JP7053169B2 - プロコラーゲンプロセッシング促進剤 - Google Patents
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Description
ADAMTS2は、a disintegrin-like and metalloprotease reprolysin type with thrombospondin type 1 motif, 2(GeneID:9509)を、BMP1は、bone morphogenetic protein1(GeneID:649)を指し、プロコラーゲンのプロセッシング酵素として知られている(非特許文献1)。ここで、GeneIDは、「NCBI Entrez Gene」における遺伝子IDを表す 。
1)活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とするプロコラーゲンプロセッシング促進剤。
2)活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とするBMP1発現促進剤。
3)活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とするADAMTS2発現促進剤。
4)活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とするコラーゲン線維形成促進剤。
5)活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とする皮膚のタルミ予防又は改善剤。
6)活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とする皮膚のシワ予防又は改善剤。
公知の抽出方法としては、例えば、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、超臨界抽出、超音波抽出及びマイクロ波抽出等が挙げられる。
より好適な水-アルコール系混合溶剤としては、20%(v/v)以上、好ましくは30%(v/v)以上、そして95%(v/v)以下、80%(v/v)以下のエタノール水溶液が挙げられる。例えば、20~95%(v/v)エタノール水溶液、好ましくは30~80%(v/v)エタノール水溶液が挙げられる。
活性炭処理に用いる活性炭としては、松等の木、竹、椰子殻、胡桃殻等の植物質のほか、石炭質、石油質等を原材料としても良い。また、上記活性炭の原材料に水蒸気や二酸化炭素、空気等のガスを使う高温炭化法等の物理的な方法や塩化亜鉛等の化学薬品を使って処理した上で加熱し、多孔質にしたものや、化学的な方法による活性化処理を施して得られるもの等を利用しても良い。本発明では、安全性の観点から、植物質を原材料とする活性炭が好ましく用いられる。
活性炭の形状としては顆粒状~微粉末まで様々の粒子径のものがあるが、吸着能力から微粉末が望ましい。その細孔構造の直径ピークは、0.01nm~500nm付近が好ましく、より好ましくは0.1nm~50nm付近、さらに好ましくは1nm~10nm付近である。
したがって、活性炭処理オウバク抽出物に、ADAMTS2及びBMP1の発現促進作用、コラーゲン線維形成促進作用があったことは、活性炭処理オウバク抽出物が、真皮結合組織をより収縮させ、引き締め強度を増加させることができ、老化等により低下した皮膚の弾力性を向上させ、皮膚のタルミやシワの抑制や回復、ハリの維持又は回復に有効であると云える。
ここで、ヒトに対する使用は、治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。
また、「ADAMTS2の発現促進」とはADAMTS2 mRNAへのADAMTS2遺伝子の転写を誘導又は促進すること、ADAMTS2タンパク質へのADAMTS2 mRNAの翻訳を誘導又は促進することが挙げられ、「BMP1の発現促進」とは、BMP1 mRNAへのBMP1遺伝子の転写を誘導又は促進すること、BMP1タンパク質へのBMP1 mRNAの翻訳を誘導又は促進することが挙げられる。
斯かる製剤は、それぞれ一般的な製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体、例えば、各種油剤、界面活性剤、ゲル化剤、防腐剤、酸化防止剤、溶剤、アルコール、水、キレート剤、増粘剤、紫外線吸収剤、乳化安定剤、pH調整剤、色素、香料等とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって得ることができる。また、これらの化粧品、医薬部外品又は医薬品等には、それぞれの製剤に応じて、適宜、植物抽出物、殺菌剤、保湿剤、抗炎症剤、抗菌剤、清涼剤、抗脂漏剤等を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
また、上記化粧品、医薬品又は医薬部外品の適用対象者としては、それを必要とするヒトであれば特に限定されないが、皮膚の弾力性改善、皮膚のタルミやハリの予防又は改善、皮膚のシワの予防又は改善、或いは皮膚引き締めを望むヒトの皮膚部位が好ましく、特に顔面の皮膚が好ましい。
<1>活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とするプロコラーゲンプロセッシング促進剤。
<2>活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とするBMP1発現促進剤。
<3>活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とするADAMTS2発現促進剤。
<4>活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とするコラーゲン線維形成促進剤。
<5>活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とする皮膚のタルミ予防又は改善剤。
<6>活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とする皮膚のシワ予防又は改善剤。
<8>BMP1発現促進剤を製造するための、活性炭処理オウバク抽出物の使用。
<9>ADAMTS2発現促進剤を製造するための、活性炭処理オウバク抽出物の使用。
<10>コラーゲン線維形成促進剤を製造するための、活性炭処理オウバク抽出物の使用。
<11>皮膚のタルミ予防又は改善剤を製造するための、活性炭処理オウバク抽出物の使用。
<12>皮膚のシワ予防又は改善剤を製造するための、活性炭処理オウバク抽出物の使用。
<14>BMP1発現促進に使用するための、活性炭処理オウバク抽出物。
<15>ADAMTS2発現促進に使用するための、活性炭処理オウバク抽出物。
<16>コラーゲン線維形成促進に使用するための、活性炭処理オウバク抽出物。
<17>皮膚のタルミ予防又は改善に使用するための、活性炭処理オウバク抽出物。
<18>皮膚のシワ予防又は改善に使用するための、活性炭処理オウバク抽出物。
<20>活性炭処理オウバク抽出物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するADAMTS2発現促進方法。
<21>活性炭処理オウバク抽出物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取するコラーゲン線維形成促進方法。
<22>活性炭処理オウバク抽出物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する皮膚のタルミ予防又は改善方法。
<23>活性炭処理オウバク抽出物を、それらを必要とする対象に有効量で投与又は摂取する皮膚のシワ予防又は改善方法。
<24>前記<7>~<12>及び<19>~<23>において、使用又は方法は非治療的な使用又は非治療的な方法である。
<25>前記<1>~<24>において、オウバク抽出物を得るための抽出溶剤が、水、アルコール系溶剤(好ましくはメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール)、又は水-アルコール系混合溶剤であり、好ましくは水-エタノール混液である。
<26>前記<1>~<25>において、活性炭処理は、粉末状又は粒状の活性炭をオウバク抽出物に添加、撹拌した後、当該活性炭を除去するものである。
<27>前記<1>~<12>のBMP1発現促進剤、ADAMTS2発現促進剤、コラーゲン線維形成促進剤、皮膚のタルミ予防又は改善剤又は皮膚のシワ予防又は改善剤において、製剤中の活性炭処理オウバク抽出物の含有量は、一般的に固形分濃度として、好ましくは0.0000001質量%以上、より好ましくは0.000001質量%以上、さらに好ましくは0.000005質量%以上であり、そして好ましくは1質量%以下、より好ましくは0.1質量%以下、さらに好ましくは0.05質量%以下である。また、固形分濃度として、好ましくは0.0000001~1質量%、より好ましくは0.000001~0.1質量%、さらに好ましくは0.000005~0.05質量%である。
製造例1 活性炭処理オウバク抽出物の製造
オウバク(キハダ樹皮)1.0kgに50%(v/v)エタノール水溶液10Lを加え、室温で7日間抽出後、濾過してオウバク抽出液(活性炭未処理オウバク抽出物)を得た(蒸発残分:1.2(w/v%))。得られた抽出液に、固形分の3倍量の活性炭(大阪ガスケミカルズ社、白鷲A(細孔構造のピーク直径2nm))を加え、室温下で1時間撹拌処理した後ろ過した。得られたろ液を冷温(4℃前後)下で1週間静置し、析出した不溶成分を除去してオウバク抽出物の活性炭処理品(活性炭処理オウバク抽出物)を得た(蒸発残分:0.19(w/v%))。
ウシ胎児血清(FBS)を10%含む最少必須培地(MEM)を用いて37℃、5%CO2条件下で定法に従い培養した新生児由来皮膚線維芽細胞を、アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩n水和物(以降、アスコルビン酸と表記)含有MEMにて12ウェルプレートに2.5×105cells/mL/ウェルの細胞密度で播種した。翌日、FBS濃度を0.6%に減じた培地にて培地交換するとともに、製造例1で調製したオウバク抽出物の活性炭処理品(活性炭処理オウバク抽出物)を添加した。添加48時間後(ADAMTS2の場合は添加72時間後)、培地を除き、RNeasy kit(QIAGEN社)の細胞溶解bufferを用いて細胞を溶解し、同kit添付のプロトコルに従いtotal RNAを抽出した。次にHigh-Capacity cDNA Archive kit(Applied Biosystems社)を用いて、逆転写反応により(反応条件:25℃-10分、37℃-120分)cDNAを得た。得られたcDNAを用い、リアルタイムPCRによりADAMTS2 mRNA、BMP1 mRNA及びI型コラーゲン遺伝子(COL1A1)mRNAの発現解析を行った。具体的には、Taqman probeの目的遺伝子を用いてアプライドバイオシステムズ社StepOnePlusのプロトコルに従い発現解析を行った。使用したTaqman probe(Life technologies社製)は以下の通りである。
ADAMTS2:Hs01029111_mL
BMP1:Hs00241807_mL
COL1A1:Hs00164004_mL
これらのmRNA発現量は内部標準遺伝子(ADAMTS2及びBMPIではGAPDHを、COL1A1では18Sを内部標準遺伝子として使用)の発現量で補正し数値化した。
結果を表1に示す。抽出物添加群における各遺伝子のmRNA発現量は、コントロールの発現量を100としたときの相対値として示した。
FBSを10%含むMEMを用いて37℃、5%CO2条件下で定法に従い培養した新生児由来皮膚線維芽細胞を、アスコルビン酸含有MEMにて12ウェルプレートに2.5×105cells/mL/ウェルの細胞密度で播種した。翌日、FBS濃度を0.6%に減じた培地にて培地交換するとともに、製造例1で得た活性炭未処理オウバク抽出物を添加した。添加後48時間後、培地を除き、実施例1と同様にtotal RNAを抽出し、逆転写反応によりcDNAを得た。得られたcDNAを用い、実施例1と同様にリアルタイムPCRによりADAMTS2 mRNA、BMP1 mRNAの発現解析を行った。これらのmRNA発現量は内部標準遺伝子(RPLP0を内部標準遺伝子として使用)の発現量で補正し数値化した。
結果を表2に示す。抽出物添加群における各遺伝子のmRNA発現量は、コントロールの発現量を100としたときの相対値として示した。
アスコルビン酸含有DMEMを用い、4ウェルチャンバーに新生児由来皮膚線維芽細胞を1.2×105cells/mL/ウェルの密度で播種した。翌日、FBS濃度を2%に減じた培地にて培地交換するとともにオウバク活性炭処理品を0.1v/v%添加し培養した。適宜培地交換を行い、添加6日後に培地を吸引除去しPBSで細胞表面を洗浄後、4%パラホルムアルデヒド/PBSで細胞を固定した。固定した細胞の表面をPBSで洗浄した後、DAKO Protein Block Serum-Freeで10分間処理した。1%ウシ血清アルブミン(BSA)/PBSで100倍希釈したヒト1型コラーゲン抗体(Purified Rabbit anti-Human Collagen Type1;CEDARLANE社)を60分間反応させた後、細胞表面をPBSで洗浄し、次いで1%BSA/PBSで100倍希釈した蛍光標識2次抗体(Goat anti-Rabbit Secondary Antibody,Dylight488;ThermoFisher SCIENTIFIC社)を60分間反応させた。PBS洗浄、褪色防止用封入剤とカバーガラスで細胞を封入した。共焦点顕微鏡による観察を行い(励起波長:488nm、観察波長:521nm)、同時にウェル内5か所をランダムに撮影し、それぞれの蛍光強度を数値化(算術平均輝度)することで半定量的な評価を実施した。結果を図1に示す。
図1に示すとおり、活性炭処理オウバク抽出物により細胞表面のコラーゲン線維形成の促進が認められた。
Claims (4)
- 活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とするプロコラーゲンプロセッシング促進剤。
- 活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とするBMP1発現促進剤。
- 活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とするADAMTS2発現促進剤。
- 活性炭処理オウバク抽出物を有効成分とするコラーゲン線維形成促進剤。
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