタンパク質分解酵素処理は、好ましくは１０〜８０℃、より好ましくは３５〜７５℃、さらに好ましくは４０〜６０℃の条件下で行われる。

中性プロテアーゼを用いたタンパク質分解酵素処理は、高タンパクＲＪ、中性プロテアーゼ及び水（又は緩衝液）を含む反応液を、所定条件下でインキュベートすることにより実施される。タンパク質分解酵素処理の処理時間は、反応温度、酵素の力価等により適宜設定されるが、好ましくは０．１〜６時間、より好ましくは０．５〜２時間である。処理時間が０．１時間未満の場合、酵素処理ＲＪの抗酸化作用を十分に高めることができない。逆に、処理時間が６時間を越える場合、酵素処理ＲＪの製造に要する時間が著しく浪費されるため不経済である。また、抗酸化作用等の有用な効果が逆に低下するおそれがある。なお、このタンパク質分解酵素処理は、前記インキュベート後の反応液を直ちに８５〜１００℃で５〜６０分間加熱して前記プロテアーゼを失活させることが望ましい。

前記反応液には、高タンパクＲＪに起因する粘度上昇を抑えてタンパク質分解酵素処理を迅速に進行させるための溶媒として、水又は緩衝液が含有されている。反応液は、高タンパクＲＪの重量に対して２〜１５倍量、好ましくは２〜１４倍量、より好ましくは３〜１０倍量の水又は緩衝液が含有されていることが望ましい。高タンパクＲＪの重量に対して２倍量未満の溶媒が加えられる場合、高タンパクＲＪに起因する反応液の粘度上昇を十分に抑えることができないため、タンパク質分解酵素処理を迅速に進行させることが困難になる。逆に、高タンパクＲＪの重量に対して１０倍量を超える溶媒が加えられる場合、得られた酵素処理ＲＪを粉末化する際、多くの時間を要するという不都合が発生する。

本実施形態の酵素処理ＲＪは、高い抗酸化作用、保湿作用、皮膚繊維芽細胞の増殖促進作用、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性作用、疲労回復作用、及びカルシウム吸収促進作用を有する。したがって、それらの作用効果を得ることを目的とした抗酸化剤、保湿剤、皮膚繊維芽細胞の増殖促進剤、ＡＣＥ阻害剤又は血圧降下剤、疲労回復剤、及びカルシウム吸収促進剤として適用することができる。具体的な配合形態として、抗酸化剤は、好ましくは飲食品、化粧品及び医薬品等として適用することができる。保湿剤及び皮膚繊維芽細胞の増殖促進剤は、好ましくは化粧品等として適用することができる。ＡＣＥ阻害剤又は血圧降下剤は、好ましくは血圧が高めの方の飲食品及び医薬品等として適用することができる。疲労回復剤は、好ましくは栄養補助食品等の飲食品及び医薬品等として適用することができる。カルシウム吸収促進剤は、好ましくは栄養補助食品等の飲食品及び医薬品等として適用することができる。

本実施形態の酵素処理ＲＪを化粧品に適用する場合、化粧品基材に配合することにより製造することができる。化粧品の形態は、乳液状、クリーム状、粉末状等のいずれであってもよい。このような美白化粧品を肌に適用することにより、保湿等の効果を得ることができる。化粧品基剤は、一般に化粧品に共通して配合されるものであって、例えば、油分、精製水及びアルコールを主要成分として、界面活性剤、保湿剤、酸化防止剤、増粘剤、抗脂漏剤、血行促進剤、美白剤、ｐＨ調整剤、色素顔料、防腐剤及び香料から選択される少なくとも一種が適宜配合される。

本実施形態の酵素処理ＲＪを飲食品に適用する場合、種々の食品素材又は飲料品素材に添加することによって使用することができる。飲食品の形態としては、特に限定されず、液状、粉末状、ゲル状、固形状等のいずれであってもよく、また剤形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ドリンク剤のいずれであってもよい。その中でも、吸湿性が抑えられることから、カプセル剤であることが好ましい。前記飲食品としては、その他の成分としてゲル化剤含有食品、糖類、香料、甘味料、油脂、基材、賦形剤、食品添加剤、副素材、増量剤等を適宜配合してもよい。

本実施形態の酵素処理ＲＪを医薬品として使用する場合は、服用（経口摂取）により投与する場合の他、血管内投与、経皮投与等のあらゆる投与方法を採用することが可能である。本実施形態の酵素処理ＲＪは経口摂取により投与されることが望ましい。剤形としては、特に限定されないが、例えば、散剤、粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、液剤、注射剤等が挙げられる。また、添加剤として賦形剤、基剤、乳化剤、溶剤、安定剤等を配合してもよい。

本実施形態によって発揮される効果について、以下に記載する。
（１）本実施形態において、生ＲＪ等に抽出溶媒を添加して可溶性画分を分離した後、前記抽出溶媒に対して不溶性の画分に中性プロテアーゼを作用して得られる酵素処理ＲＪは、高い抗酸化作用を有している。したがって、抗酸化作用を目的とした化粧品、飲食品及び医薬品に好ましく適用することができる。

（２）本実施形態において、生ＲＪ等に抽出溶媒を添加して可溶性画分を分離した後、前記抽出溶媒に対して不溶性の画分に中性プロテアーゼを作用して得られる酵素処理ＲＪは、高い保湿作用及び皮膚繊維芽細胞の増殖を促進する作用を有している。したがって、保湿作用等を目的とした化粧品により好ましく適用することができる。

（３）本実施形態において、生ＲＪ等に抽出溶媒を添加して可溶性画分を分離した後、前記抽出溶媒に対して不溶性の画分に中性プロテアーゼを作用して得られる酵素処理ＲＪは、高いＡＣＥ阻害活性作用を有している。したがって、血圧降下作用を目的とした飲食品及び医薬品等により好ましく適用することができる。

（４）本実施形態において、生ＲＪ等に抽出溶媒を添加して可溶性画分を分離した後、前記抽出溶媒に対して不溶性の画分に中性プロテアーゼを作用して得られる酵素処理ＲＪは、高い疲労回復作用を有している。したがって、疲労回復作用を目的とした飲食品及び医薬品等により好ましく適用することができる。

（５）本実施形態において、生ＲＪ等に抽出溶媒を添加して可溶性画分を分離した後、前記抽出溶媒に対して不溶性の画分に中性プロテアーゼを作用して得られる酵素処理ＲＪは、高いカルシウム吸収促進作用を有している。したがって、カルシウム吸収促進作用を目的とした飲食品及び医薬品等により好ましく適用することができる。

（６）本実施形態において、高タンパクＲＪを得るために、生ＲＪに配合する親水性有機溶媒は、エタノールが好ましく使用される。したがって、最終的に得られる酵素処理ＲＪを生体に対して容易に適用することができる。

（７）本実施形態において、高タンパクＲＪに適用する中性プロテアーゼは、サーモリシンが好ましく適用される。したがって、酵素処理によって抗酸化作用、保湿作用、皮膚繊維芽細胞の増殖促進作用、ＡＣＥ阻害活性作用、疲労回復作用、及びカルシウム吸収促進作用をより高めることができる。

（８）本実施形態において、高タンパクＲＪに適用する中性プロテアーゼは、アスペルギルス．オリザエ由来のエンド型プロテアーゼ及びエキソ型プロテアーゼが好ましく適用される。したがって、酵素処理によって抗酸化作用、保湿作用、皮膚繊維芽細胞の増殖促進作用、ＡＣＥ阻害活性作用、疲労回復作用、及びカルシウム吸収促進作用をより高めることができる。

なお、上記実施形態は以下のように変更してもよい。
・上記実施形態における酵素処理ＲＪは、酵素によるタンパク質分解処理後の反応液をそのまま医薬品に適用してもよく、溶媒を蒸発させて濃縮処理して適用してもよく、乾燥及び粉末化して適用してもよい。

・上記実施形態における酵素処理ＲＪは、ヒトが摂取する医薬品に対して適用することができるのみならず、家畜の飼料に医薬品として配合してもよい。

・高タンパク質画分は、不純物を取り除くために再度、抽出溶媒を用いて洗浄処理を行なってもよい。

以下に試験例を挙げ、前記実施形態をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（酵素処理ＲＪの調製）
中国産生ＲＪ（固形分３５％（ｗ／ｗ））１ｋｇに抽出溶媒としてエタノール９９容量％の含水親水性有機溶媒２．５ｋｇを加えて室温（約２５℃）で２４時間攪拌し、生ＲＪ中の不溶性成分を沈殿させた。その後、攪拌抽出液を濾布で濾過して可溶性成分を溶解する溶媒と不溶性画分（高タンパクＲＪ）を分離した。この高タンパクＲＪには、主として水溶性タンパク質が高含有されている。生ＲＪ１ｋｇより高タンパクＲＪ約０．７ｋｇ（固形分４８質量％）を得た。

前記高タンパクＲＪ１００ｇに水６６０ｍｌを加え、ｐＨ７に調整することにより、酵素処理用のＲＪ希釈液を調製した。次に、前記ＲＪ希釈液に、中性プロテアーゼを添加することにより、反応液を調整した。中性プロテアーゼとしてサーモリシン、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）由来の中性プロテアーゼ、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）由来の中性プロテアーゼの３種類を使用した。

サーモリシンは、サモアーゼＰＣ１０Ｆ（大和化成社製）を使用した。サモアーゼＰＣ１０Ｆは、９００００ＰＵ／ｇ以上の力価（１ＰＵ＝カゼイン（終濃度０．５％）にｐＨ７．２、３５℃で作用するとき、反応初期の１分間に１μｇのチロシンに相当する酸可溶性低分子分解産物を生成するのに必要な酵素量）を有している。サモアーゼＰＣ１０Ｆを上記酵素処理用のＲＪ希釈液に０．５ｇ添加することにより、反応液を調製した。

アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）由来の中性プロテアーゼは、スミチームＦＰ（新日本化学工業社製）を使用した。スミチームＦＰは、エンド型プロテアーゼ５００００Ｕ／ｇ以上の力価を有している。スミチームＦＰを上記酵素処理用のＲＪ希釈液に０．５ｇ添加することにより、反応液を調製した。

バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）由来の中性プロテアーゼは、プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）を使用した。プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇは、１５００００Ｕ／ｇ以上の力価を有している。プロテアーゼＮ「アマノ」Ｇを上記酵素処理用のＲＪ希釈液に０．５ｇ添加することにより、反応液を調製した。

続いて、サモアーゼを添加した反応液を６５℃、その他の反応液を５０℃でインキュベートすることにより、タンパク質分解酵素処理を実施した。タンパク質分解酵素処理の開始から、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後及び１７時間後にそれぞれ反応液を少量ずつ採取した。採取直後の各反応液をろ紙（アドバンテック東洋製Ｎｏ．２）で吸引ろ過後、凍結乾燥し、粉末状にした酵素処理ＲＪをそれぞれ調製した。ちなみに、前記タンパク質分解酵素処理の開始から終了までの反応液の温度及びｐＨを不定期に測定したところ、温度管理上の誤差や実験上の誤差の範囲内で、概ね初期反応温度及び中性領域の条件が継続的に維持されていたことを確認した。

（試験例１、抗酸化活性としてのラジカル捕捉能試験）
酵素処理ＲＪの生理活性作用の一つである抗酸化作用をラジカル捕捉能試験によって比較した。本試験では、ラジカル状態で５１７ｎｍの極大吸収を持つＤＰＰＨ(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)が抗酸化物質により還元されて退色することを利用するものである。各酵素処理ＲＪを無水エタノール中に各々０．００１質量％の濃度で溶解させて試料溶液を調製した。前記各試料溶液１００μｌに、１７０μＭのＤＰＰＨエタノール溶液１．９ｍｌを加えて混合し、ＤＰＰＨエタノール試料溶液とした後、室温（２２℃）で１５分間反応させた。そして、分光光度計（島津製作所製ＵＶ-１２００）を用いて、各ＤＰＰＨエタノール試料溶液の光の波長５１７ｎｍにおける吸光度を測定した。尚、対照（コントロール）として溶媒のみを用いて同操作を行なった。ＤＰＰＨラジカル捕捉率は以下の式より求めた。また、比較対照として抽出原料として用いた中国産生ＲＪの凍結乾燥ＲＪ（ＦＤＲＪ）を使用し、上記と同様の方法によりＤＰＰＨラジカル捕捉率を測定した。その結果を表１に示す。

ＤＰＰＨラジカル捕捉率（％）＝｛（Ａｃ−Ａｓ）／Ａｃ｝×１００
Ａｃ：コントロールの吸光度
Ａｓ：ＤＰＰＨ溶液添加時の吸光度−エタノールのみ添加時の吸光度

表１に示されるように、高タンパクＲＪを各々のタンパク質分解酵素で処理する事により産出された酵素処理ＲＪは、特にスミチーム処理及びサモアーゼ処理において、生ＲＪよりもＤＰＰＨラジカル捕捉率が向上した。また、スミチーム処理及びサモアーゼ処理において、酵素処理時間３０分が最もＤＰＰＨラジカル捕捉率が高く、その後、酵素処理時間２時間を超え４時間目以降になるとＤＰＰＨラジカル捕捉率が減少していくことが確認された。プロテアーゼＮ処理も処理時間２時間において僅かに生ＲＪよりも高いＤＰＰＨラジカル捕捉率を示した。

フリーラジカルは悪性腫瘍、心疾患、脳血管疾患等の種々の疾患の原因因子と考えられている。フリーラジカルを除去する作用を有する酵素処理ＲＪはそれらの疾患の予防及び治療のための有効な成分になり得る。したがって、フリーラジカル除去能の発揮を目的とする健康食品、化粧品及び医薬品等の有効成分として好適に配合することができる。

（試験例２、抗酸化活性としてのβカロチン退色試験）
酵素処理ＲＪの生理活性作用の一つである抗酸化作用をβカロチン退色試験によって比較した。主として植物の黄色色素として知られるβカロチンは、水溶液中では、自然酸化により退色が進行する。一方、この退色は、抗酸化物質を共存させることにより、進行を抑制することができる。本試験で用いる酵素処理ＲＪの試料として、試験例１で用いたスミチーム２時間処理、及びサモアーゼ４時間処理後の凍結乾燥した粉末を水で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈したものを使用した。陽性対象の試料として、カルノシン（０．０２ｍｇ／ｍｌ）及びＢＨＴ（０．０２ｍｇ／ｍｌ）を使用した。また、比較対照として抽出原料として用いた中国産生ＲＪの凍結乾燥ＲＪ（ＦＤＲＪ）を水で０．５ｍｇ／ｍｌに希釈したものを使用した。

まず、褐色ナスフラスコ内にてβカロチン０．５ｍｇ、リノール酸２０ｍｇ、ｔｗｅｅｎ８０；２００ｍｇをクロロホルム１０ｍｌに溶解した。溶解後、蒸発乾固によりクロロホルムを除き、蒸留水１００ｍｌを加えた。この溶液４５ｍｌに０．２Ｍリン酸緩衝液４ｍｌを加え、キャップ付試験管に４．９ｍｌ分注した。分注後、下記表２に示される各試料を０．１ｍｌ添加し、吸光度（ＯＤ４７０ｎｍ）を測定した。その時の吸光度の値を０時間反応値とした。０時間反応値を測定した後、試験液は４０℃で保管し、１時間毎にＯＤ４７０ｎｍを測定した。本試験系の抗酸化能の評価として、０時間の吸光度値を１００％とし、１時間毎に測定される値を下記の式に当てはめることによりβカロチン残存率を算出した。４時間後のβカロチン残存率の結果を表２に示す。

βカロチン残存率（％）＝（時間毎の吸光度の値×１００）÷（０時間反応値）

表２に示されるように、スミチーム処理及びサモアーゼ処理した酵素処理ＲＪは、いずれも生ＲＪよりも高い抗酸化能が確認された。酵素処理ＲＪは、酵素処理を行なっていない生ＲＪと比較して、値が約２倍に上昇していることが確認された。従って、高タンパクＲＪをサモアーゼ処理及びスミチウム処理することによって産出された酵素処理ＲＪは、抗酸化能が処理前よりも向上し、高い抗酸化活性を有することが確認された。

（試験例３、抗酸化活性としてのジエチルチオバルビツール酸（ＤＥＴＢＡ）試験）
酵素処理ＲＪの生理活性作用の一つである抗酸化作用をＤＥＴＢＡ試験によって比較した。本試験では、リノール酸の自動酸化反応で微量に生じた過酸化脂質を高感度なジエチルチオバルビツール酸（ＤＥＴＢＡ）法にて検出する。本試験で用いる酵素処理ＲＪの試料として、試験例１で用いたスミチーム２時間処理、及びサモアーゼ４時間処理後の凍結乾燥した粉末を水で０．０５ｍｇ／ｍｌに希釈したものを使用した。陽性対象の試料として、カルノシン（０．０５ｍｇ／ｍｌ）及びＢＨＴ（０．０５ｍｇ／ｍｌ）を使用した。また、比較対照として抽出原料として用いた中国産生ＲＪの凍結乾燥ＲＪ（ＦＤＲＪ）を水で０．０５ｍｇ／ｍｌに希釈したものを使用した。

まず、試料区（ｎ＝３）として、０．２％リノール酸（エタノール溶液）２０μｌと、表３に示される各試料又は蒸留水８０μｌをキャップ付試験管内にて混合した。ブランク（ｎ＝２）は、エタノール２０μｌと、表３に示される各試料又は蒸留水２０μｌを混合した。試料区及びブランクは、キャップを外し８０℃で６０分間加熱した。加熱後、氷冷した。酸化防止剤として２０ｍＭ；ＢＨＴ(2,6-Di-t-butyl-4-methylphenol：和光純薬社製)２００μｌ添加及び混合後、リノール酸の酸化を停止させた。そこに８％ＳＤＳを２００μｌと蒸留水４００μｌ添加し、混合した。混合後、１２．５ｍＭのＤＥＴＢＡ３．２ｍｌを添加し、キャップを締めて９０℃１５分加熱した。加熱後、酢酸エチルを４ｍｌ添加、攪拌後に遠心分離（２０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ、室温)した。酢酸エチル層を蛍光光度計（Ｅｘ５１５−Ｅｍ５５５）にて測定した。各試料の抗酸化力は、測定値を下記の式を用いて算出した。結果を表３に示す。

蒸留水(試料区)−蒸留水(ブランク)＝Ａ
試料(試料区)−試料(ブランク)＝Ｂ
１００−（Ｂ÷Ａ×１００）＝阻害率

表３に示されるように、スミチーム処理及びサモアーゼ処理した酵素処理ＲＪは、いずれも生ＲＪよりも高い抗酸化能が確認された。特にスミチーム処理した酵素処理ＲＪは、陽性対照であるカルノシンと同等の抗酸化力を有していることが確認された。

（試験例４、保湿試験）
酵素処理ＲＪと酵素処理前の生ＲＪとの保湿性を比較した。酵素処理ＲＪの試料として、試験例１で用いたスミチーム２時間処理及びサモアーゼ４時間処理後の凍結乾燥した各々の粉末について、それぞれ水で３．３％及び１０％水溶液としたものを使用した。陽性対照として、アルギン酸ナトリウム（１．２５％水溶液）を使用した。陰性対照として、蒸留水を使用した。また、比較対照として抽出原料として用いた中国産生ＲＪの凍結乾燥ＲＪ（ＦＤＲＪ）を水で３．３％溶液に調整したものを測定に用いた。

まず、精密天秤の秤量室内にシリカゲルを置き、湿度が安定するまで放置する。次に、直径６ｍｍ、厚さ０．７ｍｍのペーパーディスクを秤量皿の中央に置き、ゼロあわせを行なう。そして、試料１０μｌを滴下し、直ちに重量を測定した。次に、試料滴下後、２０分後の重量を測定した。滴下直後の重量に対する２０分後の重量変化を水分残存率（％）として算出した。結果を表４に示す。

表４に示されるように、ＦＤＲＪについて、蒸留水と変わらない結果となった。一方、酵素処理ＲＪ（スミチーム処理ＲＪ及びサモアーゼ処理ＲＪ）は、いずれも水分残存率が５０％を超え、保水性が１．２５％アルギン酸ナトリウム溶液とほぼ同等の水分残存率であることが確認された。また、サモアーゼ処理した酵素処理ＲＪは、スミチーム処理した酵素処理ＲＪより僅かに水分残存率が高かった。また、酵素処理ＲＪ（スミチーム処理ＲＪ及びサモアーゼ処理ＲＪ）は、いずれも濃度依存的に保水性の効果が向上することが確認された。この結果から、生ＲＪは、抽出溶媒に不溶性の画分である高タンパクＲＪを特定の酵素処理によって、低分子化されることによってはじめて保湿性が得られることが確認された。本実施例の酵素処理ＲＪは、保湿性の発揮を目的とする化粧品等の有効成分として好適に配合することができる。

（試験例５、皮膚保湿性モニター試験）
酵素処理ＲＪを、ヒトの皮膚に塗布した際の保湿性について評価した。酵素処理ＲＪの試料として、試験例１で用いたサモアーゼ４時間処理後の凍結乾燥した粉末について、水で２．０％溶液としたものを使用した。陰性対照として、蒸留水を使用した。また、比較対照として抽出原料として用いた中国産生ＲＪの凍結乾燥ＲＪ（ＦＤＲＪ）を水で２．０％溶液に調整したものを測定に用いた。

まず、２０代〜６０代の男女９名の上腕内側に、各試料を塗布し指で十分に皮膚に浸透させた後、１分後の水分量を測定した。水分量の測定には、モイスチュアーチェッカー（スカラ社製）を使用し、各試料について５回ずつ測定し、その平均値を集計した。測定時の室温は２４〜２５℃、湿度は３７〜４１％に設定した。結果を表５，６に示す。

表５，６に示されるように、蒸留水を塗布した時と比較して、生ＲＪ及び酵素処理ＲＪを塗布した時は水分量の向上が認められ、保湿性が向上したことが確認された。特に、酵素処理ＲＪの塗布時には、蒸留水に対して有意な水分量の向上が認められた。尚、生ＲＪ又は生ＲＪの希釈液を肌に塗布した際のざらつきも酵素処理することにより改善されるとともに、希釈液に溶解した際の濁りが認められないことが確認された（データ未添付）。かかる点からも本実施例の酵素処理ＲＪは、保湿性の発揮を目的とする化粧品等の有効成分として好適に配合することができることが確認された。

（試験例６、皮膚繊維芽細胞増殖試験）
酵素処理ＲＪが、ヒトの皮膚繊維芽細胞の増殖に及ぼす影響について評価した。酵素処理ＲＪの試料として、試験例１で用いたスミチーム２時間処理及びサモアーゼ４時間処理後の凍結乾燥した粉末を使用した。陰性対照（コントロール）として、蒸留水を使用した。また、比較対照として抽出原料として用いた中国産生ＲＪの凍結乾燥ＲＪ（ＦＤＲＪ）を使用した。ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ；理化学研究所から分譲）を１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００ｕｎｉｔ／ｍＬ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するα−ＭＥＭ培地で培養し、２×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調整して、１００μｌ播種した。次に、水を用いて最終濃度２００μｇ／ｍｌとなるよう調整した各試料溶液１０μｌを添加し、４８時間培養後、ＭＴＴアッセイにて細胞の増殖度を確認した。ＭＴＴアッセイにおける吸光度の変化を表７に示す。

表７に示されるように、コントロール（蒸留水）に対して、サモアーゼを用いた酵素処理ＲＪは、僅かにその増殖作用が有意に向上した。また、生ＲＪとの比較し、酵素処理したＲＪの方がヒト皮膚繊維芽細胞を有意に増殖させることが確認された。この結果より、生ＲＪは、抽出溶媒に不溶性の画分である高タンパクＲＪを特定のプロテアーゼにより低分子化することにより、皮膚細胞に対して良い影響を及ぼすことが確認された。

（試験例７、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性試験）
アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）は血圧上昇因子アンジオテンシンＩＩの生成に関わる酵素であり、この酵素の働きを抑えることは、血圧の降下にもつながることが確認されている。そこで、酵素処理ＲＪに関して、その作用を確認した。本試験で用いる酵素処理ＲＪの試料として、試験例１で用いたスミチーム２時間処理、及びサモアーゼ４時間処理後の凍結乾燥した各粉末を水で最終濃度１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．０４ｍｇ／ｍｌにそれぞれ希釈したものを使用した。また、比較対照として中国産生ＲＪより得られる抽出溶媒に不溶性の画分である高タンパクＲＪの凍結乾燥した粉末を水で１００ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌにそれぞれ希釈したものを使用した。

ＡＣＥ阻害活性の測定は受田らの方法に準じて行った。即ち、まず各試料溶液５０μｌ及び５．８３ｍＭ基質（Ｂｚ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ：１Ｍ食塩含有１２５ｍＭホウ酸緩衝液に溶解）１５０μｌを混合し、３７℃５分間プレインキュベートした。次に、ブランクには１Ｎ塩酸２５０μｌを加え、各試料には、１２０ｍＵ／ｍｌのウサギ肺由来アンジオテンシン変換酵素を５０μｌ添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。各試料に１Ｎ塩酸を２５０μl加えて攪拌後、酢酸エチルにて生成した馬尿酸を抽出し、２２８ｎｍの吸光度を測定した。各濃度の試料溶液よりＡＣＥ阻害活性を５０％阻害する濃度（ｍｇ／ｍｌ）をＡＣＥ阻害活性ＩＣ_５０値として求めた。結果を表８に示す。

表８に示されるように、酵素処理前の高タンパクＲＪでは、ＡＣＥ阻害活性については殆ど認められなかった。一方、中性プロテアーゼ処理を行なった試料については、ＡＣＥ阻害活性が認められた。ＡＣＥ阻害活性は、中性プロテアーゼ処理を行なうことにより初めて発現することが確認された。尚、本実施例の酵素処理ＲＪのＡＣＥ阻害活性は、中国産生ＲＪを原料として上記の中性プロテアーゼで処理したものと比較して同等以上であった（データ未掲載）。本実施例の酵素処理ＲＪは、血圧降下作用の発揮を目的とする飲食品及び医薬品等の有効成分として好適に配合することができることが確認された。

（試験例８、疲労回復試験）
酵素処理ＲＪの生理活性作用の一つである疲労回復作用をマウス強制水泳試験によって確認した。マウスを水中に入れると、最初の１分間程度は四肢と尾を使って泳ぎ、脱出を試みる。しかしその後は、疲労によりマウスが水泳を止め、水面に浮くだけの時間が生じる。これを不動時間として計測する。本試験で用いる酵素処理ＲＪの試料として、試験例１で用いたサモアーゼ４時間処理後の凍結乾燥した各粉末を使用した。比較対照として抽出原料として用いた中国産生ＲＪの凍結乾燥ＲＪ（ＦＤＲＪ）を使用した。陽性対象の試料として、カルノシンを使用した。尚、強制水泳は、直径１９ｃｍ、深さ２７ｃｍの水槽に水（水温２５℃）を入れ、この水槽で行なった。試験動物としてｄｄｙ系雄性マウス（４週齢）を使用した。まず、各試料を蒸留水に溶解し（５００ｍｇ／ｋｇ（体重）／１０ｍｌ、陽性対照は５０ｍｇ／ｋｇ（体重）／１０ｍｌ）、１日１回、１０日間を経口投与した。１１日目は５分間の予備強制水泳を試行し、その直後に各試料を同量経口投与した。その経口投与６０分経過後に再強制水泳を５分間試行した。５分間の再強制水泳中に、マウスが水中で動かない時間を累計し、これを不動時間とした。不動時間の結果を表９に示す。

表９に示されるように、コントロール（蒸留水）に対して、サモアーゼを用いた酵素処理ＲＪは、有意な不動時間の短縮が認められた。また、生ＲＪは不動時間の短縮効果はほとんど認められなかった。さらに、ＡＴＰ／ＡＭＰ比（エネルギー消費の指標）の測定を行った結果、酵素処理ＲＪ及びカルノシンを投与した場合、それぞれＡＴＰ／ＡＭＰ比が回復している傾向が認められた（データ未掲載）。この結果より、生ＲＪは、抽出溶媒に不溶性の画分である高タンパクＲＪを特定のプロテアーゼにより低分子化することにより、肉体疲労の改善作用を示すことが確認された。

（試験例９、カルシウム吸収試験）
酵素処理ＲＪの生理活性作用の一つであるカルシウム吸収促進作用を反転腸管試験によって確認した。まず、ラットの小腸を摘出し、反転させ、反転腸管嚢を作成、腸管内に生理食塩水を２ｍｌ入れ、酸素で５分間還流後、以下の試料溶液８０ｍｌ中で４０℃、３０分間インキュベートした。腸管内に取り込まれたカルシウムイオンの量をカルシウム測定キット(アクアオートカイノスＣａ測定キット、カイノス社製)を用いて比色定量（６６０ｎｍ）した。本試験で用いる酵素処理ＲＪの試料として、試験例１で用いたサモアーゼ４時間処理後の凍結乾燥した各粉末を使用した。比較対照として抽出原料として用いた中国産生ＲＪの凍結乾燥ＲＪ（ＦＤＲＪ）を使用した。各試料をカルシウムイオン溶液に０．３重量％の濃度で溶解させた。カルシウムイオン溶液は、生理食塩水に塩化カルシウムを添加し、カルシウム濃度が０．０７重量％となるように調製した。結果を表１０に示す。

表１０に示されるように、カルシウムイオン溶液（コントロール）に対して、サモアーゼを用いた酵素処理ＲＪをカルシウムイオン溶液に添加した場合、吸光度が約２倍上昇した。つまり、酵素処理ＲＪにより腸管内へのカルシウムイオンの吸収が促進されたことを示す。一方、生ＲＪをカルシウムイオン溶液に添加した場合、吸光度の上昇は認められなかった。この結果より、ＲＪを特定の酵素を用いてペプチド化することにより初めてカルシウム吸収促進能が発揮されることが確認された。

Claims

生ローヤルゼリー及び乾燥ローヤルゼリーから選ばれる少なくとも一種に抽出溶媒として親水性有機溶媒又は含水親水性有機溶媒を添加して可溶性画分を分離した後、前記抽出溶媒に対して不溶性の画分に中性プロテアーゼを作用して得られ、前記親水性有機溶媒は、エタノールであり、前記中性プロテアーゼは、サーモリシンである酵素処理ローヤルゼリーにおいて、
前記酵素処理ローヤルゼリーは、皮膚繊維芽細胞の増殖促進剤として適用され、服用、血管内投与又は経皮投与により投与されることを特徴とする酵素処理ローヤルゼリー。
生ローヤルゼリー及び乾燥ローヤルゼリーから選ばれる少なくとも一種に抽出溶媒として親水性有機溶媒又は含水親水性有機溶媒を添加して可溶性画分を分離した後、前記抽出溶媒に対して不溶性の画分に中性プロテアーゼを作用して得られ、前記親水性有機溶媒は、エタノールであり、前記中性プロテアーゼは、サーモリシンである酵素処理ローヤルゼリーを有効成分として含有し、
服用、血管内投与又は経皮投与により投与されることを特徴とする皮膚繊維芽細胞の増殖促進剤。