JP2022045494A

JP2022045494A - Ｍｆａｐ－４発現促進剤

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Publication number: JP2022045494A
Application number: JP2020151111A
Authority: JP
Inventors: 圭高野; Kei Takano; 美佳青木; Miyoshi Aoki; 慎也笠松; Shinya Kasamatsu
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2020-09-09
Filing date: 2020-09-09
Publication date: 2022-03-22

Abstract

【課題】真皮線維芽細胞においてＭＦＡＰ－４の発現を促進するＭＦＡＰ－４発現促進剤、ミクロフィブリル形成促進剤、弾性線維形成促進剤を提供する。【解決手段】メマツヨイグサ及びユキノシタ、並びにそれらの抽出物から選択される少なくとも１つを有効成分とする真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４発現促進剤。【選択図】なし

Description

本発明は、ＭＦＡＰ－４発現促進剤、詳細には真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４発現促進剤に関する。

慢性的な紫外線（ＵＶ）の照射によって引き起こされる光老化皮膚の特徴として、シワやたるみ等が挙げられる。皮膚の光老化の一因として真皮細胞外マトリクス（ＥＣＭ）である弾性線維の断裂やそれに伴う分解の増加、また、コラーゲン線維の減少等が報告されており、これら２つの線維は皮膚弾性の機能発現に深く関連していることが広く知られている。その中でも特に弾性線維は、皮膚中での量は非常に少ないにも関わらず、皮膚弾性に重要であることが明らかにされている。ここで、上述した光老化は通常に使用される意味での「老化」、すなわち加齢に伴う老化とは区別され得る。すなわち、光老化によって生じるシワやたるみは、加齢に伴う代謝の低下によって生じるシワやたるみ、また、皮膚の乾燥に伴うシワ（小じわ）とは区別される。

弾性線維はミクロフィブリルとトロポエラスチンの２つの主要な成分から構築されており、ミクロフィブリルの主要な構成タンパク質は巨大な（～３５０ｋＤａ）糖タンパク質として知られるフィブリリン－１である。フィブリリン－１モノマーは直線方向及び水平方向に重合しミクロフィブリルの骨格を形成し、その後、ｌａｔｅｎｔｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－β－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＬＴＢＰｓ）、Ｆｉｂｕｌｉｎｓ、ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌａｓｓｏｃｉａｔｅｄｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＭＡＧＰｓ）、ｅｌａｓｔｉｎｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｉｎｔｅｒｆａｃｅｌｏｃａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＭＩＬＩＮ）－１等のアダプタータンパク質が結合することによって、成熟したミクロフィブリルが形成される。一方、トロポエラスチンは６０－７０ｋＤａのｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｉｎｇドメインとｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃドメインを持つタンパク質であり、お互いのｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃドメインが相互作用し（ｃｏａｃｅｒｖａｔｉｏｎ）、その後、ｌｙｓｙｌｏｘｉｄａｓｅ（ＬＯＸ）と呼ばれる酵素によってミクロフィブリルに結合し、成熟した弾性線維が形成される。

過去に本発明者らが属する研究グループは、ヒト皮膚における光老化メカニズムを明らかにすることを目的として、ヒト皮膚を免疫不全マウスに移植し、慢性的にＵＶＢを照射して誘導する光損傷／老化モデルを構築した（非特許文献１）。この光老化モデル皮膚においてｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ－４（ＭＦＡＰ－４）の顕著な発現減少を見出し、同光老化モデル皮膚においてＭＦＡＰ－４を過剰発現させたところ、慢性的なＵＶＢ照射によって誘導されるシワ形成や皮膚弾性の悪化が有意に抑制されることを確認している。さらに、ＭＦＡＰ－４の機能を詳細に解析した結果、ＭＦＡＰ－４はフィブリリン－１と相互作用し、弾性線維形成の中でも特にその土台となるミクロフィブリルの形成に必須の因子であることを明らかにした。また、ヒト皮膚において、加齢により低下する真皮のＭＦＡＰ－４の発現が、露光部ではさらに発現が低下していることも明らかにしている（非特許文献２）。

したがって、真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４の産生を促進することができれば、真皮におけるＥＣＭ及び弾性線維の構築を促すとともにその分解を抑えて、その弾性構造を維持し、結果として、特に慢性的な紫外線照射による光老化による症状、例えば皮膚のシワ、たるみ、はりの低下等の予防及び／または改善を図ることができる。

アカバナ科マツヨイグサ属のメマツヨイグサは、民間薬として鎮痛薬、緩和薬、収れん薬、傷薬、抗血液凝固剤として利用されてきた植物である。また、ユキノシタ科のユキノシタも、民間薬としてからだのむくみ、胃もたれ、下痢、腫れもの等の消炎等に用いられている植物である。
また、メマツヨイグサの種子抽出物には細胞賦活効果があり、皮膚の老化防止効果を有すること（特許文献１）、及びメマツヨイグサ抽出物及びユキノシタ抽出物には腱細胞においてＭＦＡＰ－４の発現を促進し、皮膚支帯改善作用を有すること（特許文献２）が報告されている。また、ユキノシタ抽出物には、関節炎の予防又は治療効果があること（特許文献３）、酸化蛋白質分解酵素（ＯＰＨ）の活性を増強する作用があること（特許文献４）が報告されている。

しかし、メマツヨイグサ及びユキノシタが真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４の発現を促進すること、またミクロフィブリルや弾性線維の形成を促進することは知られていない。

特開２００４－１３７２３３号公報特開２０１７－２１８４２９号公報国際公開第２００２／１０２３９６号特開２０１９－１９３６２０号公報

Hachiya A, Sriwiriyanont P, Fujimura T, Ohuchi A, Kitahara T, Takema Y, Kitzmiller WJ, Visscher MO, Tsuboi R, Boissy RE (2009) Mechanistic effects of long-term ultraviolet B irradiation induce epidermal and dermal changes in human skin xenografts. Am J Pathol. 174(2), 401-413. Kasamatsu S, Hachiya A, Fujimura T, Sriwiriyanont P, Haketa K, Visscher MO, Kitzmiller WJ, Bello A, Kitahara T, Kobinger GP, Takema Y (2011) Essential role of microfibrillar-associated protein 4 in human cutaneous homeostasis and in its photoprotection. Sci Rep. 1, 164.

本発明は、真皮線維芽細胞においてＭＦＡＰ－４の発現を促進するＭＦＡＰ－４発現促進剤、ミクロフィブリル形成促進剤、弾性線維形成促進剤を提供することに関する。

本発明者らは、天然由来の物質を探索した結果、メマツヨイグサ及びユキノシタの抽出物に、真皮線維芽細胞においてＭＦＡＰ－４発現促進作用があり、当該細胞におけるミクロフィブリルや弾性線維の形成を促進する作用を有することを見出した。

すなわち、本発明は、以下の１）～３）を提供する。
１）メマツヨイグサ及びユキノシタ、並びにそれらの抽出物から選択される少なくとも１つを有効成分とする真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４発現促進剤。
２）メマツヨイグサ及びユキノシタ、並びにそれらの抽出物から選択される少なくとも１つを有効成分とする真皮におけるミクロフィブリル形成促進剤。
３）メマツヨイグサ及びユキノシタ、並びにそれらの抽出物から選択される少なくとも１つを有効成分とする真皮における弾性線維形成促進剤。

本発明によれば、真皮線維芽細胞のＭＦＡＰ－４産生を促進し、当該細胞におけるミクロフィブリルや弾性線維の形成を促進することによって、真皮におけるＥＣＭの弾性構造を維持することができる。これにより、皮膚の加齢による老化（自然老化）並びに慢性的な紫外線照射による光老化による症状、例えば皮膚のシワ、たるみ、はりの低下等の予防及び／または改善を図ることができる。

メマツヨイグサ抽出物によるミクロフィブリル形成促進効果（免疫蛍光染色画像）。スケールバー＝５０μｍ。メマツヨイグサ抽出物によるミクロフィブリル形成促進効果（図１の二値化画像）。メマツヨイグサ抽出物による弾性線維形成促進効果（免疫蛍光染色画像）。スケールバー＝１００μｍ。メマツヨイグサ抽出物による弾性線維形成促進効果（図３の二値化画像）。

本発明において、「メマツヨイグサ」とは、アカバナ科マツヨイグサ属のメマツヨイグサ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａｂｉｅｎｎｉｓ）を指し、別名イブニングプロムローズとも称される。「ユキノシタ」とは、ユキノシタ科ユキノシタ属のユキノシタ（Ｓａｘｉｆｒａｇａｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ）を指し、別名イドクサ、コジソウとも称される。

本発明において、メマツヨイグサ及びユキノシタ（以下、両者を「植物」とも称する）は、特に限定されない限り、当該植物の任意の部位、例えば全草、全木、葉、茎、芽、花、蕾、樹木、木質部、樹皮、根、根茎、仮球茎、塊根、地衣体、葉状体、種子、果実、若しくは樹脂等、又はそれらの組み合わせを利用すればよい。好ましい部位は、メマツヨイグサの場合は種子、花であり、ユキノシタの場合は葉、全草であり、より好ましい部位はメマツヨイグサの場合は種子であり、ユキノシタの場合は葉である。

斯かる植物は、そのまま若しくはそれを圧搾することにより得られる搾汁、植物体自身を乾燥した乾燥物若しくはその粉砕物、あるいはこれらから抽出した抽出物として用いることができるが、抽出物として用いるのが好ましい。
また、本発明において、上記の植物又はその抽出物は、２種以上を混合して用いてもよい。

斯かる本発明の植物の抽出物としては、各植物を常温又は加温下にて抽出するか又はソックスレー抽出器等の抽出器具を用いて抽出される各種溶媒抽出物、超臨界二酸化炭素等の超臨界抽出によって得られる抽出物、その希釈液、その濃縮液又はその乾燥末等が挙げられる。

抽出のための溶媒には、極性溶媒、非極性溶媒のいずれをも使用することができる。溶媒の具体例としては、例えば、水；１価、２価又は多価のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン等の鎖状又は環状のエーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ヘキサン等の飽和又は不飽和の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ピリジン類；ジメチルスルホキシド；アセトニトリル；二酸化炭素、超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他のオイル類；並びにこれらの混合物が挙げられる。好適には、水、アルコール類及びその水溶液が挙げられ、アルコール類としてはメタノール、エタノール、１，３－ブチレングリコール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、イソブタノール、ｓｅｃ－ブタノール、ｔ－ブタノール等が挙げられ、好ましくはエタノール又は１，３－ブチレングリコールであり、より好ましくは１，３－ブチレングリコールである。

上記アルコール類の水溶液におけるアルコールの濃度（２５℃における容量％）は、好ましくは１０容量％以上、より好ましくは２０容量％以上、さらに好ましくは２５容量％以上であり、且つ好ましくは９５容量％以下、より好ましくは８５容量％以下、さらに好ましくは７５容量％以下である。また、上記アルコール類の水溶液におけるアルコールの濃度は、好ましくは１０～９５容量％、より好ましくは２０～８５容量％、さらに好ましくは２５～７５容量％である。好ましくは、１０～９５容量％１，３－ブチレングリコール水溶液、より好ましくは２０～８５容量％１，３－ブチレングリコール水溶液、さらに好ましくは２５～７５容量％１，３－ブチレングリコール水溶液が挙げられる。

抽出における溶媒の使用量としては、本発明の植物（乾燥質量換算）１ｇに対して１～１００ｍＬが好ましい。抽出条件は、十分な抽出が行える条件であれば特に限定されないが、例えば、抽出時間は好ましくは１時間以上、より好ましくは３時間以上がより好ましく、他方、好ましくは２ヶ月以下、より好ましくは５週間以下、より好ましくは３週間以下である。抽出温度は０℃以上が好ましく、５℃以上がより好ましく、他方、溶媒沸点以下が好ましく、９０℃以下がより好ましい。通常、低温なら長時間、高温なら短時間の抽出を行う。
抽出手段は、特に限定されないが、例えば、固液抽出、液液抽出、浸漬、煎出、浸出、還流抽出、ソックスレー抽出、超音波抽出、マイクロ波抽出、攪拌等の通常の手段を用いることができる。

本発明の植物の抽出物は、例えば食品や医薬品上許容し得る規格に適合し、本発明の効果を発揮するものであれば粗精製物であってもよい。また、必要に応じて、液々分配、固液分配、濾過膜、活性炭、吸着樹脂、イオン交換樹脂、澱出し等の公知の技術によって不活性な夾雑物の除去、脱臭、脱色等の処理を施すことができる。
また、さらに公知の分離精製方法を適宜組み合わせてこれらの純度を高めてもよい。精製手段としては、有機溶剤沈殿、遠心分離、限界濾過膜、高速液体クロマトグラフやカラムクロマトグラフ等が挙げられる。

また、本発明の植物の抽出物は、そのまま用いてもよく、適宜な溶媒で希釈した希釈液として用いてもよく、あるいは濃縮エキスや乾燥粉末としたり、ペースト状に調製したものでもよい。また、凍結乾燥し、用時に、通常抽出に用いられる溶剤、例えば水、エタノール、水・エタノール混液等の溶剤で希釈して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。

後記実施例に示すように、メマツヨイグサ抽出物及びユキノシタ抽出物は真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４、フィブリリン１及びトロポエラスチンの発現を促進し、また当該細胞におけるミクロフィブリルや弾性線維の形成を促進する作用を有する。従って、上記植物又はそれらの抽出物は、真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４発現促進剤、フィブリリン１発現促進剤、トロポエラスチン発現促進剤、ミクロフィブリル形成促進剤又は弾性線維形成促進剤（（以下、「真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４発現促進剤等」と称す））となり得、真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４発現促進剤等を製造するために使用できる。
また、上記植物又はそれらの抽出物は、真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４の発現を促進するため、フィブリリン１の発現を促進するため、トロポエラスチンの発現を促進するため、ミクロフィブリルの形成を促進するため、弾性線維の形成を促進するために使用することができる。ここで、当該使用は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的使用であっても非治療的使用であってもよい。尚、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。

本発明において、「ＭＦＡＰ－４」（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ４）とは、ＧｅｎｅＩＤ：４２３９、ＭＩＭＩＤ：６００５９６として知られているタンパク質である。
本発明において、「フィブリリン－１」（Ｆｉｂｒｉｌｉｎ－１；ＦＢＮ１）とは、ＧｅｎｅＩＤ：２２００、ＭＩＭＩＤ：１３４７９７として知られているタンパク質である。
本発明において、「トロポエラスチン」（Ｔｏｒｏｐｏｅｌａｓｔｉｎ；ＥＬＮ）とは、ＧｅｎｅＩＤ：２００６、ＭＩＭＩＤ：１３０１６０として知られているタンパク質である。
本発明において、「ＭＦＡＰ－４発現促進」、「フィブリリン－１発現促進」及び「トロポエラスチン促進」には、遺伝子レベルでの発現促進及びタンパク質レベルでの発現促進が包含される。遺伝子レベルでの発現促進にはｍＲＮＡの発現促進、ｍＲＮＡへの転写促進が挙げられ、タンパク質レベルでの発現促進には翻訳における促進が含まれる。各発現レベルは任意のパラメーターに基づいて測定することができる。
ＭＦＡＰ－４は、線維芽細胞、腱細胞、骨格筋細胞、肝星状細胞、脂肪幹細胞、神経芽細胞腫、Ｔリンパ芽球性白血病細胞等に発現することが知られているが、本発明のＭＦＡＰ－４発現促進は真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４の発現促進を意味する。後記参考例に示すように、腱細胞と線維芽細胞では細胞内のＭＦＡＰ－４の遺伝子発現機構が完全に一致しておらず、腱細胞においてＭＦＡＰ－４の発現を促進する物質であっても、線維芽細胞においても同様の作用を有するとは云えない。

本発明において、「ミクロフィブリル」とは、動物の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を構成する弾性線維を、トロポエラスチンと共に構成する糖タンパク複合体を指し、その形成促進とはミクロフィブリルの主要構成タンパク質であるフィブリリン－１の重合が促進されることを意味する。好ましくは、フィブリリン－１と相互作用し、ミクロフィブリル形成の必須因子であるＭＦＡＰ－４の発現促進によりミクロフィブリルの形成が促進されることが挙げられる。本発明においてミクロフィブリルとは、真皮のミクロフィブリルである。
また、「弾性線維の形成促進」とは、ミクロフィブリルにトロポエラスチンが結合し、成熟した弾性線維の形成が促進されることを意味し、好ましくは弾性線維形成においてその土台となるミクロフィブリルの形成促進によってその形成が促進されることが挙げられる。本発明において弾性線維とは、真皮の弾性線維である。

本発明の真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４発現促進剤等は、真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４の発現促進、ミクロフィブリルの形成促進、弾性線維の形成促進の各作用効果を発揮する、ヒト若しくは動物用の医薬品、医薬部外品、化粧品となり、また当該医薬品、医薬部外品、化粧品に配合して使用される素材又は製剤となり得る。

本発明の真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４発現促進剤等を医薬品（医薬部外品を含む）として用いる場合、当該医薬品は任意の投与形態で投与され得る。投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与又は注射剤、坐剤、吸入薬、経皮吸収剤、外用剤等による非経口投与が挙げられるが、好ましい形態は非経口投与である。一例として、当該医薬又は医薬部外品は、ローション、クリーム、ジェル、軟膏、貼布剤等の形態の皮膚外用剤の形態であり得る。
このような種々の剤型の医薬製剤は、本発明の植物又はその抽出物と他の薬学的に許容される賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤、増粘剤、乳化剤、滑沢剤、分散剤、被膜剤、界面活性剤、被膜剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、嬌味剤、矯臭剤、香料等を適宜組み合わせて調製することができる。

本発明の真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４発現促進剤等を化粧品として用いる場合、当該化粧品の形態としては、クリーム、乳液、ローション、懸濁液、フォーム、ジェル、パウダー、パック、シート、パッチ、スティック、ケーキ等、化粧品に使用され得る任意の形態が挙げられる。
斯かる化粧品は、本発明の植物又はその抽出物と、化粧料として許容される担体（例えば、希釈剤、分散剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、分散剤、乳化剤、界面活性剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、殺菌剤、香料等）を適宜組み合わせて常法により調製することができる。

当該医薬品や化粧品における本発明の植物又はその抽出物の含有量（乾燥物換算）は、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上、より好ましくは０．０１質量％以上、且つ９９．９９９質量％以下、好ましくは１０質量％以下、より好ましく５質量％以下であり、また好ましくは０．０００１～９９．９９９質量％、好ましくは０．００１～１０質量％、より好ましくは０．０１～５質量％である。なお、本明細書において「乾燥物」とは、抽出物を－３０～－４０℃で３～４時間凍結させたものを、乾燥温度４０～１００℃、真空到達度２０～７０Ｐａの条件下で、１２～２０時間かけて乾燥させて得られる残分をいう。

本発明の真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４発現促進剤等の投与量は、対象の種、体重、性別、年齢、状態又はその他の要因に従って変動し得る。投与の用量、経路、間隔、及び摂取の量や間隔は、当業者によって適宜決定され得る。例えば、上記植物の抽出物の乾燥物換算で、成人（体重６０ｋｇ）１人、１日あたり、好ましくは０．０１ｍｇ以上、より好ましくは０．１ｍｇ以上であり、より好ましくは１０ｍｇ以上であり、且つ好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下である。また、１日あたり好ましくは０．０１～１０００ｍｇ、より好ましくは０．１～５００ｍｇ、より好ましくは１０～１００ｍｇである。

投与する対象としては、動物、好ましくはヒトが挙げられ、皮膚の加齢による老化並びに慢性的な紫外線照射による光老化による症状、例えば皮膚のシワ、たるみ、はりの低下等の予防及び／または改善を望むヒトが好ましい。当該投与は、美容を目的として、非治療的に投与され得る。
また投与する部位としては、日常的又は慢性的に紫外線照射を受け易く、光老化による皮膚のシワ、たるみ、はりの低下等の症状が顕在化し易い部位が好ましく、具体的には顔面、頸、デコルテ、手の甲、前腕外側、上腕外側等が挙げられる。

以下、実施例を示し、本発明をより具体的に説明する。
実施例１植物抽出物によるＭＦＡＰ－４発現促進
（１）細胞培養
正常ヒト真皮線維芽細胞（線維芽細胞）は倉敷紡績株式会社より購入した。線維芽細胞は１０％（ｖ／ｖ）のＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するダルベッコ変法イーグル（ＤＭＥＭ）培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ_２の条件下で培養した。

（２）植物抽出物
ルナホワイトＢ（メマツヨイグサ抽出物；抽出溶媒は５０％（ｖ／ｖ）１，３－ブチレングリコール（以下、「ＢＧ」とする）及びファルコレックスユキノシタＭＢ（ユキノシタ抽出物；抽出溶媒は３０％（ｖ／ｖ）ＢＧ）はそれぞれ一丸ファルコス株式会社より入手した。

（３）メマツヨイグサ抽出物及びユキノシタ抽出物が弾性線維形成関連遺伝子（ＭＦＡＰ－４、フィブリリン－１（ＦＢＮ１）、トロポエラスチン（ＥＬＮ））の発現量に及ぼす影響
線維芽細胞を５×１０^４ｃｅｌｌｓ／５００μｌ／ｗｅｌｌの密度で、２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地を用いて２４－ｗｅｌｌｐｌａｔｅに播種した。翌日、最終濃度０．３％（ｖ／ｖ）のメマツヨイグサ抽出物（対照として同量の５０％（ｖ／ｖ）ＢＧ）、あるいは、最終濃度０．５％（ｖ／ｖ）のユキノシタ抽出物（対照として同量の３０％（ｖ／ｖ）ＢＧ）を添加したＦＢＳ未添加ＤＭＥＭ培地３００μｌ／ｗｅｌｌに置換した。それから２日間の培養終了後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて定法に従いｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。その抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを鋳型とし、ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡｔｏｃＤＮＡＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。反応には、ＰｒｏＦｌｅｘＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。続いて合成したｃＤＮＡ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）ｐｒｏｂｅを用いて、定量的ＰＣＲ法による遺伝子発現解析を行った。各遺伝子に特異的なｐｒｏｂｅ及びｐｒｉｍｅｒは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙｓ（Ｐ／Ｎ４３３１１８２）を使用した。各々の発現量は、６０ＳａｃｉｄｉｃｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎＰ０（ＲＰＬＰ０）の発現量により補正した。反応条件は定法に従い、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＳｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。

結果を表１、表２及び表３に示す。なお結果は、抽出溶媒のみを添加した溶媒コントロールにおける発現量を１とした相対値で示す。メマツヨイグサ抽出物及びユキノシタ抽出物は、いずれもＭＦＡＰ－４（ＭＦＡＰ－４）、フィブリリン－１（ＦＢＮ１）、また、トロポエラスチン（ＥＬＮ）の遺伝子発現を促進した。

（４）メマツヨイグサ抽出物がＭＦＡＰ－４のタンパク質発現量に及ぼす影響
線維芽細胞を６×１０^５ｃｅｌｌｓ／１ｍｌ／ｗｅｌｌの密度で、２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地を用いて１２－ｗｅｌｌｐｌａｔｅに播種した。翌日、最終濃度０．０３％（ｖ／ｖ）もしくは０．１％（ｖ／ｖ）のメマツヨイグサ抽出物（対照として同量の５０％（ｖ／ｖ）ＢＧ）を添加したＦＢＳ未添加ＤＭＥＭ培地５００μｌ／ｗｅｌｌに置換した。それから７日間の培養終了後、上清を除き、細胞をＰＢＳで洗浄した後、１ｍＭの濃度でＰＭＳＦ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加したＣｅｌｌｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて細胞を回収してから、超音波処理により細胞を破砕した。その後、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、その上清についてＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）を標準物質としたＢＣＡ（ビシンコニン酸）法によりタンパク質量を定量した後、各群のタンパク質量を揃え、定法に従ってＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットに供した。一次抗体としてブロッキング液で１０００倍希釈した抗ＭＦＡＰ－４抗体（Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ；ＰＡＦ５８９Ｈｕ０１）を用いた。また、内部標準としてブロッキング液で５０００倍希釈した抗β－Ａｃｔｉｎ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；４９７０ｓ）を用いた。二次抗体としては、ブロッキング液で２５００倍希釈したＨＲＰ－ＣｏｎｊｕｇａｔｅｄＰｏｌｙｃｌｏｎａｌＧｏａｔＡｎｔｉＲａｂｂｉｔ（Ｄａｋｏ；Ｐ０４４８）を用いた。その後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）ＷｅｓｔＤｕｒａＥｘｔｅｎｄｅｄＤｕｒａｔｉｏｎＳｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて発光させ、ＡｍｅｒｓｈａｍＩｍａｇｅｒ６００（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて発現量を可視化した。その後、同イメージャーシステムにて、ＭＦＡＰ－４（７２ｋＤａ及び３６ｋＤａ）のバンドを検出してＭＦＡＰ－４タンパク質の発現量を定量し、内部標準であるβ-Ａｃｔｉｎ発現量により補正した。

結果を表４、表５に示す。なお結果は、抽出溶媒のみを添加した溶媒コントロールにおけるタンパク質発現量を１とした相対値で示す。メマツヨイグサ抽出物は、ＭＦＡＰ－４のタンパク質発現（分子量が７２ｋＤａ及び３６ｋＤａ）を促進した。

実施例２メマツヨイグサ抽出物によるミクロフィブリル形成促進
（１）細胞培養
正常ヒト真皮線維芽細胞（線維芽細胞）は倉敷紡績株式会社より購入した。線維芽細胞は１０％（ｖ／ｖ）のＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するダルベッコ変法イーグル（ＤＭＥＭ）培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ_２の条件下で培養した。

（２）植物抽出物
ルナホワイトＢ（メマツヨイグサ抽出物；抽出溶媒は５０％（ｖ／ｖ）ＢＧ）は一丸ファルコス株式会社より入手した。

（３）メマツヨイグサ抽出物がミクロフィブリル形成に及ぼす影響
２４－ｗｅｌｌｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌ底部に予めカバーガラスを設置しておき、線維芽細胞を３×１０^５ｃｅｌｌｓ／５００μｌ／ｗｅｌｌの密度で１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地を用いて播種した。翌日、最終濃度０．２％（ｖ／ｖ）のメマツヨイグサ抽出物（対照として同量の５０％（ｖ／ｖ）ＢＧ）を添加した０．５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）５００μｌ／ｗｅｌｌに置換し、さらに３日間培養した後、カバーガラス上で培養した線維芽細胞を氷冷メタノールで２０分間インキュベートすることで固定化した。５％（ｖ／ｖ）のＢＳＡを含むＰＢＳを添加し、室温で１時間ブロッキングした後、ウサギ由来抗ヒトＦｉｂｒｉｌｌｉｎ－１抗体（ＥｌａｓｔｉｎＰｒｏｄｕｃｔｓＣｏｍｐａｎｙ；ＥＰＣ－ＰＲ２１７）を２．５％（ｖ／ｖ）のＢＳＡを含むＰＢＳで２００倍希釈して添加し、４℃で１６時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、２．５％（ｖ／ｖ）のＢＳＡを含むＰＢＳでＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ａ１１００８）を２００倍希釈して添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、カバーガラスに接着した細胞をＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄａｎｔｉｆａｄｅｒｅａｇｅｎｔｗｉｔｈＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてスライドガラスにマウントした。その免疫蛍光を共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ７１０（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）を用いて観察した。

結果を図１に示す。メマツヨイグサ抽出物によりフィブリリン－１の密度が高まっており、ミクロフィブリル形成が促進されているのが観察された。
次に、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて図１で示した画像を二値化することにより、フィブリリン－１のシグナル面積を算出した。
結果を図２及び表６に示す。二値化した画像によっても、メマツヨイグサ抽出物によりフィブリリン－１の密度が高まっており、ミクロフィブリル形成が促進されているのが観察された。また、フィブリリン－１のシグナル面積も増加していることが確認された。

実施例３メマツヨイグサ抽出物による弾性線維形成促進
（１）細胞培養
正常ヒト真皮線維芽細胞（線維芽細胞）は倉敷紡績株式会社より購入した。線維芽細胞は１０％（ｖ／ｖ）のＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するダルベッコ変法イーグル（ＤＭＥＭ）培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ_２の条件下で培養した。

（３）メマツヨイグサ抽出物がミクロフィブリル形成に及ぼす影響
２４－ｗｅｌｌｐｌａｔｅの各ｗｅｌｌ底部に予めカバーガラスを設置しておき、線維芽細胞を３×１０^５ｃｅｌｌｓ／５００μｌ／ｗｅｌｌの密度で１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地を用いて播種した。翌日、最終濃度０．２％（ｖ／ｖ）のメマツヨイグサ抽出物（対照として同量の５０％（ｖ／ｖ）ＢＧ）を添加した２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）５００μｌ／ｗｅｌｌに置換し、さらに１４日間培養した後、カバーガラス上で培養した線維芽細胞を氷冷メタノールで２０分間インキュベートすることで固定化した。５％（ｖ／ｖ）のＢＳＡを含むＰＢＳを添加し、室温で１時間ブロッキングした後、マウス由来抗ヒトＥｌａｓｔｉｎ抗体（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ；ＭＡＢ２５０３）及びウサギ由来抗ヒトＦｉｂｒｉｌｌｉｎ－１抗体（ＥｌａｓｔｉｎＰｒｏｄｕｃｔｓＣｏｍｐａｎｙ；ＥＰＣ－ＰＲ２１７）を２．５％（ｖ／ｖ）のＢＳＡを含むＰＢＳでそれぞれ２００倍希釈して添加し、４℃で１６時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、２．５％（ｖ／ｖ）のＢＳＡを含むＰＢＳでＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ａ１１００８）及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ａ３１５７０）をそれぞれ２００倍希釈して添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、カバーガラスに接着した細胞をＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄａｎｔｉｆａｄｅｒｅａｇｅｎｔｗｉｔｈＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてスライドガラスにマウントした。その免疫蛍光を共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ７１０（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）を用いて観察した。

結果を図３に示す。メマツヨイグサ抽出物によりフィブリリン－１及びトロポエラスチンの密度が高まっており、弾性線維形成が促進されているのが観察された。
次に、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて図３で示した画像を二値化することにより、フィブリリン－１及びトロポエラスチンのシグナル面積を算出した。
結果を図４及び表７に示す。二値化した画像によっても、メマツヨイグサ抽出物によりフィブリリン－１及びトロポエラスチンの密度が高まっており、弾性線維形成が促進されているのが観察された。また、フィブリリン－１及びトロポエラスチンのシグナル面積も増加していることが確認された。

参考例キイチゴ抽出物、チャ抽出物、また、オトギリソウ抽出物がＭＦＡＰ－４産生に及ぼす影響
（１）細胞培養
正常ヒト真皮線維芽細胞（線維芽細胞）は倉敷紡績株式会社より購入した。線維芽細胞は１０％（ｖ／ｖ）のＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するダルベッコ変法イーグル（ＤＭＥＭ）培地（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３７℃、５Ｖｏｌ％ＣＯ_２の条件下で培養した。

（２）植物抽出物
ファルコレックスキイチゴＢ（キイチゴ抽出物（抽出部位：果実）；抽出溶媒は５０％（ｖ／ｖ）ＢＧ）及び緑茶リキッドＣ（チャ抽出物（抽出部位：葉）；抽出溶媒は２０％（ｖ／ｖ）ＢＧ及び２６％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ）はそれぞれ一丸ファルコス株式会社より入手した。オトギリソウ（２０）（オトギリソウ抽出物（抽出部位：地上部（花、葉、茎）；抽出溶媒は１４％（ｖ／ｖ）ＥｔＯＨ）は丸善製薬株式会社より入手した。

（３）キイチゴ抽出物、チャ抽出物、また、オトギリソウ抽出物がＭＦＡＰ－４（ＭＦＡＰ－４）の遺伝子発現量に及ぼす影響
線維芽細胞を５×１０^４ｃｅｌｌｓ／５００μｌ／ｗｅｌｌの密度で、２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを添加したＤＭＥＭ培地を用いて２４－ｗｅｌｌｐｌａｔｅに播種した。翌日、最終濃度が０．３％（ｖ／ｖ）あるいは０．５％（ｖ／ｖ）のキイチゴ抽出物、チャ抽出物、もしくは、オトギリソウ抽出物（対照として同量の各抽出溶媒）を添加したＦＢＳ未添加ＤＭＥＭ培地３００μｌ／ｗｅｌｌに置換した。それから２日間の培養終了後、細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＲＮｅａｓｙＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて定法に従いｔｏｔａｌＲＮＡを抽出した。その抽出したｔｏｔａｌＲＮＡを鋳型とし、ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙＲＮＡｔｏｃＤＮＡＫｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを合成した。反応には、ＰｒｏＦｌｅｘＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。続いて合成したｃＤＮＡ及びＴａｑＭａｎ（登録商標）ｐｒｏｂｅを用いて、定量的ＰＣＲ法による遺伝子発現解析を行った。各遺伝子に特異的なｐｒｏｂｅ及びｐｒｉｍｅｒは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＴａｑＭａｎ（登録商標）ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＡｓｓａｙｓ（Ｐ／Ｎ４３３１１８２）を使用した。各々の発現量は、６０ＳａｃｉｄｉｃｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎＰ０（ＲＰＬＰ０）の発現量により補正した。反応条件は定法に従い、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＳｙｓｔｅｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。

結果を表８、表９及び表１０に示す。前記特許文献２において、腱細胞においてＭＦＡＰ－４の発現向上が認められているキイチゴ抽出物、チャ抽出物及びオトギリソウ抽出物は、いずれもＭＦＡＰ－４の遺伝子発現を促進しなかった。

Claims

メマツヨイグサ及びユキノシタ、並びにそれらの抽出物から選択される少なくとも１つを有効成分とする真皮線維芽細胞におけるＭＦＡＰ－４発現促進剤。
メマツヨイグサ及びユキノシタ、並びにそれらの抽出物から選択される少なくとも１つを有効成分とする真皮におけるミクロフィブリル形成促進剤。
メマツヨイグサ及びユキノシタ、並びにそれらの抽出物から選択される少なくとも１つを有効成分とする真皮における弾性線維形成促進剤。