CN111491615A - 包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物及其制备方法，详细地，涉及如下的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物及其制备方法，即，利用乳杆菌发酵槐树果实来获得发酵液或提取上述发酵液来获得提取液，因此，具有优秀的改善皮肤皱纹效果且对皮肤刺激无副作用，而且，提供包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的化妆品组合物，从而促进成纤维细胞增殖，并通过抑制分子内胶原蛋白(Collagen)、基质金属蛋白酶组织抑制因子‑1(TIMP‑1)、弹性蛋白原(Tropoelastin)的基因表达和基质金属蛋白酶‑1(MMP‑1)的基因表达来改善皮肤的皱纹。

Description

包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮 肤皱纹的化妆品组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物及其制备方法，详细地，涉及如下的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物及其制备方法，即，利用乳杆菌发酵槐树果实来获得发酵液或提取上述发酵液来获得提取液，因此，具有优秀的改善皮肤皱纹效果且对皮肤刺激无副作用。

并且，本发明涉及如下的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物及其制备方法，即，提供包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的化妆品组合物，从而促进成纤维细胞增殖，并通过抑制分子内胶原蛋白(Collagen)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)、弹性蛋白原(Tropoelastin)的基因表达和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的基因表达来改善皮肤的皱纹。

背景技术

化妆品的功能不仅仅在于清洁或美容，而且还消除或抑制由水分、污染物质和压力、紫外线等外在因素及免疫细胞的功能下降、细胞活性的下降等内在因素引起的因自由基(Free Radical)、活性氧、过氧化物等而导致的蛋白质、核酸、细胞膜脂质破坏等皮肤老化等原因。

并且，为了满足消费者对高功能性化妆品的需求，陆续开发出具有美白、改善及抑制皮肤皱纹以及防紫外线功能的化妆品。其中，改善及抑制皱纹的产品尤其备受欲维持年轻皮肤的消费者的关注。

随着年龄的增大，人的皮肤通常因外在环境而失去水分、弹性、色泽及光泽并变得粗糙。将这种现象成为皮肤老化，其为黑斑、皱纹、雀斑等变多的过程。

当年幼时，由于体内的胶原蛋白(Collagen)的量多而使得全身皮肤具有光滑，但是，随着年龄的增大，缺乏胶原蛋白或者其质量下降，因此，皮肤失去弹性，产生皱纹。皮肤的皱纹受皮肤的水分的含量和胶原蛋白的含量及免疫功能等多种因素的影响，其中，具有最大影响力的是胶原蛋白的含量。

胶原蛋白存在于皮肤的真皮层，占皮肤总干重的约70％。皮肤的弹性由其胶原蛋白和弹性蛋白(elastin，弹性纤维)维持。

胶原蛋白分子在成纤维细胞(Fibroblast)中形成，它们向细胞外分泌后，形成三重螺旋结构。胶原蛋白的主要功能为维持皮肤的机械性坚固性、增强结合组织的抵抗力及组织的结合力、支撑细胞粘合、诱导细胞分裂及分化等(V an der Rest等，1990)。

在生物体内适当调节如胶原蛋白等细胞外基质的合成和分解，但是，随着老化的发生，其合成量减少，促进作为用于分解胶原蛋白的酶的基质金属蛋白酶(MMP，matrixmetalloproteinase)的表达，因此，皮肤的弹性下降，形成皱纹。

并且，由自然老化引起的细胞活性的减少及缘由在于胶原酶(Collagenas e)的活性的内在因素以及污染、紫外线、压力等外在因素使活性氧及自由基增加，因此，使皮肤的弹性下降(Ingrid Emerit

Free radical and aging，1992)。

基质金属蛋白酶(MMP)为因自然老化和紫外线暴露而在生物体内分泌的蛋白质分解剂，其为分解细胞外基质(ECM，Extra Cellular Matrix)内结合组织(胶原蛋白(Collagen)，弹性蛋白(Elastin)，糖胺-聚糖(Glycosamin o-glycans)等)的酶(Enzyme)。基质金属蛋白酶(MMP)为从如多形核中性粒细胞(Polymorphonuclearneutrophil)、巨噬细胞(Macrophage)、成纤维细胞(Fibroblast)、骨细胞(Born cell)等细胞分泌的钙及锌依赖性内肽酶(Endo peptidase)，在中性pH中起作用并利用多种细胞外基质作为基质。其种类为M MP1～MMP16。其中，成为重点研究对象的与胶原蛋白(Collagen)分解有关的基质金属蛋白酶(MMP)为MMP1、MMP9。

通常，相比于20岁，在80岁时胶原蛋白减少65％，因此，皮肤的厚度变薄，而这与皮肤的皱纹形成密切相关(Arthur K.Balin等，Aging and the skin，1989)。

并且，最近，对皮肤老化的广泛研究中进一步强调了胶原蛋白在皮肤中的重要性。通过促进皮肤中的胶原蛋白的合成并通过抑制MMP1、MMP9等基质金属蛋白酶的活性来使真皮基质的成分增加，从而可期待抗氧化、改善皱纹、增强弹性、强化皮肤及治愈伤口等抗老化效果。

为了获得这些效果，以往在化妆品中配合胶原蛋白来制备产品。然而，这种化妆品为将胶原蛋白涂敷于皮肤的表面上来使用，因此，难以通过经皮吸收作为高分子的胶原蛋白，无法期待其功能。

并且，最近，虽然给皮肤的真皮直接注射胶原蛋白，但是，由于这种方法具有副作用，也无法真正地改善皮肤皱纹。

最近，为了解决如上所述的问题，用于促进胶原蛋白合成的物质备受关注，胶原蛋白合成促进物为维甲酸(Retinoic acid)、源自动物胎盘的蛋白质(日本专利特开平8-231370)等。

然而，维甲酸由于它的不稳定性而其剂型技术复杂，而且还存在皮肤刺激和红肿等安全性问题，因此在其使用上存在局限，由于疯牛病而禁止使用源自作为从牛摘取的物质的动物胎盘的蛋白质，难以期待通过促进皮肤胶原蛋白的合成来改善皮肤皱纹的效果。

因此，急切需要开发对生物体安全且使用方便、在剂型上具有高稳定性和优秀、具有促进胶原蛋白生成的效果的促进胶原蛋白生成且抑制MMP1、MM P9等的活性的新型物质，而且急需开发容易使用含有这种物质的化妆品。

槐树(Sophora japonica L.)为属于豆科植物的阔叶乔木，遍布于韩国、中国、日本等东北亚一带，树的高度为约15m至约25m，细枝无毛，呈草绿色。叶子为椭圆形或野叶形状，由9个至15个交替形态的小叶形成。

在7～8月树枝的末端盛开淡黄色花，在中医中将其称为槐花，将花苞称为槐米，将果实称为槐实或槐角。

上述槐树的花和果实在中医中用作中药材，含有从豆叶中分离的作为黄酮类化合物的芹菜素(apigenin)和异黄酮(isoflavone)类成分，因此具有抗炎、止血、治疗高血压、痔疮、湿疹等效果，而且曾报道过使用于肠出血、子宫出血、牙龈炎症和皮肤化妆等。(宋幸善等，大韩化妆品学会，2016，42(4)，p351-358)

另一方面，含有大量蜂蜜的槐树的槐花(Sophprae Flos)中含有作为主要成分的10～28％的芸香苷、少量的山柰酚、槲皮素、槐定碱和染料木素糖甙，最近，分离出了槐花米甲素A、槐花米甲素B、槐花米甲素C。上述槐花具有突出的酪胺酸酵素抑制活性及黑色素生成抑制效果，因此，还可以有效用作美白用组合物。(授权专利第10-1289813号)

并且，以往为了确认槐树的花、果实、树枝提取物的功效和效果，利用了甲醇或乙醇回流提取法等。通过如上所述的方法提取的甲醇槐树花提取物的多酚的含量为38.9mg/g，相比于此，通过75％乙醇回流提取法提取的槐树花提取物的多酚的平均含量为261.38±7.02mg/g，其产生更好的结果。这种结果可对溶剂和提取法等成分的效果产生影响。(关于槐树的花、果实、树枝提取物皮肤改善效果的研究。作者：宋幸善、张慧仁。大韩化妆品学会2016年11月10日)

而且，传统的槐树的果实荚为圆柱形状或念珠形状，果实与树枝及树皮一起用于痔疮的治疗，庭院树或木材用于家具材料。相比于在雌性激素中公知为功效最优越的雌甾二醇，如上所述的槐树，尤其，槐树的果实的槐树果实提取物的雌性激素分泌活性更好，因此，对包含槐树提取物作为有效成分的组合物的研究正在活跃地进行中。(公开专利第10-2011-0004603号)

但是，以往所使用的对抗老化、皮肤皱纹改善具有效果的槐树提取物为简单抑制抗坏血酸、视黄醇及胶原酶活性的物质，作为通过配合在化妆品或医药品中来防止改善皮肤的皱纹及防止老化的方法来使用，当配合时，稳定性不好或难以使皮肤吸收，其效果微乎其微，因此，具有难以获得实质性效果的问题。

发明内容

要解决的技术问题

本发明为了解决如上所述的问题而提出，其目的在于，提供如下的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物及其制备方法，即，利用乳杆菌发酵槐树果实来获得发酵液或提取上述发酵液来获得提取液，因此，具有优秀的改善皮肤皱纹效果且对皮肤刺激无副作用。

并且，本发明的目的在于，提供如下的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物及其制备方法，即，提供包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的化妆品组合物，从而促进成纤维细胞增殖，并通过抑制分子内胶原蛋白(Collagen)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)、弹性蛋白原(Tropoelastin)的基因表达和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的基因表达来改善皮肤的皱纹。

解决问题的技术方案

本发明的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物的特征在于，包含利用乳杆菌发酵槐树果实来获得的槐树果实发酵液。

并且，本发明的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物的特征在于，包含利用乳杆菌发酵槐树果实来获得的槐树果实发酵物的提取液。

并且，本发明中，优选地，使用选自由水、碳数为1个至4个的无水低级醇或含水低级醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯及1，3-丁二醇组成的组中的一种提取溶剂对上述槐树果实进行提取。

同时，本发明的特征在于，包括：步骤(S10)，获得槐树果实提取液；步骤(S20)，在上述槐树果实提取液中接种乳杆菌菌株来获得发酵液；步骤(S30)，在从上述步骤(S20)的槐树果实发酵液中去除培养菌之后，利用水浴提取法获得槐树果实发酵提取液；以及步骤(S40)，向上述步骤(S20)的槐树果实发酵液或上述步骤(S30)的槐树果实发酵提取液中添加稳定剂、维生素、颜料、色素及香料来获得化妆品组合物。

发明的有益效果

如上所述，本发明的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物及其制备方法具有如下的效果，即，利用乳杆菌发酵槐树果实来获得发酵液或提取上述发酵液来获得提取液，因此，具有优秀的改善皮肤皱纹效果且对皮肤刺激无副作用。

并且，本发明的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物及其制备方法具有如下的效果，即，提供包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的化妆品组合物，从而促进成纤维细胞增殖，并通过抑制分子内胶原蛋白(Collagen)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)、弹性蛋白原(Tropoelastin)的基因表达和基质金属蛋白酶-1(M MP-1)的基因表达来改善皮肤的皱纹。

附图说明

图1为本发明一实施例的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物的制备方法的流程图。

具体实施方式

本发明以用于使改善皮肤皱纹效果和有效性极大化的发酵技术为基础进行了研究。经结果确认，利用乳杆菌发酵槐树果实而得的发酵液或其提取液显著地抑制分子内胶原蛋白(Collagen)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIM P-1)、弹性蛋白原(Tropoelastin)的基因表达和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的基因表达来产生改善皮肤的效果，由此完成了本发明。

以下，说明本发明的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物。

本发明的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物的特征在于，包含利用乳杆菌发酵槐树果实来获得的槐树果实发酵物的提取液。

并且，用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物的特征在于，包含从利用乳杆菌发酵槐树果实而得的槐树果实发酵液提取的提取液。

在现有技术中，虽然将槐树花、槐树叶的提取物用作化妆品组合物，但在本发明中，为了使改善皮肤皱纹效果和有效性极大化，仅使用了槐树果实，并且，为了通过提高有效成分的皮肤吸收效率来提高改善皮肤皱纹效果，在本发明中，将利用乳杆菌发酵槐树果实而得的发酵液或其提取液用作用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物，从而通过比以往显著抑制分子内胶原蛋白(Collagen)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)、弹性蛋白原(Tropoelastin)的基因表达和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的基因表达来使改善皮肤效果极大化。

上述槐树果实的优选干重比为槐树果实为10重量百分比至40重量百分比，优选地，使用选自由水、碳数为1个至4个的无水低级醇或含水低级醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯及1，3-丁二醇组成的组中的一种提取溶剂对上述槐树果实进行提取。

上述槐树果实可通过本领域中公知的常规的方法，即，在常规的温度和压力的条件下，可使用常规的溶剂来制备槐树果实提取液。

作为一例，使用选自由水、碳数为1个至4个的无水低级醇或含水低级醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯及1，3-丁二醇组成的组成的溶剂提取本发明的作为组合物的有效成分的槐树果实，或者利用上述溶剂对槐树果实进行提取后，将它们混合来制备。

上述溶剂为醇类，优选地，上述溶剂为乙醇，更优选地，乙醇为60～80％的乙醇。上述提取溶剂的适合添加量为槐树果实干重的1倍至20倍重量，更优选地，5倍至20倍重量，最优选地，10倍重量。

另一方面，本发明的利用乳杆菌发酵槐树果实而得的发酵液不仅包含通过如上所述的提取法提取的提取物，而且还包含通过常规纯化过程提取的提取物。

例如，应解释为，通过利用具有固定分子量临界值的超过滤膜的分离、利用多种色谱法(为了根据大小、电荷、疏水性或亲和性分离而制备的)的分离等、额外实施多种纯化方法来获得的分馏物也包含在本发明的利用乳杆菌发酵槐树果实而得的发酵液中。

并且，本发明的利用乳杆菌发酵槐树果实而得的发酵液还包含通过减压蒸馏及冻结干燥或喷雾干燥等附加过程将发酵液制备成粉末状态的。

本发明的槐树果实发酵液或槐树果实发酵提取液作为上述利用乳杆菌发酵槐树果实而得的发酵液或提取上述发酵液而得的提取液，促进成纤维细胞增殖，并抑制分子内胶原蛋白(Collagen)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TI MP-1)、弹性蛋白原(Tropoelastin)的基因表达和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的基因表达，从而其为具有优秀的改善皮肤皱纹效果且对皮肤刺激无副作用的天然的安全制剂，而且，其生产费用低。

在本发明中，用乳杆菌发酵槐树果实而得的发酵液可以为浓缩的液体形态，也可以为干燥的粉末形态。

上述乳杆菌为作为从人的大便鉴定出的菌株的鼠李糖乳杆菌(Lactobacill usrhamnsus)vitaP1(保藏编号：KACC92054P)菌株，是利用韩国(株)丹鼎生物的菌株进行发酵的。

本发明的包含槐树果实发酵液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物具有非常优秀的改善皱纹功效，在所适用的产品中呈现出优秀的稳定性。

并且，具有促进成纤维细胞增殖，并抑制分子内胶原蛋白(Collagen)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)、弹性蛋白原(Tropoelastin)的基因表达和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的基因表达的等效果。

根据本发明的优选实施例，相对于化妆品组合物的总重量，利用乳杆菌发酵槐树果实而得的发酵液或提取发酵液而得的提取液的含量为0.01重量百分比至20.0重量百分比，优选地，0.1重量百分比至15.0重量百分比，更优选地，1重量百分比至10.0重量百分比。

相对于化妆品组合物的总重量，在上述槐树果实发酵液或提取发酵液而得的提取液的含量包含小于0.01重量百分比的情况下，具有在促进成纤维细胞增殖及抑制分子内胶原蛋白(Collagen)、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TI MP-1)、弹性蛋白原(Tropoelastin)的基因表达和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的基因表达中没有效果的问题，在大于20重量百分比的情况下，对于皮肤干燥的人群而言，会发生皮肤瘙痒和刺痛的问题。

本发明的槐树果实发酵液或提取发酵液而得的提取液具有改善皮肤皱纹的效果，除了皮肤干燥的人群之外，对皮肤刺激无副作用，因此可以使用含量大于20重量百分比，甚至可达100重量百分比的槐树果实发酵液或槐树果实发酵提取液的化妆品组合物。

本发明的化妆品组合物中所包含的成分中，除了包含作为有效成分的利用乳杆菌发酵槐树果实而得的发酵液之外，而且还包含在化妆品组合物中通常所利用的成分，例如，抗氧化剂、稳定剂、溶解剂、维生素、颜料、色素及香料等常规的辅助剂以及载体。

本发明的化妆品组合物可制备成在本技术领域中通常所制备的任何剂型，例如，可制备成溶液、悬浮液、乳浊液、浆料、凝胶、霜、乳液、粉末、香皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉末粉底、悬浮液粉底、蜡粉底及喷雾剂等，但并不限定于此。更详细地，可制备成柔软化妆水、营养化妆水、营养霜、按摩霜、精华液、面膜、眼霜、洁面霜、洗面奶、卸妆水、面膜、喷雾剂或粉末等剂型。

在本发明的剂型为浆料、霜或凝胶的情况下，可利用选自动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌中的一种以上作为载体成分。

在本发明的剂型为粉末或喷雾剂的情况下，可利用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末作为载体成分，尤其，在本发明的剂型为喷雾剂的情况下，还可以包含如氯氟碳塑料、丙烷/丁烷或二甲醚等推进剂。

在本发明的剂型为溶液或乳浊液的情况下，利用溶剂、溶解剂或乳浊剂，例如，可利用选自水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、丁二醇、1，3-丁二醇油、聚氧乙烯硬化蓖麻油、丙三醇、甘油、脂肪族酯、苯氧乙醇、三乙醇胺、聚乙二醇、蜂腊、聚山梨酯60、山梨坦倍半油酸酯、石蜡、山梨坦硬脂酸酯、亲油型单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、甘油硬脂酸酯/PEG-400硬脂酸酯、羧基聚合物、谷甾醇、聚甘油2-油酸酯、神经酰胺、胆固醇、乳化剂-4、二鲸蜡醇磷酸酯、澳洲坚果油、羧基乙烯聚合物、黄胞胶或失水山梨醇的脂肪酸酯中的一种以上作为载体成分。

在本发明的剂型为悬浮液的情况下，可利用选自如水、乙醇、丙三醇、丁二醇或丙二醇等液态稀释剂、如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇及聚氧乙烯山梨糖醇酐酯等悬浮剂、微晶纤维素、羟乙基纤维素、透明质酸钠、苯氧乙醇、偏氢氧化铝、膨润土、硬脂酸、鲸蜡醇、单硬脂酸甘油酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、山梨坦倍半油酸酯、单硬脂酸甘油酯/甘油硬脂酸/聚氧乙烯硬脂酸酯、蜡、石蜡、角鲨烷、辛酸/癸酸甘油三酯、羧基乙烯聚合物、三乙醇胺、琼脂或蓍胶中的一种以上作为载体成分。

在本发明的剂型为含表面活性剂的清洁剂的情况下，可利用选自脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙磺酸盐、咪唑啉鎓衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯中的一种以上作为载体成分。

以下，参照附图说明本发明的包含槐树果实发酵液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物的制备方法。

图1为示出本发明的包含槐树果实发酵液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物的制备方法的流程图。

以下，参照附图说明本发明的优选实施内容，优选地，本发明的包含槐树果实发酵液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物的制备方法包括如下的步骤，但并不限定于此。

本发明的特征在于，包括步骤(S10)，获得槐树果实提取液；步骤(S20)，在上述槐树果实提取液中接种乳杆菌菌株来获得发酵液；步骤(S30)，在从上述步骤(S20)的槐树果实发酵液中去除培养菌之后，利用水浴提取法获得槐树果实发酵提取液；以及步骤(S40)，向上述步骤(S20)的槐树果实发酵液或上述步骤(S30)的槐树果实发酵提取液中添加稳定剂、维生素、颜料、色素及香料来获得化妆品组合物。

以下，按各个步骤说明本发明的制备方法。

在上述步骤(S10)中，获得槐树果实提取液。

用纯化水清洗上述槐树果实并进行干燥之后，粉碎，然后利用50目(me sh)至200目的筛网获得微细的粉碎物。向上述槐树果实粉碎物中添加100g/L至300g/L的蒸馏水，在水浴条件下，进行回流提取3次，每次进行3小时至7小时，经过冷浸之后，利用3μm至8μm的滤纸过滤来制备提取液，将此提取液用作发酵过程的提取液。

在步骤(S20)中，在上述槐树果实提取液中接种乳杆菌菌株来获得发酵液。

向在上述步骤(S10)中获得的槐树果实提取液中添加乳杆菌菌株和LB肉汤(LBBroth)培养基，在25至35的好氧条件下，发酵40小时至120小时。经过培养之后，将培养液离心分离来第一次去除培养菌而获得过滤液，将上述过滤液再次利用过滤器过滤至0.2μm之后，进行灭菌处理，以不再进行培养。

相对于妆品组合物的总重量，可包含0.01重量百分比至20.0重量百分比的在上述步骤(S20)中获得的槐树果实发酵液。

相对于妆品组合物的总重量，在上述槐树果实发酵液的含量小于0.01重量百分比的情况下，存在不产生抑制脂氧合酶、透明质酸酶的活性及消除自由基的效果的问题，在大于20重量百分比的情况下，对于皮肤干燥的人群而言，存在皮肤瘙痒和刺痛的问题。

在步骤(S30)中，在从上述步骤(S20)的槐树果实发酵液中去除培养菌之后，利用水浴提取法获得槐树果实发酵提取液。

向在上述步骤(S20)中获得的槐树果实发酵液中加入灭菌剂及防腐剂之后，利用水浴提取法获得槐树果实发酵提取液。对上述培养菌被去除的槐树果实发酵液进行回流水浴提取3次，每次进行3小时至7小时，经过冷浸之后，利用3μm至8μm的滤纸过滤。完成过滤之后，获得槐树果实发酵提取液。

相对于妆品组合物的总重量，可包含0.01重量百分比至20.0重量百分比的在上述步骤(S30)中获得的槐树果实发酵提取液。

相对于妆品组合物的总重量，在上述槐树果实发酵提取液的含量小于0.01重量百分比的情况下，存在不产生抑制脂氧合酶、透明质酸酶的活性及消除自由基的效果的问题，在大于20重量百分比的情况下，对于皮肤干燥的人群而言，会存在皮肤瘙痒和刺痛的问题。

在步骤(S40)中，向上述步骤(S20)的槐树果实发酵液或上述步骤(S30)的槐树果实发酵提取液中添加稳定剂、维生素、颜料、色素及香料来获得化妆品组合物。

以下，通过本发明的制备例、实施例、比较例、试验例及剂型例进行详细说明，

下述制备例、实施例、比较例、试验例及剂型例仅用于例示本发明，而本发明并不限定于下述制备例、实施例、比较例、试验例及剂型。

制备例.槐树果实提取液的制备方法

用纯化水清洗槐树果实并进行干燥之后，粉碎，然后利用100目(mesh)的筛网获得微细的粉碎物。添加10％(V/V)的乙醇水溶液以使槐树果实粉碎物的浓度成为100g/L，在水浴条件下，进行回流提取3次，每次进行5小时，经过冷浸之后，利用6μm的滤纸(沃特曼(whatman)#3)过滤来制备提取液，将此提取液用作发酵过程的提取液。

并且，在50℃以下对上述提取液进行减压浓缩及冻结干燥来在功效评价时使用。

实施例.槐树果实发酵液及槐树果实发酵提取液的制备方法

向在上述制备例中制备的槐树果实提取液中加入鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)vitaP1菌株(保藏编号：KACC92054P)和LB肉汤(LB Broth)培养基，并在30的好氧条件下，发酵96小时。经过培养之后，将培养液离心分离来第一次去除培养菌而获得过滤液，将上述过滤液再次利用过滤器过滤至0.2μm之后，进行灭菌处理(121，15分钟，1.5气压)，以不再进行培养。向通过灭菌获得的槐树果实发酵物中添加纯化水并进行回流水浴提取3次，每次进行5小时，经过冷浸之后，利用6μm的滤纸(沃特曼(what man)#3)过滤。将经过过滤获得的提取液移送至浓缩槽并在50℃以下进行减压浓缩及冻结干燥。

比较例.乳杆菌培养液的制备方法的比较例

在本比较例中，在LB肉汤(LB Broth)培养基中30的好氧条件下对在实施例中所使用的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)vitaP1菌株(保藏编号：KACC92054P)发酵菌株进行培养96小时。经过培养之后，将培养液离心分离来第一次去除培养菌而获得过滤液，将上述过滤液再次利用过滤器过滤至0.2μm之后，进行灭菌处理(121，15分钟，1.5气压)，以不再进行培养。将培养菌被去除的培养液移送至浓缩槽在50℃以下进行减压浓缩及冻结干燥。

试验例1.通过本发明的槐树果实发酵液确认细胞增殖及毒性

细胞培养

为了确认在上述实施例、比较例中制备的槐树果实发酵液干粉和乳杆菌培养液干粉以及在制备例中制备的干粉的作用于抗老化的基因表达，使用HaCa T(人角质形成细胞系(Human keratinocyte cell line))作为胶原蛋白(Colla gen)和基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)，使用CCD-986Sk(人成纤维细胞系(Human fibroblast cell line))作为基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和弹性蛋白原(Tropoelastin)。使用包含10％(v/v)的胎牛血清(FBS，fetal bovine serum，Gibco，USA)，100U/mL的链霉素(streptomycin)，100U/mL的青霉素(penicillin)抗生素(Gibco，USA)的杜贝克改良鹰培养基(DME M，Dulbecco'smodified eagle's medium，Gibco，USA)并在5％的CO₂及37℃的条件的培养箱中培养HaCaT细胞、CCD-986Sk细胞。

细胞存活率测定实验(MTT assay)

确认了在上述实施例、比较例中制备的槐树果实发酵液干粉和乳杆菌培养液干粉以及在制备例中制备的干粉对细胞增殖产生的影响。

为了确认细胞增殖及毒性，通过如下的方法进行了实验。

将处于培养中的3T3细胞(成纤维细胞系(fibroblast cell line))以5000细胞/孔分株于96孔微板中，在恒温槽中培养30分钟，分别按0.01(％，W/V)、0.05(％，W/V)、0.1(％，W/V)、0.5(％，W/V)的浓度投入试样并培养72小时。经过72小时的培养之后，加入噻唑蓝(Thiazoline blue)再加4小时的培养时间。扔掉全部培养液，在微板的各孔中加入反应终止液并搅拌5小时后，在570nm测量了吸光度。投入与试样注入量相同量的10％的胎牛血清(Fetal Bovine Serμm，FBS)培养基来在细胞生长的最佳条件下同时培养对照组，将对照组的细胞增殖设置为100％来计算试样投入实验组的细胞增殖率。

通过计算式1计算了细胞增殖效果，其结果如下列表1所示。

计算式1

表1.通过槐树果实发酵液的细胞增殖及毒性缓解效果

如表1所示，当将在细胞生长最佳条件下的细胞增殖设置为100％时，在实施例和比较例中制备的槐树果实发酵液干粉和乳杆菌培养液干粉以及在制备例中制备的槐树果实提取液干粉均无毒性。

尤其，确认到在实施例和制备例中具有细胞增殖效果，相比于制备例，在实施例中呈现出优越的细胞增殖效果，因此其细胞增殖效果最优秀。与此相反，在比较例中虽然未出现毒性，但确认到也没有细胞增殖效果。

试验例2.抑制细胞中胶原蛋白(Collagen)、金属蛋白酶组织抑制因子-1(Timp-1) 及弹性蛋白原(Tropoelastin)的基因表达和MMP-1的基因表达的效果

制备5×10⁵cells/mL细胞数的HaCaT细胞和CCD-986Sk细胞后，在陪替氏培养皿中处理，并在5％的CO₂及37℃的条件下培养24小时。细胞在陪替氏培养皿中生长80％以上之后，添加了出现100％以上的细胞存活率的浓度的提取物。

处理在上述实施例、比较例中制备的槐树果实发酵液干粉和乳杆菌培养液干粉以及在制备例中制备的槐树果实提取液干粉后，在DMED/10FBS中在5％的CO₂及37℃的条件下培养24小时。经过24小时之后，按照Komoroski等(Drug Metab.Dispos.32：512-518，2004)中记载的方法进行了从细胞分离RNA、cDNA合成以及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)。经确认，在RT-PCR中所测定的基因抑制COL1A1、基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)及弹性蛋白原(Tropoelastin)的表达和基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的表达。为了确认基因表达的差异，使用GAPDH作为管家基因(house keeping gene)。

各个基因的引物序列如表2所示。将所提取的RNA作为模板，利用总量为15μL的寡核苷酸dT-适配子引物(Oligo dT-adaptor primer)和DEPC水(D EPC water)并在70℃的温度下改性5分钟后，通过Moloney小鼠白血病病毒(M-MLV，Moloney murine leukemiavirus)RNA的逆转录来进行在42℃的温度下60分钟、在94℃的温度下5分钟的cDNA合成。通过PCR反应扩增所合成的cDNA，反应液的总量为25μL。各反应物的最终浓度为如下，引物100pmol、1.0μM、dNTP混合物0.2mM、5×green or colorless GoTaq Reactio n buffer(5×绿色或无色GoTaq反应缓冲液)1×1.5mM、MgCl2(PCR缓冲液)及GoTaq DNA聚合酶1.25units。对于改性(Denaturation)、退火(anne aling)、延伸(extension)的PCR反应条件为如下，在95℃的温度下2分钟、在95℃的温度下30秒钟、在60℃的温度下30秒钟、在72℃的温度下1分钟、在72℃的温度下5分钟，进行30～40周期。经过PCR反应之后，在2％的琼脂糖凝胶(agarose gel)中对产物的10μL进行了电泳。利用凝胶成像系统一体机(韩国labtech公司，Cat.No DGS-200D)来确认了表达量。

表2.基因的引物碱基序列

表3.通过槐树果实发酵液的胶原蛋白表达(Collagen expression)

表4.通过槐树果实发酵液的基质金属蛋白酶组织抑制因子-1表达(TIM P- 1expression)

表5.通过槐树果实发酵液的弹性蛋白原表达(Tropoelastin expression)

表6.通过槐树果实发酵液的基质金属蛋白酶-1表达(MMP-1 expression)

如上述表3至表6所示，进行PT-PCR后观察，经结果确认，相比于在比较例中制备的乳杆菌培养液干粉及在制备例中制备的槐树果实提取液干粉，本发明的实施例的胶原蛋白(Collagen)及基质金属蛋白酶组织抑制因子-1(TI MP-1)的表达增加，基质金属蛋白酶-1(MMP-1)的表达浓度依赖性性地减少。与作为对照组的腺苷(Adenosine)相比，本发明的实施例显示优秀或者相似的结果。

并且，弹性蛋白原(Tropoelastin)为形成表示皮肤弹性的弹性纤维中心的弹性蛋白的因子，在实施例1中显示与作为对照组的腺苷(Adenosine)相似的结果。

剂型例1.包含本发明的槐树果实发酵液的化妆水的制备

包含实施例的槐树果实发酵液干粉的化妆品中的化妆水(润肤液)的剂型例如表7所示。

表7.包含槐树果实发酵液的化妆水的结构

<u>编号</u>	<u>原材料</u>	<u>含量(重量百分比)</u>
			1	槐树果实发酵液干粉(实施例)	1.0
2	丙三醇	3.0
			3	丁二醇	2.0
4	丙二醇	2.0
			5	聚氧乙烯硬化蓖麻油	1.0
6	乙醇	10.0
			7	三乙醇胺	0.1
8	防腐剂	微量
			9	色素	微量
10	香料	微量
			11	纯化水	余量

为了制备上述化妆水，向在表7中所记载的11号中依次投入2号、3号、4号及8号来搅拌并使它们溶解后，将5号加热至60℃左右来使其溶解后，投入10号进行溶解后，投入11号中。最后，投入1号、6号、7号及9号并充分搅拌后，进行熟成。

剂型例1.包含本发明的槐树果实发酵液的营养乳液的制备

包含实施例的槐树果实发酵液干粉的化妆品中的营养乳液的剂型例如表8所示。

表8.包含槐树果实发酵液的营养乳液的结构

<u>编号</u>	<u>原材料</u>	<u>含量(重量百分比)</u>
			1	槐树果实发酵液干粉(实施例)	2.0
2	蜂腊	1.0
			3	聚山梨酯60	1.5
4	山梨坦倍半油酸酯	0.5
			5	液状石蜡	10.0
6	山梨坦硬脂酸酯	1.0
			7	亲油型单硬脂酸甘油酯	0.5
8	硬脂酸	1.5
			9	甘油硬脂酸酯/PEG-400硬脂酸酯	1.0
10	丙二醇	3.0
			11	羧基聚合物	0.1
12	三乙醇胺	0.2
			13	防腐剂	微量
14	色素	微量
			15	香料	微量
16	纯化水	余量

为了制备上述营养乳液，将在表8中所记载的10号、11号、13号及16号混合搅拌，加热至80～85℃之间并投入至制备部后，启动乳化机，将2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号及12号加热至80～85℃之间并溶解后，进行乳化。结束乳化之后，利用搅拌机搅拌并冷却至50℃后，投入15号并冷却至45℃后，投入14号，在35℃的温度下投入1号并冷却至25℃后，进行熟成。

剂型例3.包含本发明的槐树果实发酵液的营养霜的制备

包含实施例的槐树果实发酵液干粉的化妆品中的营养霜的剂型例如表9所示。

表9.包含槐树果实发酵液的营养霜的结构

为了制备上述营养霜，将在表9中所记载的12号、13号、14号及16号混合搅拌，加热至80～85℃之间并投入至制备部后，启动乳化机，将2号、3号、4号、5号、6号、7号、8号、9号、10号及11号加热至80～85℃之间并溶解后，投入15号并搅拌之后投入至制备部来进行乳化。结束乳化之后，利用搅拌机搅拌并冷却至35℃，投入1号并冷却至25℃后，进行熟成。

剂型例4.包含本发明的槐树果实发酵的精华液的制备

包含实施例的槐树果实发酵液干粉的化妆品中的精华液的剂型例如表10所示。

表10.包含槐树果实的第三次发酵液的精华液的结构

为了制备上述精华液，在规定温度下，将对在表10中记载的2号、3号、4号、5号及6号进行均质化来制备的物质称为非离子系两亲性脂质。将上述非离子系两亲性脂质与1号、7号、8号及14号混合，在规定温度下进行均质化来使其通过微流化机，接着，在规定温度下缓慢地接种9号来进行均质化后，再次使其通过微流化机。然后，投入10号、11号、12号及13号来进行分散、稳定化、熟成。

本发明中所说明的内容仅为用于包含槐树果实发酵液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物及其制备方法的实施例，本发明并不限定于上述实施例，而是能够以其他的多种形态实现，本实施例仅用于使本发明的公开更加完整，为了使本发明所属技术领域的普通技术人员完整地理解发明的范畴而提供，本发明由发明要求保护范围的范畴定义。

Claims (9)

1.一种包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物，其特征在于，包含利用乳杆菌发酵槐树果实来获得的槐树果实发酵液或其提取液。

2.根据权利要求1所述的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物，其特征在于，使用选自由水、碳数为1个至4个的无水低级醇或含水低级醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯及1，3-丁二醇组成的组中的一种提取溶剂对上述槐树果实进行提取。

3.根据权利要求1所述的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物，其特征在于，相对于化妆品组合物的总重量，包含0.01重量百分比至20.0重量百分比的上述槐树果实发酵液或其提取液。

4.根据权利要求1所述的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物，其特征在于，上述槐树果实发酵液或其提取液具有改善皱纹效果且对皮肤刺激无副作用。

5.一种包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物的制备方法，其特征在于，包括：

步骤(S10)，获得槐树果实提取液；

步骤(S20)，在上述槐树果实提取液中接种乳杆菌菌株来获得发酵液；

步骤(S30)，从上述步骤(S20)的槐树果实发酵液中去除培养菌之后，利用水浴提取法获得槐树果实发酵提取液；以及

步骤(S40)，向上述步骤(S20)的槐树果实发酵液或上述步骤(S30)的槐树果实发酵提取液中还添加稳定剂、维生素、颜料、色素及香料来获得化妆品组合物。

6.根据权利要求5所述的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物的制备方法，其特征在于，相对于化妆品组合物的总重量，包含0.01重量百分比至20.0重量百分比的在上述步骤(S20)中获得的槐树果实发酵液或在步骤(S30)中获得的槐树果实发酵提取液。

7.根据权利要求5所述的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物的制备方法，其特征在于，在上述步骤(S10)中，用纯化水清洗上述槐树果实并进行干燥之后，粉碎，然后利用50目至200目的筛网获得微细的粉碎物，向上述槐树果实粉碎物中添加100g/L至300g/L的蒸馏水，在水浴条件下，进行回流提取3次，每次进行3小时至7小时，经过冷浸之后，利用3μm至8μm的滤纸过滤来获得提取液。

8.根据权利要求5所述的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物的制备方法，其特征在于，在上述步骤(S20)中，向在上述步骤(S10)中获得的槐树果实提取液中添加乳杆菌菌株和LB肉汤培养基，在25至35的好氧条件下，发酵40小时至120小时，经过培养之后，将培养液离心分离来第一次去除培养菌而获得过滤液，将上述过滤液再次利用过滤器过滤至0.2μm之后，进行灭菌处理。

9.根据权利要求5所述的包含槐树果实发酵液或其提取液作为有效成分的用于改善皮肤皱纹的化妆品组合物的制备方法，其特征在于，在上述步骤(S30)中，向在上述步骤(S20)中获得的槐树果实发酵液中加入灭菌剂及防腐剂之后，利用水浴提取法获得槐树果实发酵提取液，对上述培养菌被去除的槐树果实发酵液进行回流水浴提取3次，每次进行3小时至7小时，经过冷浸之后，利用3μm至8μm的滤纸过滤，完成过滤之后，获得提取液。

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